UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU PATOGENICIDADE DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS E COMPATIBILIDADE COM INSETICIDAS PARA O MANEJO DE Diaphorina citri KUWAYAMA, (HEMIPTERA: LIVIIDAE) ANA PAULA FERREIRA PINTO Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp - Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Agronomia (Proteção de Plantas) BOTUCATU-SP Julho – 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CAMPUS DE BOTUCATU PATOGENICIDADE DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS E COMPATIBILIDADE COM INSETICIDAS PARA O MANEJO DE Diaphorina citri KUWAYAMA, (HEMIPTERA: LIVIIDAE) ANA PAULA FERREIRA PINTO Orientador: Prof. Dr. Antonio Batista Filho Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp - Campus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Agronomia (Proteção de Plantas) BOTUCATU-SP Julho – 2016 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMEN- TO DA INFORMAÇÃO – DIRETORIA TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - UNESP – FCA – LAGEADO – BOTUCATU (SP) Pinto, Ana Paula Ferreira, 1985- P659p Patogenicidade de fungos entomopatogênicos e compati- bilidade com inseticidas para o manejo de Diaphorina citri Kuwayama, (Hemiptera: Liviidae) / Ana Paula Ferrei- ra Pinto. – Botucatu : [s.n.], 2016 x, 91 f. : fots. color., grafs. color., tabs. Tese (Doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Fa- culdade de Ciências Agronômicas, Botucatu, 2016 Orientador: Antonio Batista Filho Inclui bibliografia 1. Frutas cítricas – Doenças e pragas. 2. Inseto como transmissor de doenças das plantas. 3. Fungos patogêni- cos. 4. Defensivos agrícolas. I. Batista Filho, Antonio. II. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Fi- lho” (Câmpus de Botucatu). Faculdade de Ciências Agronô- micas. III. Título. III BIOGRAFIA DO AUTOR ANA PAULA FERREIRA PINTO – Filha de Osvaldo da Silva Pinto e Joana Aparecida Ferreira Pinto, nascida no município de Campinas - SP, em 01 de julho de 1985. Bióloga, graduada pela Pontifícia Universidade Católica de Campinas - SP em dezembro de 2009. Obteve o título de Mestre em Sanidade, Segurança Alimentar e Ambiental no Agronegócio pelo Instituto Biológico, São Paulo - SP no ano de 2012. Possui publicações na área de controle biológico de pragas, participou de diversos eventos nacionais e internacionais sobre controle biológico. Cursou Doutorado em Proteção de Plantas pela Faculdade de Ciências Agronômicas/UNESP – Campus de Botucatu - SP, 2016. IV “A tarefa não é tanto ver o que ninguém viu ainda, mas pensar o que ninguém pensou sobre algo que todos veem” Arthur Schopenhauer (1788 – 1860) V Aos meus pais, dedico. À minha família, ofereço. VI AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por ter sempre me dado mais que o necessário para concluir o meu trabalho. Ao meu Orientador, Prof. Dr. Antonio Batista Filho, pela oportunidade de cursar meu doutorado, por toda a estrutura oferecida para o meu trabalho ser realizado no Instituto Biológico, e por todos os ensinamentos, experiência e ajuda, pelo exemplo profissional a ser seguido. Muito Obrigada! Aos membros da banca de defesa Prof. Dr. Antonio Batista Filho, Prof. Dr. Lucas Detogni Simi, Prof. Dra. Dinalva Alves Mochi, Prof. Dra. Regiane Cristina Oliveira de Freitas Bueno e Prof. Dr. Edson Luiz Lopes Baldin pelas sugestões e correções fundamentais para melhoria deste trabalho. Aos professores e funcionários da Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu, que possibilitaram, no aprendizado ou na prestação de serviços, a realização desse trabalho. Aos pesquisadores do Instituto Biológico, Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida, Dr. Valmir Antonio Costa, Dr. Luis Garrigós Leite e tantos outros que possibilitaram esse trabalho ser concluído. Ao Dr. Valmir Antonio Costa em especial, pelo auxilio com as fotografias dos resultados desse trabalho. Aos Dr. César Junior Bueno, Gabriele Saqui, Cristina Queiroz e Fernando Baldo pela ajuda na interpretação dos dados, análise estatística e elaboração de tabelas e gráficos. Ao Instituto Biológico pela oportunidade de desenvolvimento dos estudos. Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos. VII À Roselaine Nunes da Silva Bueno, agradeço em especial, pelo companheirismo, paciência, ajuda e conselhos, por todas as comidas gostosas que faz, por cuidar de mim depois da minha cirurgia, por todos os abraços e por saber se estou triste só olhando nos meus olhos. Além do seu profissionalismo, sua amizade foi essencial e muito importante para mim, e eu serei eternamente grata. Aos amigos do Laboratório de Controle Biológico, Ana Beatriz Monteiro, Ana Paula dos Santos Bartels, Isabella Alice Gotti, Jaqueline Lyra Saltorato, Julie Orozco, Lucas Detogni Simi, Lucas Vitor, Milena Yasmin da Silva Souza, Renata Marraschi, Roselaine Nunes da Silva Bueno pela ajuda imprescindível para a realização deste trabalho, atenção, carinho, pela convivência harmoniosa ao longo desses anos, por aguentarem as minhas choradeiras, por ficarem triste quando eu estava triste e pelas risadas infinitas que não vou esquecer jamais e por permitirem compartilhar um pouco da minha alegria com vocês – AMO TODOS VOCÊS! Agradeço aos meus pais Osvaldo da Silva Pinto e Joana Aparecida Ferreira Pinto. Essa tese foi concluída graças ao apoio e suor de vocês, pois eu não conseguiria sozinha. Muito obrigado por todo o apoio, carinho, paciência, determinação e inspiração. Aos meus irmãos Alessandro Ferreira Pinto e Fábio Ferreira Pinto, pela amizade, companheirismo e carinho. A toda minha família pelo carinho e incentivo. Ao Felipe Azevedo por todo carinho, dedicação e atenção. Por cada palavra de incentivo, por dividir os momentos felizes, por me apoiar nos piores momentos e mesmo de tão longe conseguir ser meu porto seguro. MUITO OBRIGADA, amo você! As amigas/irmãs Fernanda Maria Ferreira, Eline Santana, Luciana Ganzarolli, Cibele Suzart, Gabriele Saqui e Michele Vicentini pela amizade, carinho e atenção em todos os momentos difíceis da minha vida e por dividirem comigo tantas alegrias – AMO VOCÊS! A Dra. Zuleide Alves Ramiro pelo convívio. VIII Aos queridos companheiros de sofrimento em Botucatu/SP: Fabíola Medeiros, Evelynne Urzêdo Leão, Gabriela Santa Rosa, Stéfani Thais, Mariana Sales, Claudiane Paes, João Victor (Ti-Ralo), Anderson Ravanny, Janaina Matias, Cibele Raio, Patricia Tatemoto e Ivi Back. Muito obrigada por todo carinho, convívio, almoços, festas, cachoeiras e choradeiras. Sem vocês não seria tão bom. Aos não menos importantes figuras de minha vida, Jack e Theodoro, que mesmo não falando, transmitiram sempre muito amor e companheirismo. E a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a essa conquista. https://www.facebook.com/evelynne.urzedoleao https://www.facebook.com/evelynne.urzedoleao https://www.facebook.com/janaina.matias.50 https://www.facebook.com/cibele.raio https://www.facebook.com/paty.tatemoto https://www.facebook.com/ivi.back?fref=photo IX SUMÁRIO 1. RESUMO .......................................................................................................................................... 1 2. SUMMARY ...................................................................................................................................... 3 LISTA DE TABELAS .............................................................................................................................. 5 LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................... 7 3. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 9 4. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................................... 12 4.1. Citricultura .................................................................................................................................. 12 4.2. Doenças e pragas dos citros ........................................................................................................ 13 4.3. Huanglongbing (HLB) ................................................................................................................ 15 4.3.1. Características gerais ............................................................................................................... 15 4.3.2. Danos ....................................................................................................................................... 16 4.4. Psilídeo dos citros: características gerais e biologia ................................................................... 17 4.4.1. Morfologia ............................................................................................................................... 17 4.4.2. Hospedeiro .............................................................................................................................. 18 4.4.3. Ovos ........................................................................................................................................ 18 4.4.4. Ninfas ...................................................................................................................................... 18 4.4.5. Adultos .................................................................................................................................... 19 4.5. Distribuição ................................................................................................................................. 20 4.6. Formas de controle e legislação .................................................................................................. 22 4.6.1. Legislação para o HLB ............................................................................................................ 22 4.6.2. Controle químico ..................................................................................................................... 23 4.6.3. Controle biológico ................................................................................................................... 25 4.7. Compatibilidade de fungos entomopatogênicos com produtos fitossanitários ........................... 29 X 5. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................ 32 5.1. Obtenção e criação de Diaphorina citri ...................................................................................... 32 5.2. Fungos entomopatogênicos ......................................................................................................... 33 5.3. Patogenicidade de fungos entomopatogênicos à ninfas de Diaphorina citri e determinação do tempo letal médio 50% (TL50) ................................................................................................................. 36 5.4. Patogenicidade de fungos entomopatogênicos à adultos de Diaphorina citri............................. 39 5.5. Compatibilidade de produtos fitossanitários utilizados na citricultura em condições de laboratório ............................................................................................................................................... 40 5.6. Análise estatística ........................................................................................................................ 43 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................... 44 6.1. Obtenção e criação de Diaphorina citri ...................................................................................... 44 6.2. Patogenicidade de fungos entomopatogênicos à ninfas de Diaphorina citri e determinação do tempo letal médio 50% (TL50) ................................................................................................................. 45 6.3. Patogenicidade de fungos entomopatogênicos à adultos de Diaphorina citri............................. 