JULIANA ZORZI COLÉTE Manutenção da vitalidade do ligamento periodontal cementário de dentes de macaco armazenados em resveratrol. Araçatuba-SP 2011 JULIANA ZORZI COLÉTE Manutenção da vitalidade do ligamento periodontal cementário de dentes de macaco armazenados em resveratrol. Trabalho de Conclusão de Curso como parte dos requisitos para a obtenção do título de Bacharel em Odontologia da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Orientador: Prof. Dr. Wilson Roberto Poi Co-orientadora: Profª. Drª. Alessandra Marcondes Aranega Araçatuba-SP 2011 Dedicatória “Aos meus pais, Oswaldo e Fátima, que lutaram comigo para a realização desse sonho, com carinho, amor, exemplo de dignidade e perseverança e incansável apoio ao longo desses anos .” Agradecimentos A Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e me suprir em todas as minhas necessidades. Ao meu orientador Wilson Roberto Poi, por acreditar em mim, pela amizade, carinho, respeito, incentivo, conselhos, proteção, apoio, paciência, contribuição para o meu crescimento profissional e pessoal e, principalmente pela agradável convivência. Jamais esquecerei como foi importante conviver com a sua Luz em minha vida. À minha co-orientadora Alessandra Marcondes Aranega, pelo carinho, por me mostrar o caminho da ciência, sempre com dedicação, paciência, apoio e incentivo em todos os momentos. Aos meus pais, Oswaldo e Fátima e ao meu irmão Oswaldo Neto, pelo carinho, amor, respeito e apoio incondicional. Vocês são minha vida, amo vocês. A minha família, por todo apoio, amor, carinho e principalmente por sempre demonstrarem amor e orgulho. A minha amiga Elizane Ferreira Hamanaka pelo carinho, colaboração com este trabalho, confiança e apoio. Aos meus amigos da VIII Turma de Odontologia, pelo respeito, amizade, horas de estudo, momentos de diversão e alegria, confiança, e apoio em todos os momentos dessa caminhada comum. Aos funcionários do Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, Cleide Lemos, Maria Dirce Boatto, Gilmar Martins de Oliveira e Paulo Roberto Gratão, pela inestimável ajuda durante a realização deste trabalho. Ao PIBIC CNPq, pela concessão da bolsa de iniciação científica e pelo apoio financeiro para a realização da pesquisa. À Universidade Estadual Paulista, pela oportunidade de realização do curso de graduação. "Cada pessoa que passa em nossa vida, passa sozinha, é porque cada pessoa é única e nenhuma substitui a outra. Cada pessoa que passa em nossa vida, passa sozinha e não nos deixa só, porque deixa um pouco de si e leva um pouquinho de nós. Essa é a mais bela responsabilidade da vida e a prova de que as pessoas não se encontram por acaso. " Charles Chaplin. Manutenção da vitalidade do ligamento periodontal cementário de dentes de macaco armazenados em resveratrol Juliana Zorzi Coléte; Wilson Roberto Poi; Elizane Ferreira Hamanaka; Lucieni Campoli Alves; Sônia Regina Panzarini; Celso Koogi Sonoda. Running title: Resveratrol e reimplante dentário. Unesp – Univ Estadual Paulista, Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada, Faculdade de Odontologia de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Wilson Roberto Poi, Disciplina de Clínica Integrada, Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada, Faculdade de Odontologia, Unesp - Univ Estadual Paulista, Rua José Bonifácio, 1193, Vila Mendonça, Araçatuba, São Paulo, 16015-050, Brasil. Tel: +55 02118-3636-3240. E-mail: poi@foa.unesp.br 2 Sumário Resumo 4 Abstract 5 1. Introdução 6 2. Proposição 9 3. Material e Método 10 4. Resultado 13 5. Discussão 16 6. Conclusão 19 7. Referências 20 Anexo A – Comissão de Ética 28 Anexo B – Ilustração da Fase Experimental 29 3 Lista de Figuras FIGURA 1 - Teste de solubilidade. 12 FIGURA 2 - Grupo I – imediato. 15 FIGURA 3 - Grupo II – seco 6 horas. 15 FIGURA 4 - Grupo III – resveratrol 6 horas. 