RESSALVA
Atendendo solicitação do(a)
autor(a), o texto completo desta tese
será disponibilizado somente a partir
de 02/09/2024.
Chadia Chahud Maestrello
Imobilização de xilanases de Aspergillus labruscus ITAL 22.223: utilização
em reator para obtenção de xilose a partir de sabugo de milho para
produção de xilitol
Tese apresentada ao Programa
de Pós-graduação em
Biotecnologia do Instituto de
Química, UNESP,
Araraquara/SP, como parte das
exigências para obtenção do
título de Doutora em
Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Luis Henrique Souza Guimarães
Araraquara/SP
2022
M186i
Maestrello, Chadia Chahud
Imobilização de xilanases de Aspergillus labruscus ITAL
22.223 : utilização em reator para obtenção de xilose a partir de
sabugo de milho para produção de xilitol / Chadia Chahud
Maestrello. -- Araraquara, 2022
117 f. : il.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp),
Instituto de Química, Araraquara
Orientador: Luis Henrique Souza Guimarães
1. Resíduos agrícolas. 2. Fermentação em estado sólido. 3.
Xilitol. 4. Aspergillus. 5. Enzimas imobilizadas. I. Título.
Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do
Instituto de Química, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a).
Essa ficha não pode ser modificada.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
Câmpus de Araraquara
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
TÍTULO DA TESE: "Imobilização de xilanases de Aspergillus labruscus ITAL 22.223: utilização em reator para
obtenção de xilose a partir de sabugo de milho para produção de xilitol"
AUTORA: CHADIA CHAHUD MAESTRELLO
ORIENTADOR: LUIS HENRIQUE SOUZA GUIMARÃES
Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em BIOTECNOLOGIA, pela
Comissão Examinadora:
Prof. Dr. LUIS HENRIQUE SOUZA GUIMARÃES (ParticipaçaoVirtual)
Departamento de Biologia / Faculdade de Filosofia Ciências e Letras - USP - Ribeirão Preto
Profa. Dra. DANIELA ALONSO BOCCHINI (ParticipaçaoVirtual)
Departamento de Bioquímica e Tecnologia Química / Instituto de Química - UNESP - Araraquara
Prof.ª Dr.ª SANDRA REGINA POMBEIRO SPONCHIADO (ParticipaçaoVirtual)
Departamento de Bioquimica e Tecnologia Quimica / Instituto de Quimica - UNESP - Araraquara
Prof. Dr. HAMILTON CABRAL (ParticipaçaoVirtual)
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto / Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto
Profª. Drª. MARINA KIMIKO KADOWAKI (ParticipaçaoVirtual)
CentrodeCiênciasMédicaseFarmacêuticas/UniversidadeEstadualdoOestedoParaná-Unioeste-Cascavel,Paraná
Araraquara, 02 de setembro de 2022
Instituto de Química - Câmpus de Araraquara -
Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São
Paulohttp://www.iq.unesp.br/#!/pos-
graduacao/biotecnologia/CNPJ:48.031.918/0027-63.
http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ
http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ
DADOS CURRICULARES
IDENTIFICAÇÃO
Nome: Chadia Chahud Maestrello
Nome em citações bibliográficas: MAESTRELLO, C. C.
ENDEREÇO PROFISSIONAL
Universidade de São Paulo, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto/SP. Avenida Bandeirantes, 3900, Vila Monte Alegre, 14040-901
– Ribeirão Preto/SP – Brasil.
FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO
2018 – 2022 - Doutorado em Biotecnologia (Conceito CAPES 6). Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Brasil. Título “Imobilização
de xilanases de Aspergillus labruscus ITAL 22.223: utilização em reator para
obtenção de xilose a partir de sabugo de milho para produção de xilitol e etanol”.
Orientador: Prof. Dr. Luis Henrique Souza Guimarães.
2016 – 2018 – Mestrado em Biotecnologia (Conceito CAPES 6). Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Brasil. Título “Produção de
celulases e xilanases pelo fungo Aspergillus labruscus ITAL 22.223 cultivado em
Fermentação em Estado Sólido utilizando resíduos agroindustriais”. Orientador:
Prof. Dr. Luis Henrique Souza Guimarães.
2010 – 2014 – Graduação em Engenharia de Energias Renováveis e Ambiente,
modalidade Bacharelado. Centro Universitário de Araraquara, UNIARA, Brasil.
Título: Produção de Biogás a partir de cama de frango e dejetos bovinos.
Orientador: Prof. Dr. João Antônio Galbiatti.
FORMAÇÃO COMPLEMENTAR
2015 – Água em curso (Carga horária: 12h)
Agência Nacional de Água, ANA, Brasil.