53 6.4. Compatibilidade de produtos fitossanitários utilizados na citricultura em condições de laboratório ............................................................................................................................................... 60 7. CONCLUSÕES ............................................................................................................................... 72 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................ 73 1 1. RESUMO PATOGENICIDADE DE FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS E COMPATIBILIDADE COM INSETICIDAS PARA O MANEJO DE Diaphorina citri KUWAYAMA, (HEMIPTERA: LIVIIDAE), Botucatu, 2016. Tese (Doutorado em Agronomia/Proteção de Plantas) - Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Aluna: ANA PAULA FERREIRA PINTO Orientador: ANTONIO BATISTA FILHO Em 2004 foi relatada, nos pomares cítricos do estado de São Paulo, a presença do Huanglongbing. No Brasil, esta doença é causada pelas bactérias Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus, que são transmitidas pelo psílideo-dos-citros Diaphorina citri. A principal forma de controlar a doença é através do controle do inseto vetor, atualmente realizada com o uso de produtos fitossanitários. A mortalidade de adultos do psilídeo por fungos entomopatogênicos tem sido observada em campo, e alguns estudos estão sendo desenvolvidos, há pouca informação na literatura sobre o 2 efeito desses patógenos no controle microbiano do inseto vetor. Dessa forma, o presente estudo avaliou a patogenicidade de 20 isolados de fungos entomopatogênicos sobre adultos e ninfas de D. citri em condições de laboratório e semi-campo, bem como a sua compatibilidade com produtos fitossanitários, de diferentes grupos, utilizados na citricultura. Ninfas e adultos de D. citri, provenientes de criação em laboratório, foram expostas à uma concentração de 6,7x107 conídios/mL, avaliando a mortalidade desses insetos. Através dessa mortalidade foi determinado o tempo letal médio para 8 isolados, com maior porcentagem de mortalidade confirmada. A compatibilidade em laboratório foi observada adicionando os produtos químicos ao meio de cultura BDA, foi inoculado com o fungo em três pontos equidistantes da placa de Petri, a qual foi mantida em câmara climatizada tipo BOD por um período de sete dias. Após esse período, foram avaliados o crescimento vegetativo, esporulação, viabilidade do entomopatógeno. Em ensaios de laboratório, todos os produtos afetaram o desenvolvimento dos fungos e foi possível classificar os produtos como moderadamente tóxico, tóxico e compatível. Palavras-chave: Huanglongbing, greening, controle microbiano, fungos entomopatogênicos, psilídeo-dos-citros. 3 2. SUMMARY In 2004 it has been reported the presence of HLB, also known as "greening", in citrus orchards at São Paulo state. In Brazil, this disease is caused by bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus and Candidatus Liberibacter americanus, which are transmitted by the psyllid-of-citrus Diaphorina citri. The main way to control the disease is through the control of the insect vector, which is currently carried out using chemicals. The mortality of psyllid adults by entomopathogenic fungi have been observed in the field and studies are being developed, but little is known about the effect of these pathogens in the insect vector control. Thus, we performed a study to determine the pathogenicity of entomopathogenic fungi on adults and nymphs of D. citri in laboratory and semi-field as well as its compatibility with pesticides used in citriculture. Laboratory created nymphs and adults of D. citri were exposed to a constant concentration of the pathogen 6,7x107 conidia/ml and it was observed the mortality of these insects. Through this mortality it was determined the median lethal time for 8 isolates, confirmed with the best mortality percentage. Laboratory compatibility was observed by incorporating chemicals to PDA culture medium which, after solidification, were inoculated with the fungus at three equidistant points of the Petri dish, which was kept in BOD chamber 4 for a period of seven days. After this period, its vegetative growth, sporulation, viability of the pathogen has been evaluated. It has been observed in laboratory that all products affected the development of the fungi and it was possible to classify products as moderately toxic, toxic and compatible. Keywords: Huanglongbing, greening, microbial control, entomopathogenic fungi, citrus- psyllid. 5 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Porcentagem de plantas com sintoma de HLB para regiões do Estado de São Paulo (adaptado de FUNDECITROS, 2012). .................................................................................................................. 21 Tabela 2. Isolados utilizados nos ensaios de patogenicidade. ............................................................... 35 Tabela 3. Isolados utilizados nos ensaios de compatibilidade em condições de laboratório. ............... 40 Tabela 4. Produtos utilizados na cultura de citros para o controle de Diaphorina citri, doses recomendadas segundo lista de produtos registrados para a cultura (MAPA). ..................................... 42 Tabela 5. Média de mortalidade confirmada de ninfas de Diaphorina citri por fungos entomopatogênicos, na concentração de 6,7x107 conídios/mL, no 10° dia de avaliação (T=25° ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .................................................................................................... 46 Tabela 6. Porcentagem de mortalidade confirmada de ninfas de D. citri por fungos entomopatogênicos, na concentração de 6,7x107 conídios/mL, no 10° dia de avaliação (T=25° ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .......................................................................................................................................... 50 Tabela 7. Tempos letais médios (TL50) em dias e equação da regressão linear obtidos pela análise Probit para a mortalidade de ninfas de D. citri. ............................................................................................... 50 Tabela 8. Mortalidade confirmada de adultos de Diaphorina citri por fungos entomopatogênicos, na concentração de 6,7x107 conídios/mL, no 10° dia de avaliação (T=25° ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). ............................................................................................................................................... 55 Tabela 9. Valores médios do crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade de colônias do isolado IBCB 276 de Beauveria bassiana na presença de produtos químicos utilizados na citricultura em condições de laboratório, após 7 dias (T=25 ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .................. 61 Tabela 10. Valores médios do crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade de colônias do isolado IBCB 348 de Metarhizium anisopliae na presença de produtos químicos utilizados na citricultura em condições de laboratório, após 7 dias (T=25 ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .................. 62 Tabela 11. Valores médios do crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade de colônias do isolado IBCB 425 de Metarhizium anisopliae na presença de produtos químicos utilizados na citricultura em condições de laboratório, após 7 dias (T=25 ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .................. 63 Tabela 12. Valores médios do crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade de colônias do isolado IBCB 616 de Lecanicillium lecanii na presença de produtos químicos utilizados na citricultura em condições de laboratório, após 7 dias (T=25 ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .................. 65 Tabela 13. Valores médios do crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade de colônias do isolado IBCB 619 de Lecanicillium lecanii na presença de produtos químicos utilizados na citricultura em condições de laboratório, após 7 dias (T=25 ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .................. 67 6 Tabela 14. Valores médios do crescimento vegetativo, esporulação e viabilidade de colônias do isolado IBCB 618 de Lecanicillium sp. na presença de produtos químicos utilizados na citricultura em condições de laboratório, após 7 dias (T=25 ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). ................................... 68 Tabela 15. Valores do Índice Biológico e classificação de produtos químicos utilizados na citricultura em condições de laboratório. ................................................................................................................. 70 7 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Número de plantas eliminadas no estado de São Paulo – Adaptado de levantamento CDA 14/03/2016............................................................................................................................................. 23 Figura 2. Método de criação: A) e C) plantas mantidas em casa de vegetação; B) brotações; D) plantas nas gaiolas de criação de adultos; E) ninfas e “honeydew” .................................................................. 33 Figura 3. Lâmina para microcultivo ...................................................................................................... 34 Figura 4. Gaiolas individualizadas para testes de TL ............................................................................ 37 Figura 5. Sequência da pulverização das suspenções sobre Murraya paniculata contendo ninfas de Diaphorina citri. ................................................................................................................................... 38 Figura 6. Sequência de montagem de patogenicidade adultos de Diaphorina citri. ............................. 39 Figura 7. Adulto de Diaphorina citri e ovos. ........................................................................................ 44 Figura 8. Ninfas e ovos de Diaphorina citri. ........................................................................................ 44 Figura 9. Ninfa de 5º instar de Diaphorina citri ................................................................................... 45 Figura 10. Mortalidade confirmada de Diaphorina citri após aplicação do isolado IBCB 66 - B. bassiana. A) ninfa de D. citri morta com coloração avermelhada caracterizando a presença de micotoxina; B) ninfa de D. citri morta durante o processo de ecdise com mortalidade confirmada e C) ninfa de D. citri com mortalidade confirmada......................................................................................................................... 47 Figura 11. Mortalidade confirmada de ninfas de Diaphorina citri após aplicação de isolados de fungos entomopatogênicos. A) Ninfa de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 130 – Isaria fumosorosea; B) Ninfa de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 224 – Beauveria bassiana; C) Ninfa de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 386 – Beauveria brongniartii; D) Ninfa de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 364 – Metarhizium anisopliae; E) Ninfa de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 619 – Lecanicillium lecanii; F) Ninfa de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 632 – Cladosporium sp. ............................................................................................................................................................... 