16 4 Resumo A manutenção da vitalidade do ligamento periodontal cementário é de extrema importância para o sucesso do reimplante dentário. Minimizar o período de exposição do dente avulsionado ao meio seco ou mantê-lo em meio úmido, se constitui em importante conduta para o tratamento. Recentemente, o resveratrol tem sido bastante estudado, em razão das suas propriedades antioxidantes e da sua capacidade de prolongar a vida de diversos organismos desde as leveduras até os mamíferos. Portanto, o objetivo deste trabalho é avaliar a manutenção da vitalidade do ligamento periodontal cementário armazenado em resveratrol. Para isso foram empregados incisivos superiores e inferiores de três macacos, totalizando 24 dentes. No grupo I os dentes foram extraídos e imediatamente imersos em solução fixadora. No grupo II os dentes foram mantidos em meio seco por 6 horas. No grupo III os dentes foram imersos em 50 ml de solução de resveratrol em propilenoglicol (5 μM/L) durante 6 horas. Os cortes obtidos foram corados em H.E. para estudo histomorfológico. Os resultados demonstraram que no grupo imediato houve presença de moderado número de fibroblastos, alguns macrófagos e linfócitos. O grupo seco apresentou ausência de vasos sanguíneos e fibroblastos em degeneração. No grupo resveratrol 6 horas houve presença de pequeno número de fibroblastos e discreta vascularização. Foi possível concluir que o resveratrol é um bom meio de conservação da vitalidade das células do ligamento periodontal por 6 horas. Palavras-Chave: reimplante dentário; avulsão dentária; resveratrol. 5 Abstract The maintenance of vitality of the cement periodontal ligament is important for success of tooth reimplantation. It has been suggested to minimize the period of exposure of the avulsed tooth to dry environment or keep it in wet storage. Recently, resveratrol has been extensively studied due to its antioxidant properties and ability to prolong the lives of several organisms since yeast to mammals. The aim of this study is to evaluate the maintenance of vitality of the cement periodontal ligament stored in resveratrol. The analysis was conducted using maxillary and mandibular incisors of three monkeys, total of 24 teeth. In group I the teeth were extracted and immediately immersed in fixative solution. In group II the teeth were maintained in dry environment for 6 hours. In group III the teeth were immersed in 50ml of solution of resveratrol in propylene glycol (5 μM/L) for 6 hours. The cuts were stained with H.E. for histomorphological analysis. The results demonstrated that in the group immediate showed presence of a moderate number of fibroblasts, some macrophages and lymphocytes. The dry group showed absence of blood vessels and fibroblasts in degeneration. In the group resveratrol 6 hours showed presence of small numbers of fibroblasts and mild vascularization. It was concluded that the resveratrol is adequate for maintenance of vitality of cells of periodontal ligament for 6 hours. Keywords: tooth reimplantation; tooth avulsion; resveratrol. 6 1-Introdução A avulsão dentária se constitui em um trauma complexo caracterizado pelo rompimento do feixe vásculo-nervoso e ligamento periodontal, expondo o dente ao meio externo. Apesar de pouco freqüente entre as agressões traumáticas, pode levar a perda do elemento dentário. A prática de esportes, trabalhos de alto risco e o uso cada vez maior de veículos automotores têm contribuído para isso (1). O procedimento ideal para tratamento da avulsão é o reimplante dentário, mesmo quando as condições não sejam as mais favoráveis, pois restabelece a função e a estética, mesmo que temporariamente (1). Para se obter um prognóstico favorável, a manutenção da vitalidade do ligamento periodontal é de extrema importância e o reimplante imediato é a melhor opção de tratamento (2). Porém, tal conduta raramente ocorre, seja por conta da extensão do trauma que coloca em risco a vida do paciente, ou devido à complexidade do dano à área receptora e ainda a falta de conhecimento sobre a possibilidade do reimplante dentário (3-7). Em tais condições, quanto menor o tempo em que o dente avulsionado permanecer em meio seco, melhor o prognóstico, sendo que os melhores resultados foram obtidos para reimplantes feitos em até 5 minutos (5,8). Para contornar esse inconveniente os meios de conservação para manutenção da vitalidade celular têm sido estudados, pois essa capacidade pode ser até mais importante que o tempo extra- alveolar (3,9,10). O meio de conservação deve estar disponível no momento da avulsão e ser capaz