2015 – Capacitação em Energia Renováveis – O Biogás (Carga horária: 16h)
Observatório de Energias Renováveis para a América Latina e Caribe, ONUDI,
Uruguai.
2016 – Escrita Científica (Carga horária: 6h)
Universidade de São Paulo, USP, Brasil.
2016 – Espectrometria de Massas – Avançado (Carga horária: 8h)
Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, SBBq, Brasil.
2019 – Docência no Ensino Superior: fundamentos e práticas pedagógicas
(Carga horária: 30h)
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Brasil.
2021- Fundamentos da cromatografia líquida para indústria farmacêutica –
HPLC (Carga horária: 8h)
Cromatografando, HPLC, Brasil.
2022 – HPLC sem mistério (Carga horária: 8h)
Cromatografando, HPLC, Brasil.
PROJETOS DE PESQUISA/ATUAÇÃO PROFISSIONAL
2013 – 2015 – Membro Discente da Comissão Própria de Avaliação.
Universidade de Araraquara, UNIARA.
2015 – 2016 – Bolsista FAPESP, treinamento técnico TT3
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP, Brasil.
2016 – 2018 – Projeto de Mestrado: Análise secretômica da linhagem Aspergillus
sp. cultivado em fermentação em estado sólido (FES) contendo bagaço de cana-
de-açúcar como substrato. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, UNESP, Brasil.
2020-2021 – Estágio docência. Universidade Estadual Paulista “Júlio de
Mesquita Filho”, UNESP, Brasil.
PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA
Artigos completos publicados em periódicos
CAVALCANTI, R. M. F.; MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Immobilization of the Tannase From Aspergillus fumigatus CAS21:
Screening the Best Derivative for the Treatment of Tannery Effluent Using a
Packed Bed Reactor. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology , v. 9,
p. 1-12, 2021.
MAESTRELLO, C. C. Reaproveitamento de resíduos de madeira da construção
civil para geração de energia: Revisão. Construindo, v. 3, p. 1-9, 2021.
MAESTRELLO, CHADIA CHAHUD; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE SOUZA.
Potential of the Aspergillus labruscus ITAL 22.223 as a producer of cellulolytic
enzymes and xylanase under solid-state fermentation. International Journal of
Scientific Reports, v. 4, p. 147-152, 2018.
CHAHUD, E.; MAESTRELLO, C. C.; CHAHUD, B.; NUNES BRANCO, L. A. M.
Proposta de dimensionamento de peças de madeira submetida à tração
paralelas às fibras*. Construindo, v. 9, p. 1-7, 2017.
http://lattes.cnpq.br/0544094782013333
http://lattes.cnpq.br/0544094782013333
http://lattes.cnpq.br/0544094782013333
Resumos publicados em anais de congress
AVALCANTI, R. M. F.; MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Imobilização da tanase de Aspergillus ochraceus e aplicação na síntese
de propil galato analisada por TLC e FTIR. In: Congresso Online Internacional
de Bioquímica, 2020, Divinópolis. Congresso Online Internacional de Bioquímica,
2020.
CAVALCANTI, R. M. F.; MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Tratamento enzimático do chá verde em reator de leito fixo com tanase
imobilizada em esferas de alginato. In: Semana de Bioquímica Aplicada, 2020,
Viçosa. Semana de Bioquímica Aplicada, 2020. v. 1. p. 67-69.
CAVALCANTI, R. M. F.; MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Immobilization of the Aspergillus ochraceus tannase and application of
the derivate in enzymatic hydrolysis of tannins of grape juice and black tea. In:
30º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2019, Maceió. Anais do 30º
Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2019.
MAESTRELLO, C. C.; CAVALCANTI, R. M. F.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Hydrolysis of xylans extracted from corn cobs by free and immobilized
xylanase produced by Aspergillus labruscus ITAL 22.223. In: 30º Congresso
Brasileiro de Microbiologia, 2019, Maceió. Anais do 30º Congresso Brasileiro de
Microbiologia, 2019.
MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE SOUZA. Produção e
caracterização parcial da xilanase de Aspergillus labruscus ITAL 22.223 em
fermentação em estado sólido. In: VIII Congresso Farmacêutico e IV Jornada de
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia, 2018, Araraquara. Revista de
Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 2018. v. 39.
http://lattes.cnpq.br/0544094782013333
http://lattes.cnpq.br/0544094782013333
Apresentação de Trabalhos
CAVALCANTI, R. M. F.; MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Imobilização da tanase de Aspergillus ochraceus e aplicação na síntese
de propil galato analisada por TLC e FTIR. 2020. (Apresentação de
Trabalho/Congresso).
