UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL BIODISPONIBILIDADE E EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO DE L E DL-METIONINA NA INTEGRIDADE INTESTINAL E ESTADO OXIDATIVO DE LEITÕES NA FASE DE CRECHE Raphael Perini Caetano Zootecnista 2019 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL BIODISPONIBILIDADE E EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO DE L E DL-METIONINA NA INTEGRIDADE INTESTINAL E ESTADO OXIDATIVO DE LEITÕES NA FASE DE CRECHE Discente: Raphael Perini Caetano Orientador: Prof. Dr. Luciano Hauschild Coorientador: Prof. Dr. Paulo Henrique Reis Furtado Campos Coorientador: Prof. Dr. Luan Sousa dos Santos Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre Zootecnia 2019 DADOS CURRÍCULARES DO AUTOR RAPHAEL PERINI CAETANO – nascido em Ribeirão Preto/SP, no dia 05 de agosto de 1990. Ingressou no curso de Zootecnia da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, Unesp – Câmpus de Ilha Solteira, em agosto de 2011, graduando-se em agosto de 2016. Durante o período de 2013 a 2014 foi bolsista de Iniciação Científica da FAPESP sob orientação do Prof. Dr. Antonio Carlos de Laurentiz e presidente do Centro Acadêmico da Zootecnia de Ilha Solteira – CAZIS na gestão 2013/2014. No período de 2014 a 2015 foi bolsista de Intercâmbio AREX/Unesp, na Universidade de Santiago de Compostela, Lugo, Espanha, também sob orientação do Prof. Dr. Antonio Carlos de Laurentiz. Em março de 2017 iniciou os estudos no curso de mestrado do Programa de Pós-graduação em Zootecnia na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp – Câmpus de Jaboticabal, sendo bolsista da CAPES e, posteriormente, FAPESP. Realizou estágio no exterior entre 2018 e 2019, financiado pela BEPE/FAPESP, na “University of Manitoba”, Winnipeg, Canadá, sob orientação do Prof. Dr. Luciano Hauschild e supervisão do Prof. Dr. Charles Martin Nyachoti. “É exatamente disso que a vida é feita, de momentos. Momentos que temos que passar, sendo bons ou ruins, para o nosso próprio aprendizado. Nunca esquecendo do mais importante: nada nessa vida é por acaso. Absolutamente nada. Por isso, temos que nos preocupar em fazer a nossa parte, da melhor forma possível. A vida nem sempre segue a nossa vontade, mas ela é perfeita naquilo que tem que ser.” Chico Xavier DEDICO Aos meus pais Sérgio e Milna, à minha irmã Jéssica, aos meus avós José e Irene e à minha tia Wilma, que me apoiaram, me encorajaram e sempre foram estímulo e exemplo de vida fundamentais. AGRADECIMENTOS A Deus por sempre iluminar meu caminho e minhas escolhas, por me dar forças para superar minhas dificuldades e por conceder tantas oportunidades e bênçãos em minha vida. À minha família por todo amor e dedicação, pela educação que me deram, pelos valores que me ensinaram e por todos os sacrifícios que realizaram por mim. Ao meu orientador Prof. Dr. Luciano Hauschild por ter acreditado em mim, me concedido a oportunidade de desenvolver este projeto e pela excepcional orientação e apoio. À Profª Drª Luciane Helena Gargaglioni Batalhão pelo auxílio e orientação burocrática referente à bolsa. Aos meus coorientadores Prof. Dr. Luan Sousa dos Santos e Prof. Dr. Paulo Henrique Reis Furtado Campos pela ajuda com a elaboração do projeto, estatística, artigo, pelos conselhos e contribuições que me deram durante o curso. À equipe do LabSui (Laboratório de Estudos em Suinocultura), por ter me acolhido e contribuído tanto para a realização de meus trabalhos quanto para meu crescimento profissional, especialmente Alicia, Alini, Estefânia e Jaqueline, que sempre estiveram ao meu lado e me ajudaram nas correrias e nos momentos difíceis. Ao Welex e ao Sr. José Antônio Segecic pela amizade, parceria, paciência, apoio e pelos ensinamentos que dividiram comigo em todas as etapas do experimento e fora deles. Aos meus amigos Hanay, Heloisa e Renan pelo apoio nas disciplinas e pelos momentos de diversão. A todos os estagiários que participaram dos experimentos que conduzi e que agregaram fortemente nas ações diárias e tarefas pesadas: Bárbara, Brandon, Eunice, Fernanda, Gabriel H., Gabriel S., Heloísa, Janine, Joseane, Larissa, Marina, Natália, Raissa e Vitor. Ao Prof. Dr. Charles Martin Nyachoti e sua equipe, por terem me permitido realizar estágio de pesquisa na “University of Manitoba”, me acolhido de forma tão calorosa e me possibilitado participar de palestras e estudos tão enriquecedores. À Tais Sasahara, à Profª Drª Marcia Rita Fernandes Machado e à equipe do Laboratório