1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL IMPLICAÇÕES DA DISPONIBILIDADE DE ESPAÇO NO CONFINAMENTO DE BOVINOS DE CORTE Fernanda Macitelli Benez Zootecnista JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL 2015 1 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL IMPLICAÇÕES DA DISPONIBILIDADE DE ESPAÇO NO CONFINAMENTO DE BOVINOS DE CORTE Fernanda Macitelli Benez Orientador: Prof. Dr. Mateus J. R. Paranhos da Costa Abril de 2015 Jaboticabal – SP Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Zootecnia 3 Macitelli-Benez, Fernanda M152i Implicações da disponibilidade de espaço no confinamento de bovinos de corte / Fernanda Macitelli Benez. – – Jaboticabal, 2015 vii, 77p. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015 Orientador: Mateus José Rodrigues Paranhos da Costa Banca examinadora: Antônio Rodrigues da Silva, Júlio Jardim Barcellos, Marcia Del Campo Gigena, Wignez Henrique Bibliografia 1. Ambiente. 2. Bem-estar animal. 3. Desempenho. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 636.083:636.2 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. 4 DADOS CURRICULARES DO AUTOR FERNANDA MACITELLI BENEZ - Nascida na cidade de São Paulo – SP, no dia 11 de agosto de 1977. Filha de Bruno Antônio Macitelli e Maria Aparecida Pacheco Macitelli. Zootecnista, graduada pela FCAV – Unesp em 1999 e Mestre em Zootecnia pela mesma Universidade, em 2003. Trabalhou durante oito anos como Zootecnista e administradora de fazendas do Grupo RPA no Mato Grosso. Professora de bovinocultura durante três anos (2005 a 2008) na Universidade de Cuiabá, no município de Rondonópolis e professora temporária da Universidade Federal de Mato Grosso de 2005 a 2007. Atualmente é pecuarista e professora efetiva da disciplina de Bovinocultura de Corte e Comportamento e Bem-estar animal na Universidade Federal de Mato Grosso, campus de Rondonópolis. 5 "O animal é tão ou mais sábio do que o homem: conhece a medida da sua necessidade, enquanto o homem a ignora." (Demócrito) 6 DEDICO... Ás pessoas que me completam, dão sentido à minha vida e me estimulam a ser uma pessoa melhor a cada dia. Obrigada pelo apoio, atenção e amor incondicional. A tese e o título são meus, mas a vitória é nossa! Ao meu marido Adalberto, meus filhos Ana Clara e Adalberto Filho e meus pais Bruno e Cida 7 OFEREÇO... Aos meus irmãos e eternos companheiros Ana Paula, Thiago; Aos meus cunhados e incentivadores Milena e Alexandre; Á minha sobrinha amada Lara; Aos meus sogros Lavínia e Adalberto; E em especial ao meu orientador e responsável por fazer eu me apaixonar novamente pela minha profissão. Obrigada por confiar em mim e me proporcionar a chance que eu precisava para voltar a acreditar na vida. 8 Agradecimentos À DEUS, pela vida, pela renovação da fé e por me mostrar constantemente que está presente ao me lado. Á minha querida Nerita, por realizar o papel de mãe dos meus filhos na minha ausência, cuidar da minha casa e sempre estar ao meu lado. Aos meus amigos Désirré, Janaína, Lívia e Arquimedes. Obrigada por se fazerem presentes em todos os momentos que precisei de um amigo. Levo vocês no meu coração para sempre. Aos amigos do Grupo ETCO, em especial à Aline, Tiago, Monique, Franciely, Maria Camila, Karen, Natália, Luciana, Taciana e Tâmara, por me tratarem com tanto carinho. Contem comigo! Ao Professor Fabrício Singaretti de Oliveira, por aceitar o desafio de estudar a melhor forma de avaliar as glândulas adrenais e por sempre se mostrar disponível. Ao Professor Fernando Baldi e Aline, por me auxiliarem nas intermináveis análises estatísticas. Aos Professores Antônio, Júlio, Wignez, Márcia, por aceitarem participar da banca de avaliação dessa tese e contribuírem com seus conhecimentos. Agradeço também à professora Karen pelo carinho e discussões. Aos meus alunos e agora colegas zootecnistas Pamella, Dayla, Aline, Douglas, Deise, Fernanda, Néia, Rosi e Pamela. Agradeço por vocês não medirem esforços para me ajudar. Sem vocês não haveria todos esses dados na minha tese. Meu sincero e carinhoso muito obrigada! Ao Grupo Bom Futuro, em especial ao Sr. Fernado, Dayla e colaboradores da Fazenda Fartura. O apoio de vocês foi vital para conclusão do meu doutarado. Obrigada pela confiança! À Empresa Novanis, em especial ao Arlindo, pelo constante apoio e incentivo. À UNESP e UFMT por me proporcionarem capacitação. E claro, aos animais, por alimentarem meu conhecimento e encherem meus dias de motivação. 9 SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... iii RESUMO..................................................................................................................... iv PALAVRAS-CHAVE……………………………………………………………................. iv SUMMARY………………………………………………………………………................. v KEY-WORDS……………………………………………………………………................. v CAPÍTULO 1 – Considerações gerais 1. Introdução…………………………………………………….................................... 01 2. Revisão de literatura…………………………………………................................... 03 3. Referências bibliográficas……..…………………………….................................... 12 CAPÍTULO 2 - Reduced space for outdoor confined beef cattle causes greater environmental impact and increases animal stress and disease Abstract..................................................................................................................... 20 Keywords.................................................................................................................. 20 Introduction............................................................................................................... 21 Materials and Methods............................................................................................. 22 Results...................................................................................................................... 30 Discussion................................................................................................................. 36 Conclusion………………………………………………………………………………… 41 References................................................................................................................ 41 CAPÍTULO 3 - Is the space availability really important for the feedlot beef cattle performance? Abstract.................................................................................................................... 47 Keywords.................................................................................................................. 47 10 Introduction............................................................................................................... 48 Materials and Methods............................................................................................. 49 Results................................................................................................................... 56 Discussion.............................................................................................................. 62 Conclusion............................................................................................................. 67 References............................................................................................................. 68 CAPÍTULO 4 - Considerações finais Implicações gerais................................................................................................... 74 Avaliação econômica............................................................................................... 76 Perspectivas futuras................................................................................................ 77 11 LISTA DE ABREVIATURAS mm – milímetro (millimeter) cm – centímetro (centimeter) m – metro (meter) m² - metro quadrado (square meter) h – hora (hour) min – minuto (minut) kg – quilograma (kilogram) °C – graus Celsius (Celsius degree) AT – temperature ambiente (environmental temperature) RH – umidade relativa do ar (relative humidity) BGT – temperatura do globo negro (black globe temperature) LD – dificuldade de locomoção (locomotion deficits) HA – alteração de casco (hoof alterations) TE – alteração de tegumento (tegument alteration) DI – diarreia (diarrhea) BD – dificuldade de respirar (breathing difficulty) MA – área medular da glândula adrenal (adrenal gland medullar area) CA – área cortical da glândula adrenal (adrenal gland cortical area) ACTH – hormônio adenocorticotrófico (adenocorticotropic hormone) BRD – doença respiratória bovina (bovine respiratory disease) TDN – nutrientes digestíveis totais (total digestible nutrients) OR – razão entre possibilidades (odds ratio) RC – classe de referência (reference class) Ibw – peso vivo inicial (inicial body weight) Mbw – peso vivo intermediário (intermediate body weight) Fbw – peso vivo final (final body weight) Dgw1 – ganho de peso médio diário no período 1 (first period daily weight gain) Dgw2 - ganho de peso médio diário no período 2 (second period daily weight gain) Dgwt – ganho de peso médio diário no período total (total period daily weight gain) Cw – peso da carcaça (carcass weight) Aw – peso da glândula adrenal (adrenal gland weight) Raw – peso da glândula adrenal direita (right side adrenal gland weight) Law – peso da glândula adrenal esquerda (left side adrenal gland weight) N – número (number) SIF – Serviço de Inspeção Federal (Federal Inspection Service) DIPOA - Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal (Department of Animal Products Inspection) MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply) iii 12 IMPLICAÇÕES DA DISPONIBILIDADE DE ESPAÇO NO CONFINAMENTO DE BOVINOS DE CORTE RESUMO - O objetivo dessa pesquisa foi avaliar as implicações da disponibilidade de espaço no bem-estar, desempenho e