CAVALCANTI, R. M. F.; MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Tratamento enzimático do chá verde em reator de leito fixo com tanase
imobilizada em esferas de alginato. 2020. (Apresentação de Trabalho/Outra).
MAESTRELLO, C. C.; CAVALCANTI, R. M. F.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Hydrolysis of xylans extracted from corn cobs by free and immobilized
xylanase produced by Aspergillus labruscus ITAL 22.223. 2019. (Apresentação
de Trabalho/Congresso).
CAVALCANTI, R. M. F.; MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE
SOUZA. Immobilization of the Aspergillus ochraceus tannase and application of
the derivate in enzymatic hydrolysis of tannins of grape juice and black tea. 2019.
(Apresentação de Trabalho/Congresso).
MAESTRELLO, C. C.; GUIMARÃES, LUIS HENRIQUE SOUZA. Produção e
caracterização parcial da xilanase de Aspergillus labruscus ITAL 22.223 em
fermentação em estado sólido. 2018. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
MAESTRELLO, C. C., JORGE, J. A., GUIMARÃES, L. H. S. Production of
Enzymes of the Cellulolytic Complex by Aspergillus labruscus Under Solid State
Using Agroindustrial by Products. 2017. (Apresentação de trabalho/Congresso).
MAESTRELLO, C. C., JORGE, J. A., GUIMARÃES, L. H. S. Produção de
Enzimas do Complexo Celulolítico de Aspergillus labruscus Utilizando
Produtos/Resíduos Agroindustriais em Fermentação em Estado Sólido (FES).
2017. (Apresentação de trabalho/Congresso).
http://lattes.cnpq.br/0544094782013333
http://lattes.cnpq.br/0544094782013333
PARTICIPAÇÃO EM BANCAS DE COMISSÕES JULGADORAS
MAESTRELLO, C. C. XXXII Congresso de Iniciação Científica da UNESP. 2020.
Universidade Estadual “Júlio de Mesquita Filho”.
PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS, CONGRESSOS, EXPOSIÇÕES E FEIRAS
5º Congresso Internacional de Bioenergia. Curitiba-PR, 10 a 13 de agosto de
2010. (Congresso).
6º Congresso Internacional de Bioenergia. Curitiba-PR, 16 a 19 de agosto de
2011. (Congresso).
Encontro Internacional Brasil-Moçambique: Perspectivas para os
Biocombustíveis. Universidade de São Paulo – USP, Ribeirão Preto-SP, 16 de
março de 2011. (Encontro).
Semana de Engenharia Bioenergética. Centro Universitário de Araraquara-
UNIARA, 23 a 27 de maio de 2011. (Encontro).
Semana da Engenharia Bioenergética: Inovações Tecnológicas em Energias
Renováveis. Centro Universitário de Araraquara- UNIARA, 01 a 04 de outubro
de 2012. (Encontro).
XIV Feira de Cursos da UNIARA. Centro Universitário de Araraquara- UNIARA.
2013. (Feira)
46a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular.
Águas de Lindóia-SP, 27 a 30 de julho de 2017. (Congresso).
2º Encontro Nacional de Química Biotecnológica e Agroindustrial. Universidade
de São Paulo – USP, Ribeirão Preto-SP, 03 a 06 de setembro de 2017.
(Congresso).
VIII Congresso Científico da UNESP e IV Jornada de Engenharia de
Bioprocessos e Biotecnologia. Produção e caracterização parcial de xilanase de
Aspergillus labruscus ITAL 22.223 em fermentação em estado sólido.
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, Araraquara.
2018. (Congresso).
30º Congresso Brasileiro de Microbiologia. Hydrolysis of xylans extracted from
corn cobs by free and immobilized xylanase produced by Aspergillus labruscus
ITAL 22.223. Maceió – AL. 2019. (Congresso).
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus
pais (in memoriam) Gilberto e
Marisa e a minha irmã Muriel, por
todo amor, carinho, compreensão
e união em todos os momentos
desta e de muitas trajetórias.
Agradecimentos
A Deus, primeiramente, pela oportunidade da encarnação nesta Terra para
minha própria evolução, me proporcionando luz, força, fé e amor no meu
caminhar.
Ao prof. Dr. Luis Henrique Souza Guimarães, pela oportunidade, confiança
depositada, pelos ensinamentos e orientações ao longos dos 6 anos e meio de
trabalho e convivência. Muito obrigada.