de Morfologia de Invertebrados, DBAA, FCAV, especialmente ao Prof. Dr. Fernando José Zara, Márcia Fiorese Mataqueiro e Maria Alice Garcia Bento pela paciência e auxílio com as análises de morfologia intestinal. À equipe da Profª Drª Priscila L. Gratão, principalmente à Sonia Maria R. Carregari pela orientação e ajuda com a coleta e processamento das amostras para análises de estado oxidativo. À equipe do Prof. Dr. Alceu Afonso Jordão Júnior, especialmente à Paula Payão Ovidio e à Tania Riul pela ajuda com as análises laboratoriais e pela grande amizade. À Ana Paula de Oliveira Sader e ao Sr. Orlando Agostini por todo carinho, auxílio, orientação e confiança. Às bancas de defesa de projeto, qualificação e defesa de dissertação pelas sugestões e por agregarem enormemente ao trabalho. Aos animais que deram a vida para que este projeto se concretizasse. A todos os professores, técnicos, funcionários e alunos que me auxiliaram durante o mestrado e durante a elaboração e execução do experimento. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. O projeto também foi realizado com apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) - Nº Processo 2017/10354-5 e da Evonik Nutrition & Care GmbH. i SUMÁRIO Página CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS ........................................... iii RESUMO ............................................................................................................................................... iv ABSTRACT ............................................................................................................................................ v CAPÍTULO 1 - Considerações gerais ............................................................................................. 1 1. Introdução ..................................................................................................................................... 1 2. Revisão de literatura................................................................................................................... 2 2.1. Morfofisiologia intestinal ....................................................................................................... 2 2.2. Aminoácidos na nutrição animal ........................................................................................ 4 2.3. A isomeria dos aminoácidos ................................................................................................ 5 2.4. A importância da metionina para o equilíbrio oxidativo ............................................... 7 3. Objetivos ........................................................................................................................................ 9 3.1. Objetivo geral ........................................................................................................................... 9 3.2. Objetivos específicos ............................................................................................................. 9 4. Referências ................................................................................................................................... 9 CAPÍTULO 2 - Effects of L-Methionine and DL-Methionine on bioavailability, intestinal morphology and oxidative status of weaned and growth pigs .............................................13 Abstract .................................................................................................................................................15 1. Introduction ..................................................................................................................................16 2. Material and Methods ..................................................................................................................17 2.1. Animals, housing and experimental diets ...................................................................................17 2.2. Nitrogen (N) Balance .................................................................................................................19 2.3. Sampling and collection (blood and tissues) ..............................................................................19 2.4. Chemical analysis ......................................................................................................................20 2.4.1. Preparation of tissue homogenate ..........................................................................................20 2.4.2. Determination