48 Figura 12. Média de mortalidade confirmada de ninfas de Diaphorina citri com os isolados de fungos entomopatogênicos, na concentração de 6,7x107 conídios/mL, no 10° dia de avaliação (T=25° ±1°C; UR=70 ±10%; fotofase de 12 horas). .................................................................................................... 49 Figura 13. Mortalidade confirmada de adultos de Diaphorina citri após aplicação de isolados de Isaria sp. A) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 130 – Isaria fumosorosea; B) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 201 – Isaria fumosorosea; C) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 638 – Isaria fumosorosea; D) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 220 – Isaria farinosus; E) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 236 – Paecilomyces lilacinus. ......................................... 56 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042808 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042808 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042814 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042815 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042816 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042818 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042820 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042820 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042820 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042820 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042820 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042820 8 Figura 14. Mortalidade confirmada de adultos de Diaphorina citri após aplicação de isolados de Beauveria sp. A) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 66 – Beauveria bassiana; B) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 224 – Beauveria bassiana; C) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 276 – Beauveria bassiana; D) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 331 – Beauveria brongniartii; E) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 106 – Beauveria brongniartii; F) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 386 – Beauveria brongniartii. .......................................................................................................................................... 57 Figura 15. Mortalidade confirmada de adultos de Diaphorina citri após aplicação de isolados de Metarhizium sp. A) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 185 – Metarhizium anisopliae; B) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 348 – Metarhizium anisopliae; C) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 364 – Metarhizium anisopliae; D) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 425 – Metarhizium anisopliae. ........................................................................................................................ 58 Figura 16. Mortalidade confirmada de adultos de Diaphorina citri após aplicação de isolados de Lecanicillium sp. A) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 616 – Lecanicillium lecanii; B) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 619 – Lecanicillium lecanii; C) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 618 – Lecanicillium lecanii; D) Adulto de D. citri com mortalidade confirmada pelo isolado IBCB 76 – Lecanicillium sp. ................................................................................................................................... 59 Figura 17. Adulto de Diaphorina citri com mortalidade confirmada após aplicação do isolado IBCB 632 – Cladosporium sp. ............................................................................................................................... 59 Figura 18. Crescimento do isolado IBCB 276 de Beauveria bassiana, após sete dias de cultivo, em meio de cultura contendo produtos químicos utilizados na citricultura. A) Testemunha – Meio contendo B.D.A.; B) Danimen 300 EC; C) Neem. ............................................................................................... 60 Figura 19. Crescimento do isolado IBCB 619 de Lecanicillium lecanii, após sete dias de cultivo, em meio de cultura contendo produtos químicos utilizados na citricultura. A) Testemunha; B) Malathion 1000 EC; C) Provado 200 SC; D) Tiger 100 EC; E) Neem; F) Engeo Pleno SC; G) Actara 250 WG; H) Sumidan 150 SC; I) Delegate 250 WG; J) Winner 200 SL; K) Lorsban 480 BR; L) Danimen 300 EC. ............................................................................................................................................................... 66 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042821 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042822 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042822 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042822 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042822 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042822 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042822 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042823 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042823 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042823 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042823 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042823 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042823 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042824 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042824 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042825 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042825 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042825 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042826 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042826 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042826 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042826 file:///C:/Ana%20Paula/Doutorado%20UNESP/TESE/Tese_27-03-2016.docx%23_Toc447042826 9 3. INTRODUÇÃO Os citros são de grande importância econômica mundial, sendo atualmente produzido em 140 países, e segundo projeções do Ministério da Agricultura, a produção de laranja deverá passar de 13,7 milhões de toneladas na safra 2015 para 13,6 milhões de toneladas em 2025 (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2015). Os maiores produtores são Brasil, Estados Unidos, China, México e os países do Mediterrâneo (ABDULLAH et al., 2009). Desde a década de 80, o Brasil tornou-se o maior produtor mundial de citros, sendo o líder mundial de produção e exportação de suco de laranja concentrado congelado. A citricultura representa um setor altamente organizado e competitivo, considerada uma das mais destacadas agroindústrias brasileiras. Dentre os estados da federação, São Paulo é o que abriga o maior parque citrícola, considerado também um dos maiores do mundo. Apontada como motivo de orgulho para o país, a cadeia dos citros traz, por meio das exportações, bilhões de dólares à nossa economia. (NEVES et al., 2010). O setor citrícola, representou em 2013, 3% do PIB agroindustrial do estado de São Paulo. Indicando um desempenho de -22% ao ano. A produção de suco de laranja faturou, em 2013 US$ 2 bilhões, ocupando 8% da área plantada do estado (CEPEA, 2014). A citricultura gera, entre empregos diretos e indiretos, um contingente de aproximadamente 400 mil postos de trabalho, e uma massa salarial anual de R$ 676 milhões em 2010 (NEVES et al., 10 2010). Produtores de citros faturaram US$ 2 bilhões em 2009 e o faturamento total da cadeia produtiva de citros foi de US$ 14,6 bilhões. No Brasil, em 2010, foram quase 165 milhões de árvores produzindo, e na Flórida – EUA foram 60 milhões (NEVES et al., 2010). Apesar de toda essa importância econômica da citricultura para o Brasil, há muitos aspectos deste setor que merecem mais atenção, como os problemas fitossanitários que reduzem o lucro e tornam as exportações mais difíceis, pois as pragas e doenças exóticas que foram introduzidas no Brasil durante as últimas décadas têm causado muitas perdas econômicas para os produtores (NAVA et al., 2007). A agricultura visa uma maior produção e para atingir a meta os agricultores têm que conviver com pragas que assolam as plantações e a utilização em massa de produtos fitossanitários vem causando danos ao ambiente e à saúde da população, devido à possibilidade de contaminação direta da aplicação, bem como à contaminação indireta das águas e alimentos (SANTOS, 2014). Dentre as doenças presentes na cultura está o Huanglongbing (HLB) popularmente conhecido como “greening” (TSAI; LIU, 2000; ALEMÁN et al., 2007; BOINA et al., 2009). Essa doença, atualmente, é a maior responsável pelas perdas na citricultura, sendo que sua presença foi relatada em literatura em Março de 2004 no Brasil, no estado de São Paulo, na cidade de Araraquara (BOVÉ, 2006; ALEMÁN et al., 2007; NAVA et al., 2007). Algumas técnicas têm sido estudadas e recomendadas para o controle da doença, dentre elas variedades resistentes, porta-enxertia, óleos minerais, a injeção de antibióticos, redução da fonte de inoculo e o controle do inseto vetor. A redução da fonte de inoculo tem sido um método comumente utilizado e exigido em legislação, mas para esse tipo de controle recomenda-se a retirada da planta doente, diminuindo assim os pomares de citros (HALBERT & MANJUNATH, 2004; ABDULLAH et al., 2009). O controle do vetor é a técnica que vem sendo mais estudada atualmente (COCCO; HOY, 2008; AVERY et al., 2009; SANCHES et al., 2009). Dentre as principais técnicas de controle deste inseto está o controle químico por ser considerada uma ferramenta importante para reduzir a população do inseto, disseminação e transmissão dos patógenos (YAMAMOTO et al., 2009). Contudo, o uso intensivo de produtos fitossanitários tem sérias restrições pela contaminação do meio ambiente e danos à saúde humana, além de poder afetar organismos não alvo, como insetos benéficos, animais silvestres e de criação. Assim, o controle 11 biológico se apresenta como uma ótima alternativa, permitindo reduzir os danos causados pelo inseto vetor, mantendo a viabilidade econômica do sistema produtivo, sem causar impactos negativos ao ambiente (SOUZA & REIS, 1986; PEREIRA et al., 2004). Para o desenvolvimento de estratégias de manejo fitossanitário eficientes se faz necessária interações entre produtos químicos e biológicos, com a disponibilização de produtos compatíveis aos seus inimigos naturais, como os fungos entomopatogênicos, pois alguns produtos fitossanitários afetam o crescimento vegetativo, a viabilidade e a conidiogênese destes agentes, ou até alterar sua composição genética, acarretando modificações na sua virulência (BATISTA et al., 2003). Diferentemente de outros agentes microbianos, os fungos são patógenos de largo espectro, capazes de colonizar diversas espécies de insetos e de causar com frequência, epizootias em condições naturais (ALVES et al., 2008). A grande variabilidade genética destes organismos determinam diferenças no grau de virulência do patógeno, interferindo na eficiência de controle de insetos, sendo assim, a seleção de isolados adaptados às condições climáticas e de cultivo em cada região torna-se necessária, para que se conheça a potencialidade dos diferentes materiais genéticos e se possa eleger os mais adequados para a utilização em programas de controle biológico (ALMEIDA et al., 1998; FERNANDES et al., 2006). No manejo integrado de pragas, a preservação de inimigos naturais tem sido uma das práticas de maior importância e a aplicação de produtos fitossanitários de alta toxicidade e de largo espectro estão sendo reconhecidos como a principal causa de desequilíbrios biológicos assim, a utilização de compostos seletivos é de grande importância para diminuir a ressurgência de pragas e seleção de insetos resistentes. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito patogênico de cinco espécies de fungos entomopatogênicos sobre ninfas e adultos de Diaphorina citri em condições de laboratório e a compatibilidade desses fungos com produtos fitossanitários utilizados na citricultura brasileira. 12 4. REVISÃO DE LITERATURA 4.1. Citricultura A produção brasileira de citros se concentra no estado de São Paulo e maior parte dessa produção destina-se ao mercado de suco. Os principais mercados importadores são os países da União Europeia e da Ásia (FNP CONSULTORIA & COMÉRCIO, 2008; NEVES et al., 2004). Sua importância vai além da geração de divisas para a economia brasileira, o setor tem grandes impactos na criação de empregos, formação de capital, geração de renda, agregação de valor e no desenvolvimento regional (ZULIAN, DÖRR; ALMEIDA, 2013). De cada cinco copos de suco de laranja consumidos no mundo, três são produzidos nas fábricas brasileiras. O Brasil é o maior produtor mundial de laranjas do mundo seguido por Estados Unidos, China, Índia, México, Egito e Espanha e concomitantemente maior exportador de suco de laranja. A produção de citros ocorre principalmente no estado de São Paulo, onde encontram-se cerca de 85% da produção brasileira de laranjas. Outros estados como Bahia, Minas Gerais, Pará, Paraná e Rio Grande do Sul contribuem para o agronegócio dos citros com a produção, principalmente, de laranjas, tangerinas e limões (BRASIL, 2015). 13 A produção de laranja deverá passar de 13,7 milhões de toneladas na safra 2015 para 13,6 milhões de toneladas em 2025, segundo projeções do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Essa variação corresponde a uma tendência de queda, já que a área plantada de laranja deve sofrer uma redução nos próximos anos. Deverá passar dos atuais 615 mil hectares para 480 mil. O Estado de São Paulo, principal produtor do país, vem reduzindo a área de colheita da laranja. O estado tinha uma área de laranja de 722,8 mil hectares em 1990, e em 2013 caiu para 456,8 mil hectares, redução de 36,8% na área. A produção no estado tem-se mantido em torno de 13,0 milhões de toneladas ao ano (IBGE, 2015; Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2015). A densidade de árvores por hectare aumentou expressivamente nos últimos anos. Era de 250 árvores/hectare em 1980, 357 árvores em 1990, 476 árvores em 2000 e atualmente existem pomares com quase 850 árvores por hectare (NEVES et al., 2010). O atual modelo produtivo com alta escala de produção, pomares mais adensados, irrigação e exclusividade de produção para a indústria de suco é insuficiente para reduzir os custos de produção e os ganhos de produtividade futura serão muito limitados por conta da maior incidência do HLB nos pomares, principalmente levando em conta a falta de ações coletivas no intuito de reduzir os gastos com a cultura e melhorar a rentabilidade do setor produtivo. O HLB afeta tanto o custo operacional do citricultor que implica em mais gastos para manter o controle da doença com inspeções, pulverizações, erradicações e replantio, quanto na receita, porque limita a produtividade dos pomares. A saída definitiva para enfrentar o HLB é o desenvolvimento de cultivar de laranja resistente, mas essa solução pode levar anos. É muito improvável que ocorra em nível comercial ainda nesta década, um controle fitossanitário coletivo, bem como investimentos em novas formas de redução de custo que deverão ser os próximos passos no intuito de manter a sustentabilidade econômica da produção da laranja (CEPEA, 2011). 4.2. Doenças e pragas dos citros Plantas do gênero Citrus spp. são afetadas por numerosas pragas e doenças que causam danos diretos ou indiretos, estando entre as culturas que mais têm perdas pelo ataque de insetos, ácaros e patógenos sendo altamente dependente dos produtos fitossanitários para a redução populacional das pragas e diminuição dos danos e prejuízos, em 14 certos casos, para evitar a transmissão de fitopatógenos (YAMAMOTO et al., 2009; PARRA et al., 2003). As pragas e doenças foram responsáveis pela erradicação de 40 milhões de árvores de citros nos últimos anos. A mortalidade de plantas cítricas saltou de 4% para 7,5%. Esses problemas fitossanitários foram responsáveis por perdas de quase 80 milhões de caixas por ano. Uma das preocupações mais sérias do setor é o HLB, que avança com extrema rapidez (NEVES et al., 2010). Muitas dessas pragas são consideradas importantes em razão dos prejuízos causados à cultura. Dentre os ácaros, o ácaro-da-leprose e o ácaro-da-falsa-ferrugem são pragas-chave, transmitindo o vírus da leprose dos citros e causando manchas de coloração escura que inviabiliza o consumo “in natura”, respectivamente. Outros ácaros são considerados pragas importantes, como o ácaro-branco e o ácaro-purpúreo; ácaro-texano e o ácaro-mexicano também causam danos à citricultura. Alguns dípteros também causam danos, destacando a Ceratitis capitata, Anastrepha fraterculus, A. obliqua e a Neosilba spp. consideradas pragas- chave encontradas no Brasil. Suas larvas alimentam-se da polpa dos frutos deixando-os impróprios para a indústria e para o consumo “in natura” (PARRA et al., 2003). Lepidópteros são frequentemente encontrados causando danos aos citros, como a lagarta-minadora Phyllocnistis citrella, que ao se alimentar das folhas abre minas prateadas, que favorecem a disseminação do cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri; já o bicho-furão Ecdytolopha aurantiana ao se alimentar causa o apodrecimento dos frutos, ambos são considerados como pragas-chave. Heraclidesthoas brasiliensis, H. anchysiadescapys conhecidos como lagartas-das-folhas, dentre outras, também causam danos à cultura (PARRA et al., 2003). Além das pragas anteriormente citadas, há outras que são classificadas também como pragas-chave como as cochonilhas de carapaça Selenaspidus articulatus, Parlatoria ziziphi, P. cinerea, Unaspis citri e as cochonilhas sem carapaça Orthezia praelonga. Outras cochonilhas de carapaça causam danos em algumas propriedades, mas não são classificadas como pragas-chave como Pinnaspis aspidistrae, Chrysomphalus aonidum, Mycetaspis personata, Cornuaspis beckii, Insulaspis gloverri, Pseudaonidia trilobitiformis dentre as cochonilhas sem carapaças espécies como Icerya purchasi, I. brasiliensis, Coccus viridis, Saissetia coffeae, S. oleaeoleae, Pulvinaria sp. Planococcus citri são encontradas nos pomares causando danos (PARRA et al., 2003). 15 Naupactus cervinus, Diploschema rotundicolle, Macropophora accentifer da ordem Curculionidae são classificadas como pragas importantes. Há também as cigarrinhas da clorose variegada dos citros (CVC) Dilobopterus spp., Oncometopia spp., Bucephalogonia spp. e Acrogonia spp. (PARRA et al., 2003). O huanglongbing (HLB) e a CVC, juntamente com o cancro cítrico, são as principais doenças bacterianas que ocorrem em citros no Brasil e segundo Yamamoto et al. (2009), podem inviabilizar a produção citrícola do país. Segundo os autores, a CVC e o HLB são doenças importantes, pois, além de causar danos e prejuízos diretos, apresentam vetores que disseminam seus agentes causais. 4.3. Huanglongbing (HLB) 4.3.1. Características gerais Huanglongbing (HLB), “ex-greening”, é uma doença severa do citros, causada pela bactéria gram negativa do gênero Candidatus Liberibacter, restrita ao floema das árvores, possuindo dois hospedeiros nos quais ela se multiplica: a planta e o inseto vetor (BOVÉ; GARNIER, 2002; GARNIER et al., 2000; SANCHES et al., 2009). De acordo com Bové e Garnier (2002), essas bactérias são patogênicas às plantas, e causam poucos danos aos insetos hospedeiros, nos quais elas mostram-se semelhantes a bactérias simbiônticas aos mesmos. Atualmente são conhecidas três raças de bactérias causadoras do “greening”: asiática (Candidatus Liberibacter asiaticus), africana (Candidatus Liberibacter africanus) e americana (Candidatus Liberibacter americanus), ocorrendo respectivamente na Ásia, África e Américas, sendo a última descoberta recentemente (JAGOUEIX et al., 1994; TEIXEIRA et al., 2005b; FUNDECITRUS, 2005). Ao contrário do patossistema citros - Xylella fastidiosa - cigarrinha, que apresenta 12 vetores da bactéria, no HLB existe somente um vetor, no caso do Brasil, o psilídeo- dos-citros Diaphorina citri (YAMAMOTO et al., 2009). A bactéria causadora do HLB pertence à subdivisão alfa de Proteobacteria, cuja característica principal consiste em ser um organismo que vive intimamente associado às células eucarióticas e, em muitos casos, adquirem a habilidade de sobreviver e crescer dentro de artrópodes hospedeiros, além do floema das plantas hospedeiras (BOVÉ; GARNIER, 2002). Embora existam registros do século XVIII 16 sobre a doença, pouco se pode afirmar sobre a real manifestação do “greening” nesse período devido à falta de informações, muitas vezes confundidas com a deficiência de zinco, falta de drenagem, doenças ocasionadas por nematoides, toxicidade mineral do solo, entre outros fatores (GRAÇA, 1991). A bactéria apresenta persistência não propagativa, (se reproduzindo dentro do inseto sem se transmitir às outras gerações), e sua transmissão ocorre pelo processo de alimentação quando o inseto passa de uma árvore para outra e não se dissemina pelas sementes ou por meio do vento, da água, pelos trabalhadores ou pela utilização de instrumentos agrícolas (GARAY, 2009) O primeiro relato da doença no Brasil, bem como o primeiro caso das Américas, foi feito em março de 2004, no município de Araraquara, Estado de São Paulo, sendo diagnosticada a bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus e posteriormente, o descobrimento da nova espécie, até então desconhecida, Candidatus Liberibacter americanus (COLETTA- FILHO et al., 2004; TEIXEIRA et al., 2005a). Em 2005, foi confirmado o primeiro caso na Flórida pelo US Department of Agriculture’s Animal and Plant Healthy Inspection Services e pelo Florida Department of Agriculture and Consumer Services (KNIGHTEN et al., 2005). O período de latência do patógeno em citros é variável, podendo o mesmo expressar os sintomas de quatro meses a um ano após a infecção. Uma vez infectadas, as plantas jovens morrem em dois a quatro anos (HUANG et al., 1990). 4.3.2. Danos O problema é a transmissão do “greening”, doença que preocupa todo o ramo da citricultura brasileira e mundial. Parra et al. (2010) relatam que 5% das plantas cítricas do estado de São Paulo encontravam-se com sintomas da doença. Bassanezi et al. (2006) observaram uma redução de 70% na produção de frutos em plantas com quatro a seis anos de idade com mais de 60% da copa com sintomas da doença. Os danos nas árvores de citros são variáveis, podendo atingir e se manifestar apenas em alguns locais causando pequenos danos; em outros casos, pode atacar a planta inteira, ocasionando a perda total da produção, inclusive a morte da planta. Os sintomas nas folhas podem ser de dois tipos: sintomas primários, caracterizados pelo amarelecimento ao longo das nervuras e às vezes com desenvolvimento de manchas irregulares; e secundários, com 17 o surgimento de folhas pequenas, verticais e com clorose similar à deficiência de zinco e de ferro (GRAÇA, 1991). Os frutos são reduzidos, assimétricos e de sabor amargo, provavelmente pela alta acidez e baixa quantidade de açúcar. Apresentam queda prematura e os que continuam na árvore não desenvolvem a coloração madura, permanecendo verdes – dando o nome da doença de “greening”. Outro ponto prejudicado são as raízes, que apresentam pequeno desenvolvimento (BOVÉ et al., 1974). 