de manter a vitalidade, a capacidade de fixação e a clonogenicidade da célula 7 (11,12). Deve possuir pH e osmolaridade fisiologicamente compatíveis e não provocar danos às células (13,14). Dentre os vários tipos estudados encontramos o Viaspan®, a solução salina balanceada de Hank (14,15), o Eurocollins (16), a própolis (17-19), o extrato de chá verde (20), a água de torneira (12), a saliva (13,21), o soro fisiológico (22) e o leite (9-11,14,15,23-26). Alguns meios de conservação como o Viaspan® e a solução salina balanceada de Hank possuem melhores propriedades do que o leite e podem manter a vitalidade das células por longos períodos de tempo (14,15). Recentemente, um composto tem chamado a atenção dos pesquisadores por apresentar a capacidade de prolongar o tempo de vida das células (27-31). Inicialmente isolado das raízes do heléboro-branco (Veratrum grandiflorum), em 1940, o resveratrol (trans-3,5,4’-triidroxistilbeno), um composto polifenólico natural, é também encontrado em outras plantas incluindo amora, amendoim, castanhas, legumes e, especialmente, na casca das uvas vermelhas. É encontrado em alta concentração em alguns tipos de vinhos elaborados a partir de uvas tintas, podendo alcançar até 14 mg/L. Sendo uma fitoalexina, ou o antibiótico da planta, é produzido em resposta ao estresse, tais como uma infecção por fungos, radiação ultravioleta e alterações de temperatura (32). Pesquisas têm demonstrado que apresenta potente ação antioxidante, antiinflamatória, antimicrobiana, antiplaquetária, além de efeitos antiproliferativos (31,33,34). Está associado a um grande número de benefícios à saúde, notadamente aqueles que envolvem o envelhecimento, incluindo as doenças neurodegenerativas, câncer e arteriosclerose (35-37). 8 Achados recentes indicam também benefícios para o sistema cardiovascular (38) tais como a redução do estresse oxidativo do miocárdio (39), a redução da apoptose (40) e o aumento da formação capilar (41). Esse composto comprovadamente estende a vida de diversos organismos como nematóides (42), leveduras (27,43,44), mosca da fruta (42,45), peixes (46) e camundongos (47). Como não foram encontrados trabalhos na literatura que avaliam a vitalidade celular utilizando o resveratrol como meio de conservação e, em razão das suas propriedades já relatadas, é oportuna a realização deste estudo. 9 2-Proposição Analisar, histomorfologicamente, a vitalidade das células do ligamento periodontal de dentes de macaco mantidos em resveratrol por 6 horas. 10 3-Material e Método Previamente à sua realização, a metodologia empregada no trabalho foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP (Anexo A). Para a realização deste trabalho foram utilizados os incisivos superiores e inferiores de três macacos (Cebus apella) com boa saúde, adultos, cedidos e alojados no Núcleo de Procriação de Macaco-Prego do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Odontologia do Câmpus de Araçatuba – UNESP. Esses animais também foram utilizados em outros estudos experimentais. Para o procedimento cirúrgico, os animais foram inicialmente pesados e sedados por meio de inalação de éter sulfúrico (Miyako do Brasil Indústria e Comércio LTDA, Guarulhos, SP, Brasil), recebendo a seguir 0,1Ml de Diazepan (Sigma Pharma, São Bernardo do Campo, SP, Brasil) intramuscular para promover um relaxamento e, logo após, anestesiados com injeção intraperitonial de Thionembutal (Abbott Laboratórios do Brasil Ltda) na dosagem de 30 mg/kg por peso corporal. Alcançado o estado de anestesia cirúrgica foi realizada a sindesmotomia, luxação e extração dos incisivos superiores e inferiores, previamente à eutanásia. Após a extração, os dentes foram divididos em três grupos (com oito dentes cada): Grupo I: os dentes foram imersos imediatamente em solução fixadora (formalina a 10%). 