qualidade de carcaça e carne de bovinos de corte confinados. Foram confinados 1350 machos inteiros em três disponibilidades de espaço: 6 (T6), 12 (T12) e 24 (T24) m2/animal. Todos os animais receberam a mesma dieta. Foram utilizados indicadores de bem-estar animal com base no ambiente (escore de poeira e profundidade da lama) e com base nos animais, sendo parte destas medidas realizada com os animais alojados nos currais do confinamento, como as medidas de indicadores comportamentais (número de animais em pé, deitado, ou no cocho), de conforto (grau de sujidade dos animais), e de saúde (número de tosses e espirros por minuto, porcentagens de animais com diarreia, alteração de cascos, problemas de locomoção, alteração de tegumento, e com corrimentos nasal e ocular), e parte após o abate dos animais, no frigorífico, avaliando- se indicadores de saúde, com o diagnóstico macroscópico de vísceras (porcentagem de animais com bronquite, enfisema pulmonar, nefrite e cisto urinário), e indicadores de estresse, com a coleta das glândulas adrenais direita e esquerda de 20% dos animais de cada tratamento (medindo o peso e as áreas cortical e medular). Foram avaliados também indicadores de desempenho (peso final, ganho de peso médio diário, peso da carcaça quente) e de qualidade das carcaças (número e severidade dos hematomas e grau de acabamento de gordura) e da carne (pH). Em geral, os resultados mostraram que o T24 ofereceu melhores condições ambientais para realizar a fase de terminação dos bovinos que os demais tratamentos, evidenciada pela menor frequência de ocorrência de poeira e profundidade da lama (P < 0,01), menores porcentagens de animais com corrimentos nasal e ocular e com problemas de locomoção (P < 0,05), além de menor porcentagem de animais com diagnóstico de bronquite, enfisema pulmonar, nefrite e cisto urinário. Além disso, T24 apresentou maior ganho de peso médio diário (P < 0,01), menor número médio de hematomas novos e superficiais por carcaça, e também menores médias de peso e da área cortical da glândula adrenal (P < 0,01). Apesar de T6 ter apresentado maior resultado de pH da carne (P < 0,05), e haver diferença significativa na frequência de distribuição dos escores de acabamento de gordura (P < 0,05), todos os tratamentos apresentaram médias de pH e acabamento de gordura dentro do que é esperado para assegurar uma boa qualidade da carne. Conclui-se que aumentar a disponibilidade de espaço para bovinos de corte em confinamento reduz o estresse, favorece o bem-estar animal e melhora o desempenho e a qualidade das carcaças dos animais. Palavras chave: ambiente, bem-estar animal, comportamento, desempenho, saúde iv 13 IMPLICATIONS OF THE SPACE AVAILABILITY IN THE BEEF CATTLE FEEDLOTS SUMMARY - The objective of this research was to evaluate the implications of the space availability in feedlot beef cattle on animal welfare, performance and carcass and meat quality. One thousand, three hundred and fifty bulls were confined within three space allowance: 6 (T6), 12 (T12) and 24 (T24) m2/animal. All animals received the same diet. The animal welfare were assessed using environmental (dust score and mud depth) and animal based indicators, part of these measurements was carried out with the animals housed in confinement pens by using behavioral (number of animals standing, lying down, or in the feed bunk), comfort (percentage of dirty animals), and health indicators (number of coughs and sneezes per minute, and the percentages of animals with diarrhea, hooves alterations, locomotion problems, tegument alterations, and nasal and ocular discharges), and part after slaughtering the animals, evaluating health indicators, with macroscopic diagnosis of animal viscera (percentage of animals with bronchitis, emphysema, nephritis and urinary cyst), and stress indicators besides the collection of the left and right adrenal glands from 20% of the animals from each treatment (to assess the weight and cortical and medullar areas). Growth performance (final body weight, average daily gain weight, hot carcass weight), and carcasses (number and severity of bruises and degree of fat finishing), and meat quality (pH) indicators were also measured. In general, the results showed that the T24 offered better environmental conditions for the finishing phase of beef cattle than the other treatments, evidenced by the lower frequency of occurrence of dust and mud depth (P < 0.01), lower percentages of animals with nasal and ocular discharges and locomotion problems (P < 0.05), and lower percentage of animals diagnosed with bronchitis, emphysema, nephritis and urinary cyst. In addition, T24 showed higher mean of daily weight gain (P < 0.01), lower means in the number of new and superficial bruises per carcass, and also lower means of adrenal gland weight and cortical area (P < 0.01). Although, the significant difference for the distribution of the fat covering score, and T6 have shown highest mean for meat pH (P < 0.05), all treatments displayed means within the range that is expected to ensure the meat quality. It is concluded that increasing the availability of space in beef cattle feedlots reduces stress, promotes animal welfare and improves performance and the quality of the carcasses of animals. Keywords: animal welfare, behavior, environment, health, performance v 1 CAPÍTULO 1. Considerações gerais 1. Introdução A bovinocultura de corte brasileira apresentou transformações notáveis nas últimas décadas, resultantes principalmente da estabilidade econômica, da utilização de cruzamentos inter-raciais visando precocidade e melhoria na qualidade da carne, bem como da aplicação de sistemas mais intensivos de produção como integração lavoura-pecuária, silvipastoris, semi-confinamento e confinamento (Vilella et al., 2008; Lemaire et al., 2014; Oliveira e Millen, 2014, Gil et al., 2015). De maneira geral, a aplicação desses sistemas vai além da ideia remota de favorecer a produção de bovinos em períodos de menor disponibilidade de forragens, o que coincide com a época de melhores preços da arroba. Atualmente os sistemas intensivos de produção caracterizam-se como adjuvantes da agricultura, uma vez que aumentam a disponibilidade de áreas para a produção de grãos e de outro produtos agrícola, otimizam o uso de maquinários e mão de obra, além de promoverem maior aproveitamento dos resíduos da produção de importantes culturas do panorama agrícola brasileiro. Adicionalmente, Oliveira e Millen (2014) afirmaram que a crescente intensificação do sistema de produção brasileira de bovinos de corte também é resposta à demanda do mercado por carne de qualidade. Dados do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA, 2014) indicam que houve acréscimo na produtividade da bovinocultura de corte brasileira na última década, uma vez que a estimativa de crescimento do rebanho foi de apenas 4% (de 204 milhões de animais em 2004 para 212 milhões em 2013), enquanto o número de animais abatidos aumentou em 30% (de 20,4 milhões de animais em 2004 para 26,7 milhões em 2013). Um dos fatores responsáveis pelo aumento de produtividade brasileira é a crescente utilização do confinamento para bovinos na fase final de produção, como caracterizado pelos dados da Associação Nacional dos Confinadores (Assocon, 2014), que mostraram que o número de animais confinados dobrou entre os anos de 2010 (2 milhões de bovinos) e 2013 (4 milhões de bovinos), e com estimativa 2 de que 4,4 milhões de bovinos tenham sido confinados em 2014. Existem ainda projeções de que, no Brasil, até o ano de 2023 sejam produzidas 2,4 milhões de toneladas de carne oriundas de confinamento, ou seja, praticamente o triplo que em 2013 (Rabobank, 2014). Diante desse contexto, visando aprimorar as práticas utilizadas em confinamento, técnicos e pecuaristas investem no uso de tecnologias, caracterizadas pela automação na preparação e distribuição dos alimentos, avanços no manejo nutricional (com atenção especial à formulação das dietas) e utilização de animais com maior potencial produtivo. Entretanto, é necessário ressaltar que apesar do confinamento de bovinos ser benéfico para a melhoria na eficiência de produção de carne, existe o risco deste sistema de criação não contemplar aspectos importantes relacionados às necessidades dos animais, dentre eles, boas condições de conforto físico e psíquico (Boissy et al., 2007; Estevez et al., 2007; Fraser et al., 2013). Apesar do confinamento no Brasil ocorrer apenas na fase de terminação e por um período curto de tempo, em média 80 a 100 dias (Duarte, 2014; Mello e Cassol, 2014), as diversas mudanças nas condições de criação que são impostas aos animais tem importantes impacto no seu bem-estar. As alterações mais comuns se caracterizam pela dependência direta do homem para o atendimento de recursos essenciais (como oferta de alimento e água, por exemplo), substituição de dieta rica em fibra por outra mais concentrada, e oferecimento de água em pequenos reservatórios. Adicionalmente, pode existir ainda a mistura de animais de diferentes rebanhos no mesmo lote, ausência de sombra e substituição de amplo espaço por área restrita, aliada a alta densidade de animais. Além dos elementos citados, a baixa disponibilidade de espaço potencializa outros fatores que afetam o bem-estar dos animais, dificultando a adaptação e reduzindo o desempenho dos mesmos, como a presença constante de poeira e/ou lama no ambiente (West, 2011; Mader, 2011). Como agravante, agentes químicos e biológicos presentes na poeira e lama, associados à redução da imunidade decorrente do estresse causado pelo confinamento (Fell et al., 1999), são os principais responsáveis pelas ocorrências de doenças respiratórias (Edwards, 2010), que causam 3 70 a 