4.4. Psilídeo dos citros: características gerais e biologia 4.4.1. Morfologia Diaphorina citri Kuwayama (Waterston) (Hemiptera: Liviidae) foi descrita ocorrendo em citros em Shinchiku Taiwan, 1907. Há seis outras espécies de Diaphorina relatadas em citros e em plantas da família Rutaceae, sendo referidas cerca de 21 espécies de hospedeiros, embora não ocorra o desenvolvimento completo (PARRA et al., 2010). São insetos sugadores dos vasos condutores das plantas e possuem pernas metatorácicas modificadas para saltar. Os adultos medem de dois a quatro milímetros e têm o corpo manchado de marrom, cabeça marrom claro, asa dianteira alargada da metade até o ápice, antena com ápice preto e com duas pequenas manchas marrom claras no meio dos segmentos, além de apresentarem secreção cerosa na forma de um pó (AUBERT, 1987; GALLO et al., 2002). Quando parados, apresentam a disposição de 45º em relação ao substrato que se encontram (MEAD, 2002). Os ovos medem cerca de 0,31 mm de altura e 0,14 mm de largura (TSAI; LIU, 2000). São alongados, engrossados na base, cônicos na parte distal e, assim que ovipositados, são de coloração pálida tornando-se amarelo-alaranjados com o tempo. A postura é feita verticalmente na superfície das folhas e/ou brotos (MEAD, 2002). As ninfas passam por cinco ínstares, sendo que no primeiro ínstar apresentam coloração amarelo claro, tornando-se mais escuras posteriormente. Nesse mesmo ínstar, medem 0,3 mm de comprimento por 0,17 mm de largura. As de segundo instar apresentam dimensões de 0,45 x 0,25 mm, as de terceiro 0,74 x 0,43 mm, as de quarto ínstar 1,01 x 0,7 mm. O quinto e último ínstar pode alcançar medidas de 1,6 x 1,02 mm. 18 4.4.2. Hospedeiro Apesar de ser considerada uma praga de citros, sua ocorrência em murta (Murraya paniculata L.; Família: Rutaceae), planta de origem asiática, foi descrita pela primeira vez em 1975. A M. paniculata (L.) conhecida como murta-de-cheiro é bastante utilizada como cerca viva ou como planta ornamental no Brasil, sendo um dos principais hospedeiros deste psilídeo (PARRA et al., 2010). Em vários Estados brasileiros, como no Paraná, há proibição do plantio da Murta, através da Lei Estadual 15.953 de 2008, que determina o fim da Murta no Estado, fixando um prazo para a erradicação. 4.4.3. Ovos Os ovos têm coloração amarela alaranjada e são depositados em brotações recentes (PARRA et al., 2010). O número de posturas totais das fêmeas também é bastante variável. Para Huang (1990) (apud YANG et al., 2006) esse valor é de 1900 ovos, com média entre 630 e 1230 ovos; já Tsai e Liu (2000) calculam em 800 ovos. O período de incubação dos ovos também variou de 3,5; 4,2 e 9,7 dias a 28ºC, 25ºC e 15ºC, respectivamente. A postura também é influenciada pelas plantas hospedeiras. Para Citrus jambhiri o número de ovos por fêmea e o número máximo de posturas foi de 572 e 818, respectivamente. Para Citrus aurantium, M. paniculata e Citrus paradisi, esses valores foram de 613 e 830, 626 e 994, 858 e 1378, respectivamente (PARRA et al., 2010). 4.4.4. Ninfas As ninfas são praticamente imóveis, ficando grande parte do tempo agregadas e se alimentando na superfície abaxial das folhas, parte terminal do pecíolo e entre a gema axilar e os brotos novos (TSAI; LIU, 2000). Quando perturbadas, podem se deslocar mais rapidamente. Ao se agruparem, o acúmulo da secreção adocicada (“honeydew”) liberada na porção terminal do abdome pode favorecer a formação de fungos oportunistas, formando a fumagina (Capnodium elaeophilum) que afeta o processo fotossintético da planta hospedeira, que pode levar ao secamento das estruturas vegetais atacadas (MEAD, 2002). 19 A variação dos ínstares das ninfas está entre 16 e 18 dias em épocas quentes e até 45 dias em épocas mais frias. O trabalho de Tsai e Liu (2000) relata a variação no tempo de desenvolvimento das ninfas do psilídeo em diferentes hospedeiros. Em C. paradisi, o tempo foi de 12,6 dias, enquanto que em M. paniculata, C. aurantium e C. jambhiri foi de 12,8; 13,1 e 13,5; respectivamente. Parra et al. (2010) relatam que o período de desenvolvimento em Citrus limonia (limão cravo), M. paniculata e Citrus sunki (tangerina Sunki) não foi afetado com relação à duração, sendo próxima a 18 dias nos três hospedeiros; os mesmos autores relatam que a razão sexual também não foi influenciada pelo hospedeiro, sendo igual a 0,5. Tsai e Liu (2000) constataram que o tempo de desenvolvimento de ovo a adulto variou conforme o hospedeiro, sendo de 16,8; 16,9; 17,3 e 17,6 dias em C. paradisi, M. paniculata, C. aurantium e C. jambhiri, respectivamente, apresentando uma variação para a M. paniculata. A viabilidade foi reduzida quando o inseto se desenvolveu em C. sunki, que apresentou uma mortalidade ninfal de 45%, sendo o hospedeiro menos adequado para a praga (PARRA et al., 2010). As ninfas e adultos causam danos diretos por suas picadas sucessivas na planta hospedeira, injetando toxinas ao se alimentarem, causando deformação das folhas jovens, seca de brotações, retorcimento e engruvinhamento. As folhas deformam-se pela retirada da seiva elaborada de plantas hospedeiras (PARRA et al., 2010; SANCHES et al., 2009). 4.4.5. Adultos Plantas jovens com brotações novas estimulam a oviposição, com a postura das fêmeas a dois cm do ápice das folhas, pecíolos ou gemas (TSAI; LIU, 2000). Adultos avaliados em M. paniculata ocuparam 95% dos brotos, ovipositando de dois a quatro dias e gerando de 25 a 100 ninfas por broto (SKELLEY; HOY, 2004). O período de pré-oviposição é de cerca de 10 dias e a longevidade da fêmea é maior que a do macho, sendo a postura concentrada nos primeiros 10 dias de vida (PARRA et al., 2010), podendo apresentar 10 gerações por ano. Yasuda et al. (2005) demonstraram que adultos de D. citri se encontram dispersos em todas as partes da planta. Segundo Parra et al. (2010), são mais frequentemente associados a ramos em crescimento, podendo se alimentar em folhas maduras, porém, os ovos 20 e as ninfas dos mesmos se concentram nas brotações da parte apical. Tsai et al. (1984) (apud YANG et al., 2006) encontraram maior incidência de adultos na nervura central das folhas (43%), seguida dos pecíolos (31%), borda foliar (24%) e talo (<2%). O comportamento dos adultos varia conforme sua idade e a temperatura ambiente. Os recém-emergidos não voam ou caem rapidamente quando as folhas são tocadas, ficando concentrados na parte abaxial das folhas. As fases reprodutiva e madura caracterizam- se por um comportamento dispersivo, saltando e voando pequenas distâncias. No inverno os movimentos tornam-se mais lentos, com a tendência dos insetos a se agruparem na superfície abaxial das folhas. Adultos ficam inativos abaixo de 8ºC, retomando as atividades por volta de 11ºC, de acordo com Xu (1988) e Xie et al. (1988) (apud YANG et al., 2006). Os movimentos tornam-se mais rápidos, com saltos enérgicos por parte dos adultos, quando a temperatura atinge entre 24 e 29ºC. As fêmeas prestes a ovipositar não voam e ficam refugiadas nas brotações (SKELLEY; HOY, 2004). Apesar da preferência por brotações, quando submetidos às árvores mais velhas, os psilídeos acabam por se alimentar de folhas ou ramos maduros. Os adultos podem viver entre 80 e 90 dias quando há alimento disponível (AUBERT, 1987). As maiores longevidades de fêmeas observadas por Tsai e Liu (2000) foram de 54, 54, 60 e 66 dias em C. paradisi, M. paniculata, C. aurantium e C. jambhiri, respectivamente, sendo que a média ficou entre 39,6 e 47,5 dias. Para Liu e Tsai (2000), a longevidade das fêmeas foi de 88, 3 dias a 15ºC, sendo que os maiores valores foram de 117, 60, 56, 52 e 51 dias para 15ºC, 20ºC, 25ºC, 28ºC e 30ºC, respectivamente. Podem ocorrer de 9 a 10 gerações ao ano, dependendo da temperatura. 4.5. Distribuição D. citri foi relatada pela primeira vez no Brasil por Costa-Lima (1942) e posteriormente, por Catling (1970). Preferencialmente, D. citri ocupa regiões tropicais e subtropicais da Ásia, como China, Índia, Myanmar, Taiwan, Filipinas, Malásia, Indonésia, Sri Lanka, Paquistão, Tailândia, Nepal, Hong Kong, Ilhas Ryukyu, Afeganistão, Arábia Saudita, Ilhas Maurício e Ilhas Reunião (WOOLER; PADGHAM; ARAFAT, 1974). No Brasil, apesar de ter sido relatada há mais de 60 anos, a ocorrência e distribuição desse inseto está sendo melhor estudada somente agora, devido à real importância na produção citrícola. Dados da 21 FUNDECITRUS (2007) relataram a presença da doença em 154 municípios do estado de São Paulo e apenas um caso em Minas Gerais. Yamamoto; Paiva e Gravena (2001) demonstraram que há uma variação significativa na dinâmica populacional de D. citri em pomares na região norte do Estado de São Paulo, uma vez que a densidade mais alta ocorreu no final da primavera e começo do verão, enquanto que durante o outono e inverno a população foi reduzida. Essa oscilação provavelmente está relacionada ao regime de chuvas e, consequentemente, ao surgimento de novas brotações no pomar de citros. O último levantamento realizado pela FUNDECITRUS (2012) apontou que o “greening” já atingiu 64,1% dos talhões dos pomares paulistas, evoluindo rapidamente, já que em 2004 os relatórios apontavam 3,4% dos talhões contaminados. A incidência de plantas com sintomas saltou de 0,58%, em 2008, para 6,91%, em 2012 (FUNDECITRUS, 2012). A doença atinge maiores incidências nas regiões Centro e Leste e apresentou, respectivamente, 9,89% e 14,81% de plantas com sintomas, em 2012. Embora com incidências menores, as regiões Norte (1,78%) e Oeste (1,35%) apresentam taxas de avanço da doença semelhantes as das regiões Centro e Leste. Por outro lado, as regiões Sul e Noroeste têm incidências (respectivamente 0,85% e 0,28%) e taxas de crescimento menores que as demais regiões. O HLB aumenta no estado de São Paulo porque alguns produtores ainda não fazem o manejo correto do vetor, outros começam tardiamente e os que adotam as medidas, sofrem com vizinhos que não realizam o processo (TABELA 1). Tabela 1. Porcentagem de plantas com sintoma de HLB para regiões do estado de São Paulo (adaptado de FUNDECITRUS, 2012). Porcentagem de plantas com sintomas Centro Norte Nordeste Oeste Leste Sul 2008 1,12 0,00 0,01 0,01 0,73 0,07 2009 1,36 0,04 0,00 0,06 1,70 0,10 2010 3,51 0,39 0,01 0,34 2,76 0,29 2011 6,08 0,81 0,17 0,68 7,15 0,84 2012 9,89 1,78 0,28 1,35 14,81 0,85 22 4.6. Formas de controle e legislação 4.6.1. Legislação para o HLB O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento determinou através da Instrução Normativa (IN) 53, de 16 de outubro de 2008, os critérios e procedimentos para a realização, por parte dos Órgãos Estaduais de Defesa Sanitária Vegetal (OEDSV), dos levantamentos de ocorrência do HLB visando à delimitação da extensão das áreas afetadas e à adoção de medidas de prevenção e erradicação. A 53 estabeleceu alguns critérios:  A produção de material propagativo de citros, nas áreas onde for constatada a ocorrência do HLB, somente será permitida em ambiente protegido por tela de malha com abertura de, no máximo, 0,87 x 0,30 mm;  Comprovada a presença da bactéria, todas as plantas devem ser eliminadas;  Em viveiro, será eliminado o lote de produção no qual for confirmada, por laudo laboratorial oficial, a presença da bactéria, sendo os demais lotes liberados somente após quatro meses;  O trânsito de material propagativo de plantas hospedeiras oriundo de onde for constatada a praga obedecerá à legislação de certificação fitossanitária de origem e permissão de trânsito de vegetais;  O proprietário de áreas com ocorrência da praga deverá realizar no mínimo, vistorias trimestrais, para identificar e eliminar as plantas com sintomas de HLB e deverá apresentar dois relatórios anuais, comunicando os resultados das vistorias;  Caberá ao proprietário a responsabilidade de eliminar as plantas hospedeiras contaminadas, mediante arranquio ou corte rente ao solo, com manejo para evitar brotações, não lhe cabendo qualquer tipo de indenização;  Determina a eliminação das plantas sintomáticas e assintomáticas do mesmo talhão quando a incidência da doença é superior a 28%.  