Aos meus pais, Profa. Dra. Marisa Chahud e Prof. Gilberto Antonio Maestrello,
que hoje se encontram na pátria espiritual. Agradeço por terem assumido e
desempenhado de forma ímpar a missão de me trazerem ao mundo para que
eu pudesse ter a chance de seguir o exemplo da força, garra, luta e dedicação
que tiveram ao longo dos anos para comigo e meus irmãos. O legado de amor
deixado por vocês me acompanhará por todos os dias da minha vida. Amo
vocês eternamente, com a certeza do reencontro.
À minha irmã, Muriel Chahud Maestrello, pela paciência e compreensão
durante todos esses 30 anos de convivência. Amo você.
Aos meus tios, Prof. Dr. Fernando Chahud e Adriana Chahud, e aos meus
primos, Fernando Jr. e Leonardo, pela convivência excepcional durante esses
anos que estive em Ribeirão Preto. Serei eternamente grata por tudo o que
fizeram por mim. Amo vocês.
Ao meu tio, Prof. Dr. Eduardo Chahud, o Engenheiro mais admirável que
conheci nesta vida, por todo apoio e incentivo de ingressar neste mundo
acadêmico, afinal, engenheiro entende engenheiro!!! Obrigada por tudo o que
fez e faz por nossa família. Amo você.
Às minhas primas Bruna, Mariana e Natália pela amizade inabalável que veio,
literalmente, do berço. Amo vocês enternamente.
Aos meus padrinhos Ricardo Chahud e Eliana Bueno da Silva Chahud que
estão presentes em todos os momentos da minha vida, torcendo e
incentivando-me a seguir em frente. Amo vocês.
Às minhas tias Daniela e Madalena que se fizeram presente em todos os
momentos, felizes ou não, da minha vida. Amo vocês.
Às minhas tias, Adur, Badia, Vitória (In memoriam), que sempre acreditaram no
meu potencial, incentivando-me em todos os momentos que estivemos juntas
neste plano. A saudade é imensa, mas a certeza do reencontro é confortador.
Amo vocês.
Aos meus eternos e fiéis amigos de vida, Jéssica e Paulo, por estarem comigo
em todos os momentos nesses ultimos 20 anos de amizade. Obrigada por
todos os churrascos e jantares. Mas, sobretudo, obrigada por me darem o título
de “titia mais babona do planeta” com a chegada da Manuela. Com a certeza
de que somos muito mais que amigos, hoje somos uma família. Amo vocês
infinitamente.
Aos amigos que Ribeirão Preto me proporcionou. Thaís, Rayza, Pedro, Isabela,
Larissa, Fernanda, Camila e Luiz Felipe pelo companherismo, amizade,
risadas, traquinagens no laboratório e sobremesas pós almoço. Sem vocês os
dias não teriam luz!!!
Ao técnico Maurício pelo auxílio e apoio no laboratório.
A Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, pela
disponibilidade para a realização desta pesquisa.
Aos funcionários do Insitituto de Química de Araraquara, UNESP, por estarem
sempre a disposição quando foi necessário, em especial às secretárias da Pós-
Graduação em Biotecnologia.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de
Financiamento 001.
“Por isso, vê lá onde pisa. Respeite
a camisa que a gente suou,
respeite quem pode chegar onde a
gente chegou! E a gente chegou
muito bem, sem desmerecer a
ninguém!!!”
Jorge Aragão
RESUMO
O sabugo de milho é um resíduo rico em material lignocelulósico que pode ser
reaproveitado para produção de xilitol, por meio de conversão enzimática e
posterior fermentação com leveduras do gênero Candida. Diante do exposto,
esse estudo teve por objetivo a extração de xilana de sabugo de milho para ser
hidrolisada por xilanase de Aspergillus labruscus ITAL 22.223 imobilizada e a
xilose, obtida da hidrólise enzimática, utilizada em fermentação com Candida
tropicalis ATCC 750 para produção de xilitol. As xilanas extraídas apresentaram
baixa contaminação por proteínas (<0,45%) e fenóis (<0,1%) e quando
hidrolisadas enzimáticamente, foi possível constatar, através do CCD, bandas
de nítidas de xilose, xilobiose e xilotriose. Na caracterização da atividade
enzimática, utilizando xilana comercial como substrato, a enzima apresentou
temperatura ótima na faixa de 55–75 ºC, pH ótimo de reação de 4,5 e 5,5,
termoestabilidade em 45 ºC por 120 min e estabilidade ao pH na faixa de 3,0 a
5,0 por 1 h. Para xilana extraída de sabugo de milho (ABST) 5% utilizada como
substrato, a temperatura ótima de reação para a enzima foi de 45-60 ºC, pH
ótimo de reação 3,5 e 5,0, termoestabilidade de 45-50 ºC por 24 h e estabilidade
ao pH de 80% de atividade em todas as faixas analisadas. Na imobilização da
xilanase, utilizando resinas de troca iônica, obteve-se rendimento, eficiência,
atividade recuperada e atividade do derivado de 93%, 97%, 100% e 11U/g,
respectivamente, para DEAE-Celulose, e de 99%, 98%, 11% e 8,9 U/g,
respectivamente, para DEAE-Sephadex. Os derivados apresentaram
temperatura e pH ótimo de reação de 55 ºC e 5,0, utilizando a xilana ABST como
substrato. O derivado DEAE-Celulose foi utilizado em reator enzimático para
hidrolisar a xilana ABST, obtendo 2mg/mL de xilose ao final de 48 h. Na
fermentação com C. tropicalis, a xilose comercial 2% foi 85% consumida a 35 ºC
em 72 h de fermentação. No ensaio com a xilose obtida da hidrolise da xilana
ABST, a levedura consumiu cerca 60% ao final de 96 h e as análises de HPLC
indicaram a produção de 1,02 mg/mL de xilitol em 48 h de fermentação. Deste
modo, foi possível produzir xilitol a partir da xilose obtida da hidrólise da xilana
de sabugo de milho, potencializando a reutilização do sabugo de milho para
produção de produtos de alto valor agregado.
