RESSALVA 

 

 

 

 
Atendendo solicitação da autora, o texto 

completo desta TESE será disponibilizado 

somente a partir de 26/09/2021. 



 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO 

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS 

DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS 

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA APLICADAS À 

FARMÁCIA 

 

 

 

 

 

 

Mariana Cristina Galeane Vicentin 

 

 

 

 

 

 

Estudo de peptídeos antimicrobianos contra Candida albicans e avaliação 

da segurança em modelo Zebrafish (Danio rerio) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara 

2019 

 

  



 

Mariana Cristina Galeane Vicentin 

 

 

 

 

Estudo de peptídeos antimicrobianos contra Candida albicans e avaliação 

da segurança em modelo Zebrafish (Danio rerio) 

  

 

 

 

 

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biociências e Biotecnologia 

Aplicadas à   Farmácia da Faculdade de Ciências 

Farmacêuticas de Araraquara – UNESP, como pré-

requisito para obtenção do título de Doutor. 

 

Candidata: Mariana Cristina Galeane Vicentin 

Orientador: Prof(a). Dr(a). Ana Marisa Fusco 

Almeida 

Coorientador: Dr. Paulo Cesar Gomes 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara 

2019 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 

Vicentin, Mariana Cristina Galeane. 
V633e           Estudo de peptídeos antimicrobianos contra Candida albicans e 

avaliação da segurança em modelo Zebrafish (Danio rerio) / Mariana 
Cristina Galeane Vicentin.  – Araraquara: s.n., 2019. 
       122 f. : il. 
 

Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de 
Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de 
Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia.   

  
Orientadora: Ana Marisa Fusco Almeida. 

Coorientador: Paulo Cesar Gomes. 
                           
       1. Peptídeos antimicrobianos.  2. Candidíase. 3. Córion. 4. 
Espectrometria de massas. 5. Toxicidade. 6. Zebrafish.  I. Almeida, Ana 

Marisa Fusco, orient. II. Gomes, Paulo Cesar, coorient. III. Título. 

                       Diretoria do Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - Faculdade de Ciências Farmacêuticas 

                                                                          UNESP - Campus de Araraquara 

 
CAPES: 33004030081P7 

Esta ficha não pode ser modificada 



DEDICATÓRIA 

 

Dedico este trabalho, primeiramente, aos meus pais Shirley e Jair, que 

sem eles, este sonho não seria possível! Gratidão por todo amor 

imenso e incondicional, toda a força e dedicação, trabalho, apoio, 

companheirismo, incentivo, pelos ensinamentos da vida, que sem 

dúvida, foram indispensáveis para meu crescimento pessoal e 

profissional, responsáveis por toda minha índole e dignidade. Agradeço 

por me ensinarem o que é uma família estruturada, companheira, 

unida e feliz!! Vocês são minha vida! 

 

A minha companheira de vida, minha irmã Michele, que nossa ligação 

vai muito além de irmandade, é uma parceria de amizade, 

companheirismo e confiança. Obrigada por sempre me estimular e 

apoiar em todas as decisões, pela força para continuar a enfrentar os 

desafios deste trabalho, pelas palavras de conforto e de incentivo, pelo 

amor e dedicação! Um obrigada mais que especial ao Leandro, que 

junto a você, minha irmã, me deram de presente dois sobrinhos 

maravilhosos, Nicole e Arthur!   

 

Ao meu companheiro, meu eterno namorado, meu marido André 

Vicentin, que sempre me ouviu nas horas de desespero e sempre 

esteve ao meu lado, com conselhos que jamais esquecerei. Gratidão 

por ter escolhido você para sempre estar em minha vida, em todos os 

momentos, e estarmos formando nossa família. Sem sua companhia 

não teria alcançado meus objetivos! Amor incondicional pela nossa 

filha Helena, que neste momento, ainda se desenvolve dentro de mim, 

mas que já enche nossa casa e nossa vida do amor mais puro e da 

benção mais grandiosa!!  

 

Aos meus avós, que mesmo não estando mais presentes, sei que de 

algum lugar, olham e zelam por mim!! 



 

À Deus, pela sua presença constante em minha vida e no meu caminho, 

agradeço pelo dom da vida e pela saúde, e pelas pessoas maravilhosas 

que me deu como família!!! 

 

“A única coisa boa que a velhice nos dá é a sabedoria. Por isso, quem 

ouve o conselho dos pais nunca se dá mal na vida” (Chico Anysio). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



AGRADECIMENTOS 

 

Meus sinceros e amorosos agradecimentos a todas as pessoas que 

auxiliaram de alguma forma para a realização deste trabalho, pela 

paciência, ajuda, amizade e apoio contribuídos. 

 

A minha orientadora Profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida, meus 

sinceros agradecimentos pela oportunidade que me cedeu no 

laboratório, pela experiência, auxílio e ensinamento para a realização 

deste trabalho. Obrigada por me permitir todo este aprendizado, por 

me ajudar a amadurecer na vida, por todo meu crescimento 

profissional e pessoal e por confiar em meu trabalho!! Só tenho 

agradecimentos e boas lembranças!! 

 

A minha eterna gratidão ao meu coorientador Dr. Paulo César Gomes, 

que por muitos momentos diários e difíceis, me ensinou muito e 

sempre com muita paciência e determinação. Aprendi muitas coisas 

com você, obrigada!!! Gratidão pela equipe que formamos no 

laboratório de Zebrafish, que juntos conseguimos ir além! Obrigada por 

toda parceria, amizade, disponibilidade e dedicação nestes anos e por 

permitir que mais esta etapa em minha vida tenha sido cumprida. 

 

A Profa. Dra. Maria José Soares Mendes-Giannini, obrigada por me 

ceder a oportunidade de trabalhar no laboratório e pela confiança. 

Obrigada por transmitir sua sabedoria e experiência, por auxiliar 

sempre na realização deste trabalho e pelo apoio. 

 

A Rosângela, técnica do laboratório de micologia, por sempre ser tão 

paciente e sempre estar disposta a ajudar em todos os momentos! 

Muito obrigada por tudo! 

 



Aos meus amigos de laboratório, que de alguma forma, cada um de 

vocês me ajudaram e compartilharam muitas lembranças diárias, por 

todo apoio, ânimo, experiências, carinho, amizade, dedicação, 

paciência, companheirismo, enfim, todos os momentos bons e ruins 

que passamos juntos, obrigada por me fazerem amadurecer e 

aprender com cada um de vocês! Momentos inesquecíveis!  

 

Um agradecimento mais que especial a Junya de Lacorte Singulani, que 

dividiu muitos momentos comigo e também pela parceria na equipe 

Zebrafish! Sempre soube que podia contar com você em todas as 

situações! Muito obrigada por sempre estar disposta a me ajudar em 

todos os momentos!! 

  

Ao Prof. Dr. Mario Sergio Palma e sua equipe, que gentilmente cederam 

alguns peptídeos para a realização deste trabalho. Meus sinceros 

agradecimentos por me permitirem trabalhar em parceria com vocês! 

 

Meu agradecimento mais que especial a minha amiga Natália 

Strohmayer, que tive a honra de conhecer no laboratório e que se 

tornou minha amiga de todas as horas! Obrigada por ser a pessoa que 

sempre se dispôs a me ajudar em muitas ocasiões no laboratório! 

Obrigada por sempre estar presente em todas as situações da minha 

vida. 

 

A Dra. Paula Aboud Barbugli, assistente de suporte acadêmico IV da 

Faculdade de Odontologia de Araraquara, pela paciência, 

ensinamentos, e pela disponibilidade do uso do aparelho de 

microscopia confocal. 

 

A todos os funcionários e docentes da Universidade Estadual Paulista -

UNESP, que de alguma forma, contribuíram para o rendimento e 

finalização deste estudo. 



 

À CAPES pelo apoio financeiro cedido. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



RESUMO  

Devido ao aumento das doenças fúngicas, do uso indiscriminado de 

antimicrobianos, associados ao aparecimento de cepas resistentes e formadoras 

de biofilmes, é essencial a busca pelo desenvolvimento de novos antifúngicos 

mais eficientes. As espécies de Candida são conhecidas pela capacidade de 

infectar humanos, sendo a formação de biofilmes um dos fatores de virulência 

mais importantes. No estudo interação patógeno-hospedeiro, bem como para 

eficácia terapêutica e segurança, algumas vantagens no uso de modelos animais 

alternativos são a redução de tempo de resposta em experimentos, eficiência e 

baixo custo quando comparado ao uso de camundongos. Desta forma, 

moléculas antifúngicas estão sendo testadas nestes animais alternativos, como 

Danio rerio (Zebrafish), um vertebrado que apresenta rápida reprodução e 

homologia genética e funcional com os mamíferos. Em relação às moléculas em 

testes, há um crescente estudo de peptídeos oriundos de venenos e da 

hemolinfa de insetos, como novos compostos antifúngicos, os quais possam 

apresentar além de boa atividade, baixa toxicidade e não-teratogenicidade. 

Neste trabalho, foram estudados peptídeos análogos de Mastoparanos de 

vespas (MKs) cuja atividade antimicrobiana já é conhecida, previamente 

sintetizados com modificações nas suas características estruturais, como 

número de resíduos de Lisina e carga líquida. Levando em consideração as 

características estruturais dos MKs, outros quatro peptídeos foram sintetizados 

e estudados, dos quais dois peptídeos (PepM1; PepM2) são análogos do 

antimicrobiano Moricin C3, derivado da hemolinfa de Galleria mellonella, e dois 

peptídeos (PepM3; PepM4) análogos dos IsCT, uma classe oriunda do veneno 

do escorpião Opisthacanthus madagascariensis. Os resultados revelaram que as 

modificações quanto ao número de resíduos carregados e a distribuição em 

relação à fração hidrofóbica na cadeia peptídica, influenciaram tanto na atividade 

anti-Candida como em relação à toxicidade. Os análogos mostraram uma 

promissora atividade antifúngica contra Candida albicans, com a concentração 

inibitória mínima (CIM) variando de 15,62 a 250 µg/mL, apresentaram diferenças 

em relação à toxicidade em Zebrafish e também à citotoxicidade em 

queratinócitos de pele. Aqueles com melhores resultados da CIM foram 

selecionados para testes em espectrometria de massas para estudo da 

permeabilidade do córion do embrião de Zebrafish, onde foi visto também, 



alterações no comportamento destes peptídeos de acordo com as diferenças das 

suas características estruturais. Além disso, a metodologia de infecção por 

imersão usando embriões de Zebrafish foi padronizada neste trabalho frente C. 

albicans e, através de mapeamento por imagem, foi possível verificar o 

estabelecimento da infecção e aderência do patógeno. 

 

Palavras – chave: Peptídeos antimicrobianos; candidíase; córion; 

espectrometria de massas; toxicidade; zebrafish. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



ABSTRACT  

Due to the increase of fungal diseases, indiscriminate use of antimicrobial linked to 

occurrence of resistance and biofilm – forming strains, the search for the 

development of new efficient antifungals is essential. Candida species are known for 

their ability to infect humans, and biofilm formation is one of the most important 

virulence factors. In respect pathogen – host interaction, as well as for therapeutic 

efficacy and safety, some advantages in the use of alternative animal models are the 

reduction of response time in experiments, efficiency and low cost when compared 

to the use of mice. Thus, antifungal molecules are being tested in these alternative 

animals, such as Danio rerio (Zebrafish), a vertebrate that exhibits rapid reproduction 

and genetic and functional homology with mammals. Regarding molecules under 

test, there is a growing study of peptides from poisons and insect hemolymph, as 

new antifungal compounds, which may present aside from to good activity, low 

toxicity and non-teratogenicity. In this work, it was studied was mastoparan analog 

peptides (MKs), whose antimicrobial activity is already known, previously 

synthesized with modifications in their structural characteristics, such as Lysine 

residues number and net charge. Taking into account the structural characteristics 

of MKs, four other peptides were synthesized and studied, of which two peptides 

(PepM1; PepM2) are analogues of the antimicrobial Moricin C3, derived from 

Galleria mellonella hemolymph, and two peptides (PepM3; PepM4) analogs of IsCT, 

a class from the poison of the scorpion Opisthacanthus madagascariensis. The 

results revealed that the changes in the number of charged residues and the 

distribution in relation to the hydrophobic fraction in the peptide chain influenced as 

well anti-Candida activity as toxicity and cytotoxicity. The analogues showed 

promising antifungal activity against Candida albicans, with minimal inhibitory 

concentration (MIC) ranging from 15.62 to 250 µg/mL, and showed differences in 

toxicity in Zebrafish. Those with the best MIC results were selected for mass 

spectrometric tests to study the permeability of the Zebrafish embryo chorion, where 

it was also seen changes in the behavior of these peptides according to differences 

in their structural characteristics. In addition, the methodology of immersion infection 

using Zebrafish embryos was standardized in this study against C. albicans and, 

through image mapping, it was possible to verify the infection establishment and 

pathogen adherence. 

Keywords: Antimicrobial peptides; candidiasis; chorion; mass spectrometry; toxicity; 

zebrafish. 



1. INTRODUÇÃO 

 

1.1. Candida albicans 

 Infecções causadas por vários microrganismos representam uma grande 

ameaça para sobrevivência humana (WISE, 2011), e além disso, os que são 

considerados comensais tornam-se patogênicos no momento em que ocorrem 

mudanças no sistema de defesa do hospedeiro ou por procedimentos invasivos, 

sendo que a emergência da resistência aos medicamentos cria obstáculos aos 

tratamentos (PAYNE et al., 2006). 

 Considera-se dentro de um bilhão de pessoas, uma estimativa de mais de 

150 milhões apresenta graves doenças fúngicas, ocasionando um grande 

impacto na sobrevivência destes ou até evoluindo para um caso fatal. Entretanto, 

a severidade varia de infecções mucocutâneas médias-assintomáticas a 

infecções sistêmicas potencialmente letais. A mortalidade relacionada as 

doenças fúngicas é similar à da tuberculose e três vezes maior do que a malária 

(BROWN et al., 2012; BONGOMIN et al., 2017). 

