RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta Tese será disponibilizado somente a partir de 11/12/2021. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE ZINCO NO PERFIL PROTEÔMICO E METALÔMICO DA GELEIA REAL E NO TRANSCRIPTOMA DE ABELHAS Apis mellifera L. MARCELO POLIZEL CAMILLI BOTUCATU – SP 2021 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE ZINCO NO PERFIL PROTEÔMICO E METALÔMICO DA GELEIA REAL E NO TRANSCRIPTOMA DE ABELHAS Apis mellifera L. MARCELO POLIZEL CAMILLI ORIENTADOR: Prof. Dr. Ricardo de Oliveira Orsi BOTUCATU – SP Junho – 2021 Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Zootecnia como parte das exigências obtenção do título de Doutor em Zootecnia C183e Camilli, Marcelo Polizel Efeito da suplementação de zinco no perfil proteômico e metalômico da geleia real e no transcriptoma de abelhas Apis mellifera / Marcelo Polizel Camilli. -- Botucatu, 2021 75 p. : il., tabs., fotos Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu Orientador: Ricardo de Oliveira Orsi Coorientador: Samir Moura Kadri 1. Abelha. 2. Mineral. 3. Nutrição. 4. Apicultura. 5. Geleia real. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. i "Nem tudo que reluz é ouro, Nem todos os que vagueiam estão perdidos" J. R. R. Tolkien ii DEDICATÓRIA Aos meus pais, Marta Rita Polizel Camilli e Marcos Antonio Camilli (in memorian) pela criação, educação, carinho e amor incondicional. Por todo o suporte que me deram para alcançar meus objetivos pessoais e profissionais. Ao meu avô Antonio Luis Camilli, pela nossa amizade e por me despertar o interesse pelo mundo das abelhas. A minha avó Cecília Souza e Silva Camilli por me ensinar a amar todo e qualquer ser vivo. Ao meu irmão Marco Antonio Camilli por toda nossa amizade e cumplicidade. A minha namorada Elisa Pioltine por estar ao meu lado em todos os momentos e incentivar minhas decisões. A minha sobrinha Alice Nakayama Camilli por nos trazer esperança e alegria em tempos de pandemia, Que esta seja uma pequena retribuição por tudo o que me proporcionam. iii AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001 Ao programa de Pós-Graduação em Zootecnia – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Campus de Botucatu. Ao meu orientador Professor Doutor Ricardo de Oliveira Orsi, pela oportunidade de orientação, paciência e confiança depositada. Ao meu coorientador Doutor Samir Moura Kadri, por toda a colaboração, dedicação nesta pesquisa e pelo companheirismo ao longo desta etapa. Ao Professor Doutor Paulo Eduardo Martins Ribolla, por disponibilizar seu laboratório e pela assistência nas análises. Ao Professor Doutor Pedro Magalhães Padilha, por disponibilizar seu laboratório e pela assistência nas análises. Ao Doutor José Cavalcante Souza Vieira, por toda a colaboração e dedicação nas análises bioquímicas. Aos amigos do NECTAR: Daniel, Samir, Maurice, Gabriel, Juliana, Aime, Alex, Wellingtom, Thais e Rodrigo pela colaboração e convivência diária. Ao funcionário e amigo Maurício por toda a colaboração e parceria. iv BIBLIOGRAFIA DO AUTOR Marcelo Polizel Camilli nasceu na cidade de Bocaina – SP no dia 12 de setembro de 1991. Mudou-se para Dois Córregos aos sete meses de idade com sua mãe Marta Rita Polizel Camilli e seu irmão Marco Antonio Polizel Camilli. Aos doze anos de idade começou a acompanhar seu avô Antonio Luis Camilli em seu apiário, despertando seu interesse no mundo das abelhas. Durante a adolescência sempre teve contato com a natureza, acampando e pescando com seus amigos, o que fez com que acendesse uma verdadeira paixão pelos seres vivos e escolhesse sua futura carreira profissional. Em 2011, mudou-se para Botucatu – SP após ingressar no curso de Ciências Biológicas do Instituto de Biociências (IB) da Universidade Estadual Paulista (UNESP). No ano de 2014 teve contato com a sala de aula, tornando-se professor eventual da Escola Estadual Profa. Sophia Gabriel de Oliveira, por dois anos. Em Julho de 2016 se interessou pelas linhas de pesquisa do Núcleo de Ensino, Ciência e Tecnologia em Apicultura Racional (NECTAR) da UNESP Botucatu e realizou um estágio no setor de apicultura. Graduou-se em Ciências Biológicas pelo IB, UNESP Botucatu em Dezembro de 2016 e ingressou no Programa de Pós-Graduação em Zootecnia da FMVZ, UNESP – Botucatu sob orientação do Prof. Dr. Ricardo de Oliveira Orsi. Seu trabalho de mestrado teve como objetivo avaliar os efeitos da suplementação proteica no desenvolvimento das glândulas mandibulares de abelhas Apis mellifera. Em janeiro de 2019 ingressou no doutorado sob orientação do Prof. Dr. Ricardo de Oliveira Orsi, continuando seus estudos na área de nutrição de abelhas Apis mellifera. v RESUMO GERAL As abelhas A. mellifera possuem necessidades específicas de nutrientes para que possam desenvolver todo o seu potencial produtivo e reprodutivo, visando a sobrevivência e manutenção da colônia. Neste projeto avaliamos duas fontes de zinco (orgânico e inorgânico), em diferentes concentrações e seus reflexos no perfil metaloproteômico da geleia real e no transcriptoma de abelhas com 6 dias de idade. Foram utilizadas 35 colônias de abelhas A. mellifera, distribuídas aleatoriamente nos seguintes tratamentos (05 colmeias por tratamento): controle: xarope de açúcar sem suplementação de zinco; ZNI25: xarope de açúcar suplementado com 25 ppm de Zn inorgânico; ZNI50: xarope de açúcar suplementado com 50 ppm de Zn inorgânico; ZNI75: xarope de açúcar suplementado com 75 ppm de Zn inorgânico; ZNO25: xarope de açúcar