Palavras-chaves: Xilana; Xilanase; Xilitol; Imobilização.
ABSTRACT
Corn cob is a residue rich in lignocellulosic material that can be reuse for the
xylitol production, through enzymatic conversion and fermentation subsequent
with yeasts of Candida genus. Given above, this study aimed to xylan extract of
corn cobs to be hydrolyzed by immobilized Aspergillus labruscus ITAL 22,223
xylanase and the xylose, obtained from enzymatic hydrolysis, used in Candida
tropicalis ATCC 750 fermentation to xylitol production. The xylans extracted
showed low contamination by proteins (<0.45%) and phenols (<0.1%) and, when
enzymatically hydrolyzed, it was possible to observe, through the CCD, clear
bands of xylose, xylobiose and xylotriose. In the enzymatic activity
characterization, using commercial xylan as substrate, the enzyme presented an
optimal temperature in range of 55-75 ºC, pH reaction optimal of 4.5 and 5.5,
thermostability at 45 ºC for 120 min and stability at pH in the range from 3.0 to
5.0 for 1 h. For corn cob ABST 5% xylan used as substrate, the optimal
temperature for the enzyme was 45-60 ºC, optimal reaction pH of 3.5 and 5.0,
thermostability of 45-50 ºC for 24 h and stability at pH of 80 % of activity in all
analyzed range. In enzymatic immobilization, using ion exchange resins, yield,
efficiency, recovered activity and derivative activity of 93%, 97%, 100% and
11U/g were obtained, respectively, for DEAE-Cellulose, and 99%, 98 %, 11% and
8.9 U/g, respectively, for DEAE-Sephadex. Derivatives showed an optimal
reaction temperature and pH of 55ºC and 5.0, using ABST xylan as substrate.
The DEAE-Cellulose derivative was used in an enzymatic reactor to hydrolyze
ABST xylan, obtaining 2mg/mL of xylose after 48 h. The fermentation with C.
tropicalis, the commercial xylose 2% was consumed 85% at 35 ºC in 72 h of
fermentation. The assay with xylose obtained from ABST hydrolysis, the yeast
consumed about 60% at in 96 h and HPLC analyzes production indicated of 1.02
mg/mL of xylitol in 48 h of fermentation. In this way, it was possible xylitol
production from xylose obtained from the xylan hydrolysis of corn cob, enhancing
reuse of corn cob for products production with high added value.
Keywords: Xylan; Xylanase; Xylitol; Immobilization.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Produção de milho nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste,
Sudeste e Sul no ano de 2021. ....................................................................... 23
Figura 2. Componentes externos do sabugo de milho. ................................... 25
Figura 3. Modelo da parede celular da biomassa lignocelulósica ................... 26
Figura 4. Classes das Hemiceluloses ............................................................. 28
Figura 5. Hidrólise da hemicelulose pelo complexo xilanolítico. ..................... 30
Figura 6. Crescimento de Aspergillus labruscus ITAL 22.223 ......................... 32
Figura 7. Metabolismo de xilose ..................................................................... 41
Figura 8. Esquema simplificado dos experimentos realizados no presente
estudo. ............................................................................................................ 45
Figura 9. Fluxograma do processo de extração da xilana............................... 48
Figura 10. Esquema do processo de utilização do reator. .............................. 58
Figura 11. Espectros de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR)..