 Em relação as infecções fúngicas, as espécies que mais comumente 

estão envolvidas nestas doenças são as Candida spp., que estão presentes na 

cavidade oral com taxas em torno de 20-40% na população em geral, e em 

outros segmentos do trato gastrointestinal. As infecções por esta espécie 

apresentam um índice de 75%, causando uma variedade de infecções 

mucocutâneas que debilitam o paciente, e dependendo da condição do sistema 

imune (PFALLER & DIEKEMA, 2010; COLOMBO et al., 2013), como alterações 

fisiológicas na infância (prematuros), envelhecimento, imunodeficiências 

congênitas, doenças degenerativas, imunossupressão por drogas ou 

procedimentos médicos podem levar a alterações da defesa do paciente 

(COLOMBO et al., 2013; DIGNANI; SOLOMKIN; ANAISSIE, 2003). 

 Estudos estimam que cerca de um bilhão de pessoas apresentam 

infecções por fungos na pele, unhas e cabelo, com aproximadamente 10 milhões 

relacionados a infecção por candidíase na mucosa. Dentre as Candida spp. de 

importância clínica, as quais são aproximadamente 20 espécies, Candida 

albicans é o patógeno oportunista mais comum, responsável por 45% dos casos 

totais, especialmente em pacientes imunocomprometidos, tendo como um dos 

marcadores do agravamento imunológico de pacientes com AIDS a candidíase 



oral, uma das infecções oportunistas mais prevalentes nesta população, 

podendo ocorrer recorrência ou até progredir para uma esofagite (COLOMBO et 

al., 2013; JOHNSON, 2010; BONGOMIN et al., 2017).  

 Estudos mostram que C. albicans continua a ser o principal agente 

etiológico de várias manifestações clínicas que vão desde lesões superficiais da 

pele até sistêmica candidíase invasiva (SELLAM et al., 2009; COSTA et al., 

2013), e que, considerando isolados de amostras clínicas, 60% são referentes a 

C. albicans (BARBEDO & SGARBI, 2010). Este patógeno comumente coloniza 

vários sítios anatômicos em humanos (ODDS, 1988) e, mais do que isso, a sua 

resistência às drogas continua sendo uma séria preocupação no contexto clínico. 

Portanto, obter um entendimento na patogênese de C. albicans deverá melhorar 

a terapia antifúngica, e facilitar o estudo e desenvolvimento de novas drogas 

(BERMAN & SUDBERY, 2002). 

 Uma das formas de manifestação superficial causada por C. albicans é a 

candidíase oral, que pode ocorrer devido a uma alteração da imunidade local ou 

sistêmica, ocasionada pela idade (idosos e neonatos prematuros), por uso de 

prótese, exposição a drogas imunossupressivas como corticosteroides ou 

quimioterapia ou pela presença de doenças como desnutrição, diabetes, câncer, 

entre outras (VAZQUEZ & SOBEL, 2002; COLOMBO et al., 2013). C. albicans é 

responsável por aproximadamente 90% dos isolados causadores de candidíase 

oroesofágica (VAZQUEZ, 2003; COLOMBO et al., 2013). 

 Além disso, C. albicans é o agente causador mais comum de doenças 

fúngicas genitourinárias como candidíase vulvovaginal (CVV) (COLOMBO et al., 

2013; PFALLER & DIEKEMA, 2010; ILKIT & GUZEL, 2011; ALGARIHI et al., 

2019), sendo a segunda causa de leucorréia infecciosa, e em pacientes da 

América do Norte, é responsável por aproximadamente 13 milhões de casos de 

vaginite, anualmente. Estudos apontam que 75% das mulheres já apresentaram 

um episódio de CVV durante os anos férteis, estimando 5% de recidivas 

(estabelecido como quatro ou mais episódios todos os anos) (KENNEDY & 

SOBEL, 2010; COLOMBO et al., 2013; GIRALDO & WATKIN, 1998).  

 CVV se enquadra em duas classificações, dependendo da presença ou 

não de comorbidades associadas com esta condição, designadas de primária ou 

secundária. A primeira é, geralmente, responsável pela maioria dos casos e é 

idiopática; já a segunda pode manifestar-se por diferentes causas como 



desequilíbrio hormonal, desordens metabólicas, altos níveis de estrógeno, 

alguns medicamentos como antibióticos ou contraceptivos e imunossupressão 

(ACHKAR & FRIES, 2010; COLOMBO et al., 2013). 

 Os fungos apresentam parede e membrana celular, sendo sua parede 

composta principalmente de polissacarídeos como glucanos, manana e quitina 

(RUIZ-HERRERA et al., 1994). Mais especificamente de células de Candida, a 

parede é composta abundantemente por glucanos, sendo 60-65% do total dos 

polissacarídeos, e as mananas entre 20-25%. A camada externa da parede 

celular é principalmente composta de manana e laminarina. O que mais 

diferencia a classe fúngica é o componente lipídico neutro principal, conhecido 

como ergosterol (WANG, et al., 2014; SULLIVAN et al., 1983; TANIDA et al., 

2006). 

 Considerando a natureza oportunista deste patógeno, existe um 

verdadeiro desafio relacionado às defesas do sistema imune do hospedeiro e os 

fatores de virulência de C. albicans (CASADEVALL & PIROFSKI, 2003; JABRA-

RIZK et al., 2016; GRATACAP et al., 2017), como por exemplo a candidíase 

orofaríngea aguda, sendo que ela é mais comum em pacientes com neutropenia, 

podendo ter a imunidade inata e adaptativa afetada devido aos tratamentos 

imunossupressores, como radiação, quimioterapia, uso de antibióticos e 

corticosteroides (LORTHOLARY & DUPONT, 1997; SCULLY et al., 1994; 

GRATACAP et al., 2017). 

 Juntamente com Staphylococcus aureus (S. aureus), Candida é um 

patógeno predominantemente nosocomial (adquirida no hospital) causando alta 

morbidade e mortalidade (PETERS et al., 2012). Entre todas as espécies de 

Candida, C. albicans é um dos patógenos fúngicos humanos melhor estudado, 

sendo conhecido por crescer em três distintas estruturas morfológicas 

(morfogênese): leveduras, pseudohifas e hifas verdadeiras (KIM & SUDBERY, 

2011). Ambas as hifas e pseudohifas são invasivas, o que pode promover uma 

maior invasão nos tecidos durante o estágio inicial da infecção (SUDBERY et al., 

2004; MAYER et al., 2013).  Devido à hifa ter tendências de aderir e 

penetrar no tecido do hospedeiro, elas são responsáveis por infecções na 

mucosa (candidíase oral) (PETERS et al., 2012). Além disso, estas formas 

filamentosas são também importantes para a colonização de órgãos, como rins, 

causando infecções profundas. A forma de levedura, pelo contrário, pode ser 



mais adequada para disseminação na corrente sanguínea e doença sistêmica 

(SUDBERY et al., 2004).  

 A infecção de corrente sanguínea causada por C. albicans é conhecida 

como “candidemia”, sendo que esta pode levar à infecção de órgãos internos, 

uma condição conhecida como “candidíase disseminada”; e tanto a candidemia 

quanto a candidíase disseminada representam problemas médicos e clínicos 

extremamente sérios (KIM & SUDBERY, 2011). A candidíase disseminada está 

associada a 30-40% da mortalidade em pacientes imunocomprometidos 

(CHENG et al., 2004; YANG et al., 2010). Em relação a epidemiologia no Brasil, 

estudos indicam que durante um período de 12 meses (março/2002-

fevereiro/2003) em quatro hospitais da cidade de São Paulo, de um total de 7.038 

casos de bacteremias e fungemias avaliados, 4,3% do total de infecções da 

corrente sanguínea correspondia a Candida spp. (COLOMBO & GUIMARAES, 

2003; COLOMBO, 2003). Outros estudos indicam que a taxa de mortalidade 

atribuída a candidemia permanece aproximadamente 50% (COLOMBO et al., 

2007; GUDLAUGSSON et al., 2003), e que C. albicans foi a principal causa de 

candidemia em 32 de 40 estudos, mostrando prevalência com taxas entre 18,8% 

e 66% (DA MATTA et al., 2017). 

 Fatores de virulência que permitem C. albicans evoluir de comensal para 

patógeno incluem reconhecimento de biomoléculas do hospedeiro (adesinas), 

morfogênese, proteases aspartil secretadas (SAPs), fosfolipases (PLs) e 

alteração fenotípica (CALDERONE & FONZI, 2001; KUO et al., 2013; 

DEMUYSER et al., 2014). Entre estes fatores, a transição levedura-hifa 

(morfogênese) é considerada um fator de virulência crucial para patogênese de 

C. albicans (KUO et al., 2013). 

 Uma condição para a patogenicidade de espécies de Candida é a invasão 

do tecido do hospedeiro, sendo mediada por moléculas de adesão (adesinas) 

expressas na superfície, interações específicas ligante-receptor e também 

interações não específicas, que permitem a este patógeno se ligar a uma 

variedade de tecidos eucarióticos (LASS-FLORL, 2009; CHIN et al., 2016).  

 O fenômeno descrito como transição reversível entre levedura unicelular 

e formas de crescimento filamentoso para pseudohifa e hifa é chamado 

morfogênese (CALDERONE & FONZI, 2001). O crescimento de hifas é 

promovido por um número de fatores ambientais como temperatura de 



crescimento a 37 ºC, presença de soro, pH neutro, alto CO2, entre outros (KIM & 

SUDBERY, 2011; MAYER et al., 2013). Células de leveduras crescem a 30 ºC e 

em pH ácido (pH 4,0); e as pseudohifas em condições como 35 ºC e pH 5,5 (KIM 

& SUDBERY, 2011; MAYER et al., 2013). 

 A alteração fenotípica é uma transição entre estados celulares alternativos 

considerada categórica para a patogênese fúngica, para colonizar e infectar 

diferentes nichos no hospedeiro. Candida albicans altera de colônias brancas e 

lisas para colônias planas e cinzas (mais opacas), sugerindo ser importante, 

principalmente, na interação com o sistema imune do hospedeiro (GEIGER et 

al., 2004; LOHSE & JOHNSON, 2008; CHIN et al., 2016). Existem diferenças 

entre esses dois tipos de colônias, como por exemplo a forma da célula, em que 

as células brancas são ovoides e as opacas são alongadas em forma de feijão 

(CALDERONE & FONZI, 2001; ANDERSON et al., 1990). Além disso, esta 

alteração pode ser um mecanismo adaptativo das células de C. albicans para 

escapar do sistema imune do hospedeiro, pois as células brancas e opacas são 

diferencialmente fagocitadas por macrófagos (LOHSE & JOHNSON, 2008; CHIN 

et al., 2016).  

 Outro fator de virulência de C. albicans são as aspartil proteinases 

secretadas (SAPs), que são produzidas logo depois do processo de adesão à 

superfície celular. As SAPs facilitam a penetração ativa do fungo para dentro das 

células hospedeiras e aumentam a eficiência na aquisição de nutriente 

extracelular para as próprias células do patógeno (WACHTLER et al., 2012; 

NAGLIK et al., 2003; CHIN et al., 2016). Esse fornecimento de nutrientes se dá 

pela degradação de proteínas do hospedeiro, o que facilita a penetração e 

invasão dos tecidos, além da evasão das respostas imunes (GAUWERKY et al., 

2009; CHAFFIN et al., 1998; CHIN et al., 2016). 

 As fosfolipases também são enzimas que aumentam a patogenicidade da 

infecção por Candida. Elas quebram os fosfolipídios das membranas da célula 

hospedeira, que por sua vez, auxilia na aderência, penetração e por fim, na 

invasão celular (MAVOR et al., 2005; CHIN et al., 2016). 

 Muitos fungos e bactérias são descritos como capazes de formar 

biofilmes, estabelecendo comunidades resistentes em uma variedade de 

superfícies clínicas (DONLAN, 2001; HOYLE et al., 1990). Estes conglomerados 

de células aderentes representam um sério obstáculo para o tratamento da 



infecção. Em comparação com as células planctônicas, estes são extremamente 

resistentes às terapias antimicrobianas (HAWSER et al., 1998).  

 Biofilmes são comunidades dinâmicas de microrganismos aderidos 

fortemente a superfícies biológicas e não biológicas (CHANDRA, et al., 2001), 

caracterizados por uma malha fibrilar de polissacarídeos (matriz) à qual se fixam 

microrganismos, formando uma arquitetura tridimensional complexa 

(CHANDRA, et al., 2001), e estas células microbianas, ditas sésseis, diferem em 

suas propriedades biológicas de suas homólogas livres, flutuantes ou 

planctônicas (COSTERTON, et al., 1995; DONLAN & COSTERTON, 2002). A 

matriz de um biofilme funciona como barreira física afetando a penetração do 

agente antimicrobiano aplicado externamente, protegendo as células internas do 

biofilme (LONNEMANN, 2000; PIERCE et al., 2008). As células em biofilme 

exibem um distinto fenótipo de células livres flutuantes (planctônicas), incluindo 

sua reduzida susceptibilidade para agentes antimicrobianos (KUCHARIKOVA et 

al., 2013, KUCHARIKOVA et al., 2011; NOBILE et al., 2006). Estudos tem 

mostrado que a matriz extracelular do biofilme tem uma importante função na 

tolerância para os antifúngicos como a classe dos azóis (NETT et al., 2010b; 

BONHOMME & D'ENFERT, 2013; MITCHELL et al., 2015); outro processo desta 

tolerância é a densidade celular, expressão de bombas de efluxo ou ocorrência 

de células persistentes (variantes fenotípicas de tipo selvagem que são 

altamente tolerantes) (LAFLEUR et al., 2006; BONHOMME & D'ENFERT, 2013).  

 Recentemente, WÖLLERT & LANGFORD, (2016), descreveram 

mudanças na arquitetura e no mecanismo de rearranjo do citoesqueleto de 

actina em células epiteliais de pele infectadas com biofilmes de C. albicans, 

mostrando que os biofilmes são formas presentes em células hospedeiras. 

 A produção de células persistentes associada com a resistência das 

respostas imunes do hospedeiro tem mostrado que a necessidade de melhorar 

as terapias medicamentosas é crucial (CHRISTENSEN et al., 2007; SHIRTLIFF 

et al., 2009).   

 

1.2.  Peptídeos antimicrobianos (AMP`s) 

A resistência dos fungos aos agentes antifúngicos traz a necessidade 

emergencial de se descobrir novas terapias, uma vez que estas infecções podem 

ser letais. Concomitante a isto, como há um número limitado de antibióticos 



disponíveis com atividades e mecanismo de ação similares, pesquisas intensivas 

estão em progresso para novas e não-convencionais terapias antimicrobianas 

(CZAPLEWSKI et al., 2016; MAHLAPUU et al., 2016). 