of total proteins ..............................................................................................20 2.4.3. Determination of carbonyl level .............................................................................................20 2.4.4. Determination of the level of Malondialdehyde (MDA) .........................................................21 2.4.5. Determination of the Level of Reduced Glutathione (GSH), Oxidized Glutathione (GSSG), GSH : GSSG and Total Glutathione ......................................................................................................21 2.5. Intestinal morphology ................................................................................................................22 2.6. Statistical analysis ......................................................................................................................22 3. Results ...........................................................................................................................................23 ii 3.1. Diets and AA levels ....................................................................................................................23 3.2. Experiment 1 ..............................................................................................................................23 3.2.1. N balance assay ......................................................................................................................23 3.2.2. Oxidative status ......................................................................................................................24 3.2.3. Intestinal Morphology ............................................................................................................24 3.3. Experiment 2 ..............................................................................................................................25 3.3.1. N Balance assay .....................................................................................................................25 3.3.2. Oxidative status ......................................................................................................................25 3.3.3. Intestinal Morphology ............................................................................................................26 4. Discussion ......................................................................................................................................26 4.1. N Balance ...................................................................................................................................26 4.2. Oxidative Status..........................................................................................................................27 4.3. Intestinal Morphology ................................................................................................................28 5. Conclusions ...................................................................................................................................29 Conflict of interest ................................................................................................................................29 Acknowledgement ................................................................................................................................30 References .............................................................................................................................................30 iii CERTIFICADO DA COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS iv BIODISPONIBILIDADE E EFEITOS DA SUPLEMENTAÇÃO DE L E DL- METIONINA NA INTEGRIDADE INTESTINAL E ESTADO OXIDATIVO DE LEITÕES NA FASE DE CRECHE RESUMO - Dois estudos foram conduzidos com objetivo de comparar a biodisponibilidade relativa de L-Met e DL-Met com base em ensaio de balanço de N e os efeitos promovidos por ambas as fontes na morfologia intestinal e no sistema antioxidante de suínos em fase inicial e final de creche. Em cada experimento foram utilizados 42 suínos machos castrados (Agroceres PIC, Rio Claro, SP, Brazil: CamboroughTM x AGPIC 337TM) com peso inicial de 10,7 ± 1,09 kg e 20,5 ± 1,55 kg, respectivamente para o experimento 1 e o experimento 2. Cada experimento foi dividido em dois períodos experimentais com 21 suínos. Cada período experimental correspondeu a um bloco. Três suínos foram distribuídos aleatoriamente em 7 dietas experimentais dentro de cada