80% dos casos de morbidade e 40 a 50% dos casos de mortalidade nos bovinos confinados (Smith, 1998). Fraser et al. (2013) afirmaram que o bem-estar ruim não é só uma consequência de doenças, mas também de outras reações dos animais frente a um ambiente desafiador. Segundo Welfare Quality® (2009), a saúde é apenas um dos aspectos que pode ser utilizado como indicador de bem-estar animal, sendo necessário avaliar outros indicadores, como por exemplo, os relacionados à alimentação, alojamento e comportamento, para que assim se tenha uma avaliação mais segura do estado de bem-estar de um dado animal. É importante destacar que todos os envolvidos na cadeia produtiva da carne bovina devem estar conscientes de que, na percepção da sociedade, o bem-estar de bovinos confinados é reduzido quando comparados ao de bovinos mantidos em pastagens (Lee et al., 2013). Isto ocorre, provavelmente, pela perspectiva de que a restrição de espaço, por si, é uma situação estressante e que causa sofrimento aos animais (Del Campo et al., 2014; Spooner et al., 2014), além de ser uma questão ética importante na produção dos mesmos. Nesse contexto, são necessários estudos que relacionem alterações ambientais e de manejo impostas aos animais confinados, e seus potenciais efeitos negativos no bem-estar animal e, consequentemente, na eficiência de produção de carne de qualidade. Diante do exposto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a implicação da disponibilidade de espaço em confinamento no bem-estar, desempenho e qualidade da carcaça e carne de bovinos de corte. 2. Revisão de literatura Após a segunda guerra mundial, a crescente demanda por proteína de origem animal e, posteriormente, devido à pressão de outros fatores econômicos, levaram as cadeias produtivas de carnes a investirem em estruturas nas quais pudessem aumentar a produção em espaços cada vez menores (Vanhonacker et al., 2009; Fraser 4 et al.; 2013). No entanto, as necessidades dos animais não foram levadas em consideração nesses sistemas intensivos de produção (Fraser, 1983). Muitos são os fatores que podem afetar o desempenho dos animais nos variados sistemas de criação, sendo o ambiente um aspecto extremamente relevante. Logo, é importante apresentar o conceito de ambiência, como sendo “o espaço constituído por um meio físico e, ao mesmo tempo por um meio psicológico, preparado para o exercício das atividades do animal que nele vive” (Paranhos da Costa, 2000). Assim, o ambiente dos bovinos mantidos em regime de confinamento envolve todos os elementos capazes de afetar a vida dos mesmos, de forma positiva ou negativa, sendo, de acordo com Averós et al. (2014), a disponibilidade de espaço o elemento primordial, visto que sua limitação impacta severamente o bem-estar dos animais e consequentemente a produção. A indicação de disponibilidade de espaço para a criação de animais é um tema complexo, uma vez que esta pode variar com o tamanho do grupo e como os membros do grupo dividem esse espaço ao longo do tempo (Petherick, 2007). Na literatura científica brasileira são escassas as recomendações de disponibilidade de espaço para bovinos confinados, e na internacional são conflitantes, uma vez que existem estudos que utilizaram desde 1,2 (Gupta et al., 2007) até 33 m²/animal (Mader, 2011). Isso ocorre devido às particularidades de cada país ou região onde os bovinos são confinados, que apresentam diferentes instalações e tempo de permanência no confinamento em função do clima, raças e idade dos animais. No Brasil, disponibiliza-se em média 12 m²/animal, mas não existe um consenso, sendo recomendado por técnicos de 8 a 50 m²/animal (Souza et al., 2003; Quadros, s.d.). É inegável que a adoção de sistemas intensivos pode aumentar a capacidade de produção de bovinos (Assocon, 2014), e que a demanda pela mesma continuará crescente nas próximas décadas (Rabobank, 2014). Entretanto, ressalta-se que muitas análises financeiras são realizadas visando à lucratividade dos sistemas, mas nenhuma delas considera o quanto se deixa de ganhar ao manter os animais tentando se adaptar a um ambiente que não atende às suas necessidades físicas e psíquicas. A tentativa do organismo animal em adaptar-se a ambientes desafiadores provoca um conjunto de alterações fisiológicas e comportamentais, que caracterizam o 5 estado de estresse (Selye, 1936), com potenciais efeitos negativos no bem-estar animal e na produção (Bearden e Fuguay, 1980). Em situações estressantes há ativação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HHA), com a liberação do hormônio liberador de corticotrofina (CRH), produzido pelo hipotálamo, que atua na hipófise estimulando a produção do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), que atua no córtex das glândulas adrenais, estimulando a secreção de glicocorticoides (Möstl e Palme, 2002; Franci, 2005). Os glicocorticoides, principalmente o cortisol no caso dos bovinos, são responsáveis por controlar a resposta inflamatória deflagrada durante o estresse agudo, como também mobilizar energia principalmente para o cérebro, coração, fígado e rins, via aumento da neoglicogênese, glicólise, inibição da captação de glicose, e ativação da proteólise e da lipólise (Habib et al., 2001; Carroll e Forsberg, 2007). Nos casos de estresse crônico, em que os níveis de glicocorticoides circulantes são constantemente elevados, pode ocorrer catabolismo proteico, hiperglicemia, atrofia do tecido linfoide, redução do número de linfócitos e anticorpos, ocasionando falhas no sistema imunológico e reprodutivo, lesões aos tecidos e órgãos, inibição de crescimento e consequentemente redução na produção, e até mesmo alterações psicológicas, como depressão (Matteri et al., 2000; Tsigos e Chrousos, 2002; Carroll e Forsberg, 2007). Sintetizando, bem-estar animal e estresse são conceitos associados, mas devem ser considerados como vertentes opostas de um processo comum, pois a boa condição de bem-estar animal não pode ser alcançada quando o animal está estressado (Veissier e Boissy, 2007). O tema bem-estar animal tem sido pauta de grandes discussões, entre os diferentes elos da cadeia produtiva da carne, principalmente quando o foco está na criação intensiva de animais de produção (OIE, 2002). Entretanto, o valor atribuído ao bem-estar dos animais difere entre os elos, onde os produtores e a indústria atribuem ao bem-estar animal um valor econômico já que existem efeitos diretos na produção e na qualidade do produto final (Del Campo et al., 2014); enquanto que a sociedade, em geral, vinculam o bem-estar dos animais com saúde ou sofrimento (Vanhonacker et al., 2009; Spooner et al., 2014). Porém, a definição de bem-estar animal é complexa, podendo ser feita com base nos estados emocionais, ou seja, pelos sentimentos 6 experimentados pelos animais (Dawkins, 1990 e Duncan, 1993) ou por meio do funcionamento biológico dos animais, definindo bem-estar como o estado do organismo em suas tentativas de se ajustar ao seu ambiente (Broom,1986). Por ser uma questão que envolve importantes dimensões políticas, econômicas, científicas e éticas, faz-se necessário a adoção de uma definição mais ampla e detalhada, onde: “bem-estar animal significa como um animal está respondendo às condições em que vive. Um animal é considerado em bom estado de bem-estar se (com comprovação científica) estiver saudável, confortável, bem nutrido, seguro, capaz de expressar seu comportamento natural, e se não estiver sofrendo com dores, medo e angústias. Bem-estar animal requer prevenção contra doenças e tratamento veterinário, abrigo adequado, gerenciamento, nutrição, manejo cuidadoso e abate humanitário” (OIE, 2002). Por fim, para que o bem-estar possa ser comparado em situações diversas ou avaliado em uma situação específica, deve-se empregar avaliações científicas livres de visões antropocêntricas em relações aos animais. Uma vez terminada a avaliação, esta deve ser capaz de prover informações necessárias para que decisões éticas possam ser tomadas em relação à produção dos animais. Os melhores indicadores de bem- estar animal são os que se referem às características do animal indivíduo e não a algo proporcionado pelo homem (Broom e Molento, 2004), como o comportamento, a saúde, o desempenho e as alterações fisiológicas. O comportamento dos animais é uma ferramenta reconhecida para a avaliação do seu bem-estar (Welfare Quality®, 2009). Segundo Fraser (1983) é seguro utilizar os comportamentos de manutenção para determinar se animais mantidos em confinamento estão em um ambiente que os permita expressar seus comportamentos naturais, uma vez que pode ocorrer redução ou impossibilidade dos animais apresentarem comportamentos exploratórios (em relação ao ambiente ou a novos estímulos), seleção de alimentos (principalmente quando a dieta é composta por grãos), deslocamentos e deambulação (perambulação, andamentos naturais como trote e galope, usa de rotas específicas para andar e deitar, etc.) e manutenção corporal (termorregulação e limpeza, por exemplo). 