Devido ao fator emergencial para a pesquisa e desenvolvimento de novos 

tratamentos antifúngicos, um interesse amplo em produtos naturais tem levado 

aos estudos com compostos não-tradicionais, como por exemplo os venenos de 

insetos e outros animais, que apresentam funcionalidades medicinais 

valorizadas no combate a muitas doenças como câncer, analgésicos, 

anticoagulantes, diabetes, entre outros (SAMY, et al., 2015; HARVEY, 2014; 

BEA, et al., 2017). 

Peptídeos de defesa do hospedeiro ou AMP`s envolvem mecanismos de 

membrana ativa ou de alvos intracelulares sem danos de membrana, que geram 

interesse por sua possível utilização como agentes antimicrobianos em uma era 

de resistência antibiótica (BROGDEN & BROGDEN, 2011; MEMARIANI et al., 

2016). Estes compostos podem ser encontrados em todos os organismos, são 

componentes importantes da defesa não específica e do sistema imune inato de 

diferentes grupos de animais (MITSUHARA, 2001; DE SOUZA et al., 2011). 

Possuem uma notável estrutura e diversidade funcional, e somando-se a 

atividade antimicrobiana direta, eles apresentam propriedades 

imunomodulatórias, o que os tornam interessantes para desenvolvimento de 

novas terapêuticas (FJELL et al., 2012; MAHLAPUU et al., 2016).  

Adicionalmente, HANCOCK & PATRZYKAT (2002) observaram que os 

AMP`s apresentam muitas propriedades benéficas, incluindo amplo espectro de 

atividade antimicrobiana, comumente não induzem resistência bacteriana, rápido 

mecanismo de morte, e apresentam atividade sinérgica quando combinados com 

antibióticos clássicos, sendo um atrativo no desenvolvimento de novos 

candidatos antimicrobianos.  

Estudos presumem que os microrganismos não criarão resistência contra 

muitos AMP`s, uma vez que eles agem na membrana celular. Isto porque, apesar 

de alguns mecanismos de resistência já terem sido descritos, eles envolvem uma 

grande alteração na composição da membrana a fim de mudar a carga, 

interferindo na associação peptídeo-alvo, ou também por serem mecanismos 

altamente específicos que não são cabíveis a um grande número de peptídeos 

antimicrobianos (BROGDEN, 2005; CHAN et al., 2006). 



Apesar de ainda ser pouco estudado como ocorre a interação de 

peptídeos com os fungos, AMP`s que são catiônicos anfipáticos podem interagir 

com os lipídios aniônicos da membrana fúngica e romper a integridade desta 

(WANG et al., 2014), formando poros que permitem a saída de nutrientes e íons 

essenciais (LI et al., 2014; MATSUZAKI, 1999; ZASLOFF, 2002).  

DENNISON et al., (2005) indicaram que o mecanismo de atuação dos 

AMP´s pode ser desde ataque direto à membrana microbiana, como até exercer 

a atividade antimicrobiana através de alvos adicionais como DNA e 

peptidoglicano (MEMARIANI et al., 2016). Muitos AMP´s possuem uma direta e 

rápida atividade devido à quebra da integridade física da membrana microbiana 

e/ou pela translocação através da membrana no interior do citoplasma da 

bactéria, atuando em alvos intracelulares (HANCOCK & SAHL, 2006; 

MAHLAPUU et al., 2016).  

Entretanto, os diferentes mecanismos de morte que não envolvem danos 

de membrana são alvos intracelulares que incluem inibição de síntese de 

macromoléculas como ácidos nucléicos ou proteínas (SUBBALAKSHMI & 

SITARAM 1998; LI et al., 2014), inibição de função enzimática ou metabólica 

(OTVOS et al. 2000; LI et al., 2014), e inibição da formação da membrana ou 

parede celular do microrganismo (BRÖTZ et al. 1998; LI et al., 2014). 

Os AMP´s constituem um grupo representado por peptídeos com 

estruturas lineares ou cíclicas, com propriedades hidrofóbicas ou anfipáticas. Em 

relação às estruturas primárias dos AMP´s, assim como no caso dos peptídeos 

antibacterianos, não existe um domínio estrutural conservado ao qual seja 

atribuída a atividade antifúngica dessas moléculas (FALICO & CASTRO, 2014; 

JESSEN et al., 2006). Muitos peptídeos antifúngicos são capazes de formar α-

hélice, o que poderia estar relacionado com sua habilidade em interagir com as 

cadeias laterais de lipídeos da membrana dos diferentes microrganismos, 

levando à ruptura da função da membrana e interferindo com o balanço osmótico 

da célula (FALICO & CASTRO, 2014; GORAYA et al., 1998). 

Forças eletrostáticas entre AMP´s catiônicos e a carga negativa da 

superfície dos microrganismos são pontos alvos para a interação entre peptídeos 

e membrana microbiana, uma vez que a interação com a membrana é fator 

crucial para a atividade direta destes (YEAMAN & YOUNT, 2003; GIULIANI et 

al., 2007; YEUNG et al., 2011; EBENHAN et al., 2014; MAHLAPUU et al., 2016).  



Levando em consideração AMP`s que atuam como dano de membrana, 

existem três mecanismos já descritos que podem causar a lise pela formação de 

poros, provocados pelos peptídeos: “carpete” (SHAI, 1999), “barril” (SANSOM, 

1991; SHAI, 1999) e “toroidal” (LUDTKE et al., 1996). No primeiro modelo, os 

peptídeos estão em contato com a cabeça do grupo lipídico durante o processo 

de permeação de membrana e não se inserem dentro do núcleo hidrofóbico da 

membrana (POUNY et al., 1992; SHAI, 1999). Já no segundo modelo, os AMP`s 

se inserem no núcleo hidrofóbico da membrana e formam poros transmembrana 

(EHRENSTEIN & LECAR, 1977; SHAI, 1999). O último modelo, apresenta uma 

maior complexidade de entendimento, resumidamente a bicamada lipídica 

dobra-se nela mesma como se fosse o interior de um toro, deformando a 

membrana e formando uma curvatura. Esta deformação e a flexão na área 

toroidal custam uma energia. Assim, os peptídeos seriam incorporados para 

auxiliar nesta energia e tensão gerados pela expansão da membrana, 

estabilizando os poros (LUDTKE et al., 1996). A figura 1 é representativa dos 

mecanismos de ação dos AMP`s (CARVALHO & MACHINI, 2013). 

 

Figura 1. Modelos de mecanismo de ação dos AMP`s em membrana lipídica. 1 

– Adsorção peptídica na superfície da membrana (modelo “barril”); 2- Interação 

eletrostática entre os resíduos carregados positivamente do peptídeo e as 

cargas negativas dos fosfolipídeos (modelo “carpete”); 3 - Inserção do AMP pela 

bicamada resultando em poro toroidal ou cilíndrico (modelo “toroidal”) 

(CARVALHO & MACHINI, 2013). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

O desenho de novos peptídeos, no intuito de aumentar atividade 

antimicrobiana e reduzir a toxicidade, tem sido amplamente estudado, apesar do 

mecanismo de ação específico ainda não ser muito bem compreendido. Esta 

melhora nas funções dos AMP`s podem ser realizadas por alterações nos 

parâmetros físico-químicos, como por exemplo tamanho da cadeia, 

anfipacidade, conteúdo de conformação alfa-hélice e carga líquida positiva 

(DATHE & WIPRECHT, 1999; DATHE et al., 2002; DE SOUZA et al., 2011).  

Estudos destacam que alguns peptídeos são capazes de suprimir a 

formação de biofilmes e induzir a dissolução de biofilmes existentes, sendo este 

último especialmente importante, uma vez que pode alterar totalmente a 

maturação dele, existindo ainda aqueles que possuem capacidade de 

sensibilizar os biofilmes, permitindo que estes se tornem mais sensíveis a ação 

de outros agentes microbianos (FJELL et al., 2012; MEMARIANI et al., 2016; 

LEITCH & WILLCOX, 1999).   

Peptídeos antimicrobianos têm sido isolados de venenos de animais, que 

são misturas complexas de componentes utilizados no intuito de defesa e no 

ataque as suas presas. Muitos venenos já foram estudados com objetivo de 

isolar os AMP`s, incluindo insetos como vespas e também do escorpião, como 

por exemplo o peptídeo polybia-CP, ILGTILGLLKSL-NH2, isolado da vespa 

Polybia paulista (SOUZA et al., 2005). Este AMP mostrou atividade 

antibacteriana e antitumoral, com mecanismo de ação membrana-ativa, 

entretanto, pouco se conhece sobre este mecanismo (WANG et al., 2011; WANG 

et al., 2012; WANG et al., 2016). 

Peptídeos mastoparanos isolados dos venenos de vespas tem alta 

atividade antimicrobiana, por exemplo, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, 

Bacilus subtilis, entre outros. Eles são tetradecapeptídeos amidados na porção 

C-terminal, policatiônicos e geralmente tem de dois a quatro resíduos de Lisina 

em suas sequências (DE SOUZA et al., 2011; NAKAJIMA et al., 1986). Estudos 

de número de resíduos de Lisina e sua distribuição na sequência dos peptídeos 

sugerem sua influência na anfipacidade e na carga líquida positiva destes 



peptídeos, promovendo um segmento hélice estável e uma mais homogênea 

superfície hidrofóbica, e consequentemente influenciando a interação com 

membranas (DE SOUZA et al., 2011; DE SOUZA et al., 2015; DOS SANTOS et 

al., 2004; DA SILVA et al., 2014).  

Mastoparanos possuem muitos mecanismos de ação, além dos 

causadores de membrana discutidos na figura 1. O posicionamento dos resíduos 

de Lisina (posições estratégicas 4/5 e 11/13) mantém estável a alfa-hélice, que 

se expande do resíduo 4 ao 13, tendo uma superfície hidrofóbica mais 

homogênea na estrutura anfipática, podendo contribuir para a máxima eficiência 

lítica (DE SOUZA et al., 2011). 

Os insetos apresentam um sistema imune efetivo, com mecanismos de 

resposta humoral e inata. Fagocitose e encapsulação, por exemplo, são 

mediados por hemócitos, e os peptídeos e proteínas antimicrobianas são 

componentes essenciais da resposta imune humoral, sendo estes sintetizados 

no corpo gordo do inseto durante a resposta contra patógenos, e secretados na 

hemolinfa (apresenta funcionalidades análogas ao soro de mamíferos), sendo 

depois difundidos para os locais da infecção para combater os componentes das 

bactérias ou da parede celular fúngica (BULET & STOCKLIN, 2005; 

FERRANDON et al., 2007; JIRAVANICHPAISAL et al., 2006; LAVINE & 

STRAND, 2002; LECLERC & REICHHART, 2004; MARMARAS & 

LAMPROPOULOU, 2009; MAKA et al., 2010; BULET et al., 1999; 

VIERSTRAETE et al., 2004; BERGIN et al., 2006), uma vez que a resposta 

imune adaptativa é inexistente nestes invertebrados (FARUCK et al., 2016).  

Um modelo de inseto que tem sido amplamente utilizado para estudos de 

resposta imune é a traça de cera Galleria mellonella (Lepidoptera). Pesquisas 

recentes mostraram a presença de um grande conjunto de peptídeos 

antimicrobianos na hemolinfa da mesma. Dentre os identificados, alguns são 

peptídeos lineares alfa hélice (cecropina e moricin-like), peptídeos estabilizados 

por cisteína (defensinas), ricos em prolina e glicina (gloverin) (BROWN et al., 

2008, 2009; CYTRYNSKA et al., 2007; KIM et al., 2004; LEE et al., 2004; MAK 

et al., 2001; SCHUHMANN et al., 2003; MAKA et al., 2010). 

Os AMP`s produzidos pela larva podem ter interações benéficas que 

incluem sinergismo, diversificação funcional e potencialização (BARRIBEAU et 

al., 2014; DOBSON et al., 2013; MOGHADDAM et al., 2016), tornando-se mais 



eficaz e permitindo a ação direta sobre patógenos específicos (VILCINSKAS et 

al., 2013; HAINE et al., 2008; MOGHADDAM et al., 2016). 

Estudos indicam que o sistema imune da larva de Galleria mellonella 

diferencia – se e responde adequadamente a partir do patógeno em que entrou 

em contato. Peptídeos antimicrobianos e proteínas são cruciais na resposta 

imune humoral e são produzidos contra os patógenos invasores (MAK et al., 

2001). 

MAK et al., 2001 fizeram estudos com G. mellonella infectada com vários 

patógenos, sendo um deles C. albicans, e analisaram a resposta imune da larva 

frente produção de AMP`s, como cecropin, anionic 1 e 2, entre outros. Eles 

observaram que quando a larva está infectada com C. albicans não provoca 

muitas mudanças efetivas nos níveis dos peptídeos antimicrobianos estudados, 

pois talvez leva ao aparecimento de outros peptídeos não investigados. Outra 

observação foi que o peptídeo anionic 2 pode atuar sinergicamente com outros 

AMP`s presentes na hemolinfa, potencializando sua atividade. 

Destacando outros dois peptídeos isolados de animais, conhecidos como 

a classe do IsCT, foram denominados como IsCT (ILGKIWEGIKSLF-NH2) o 

primeiro AMP isolado por DAI et al., 2001, e IsCT2 (IFGAIWNGIKSLF-NH2), 

isolado do mesmo veneno, dividindo 78% de homologia com o primeiro, 

apresentando semelhante atividade biológica, isolado por DAI et al., 2002. 

Ambos foram originados do veneno do escorpião da espécie Opithancatus 

madagascariensis, apresentando 13 resíduos de aminoácidos com C-terminal 

amidado, formando uma estrutura secundária alfa-hélice com propriedades 

anfipáticas. A denominação IsCT é devido à esta espécie ter sido encontrada em 

Isalo, Madagascar e o peptídeo ter atividade citotóxica (DAI et al., 2001; BEA et 

al., 2017). 

DAI et al., (2001, 2002), mostrou uma promissora atividade antimicrobiana 

dos dois IsCT (IsCT e IsCT2) frente Staphylococcus aureus, Escherichia coli, 

Candida albicans, entre outros; por outro lado, os peptídeos resultaram em alta 

atividade hemolítica (BELOKONEVA et al., 2003). Desta forma, estes resultados 

mostram o quão importante são os estudos relacionados à substituição de alguns 

resíduos de aminoácidos na estrutura peptídica, a fim de reduzir a toxicidade e 

melhorar atividade antimicrobiana.  