........................................................................................................................ 66
Figura 12.Atividade enzimática relativa das xilanases dos microrganismos A.
labruscus e B. subtilis ..................................................................................... 69
Figura 13. Hidrólise das xilanas A S20, B S20, A ST e B ST e das misturas da
xilanas A S20 + B S20 e A ST + B ST ............................................................. 70
Figura 14. Influência da temperatura e do pH na atividade da xilanase livre
precipitada, termoestabilidade e estabilidade ao pH, utilizando o substrato xilana
comercial ........................................................................................................ 72
Figura 15.Influência da temperatura e do pH na atividade da xilanase livre
precipitada, termoestabilidade e estabilidade ao pH, utilizando o substrato ABST.
........................................................................................................................ 74
Figura 16. Cromatografia em Camada Delgada ............................................. 76
Figura 17. Atividade enzimática da xilanase imobilizada em alginato de sódio por
diferentes ciclos. ............................................................................................. 78
Figura 18. Influência da temperatura e do pH na atividade da xilanase
imobilizada em DEAE-Celulose, utilizando xilana comercial e xilana ABST como
substratos. ...................................................................................................... 83
Figura 19. Influência da temperatura e do pH na atividade da xilanase
imobilizada em DEAE-Sephadex, utilizando xilana comercial e xilana ABST
como substratos. ............................................................................................. 84
Figura 20. Reuso dos derivados DEAE-Celulose e DEAE-Sephadex, utilizando
Xilana comercial .............................................................................................. 85
Figura 21. Produção de xilose pelo derivado DEAE-Celulose em reator de leito
fixo, usando xilana ABST como substrato. ...................................................... 87
Figura 22. Crescimento da levedura Candida tropicalis ATCC 750 ................ 89
Figura 23. Consumo de xilose obtida da hidrólise de ABST C. tropicalis ATCC
750 .................................................................................................................. 91
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros de operação do reator.................................................. 59
Tabela 2. Rendimentos das xilanas extraídas, em relação à matéria bruta do
sabugo de milho. ............................................................................................. 64
Tabela 3. Quantificação de proteínas e fenóis da xilana comercial das xilanas
extraídas do sabugo de milho. ........................................................................ 68
Tabela 4. Imobilização de xilanase livre em extrato bruto (sem processo de
precipitação) de A. labruscus por adsorção em resinas após 24 h. ................. 79
Tabela 5. Imobilização da xilanase produzida por A. labruscus e precipitada, em
resinas DEAE-Sephadex e DEAE-Celulose pH 7,0 após 24h. ........................ 81
Tabela 6. Consumo de xilose (%) na fermentação com C. tropicalis ATCC 750.
........................................................................................................................ 90
Tabela 7. Parâmetros de bioconversão da xilose extraída de sabugo de milho
pela levedura C. tropicalis. .............................................................................. 92
LISTA DE ABREVIATURAS
ABST – Xilana extraída de sabugo de milho
ATP – Adenosina trifosfato
ATR – Reflexão total atenuada
BDA – Batata Dextrose Agar
BSA – Albumina de Soro Bovino
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CM – Carboximetil
DEAE – Dietilaminoetil
DNS - ácido 3,5-dinitrosalicílico
E.C. – Enzyme Commission
FES – Fermentação em Estado Sólido
FTIR – Espectrometria de infravermelho com transformada de Fourier
HPLC - High Performance Liquid Cromatography
m/v – Massa por volume
mg/mL – Miligrama por mililitro
NADH – Nicotinamida adenina dinucletotídeo
NADPH – Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina
PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida
pI – ponto isoelétrico
SDS – Dodecil sulfato de sódio
TCA – Ácido tricarboxílico
U – Unidade de atividade enzimática
XDH – xilitol desidrogenase
XI – xilose isomerase
XK – xiluloquinase
XOS – Xilooligossacarídeos
XR – Xilose redutase
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................ 23
1.1. Hemicelulose .......................................................................................... 27
1.2. Complexo xilanolítico ............................................................................ 30
1.3. Produção de xilanases ......................................................................... 31
1.3.1. Aspergillus labruscus ITAL 22.223 .................................................... 32
1.3.2. Fermentação em Estado Sólido ......................................................... 33
1.4. Aplicação das xilanases ........................................................................ 35
1.5. Imobilização de enzimas ....................................................................... 38
1.6. Metabolismo de xilose ........................................................................... 40
1.7. Produção de xilitol ................................................................................. 42
2. OBJETIVOS ............................................................................................... 43