7 De acordo com Brörkens et al. (2009), o comportamento de deitar-se dos bovinos é associado ao descanso, e a restrição de espaço pode privar ou dificultar esse comportamento, aumentando o risco de lesões nas articulações e de claudicação. Estudo realizado utilizando diferentes disponibilidades de espaço para vacas leiteiras confinadas (7,26 e 9,18 m²/animal) mostrou que houve redução do tempo que as vacas permaneciam deitadas quando a disponibilidade de espaço foi menor (Lobeck- Luchterhand et al., 2015). Resultados semelhantes foram apresentados por Gygax et al. (2007), onde ao confinar bovinos com disponibilidade de espaço de 2,5; 3,0; 3,5 e 4,0 m²/animal concluíram que, conforme há restrição de espaço, se reduz linearmente o tempo que os animais ficam deitados, além dos mesmos não estenderem as pernas como deveriam para deitar, e ainda alteraram as posições corporais enquanto deitados com menor frequência. Os comportamentos relacionados ao descanso e alimentação de vacas leiteiras confinadas com diferentes disponibilidades de espaço, são bem documentados, apesar de contraditórios. Estudos realizados por Hill et al. (2009) e Krawcsel et al. (2012) mostraram que apenas o tempo de descanso, e não o de alimentação e ruminação, foi relacionado com a disponibilidade de espaço, diferente de Friend et al. (1979) e Huzzey et al. (2006) que encontraram associações entre todas essas variáveis. Bristow e Holmes (2006) e Zoccola et al. (2012) afirmaram que a redução do tempo de ruminação está intimamente relacionada com o aumento de cortisol circulante em condições de estresse crônico. Nesse contexto, Krawcsel et al. (2012) justificaram que a diferença entre os resultados sugere que mudanças físicas no ambiente de um animal requer um tempo longo antes que alterações nos comportamentos e na produção sejam evidentes. Vale ressaltar que nos estudos apresentados acima há dois fatores que se confundem, uma vez que os autores estudaram a disponibilidade de espaço da baia juntamente com a do cocho. Mas esse fato não invalida os resultados, que de maneira geral indicam que o espaço é importante, independente de qual recurso esteja disponibilizado no mesmo. A restrição de espaço no confinamento de bovinos também está relacionada ao aumento de ocorrências de comportamentos sociais agonísticos, resultantes de maior probabilidade de haver encontros competitivos e violação do espaço individual (Fraser, 8 1980; Lindberg, 2001; Rodenburg e Koene, 2006). Resultados encontrados por Kondo et al. (1989) evidenciaram que a manutenção de um espaço individual por cada animal parece ser uma necessidade especial, uma vez que existe correlação negativa entre comportamentos agonísticos e espaço disponível para bovinos confinados (r² = -0,48; P < 0,01), e ainda comprovaram, igualmente a Gygax et al. (2007), que esses animais optam em manter maior distância entre eles quando existe espaço para tal. Outro comportamento social relevante para a avaliação do bem-estar de bovinos confinados é o de monta, responsável pela remoção de 1 a 3% dos animais do confinamento, podendo até ocasionar a morte dos mesmos (Blackshaw et al., 1997). Klemm et al. (1983) destacaram que a monta está vinculada a feromônios, podendo ser definida, primeiramente, como um comportamento sexual, mas também como uma atitude de imposição ou auto-proteção, caracterizando-se como um comportamento agressivo, sendo presente de maneira mais intensa entre os bovinos confinados, principalmente em ambientes onde recursos como sombra, alimento e espaço são disputados. De acordo com Blackshaw et al. (1997), apesar de ser um comportamento natural entre bovinos, o comportamento de monta pode se tornar uma síndrome quando alguns animais são montados constantemente (receptores) por muitos outros (autores), sendo então considerado um comportamento anômalo. Além disso, existem outros tipos de comportamentos anormais, como por exemplo, enrolar de língua ou lamber e morder instalações, que ocorrem principalmente quando os animais são mantidos em condições de restrição de espaço e agravada pela alta densidade animal (Lindberg, 2001; Broom e Fraser, 2007). De acordo com Bartolomucci (2007), existe uma relação muito forte entre fatores sociais, estresse e saúde, uma vez que, na vida em grupo, existem relações positivas e negativas que afetam psicologicamente e fisicamente os animais. Muitos dos problemas de saúde em bovinos podem ser potencializados pelas alterações ambientais provocadas pela restrição de espaço, como a crescente presença de lama (Mader, 2011) e/ou poeira (West, 2011), além dos agentes tóxicos (May et al., 2012) e patogênicos (Edwards, 2010) presentes nas mesmas. A presença de poeira está relacionada com o tamanho das partículas do solo, condições climáticas, movimentação dos animais e de veículos (West, 2011), e aumenta o risco de doenças, 9 principalmente as respiratórias (Edwards, 2010). Já o acúmulo da lama está associado às falhas no sistema de drenagem das instalações, acompanhado ao acúmulo de dejetos dos animais e maior ocorrência de chuva (Mader, 2011). Scharwtzkopf- Geinswein et al. (2012) alertaram quanto aos possíveis efeitos deletérios causados pela presença constante e abundante de lama, como claudicação, doenças nos cascos, injúrias na pele e dificuldade de caminhar e deitar, que afetam negativamente o desempenho dos bovinos confinados (Mader, 2001; Taylor et al., 2010). Krawcsel et al. (2012) afirmaram que muitos dos problemas de saúde dos bovinos confinados surgem devido à baixa imunidade em resposta ao estresse exercido pela restrição de espaço. Segundo Franci (2005), desafios físicos e psíquicos, quando crônicos, resultam em um mecanismo de retroalimentação entre o sistema endócrino e imune, onde a hiperativação do eixo HHA secreta glicocorticoides inibitórios do sistema imune, que por sua vez produzem citocinas estimuladoras da produção de CRH pelo hipotálamo, fechando o ciclo. Desta forma, as células responsáveis pela imunidade são capazes de se comunicar com o cérebro por meio do eixo HHA (Bartolomucci, 2007). A alta concentração de glicocorticoides liberados em situações de estresse crônico são responsáveis por modificações diretas e indiretas em todas as células do corpo (Habib et al., 2001), resultando nas mais diversas alterações fisiológicas que podem ser utilizadas como indicadores para avaliar o bem-estar animal de várias espécies, como: frequência respiratória (Franci, 2005), temperatura, níveis circulantes de glicose, leucócitos (Habib et al., 2001), cortisol e seus metabólitos (Fisher et al., 1997, Möstl e Palm, 2002), alterações funcionais do trato gastrointestinal (Habib et al., 2001; Franci, 2005), cardíaca (Black e Garbutti, 2002), renal (Benchimol et al., 2010; Bruce et al., 2015) e hepática (Rodríguez-Sureda et al. 2007; Duan et al., 2014). Além disso, pode causar também alterações anatômicas, principalmente das glândulas adrenais (Taylor e Constanzo, 1975; Alario et al., 1987; Szigethy et al. 1994; Mounier et al., 2005), e até mesmo psicológicas, resultando em alterações comportamentais importantes (Tsigos e Chrousos, 2002; Franci et al. 2005; Bartolomucci, 2007). Para avaliar a saúde dos bovinos confinados, foram recomendados pelo Welfare Quality® (2009) alguns indicadores visuais como a frequência de ocorrência de espirros 10 e tosses, a porcentagem de animais com corrimentos nasal e ocular, a dificuldade para caminhar, os problemas nos cascos, sujidade corporal, sinais de timpanismo e diarreia, entre outros. Ademais, Elsasser et al. (2011) sugeriram que a inapetência e menor consumo de alimento, letargia, diminuição da atividade e febre são outros indicadores também associados à saúde dos animais, e que podem ser considerados na avaliação do bem-estar animal. É importante destacar que antes de realizar as avaliações de bem estar dos animais, deve-se caracterizar a origem, intensidade e duração do agente estressor (Bartolomucci, 2007), assim como considerar que a capacidade de adaptação individual dos animais ao mesmo é dependente também de suas experiências (Mason, 2000), caso contrário, o indicador utilizado pode não ser eficaz. Por exemplo, Friend et al. (1979) associaram o estresse gerado pela restrição de espaço no confinamento de bovinos à maior atividade das glândulas adrenais, mas este resultado não foi confirmado por Fisher et al. (1997), Gupta et al. (2007) e Krawczel et al. (2012), talvez pelo fato das condições e os períodos experimentais terem sido distintos entre o primeiro e os demais estudos. O conjunto das reações fisiológicas originadas pelo estresse crônico afeta os melhores indicador de sucesso na produção animal: os desempenhos produtivo e reprodutivo. Independente da espécie, os hormônios relacionados à reprodução, lactação, crescimento e consumo, como o folículo estimulante, luteinizante, do crescimento, prolactina, grelina, leptina, insulina, entre outros, apresentam sua produção e/ou funções reduzidas devido às altas concentrações circulantes dos hormônios relacionados ao estresse crônico, como hormônio liberador de corticotrofina, vasopressina, tireotrófico e os glicocorticoides, sendo este último responsável por gerar maior disponibilidade de glicose ao organismo, mas que não é eficientemente utilizada pelos tecidos periféricos devido à sensibilização das células à insulina provocada indiretamente pelos próprios hormônios do estresse (Phillips et al., 1998; McCormick et al., 1998; Habib et al., 2001; Uchoa et al., 2014) . Resumidamente, o animal pode até se alimentar normalmente, mas a eficiência de utilização da energia é reduzida pelo estresse (Manson, 2000; Matteri et al., 2000), assim como a composição do ganho de 11 peso é alterada em função da diferenciação do metabolismo dos nutrientes nos diferentes tecidos (Elsasser et al., 2011). Segundo Fell (1999) existe correlação negativa entre a concentração de cortisol circulante e o ganho de peso (r = -0,544; P < 0,025) de bovinos confinados, resultado este corroborado por Gupta et al. (2006), que avaliaram diferentes disponibilidades de espaço no confinamento de bovinos, e observaram melhor ganho de peso e menor concentração de cortisol circulante em animais mantidos a 4,4 m²/animal (1,26 ± 0,22kg/dia) que em 1,2 m²/animal (0,59 ± 0,22kg /dia). Resultados encontrados Fisher et al. (1997) mostraram que as novilhas mantidas em 1,5 m²/animal ganharam menos peso (0,52 kg/dia) que aquelas mantidas a 2,0; 2,5 e 3 m²/animal (0,65; 0,70 e 0,69 kg/dia, respectivamente); no entanto, esses autores não observaram diferenças significativas no comportamento social nem nos valores da concentração de cortisol circulante entre os tratamentos. Adicionalmente, não só o ganho de peso dos animais pode reduzir quando um animal é submetido a estresse crônico, mas também a composição do ganho de peso pode ser alterada, principalmente pelo evidente aumento da distribuição do tecido adiposo, principalmente na cavidade abdominal (Rebuffé-Scrieve et al., 1992; Peckett et al., 2011). O estado físico e emocional dos animais e suas correspondentes reações aos manejos podem ter impactos importantes na quantidade e qualidade de carne produzida (Schaefer et al., 2001; Paranhos da Costa et al., 2012). No entanto, são escassos os estudos, em condições tropicais, como da maioria das regiões brasileiras, tratando da relação existente entre a implantação de estratégias para melhorar o bem- estar de bovinos em confinamentos e seus potenciais efeitos sobre o ganho de peso, qualidade das carcaças e da carne. Sendo assim, existem questionamentos constantes entre produtores e técnicos, que adotam o sistema de confinamento para bovinos, sobre quais seriam as melhores técnicas de manejo a serem empregadas, para que problemas sociais, ambientais e de saúde fossem evitados, garantindo melhores condições de bem-estar aos animais e, consequentemente, possibilitar a produção dos animais com critérios éticos e com lucratividade. 