Sendo assim, estudos já demonstraram vários análogos de IsCT com 

resíduos substituídos em posições definidas que apresentaram uma melhora da 

atividade com a toxicidade considerada moderada ou até mínima (LIM et al., 

2005; BEA et al., 2017), porém estudos envolvendo a atividade antifúngica desta 

classe de AMP`s ainda são escassos na literatura. 

 

1.3. Espectrometria de massas e Abordagem Proteômica 

A espectrometria de massas (MS) abrange uma tecnologia imprescindível 

para a interpretação das informações codificadas pelos genes, ou seja, 

proteínas. O primeiro espectro de massas foi obtido em 1912 e o grande avanço 

da espectrometria de massas no campo biológico aconteceu somente a partir da 

década de 80, com o desenvolvimento de técnicas mais avançadas conhecidas 

como MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) e ESI (Electrospray 

Ionization) (PALMA et al., 2010). 

A análise proteômica é um conjunto de metodologias analíticas que são 

capazes de caracterizar qualitativamente e quantitativamente um proteoma, 

sendo uma área interdisciplinar da ciência, agrupando disciplinas como química, 

física, biologia e informática (CANTÚ et al., 2008; TYERS & MANN, 2003; 

AEBERSOLD & MANN, 2003). Toda essa junção de áreas e conhecimentos é 

extremamente necessária pois o objetivo é estudar a função e/ou 

comportamento dos genes com base na identificação das proteínas por eles 

expressas. Os dados de espectrometria de massas também são utilizados para 

informações relacionadas na identificação de peptídeos e proteínas a partir de 

banco de dados depositados (CANTÚ et al., 2008; TYERS & MANN, 2003; 

AEBERSOLD & MANN, 2003). 

O instrumento conhecido como espectrômetro de massas é formado por 

sistema de injeção de amostra, fonte de íons, analisador de massas, detector e 

sistema de aquisição de dados. A técnica de espectrometria de massas 

determina a relação de massa e carga (m/z) de espécies ionizadas em fase 

gasosa (PALMA et al., 2010).  

As fontes de ionização, como o próprio nome indica, possuem a função 

de ionizar suavemente, para preservar a estrutura polipeptídica, e transferir as 

moléculas a serem analisadas para fase gasosa. O analisador de massas separa 

os íons formados de acordo com sua relação m/z. Após esta separação, os íons 



são detectados por eletromultiplicadores que constituem os detectores mais 

largamente usados, e então são isolados e submetidos à fragmentação por 

colisão com moléculas de gás inerte, como nitrogênio. Este espectro de 

fragmentação resultante é chamado de espectro de massas sequencial ou 

MS/MS (CANTÚ et al., 2008).   

Finalmente, após todos esses processos, os resultados de massa 

molecular (MM) dos peptídeos, tanto quanto a relativa sequência de aminoácidos 

destes (MS/MS) podem ser pesquisados nos bancos de dados depositados nos 

softwares mais comumente utilizados, que são o Sequest (ENG et al., 1994) e o 

Mascot (PERKINS et al., 1999) (CANTÚ et al., 2008). 

 

1.4. Abordagem Peptidômica  

O peptidoma representa o conjunto inteiro de peptídeos naturais de um 

sistema de célula, tecido ou corpóreo, em um determinado prazo, sob uma 

específica condição fisiológica (AMADO et al., 2010). Estudos já demonstraram 

que o peptidoma vai além de uma simples junção de produtos da degradação de 

proteínas, podendo ser espécies ativas cruciais em muitos processos biológicos 

(VILLANUEVA et al., 2006; VILLANUEVA et al., 2006; AMADO et al., 2010), 

apesar de habitualmente o peptidoma ser considerado uma consequência de um 

desequilíbrio entre a atividade de proteases e a ação de inibidores destas 

(DOUCET et al., 2008; AMADO et al., 2010). 

A metodologia de análise peptidômica foi introduzida por SCHULZ-

KNAPPE et al., (2001), a fim de avançar nas limitações propostas pelas 

metodologias proteômicas convencionais baseadas em gel, para moléculas com 

tamanho inferior a 15000Da. Tendo em mente estes fatores, o peptidoma pode 

ser então considerado como uma ampliação do proteoma, estendendo-se aos 

menores valores de massa de todas as proteínas, independente da origem do 

peptídeo (AMADO et al., 2010). 

Uma vez que a abordagem peptidômica vem crescendo, os avanços em 

instrumentos permitem uma rotina de sequenciamento e identificação de muitos 

peptídeos em várias amostras, como por exemplo fluídos corpóreos, tecidos e 

células (VILLANUEVA et al., 2005; AMADO et al., 2010); e com isso, o 

desenvolvimento de novas ferramentas médicas para diagnósticos ou até para 

desvendar a fisiopatologia de algumas doenças, estão se destacando. Um 



exemplo importante dessas novas ferramentas é a possibilidade de descobrir um 

potencial peptídeo biomarcador de doenças, como infecção ou câncer de tireóide 

(VILLANUEVA et al., 2006; AMADO et al., 2010), entre outras aplicabilidades. 

 

1.5. Modelo Zebrafish (Danio rerio)  

O controle sobre o uso de animais experimentais é crescente, e este 

assunto atrai a atenção de toda sociedade por ser um debate ético. Após os anos 

70 surgem leis que se baseiam no princípio dos 3Rs da experimentação animal, 

que foram propostos por Russel e Burch em 1959, em busca de uma estratégia 

de abordagem em relação à experimentos envolvendo animais (SCHATZMAYR 

& MÜLLER, 2008). 

Os 3Rs provém do inglês Replacement (Substituição), Reducement 

(Redução) e Refinement (Refinamento) do uso de animais em experimentos, e 

logo tornaram-se diretrizes para o controle destes em diversos países 

(SCHATZMAYR & MÜLLER, 2008). Para isso, métodos alternativos são 

considerados, sendo estes prioritários para diminuir a dor e o desconforto dos 

animais, reduzir seu número em trabalhos ou que substitua o uso de uma 

espécie animal por outra, de categoria inferior na escala zoológica, ou também 

por métodos computadorizados ou in vitro. Além disso, os animais selecionados 

para uso em protocolos experimentais devem ser de espécie e qualidade 

apropriada e com número mínimo para a obtenção de resultados válidos 

cientificamente (BONELLA, 2009). 

Em 8 de Outubro de 2008, o Brasil sanciona uma lei federal que 

regulamenta a experimentação animal, a chamada Lei Arouca, que estabelece 

critérios na criação e utilização de animais em atividades de ensino e pesquisa 

científica, em todo território nacional. Esta lei visa proteger e equacionar o uso 

dos animais de laboratório, reconhecer os direitos e estatuto moral dos animais, 

sem atitudes radicais e desarmônicas de qualquer natureza, e ainda assim, não 

impedir o avanço do conhecimento e da pesquisa (CALDAS, 2009).   

Estabelecer modelos efetivos de animais para estudos de interação 

patógeno-hospedeiro e busca de novos antifúngicos, é fundamental para o 

crescimento e desenvolvimento das pesquisas.  

Os camundongos são modelos animais predominantes usados para 

pesquisa de C. albicans, entretanto, estes são difíceis de usar em estudo de 



larga escala devido ao número limitado de descendentes produzidos e excessivo 

custo experimental. Logo, vários modelos invertebrados têm sido utilizados nas 

pesquisas, tais como Galleria mellonella (traça de cera), Drosophila 

melanogaster (mosca da fruta) e o nematódeo Caenorhabditis elegans 

(ALARCO et al., 2004; COTTER et al., 2000; PUKKILA et al., 2009). Estes 

simples hospedeiros apresentam muitas vantagens, como imunidade inata 

conservada, sistemas bem desenvolvidos, e cuidados acessíveis, entre outros 

(MYLONAKIS et al., 2007). Por outro lado, o sistema imune destes animais 

possui maior diferença quando comparado com os mamíferos, particularmente 

a falta da imunidade adaptativa. As limitações destacam a necessidade de outros 

modelos para revelar o mecanismo complexo da patogênese fúngica (ZON & 

PETERSON, 2005). 

O Danio rerio, popularmente conhecido como Zebrafish, peixe-paulistinha 

ou peixe-zebra, é uma espécie de peixe vertebrado teleósteo que pertence à 

família Crypinidae. O nome Zebrafish é derivado das faixas que estão presentes 

no lado do seu corpo, sendo que ele tem cinco listras alternadas em azul-preto 

e prata-amarelo, contendo dois tipos de células de pigmentos, melanóforos e 

iridóforos, xantóforos e iridóforos, respectivamente (REED & JENNINGS, 2011). 

Os peixes machos possuem uma barriga amarelada e são mais magros do que 

as fêmeas, que são mais prateadas (BOPP et al., 2006; STAVELEY, 2015).  

A utilização do Zebrafish como modelo experimental cresceu 

consideravelmente em poucas décadas. E levando em consideração os 

princípios dos 3Rs, como revisto pelo autor SNEDDON et al., (2017), Directive 

2010/63/EU na proteção de animais utilizados para propostas científicas 

especificou que, o peixe torna-se um animal protegido uma vez que ele é capaz 

de alimentar-se independentemente, ou em aproximadamente 120 horas pós 

fertilização (hpf). Desta forma, de acordo com estes estudos e com DUCHARME 

et al., 2015, o uso de embriões e larvas de Zebrafish está de acordo por ser 

considerado um modelo alternativo em estágios embriônicos (HAMM, et al., 

2019). 

Este peixe, que anteriormente era criado apenas como ornamental, tem 

sido utilizado em diversos estudos, desde células tronco até as bases das 

mudanças comportamentais induzidas por vício em drogas. Essa rápida 

mudança se tornou possível devido a avanços em tecnologia, conjuntamente 



com uma caracterização detalhada do animal em nível genético e molecular. 

Estes avanços permitiram o uso do Zebrafish como um vantajoso modelo 

experimental, a fim de buscar soluções para questões em biologia, doenças e 

genética humana. O Zebrafish apresenta rápida reprodução e fecundação 

externa, e tem sido muito utilizado em ensaios toxicológicos de novos fármacos 

devido à homologia genética e funcional com mamíferos (LEE & FREEMAN, 

2014; RIZZO et al., 2013; LANTZ et al., 2014; CARLSSON et al., 2014). 

O peixe é conhecido por ter alta fertilidade, o que o torna adequado para 

estudos de grande escala, e a fertilização ocorrer externamente (ZON & 

PETERSON, 2005; CHIN et al., 2016; BOPP et al., 2006). Quando os ovos não 

estão fertilizados, o crescimento é interrompido depois da primeira divisão de 

poucas células e aparecem mais turvos. Ovos fertilizados imediatamente 

tornam-se transparentes, o que faz este modelo animal muito utilizado na 

pesquisa (CHAO et al., 2010).  

Em comparação aos outros animais, o Zebrafish possui a vantagem de 

usar técnicas menos invasivas, pois tanto o embrião quanto a larva são 

transparentes, facilitando procedimentos como manipulação genética ou 

tratamento farmacológico. Além disso, estas técnicas minimizam o sofrimento do 

animal e melhoram os resultados experimentais (CHIN et al., 2016).  

Outra vantagem no uso deste embrião frente aos outros animais 

alternativos é a presença de imunidade inata e adaptativa, e mimetiza os 

mamíferos no contexto de anatomia, genética e fisiologia (MEEKER & TREDE, 

2008; CHIN et al., 2016). 

Além disso, o seu desenvolvimento é independente do peixe materno e 

acontece rapidamente, sendo que dentro de três dias, o embrião já se torna 

larva; são mantidos em água tratada especificamente com parâmetros de fácil 

manutenção, adequando o peixe para testes de alto rendimento (HERMSEN et 

al., 2011).  

 A larva do Zebrafish é considerada ideal para avaliar testes de atividade 

antifúngica in vivo bem como toxicidade em hospedeiros, por ser um vertebrado 

complexo comparado aos outros modelos alternativos, com sistemas de órgãos 

conservados e vias metabólicas (MACRAE & PETERSON, 2015; ROSOWSKI et 

al., 2018). Além disso, este animal oferece uma alternativa econômica aos 

estudos com mamíferos, excelentes ferramentas visuais e moleculares; mas 



como qualquer modelo animal, ele também apresenta algumas limitações, 

porém quando utilizado da melhor maneira em que é aplicável, este modelo é 

capaz de responder muitas perguntas (ROSOWSKI et al., 2018). 

Em embriões de Zebrafish, existem dois complexos diferentes de 

membranas, que são nomeadas como coriônica externa (zona radiata, 

conhecida como córion) e membrana plasmática interna (vitelina), e entre estas 

membranas, há um espaço perivitelino preenchido com líquido viscoso (KIMMEL 

& LAW, 1985; RAWSON et al., 2000).  

O córion do embrião é um envelope acelular, altamente estruturado que 

envolve o ovo durante o desenvolvimento embrionário, funcionando como uma 

barreira ao ambiente externo (HART et al., 1984; HENN, 2011), com várias 

funções, como proteção mecânica (RIEHL, 1991; HENN, 2011), proteção contra 

microrganismos (HISAOKA, 1958; HENN, 2011), flutuabilidade funcional 

(PODOLSKY, 2002; HENN, 2011), entre outras. Esta barreira é composta 

principalmente de glicoproteínas e proteínas, em que compostos e outras 

moléculas passam através de  canais de poros, que são parciais ou totalmente 

fechados, e parecem ser livrementes permeáveis à água, eletrólitos e pequenas 

moléculas, dependendo da fase de desenvolvimento em que o embrião se 

encontra (COWARD et al., 2002, POTTS & EDDY, 1972; RAWSON et al., 2000; 

SCAPIGLIATI et al., 1994; YAMAGAMI et al., 1992; ZHANG & RAWSON, 1996; 

HENN & BRAUNBECK, 2011; BONSIGNORIO et al., 1996). As glicoproteínas 

possivelmente são responsáveis por prevenir a transferência de material aquoso 

para dentro e fora do embrião (LILICRAP, 2010; HENN, 2011). 

Desta forma, dependendo do estágio embrionário, o córion apresenta 

diferenças na sua permeabilidade, sendo maior conforme seu crescimento e 

também ficando mais sensível aos compostos em fases posteriores. No estágio 

de clivagem inicial (entre 1 e 2 hpf), a permeabilidade começa a aumentar e o 

fechamento do blastóporo (entre 2 e 4 hpf) é observado, com permeabilidade 

máxima durante a epibolia (entre 5 e 10 hpf) (HARVEY et al., 1983; ADAMS et 

al., 2005; HERRMANN, 1993). 