2.1. Objetivo geral ......................................................................................... 43
2.2. Objetivos específicos ............................................................................ 44
3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 44
3.1. Microrganismos e manutenção das linhagens em laboratório ........... 46
3.2. Coleta e preparo do sabugo de milho para extração de xilanas ........ 46
3.3. Extração da xilana .................................................................................. 46
3.4. Caracterização físico-química das xilanas ........................................... 48
3.4.1. Análises de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) .... 48
3.4.2. Quantificação de proteínas das xilanas extraídas e dos extratos
enzimáticos ................................................................................................... 49
3.4.3. Quantificação de fenóis totais pelo método de Folin-Ciocalteu ...... 49
3.5. Produção enzimática em Fermentação em Estado Sólido (FES)........ 49
3.6. Precipitação da xilanase ........................................................................ 50
3.7. Determinação da atividade xilanásica .................................................. 51
3.8. Caracterização da xilanase livre ........................................................... 52
3.9. Cromatografia em Camada Delgada (CCD) .......................................... 52
3.10. Imobilização.......................................................................................... 53
3.10.1. Encapsulação em alginato de sódio reticulado com CaCl2 e MnCl2
53
3.10.2. Adsorção em resina CM Sephadex .................................................. 53
3.10.3. Adsorção em resina DEAE-Sephadex A25 e DEAE-Celulose ........ 54
3.11. Determinação da atividade xilanásica imobilizada ............................ 54
3.12. Determinação da eficiência, rendimento e atividade recuperada após
imobilização .................................................................................................. 55
3.13. Caracterização enzimática parcial da xilanase imobilizada em DEAE-
Celulose ......................................................................................................... 56
3.14. Utilização do derivado DEAE-Celulose em reator de leito fixo ......... 57
3.15. Fermentação com a levedura Candida tropicalis ATCC 750 ............. 59
3.16. Determinação das melhores condições de fermentação .................. 60
3.17. Determinação do crescimento celular, consumo de xilose e
concentração de xilitol ................................................................................. 60
3.18. Determinação dos parâmetros da Bioconversão .............................. 61
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................. 63
4.1. Extração de xilanas do sabugo de milho ............................................. 63
4.2. Caracterização físico-química das xilanas ........................................... 65
4.2.1. Análises de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) .... 65
4.2.2. Quantificação de proteínas e fenóis totais das xilanas extraídas ... 67
4.3. Hidrólise enzimática das xilanas comercial e extraídas ...................... 69
4.4. Caracterização da enzima livre ............................................................. 71
4.5. Análise dos produtos de hidrólise das xilanas por Cromatografia em
Camada Delgada (CCD) ................................................................................ 75
4.6. Imobilização ........................................................................................... 77
4.6.1. Imobilização em alginato de sódio .................................................... 77
4.6.2. Imobilização em resina CM Sephadex, DEAE- Sephadex A25 e DEAE-
Celulose por adsorção ................................................................................. 79
4.6.3. Caracterização enzimática da xilanase imobilizada em DEAE-
Celulose e DEAE-Sephadex ......................................................................... 82
4.6.4. Reuso dos derivados .......................................................................... 85
4.7. Utilização do derivado em reator de leito fixo ...................................... 86
4.8. Fermentação com levedura Candida tropicalis ATCC 750 utilizando
xilose comercial ............................................................................................ 88
4.8.1. Fermentação com C. tropicalis ATCC 750 utilizando xilose obtida da
xilana de sabugo de milho. .......................................................................... 91
5. CONCLUSÕES ........................................................................................... 93
6. REFERÊNCIAS .......................................................................................... 94
23
1. INTRODUÇÃO
O consumo da população de alimentos, farmacêuticos ou energéticos, os
modos de produções e alterações no estilo de vida, em decorrência do
desenvolvimento econômico, crescimento demográfico urbano e crescimento do
setor industrial somado a ineficiência da gestão de resíduos sólidos, tem
intensificado cada vez mais a produção de resíduos urbanos e agrícolas,
ocasionando de forma desenfreada a poluição ambiental (CONCEIÇÃO;
TEIXEIRA, 2021; LIMA; BARROS, 2019; ROMANO; MOLINOS-SENANTE,
2020; VIEIRA et al., 2019).
No contexto agroindustrial, o milho é um dos grãos de maior destaque no
Brasil, um dos cinco maiores produtores mundiais. Na safra 2020/21, o país
contou com cerca de 20 milhões de hectares de área cultivada, produzindo
aproximadamente 87 milhões de toneladas de milho (IBGE, 2022). Na Figura 1
podemos observar a produção nacional do grão por região, segundo o
levantamento sistemático da produção agrícola do IBGE em 2021.