O não cumprimento desta IN acarretará ao infrator as sanções estabelecidas pela legislação estadual e federal de defesa sanitária vegetal. 23 Em cumprimento à Lei de Acesso à Informação, a Coordenadoria de defesa agropecuária (CDA) do estado de São Paulo disponibiliza os dados do último levantamento realizado a partir das informações prestadas pelos proprietários. Estas informações são úteis para o desenvolvimento de pesquisas e tomadas de decisões técnicas, na adoção de estratégias públicas em função da importância da citricultura no Estado (FIGURA 1). Segundo levantamento da CDA, em 2015 foram eliminadas 3.936.808 plantas com sintomas de HLB no estado de São Paulo. Só no segundo semestre de 2015 foram 1.792.495 plantas sendo 28% delas plantas de 8 a 12 anos, 25% plantas de 4 a 8 e 16% plantas de 12 a 16 anos. Segundo o levantamento, podemos observar uma redução no número de plantas, que chegou ao seu número máximo em 2013 com 7.786.294 plantas erradicadas. 4.6.2. Controle químico O Huanglongbing é a doença mais destrutiva dos citros pela severidade dos sintomas, pelo potencial de propagação da doença e por afetar todas as variedades comerciais (SANCHES et al., 2009). Figura 1. Número de plantas eliminadas no estado de São Paulo – Adaptado de levantamento CDA 14/03/2016. 24 Métodos de cura não são relatados na literatura ficando o controle cultural como única opção, além do plantio de mudas sadias, produzidas em viveiros protegidos (YAMAMOTO et al., 2009). No estado de São Paulo esse controle se baseia em três recomendações segundo Lopes et al. (2008): 1) eliminação do inóculo por remoção de árvores sintomáticas; 2) tratamentos químicos para reduzir a população do vetor; e 3) eliminação total de M. paniculata. Devido à baixa eficiência de transmissão dos patógenos por D. citri, o controle químico é uma ferramenta para diminuir a disseminação e transmissão dos patógenos, contudo, pouco se conhece sobre a eficiência de inseticidas sistêmicos ou de contato (YAMAMOTO et al., 2009). Apesar disso, o controle convencional do vetor do HLB é feito geralmente com inseticidas sistêmicos e de contato. Os sistêmicos são mais eficazes no controle de D. citri, por ser um inseto sugador, sendo a aplicação no tronco, solo ou via “drench” (TOLLEY, 1990; QURESHI & STANSLY; 2008, YAMAMOTO, 2006; BOINA et al., 2009). Dentre os inseticidas de contato, recomendam-se os neonicotinoides (tiametoxan, imidacloprid, acetamiprid, tiacloprid), organofosforados (acetato, dimetoato, etiona, malationa, clorpirifós, metidationa), piretróides (deltametrina, lambdacialotrina, fenpropatrina, esfenvalerato, gama- cialotrina) e carbamatos (carbosulfano, indoxacarbe) (YAMAMOTO, 2006; YAMAMOTO, 2009). Salvo et al. (2006) relatam a eficiência de imidacloprid via “drench” nas doses de 0,7 e 1,0 g i.a./metro, se mantendo eficiente por até 127 dias em pomares de um ano de idade. Yamamoto et al. (2009) destacaram a importância da escolha do inseticida a ser aplicado. Deve-se levar em consideração se o produto é seletivo aos inimigos naturais, compatível com fungos entomopatogênicos, custo e histórico de aplicação, efetuando a rotação. Esses mesmos inseticidas controlam também as cigarrinhas vetoras da bactéria X. fastidiosa, e estratégias de manejo conjunto devem ser adotadas para racionalizar a utilização dos defensivos agrícolas. Contudo, o uso indiscriminado desses produtos podem causar efeitos colaterais indesejáveis, como surto de pragas secundárias. Técnicas de controle convencional, bem como o manejo integrado e a associação de métodos biológicos, tem resultado em um controle satisfatório. 25 4.6.3. Controle biológico Na procura de métodos alternativos para solucionar problemas ocasionados pelo uso não criterioso de produtos fitossanitários, tem-se avaliado métodos biológicos (parasitoides, predadores e patógenos) e comportamentais para o manejo de pragas dos citros, embora os predadores que possam ser importantes em outros países, não têm se mostrado eficientes no Brasil (PAIVA, 2009; PARRA, 2010). A aplicação do controle biológico pode ser considerada como uma alternativa válida para restaurar a biodiversidade funcional em ecossistemas agrícolas, visto que, constitui uma medida ecologicamente sustentável que visa reduzir os insumos externos e melhorar a quantidade e qualidade dos recursos internos, mediante a utilização de organismos devidamente selecionados por sua eficiência e inocuidade, além da capacidade de serem gerados a partir de recursos locais e possuírem caráter endógeno (GUÉDEZ et al., 2008).Toda população de insetos na natureza é atacada de alguma maneira por um ou mais inimigos naturais. Assim, predadores, parasitoides e entomopatógenos atuam como agentes de controle natural que, quando são adequadamente manejados, podem determinar a regulação das populações de herbívoros em um agroecossistema particular. Esse tipo de controle é vantajoso para o combate de pragas e doenças em relação ao controle químico, especialmente quanto ao aspecto ambiental, uma vez que os produtos químicos têm efeito negativo sobre o solo, água, vegetação, animais e homem, além de provocar a seleção de indivíduos resistentes (FRANCESCHINI et al., 2001). Entre os agentes biológicos de controle de pragas, os fungos entomopatogênicos são considerados um dos mais importantes e com alto potencial de utilização. Eles são capazes de atacar diversas espécies de insetos, possuem baixa toxidade para outros organismos, baixo impacto ambiental, são versáteis, podendo infectar diferentes estágios de desenvolvimento dos hospedeiros e causam frequentemente epizootias naturais. Além disso, a probabilidade dos insetos adquirirem resistência é menor ou mais lenta do que a resistência adquirida aos produtos fitossanitários (JUNGES, 2010). A grande variabilidade genética desses entomopatógenos, citada por Alves (1998), também pode ser considerada umas das principais vantagens no controle microbiano de insetos e a capacidade de penetração via tegumento, altamente especializada, representa uma característica que coloca os fungos em vantagem quando comparados a outros agentes patogênicos. 26 Em áreas de clima tropical, epizootias naturais de Aschersonia spp., Isaria spp., Lecanicillium spp., Hirsutella spp., Nomuraea rileyi, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Cordyceps spp., e de muitas espécies de fungos da ordem Entomophthorales são frequentes, foram relatadas por Alves et al. (2008). É provável que na América Latina, para cada praga, haja no mínimo um patógeno capaz de exercer o seu controle sustentável. Lecanicillium lecanni (Zimmermann) Zare & Gams (Hypocreales: Cordycipitaceae) é um dos agentes fúngicos mais efetivos e promissores para controle de insetos e ocorre frequentemente em afídeos, coccídeos e aleirodídeos, além de controlar nematoides e fungos fitopatogênicos. É considerado como um complexo de espécies, que inclui L. lecanni, L. muscarium e L. longisporum (HALL, 1981; GRAJEK, 1994; ZARE & GAMS, 2001). Esse fungo possui a capacidade de causar grandes mortalidades em pulgões sob condições naturais e em trips, moscas-brancas e ácaros. Ele requer umidade relativa entre 85 e 90% e necessita de temperatura entre 20 e 25 °C para causar alta mortalidade. Ao avaliar a patogenicidade de 50 isolados de 8 espécies de fungos entomopatogênicos (B. bassiana, M. anisopliae, Isaria fumosorosea, Paecilomyces lilacinus, L. lecanii, Lecanicillium sp., Cladosporium cladosporioides, Sporothrix sp.) para o controle de ninfas de 2° e 3° instar de Praelongorthezia praelonga (Hemiptera: Ortheziidae) Garcia (2004), verificou que os melhores resultados foram obtidos com os isolados de L. lecanni proporcionando 46,6 % de mortalidade, após 12 dias de aplicação. Cuthbertson e Walters (2005), também constataram que o fungo tem potencial para ser um importante agente de controle biológico de Bemisia tabaci. O efeito do entomopatógeno Lecanicillium spp. sobre o parasitoide Aphidius colemani foi estudado por Aiuchi et al. (2012), onde foram observados parâmetros como, longevidade dos adultos, comportamento de oviposição, velocidade de emergência e longevidade da geração F1 sob condições de laboratório, concluindo que a utilização do entomopatógeno e do parasitoide pode ser feita concomitantemente para o controle de pulgões, pois ambos são altamente compatíveis. O fungo I. fumosorosea Wize (Hypocreales: Cordycipitaceae), foi descrito como Paecilomyces fumosorosea por M. Wize em 1904 na Ucrânia, no gorgulho da beterraba, sendo uma espécie complexa, ou seja, existe uma grande variabilidade entre os isolados da mesma espécie. Pode ser encontrado no solo, nas plantas, no ar (ZIMMERMANN, 2008). Ele se mostrou eficiente no controle de térmitas, de acordo com Wright et al. (2003) e 27 sobre ninfas de Bemisia argentifolli nas culturas de tomate, repolho e pepino, quando cultivadas em casa de vegetação, de acordo com Vidal et al. (2008). Nos últimos anos, as pesquisas revelaram que isolados deste fungo foram patogênicas a ninfas e adultos de Diaphorina citri em condições de semi-campo e campo no Brasil (HOY et al., 2010; CONCESCHI, 2013; AUSIQUE, 2014). O gênero Beauveria (Hypocreales: Cordycipitaceae) é o mais comumente encontrado em insetos mortos no ambiente natural, além disso, ocorre enzooticamente ou causando epizootias em espécies de praga. A espécie Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin é um patógeno amplamente estudado como agente de controle biológico para muitas espécies de insetos pragas, sendo um dos fungos de ocorrência generalizada em todos os países. Podem ocorrer em lepidópteros, coleópteros, hemípteros, dípteros, himenópteros e ortópteros. Seus conídios podem penetrar em qualquer parte da cutícula do inseto, ou até mesmo pelo aparelho respiratório e digestório. Juntamente com M. anisopliae (Metsch.) Sorokin (Hypocreales: Clavicipitaceae) são as espécies mais estudadas e utilizadas no controle de pragas (SAMSINAKOVA, 1966; IGNOFFO, 1998; PIRES, 2002). Segundo Potrich et al. (2011), foi avaliada a virulência dos fungos entomopatogênicos B. bassiana, M. anisopliae e Isaria sp a B. tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), concluindo que os isolados de B. bassiana e Isaria sp. foram os que apresentaram maior potencial para o controle da praga com valores de mortalidade 84,1% e 98,6% respectivamente, quando utilizados na concentração de 1 x 109 conídios/mL. Dentre as formas de controle biológico, está o uso de predadores e parasitoides. Há dois parasitoides utilizados para o controle de D. citri: Diaphorencyrtus aligarhensis (Shafee, Alam & Agarwal) (Hymenoptera: Encyrtidae) e Tamarixia radiata Waterston (Hymenoptera: Eulophidae) (HALBERT & MANJUNATH 2004), sendo o último mais utilizado com ocorrência natural relatada no Brasil (GOMÉZ-TORRES et al., 2006a). Este é um ectoparasitoide do psilídeo-dos-citros nativo da Índia. Suas fêmeas se alimentam nas ninfas jovens de D. citri e preferem ovipositar nas ninfas de ínstares mais avançados (terceiro a quarto). É considerado um parasitoide muito eficiente porque sua oviposição chega a 300 ovos, sendo que, nas condições ideais para seu desenvolvimento, uma única fêmea é capaz de parasitar 500 ninfas no seu ciclo de vida, tendo assim, efetividade de 90% de parasitismo do psilídeo (SKELLEY & HOY, 2004; QURESHI et al., 2009). 