Zebrafish é utilizado em pesquisa biomédica devido à facilidade em 

experimentação manual e administração de drogas. Além disso, essa 

transparência ótica dos embriões permite a visualização em tempo real das 

interações patógeno-hospedeiro (CHEN et al., 2015).  



Recentemente, o Zebrafish tem sido utilizado em genética, na descoberta 

de drogas, otimização de compostos, toxicologia e estudo de segurança de 

medicamentos (KAWAHARA & KUNKEL, 2013; SANTORIELLO & ZON, 2012); 

seus genes são homólogos aos genes humanos em aproximadamente 70%, e 

parcialmente em sequência de proteínas (HOWE et al., 2013; SORAYA et al., 

2013). Além disso, o Zebrafish possui similaridade com sistemas nervoso e 

cardiovascular, fígado, pâncreas, intestino, vesícula biliar e algumas vias 

metabólicas de mamíferos; este animal apresenta citocromo p450, enzimas e 

receptores nucleares (CHEN & ZENG, 2011) similares aos mamíferos. Portanto, 

é uma espécie que tem sido usada como modelo para estudos de farmacologia 

e toxicologia (JURCZYK et al., 2011; LI et al., 2010).  

Em relação a ensaio de infecção, CHAO et al. (2010) demonstraram que 

C. albicans coloniza e invade o Zebrafish em múltiplos sítios anatômicos, 

causando mortalidade depois de ser injetada no interior das cavidades 

peritoniais de peixe adulto ou no saco vitelino de embriões. 

Nos últimos anos, indústrias farmacêuticas têm adotado testes em 

embriões de Zebrafish com a finalidade de identificar potenciais efeitos adversos 

de compostos em desenvolvimento, pelo fato de apresentarem baixo custo e 

rápida resposta aos experimentos (RÁLDUA & PIÑA, 2014).  

Devido à urgência na busca de novos medicamentos sem 

teratogenicidade para tratamento de infecções fúngicas, este trabalho baseou-

se no estudo de peptídeos de três grupos de animais, sendo o primeiro composto 

por  peptídeos oriundos de veneno de vespa previamente engenheirados, o 

segundo análogos de Moricin C3  derivado da hemolinfa de Galleria mellonella 

infectada com C. albicans, e por último, peptídeos análogos de IsCT, oriundos 

do veneno de escorpião, todos modificados baseando-se em estudos estruturais. 

 

2. CONCLUSÕES  

 

Os peptídeos apresentados neste trabalho foram avaliados 

estruturalmente e modificados quanto às suas respectivas sequências 

peptídicas, objetivando um composto antifúngico eficaz e seguro. Sendo assim, 

foram testados frente atividade anti-Candida albicans, toxicidade e 

teratogenicidade em embriões de Zebrafish, citotoxicidade em linhagem celular 



HaCaT, permeação ao córion, sinergismo, possível efeito de dano de membrana 

e eficácia in vivo. A tabela 8, apresenta um resumo dos resultados obtidos para 

os principais testes realizados. 

 

Tabela 8. Principais resultados obtidos para os peptídeos avaliados: Massa 

Molecular (MM), Sequência dos aminoácidos, número de Lisina (K), carga 

líquida (Q), concentração inibitória mínima (CIM), concentração fungicida mínima 

(CFM), concentração letal 50% (CL50), concentração inibitória 50% (CI50) e 

índice de seletividade (IS). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

- Os melhores resultados para atividade anticandida foram MK5789, MK58911 e 

MK4589, com mesmo número de resíduos de Lisina e carga líquida, diferindo 

em seus posicionamentos; 

- MK5789 apresentou-se menos tóxico devido a permanência de 50% dos 

embriões vivos mesmo tendo permeabilidade total pelo córion, quando 

comparado aos demais, que nas mesmas condições, demonstraram permeação 

parcial pelo córion com 100% de mortalidade dos embriões;  

- PepM1 apresentou CIM > 250 µg/mL sem efeitos tóxicos e teratogênicos; 

 

 

32-16 

32-16 



- PepM2 apresentou CIM = 125 µg/mL, não – teratogênico, porém apresentou 

toxicidade nos embriões e mostrou ser mais seletivo para membranas de 

mamíferos do que microbianas, verificado pelo IS baixo; 

- PepM4 apresentou CIM > 250 µg/mL, no entanto, apresentou 

aproximadamente 80% de sobrevivência dos embriões na concentração mais 

alta; 

- PepM3 apresentou resultados satisfatórios com CIM para C. albicans, sem 

efeitos tóxicos, teratogênicos e com viabilidade celular alta para HaCaT; 

- PepM3 demonstrou efeito sinérgico com Anfotericina B, e sugeriu ser um 

peptídeo que ocasiona dano de membrana fúngica;  

- A infecção por imersão e ensaio de eficácia in vivo em embriões de Zebrafish 

foi padronizada; 

- A avaliação de modificações estruturais se torna essencial para o 

desenvolvimento de novos agentes com potencial efeito contra patógenos 

fúngicos, e com redução de efeitos tóxicos e teratogenicidade; 

- PepM3 pode ser um potencial candidato para estes estudos estruturais 

objetivando melhora de eficácia e segurança. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

 

ACHKAR, J.M.; FRIES, B.C. Candida infections of the genitourinary tract. Clin 

Microbiol Rev, v. 23, p. 253–73, 2010.  

ADAMS, S.L., ZHANG, T., RAWSON, D.M. The effect of external medium 

composition on membrane water permeability of Zebrafish (Danio rerio) 

embryos. Theriogenology, v. 64, p.1591-1602, 2005. 

AEBERSOLD, R.; MANN, M. Nature, v. 422, p.198-207, 2003. 

AHMED, S.A.; GOGAL, R.M.; WALSH, J.E. A new rapid and simple non-

radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an 

alternative to [3H]thymidine incorporation assay. J. Immunol. Methods, v. 170, 

p. 211–224, 1994. 

AKLE, V.; AGUDELO-DUENAS, N.; MOLINA-RODRIGUEZ, M.A.; 

KARTCHNER, L.B.; RUTH, A.M.; GONZALEZ, J.M.; FORERO-SHELTON, M. 

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate 

Trypanosoma cruzi Motility In Vivo. J. Vis. Exp, v. 127, 2017. 

ALARCO, A. M.; MARCIL, A.; CHEN, J.; SUTER, B.; THOMAS, D.; 

WHITEWAY, M. Immune-deficient Drosophila melanogaster: a model for the 

innate. The Journal of Immunology, v. 172, n. 9, p. 5622-5628, 2004. 

ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, 

P. Molecular Biology of the Cell. 5th. ed. New York: Garland science, 2008. 

p.1268. 

ALGARIHI, A.; SINGH, S.; EDWARDS JR. J.E.; IBRAHIM, A.S.; UPPULURI, 

P. NDV-3A vaccination prevents C. albicans colonization of jugular vein 

catheters in mice. Scientific Reports, v. 9, n. 6194, 2019. 

AMADO, F.; LOBO, M.J.C.; DOMINGUES, P.; DUARTE, J.A.; VITORINO, R. 

Salivary peptidomics. Expert Rev. Proteomics, v. 7, n.5, p. 709–721, 2010. 

ANDERSON, J.M.; MIHALIK, R.; SOLL, D.R.  Ultrastructure and antigenicity of 

the unique cell and pimple of the Candida albicans opaque phenotype. J. 

Bacteriol, v. 172, n.1, p. 224–235, 1990. 

BARBEDO, L.S.; SGARBI, D.B.G. Candidíase.  DST - J Bras Doenças Sex 

Transm, v. 22, n.1, p. 22-38, 2010. 

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mihalik%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2403540
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Soll%20DR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=2403540


BARRIBEAU, S. M.; SADD, B.; DU PLESSIS, L.; SCHMID-HEMPEL, P. Gene 

expression differences underlying genotype-by-genotype specificity in a host-

parasite system. Proc. Natl. Acad. Sci, v. 111, p. 3496-3501, 2014. 

BEA, R.S.; PETRAGLIA, A.F., ASCUITTO, M.R., BUCK, Q.M. Antibacterial 

Activity and Toxicity of Analogs of Scorpion Venom IsCT Peptides. Antibiotics, 

v. 6, n. 3, p. 13, 2017. 

BECHINGER, B. The structure, dynamics, and orientation of antimicrobial 

peptides in membranes by multidimensional solid-state NMR spectroscopy. 

Biochim. Biophys. Acta, v. 1462, p. 157–183, 1999. 

BELOKONEVA, O.S.; VILLEGAS, E.; CORZO, G.; DAI, L.; NAKAJIMA, T. The 

hemolytic activity of six arachnid cationic peptides is affected by the 

phosphatidylcholine-to-sphingomyelin ratio in lipid bilayers. Biochim. Biophys. 

Acta Biomembr,, v. 1617, p. 22–30, 2003. 

BERGIN, D.; MURPHY, L.; KEENAN, J.; CLYNES, M.; KAVANAGH, K. Pre-

exposure to yeast protects larvae of Galleria mellonella from a subsequent 

lethal infection by Candida albicans and is mediated by the increased 

expression of antimicrobial peptides. Microbes and Infection, v. 8, p. 2105-

2112, 2006. 

BERMAN, J.; SUDBERY, P.E. Candida albicans: a molecular revolution built on 

lessons from budding yeast. Nat. Rev. Genet., v. 3, p. 918–930, 2002. 

BLAXTER, J.H.S. Pattern and Variety in Development. In: HOAR, W.S., 

RANDALL, D.J. (Eds.). Fish Physiology. London: Academic Press, 1988. p. 1-

58. (v. 11: The Physiology of Developing Fish. Part A: Eggs and Larvae.). 

BONELLA, A.E. Animais em laboratórios e a lei Arouca. Scienti & studia, São 

Paulo, v. 7, n. 3, p. 507-14, 2009. 

BONGOMIN, F.; GAGO, S.; OLADELE, R.O.; DENNING, D.W. Global and 

multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. J. Fungi, v. 3, 

n. 4, p. 57, 2017. 

BONHOMME, J.; D'ENFERT, C. Candida albicans biofilms: building a 

heterogeneous, drug-tolerant environment. Current opinion in microbiology, 

v. 16, n. 4, p. 398-403, 2013. 

BONSIGNORIO, D.; PEREGO, L.; DEL GIACCO, L.; COTELLI, F. Structure 

and macromolecular composition of the Zebrafish egg chorion. Zygote, v. 4, p. 

101-108, 1996. 



BOPP, S. K.; MINUZZO, M.; LETTIERI, T. The Zebrafish (Danio rerio): an 

Emerging model organism in the environmental field. Luxembourg: European 

Commission, Joint Research Centre. 2006. 

BOSHRA, H.; LI, J.; SUNYER, J.O. Recent advances on the complement 

system of teleost fish. Fish Shellfish Immunol, v. 20, p. 239–262, 2006. 

BROGDEN, N.K.; BROGDEN, K.A. Will new generations of modified 

antimicrobial peptides improve their potential as pharmaceuticals. Int. J. 

Antimicrob. Agents, v. 38, p. 217-225, 2011.  

BROGDEN, K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in 

bacteria? Nat. Rev., Microbiol., v. 3, p. 238-250, 2005. 

BRÖTZ, H.; BIERBAUM, G.; LEOPOLD, K.; REYNOLDS, P.E.; SAHL, H.G. The 

lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan synthesis by targeting lipid II. 

Antimicrob Agents Chemother, v. 42, p.154–160, 1998. 

BROWN, G.D.; DENNING, D.W.; GOW, N.A.R.; LEVITZ, S.M.; NETEA, M.G.; 

WHITE, T.C. Hidden Killers: Human Fungal Infections. Sci. Transl. Med,v. 4, p. 

1–9, 2012. 

BROWN, S.E.; HOWARD, A.; KASPRZAK, A.B.; GORDON, K.H.; EAST, P.D. 

The discovery and analysis of a diverged family of novel antifungal moricin-like 

peptides in the wax moth Galleria mellonella. Insect Biochem. Mol. Biol, v.38, 

p. 201–212, 2008. 

BROWN, S.E.; HOWARD, A.; KASPRZAK, A.B.; GORDON, K.H.; EAST, P.D. A 

peptidomic study reveals the impressive antimicrobial peptide arsenal of the 

wax moth Galleria mellonella. Insect Biochem. Mol. Biol, v. 39, p. 792–800, 

2009. 

BULET, P.; HETRU, C.; DIMARCQ, J.L.; HOFFMANN, D. Antimicrobial 

peptides in insects; structure and function, Dev. Comp. Immunol, v. 23, p. 329-

344, 1999. 

BULET, P.; STOCKLIN, R. Insect antimicrobial peptides: structures, properties 

and gene regulation. Protein Pept. Lett, v.12, p. 3–11, 2005. 

BUSQUET, F. et al. OECD validation study to assess intra- and inter-laboratory 

reproducibility of the Zebrafish embryo toxicity test for acute aquatic toxicity 

testing. Regul Toxicol Pharmacol, v. 69, n. 3, p. 496-511, Aug 2014.  

CALDAS, C. Experimentação animal. Cienc. Cult, v. 61, n.1, 2009, São Paulo. 

CALDERONE, A. R.; FONZI, W. A. Virulence factors of Candida albicans. 



Trends in microbiology, v. 9, n. 7, p. 327-335, 2001. 

CANTÚ, M.D.; CARRILHO, E.; WULFF, N.A.; PALMA, M.S. Sequenciamento 

de peptídeos usando espectrometria de massas: um guia prático. Quim. Nova, 

vol. 31, n. 3, p. 669-675, 2008. 

CARLSSON, G.; NORRGREN, L.; HYLLAND, K.; TOLLEFSEN, K.E. Toxicity 

screening of produced water extracts in a Zebrafish embryo assay. J Toxicol 

Environ Health A, v. 77, n. 9-11, p. 600-15, Apr 2014. 

CARVALHO, L.A.C.; MACHINI, M.T. HEMOCIDINAS DERIVADAS DA 

HEMOGLOBINA: ESTRUTURAS, PROPRIEDADES E PERSPECTIVAS. 

Quim. Nova, v. 36, n. 7, p. 1021-1029, 2013. 

CASADEVALL, A.; PIROFSKI, L.A. The damage-response framework of 

microbial pathogenesis. Nat Rev Microbiol, v. 1, n.17, p.24, 2003.  