11 Grupo II: os dentes foram mantidos em meio seco, presos pela coroa dental em uma lâmina de cera utilidade, por um período de 6 horas. Grupo III: os dentes foram imersos em solução de resveratrol por 6 horas. No grupo III os dentes foram imersos em 50mL de solução de resveratrol em propilenoglicol (baseado em teste de solubilidade previamente realizado – Figura 1) 5µΜ/L (Apothicário Farmácia de Manipulação, Araçatuba, São Paulo, Brasil), contidos em copos plásticos descartáveis. Todos os procedimentos foram realizados em temperatura ambiente. FIGURA 1 – Teste de solubilidade previamente realizado para os seguintes solventes: Tubo 1: Álcool de Cereais (produto completamente solúvel neste solvente); Tubo 2: Propilenoglicol (produto completamente solúvel neste solvente); Tubo 3: Glicerina 12 (produto parcialmente solúvel neste solvente, formando uma suspensão, pouca presença de corpo de fundo); Tubo 4: Sorbitol (produto parcialmente solúvel neste solvente, formando uma suspensão, pouca presença de corpo de fundo); Tubo 5: Saliva Artificial (produto parcialmente solúvel neste solvente, formando uma suspensão, mas sendo menos solúvel do que no Sorbitol e Glicerina, além de formar um corpo de fundo mais volumoso); Tubo 6: Leite (produto pouco solúvel neste solvente, sem formação de uma suspensão perceptível, formando um corpo de fundo equivalente a quase toda a amostra testada). As peças obtidas foram fixadas em solução de formalina a 10% por 24 horas e descalcificadas em solução de EDTA 4,13% (Ácido Etileno Diamino Tetracético – Ph 7,0, Merck, Darmstadt, Alemanha). O ponto exato da descalcificação foi obtido quando, ao introduzir uma agulha (Terumo Medical do Brasil Ltda, São Paulo, SP, Brasil) na coroa de cada dente, a mesma não apresentou resistência. Em seguida, as peças foram embebidas em parafina e submetidas a cortes transversais de 6μm de espessura. Os cortes obtidos foram corados em hematoxilina e eosina, para análise histomorfológica. As análises foram realizadas qualitativamente em microscópio de luz. As características do ligamento periodontal foram observadas em 6 horas de conservação em resveratrol. Foram considerados os fibroblastos, as células inflamatórias e os vasos sanguíneos. Em seguida, para a captura das imagens, foi utilizado o microscópio óptico Leica Aristoplan Microsystems (Leitz, Benshein, Alemanha) acoplado a uma câmera de captação da imagem (Leica DFC 300FX, Leica microsystems, Heerbrug, 13 Switzerland) conectada a um microcomputador Pentium III com um software analisador de imagens digitalizadas (Leica Câmera Software Box, Leica Imaging Manager – IM 50 Demo software). 4-Resultados Pela análise histomorfológica, o grupo I (imediato) apresentou alguns espécimes com ligamento periodontal bem vascularizado com moderado número de fibroblastos e alguns macrófagos. Em outros espécimes, pode ser notada a presença de feixes de fibras colágenas com moderado número de fibroblastos, ao lado de raros linfócitos e macrófagos (Figura 2). O grupo II (seco) mostrou o remanescente do ligamento periodontal com ausência de vasos sanguíneos ao lado de alguns fibroblastos em degeneração (Figura 3). No grupo III (resveratrol – 6 horas) uma delgada faixa de tecido conjuntivo é observada em um dos espécimes, com raros fibroblastos e macrófagos e ausência de vasos sanguíneos. Outros espécimes apresentaram remanescente do ligamento periodontal com moderado número de fibroblastos e discreta vascularização (Figura 4). 14 FIGURA 2 – Grupo I (imediato) – Feixes de fibras colágenas, moderado número de fibroblastos e alguns macrófagos e linfócitos. HE. 160x. FIGURA 3 – Grupo II (seco 6 horas) – Ligamento periodontal com ausência de vasos sanguíneos e presença de alguns fibroblastos em degeneração. HE. 160x. 15 FIGURA 4 – Grupo III (resveratrol 6 horas) – Espécime mostrando remanescente do ligamento periodontal com moderado número de fibroblastos e discreta vascularização. HE. 250x. 16 5-Discussão O reimplante dentário exige atenção especial com relação às suas principais complicações, as reabsorções radiculares (16,48-50). Durante a avulsão, o rompimento das fibras do ligamento periodontal não pode ser evitado. No entanto, as complicações adicionais durante o tempo em que o dente encontra-se fora do alvéolo podem ser evitadas ou minimizadas (49) pelo reimplante imediato (51,52) ou pela manutenção em meios de conservação adequados, tais como solução salina balanceada de Hank, Viaspan®, Eurocollins, leite, soro fisiológico e saliva (16,48,49). Atualmente, o alvo das pesquisas tem sido a busca por um meio de conservação para dentes