28 Gómez-Torres et al. (2006b) relataram a eficiência de controle de D. citri com T. radiata entre 14% e 33%. Mc Farland e Hoy (2001) avaliaram a influência da temperatura e umidade na sobrevivência de D. citri e de seus parasitoides, T. radiata e D. aligarhensis, concluindo que por mais que a população de psilídeo e de seus parasitoides aumentasse, conforme se aumentava a umidade, o psilídeo não foi dependente de altas umidades, podendo sobreviver em temperaturas elevadas, ao contrário de seus parasitoides. Estudos da biologia de T. radiata concluíram que a temperatura de 25°C é a mais adequada ao desenvolvimento do inseto (PARRA, 2010). Nos pomares de São Paulo com pouco uso de inseticidas, é comum a ocorrência de Lecanicillium sp. e Syngliocladium sp. O gênero Syngliocladium tem sido relatado como sendo patógeno de grilos e em citros esse fungo tem sido responsável por epizootias alternadas com Lecanicillium sp. (ALVES et al., 2004). Esses agentes foram os primeiros patógenos de insetos utilizados no controle microbiano e sua utilização vem sendo estudada a mais de 100 anos (WRAIGHT & BRADLEY, 1996). O número de fungos com potencial para o emprego como controladores biológicos já ultrapassa 750 espécies e 85 gêneros (PUTZKE & PUTZKE, 2002). Apesar de D. citri ter sido constatada há mais de meio século nos pomares de citros do Brasil, como praga secundária, trabalhos de controle dessa praga com fungos entomopatogênicos são escassos. De modo geral, esses fungos incluem os gêneros que estão associados a insetos e outros artrópodes, como ácaros e aranhas. Insetos sugadores são mais propensos ao ataque de fungos, que são capazes de produzir enzimas necessárias para a penetração da cutícula. A patogenicidade do fungo I. fumosorosea (Wise) Brown &. Smith foi confirmada por meio de bioensaios utilizando concentrações de 107 a 109 conídios/mL em adultos do psilídeo. Infecções por Beauveria sp. e Lecanicillium lecanii (Zimmerman) Zare & W. Gams também foram encontradas, sendo o último mais eficaz em altas densidades do inseto. Padulla et al. (2005) Padulla et al. (2007), em testes com B. bassiana, M. anisopliae (Metsch.) Sorokin e L. longisporum (Petch) Zare & Gams, observaram mortalidades de 53 a 100% em ninfas e de 13 a 100% em adultos. Doenças fúngicas nos insetos produzem uma grande variedade de sinais e sintomas, tais como o crescimento superficial nas cutículas, melanização em pontos da cutícula onde as hifas penetram, comportamento alterado (redução de alimentação, 29 desorientação, agitação excessiva, paralisia parcial, fraqueza, mudança de coloração). No caso de fraqueza, possivelmente ocorre em função da produção de toxinas pelo fungo, interferindo tanto no desenvolvimento do hospedeiro como no mecanismo de defesa contra microrganismos, incluindo os fungos (ALVES, 1998; BOUCIAS; PENDLAND, 1998). A existência de uma substância mucilaginosa envolvendo os conídios facilita adesão do patógeno à superfície do hospedeiro, seja na cutícula ou nas placas de cera, garantindo as condições de proteção contra a dessecação (MOLINA, 2007). 4.7. Compatibilidade de fungos entomopatogênicos com produtos fitossanitários Produtos químicos sempre foram a principal ferramenta, para a agricultura brasileira, no controle dos insetos considerados pragas. Tais produtos, são rotulados como eficazes, tendo como principal vantagem a capacidade de eliminar diferentes espécies de insetos em diferentes cultivos. Além dessa aparente vantagem, o custo relativamente compensador é outro fator que ajuda a impulsionar cada vez mais o uso destes produtos. Os inseticidas e fungicidas químicos já demonstraram seu importante papel, contudo, a cada dia são conhecidas as consequências indesejáveis de seu uso indiscriminado, causando efeitos prejudiciais ao meio ambiente, aos animais, ao homem e também aos inimigos naturais de pragas agrícolas, acumulando resíduos tóxicos em alimentos, contaminando água e solo, intoxicando produtores rurais, favorecendo o aparecimento de pragas resistentes e ocasionando surtos de insetos que eram considerados pragas secundárias, entre outros problemas (KIM et al., 2003; COSTA et al., 2004; MENEZES, 2005; JIMENEZ et al., 1988). Como alternativa à aplicação destes produtos surgiu, na década de 60, o manejo integrado de pragas (MIP). O conceito do MIP abrange a utilização de todas as técnicas disponíveis para a regulação de uma população de pragas, que necessitam atuar de forma harmônica. (YAMAMOTO e BASSANEZI, 2003). Os fungos são diretamente prejudicados, pois esses produtos podem causar a inibição do crescimento vegetativo, da produção e inviabilidade de conídios e esporos, além da sua patogenicidade e virulência (CAVALCANTI et al., 2002). A integração de produtos químicos com o controle biológico é crucial para o sucesso de um programa de MIP (SMILANICK, ZALOM e EHLER, 1996). A seletividade é definida como a propriedade que um produto apresenta de controlar a praga 30 visada, com o menor impacto possível, dentro do Manejo Integrado de Pragas (GAZZONI, 1994). Dentre as estratégias para a utilização de entomopatógeno, a conservação é a mais prática e econômica, pois preserva os patógenos dentro dos agroecossistemas. Assim, a busca por produtos químicos mais seletivos para a utilização no controle de pragas é necessária para não eliminar a ação dos inimigos naturais ou até promover o sinergismo, associando a ação do químico com os microrganismos entomopatogênicos (ALVES, 1998). A avaliação da possibilidade de utilização de defensivos químicos em misturas com agentes microbianos de controle pode contribuir na escolha do defensivo que menos afete o desenvolvimento do patógeno, permitindo a manutenção de fontes de inóculo no campo, indispensável para o desencadeamento de epizootias (BATISTA FILHO et al,. 1987). Diversos trabalhos demonstram que existem produtos altamente tóxicos aos patógenos e outros que apresentam grande seletividade aos mesmos (CARNEIRO, 1981), esses trabalhos vêm contribuindo para auxiliar a escolha do produto químico que menos afete o desenvolvimento dos patógenos, permitindo a manutenção de fontes de inóculo, indispensáveis para o desencadeamento de epizootias (BATISTA FILHO et al,. 1987). Entre esses trabalhos estão os realizados por Alves et al. (1993), Almeida et al. (2003), Batista Filho et al, (2001), Neves et al. (2001), Loureiro et al. (2002) e Tanzini et al. (2002) que estudaram o efeito de defensivos químicos sobre espécies de fungos entomopatogênicos como B. bassiana, M. anisopliae, L. lecanii, entre outros. Alves et al. (2001), ao avaliarem a eficácia do fungo B. bassiana associado ou não aos inseticidas Calypso 480SC, Gaucho 700PM e Provado 200SC, concluíram que a utilização de ambos associadamente constitui uma estratégia adequada para o controle de B. tabaci. Resultados semelhantes foram encontrados por Loureiro et al. (2002), ao analisarem o efeito de diversos produtos químicos utilizados na cultura da Alface e Crisântemo sobre os fungos B. bassiana, M. anisopliae, I. fumosorosea e L. lecanni, onde determinou-se que os produtos tiametoxam e imidaclopride foram compatíveis com todos os fungos estudados. Silva et al. (2013), ao testar a toxicidade in vitro de oito inseticidas, quatro fungicidas e cinco herbicidas sobre a germinação de conídios, crescimento vegetativo e viabilidade do fungo M. anisopliae, verificaram que seis produtos foram compatíveis, ou seja, os mesmos podem ser utilizados em associação com o agente de biocontrole. Estes resultados são similares com os encontrados por Cintra et al. (2013), também sob condições de laboratório, utilizando o mesmo entomopatógeno. Entretanto, Velozo (2015), ao avaliar os fungicidas Priori 31 Xtra®, Nativo® e Comet® verificou que eles foram altamente tóxicos para os isolados testados de Fusarium spp. O impacto da aplicação destes agrotóxicos sobre os entomopatógenos, pode variar em função da espécie e linhagem do patógeno, da natureza química dos produtos e das concentrações utilizadas. Assim, o conhecimento prévio do efeito tóxico dos produtos que serão utilizados, forma de aplicação, modo de ação, dose adequada, é necessário de forma a garantir a permanência destes inimigos naturais (ALVES, MOINO JÚNIOR e VIEIRA, 1993; SILVA, NEVES e SANTORO, 2005). A utilização de produtos seletivos, combinados com métodos alternativos de controle é extremamente importante, por permitir uma menor necessidade de aplicações de produtos fitossanitários no campo, possibilitando o equilíbrio do agroecossistema com a manutenção dos organismos benéficos, garantindo, desta forma uma maior economia aos produtores, e principalmente a obtenção de produtos mais saudáveis para a população. 32 5. MATERIAL E MÉTODOS Os ensaios foram desenvolvidos em Campinas – SP, no Laboratório de Controle Biológico, localizado no Centro Experimental Central do Instituto Biológico. 5.1. Obtenção e criação de Diaphorina citri Adultos de D. citri necessários para o início da criação foram fornecidos pelo Departamento de Entomologia e Acarologia – Laboratório de Biologia de Insetos da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP). A criação em laboratório foi realizada conforme método proposto por Gómez-Torres (2009). Para tal, utilizaram-se plantas de murta (M. paniculata L.), adquiridas na cidade de Holambra – SP, com 25 a 30 cm de altura; cultivadas em substrato de vermiculita e composto vegetal (1:1) e mantidas em casa de vegetação, e adubadas conforme necessidade, com adubo comercial NPK 20 20 20. As plantas sofreram podas periódicas (15 dias) para se obter brotações novas para a oviposição. As mudas de murta foram lavadas, sempre que necessário, com detergente neutro a 10%, para evitar a proliferação de outros insetos como pulgões, que dificultam a manutenção da criação. 33 Após oito a 15 dias, as plantas que apresentavam brotações foram transferidas para gaiolas de criação, confeccionadas com acrílico e tela anti-afídeo (60 x 60 x 50 cm), contendo adultos de D. citri para obtenção dos ovos (FIGURA 2). Após a oviposição, as plantas foram transferidas para gaiolas de criação teladas (43 x 43 x 37,5 cm) em sala climatizada (25º ± 1ºC) para o desenvolvimento ninfal. Após completarem o desenvolvimento, os adultos eram transferidos para novas gaiolas, com novas plantas para se iniciar o processo. Adultos e ninfas dessa criação foram utilizados nos ensaios de patogenicidade. Figura 2. Método de criação: A) e C) plantas mantidas em casa de vegetação; B) brotações; D) plantas nas gaiolas de criação de adultos; E) ninfas e “honeydew” 5.2. Fungos entomopatogênicos Foram utilizados 20 isolados dos seguintes fungos entomopatogênicos: Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Isaria fumosorosea, Isaria farinosus, Paecilomyces lilacinus, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium lecanii, Cladosporium sp. Os fungos estão depositados na Coleção de Fungos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do Instituto Biológico, localizado em Campinas, SP e reconhecida como fiel depositária pelo IBAMA (TABELA 2). Esses isolados são mantidos armazenados em “freezer” a -4°C, sob a 34 forma de conídios puros, acondicionados em microtubos e em tubos de cultura com óleo mineral. Os isolados foram escolhidos com base no tipo de hospedeiro (inseto ou solo) aleatoriamente e produzidos a partir de repicagem em três pontos em placas de Petri (nove cm de diâmetro), contendo meio autoclavado de batata-dextrose-ágar (BDA). As placas foram incubadas em câmara de germinação do tipo BOD (25º ± 1ºC e fotofase de 12 horas) para o crescimento e esporulação do fungo. Após 14 dias, foram utilizadas no preparo de suspensões. Antes das aplicações das suspensões foram determinadas as viabilidades dos conídios, através da técnica de microcultivo e exame direto em lâminas de microscopia, esterilizadas previamente e marcadas com três círculos na face inferior, recobertas com uma fina camada de BDA (FIGURA 3). Sobre o meio de