CHAFFIN,W.L.; LÓPEZ-RIBOT, J.L.; CASANOVA, M.; GOZALBO, D.; 

MARTÍNEZ, J.P. Cell wall and secreted proteins of Candida albicans: 

Identification, function, and expression. Microbiol. Mol. Biol. Rev, v. 62, p. 

130–180, 1998. 

CHAN, D.I.; PRENNER, E.J.; VOGEL, H.J. Tryptophan- and arginine-rich 

antimicrobial peptides:Structures and mechanisms of action. Biochimica et 

Biophysica Acta, v. 1758, p. 1184–1202, 2006. 

CHANDRA, J.; KUHN, D.M.; MUKHERJEE, P.K.; HOYE,R L.L.; MCCORMICK, 

T.; GHANNOUM, M.A. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida 

albicans: development, architecture, and drug resistance. J Bacteriol, v. 183, n. 

18, p. 5385-5394, Sep 2001. 

CHAO, C.C.; HSU, P.C.; JEN, C.F.; CHEN, I.H.; WANG, C.H.; CHAN, H.C.; 

TSAI, P.W.; TUNG, K.C.; WANG, C.H.; LAN, C.Y.; CHUANG, Y.J. Zebrafish as 

a model host for Candida albicans infection. Infect Immun, v. 78, p. 2512–

2521, 2010. 

CHEN, Y.; GUARNIERI, M.T.; VASIL, A.I.; VASIL, M.L.; MANT, C.T.; HODGES, 

R.S. Role of peptide hydrophobicity in the mechanism of action of alpha-helical 

antimicrobial peptides. Antimicrob. Agents Chemother, v. 51, p. 1398–1406, 

2007. 

CHEN, Q.X.; ZENG, S. Research progress of Zebrafish used in drug 

metabolism. Acta pharm Sin. v. 46, p. 1026–1031. 2011. 



CHEN, Y.Z.; YANG, Y.L.; CHU, W.L.; YOU, M.S.; LO, H.J. Zebrafish egg 

infection model for studying Candida albicans adhesion factors. PLoS ONE, v. 

10, n. 11, 2015. 

CHENG, M.F.; YU, K.W.; TANG, R.B.; FAN, Y.H.; YANG, Y.L.; HSIEH, K.S.; 

HO, M.; LO, H.J. Distribution and antifungal susceptibility of Candida species 

causing candidemia from 1996 to 1999. Diagn Microbiol Infect Dis. v. 48, p. 

33–37, 2004. 

CHIN, V.K.; LEE, T.Y.; RUSLIZA, B.; CHONG, P.P. Dissecting Candida 

albicans infection from the perspective of C. albicans virulence and omics 

approaches on host-pathogen interaction: a review. Int. J. Mol. Sci, v. 17, p. 

1643, 2016. 

CHOI, H.; LEE, D.G. Antifungal activity and pore-forming mechanism of 

astacidin 1 against Candida albicans. Biochimie, v. 105, p. 58-63, 2014. 

CHRISTENSEN, L. D.; MOSER, C.; JENSEN, P. O.; RASMUSSEN, T. B.; 

CHRISTOPHERSEN, L.; KJELLEBERG, S.; KUMAR, N.; HOIBY, N.; 

GIVSKOV, M.; BJARNSHOLT, T. Impact of Pseudomonas aeruginosa quorum 

sensing on biofilm persistence in an in vivo intraperitoneal foreign-body infection 

model. Microbiology, v. 153, n. 7, p. 2312-2320, 2007. 

CLSI. Reference Method For Broth Dilution Antifungal Susceptibility 

Testing of Yeasts; Approved Standard. 3rd. ed. Wayne, PA: Clinical and 

Laboratory Standards Institute, 2008. (CLSI document M27-A3). ISBN-1-56238-

666-2. 

COLOMBO, A.L. Contribuições para o entendimento da epidemiologia das 

infecções hematogênicas por Candida spp. e para sua abordagem terapêutica. 

Tese para obtenção do título de livre-docência apresentada a Universidade 

Federal de São Paulo, São Paulo, SP, 2003. 

COLOMBO, A.L.; GUIMARAES, T. Epidemiologia das infecções 

hematogênicas por Candida spp. Rev. Soc. Bras. Med. Trop, v. 36, n. 5, 2003.  

COLOMBO, A.L.; GUIMARAES, T.; SILVA, L.R.B.F.; MONFARDINI, L.P.A.; 

CUNHA, A.K.B.; RADY, P.; ALVES, T.; ROSAS, R.C. Prospective 

Observational Study of Candidemia in São Paulo, Brazil: Incidence Rate, 

Epidemiology, and Predictors of Mortality. Infection control and hospital 

epidemiology,  v. 28, n. 5, 2007. 



COSTA, A.C.; PEREIRA, C.A.; JUNQUEIRA, J.C.; JORGE, A.O.C. Recent 

mouse and rat methods for the study of experimental oral candidiasis. 

Virulence, v. 4, p. 391–399, 2013. 

COLOMBO, A.L.; GUIMARÃES T.; CAMARGO, L.F.A.; RICHTMANNC, R.;P 

QUEIROZ-TELLES, F.; SALLESE, M.J.C.; DA CUNHA, C.A.; YASUDAG, 

M.A.S.; MORETTI, M.L.; NUCCI, M. Brazilian guidelines for the management of 

candidiasis – a joint meeting report of three medical societies: Sociedade 

Brasileira de Infectologia, Sociedade Paulista de Infectologia and Sociedade 

Brasileira de Medicina Tropical, Braz J Infect Dis, v. 17, n. 3, p.283–312, 2013. 

COSTERTON, J.W.; LEWANDOWSKI, Z.; CALDWELL, D.E.; KORBER, D.R.; 

LAPPINSCOTT, H.M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol, v. 49, p. 711-

745, Oct 1995. 

COTTER, G.; DOYLE, S.; KAVANAGH, K. Development of an insect model for 

the in vivo pathogenicity testing of yeasts. FEMS Immunol. Med. Microbiol. v. 

27, p.163–169. 2000. 

COWARD, K.; BROMAGE, N.K.; HIBBIT, O.; PARRINGTON, J. Gamete 

physiology, fertilization and activation in teleost fish. Reviews in Fish Biology 

and Fisheries, v. 12, p. 33-58, 2002. 

CRETON, R. The calcium pump of the endoplasmic reticulum plays a role in 

midline signaling during early Zebrafish development. Developmental Brain 

Research, v. 151, p. 33- 41, 2004. 

CYTRYNSKA, M.; MAK, P.; ZDYBICKA-BARABAS, A.; SUDER, P.; 

JAKUBOWICZ, T. Purification and characterization of eight peptides from 

Galleria mellonella immune hemolymph. Peptides, v. 28, p. 533–546, 2007. 

CZAPLEWSKI, L.; BAX, R.; CLOKIE, M.; DAWSON, M.; FAIRHEAD, H.; 

FISCHETTI, V.A.; FOSTER, S.; GILMORE, B.F.; HANCOCK, R.E.W.; 

HARPER, D.; HENDERSON, I.R.; HILPERT, K.; JONES, B.V.; KADIOGLU, A.; 

KNOWLES, D.; OLAFSDÓTTIR, S.; PAYNE, D.; PROJAN, S.; SHAUNAK, S.; 

SILVERMAN, J.; THOMAS, C.M.; TRUST, T.J.; WARN, P.; REX, J.H. 

Alternatives to antibiotics-a pipeline portfolio review. Lancet Infect.Dis, v. 16, p. 

239–251, 2016. 

DA MATTA, D.A.; SOUZA, A.C.R.; COLOMBRO, A.L. Revisiting Species 

Distribution and Antifungal Susceptibility of Candida Bloodstream Isolates from 

Latin American Medical Centers. J. Fungi, v. 3, p. 24, 2017. 



DA SILVA, A.V.R.; DE SOUZA, B. M.; DOS SANTOS CABRERA, M.P.; DIAS, 

N. B.; GOMES, P.C.; STABELI, R.G.; NETO, J.R.; PALMA, M.S. The effects of 

the C-terminal amidation of mastoparans on their biological actions and 

interactions with membrane-mimetic systems. Biochimica et Biophysica Acta. 

Biomembranes, v. 1838, p. 2357-2368, 2014. 

DAI, L.; YASUDA, A.; NAOKI, H.; CORZO, G.; ANDRIANTSIFERANA, M.; 

NAKAJIMA, T. IsCT, a novel cytotoxic linear peptide from scorpion 

Opisthacanthus madagascariensis. Biochem. Biophys. Res. Commun, v. 286, 

p. 820–825, 2001.  

DAI, L.; CORZO, G.; NAOKI, H.; ANDRIANTSIFERANA, M.; NAKAJIMA, T. 

Purification, structure–function analysis, and molecular characterization of novel 

linear peptides from scorpion Opisthacanthus madagascariensis. Biochem.  

Biophys. Res. Commun., v. 293, p. 1514–1522, 2002. 

DAI, H.; RAYAPROLU, S.; GONG, Y.; HUANG, R.; PRAKASH, O.; JIANG, H. 

Solution structure, antibacterial activity, and expression profile of Manduca 

sexta moricin. J Pept Sci Off Publ Eur Pept Soc, v. 14, p.855– 863, 2008. 

DATHE, M.; WIPRECHT, T. Structural features of helical antimicrobial peptides: 

their potential to modulate activity on model membranes and biological cells. 

Biochim Biophys Acta, v. 1462, p. 71–78, 1999. 

DATHE, M.; MEYER, J.; BEYERMANN, M.; MAUL, B.; HOISCHEN, C.; 

BIERNET, M. General aspects of peptide selectivity towards lipid bilayers and 

cell membranes studied by variation of the structural parameters of amphipathic 

helical model peptides. Biochim Byophys Acta, v. 1558, p.171–186, 2002. 

DEMUYSER, L.; JABRA-RIZK, M.; VAN DIJCK, P. Microbial cell surface 

proteins and secreted metabolites involved in multispecies biofilms. Pathogens 

and disease, v. 70, n. 3, p. 219-230, 2014. 

DENNISON, S.R.; WALLACE, J.; HARRIS, F.; PHOENIX, D.A. Amphiphilic 

alpha-helical antimicrobial peptides and their structure/function relationships, 

Protein Pept. Lett. v. 12, p. 31-39, 2005. 

DE SOUZA, B.M.; SILVA, A.V.R.; RESENDE, V.M.F.; ARCURI, H.A.; DOS 

SANTOS, M.P.C.; RUGGIERO NETO, J.; PALMA, M.S. Characterization of two 

novel polyfunctional mastoparan peptides from the venom of the social wasp 

Polybia paulista. Peptides, v. 30, p.1387–1395, 2009. 



DE SOUZA, B.M.; DOS SANTOS CABRERA, M.P.; RUGGIERO-NETO, J.; 

PALMA, M.S. Investigating the effect of different positioning of lysine residues 

along the peptide chain of mastoparans for their secondary structures and 

biological activities. Amino Acids, v. 40, p. 77–90, 2011. 

DE SOUZA, B.M.; DOS SANTOS CABRERA, M.P.; GOMES, P.C.; DIAS, N.B.; 

STABELI, R.G.; LEITE, N.B.; NETO, J.R.; PALMA, M.S. Structure–activity 

relationship of mastoparan analogs: Effects of the number and positioning of 

Lys residues on secondary structure, interaction with membrane-mimetic 

systems and biological activity. Peptides, v. 72, p. 164–174, 2015. 

DIGNANI, M.C.; SOLOMKIN, J.S.; ANAISSIE, E. CANDIDA. In: ANAISSIE, E.; 

MCGINNIS, M.R.; PFALLER, M.A, (editors). Medical  mycology.  Philadelphia, 

PA: Churchill Livingstone, 2003. p. 195–239. 

DOBSON, A. J.; PURVES, J.; KAMYSZ, W.; ROLFF, J. Comparing Selection 

on S. aureus between antimicrobial peptides and common antibiotics. PloS 

One, v. 8, p. 76521, 2013. 

DONLAN, R.M. Biofilms and device-associated infections. Emerg Infect Dis, v. 

7, p. 277–281, 2001.  

DONLAN, R.M.; COSTERTON, J.W. Biofilms: survival mechanisms of clinically 

relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev, v.15, p. 167–193, 2002. 

DOS SANTOS CABRERA, M.P.; DE SOUZA, B.M.; FONTANA, R.; KONNO, 

K.; PALMA, M.S.; DE AZEVEDO JR, W.F. Conformation and lytic activity of 

eumenine mastoparan: a new antimicrobial peptide from wasp venom. J Pept 

Res, v. 64, p. 95–103, 2004. 

DOUCET, A.; BUTLER, G.S.; RODRIGUEZ, D.; PRUDOVA, A.; OVERALL, 

C.M. Metadegradomics: toward in vivo quantitative degradomics of proteolytic 

post-translational modifications of the cancer proteome. Mol. Cell Proteomics, 

v. 7, n. 10, p.1925–1951 2008. 

DUCHARME, N. A.; REIF, D. M.; GUSTAFSSON, J. A.; BONDESSON, M. 

Comparison of toxicity values across Zebrafish early life stages and mammalian 

studies: Implications for chemical  testing. Reprod  Toxicol, v. 55, p. 3-

10.doi:10.1016/j.reprotox.2014.09.005, 2015. 

EBENHAN, T.; GHEYSENS, O.; KRUGER, H.G.; ZEEVAART, J.R.; 

SATHEKGE, M. M. Antimicrobial peptides: their role as infection-selective 



tracers for molecular imaging. Bio Med Res. Int, v. 2014, Article ID 867381, 15 

p. 2014. http://dx.doi.org/10.1155/2014/867381. 

EHRENSTEIN, G.; LECAR, H. Electrically gated ionic channels in lipid bilayers. 

Q. Rev. Biophys, v. 10, p. 1-34, 1977. 

ENG, J. K.; MCCORMACK, A. L.; YATES, J. R. An approach to correlate 

tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein 

database. J. Am. Soc. Mass. Spectrom, v. 5, n. 11, p. 976-989, 1994. 

FALICO, D.A.; CASTRO, M.S. Identificação, purificação e caracterização de 

peptídeos antimicrobianos presentes na secreção cutânea do anuro 

Hypsiboas raniceps. Dissertação (Mestrado) - Fundação Universidade de 

Brasília, Instituto de Ciências Biológicas. Brasília, DF, 2014. 

FARUCK, M.O.; YUSOF, F.; CHOWDHURY, S. An overview of antifungal 

peptides derived from insect. Peptides, v. 80, p. 80–88, 2016. 