suplementado com 25 ppm de Zn orgânico; ZNO50: xarope de açúcar suplementado com 50 ppm de Zn orgânico; ZNO75: xarope de açúcar suplementado com 75 ppm de Zn orgânico. A fonte de zinco inorgânico foi o sulfato de zinco monohidratado (37,4% de zinco) e a fonte orgânica de zinco metionina (16% de zinco), diluída em xarope de açúcar. Os níveis reais de zinco foram determinados por espectrometria de absorção atômica (FAAS). As abelhas A. mellifera recém-emergidas foram marcadas ao final de 30 dias de suplementação com caneta atóxica, na região pronoto e suas coletas para análise do transcriptoma foram realizadas aos 6 dias de idade em sua fase de nutriz, com exatamente 36 dias de experimento. Para a análise do metaloproteoma da geleia real, foi induzido a produção de geleia real pelo método de transferência de larvas. Assim que coletada, o teor proteico das amostras era mensurado por espectrômetro de UV visível, as proteínas eram separadas pela eletroforese bidimensional (2D page) e as metaloproteínas separadas por espectrômetro de absorção atômica. Todas as funções biológicas associadas as metaloproteínas que continham zinco foram identificados por espectrômetro de absorção atômica. Nossos resultados sugerem que as menores concentrações de zinco orgânico (ZNO 25) alteram o maior número de expressão diferencial de proteínas da geleia real e também aumentam a concentração proteica das amostras. Em relação as análises do transcriptoma, nossos resultados sugerem que os maiores níveis de zinco inorgânico (ZNI 75) alteram a maior via de genes relacionados a importantes processos fisiológicos, entretanto, somente as menores concentrações de zinco de fonte orgânica (ZNO25) apresentaram grande aumento de genes diferencialmente expressos quando relacionados ao grupo controle (ZN0). vi Palavras-chave: Abelhas / minerais / nutrição/ proteômica/ transcriptoma / ABSTRACT A. mellifera bees have specific nutrient needs so that they can develop their full productive and reproductive potential, aiming at colony survival and maintenance. In this project, we evaluated two sources of zinc (organic and inorganic), at different concentrations and their effects on the metalloproteomic profile of royal jelly and the transcriptome of 6-day-old bees. Thirty-five colonies of A. mellifera bees were used, randomly distributed in the following treatments (05 hives per treatment): control: sugar syrup without zinc supplementation; ZNI25: sugar syrup supplemented with 25 ppm inorganic Zn; ZNI50: sugar syrup supplemented with 50 ppm inorganic Zn; ZNI75: sugar syrup supplemented with 75 ppm inorganic Zn; ZNO25: sugar syrup supplemented with 25 ppm organic Zn; ZNO50: sugar syrup supplemented with 50 ppm organic Zn; ZNO75: Sugar syrup supplemented with 75 ppm organic Zn. The inorganic zinc source was zinc sulfate monohydrate (37.4% zinc) and the organic zinc source methionine (16% zinc), diluted in sugar syrup. Actual zinc levels were determined by atomic absorption spectrometry (FAAS). The newly emerged A. mellifera bees were tagged at the end of 30 days of supplementation with a non-toxic pen, in the pronotum region, and their collections for transcriptome analysis were carried out at 6 days of age in their nursing phase, with exactly 36 days of the experiment. . For the analysis of the royal jelly metalloproteome, royal jelly production was induced by the larval transfer method. Once collected, the protein content of the samples was measured by a visible UV spectrometer, the proteins were separated by two-dimensional electrophoresis (2D page) and the metalloproteins were separated by an atomic absorption spectrometer. All biological functions associated with zinc-containing metalloproteins were identified by an atomic absorption spectrometer. Our results suggest that the lower concentrations of organic zinc (ZNO 25) alter the greater number of differential expressions of royal jelly proteins and also increase the protein concentration of the samples. Regarding the transcriptome analyses, our results suggest that the highest levels of inorganic zinc (ZNI 75) alter the largest pathway of genes related to important physiological processes, however, only the lowest concentrations of zinc from an organic source (ZNO25) showed a large increase of differentially expressed genes when related to the control group (ZN0) vii Keywords: Bees / minerals / nutrition / proteomics / transcriptome / viii Sumário CAPÍTULO 1 ................................................................................................................................... 1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ......................................................................................................... 1 Histórico da apicultura no mundo ........................................................................................ 2 Características gerais das abelhas Apis mellifera .................................................................. 4 Importância global ................................................................................................................ 5 Geleira real ............................................................................................................................ 6 Alimentação das abelhas Apis mellifera ............................................................................... 7 Exigência nutricional ............................................................................................................. 