12 3. Referências bibliográficas ALARIO, P.; GAMALLO, A.; BEATO, M. J.; TRANCHO, G. Body weight gain, food intake and adrenal development in chronic noise stressed rats. Physiology & Behavior, v. 40, n. 1, p. 29-32, 1987. 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Animal welfare were assessed using environment based (dust score and mud depth) and animal based indicators, part of these measurements was carried out with the animals housed in confinement pens by using behavioral (number of animals standing, lying down, or in the feed bunk), comfort (percentage of dirty animals), and health indicators (number of coughs and sneezes per minute, and the percentages of animals with diarrhea, hooves alterations, locomotion problems, tegument alterations, and nasal and ocular discharges), and in the slaughterhouse, evaluating health indicators with macroscopic diagnosis (percentage of animals with bronchitis, emphysema, nephritis and urinary cyst), besides stress indicators, after the collection the adrenal glands (left and right) of 20% of the animals from each treatment, to assess the weight and cortical and medullar areas of them as stress indicators. In general, the indicators of animal welfare showed that the T24 offered better environmental conditions for the finishing phase of beef cattle than the other treatments, evidenced by the lower frequency of occurrence of dust and mud depth (P < 0.01), lower percentages of animals with nasal and ocular discharges and locomotion problems (P < 0.05), and lower percentage of animals diagnosed with bronchitis, emphysema, nephritis and urinary cyst. It is concluded that the reduction of the space allowance in commercial cattle feedlots increases the stress and impoverish the animal welfare by compromising the health, behaviour and environment. Keywords: animal welfare, behavior, feedlot, health, stress 21 Introduction Over the last few decades, there has been a worldwide trend to decrease the space allowance per animal in intensive livestock farming, which is justified by a reduction in production costs and an increase in the productivity per area, as reviewed by Thornton (2010). However, societal concerns about livestock intensification have been raised which mainly focus on its impact on the environment, food safety, and animal welfare (Vanhonacker et al., 2009; Grandin, 2014). Considering the environment, limited spaces in cattle feedlot operations usually impoverish the local air quality, increasing air dust and the concentration of noxious gases (e.g., ammonia, carbon dioxide and hydrogen sulfide), and maximize the negative effects of manure and mud accumulation, speeding up pen condition degradation (Gustafsson, 1997; May et al., 2012). The severity of these problems depends on a number of factors; for instance, the amount of mud in feedlot pens is affected by rainfall, facilities’ drainage systems, and manure accumulation (Mader, 2011); while air dust condition is directly dependent on the local weather conditions, soil type, and movement of animals and vehicles (West, 2011). Furthermore, high stocking density in cattle feedlot results in social stress, since the animals are not able to avoid competitive encounters (Kondo et al., 1989; Lindberg, 2001; Fregonesi et al., 2007). Such conditions usually lead to chronic stress over time (Fisher et al., 2003), with negative effects on cattle immune function (Jensen and Larsen, 2014) and performance (Fisher et al., 1997; Fraser et al., 2013), due to behavioral, endocrine and metabolic changes (Manson, 2000; Matteri et al., 2000). To date, the few studies addressing the impact of space allowance on the welfare of confined beef cattle have shown that animals kept in larger spaces display overall better performance and welfare (Kondo et al., 1989; Gygax et al., 2007; Gupta et al., 2007). Nevertheless, most of these studies were conducted with animals maintained in indoors feedlot, with very high stock densities (from 1.2 to 6.0 m2/animal) and few animals per lot (from 8 to 24 animals). Importantly, to the best of our knowledge, there are no studies addressing the effect of stock density on the health of confined beef cattle in outdoor feedlot. 22 Outdoor beef cattle feedlots are common in many countries, such as Brazil, Mexico, USA and Canada. In Brazil, most cattle confinement is outdoors, and animals are kept in large lots (from 100-200 animals/lot) with an average space allowance of approximately 12 m²/animal (Souza et al., 2003; Quadros, nd). Although indoor and outdoor confinements may reflect different environment for these animals, both forms of confinement restrict cattle natural behavior, but probably do it in different ways. Therefore, the aim of our study was to evaluate the effects of space allowance on the welfare of outdoor confined beef cattle. To this end, we compared the effects of three different stock densities (6, 12, and 24 m²/animal) on several variables reflecting environmental, behavioral, health and physiological animal welfare indicators. Materials and methods This study was approved by the Ethics Committee on Animal Use, from the FCAV-UNESP (CEUA - protocol number 025961/13). - Local and period of study The study was conducted in a commercial feedlot in Campo Verde, Mato Grosso State - Brazil (15º32'48" S and 55o10'08" W, 736 meters above the sea level) from August 20 to November 15, 2012, totalizing around 87 days of confinement. The study period was classified as dry (from August 20 to October 5) and rainy period (from October 6 to November 15). The weather conditions were monitored by measuring black globe temperature (BGT, °C), air temperature (AT, °C) and relative humidity (RH, %), by using a black globe and a digital thermo-hygrometer (Incoterm® - model 7663). Rainfall (mm) was registered systematically using a manual pluviometer. The AT, RH, and BGT were recorded at 20-minute intervals between 7 and 17 h every other day in the first two weeks of study and then weekly until the end of the experimental period. The cumulative amount of rainfall (mm) and the average of the maximum and minimum AT, 23 BGT, and RH over the study period are presented in the Figure 1 A, B and C, respectively, according to the study weeks. Figure 1. A – Means of the maximum and minimum air temperature (AT) and black globe temperatures (BGT), B - relative humidity (RH) and C - accumulated amount of rain, per week. - Animals, treatments and facilities We evaluated 1.350 bulls (450 Nellore and 900 crossed - Angus or Caracu bulls with Nellore cows) with 30 ± 6 months of age and weighing 392 ± 46 kg. All animals were individually identified with numbered ear tags. 0 10 20 30 40 50 60 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 T em pe ra tu re ( °C ) AT max AT min BGT max BGT min 0 20 40 60 80 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 R el at iv e H um id ity ( % ) RH max RH min 0 100 200 300 400 500 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ac cu m ul at ed r ai nf al l ( m m ) Weeks A B C Dry period Rainy period 24 The animals were transported to the farm two weeks before the beginning of the study, and kept on Brachiaria ruzizienses pasture with free access to mineral supplement and water. At day 0 the animals were weighed, vaccinated (against clostridial diseases) and dewormed (using Doramectin 1%). Nine lots with 150 animals (one with Nellore and two with Crossed cattle) were assigned to three treatments, considering the space allowance of 6 (T6), 12 (T12) and 24 (T24) m² per animal. We determined the applied spaces allowance by halving and doubling the area commonly used in commercial Brazilian feedlots. The confinement pens were enclosed by fences. All pens surfaces had approximately 5% slope, and masonry feed bunk and water trough. The water troughs measured about 1.5 meters of diameter, being common for two pens, and were cleaned three times a week. There were 50 meters feed bunk lines per pen (33 cm per animal). The variation in the pen areas was made changing their length, being 18, 36 and 72 m for treatments of 6, 12 and 24 m²/animal, respectively. The layouts of the feedlot pens are shown in Figure 2. - Animal welfare indicators The welfare of the animals was assessed considering environment (air dust