bloco, resultando em um total de 6 repetições por tratamento. As dietas basais (DB) foram formuladas com deficiência de 68% em metionina, porém adequadas para os demais aminoácidos. Três níveis graduados de DL-Met e L-Met (0,03, 0,06 e 0,09%) foram suplementados à dieta basal para criar as dietas 2-7 em ambos os estudos. No experimento 1, ambas as fontes de metionina reduziram linearmente o N excretado pela urina e aumentaram linearmente a retenção de N (% de absorvido) (P ≤ 0,03). A biodisponibilidade relativa estimada para L-Met em comparação a DL-Met foi de 106% (intervalo de confiança – IC de 95%: 39 a 173%) para retenção de N (% de absorvido) em uma base equi-molar. No experimento 2, a suplementação com ambas as fontes de Met diminuiu linearmente a excreção de N urinário e aumentou linearmente o total de N retido, a retenção de N (% de ingerido e % de absorvido) (P ≤ 0,04). A biodisponibilidade estimada de L-Met em comparação a DL-Met foi de 95% (IC 95%: 13 a 177%) para retenção de N (% da ingerido) e 94% (IC 95%: 20 a 167%) para retenção de N (% de N absorvido), respectivamente em uma base equi-molar. Em ambos os experimentos, houve concentrações semelhantes de proteína carbonil e MDA no plasma, duodeno e fígado de suínos alimentados com dietas contendo L-Met ou DL-Met (P > 0,05). Não houve diferenças estatísticas na altura das vilosidades, largura das vilosidades, profundidade da cripta e razão entre altura das vilosidades : profundidade da cripta de duodeno, jejuno e íleo para ambas as fontes de Met (P ≥ 0,07). Os resultados indicam que DL-Met e L-Met são igualmente biodisponíveis como fontes de metionina e impactam positivamente na morfologia intestinal e no sistema antioxidante de suínos em fase inicial e final de creche. Palavras-chave: Aminoácido, Isomeria, Monogástrico, Morfologia Intestinal, Nutrição Animal, Suinocultura v BIOAVAILABILITY AND EFFECTS OF L AND DL-METHIONINE SUPPLEMENTATION ON GUT INTEGRITY AND OXIDATIVE STATUS OF WEANED PIGS ABSTRACT - Two studies were conducted to compare the relative bioavailability of L-Met and DL-Met based on N balance assay and the effects promoted by both sources on intestinal morphology and antioxidant system of weaned and growing pigs. In each experiment were used 42 barrows (Agroceres PIC, Rio Claro, SP, Brazil: CamboroughTM x AGPIC 337TM) with initial body weight of 10.7 ± 1.09 kg and 20.5 ± 1.55 kg, respectively for Experiment 1 and Experiment 2. Each experiment was divided into two batches with 21 pigs. Each batch corresponded to a block. Three pigs were randomly assigned to 7 experimental diets within each block, resulting in a total of 6 replicates per treatment. Basal diets (BD) were formulated with 68% methionine deficiency, but adequate for the other amino acids. Three graded levels of DL- Met and L-Met (0.03, 0.06 and 0.09%) were supplemented to the basal diet to create diets 2-7 in both studies. In experiment 1, both sources of methionine linearly reduced N excreted in the urine and linearly increased N retention (% absorbed) (P ≤ 0.03). The estimated relative bioavailability for L-Met compared to DL-Met was 106% (95% CI - confidence interval: 39 to 173%) for N retention (% absorbed) on an equi-molar basis. In experiment 2, supplementation with both Met sources linearly decreased urinary N excretion and linearly increased total N retention, N retention (% ingested and% absorbed) (P ≤ 0.04). The estimated bioavailability of L-Met compared to DL-Met was 95% (95% CI: 13 to 177%) for N retention (% of intake) and 94% (95% CI: 20 to 167%) for N retention (% absorbed N), respectively on an equi-molar basis. In both experiments, there were similar concentrations of carbonyl protein and MDA in plasma, duodenum and liver of pigs fed diets containing L-Met or DL-Met (P > 0.05). There were no statistical differences in villus height, villus width, crypt depth and villus height: crypt depth ratio of duodenum, jejunum and ileum for both Met sources (P ≥ 0.07). The results indicate that DL-Met and L-Met are equally bioavailable as methionine sources and positively impact on intestinal morphology and antioxidant system of weaned and growing pigs. Keywords: Amino Acid, Isomeria, Monogastric, Intestinal Morphology, Animal Nutrition, Pig Farming 1 CAPÍTULO 1 - Considerações gerais 1. Introdução O processo de desmame figura como um dos momentos mais críticos da suinocultura. Nessa fase, os leitões são submetidos a mudanças abruptas, como: separação da mãe, mistura com animais