FENN, J. B.; MANN, M.; MENG, C. K.; WONG, S. F.; WHITEHOUSE, C. M.; 

Science, v. 246, p. 64, 1989. 

FERRANDON, D., IMLER, J.-L., HETRU, C., HOFFMANN, J.A. The Drosophila 

systemic immune response: sensing and signalling during bacterial and fungal 

infections. Nat. Rev. Immunol, v. 7, p. 862–874, 2007. 

FJELL, C.D.; HISS, J.A.; HANCOCK, R.E.; SCHNEIDER, G. Designing 

antimicrobial peptides: form follows function. Nat.Rev.DrugDiscov, v. 11, p.37–

51, 2012. 

FUAD, N.M.; KASLIN, J.; WLODKOWIC, D. Development of chorion-less 

Zebrafish embryos in millifluidic living embryo arrays. Biomicrofluidics, v. 11, 

n. 5, 051101, doi: 10.1063/1.5001848, 2017. 

GAUWERKY, K.; BORELLI, C.; KORTING, H.C. Targeting virulence: A new 

paradigm for antifungals. Drug Discov. Today, v. 14, p. 214–222, 2009. 

GEIGER, J.; WESSELS, D.; LOCKHART, S.R.; SOLL, D.R. Release of a potent 

polymorphonuclear leukocyte chemoattractant is regulated by white-opaque 

switching in Candida albicans. Infect. Immun, v. 72, p. 667–677, 2004. 

GILBERT, S.F. Developmental biology, 6th ed. Sinauer Associates, Inc, 2000. 

GIRALDO, P.; WATKIN, S. Vaginal candidiasis: an incomprehensible challenge. 

J Bras Dis Sex Transm, v. 10, p.31–36, 1998. 

GIULIANI, A.; PIRRI, G.; NICOLETTO, S. Antimicrobial peptides: an overview 

of a promising class of therapeutics. Cent. Eur. J. Biol. v. 2, p. 1–33, 2007.  



GORAYA, J.; KNOOP, F. C.; CONLON, J. M. Ranatuerins: antimicrobial 

peptides isolated from the skin of the American bullfrog, Rana catesbeiana. 

Biochem. Biophys. Res. Commun, v. 250, n.3, p. 589-592, 1998. 

GRATACAP, R.L.; RAWLS, J.F.; WHEELER, R.T. Mucosal candidiasis elicits 

NF-kappaB activation, proinflammatory gene expression and localized 

neutrophilia in Zebrafish. Dis model & mech, v. 6, p. 1260–1270, 2013. 

GRATACAP, R.L.; SCHERER, A.K.; SEMAN, B.G.; WHEELER, R.T. Control of 

mucosal candidiasis in the Zebrafish swim bladder depends on neutrophils that 

block filament invasion and drive extracellular-trap production. Infect Immun, v. 

85, n. 9, 2017.  

GRATACAP, R.L.; WHEELER, R.T. Utilization of Zebrafish for intravital study of 

eukaryotic pathogen-host interactions. Dev. Comp. Immunol, v. 46, p. 108–

115, 2014. 

GUDLAUGSSON, O.; GILLESPIE, S.; LEE, K.; et al. Attributable mortality of 

nosocomial candidemia, revisited. Clin Infect Dis, v. 37, p. 1172-1177, 2003. 

GULLO, F.P.; SARDI, J.C.; SANTOS, V.A.; SANGALLI-LEITE, F.; PITANGUI, 

N.S.; ROSSI, S.A.; DE PAULA E SILVA, A.C.; SOARES, L.A.; SILVA, J.F.; 

OLIVEIRA, H.C.; FURLAN, M.; SILVA, D.H.; BOLZANI, V.S.; MENDES-

GIANNINI, M.J.; FUSCO-ALMEIDA, A.M. Antifungal activity of maytenin and 

pristimerin. Evid Based Complement Alternat Med, v. 2012, Article ID 

340787, 6 pages.  

Doi:10.1155/2012/340787.  

HAINE, E. R.; MORET, Y.; SIVA-JOTHY, M. T.; ROLFF, J. Antimicrobial 

defense and persistent infection in insects. Science, v. 322, p. 1257-1259, 

2008. 

HAMM, J.T.; CEGER, P.; ALLEN, D.; STOUT, M.; MAULL, E.A.; BAKER, G.; 

ZMAROWSKI, A.; PADILLA, S.; PERKINS, E.; PLANCHART, A.; STEDMAN, 

D.; TAL, T.; TANGUAY, R.L.; VOLZ, D.C.; WILBANKS, M.S.; WALKER, N.J. 

Characterizing Sources of Variability in Zebrafish Embryo Screening Protocols. 

ALTEX, v. 36, n.1, p. 103-120, 2019.        

HANCOCK, R.E.; PATRZYKAT, A. Clinical development of cationic 

antimicrobial peptides: from natural to novel antibiotics. Curr. Drug Targets 

Infect Disord, v. 2, p. 79-83, 2002. 



HANCOCK, R. E.; SAHL, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new 

anti-infective therapeutic strategies. Nat. Biotechnol. v. 24, p. 1551–1557, 

2006. 

HART, N.H.; PIETRI, R.; DONOVAN, M. The structure of the chorion and 

associated surface filaments in Oryzias--evidence for the presence of 

extracellular tubules. Journal of Experimental Zoology, v. 230, p. 273-296, 

1984. 

HARVEY, A.L. Toxins and drug discovery. Toxicon, v. 92, p. 193–200, 2014. 

HARVEY, B.; KELLEY, R.N.; ASHWOOD-SMITH, M.J. Permeability of intact 

and dechorionated zebra fish embryos to glycerol and dimethyl sulfoxide. 

Cryobiology, v, 20, p. 432-439, 1983. 

HAWSER, S.P.; BAILLIE, G.S.; DOUGLAS, L.J. Production of extracellular 

matrix by Candida albicans biofilms. J Med Microbiol, v. 47, p. 253–256, 1998. 

HEMMI, H.; ISHIBASHI, J.; HARA, S.; YAMAKAWA, M. Solution structure of 

moricin, an antibacterial peptide, isolated from the silkworm Bombyx mori. 

FEBS Lett, v. 518, p. 33–38, 2002. 

HENN, K. Limits of the fish embryo toxicity test with Danio rerio as an 

alternative to the acute fish toxicity test. Dissertation of Doctor (Doctor of 

Natural Sciences) - Combined Faculties for the Natural Sciences and for 

Mathematics of the Ruperto‐Carola University of Heidelberg. Heidelberg: 

Germany. 2011. 

HENN, K.; BRAUNBECK, T. Dechorionation as a tool to improve the fish 

embryo toxicity test (FET) with the Zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem.  

Physiol. C. Toxicol. Pharmacol, v. 153C, n. 1, p. 91-98, 2011. 

HERMSEN, S.A.B.; VAN DEN BRANDHOF, E.J.; VAN DER VEN, L.T.M.; 

PIERSMA, A.H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a 

modified Zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo 

potencies. Toxicology in vitro, v. 25, p. 745–753, 2011.  

HERRMANN, K. Effects of the anticonvulsant drug Valproic Acid and related 

substances on the early development of the Zebrafish (Brachydanio rerio). 

Toxicology in Vitro, v. 7, p. 41-54, 1993. 

HIGASHIJIMA, T.; UZU, S.; NAKAJIMA, T.; ROSS, E. M. Mastoparan, a 

peptide toxin from wasp venom, mimics receptors by activating GTP-binding 

regulatory proteins (G proteins). J. Biol. Chem, v. 263, p. 6491–6494, 1988. 



HILL, A.J.; TERAOKA, H.; HEIDEMAN, W.; PETERSON, R.E. Zebrafish as a 

model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicol. Sci, v. 86, p. 6–19, 

2005. 

HISAOKA, K.K. Microscopic Studies of the Teleost Chorion. Trans Am Microsc 

Soc, v. 77, N. 3, P. 240-243, 1958. https://www.jstor.org/stable/3223685.        

HOWE, K.; CLARK, M.D.; TORROJA, C.F.; TORRANCE, J.; BERTHELOT, C.; 

MUFFATO, M. et al. The Zebrafish reference genome sequence and its 

relationship to the human genome. Nature, v. 496, p. 498–503, 2013. 

HOYLE, B.D.; JASS, J.; COSTERTON, J.W. The biofilm glycocalyx as a 

resistance factor. J Antimicrob Chemother, v. 26, p. 1–5, 1990.  

ILKIT, M.; GUZEL, A.B. The epidemiology, pathogenesis, and diagnosis of 

vulvovaginal candidosis: a mycological perspective. Crit Rev Microbiol, v. 

37, p. 250–261, 2011. 

JABRA-RIZK, M.A.; KONG, E.F.; TSUI, C.; NGUYEN, M.H.; CLANCY, C.J.; 

FIDEL JR, P.L.; NOVERR, M. Candida albicans pathogenesis: fitting within the 

hostmicrobe damage response framework. Infect Immun, v. 84, p. 2724 –2739, 

2016.  

JENSSEN, H.; HAMILL, P.; HANCOCK, R. E. Peptide antimicrobial agents. 

Clin. Microbiol. Rev, v. 19, p. 491–511, 2006.  

JIRAVANICHPAISAL, P.; LEE, B.L.; SÖDERHÄLL, K. Cell-mediated immunity 

in arthropods: hematopoiesis, coagulation, melanization and opsonization. 

Immunobiology, v. 211, p. 213–236, 2006. 

JOHNSON N.W. The mouth in HIV/AIDS: markers of disease status and 

management challenges for the dental profession. Aust Dent J,v. 55 Suppl. 

1:85–102, 2010. 

JURCZYK, A.; ROY, N.; BAJWA, R.; GUT, P.; LIPSON, K.; YANG, C.; 

COVASSIN, L.; RACKI, W.J.; ROSSINI, A.A.; PHILLIPS, N.; STAINIER, D.Y.R.; 

GREINER, D.L.; BREHM, M.A.; BORTELL, R.; DILORIO, P. Dynamic 

glucoregulation and mammalian like responses to metabolic and developmental 

disruption in Zebrafish. Gen Comp Endocrinol. v. 170, p. 334–345, 2011. 

KARAS, M.; HILLENKAMP, F.; Anal. Chem, v. 60, p. 2299, 1988. 

KATAYAMA, H.; OHIRA, T.; AINDA, K.; NAGASAWA, H. Significance of a 

carboxyl-terminal amide moiety in the folding and biological activity of 

crustacean hyperglycemic hormone. Peptides, v. 23, n. 9, p. 1537-1546, 2002.  



KATSU, T.; KUROKO, M.; MORIKAWA, T.; SANCHIKA, K.; YAMANAKA, H.; 

SHIMODA, S.; FUJITA, Y. Interaction of wasp venom mastoparan with 

biomembranes. Biochim. Biophys. Acta, v.1027, p. 185–190, 1990. 

KAWAHARA, G.; KUNKEL, L.M. Zebrafish based small molecule screens for 

novel DMD drugs. Drug Discov Today Technol, v. 10, p. 91–96, 2013. 

KENNEDY, M.A.; SOBEL, J.D. Vulvovaginal candidiasis caused by non-

albicans Candida species: new insights. Curr Infect Dis Rep, v. 12, p.465–70, 

2010. 

KHARA, J. S.; LIM, F. K.; WANG, Y.; KE, X.-Y.; VOO, Z. X.; YANG, Y. Y.; EE, 

P. L. R.  Designing α-helical peptides with enhanced synergism and selectivity 

against Mycobacterium smegmatis : Discerning the role of hydrophobicity and 

helicity. Acta Biomater, v. 28, p. 99–108, 2015. 

KIM, C.H.; LEE, J.H.; KIM, I.; SEO, S.J.; SON, S.M.; LEE, K.Y. Purification and 

cDNA cloning of a cecropin-like peptide from the great wax moth, Galleria 

mellonella. Mol. Cells, v. 17, p. 262–266, 2004. 

KIM, J.; SUDBERY, P. Candida albicans, a major human fungal pathogen. The 

journal of microbiology, v. 49, n. 2, p. 171-177, 2011. 

KIM, H.; JANG, J.H.; KIM, S.C.; CHO, J.H. De novo generation of short 

antimicrobial peptides with enhanced stability and cell specificity. J Antimicrob 

Chemother, v. 69, n. 1, p. 121–132, 2014. 

KIMMEL, C.B.; LAW, R.D. Cell lineage of Zebrafish blastomeres. 

Developmental Biology, v. 108, p. 86-93, 1985. 

KUCHARIKOVA, S.; SHARMA, N.; SPRIET, I.; MAERTENS, J.; VAN DIJCK, 

P.; LAGROU, K. Activities of systemically administered echinocandins against 

in vivo mature Candida albicans biofilms developed in a rat subcutaneous 

model. Antimicrobial agents and chemotherapy, v. 57, n. 5, p. 2365-2368, 

2013. 

KUCHARIKOVA, S.; TOURNU, H.; LAGROU, K.; VAN DIJCK, P.; 

BUJDAKOVA, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida 

glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to 

caspofungin and anidulafungin. Journal of medical microbiology, v. 60, n. 9, 

p. 1261-1269, 2011. 

KUO, Z.Y.; CHUANG, Y.J.; CHAO, C.C.; LIU, F.C.; LAN, C.Y.; CHEN, B.S. 

Identification of infection-and defense-related genes via a dynamic host-



pathogen interaction network using a Candida albicans-Zebrafish infection 

model. Journal of innate immunity, v. 5, n. 2, p. 137-152, 2013. 

LAEMMLI, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the 

Head of Bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680, 1970. 

LAFLEUR, M. D.; KUMAMOTO, C. A.; LEWIS, K. Candida albicans biofilms 

produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial agents and 

chemotherapy, v. 50, n. 11, p. 3839-3846, 2006. 

LANTZ, M.S.; GUO, X.; CUEVAS, E.; DUMAS, M.; NEWPORT, G.D.; ALI, S.F.; 

PAULE, M.G.; KANUNGO, J. Developmental toxicity assay using high content 

screening of Zebrafish embryos. J Appl Toxicol, v. 35, n. 3, p. 261-272, May 

2014. 

LASS-FLÖRL, C. The changing face of epidemiology of invasive fungal disease 

in Europe. Mycoses, v. 52,p. 197–205, 2009.  

LAVINE, M.D.; STRAND, M.R. Insect hemocytes and their role in immunity. 

Insect Biochem. Mol. Biol. v. 32, p. 1295–1309, 2002. 