intensity and depth of mud) and animal based indicators (by using behavioral, health and physiological indicators). The assessments were performed by previously trained technicians, after achieving at least 80% of correspondence between their measurements. All observers wore personal protective equipment during data collection. Environment-based welfare indicators Dust intensity The dust intensity was evaluated on alternate days during the first two weeks of the study and thereafter weekly. The evaluations were performed in the period between 07:00 and 17:00 h, every 20 minutes intervals, registering one of the following scores: (0) no dust, (1) presence of dust which does not difficult the observer to see the animals 25 and breath, (2) presence of dust which hinders the observer to see the animals and breath, and (3) presence of dust which obstructs the observer to see the animals and makes breathing difficult. Mud depth The mud depth was measured at 9 points of the pens, two points (1 and 2) in front of the pens (2.5 meters from the feed bunk), two points in the middle of the pens (3, 4), two points at the back of the pens (2.5 meters from the fence) (5, 6) and three points (7, 8 and 9) around the water trough, as shown in Figure 2. The measurements were carried out using a wood stick that was introduced in the mud, and then using a tape to measure the height of the mud marked at the stick; after each measure the stick was washed. These measures were always taken at 16:00 h by the same person, and were made every other day for the first two weeks of the study and weekly thereafter. Figure 2. Layouts of the feedlot pens showing the points where the mud depths were measured in the pens with 6 (A), 12 (B) and 24 m²/animal (C). Points 1 and 2 in front, 3 and 4 in the middle, 5 and 6 at the back of the pens and 7, 8 and 9 around the water trough (O). 26 Animal-based welfare indicators Behavioural indicators Body posture and the position that the animals occupied in the pen were used as behavioral indicators of cattle welfare. Observations were made every other day in the first two weeks of study and thereafter weekly. The assessments were performed by the same person in each pen, being recorded at 20 minute intervals from 7:00 to 17:00 h, by recording the number of animals standing and lying in front, middle and back of the pens, as well as the number of animals attending the feed bunk. The number of animals attending the feed bunk was not added to number of animals standing. The areas in "front" of the pens were equals for all treatments (5.0 x 50 m). The resulting area, subtracting the "front" from total area, were divided into two equal parts, and characterized as "middle" and "back". To facilitate observation, we demarcate the beginning and end of the areas painting the fence posts with white paint. Health indicators Health assessment were performed every other day during the first two weeks of the study and weekly thereafter, always beginning at 08:00 and following the same pens´ order by the same observer, who was positioned in front of each pen, recording data from 10% of the animals of each lot (randomly defined). The health indicators were based in the Welfare Quality Protocol® (2009), and the following scores were used: locomotion (0 = animal walks with equal times between each step and distributes the body weight in all four feet, 1 = the animal does not present balanced distribution of body weight in all four feet or time between each step is not equal, the animal limps but can get around with four feet on the floor, and needs to be examined and treated, and 2 = the animal is reluctant to support at least one of the members on the ground when walk, requiring urgent attention and care; tegument alterations (0 = the animal does not present any tegument alteration, 1 = some area in the animal’s body is without hair, and 2 = the animal presents lesion or edema in its body; hoof alterations (0 = no alterations and 1 = alteration in length or irregular shape in, at least, one of the shells). We also evaluated some clinical signs of diseases, 27 recording for each lot the number of sneezes and coughs per minute, and the percentages of animals with nasal and ocular discharge, breathing difficulty (animals with rapid respiratory rate and wheezy breath) , diarrhea and bloating (1 = presence and 2 = absence of clinical signs). At the end of the experimental period, all animals were slaughtered at a commercial slaughterhouse, and a diagnosis of health problems was carried out by examining macroscopically the kidneys and lungs of each animal. These assessments were performed by veterinarians of the Federal Inspection Service (SIF), from the Brazilian Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply, following the guidelines of the Department of Animal Products Inspection (BRASIL, 2007). Comfort indicator To evaluate the comfort of the animals we used the measure of body dirtiness as an indicator. This measurement was based in the Welfare Quality Protocol® (2009) by using the following scores: 0 = totally clean animal; 1 = animal with up to 25% of the body dirty, 2 = animal with between 25 to 50% of its body dirty, and 3 = animal with more than 50% of its body dirty. Stress indicators The adrenal glands (right and left) of 20% of the animals (randomly selected from each treatment) were collected after slaughter, at the time of evisceration. The glands were dissected (for fat and other tissues removal), identified, placed in plastic bags and refrigerated at 4 °C. After 24 hours, they were weighed individually on a precision scale, and then frozen at -18 °C. Every frozen adrenal were inserted gland in a plastic bag (previously identified), with fixative solution of Bouin for 24 hours. After being removed from this solution, the adrenal glands were dried with paper towels, and cut them lengthwise using a bistoury. Then, the adrenals glands were placed individually on clear plane surface with identification and a ruler. All samples were photographed three times with a digital camera supported on a tripod, maintaining the lens parallel to the surface. The software Image J® and digitizer table (Bamboo®) were used to measure the longitudinal and 28 transversal axis (cm) of each gland, and to calculate the total and cortical area (cm²), and by difference the medullar area (cm²) was estimated. The adrenal gland weight and medullar and cortical areas were used as stress indicators. - Diet and feeding management The animals were fed four times a day, twice in the morning (07:30 and 10:00) and in the afternoon (14:30 and 16:30). Generally the animals received 40% of the total amount of food at the last feed of the day, and 20% in each of the other three feeds. Two diets were used during the study period, the "adaptation", offered in the first 25 days of confinement, and the "finishing", offered from the 26th day until the end of the experiment, their compositions are shown in Table 1. Table 1. Composition (% of DM) of the "adaptation" and "finishing" diets offered to the cattle in all treatments during the study period Adaptation Finishing Ingredient Corn silage 44.03 14.00 Cotton hulls 00.00 12.50 Corn residue* 07.09 10.20 Milled corn 26.18 40.30 Cotton seed cake 12.67 12.38 Soybean skin 08.13 08.84 Other** 01.90 01.78 Total 100.00 100.00 DM = Dry matter; Dry matter intake = 2.4% live weight. * Residue from corn storage ** 14.93% mineral salt, 85% urea and 0.074% sodium monensin. - Statistical analyses The behavioral and the health variables were expressed by percentages of animals displaying each behavior or presenting the signs of diseases. Furthermore, the variables related to the measurements of adrenal gland were characterized by the sum of the values of the right and left glands, adjusting these values (for each individual) to the hot carcass weight, being expressed in g (weight) and cm2 (cortical and medullar areas) per 100 kg of carcass weight. 29 After the achievement database consistency assessment, the extreme values were excluded by applying the criterion of average ± 3 standard deviations. The normality was checked for all dependent variables considered continuous (mud depths, behavioral indicators, comfort and ant-mortem health indicators, adrenal gland weight and medullar and cortical areas) using the Kolmogorov-Smirnov test. The post-mortem health indicator was considered as binomial distribution. All data were analyzed using SAS software (SAS Inst. Inc. Cary, NC) and the results were considered statistically different when P < 0.05. To assess whether the frequency of dust score depended on the treatments, the chi-square test was applied, using the Proc Freq. To evaluate the effect of treatments in the mud depths, behavioral, comfort and health indicators, a repeated measures analysis of variance (ANOVA) was applied using Proc Mixed, but before we tested witch covariance matrix may be used for each variable. We considered the fixed effects of treatment, period, week within period, and the interaction between treatment and period. Genetic group was included in the model as a random effect and also the effect of lot within treatment, which was the subject on which repeated measures across weeks were taken. Mean comparisons were performed by Tukey test. The regression coefficients of the variables for each treatment were compared using orthogonal contrasts, and all of them were linear and significant (P < 0.05). The associations between the environmental welfare indicators were estimated by using the Pearson correlation coefficient, by applying the Proc Corr. The effects of treatments on the stress indicators (adrenal gland weight and medullar and cortical areas) were