cultura foi inoculado, em cada círculo, 0,1 mL da suspensão fúngica obtida de colônias crescidas em BDA. As lâminas, acondicionadas individualmente em placas plásticas de Petri estéreis (90 x 15 mm), com algodão umedecido, foram incubadas a 27° ± 1°C, durante 18h. Após este período, foi feita a observação de 150 conídios em cada área da lâmina, utilizando-se microscópio com aumento de 400x. Foram contados conídios germinados e não germinados, estabelecendo-se a porcentagem de germinação. Cada lâmina corresponde a uma repetição, confeccionando-se três lâminas (MARQUES et al., 2004). Só foram utilizadas suspensões que apresentaram viabilidade acima de 90%. Figura 3. Lâmina para microcultivo 35 Tabela 2. Isolados utilizados nos ensaios de patogenicidade. ISOLADOS ESPÉCIE HOSPEDEIRO/FONTE DATA LOCAL Coordenadas IBCB 130 Isaria fumosorosea Solo 01/04/1999 Florínia - SP long -20.9011'/ lat -50.7321' IBCB 201 Isaria fumosorosea Solo 01/05/1999 Cascavel - PR long -24°9554'/ lat -53°4552' IBCB 638 Isaria fumosorosea Bemisia tabaci 05/08/2009 Holambra - SP long -22.6308'/ lat -47.0547' IBCB 220 Isaria farinosus Solo 01/05/1999 Ribeirão Preto - SP long -21.1716' / lat -47.8207' IBCB 236 Paecilomyces lilacinus Café 01/06/1999 Poloni - SP long -20.7882' / lat -49.8154' IBCB 66 Beauveria bassiana Hypothenemus hampei 01/07/1986 São José do Rio Pardo - SP long. -21.5961'/lat-46.8882' IBCB 224 Beauveria bassiana Citros 01/05/1999 Campinas - SP long -22.9014' / lat -47.0681' IBCB 276 Beauveria bassiana Solo 01/06/1999 Ribeirão Preto - SP long -21.1716' / lat -47.8207' IBCB 331 Beauveria brongniartii Myzus sp. 01/06/1999 Campinas - SP long -22.9014' / lat -47.0571' IBCB 106 Beauveria brongniartii Solo 01/03/1999 Posto da Mata - BA - IBCB 386 Beauveria brongniartii Mahanarva fimbriolata 01/07/1999 Sertãozinho - SP long -21.1440' / lat -48.0116' IBCB 185 Metarhizium anisopliae Solo 01/05/1999 Cascavel - PR long -24°9554'/ lat -53°4552' IBCB 348 Metarhizium anisopliae Mahanarva fimbriolata 01/07/1999 Sertãozinho - SP long -21.1440' / lat -48.0116' IBCB 364 Metarhizium anisopliae Anthonomus grandis 01/07/1999 Araras - SP long -22.3589' / lat -47.3799' IBCB 425 Metarhizium anisopliae Solo 01/01/2000 Iporanga - SP long -24.5865' / lat- 48.5948' IBCB 616 Lecanicillium lecanii Myzus persicae 08/08/2008 Campinas - SP long -22.9030/ lat -47.0647' IBCB 619 Lecanicillium lecanii Myzus persicae 08/08/2008 Campinas - SP long -22.9030/ lat -47.0647' IBCB 618 Lecanicillium sp. Myzus persicae 08/08/2008 Campinas - SP long -22.9030/ lat -47.0647' IBCB 76 Lecanicillium sp. Trialemodis sp. 01/04/1988 Itatiba - SP long -23.0054' /lat-46.8391' IBCB 632 Cladosporium sp. Tetranychus urticae 11/05/2009 Atibaia - SP long. -23.1151' / lat-46.5559' 36 Após o crescimento e conidiogênese, os conídios dos isolados de Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Isaria fumosorosea, Isaria farinosus, Paecilomyces lilacinus, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium lecanii, Cladosporium sp. foram raspados do meio de cultura com auxílio de uma espátula estéril, e colocados em frascos de Erlenmeyer (250 mL), contendo solução de Tween 80® a 0,1%. Após o preparo da suspensão original, utilizou-se 1 ml dessa suspensão para a diluição seriada. Foram feitas diluições seriadas para facilitar a contagem dos conídios em Câmara de Neubauer – microscópio ótico no aumento de 400X. 5.3. Patogenicidade de fungos entomopatogênicos à ninfas de Diaphorina citri e determinação do tempo letal médio 50% (TL50) As suspensões na concentração 6,7x107 conídios/mL foram preparadas a partir de placas de Petri contendo os isolados para se estimar o TL50. A escolha do isolado de B. bassiana IBCB 66, como padrão, foi realizada com base na virulência do entomopatógeno, constatada em bioensaios desenvolvidos em laboratório e na eficácia do isolado, quando utilizado no controle microbiano de ácaros e/ou insetos em condições de campo (BATISTA- FILHO, 2003). Além disso, os isolados IBCB 66 e IBCB 425 estão registrados no MAPA (Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento) como referência em produtos fitossanitários para agricultura orgânica segundo Instrução Normativa Conjunta SDA/SDC nº 2, de 12/07/2013. Tal concentração foi determinada por Pinto et al. (2012), e segundo esse trabalho, essa seria a dose letal 90% para o fungo entomopatogênico B. Bassiana capaz de matar 90% da população de ninfas de D. citri. Utilizada nesse trabalho como dose padrão. Os bioensaios foram realizados em condições de laboratório e foram utilizadas mudas de murta M. paniculata, sendo que cada planta foi considerada uma repetição, com ninfas de segundo a quarto instar. A quantidade de ninfas por repetição foi constante (50 insetos por repetição – 4 repetições). Para obter um número constante de insetos e ninfas com a mesma idade, cada repetição, foi mantida por 24 horas com 5 casais de D. citri, obtendo-se assim o mesmo padrão de ovoposição, retirando os insetos excedentes. A inoculação foi realizada através de pulverização com 5 mL de cada uma das suspensões fúngicas por planta utilizando um aerógrafo (a 3 cm de distância). As plantas foram mantidas em sala climatizada (25º ± 1°C e fotofase de 14 horas) em gaiolas individuais confeccionadas com copo plástico de 37 900 mL, voil, cola quente e fita adesiva (FIGURAS 4 e 5). Cada tratamento foi representado por um isolado, com quatro repetições. As ninfas do tratamento testemunha foram pulverizadas com água destilada estéril mais espalhante adesivo (Tween 80®) a 0,1%. As plantas foram irrigadas normalmente durante o ensaio para evitar o ressecamento e estresse das murtas. Figura 4. Gaiolas individualizadas para testes de TL As avaliações foram diárias, totalizando 10 dias, sendo que os insetos mortos foram transferidos para placas de Petri contendo algodão umedecido (câmara úmida) e colocados em câmara de germinação tipo BOD (25º ± 1°C e fotofase de 12 horas) por 15 dias, para se confirmar a mortalidade causada pelos patógenos através do crescimento micelial e extrusão do fungo. 38 Figura 5. Sequência da pulverização das suspenções sobre Murraya paniculata contendo ninfas de Diaphorina citri. A partir dos resultados obtidos no teste de patogenicidade, todos os isolados testados se mostraram promissores no controle de ninfas de D. citri, sendo assim, realizado teste estatístico para escolha dos melhores isolados, reduzindo o número de 20 isolados para apenas 8. Esses isolados foram então utilizados para a determinação do tempo letal e também utilizados nos testes de compatibilidade. Para a determinação do TL50, foram utilizados os dados obtidos nos testes de patogenicidade empregando-se a análise Probit. 39 5.4. Patogenicidade de fungos entomopatogênicos à adultos de Diaphorina citri Os adultos de D. citri foram coletados na criação por meio de um tubo de ensaio de plástico, sendo 10 adultos por repetição, totalizando 30 insetos por tratamento. Cada repetição foi representada por uma placa tipo “gerbox”, sendo 3 repetições. Foram coletadas de folhas cítricas de Laranja Pera cultivadas em casa de vegetação, que foram higienizadas superficialmente com solução de hipoclorito 1% e água destilada. Após a lavagem, as folhas foram secas em temperatura ambiente naturalmente. Após estarem secas foram cortados discos de 5 cm de diâmetro com o auxílio de uma tesoura. Para manter a folha por mais tempo, foi utilizada a mistura de ágar-água a 1,5%. Cada placa recebeu 7 ml de ágar-água. As suspenções fúngicas foram preparadas e padronizadas na concentração de 6,7x107 conídios/mL conforme descrito no tópico anterior. Os discos foliares foram então mergulhados nessas suspenções e após secarem completamente foram acondicionados nas placas (FIGURA 6). Essas placas foram mantidas em B.O.D. por 10 dias. Figura 6. Sequência de montagem de patogenicidade adultos de Diaphorina citri. 40 5.5. Compatibilidade de produtos fitossanitários utilizados na citricultura em condições de laboratório O efeito de onze produtos fitossanitários, dentre eles dez inseticidas utilizados na cultura de citros para o controle de D. citri (TABELA 4) e o óleo de Neem utilizado no manejo fitossanitário dos citros foram avaliados sobre os isolados com a maior mortalidade nos testes de patogenicidade, analisando-se o efeito sobre o crescimento vegetativo, conidiogênese e viabilidade dos fungos na presença dos produtos analisados. Foram avaliados 6 isolados (TABELA 3). A adição dos produtos em 200 mL de meio de cultura BDA foi realizada mantendo as concentrações recomendadas para a cultura (TABELA 4), proporcionalmente ao volume do meio, com o mesmo ainda líquido, a uma temperatura próxima a 40ºC. Em seguida, o meio foi vertido em placas plásticas de Petri descartáveis de 90 x 15 mm, sendo a inoculação dos fungos realizada após a sua solidificação. Tabela 3. Isolados utilizados nos ensaios de compatibilidade em condições de laboratório. ISOLADOS ESPÉCIE HOSPEDEIRO IBCB 276 Beauveria bassiana Solo IBCB 348 Metarhizium anisopliae Mahanarva fimbriolata IBCB 425 Metarhizium anisopliae Solo IBCB 616 Lecanicillium lecanii Myzus persicae IBCB 619 Lecanicillium lecanii Myzus persicae IBCB 618 Lecanicillium sp. Myzus persicae Foram preparadas cinco placas por tratamento, sendo a inoculação realizada por meio de uma alça de platina, em três pontos equidistantes por placa, totalizando 15 colônias de fungo, das quais seis foram escolhidas aleatoriamente, resultando assim, em seis repetições por tratamento. O tratamento testemunha foi representado por amostras do meio de cultura sem a adição dos produtos. Após a inoculação dos fungos, as placas foram mantidas em câmaras tipo BOD para promover o crescimento a 25±1ºC, por sete dias. Após esse período, foi realizada 41 a medição em dois sentidos perpendiculares, obtendo o diâmetro médio das colônias, através de uma régua comum em cm para avaliação do crescimento vegetativo. Em seguida, para avaliação da conidiogênese, essas colônias foram retiradas das placas, com o auxílio de um bisturi, juntamente com o meio de cultura, e transferidas para tubos de ensaio contendo 10 mL de água destilada e esterilizada mais espalhante adesivo (Tween 80®) a 0,1%. Para promover a desagregação dos conídios do meio de cultura seguiu-se vigorosa agitação, em um agitador de tubos, sendo então feitas as diluições necessárias das suspensões fúngicas para a contagem do número de conídios em microscópio óptico, com o auxílio de câmara de Neubauer. A viabilidade dos conídios foi avaliada, através de microcultivo e exame direto em lâminas de microscopia esterilizadas, previamente marcadas com três círculos na face inferior, recobertas com uma fina camada de BDA contendo proporcionalmente a dose recomendada do produto (FIGURA 3). Sobre o meio de cultura foi inoculado, em cada círculo, 0,1 mL da suspensão fúngica obtida de colônias crescidas em BDA As lâminas, acondicionadas individualmente em placas plásticas de Petri descartáveis de 90 x 15 mm, com algodão umedecido, foram incubadas a 27 ± 1°C, durante 24h. Após esse período, foi realizada a observação de 150 conídios em cada área da lâmina, utilizando-se microscópio com aumento de 400x (MARQUES, MONTEIRO e PEREIRA, 2004). 42 Tabela 4. Produtos utilizados na cultura de citros para o controle de Diaphorina citri, doses recomendadas segundo lista de produtos registrados para a cultura (MAPA). Produto Ingrediente ativo Grupo Químico Característica Dose recomendada Modo de ação Actara 250 WG Tiametoxam Neonicotinóide Sistêmico 3g/planta Antagonista de receptores nicotínicos da acetilcolina Malathion 1000 EC Malationa Organofosforado Contato e ingestão 150mL/100L de água Inibidor de acetilcolinesterase Provado 200 SC Imidacloprido Neonicotinóide Sistêmico 20mL/1