LECLERC, V.; REICHHART, J.M. The immune response of Drosophila 

melanogaster. Immunol. Rev. v. 198, p. 59–71, 2004. 

LEE, J.; FREEMAN, J.L. Zebrafish as a model for investigating developmental 

lead (Pb) neurotoxicity as a risk factor in adult neurodegenerative disease: a 

mini-review. Neurotoxicology, v. 43, p. 57-64, Jul 2014. 

LEE, K.; SHIN, S.Y.; KIM, K.; LIM, S.S.; HAHM, K.S.; KIM, Y. Antibiotic activity 

and structural analysis of the scorpion-derived antimicrobial peptide IsCT and 

its analogs. Biochem Biophys Res Commun, v. 323, p. 712–719, 2004. 

LEE, Y.S.; YUN, E.K.; JANG, W.S.; KIM, I.; LEE, J.H.; PARK, S.Y.; RYU, K.S.; 

SEO, S.J.; KIM, C.H.; LEE, I.H. Purification, cDNA cloning and expression of an 

insect defensin from the great wax moth, Galleria mellonella. Insect Mol. Biol, 

v. 13, p. 65–72, 2004. 

LEITCH, E. C.; WILLCOX, M. D. Lactoferrin increases the susceptibility of S. 

epidermidis biofilms to lysozyme and vancomycin. Curr Eye Res, v. 19, n. 1, p. 

12-19, Jul 1999.  

LI, W.; TAILHADES, J.; O’BRIEN-SIMPSON, N.M.; SEPAROVIC, F.; JR 

OTVOS, L.; HOSSAIN, M.A.; WADE, J.D. Proline-rich antimicrobial peptides: 

potential therapeutics against antibiotic-resistant bacteria. Amino Acids, v. 46, 

p.2287–2294, 2014. 



LI, S.; POZHITKOV, A.; RYAN, R.A.; MANNING, C.S.; BROWN-PETERSON, 

N.; BROUWER, M. Constructing a fish metabolic network model. Genome Biol, 

v. 11, p. R115, 2010. 

LILLICRAP, A. The use of Zebrafish embryos as an alternative approach 

for ecotoxicity testing. PhD thesis (Master of Philosophy in Biological 

Sciences) -  University of Exeter, UK, 2010. http://hdl.handle.net/10036/94256. 

LIM, S.S.; KIM, Y.; PARK, Y.; KIM, J.I.; PARK, I.-S.; HAHM, K.-S.; SHIN, S.Y. 

The role of the central L- or D-pro residue on structure and mode of action of a 

cell-selective alpha-helical IsCT-derived antimicrobial peptide. Biochem. 

Biophys. Res. Commun, v. 334, p. 1329–1335, 2005. 

LOHSE, M.B.; JOHNSON, A.D. Differential phagocytosis of white versus 

opaque Candida albicans by Drosophila and mouse phagocytes. PLoS ONE, v. 

3, p. 1473, 2008. 

LONNEMANN, G. Chronic inflammation in hemodialysis: the role of 

contaminated dialysate. Blood Purif, v. 18, n. 3, p. 214-223, Feb 2000. 

LORTHOLARY, O.; DUPONT, B. Antifungal prophylaxis during neutropenia and 

immunodeficiency. Clin Microbiol Rev, v. 10, p. 477–504, 1997. 

LUDTKE, S.J.; HE, K.; HELLER, W.T.; HARROUN, T.A.; YANG, L.; HUANG, 

H.W. Membrane pores induced by magainin. Biochemistry, v. 35, p. 13723–

13728, 1996. 

MACRAE, C.A.; PETERSON, R.T. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat. 

Rev. Drug Discov, v. 14, p. 721–731, 2015. 

MAHLAPUU, M.; HÅKANSSON, J.; RINGSTAD, L.; BJÖRN, C. Antimicrobial 

Peptides: An Emerging Category of Therapeutic Agents. Front. Cell. Infect. 

Microbiol, v. 6, Article n. 194, 2016. 

MAK, P.; CHMIEL, D.; GACEK, G.J. Antibacterial peptides of the moth Galleria 

mellonella. Acta Biochim. Pol, v. 48, p. 1191–1195, 2001. 

MAKA, P.; ZDYBICKA-BARABAS, A.; CYTRYNSKA, M. A different repertoire of 

Galleria mellonella antimicrobial peptides in larvae challenged with bacteria and 

fungi. Developmental and Comparative Immunology, v. 34, p. 1129–1136, 

2010. 

MARMARAS, V.J.; LAMPROPOULOU, M. Regulators and signalling in insect 

haemocyte immunity. Cell. Signal, v. 21, p. 186–195, 2009. 



MATSUZAKI, K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-

defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochimica et 

Biophysica Acta, v. 1462, p. 1-10, 1999. 

MATSUZAKI, K. Why and how are peptide–lipid interactions utilized for self-

defense? Magainins and tachyplesins as archetypes. Biochim Biophys Acta, 

v. 1462, p. 1–10, 1999. 

MAVOR, A.L.; THEWES, S.; HUBE, B. Systemic fungal infections caused by 

Candida species: Epidemiology, infection process and virulence attributes. 

Curr. Drug Targets, v. 6, p. 863–874, 2005. 

MAYER, F. L.; WILSON, D.; HUBE, B. Candida albicans pathogenicity 

mechanisms. Virulence, v. 4, n. 2, p. 119-128, 2013. 

MEEKER, N.D.; TREDE, N.S. Immunology and Zebrafish: Spawning new 

models of human disease. Dev. Comp. Immunol, v. 32, p. 745–757, 2008. 

MEMARIANI, H.; SHAHBAZZADEH, D.; SABATIER, J.M.; MEMARIANI, M.; 

KARBALAEIMAHDI, A.; BAGHERI, K.P. Mechanism of action and in vitro 

activity of short hybrid antimicrobial peptide PV3 against Pseudomonas 

aeruginosa, Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 

479, n. 1, p. 103-108, 2016.  

MITCHELL, K. F.; ZARNOWSKI, R.; SANCHEZ, H.; EDWARD, J. A.; 

REINICKE, E. L.; NETT, J. E.; MITCHELL, A.P.; ANDES, D.R. Community 

participation in biofilm matrix assembly and function. PNAS, v. 112, n. 13, p. 

4092-4097, 2015. 

MITSUHARA, I. In vitro growth inhibition of human intestinal bacteria by 

sarcotoxin IA, an insect bactericidal peptide. Biotechnol Lett, v. 23, p. 569–

573, 2001. 

MOGHADDAM, M.R.B.; TONK, M.; SCHREIBER, C.; SALZIG, D.; CZERMAK, 

P.; VILCINSKAS, A.; RAHNAMAEIAN, M. The potential of the Galleria 

mellonella innate immune system is maximized by the co–presentation of 

diverse antimicrobial peptides. Biological Chemistry, v. 397, n. 9, DOI: 

10.1515/hsz-2016-0157, 2016. 

MORASH, M.G.; DOUGLAS, S.E.; ROBOTHAM, A.; RIDLEY, C.M.; GALLANT, 

J.W.; SOANES, K.H. The zebrafish embryo as a tool for screening and 

characterizing pleurocidin host-defense peptides as anti-cancer agents, Dis 

Model Mech, v. 4, n. 5, p. 622-633, 2011. 



MYLONAKIS, E.; CASADEVALL, A.; AUSUBEL, F.M. Exploiting amoeboid and 

non-vertebrate animal model systems to study the virulence of human 

pathogenic fungi. PLoS Pathog, v. 3, p.e101, 2007. 

NAGLIK, J.R.; RODGERS, C.A.; SHIRLAW, P.J.; DOBBIE, J.L.; FERNANDES-

NAGLIK, L.L.; GREENSPAN, D.; AGABIAN, N.; CHALLACOMBE, S.J. 

Differential expression of Candida albicans secreted aspartyl proteinase and 

phospholipase B genes in humans correlates with active oral and vaginal 

infections. J. Infect. Dis, v. 188, p. 469–479, 2003. 

NAKAJIMA, T.; UZU, S.; WAKAMATSU, K.; SAITO, K.; MIYAZAWA, T.; 

YASUHARA, T.; TSUKAMOTO, Y.; FUJINO, M. Amphiphilic peptides in wasp 

venom. Biopolymers, v. 25, p. 115–121, 1986. 

NETT, J. E.; SANCHEZ, H.; CAIN, M. T.; ANDES, D. R. Genetic basis of 

Candida biofilm resistance due to drug-sequestering matrix glucan. Journal of 

Infectious Diseases, v. 202, n. 1, p. 171-175, 2010b. 

NOBILE, C. J.; ANDES, D. R.; NETT, J. E.; SMITH, JR, F. J.; YUE, F.; PHAN, 

Q.-T.; EDWARDS, JR, J.E.; FILLER, S.G.; MITCHELL, A.P. Critical role of 

Bcr1-dependent adhesins in C. albicans biofilm formation in vitro and in vivo. 

PLoS pathogens, v. 2, n. 7, p. e63, 2006.  

OCHOA-PACHECO, A.; ESCALONA ARRANZ, J.C.; BEAVEN, M.; PERES-

ROSES, R.; GAMEZ, Y.M.; CAMACHO-POZO, M.I, et al. Bioassay-guided in 

vitro Study of the Antimicrobial and Cytotoxic Properties of the Leaves from 

Excoecaria Lucida Sw. Pharmacogn Res, v. 9, p. 396–400, 2017. 

ODDS, F. C. Candida and candidosis: a review and bibliography. 2nd. ed. 

London, United Kingdom: Bailliere Tindal, 1988. 

OIZUMI, Y.; HEMMI, H.; MINAMI, M.; ASAOKA, A.; YAMAKAWA, M. Isolation, 

gene expression and solution structure of a novel moricin analogue, 

antibacterial peptide from a lepidopteran insect, Spodoptera litura. Biochim 

Biophys Acta, v. 1752, p. 83–92, 2005. 

ORME, I.; SECRIST, J.; ANATHAN, S.; KWONG, C.; MADDRY, J.; 

REYNOLDS, R.; POFFENBERGER, A.; MICHAEL, M.; MILLER, L.; 

KRAHENBUH, J.; ADAMS, L.; BISWAS, A.; FRANZBLAU, S.; ROUSE, D.; 

WINFIELD, D.; BROOKS, J. Search for new drugs for treatment of tuberculosis. 

Antimicrob. Agents Chemother. v. 45, p. 1943–1946, 2001. 



OTVOS, L.; OTVOS, I.; ROGERS, M.E.; CONSOLVO, P.J.; CONDIE, B.A.; 

LOVAS, S.; BULET, P.; BLASZCZYK-THURIN, M. Interaction between heat 

shock proteins and antimicrobial peptides. Biochemistry (Mosc), v. 39, 

p.14150–14159, 2000. 

PALMA, M.S.; DOS SANTOS, L.D.; DE SOUZA, B.M.; GOMES, P.C.; 

SAIDEMBERG, D.M.; SAIDEMBERG, N.B.B.; DIAS, N.B.; PINTO, J.R.A.S.; 

MENEGASSO, A.R.S. Apostila de Análise proteômica. Rio Claro, SP, 2010. 

PAVAN, F.R.; MAIA, P.I.; LEITE, S.R.; DEFLON, V.M.; BATISTA, A.A.; SATO, 

D.N. et al. Thiosemicarbazones, semicarbazones, dithiocarbazates and 

hydrazide/hydrazones: Anti-Mycobacterium tuberculosis activity and 

cytotoxicity. Eur J Med Chem, v. 45, p. 1898–1905, 2010. 

PAYNE, D.J.; GWYNN, M.N.; HOLMES, D.J.; POMPLIANO, D.L. Drugs for bad 

bugs: confronting the challenges of antibacterial discovery. Nat. Rev. Drug 

Discovery, v. 6, p. 29-40, 2006. 

PERKINS, D. N.; PAPPIN, D. J.; CREASY, D. M.; COTTRELL, J. S.; 

Electrophoresis, v. 20, p. 3551, 1999. 

PETERS, B. M.; OVCHINNIKOVA, E. S.; KROM, B. P.; SCHLECHT, L.; ZHOU, 

H.; HOYER, L. L.; BUSSCHER, H.J.; VAN DER MEI, H.C.; JABRA-RIZK, M.A.; 

SHIRTLIFF, M.E. Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans 

hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology, v. 158, n. Pt 

12, p. 2975-2986, 2012. 

PFALLER, M.A.; DIEKEMA, D. J. Epidemiology of Invasive Mycoses in North 

America, Crit. Rev. Microbiol, v. 36, n. 1, p. 1-53, 2010. 

PIERCE, C.G.; UPPULURI, P.; TRISTAN, A.R.; WORMLEY, F.L.; MOWAT, E.; 

RAMAGE, G.; LOPEZ-RIBOT, J.L. A simple and reproducible 96-well plate-

based method for the formation of fungal biofilms and its application to 

antifungal susceptibility testing. Nat Protoc, v.3, p. 1494-1500, 2008.  

PODOLSKY, R.D. Fertilization ecology of egg coats; physical versus chemical 

contributions to fertilization success of free-spawened eggs. The Journal of 

Experimental Biology, v. 205, p. 1657-1668, 2002. 

POTTS, W.T.W.; EDDY, F.B. The Permeability to Water of the Egg of Certain 

Marine Teleosts. Journal of Comparative Physiology, v. 82, p. 305-315, 

1972. 



POUNY, Y.; RAPAPORT, D.; MOR, A.; NICOLAS, P.; SHAI, Y. Interaction of 

antimicrobial dermaseptin and its fluorescently labeled analogs with 

phospholipid membranes. Biochemistry, v. 31, n. 49, p. 12416-12423, 1992. 

PUKKILA-WORLEY, R.; PELEG, A.Y.; TAMPAKAKIS, E.;MYLONAKIS, E. 

Candida albicans hyphal formation and virulence assessed using a 

Caenorhabditis elegans infection model. Eukaryot. Cell, v. 8, p. 1750–1758, 

2009. 

RALDÚA, D.; PIÑA, B. In vivo Zebrafish assays for analyzing drug toxicity. 

Expert Opin Drug Metab Toxicol, v. 10, n. 5, p. 685-697, May 2014. 

RAWSON, D.W.; ZHANG, T.; KALICHARAN, D.; JONGEBLOED, W.L. Field 

emission scanning electron microscopy and transmission electron microscopy 

studies of the chorion, plasma membrane and syncytial layers of the gastrula-

stage embryo of the Zebrafish