assessed using ANOVA with Proc Mixed, We considered the fixed effect of treatment, and the genetic group was included in the model as a random effect. Mean comparisons were performed by Tukey test. The effects of treatments (feedlot space allowance) on the occurrences of bronchitis, pulmonary emphysema, nephritis and renal cyst were analyzed by logistic regression using the GENMOD procedure of SAS. The binomial data distribution was assumed with probit link function to an adjacent normal distribution. The Ratios of the odds were calculated to obtain information regarding the possibility of developing each 30 disease between classes of space allowance treatments. In this analysis the treatment 24 m²/animal was assumed as reference category (RC). Results Environment- and animal-based welfare indicators were used to assess the effects of three space allowances on the welfare of beef cattle kept in an outdoor feedlot under tropical conditions. We hypothesized that beef cattle welfare would improve with increasing feedlot space allowance. Environment-based welfare indicators There was a significant difference in air dust content among treatments (chi- square test, DF = 6, �² = 49.02, and P < 0.01), with T24 yielding the best conditions (i.e., the lowest amount of dust and the highest frequency of “0” scores).The worst air dust conditions (scores 2 and 3) were infrequent in all treatments (see Figure 3) Figure 3. Percentages of dust score occurrence per treatment. 47.2 49.4 71.9 45.3 40.4 21.2 7.5 10.2 6.8 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% T06 T12 T24 F re q u en cy o f o cc u re n ce 0 1 2 + 3 31 All mud depth measurements (front, middle, back and around the water trough) were affected by the interaction between treatments and periods (P < 0.01). In general, mud was deeper for T6 than for T24, except for the middle and back measurements during the dry period and around the water trough in both periods (Table 2). Table 2. Treatment-period interaction means (±SE) for mud depth (cm) measured in front, middle, back and around the water trough of the feedlot pens Treatment Local and period T6 T12 T24 Front Dry 4.66 (0.68) xa 3.49 (0.63) xab 2.46 (0.54) xb Rainy 10.61 (0.66) ya 8.51 (0.59) yab 7.19 (0.66) yb Middle Dry 2.52 (1.52) xa 4.87 (1.46) xa 2.78 (1.36) xa Rainy 21.56 (1.56) ya 13.89 (1.39) yb 8.93 (1.51) yb Back Dry 4.83 (1.12) xa 3.50 (1.12) xa 0.16 (1.19) xa Rainy 17.17 (1.14) ya 14.39 (0.90) ya 5.28 (1.51) xb Water trough Dry 4.80 (2.57) xa 6.83 (2.52) xa 5.17 (2.45) xa Rainy 18.49 (2.93) ya 13.26 (2.54) ya 11.97 (2.85) ya Means followed by x,y across periods and a,b across the treatments did not differ statistically (Tukey test, P > 0.05). Animal-based welfare indicators Behavioural indicators Lying and standing behaviours were affected by period (F1, 67.9 = 1.47; P < 0.05 and F1, 68.1 = 3.99; P < 0.05, respectively), but not by treatment or period-treatment interaction, with lower relative frequencies of cattle lying and standing during the dry period (32.55 ± 1.60 and 52.23 ± 1.80% of the animals, respectively) than during the rainy period (33.54 ± 1.52 and 55.50 ± 1.70% of the animals, respectively). On the other hand, there was a significant interaction between treatments and periods for the relative frequencies of animals attending the feed bunk (F2, 69,3 = 8.20; P < 0.01). Significant lower means of feed bunk attendance were observed during the rainy period for all 32 treatments (P < 0.01), with more pronounced differences between periods for T6 and T12 (Table 3). Table 3. Means (±SE) of the percentages of animals (%) attending the feed bunk by treatment-period interaction Treatment Period T6 T12 T24 Dry 17.12 (1.08) xa 14.22 (1.05) xa 13.94 (1.01) xa Rainy 9.28 (1.09) yb 9.88 (1.05) yb 11.67 (1.07) ya Means followed by x,y across periods and a,b across the treatments did not differ statistically (Tukey test, P > 0.05). The percentages of animals lying in the front, middle and back of the pens were affected by treatments and periods in different ways, which we propose could be due to the variation in mud depth within pens over the feedlot periods, as presented below. The percentage of animals lying in the front was affected by treatment (F2, 4.94 = 6.31; P < 0.05) and period (F1, 55.6 = 4.76; P < 0.05), and a higher mean (P < 0.05) was observed for T24 (30.99 ± 2.05%) relative to T6 and T12 (11.81 ± 2.11% and 18.38 ± 2.03%, respectively), which did not differ from each other (P > 0.05); and a lower mean (P < 0.05) was observed for the dry (17.19 ± 1.62%) relative to the rainy period (23.61 ±1.54%). On the other hand, the percentage of animals lying in the back was significantly affected by the treatment-period interaction (F2, 54.3 = 3.91, P < 0.05). The mean for T24 was lower than for the other treatments in the dry period, and it was the only treatment that did not differ between periods (P > 0.05), as shown in Table 4. No significant effects of period or treatment were found for lying in the middle of the pen (P > 0.05). Table 4. Means (±SE) of percentage of animals lying in the back of the feedlot pens by treatment period interaction Treatment Period T6 T12 T24 Dry 49.40 (5.33) xa 48.73 (5.38) xa 17.78 (5.56) xb Rainy 31.68 (5.78) ya 39.48 (5.32) ya 22.17 (5.15) xa Means followed by x,y across periods and a,b across the treatments did not differ statistically (Tukey test, P > 0.05). 33 The average number of dirty animals did not differ among treatments (P > 0.05), with 37.50 ± 3.87, 31.01 ± 3.74 and 29.15 ± 3.71% of dirty animals for T6, T12 and T24, respectively, but it did differ among periods (F1, 42.1 = 96.83; P < 0.01), with a progressive increase of dirty animals over the experimental time period (Figure 4), resulting in approximately five times the percentage of dirty animals by the rainy period (11.58 ± 3.10% vs. 55.53 ± 3.02%, for dry and rainy periods). Figure 4. Percentages of dirty animals per treatment over the feedlot period. The mud depth at the back of the pens presented the highest correlation with the percentages of animals attending the feed bunk (r = -0.41; P < 0.01), lying (r = 0.27; P < 0.02), and dirty animals (r = 0.72; P < 0.01). Health indicators We evaluated ten ante-mortem (coughing, sneezing, nasal and ocular discharges, diarrhea, ruminal tympany, roof and integument alterations, locomotion deficits and breathing difficulty) and four post-mortem (bronchitis, pulmonary emphysema, urinary cist and nephritis) health indicators. While we did not observe any cases of ruminal tympany during data collection, there were two cases in the T6 and one in the T12 recorded in the farm database. During the dry period and the first three weeks of the rainy period, we did not record any cough, which precluded any statistical analyses for this trait. Nevertheless, 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 D irt y an im al s (% ) Weeks T06 T12 T24 Dry period Rainy period 34 we noticed an important numerical variation in frequency of coughs per minute among treatments, with means of 1.67, 0.33 and 0.00 for T6, T12 and T24, respectively (Figure 5B). There was a significant interaction between treatment and period for the number of sneezes per minute (F2, 74 = 6.41; P < 0.01). During the dry period, T6 animals had more sneezes/min than animals in the other treatments, while in the rainy period, no sneezes were recorded for animals in any of the treatments (Figure 5A). Differences in the percentages of animals with nasal and ocular discharges were found between periods (F 1, 72.4 = 4.59; P < 0.05) and among treatments (F 2, 72 = 5.9; P < 0.01). Means for both traits were significantly lower for T24 animals than those for the other treatments, and both symptoms were less frequent during the rainy period (P < 0.05), as shown in Figure 5C and 5D. Figure 5. Means of sneezes (a) and coughs (b) per minute, and percentages of animals with nasal (c) and ocular (d) discharges by treatments and periods. A C B D 35 Due to excessive amounts of mud during the last three weeks of the rainy period, it was not possible to record the scores for locomotion, tegument and hoof alterations, and then the statistical analyses for these traits were conducted using data only from the first three weeks of the rainy period. There was a significant effect of both treatment and period for the locomotion score (F 2, 69.1 = 1.90; P < 0.05, and F 1, 53.1 = 2.23; P < 0.05, respectively). Diarrhea was only affected by treatment (F 2, 62.0 = 1.68; P = 0.05) and hoof alteration only by period (F 1, 57.0 = 10.14; P < 0.01). No significant effects of treatment or period were observed for tegument alteration or breathing difficulty. Means for all variables are listed in Table 5. No animals displayed severe locomotion deficits (score 2). T6 animals presented the highest odds ratio of developing all diseases analyzed, and only in the case of bronchitis, T12 animals had a higher risk than the reference class animals (T24), as presented in Table 6. Table 5. Means (±SE) of the percentage of animals with locomotion deficits (LD), tegument alteration (TE), hoof alteration (HA), diarrhea (DI) and breathing difficulty (BD) by treatments and periods LD (%)* HA (%)* TE (%)* DI (%) BD (%) Treatment T6 4.07 (3.95)a 2.95 (1.55)a 3.98 (1.45)a 1.38 (0.61)a 0.48 (0.36)a T12 5.09 (2.93)a 1.23 (1.05)a 2.05 (1.41)a 0.64 (0.55)b 0.50 (0.33)a T24 0.78 (2.95)b 0.93 (1.04)a 1.93 (1.41)a 0.47 (0.55)b 0.20 (0.33)a Period Dry 1.48 (2.25)a 1.12 (1.15)a 1.28 (1.32)a 0.99 (0.43)a 0.44 (0.25)a Rainy 5.48 (3.11)b 3.23 (1.21)b 1.03 (1.36)a 0.67 (0.51)a 0.35 (0.30)a Means followed by the same letters in the columns across treatments and periods did not differ statistically by Tukey test (P > 0.05). *statistical analyses for LD, HA and TE were conducted using data until the first three weeks of the second period. 