avulsionados que aumente as chances de reparo e impeça a ocorrência das reabsorções radiculares. O resveratrol tem a capacidade de prolongar o tempo de vida das células. A redução do suprimento alimentar (restrição calórica) aumenta a expectativa de vida de um grande número de espécies desde as leveduras até os mamíferos (53). Quando as leveduras sofrem restrição calórica, dispositivos de estresse são ativados e as células são forçadas a encontrar energia em substratos alternativos. Isso produz alteração no consumo de oxigênio, que por sua vez afeta os padrões de oxidação e redução do DNA que estimula a atividade da SIR2 (silent information regulator 2), que codifica uma enzima, a histona desacetilase dependente de NAD+. O resveratrol ativa diretamente a SIR2 e gera benefícios similares àqueles encontrados diante da restrição alimentar (54). Tais caminhos podem existir também em organismos superiores, pois em mamíferos há sete genes de sirtuínas, 17 sendo que a SIRT1 é a mais parecida com SIR2. A concentração ideal para a ativação da proteína recombinante SIR2 varia de 2 a 5µM (27,55). Em virtude disso, foi utilizada solução de resveratrol em propilenoglicol 5µM, sendo que tal solvente foi escolhido devido às suas propriedades já conhecidas em Odontologia. Apesar de não estar bem conhecido o mecanismo pelo qual as sirtuínas participam do envelhecimento nos mamíferos, recente investigação indica que parece agir como regulador da programação de morte e maturação celular (apoptose e diferenciação, respectivamente, 56). No presente estudo, o quadro histológico encontrado no grupo imediato demonstra a presença de moderado número de fibroblastos, alguns macrófagos e linfócitos. Em contrapartida, o grupo seco 6 horas se caracterizou pela ausência de vasos sanguíneos e fibroblastos em degeneração. Já no grupo resveratrol 6 horas observou-se moderado número de fibroblastos e discreta vascularização. Esses resultados sugerem certo grau de eficiência do resveratrol quanto à manutenção da vitalidade do ligamento periodontal por 6 horas. A metodologia empregada traz algumas limitações. É possível determinar, pelo aspecto morfológico, que os fibroblastos do ligamento periodontal apresentam vitalidade, mas não é possível afirmar que as células sejam capazes de se proliferar. Entretanto, trata-se do primeiro ensaio diante do ineditismo do assunto. A despeito da diferença de metodologia, é possível fazer alguma inferência, comparando os resultados aqui obtidos com aqueles de trabalhos que estudaram as propriedades favoráveis de outros meios de conservação. 18 O leite tem sido recomendado pela maioria dos pesquisadores (4,9,10,24-26). A sua eficácia está relacionada às propriedades como pH (12) e osmolaridade fisiologicamente compatíveis (23,25), presença de substâncias nutritivas (11,13), fatores de crescimento e ao baixo conteúdo bacteriano devido ao processo de pasteurização (9,10). A manutenção do dente avulsionado em leite não deve ser superior a 6 horas (9,25), considerando que após esse período sua eficácia diminui substancialmente (10). A própolis se mostrou eficiente como meio de conservação para dentes avulsionados por 6 horas. Os bons resultados obtidos em pesquisas com essa substância têm sido explicados devido às suas eficientes propriedades antimicrobiana, antiinflamatória, anti-séptica e cicatrizante (18). O Viaspan® e a solução salina balanceada de Hank possuem capacidade de proporcionar a preservação da vitalidade das células por longos períodos de tempo (15). Por sua vez, os resultados obtidos com o resveratrol podem ser explicados pelas suas propriedades antiinflamatória, antimicrobiana, antioxidante, antiplaquetária, além de efeitos antiproliferativos (31,33,34). Deve ser enfatizada a importância da realização de outros trabalhos utilizando métodos mais aprimorados de detecção de vitalidade celular, abrindo perspectiva para novas pesquisas. 19 6-Conclusão O resveratrol é um bom meio de conservação da vitalidade das células do ligamento periodontal por 6 horas. 20 7-Referências 1. 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FIGURA 12- Frasco com solução de resveratrol. FIGURA 16- Dente extraído mantido em solução de resveratrol.