de outras leitegadas, alojamento em novos locais e alteração na alimentação de uma fonte líquida e altamente digestível (leite) para uma sólida e menos digestível. Estes fatores geram estímulos estressores que modificam a arquitetura entérica e a atividade enzimática. Adicionalmente, em função da imaturidade imunológica destes animais, a instalação de patógenos na região entérica também é favorecida, o que leva ao desenvolvimento de lesões que prejudicam a absorção de nutrientes (Lalles et al. , 2007). Com o intuito de minimizar os efeitos do desmame no desempenho e fisiologia dos animais, diferentes estratégias nutricionais têm sido utilizadas para amenizar o impacto do desmame em leitões. Dentre estas, destaca-se o uso de aminoácidos (AA) cristalinos em substituição ao farelo de soja, uma vez que leitões são mais propensos a reações de hipersensibilidade transitória aos antígenos da soja, podendo ocorrer lesões nos enterócitos (Resende, 2014). A redução do uso de farelo de soja nas dietas de leitões recém-desmamados tem-se mostrado benéfica para o desenvolvimento e manutenção da saúde do trato gastrointestinal (Ren et al. , 2014). Dentre os AA cristalinos disponíveis, a metionina tem sido utilizada em ampla escala na alimentação de suínos não apenas por contribuir com a fração proteica da dieta, mas por desempenhar, também, importantes funções no organismo. O principal destino da metionina retida nos tecidos intestinais é a produção de substâncias utilizadas para manter o sistema antioxidante das células e garantir a divisão e renovação celular. Estas ações possuem especial importância neste órgão, devido à constante renovação celular ocasionada pelas descamações naturais decorrentes do atrito com o alimento e também por agressões causadas por microrganismos que podem gerar inflamações (Oliveira Neto, 2014). Em termos de nutrição animal, as fontes de metionina usualmente utilizadas 2 são o ácido DL-2-amino-4 (metiltio) butanóico (DL-Met) e o ácido DL-2-hidroxi-4 (metilo) butanóico, mais conhecido como metionina hidróxi análoga (MHA-FA) (Visentini et al. , 2005). Contudo, para que o organismo consiga utilizar os aminoácidos é necessário que estes estejam na conformação de L-aminoácidos (Nelson e Cox, 2014). Portanto, quando D-aminoácidos são ingeridos, estes devem ser convertidos na forma L para sua utilização. Esse processo de conversão é mediado pela enzima D-aminoácido oxidase (Findrik e Vasić-Rački, 2007). Alguns autores têm relatado valores de biodisponibilidade similares entre DL-Metionina e L-metionina para suínos (Baker, 2006; Oliveira Neto, 2014). Em função desse aspecto, atualmente, a DL- metionina tem sido utilizada como fonte principal deste aminoácido nas dietas para todas as fases. Uma vez que a metionina é um aminoácido que desempenha funções biológicas de grande relevância em suínos, podendo otimizar o tempo de recuperação das áreas absortivas do trato gastrointestinal posteriormente aos estímulos estressores promovidos pela desmama, torna-se essencial para o desenvolvimento de programas nutricionais mais eficientes, sustentáveis e viáveis, o conhecimento de sua forma isomérica mais biodisponível e os efeitos por ela desempenhados a nível bioquímico e fisiológico. 9 3. Objetivos 3.1. Objetivo geral Estudar a similaridade de duas fontes isoméricas de metionina e seus efeitos no desenvolvimento intestinal e estado oxidativo de plasma e tecidos de leitões em fase inicial e final de creche. 3.2. Objetivos específicos • Estimar a biodisponibilidade dos isômeros L e DL-metionina para leitões nas fases inicial e final de creche por meio da realização de balanço de nitrogênio; • Avaliar possíveis efeitos das fontes isoméricas oferecidas na manutenção da integridade intestinal dos leitões, por meio de morfometria intestinal. • Avaliar por meio de análise de marcadores oxidativos em tecidos envolvidos com a metabolização da metionina, se a forma isomérica interfere no equilíbrio oxidativo dos leitões. 4. Referências Baker DH (2006) Comparative species utilization and toxicity of sulfur amino acids. The Journal of Nutrition 136:1670S-1675S. Barbosa KBF, Costa NMB, Alfenas RDCG, Paula SO, Minim VPR, Bressan J (2010) Estresse oxidativo: conceito, implicações e fatores modulatórios. Revista de Nutrição 23:629-643. Barreiro EJ, Ferreira VF, Costa PRR (1997) Substâncias enantiomericamente puras (sep): a questão dos fármacos quirais. Química Nova, 20: 647-656. 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