36 Table 6. Numbers and percentages of animals presenting clinical post-mortem signs of bronchitis, pulmonary emphysema, nephritis, and urinary cysts and their respective odds ratios, confidence intervals and chi-squares per treatment Disease and treatment N % Odds ratio Confidence interval �2 Bronchitis T6 153 34.02 14.88* 8.58 – 25.79 92.71 T12 65 14.44 4.90* 2.75 – 8,76 29.02 T24 15 3.33 1.00 RC . Pulmonary emphysema T6 11 2.47 5.61* 1.23 – 25.53 5.00 T12 2 0.44 1.00 0.06 – 16.12 0.00 T24 2 0.44 1.00 RC . Nephritis T6 28 6.22 3.67* 1.65 – 8.17 10.21 T12 13 2.91 1.65 0.67 – 0.25 1.20 T24 8 1.80 1.00 RC . Urinary cysts T6 43 9.58 6.69* 2.97 – 15.03 21.13 T12 10 2.24 1.43 0.55 – 3.82 0.53 T24 7 1.53 1.00 RC . Odds ratio values followed by * in the columns differ statistically from the RC (�2 test, P > 0.05). N = number of animals; (%) = percentage of animals and RC = reference class. Stress indicators The adrenal glands weight and medullar and cortical areas were used to assess the physiological status of the animals in relation to stress. There were no differences in these measurements when we compare the left and right adrenal glands; therefore, we decided to present the results as the means of the cortical and medullar areas and the sum of glands weights. Adrenal cortical area and weight were affected by treatment (F 1, 113 = 10.48 and F 2, 125 = 9.95; P < 0.01 for both), with T24 animals displaying the lowest means for both traits (Table 7). Table 7. Means (±SD) of adrenal gland medullar (MA), cortical area (CA) and weight (AW), by treatments, corrected for carcass weight Treatment MA (cm²/100 kg carcass) CA (cm²/100kg carcass) AW (g/ 100kg carcass) T6 3.59 (0.99)a 2.40 (0.50)ª 8.87 (1.13)ª T12 3.89 (0.63)a 2.27 (0.43)a 8.77 (1.12)a T24 3.73 (0.67)ª 2.11 (0.34)b 8.22 (1.20)b Means followed by the same letters in the columns did not differ statistically (Tukey test, P > 0.05). 37 Discussion In this study, we compared three different space allowances (T6, T12 and T24) for outdoor feedlot beef cattle and observed that increasing space allowance resulted in progressively more comfortable environment and healthier animals, leading to overall better animal welfare. As expected, air dust was a cause for concern only during the dry period, while mud accumulation occurred in both periods, but mostly during the rainy period. For both of these indicators, the best environmental conditions were observed for T24, and extreme mud accumulation was found for T6. These differences are probably related to the variation of stocking density among the treatments, as reported by Bonifácio et al. (2012) and Mader (2011) for mud and by West (2011) for air dust. There is empirical evidence that, besides depending on the soil moisture condition, air dust and mud accumulation are highly dependent on the cattle foot traffic on the pen surface (West, 2011; Schwartzkopf-Genswein et al., 2012). During the rainy period, we observed a reduction in the percentage of animals attending the feed bunk, as well as an increase in the percentage of animals lying and standing. A reduction in feed bunk attendance throughout the feedlot period is expected, given the increase in the diet’s energy content, what is explained by Mertens (1994) as a consequence of physiological satiety. However, these behavioral changes from the dry to the rainy period may also be attributed to the reduction in feed intake caused by the adverse pen conditions, probably mainly due to mud accumulation, as previously reported (Morrison et al., 1970; Mader, 2011). In this case, the reduction in the food intake can be attributed to psychogenic regulation (Mertens, 1994). According to Mader (2011), under such environmental conditions, maintenance requirements can increase and, as a result, cattle performance and welfare can be compromised in the long-term. In this study, we observed that this detrimental situation had an increasingly strong effect as space allowance decreased, since the reduction in animals attending the feed bunk during the rainy period (relative to the dry period) was 45.79% for T6, 30.52% for T12 and 16.28% for T24. 38 The percentage of animals lying in the front and in the back of the feedlot pens changed across study periods and treatments. During the dry period, T6 and T12 animals lay mostly in the back of the pen, while during the rainy period they chose mostly the front to lie down. T24 animals, on the other hand, lay equally across the front, middle and back of the feedlot pens for both periods. One probable explanation for the behavior observed in T6 and T12 animals during the rainy period is mud accumulation over time, which increased substantially, reaching more than 14 cm in the back of the pen for both treatments. Lying behavior is a frequent indicator of cattle comfort (Haley et al., 2001; Fischer et al., 2003), and cattle often lie while resting and ruminating (Fraser, 1983). The selection of places to lie depends on two main factors, the comfort of surfaces (Haley et al., 2001) and social interactions (Fraser, 1983). Despite the fact that pen surface degradation over time occurred across all treatments, the percentage of animals lying increased from the dry to the rainy period, reflecting the importance of this behaviour for the cattle. Regardless of the better pen conditions (with shallow mud) and the distinct pattern of pen use presented for T24 animals, we did not observed any difference across treatments in the percentage of dirty animals (scores 2 and 3). However, a visual analysis of Figure 3 shows clear differences between T24 and both T6 and T12 from weeks 5 to 8. It is important to point out that there was a rainstorm (around 90 mm) one day before the assessment on week 10, when all animals were rated as dirty, as shown in Figure 3. These results suggest that, except for extreme rainy conditions, the increase in space allowance for confined cattle can improve body hygiene. A similar trend was observed by Gygax et al. (2007), but their study was conducted with cattle confined in smaller indoor space allowances (ranging from 2.5 to 4.0 m2/bull). It is well known that challenging environments expose individuals to stress, and the effects of certain stressors are accumulative (Selye, 1952; Morbeg, 2000). Under prolonged stress situations, these stressors can cause physiological and morphological changes, as adrenal gland hypertrophy, which has been shown for some mammal species (Shively and Kaplan, 1984; Ulrich-Lay et al., 2006; Harvey, 2014). In the present study, we observed lower cortical area and weight of the adrenal gland for T24 39 cattle, indicating a lower chronic stress response in this group compared to T6 and T12 animals. One possible explanation for this finding is that lower space allowance would expose animals to unpleasant environmental factors (such as dust, noxious gases, mud, uncomfortable surfaces to lie on; Mader, 2011; West, 2011), as well as social tension (Bouissou et al., 2001). Thus, under challenging conditions, greater adrenocorticotropin hormone (ACTH) concentrations are constantly released, over stimulating the adrenal cortex, which can increase its area and gland weight (Ulrich-Lai et al., 2006; Harley, 2014). We believe that this is the first report showing that decreasing space allowance for feedlot cattle can lead to adrenal gland hypertrophy. Other relevant and negative consequence of chronic stress include the organism immunosuppression (Franci, 2005; Carroll and Forsberg, 2007; Ackermann et al., 2010), and consequently, a predisposition to illness. In this study, we observed a greater incidence of clinical signs of disease for T6 and T12 animals (Figure 4). The occurrences of sneezes and ocular and nasal discharges were greater in the dry period, being crescent as the space allowance reduced. Differently, the occurrence of coughs was inexistent for all treatments in this period. We suggest that the greater concentration of air dust in the dry period can be responsible for such events, added to the probable stress caused by the entrance on feedlot, where many of natural behaviours are suppressed, the managements are different and important environmental resources are absent or restrict (Fraser, 1983, 2013; Lee, 2013; Averós, 2014). According to Nikunen et al. (2007), Griffin et al. (2010) and Lechtenberg et al. (2011), nasal and ocular discharges, sneezes, coughs and fever are typical symptoms of bovine respiratory disease (BRD). Edwards (2010) affirmed that the BRD is a multifactorial disease caused by environmental opportunist infectious agents, that benefit from suppressed and overwhelm immune system in susceptible cattle. The same author suggested that immune-compromised cattle, previously exposed to infectious agents, as the bovine diarrhea virus, are more likely to develop BRD as a secondary infection, what could explain the higher occurrences of sneezes, nasal and ocular discharges concomitantly with the higher percentage of animals presenting diarrhea for T6 than for T12 and T24. 40 In severe untreated cases, the BRD can compromise not only the upper respiratory tract, but also reach the lungs (Thompson et al., 2006). In the present study, the occurrence of cough was limited to the rainy period, being predominant for T6, with a very low occurrence for T12 and none for T24. In this period the others respiratory symptoms decrease, probably due to the improvement of air quality. However, the high amount of mud accumulated on the rainy period could be characterized as a risk factor to aggravate the cases of respiratory infections alr