7 Zinco ...................................................................................................................................... 8 Proteomica ............................................................................................................................ 9 Transcriptoma ..................................................................................................................... 10 Referências .......................................................................................................................... 12 CAPÍTULO 2 ................................................................................................................................. 19 Title...................................................................................................................................... 20 Abstract ............................................................................................................................... 21 Material and methods ......................................................................................................... 22 Results ................................................................................................................................. 26 DIscussion ............................................................................................................................ 28 References ........................................................................................................................... 30 Supplementary material ..................................................................................................... 35 CAPÍTULO 3 ................................................................................................................................. 37 Title...................................................................................................................................... 38 Abstract ............................................................................................................................... 38 Background ......................................................................................................................... 39 Results and discussion......................................................................................................... 40 Conclusions ......................................................................................................................... 53 Material and methods ......................................................................................................... 54 References ........................................................................................................................... 57 CAPÍTULO 4 ................................................................................................................................. 61 Implicações .......................................................................................................................... 62 viii ÍNDICE DE TABELAS Capítulo 2 Tabela 1. Total royal jelly protein concentration (g L-1) ............................................26 Tabela 2. Differential royal jelly metalloprotein expression induced by dietary supplementation with differential quantities of organic zinc........................................28 Capítulo 3 Tabela 1. Total royal jelly protein concentration (g L-1) ............................................40 viii ÍNDICE DE FIGURAS Capítulo 1 Figura 1. Pintura rupestre (relação do homem com as abelhas)......................................2 Figura 2. Apicultura no Egito Antigo..............................................................................3 Figura 3. Castas encontradas em uma colônia de Apis mellifera....................................5 Capítulo 2 Figura 1 Number of royal jelly zinc-containing protein spots.......................................26 Figura 2. Figure 2 Representative image of polyacrylamide gel protein spots after 2D- PAGE…………………………………..........................................................................27 Figura 3. Figure 3 Metalloprotein GO Annotations: biological process (a) and molecular function b).......................................................................................................................27 Capítulo 3 Figura 1 DEGs between experimental groups (ZnI25,ZnI50 and ZnI75) compared to control group Zn0……………………………………………………………………….41 Figura 2 DEGs between experimental groups (ZnO25, ZnO50 and ZnO75) compared to control group Zn0……………………………………………………………………….42 Figura 3 Venn diagrams of DEGs between experimental groups supplemented with inorganic and organic source of zinc at each concentration of zinc……………………43 Figura 4 Gene Ontology analysis of both experimental group’s intersection…………45 Figura 5 Gene Ontology analysis of the experimental groups supplemented with inorganic source of zinc…………………………………………………………...……47 Figura 6 Gene Ontology analysis of the experimental groups supplemented with organic source of zinc…………………………………………………………………………..49 Figura 7 Clustering analysis of the DEGs between experimental groups supplemented with inorganic source of zinc and control group………………………………………51 viii Fig 8: Clustering analysis of the DEGs between experimental groups supplemented with organic source of zinc and control groups…………………………………………….52 12 5.0 Referências ALBERTS, B. et al. 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