Figura 1. Produção de milho nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste,
Sudeste e Sul no ano de 2021.
Fonte: IBGE (2022).
24
Nota-se que a região Centro-Oeste é responsável pela maior cota da
produção, seguida das regiões Sudeste e Sul, resultado de investimentos mais
elevados em mão de obra capacitada e em tecnologia para colheita de milho. Já
as regiões Norte e Nordeste, por serem regiões mais pobres, apresentam
produções mais baixas e o cultivo é voltado para o consumo interno, já que o
milho é uma espécie vegetal eficiente na armazenagem de energia devido a sua
capacidade de acumulação de fotoassimilados (compostos resultantes da
fotossíntese), portanto é base da alimentação dessas regiões (COSTA FILHO,
2021).
Evidentemente, a colheita do milho gera resíduos. Segundo Costa Filho
(2021), estima-se que a cada tonelada de grãos de milho produzida, são gerados
2,3 toneladas de resíduos, sendo que uma lavoura de milho pode gerar de 6 a
12 toneladas por hectares de resíduos, abundantes em carbono e nitrogênio. Os
resíduos podem ser divididos em sabugo, folha, caule e palha. Durante a
colheita, o maquinário efetua o corte do talo de milho, os grãos são debulhados
e armazenados no próprio equipamento, enquanto que uma porcentagem dos
resíduos é devolvido ao solo in situ, que tem, por finalidade, minimizar a erosão,
diminuir a evaporação e impedir o crescimento de plantas daninhas,
conservando o solo; a outra parte é utilizada em fornalhas para geração de calor.
A palhada (nome genérico dado ao caule, sabugo, folha e palha), também é
utilizada, embora menos comum, na suplementação da ração bovina, devido as
características nutricionais. Entretanto, a contribuição nutricional do sabugo para
o solo é inferior em relação aos demais resíduos, fazendo com que esse resíduo
não seja explorado em todo o seu potencial. (COSTA FILHOA, 2021; SANTOS,
2021; CRUZ et al., 2011; SANTOS, 2014; KONZEN; ALVARENGA, 2008;
DANTAS, 2013; TRAKARNPAIBOON et al., 2017; VIEIRA JÚNIOR et al., 2020).
A espiga do milho é formada pela fusão de várias espiguetas femininas
em um eixo comum, fusão que dá origem ao sabugo, pelas sementes e por
brácteas (palha do milho) que protegem o interior da espiga. O sabugo é a parte
central da espiga, onde estão presos os grãos de milho. Estruturalmente, o
sabugo é dividido em quatro partes fundamentais: palha fina, palha grossa, anel
lenhoso e medula (Figura 2).
25
Figura 2. Componentes externos do sabugo de milho.
Fonte: MORENO e FERREIRA (2018).
A palha fina é a região externa do sabugo, constitui aproximadamente 5%
do sabugo em massa; a palha grossa é a camada que se segue à palha fina e
constitui 33% do sabugo em massa; o anel lenhoso é a região interna que
constitui mais de 50% do sabugo e a medula é a região interna do anel lenhoso,
constituindo apenas 2% do sabugo em massa. Para cada 100 kg de espigas de
milho, aproximadamente 18 kg são formados pelo sabugo. Apesar de grande
quantidade gerada desse subproduto, sua utilização ainda não se mostra
compatível com o seu potencial de uso (COSTA FILHO, 2021; SILVEIRA, 2010).
Dentre as opções de utilização industrial do sabugo de milho, devido à
sua dureza e resistência, é utilizado como abrasivo e polidor em produtos de
limpeza; fabricação de tijolos e cerâmica; na produção do composto químico
furfural; na ração animal; como aditivo em óleos vegetais; na produção de
massas de bolos, pães ou pizzas por não apresentar grande solubilidade em
água ou leite (SILVEIRA, 2010; FOLEY; VANDER-HOOVEN, 1981; ANWAR;
BHANGER; YASMEEN, 2003; ZIGLIO et al., 2007).
Além disso, o sabugo de milho, é uma biomassa constituída basicamente
por celulose, pectina, lignina e hemicelulose (Figura 3). A biomassa
lignocelulósica representa cerca de 90% da biomassa de carbono disponível na
biosfera e a proporção de cada um dos componentes não é fixa, pois os teores
sofrem influencia de fatores como localização geográfica, condições climáticas,
26
origem e espécie do vegetal, entre outros (SANTOS, 2021; GUIMARÃES et al.,
2013; COSTA FILHO, 2021; SAINI et al., 2015; MUSULE et al., 2016; XU et al.,
2020).
Figura 3. Modelo da parede celular da biomassa lignocelulósica
Fonte: Ozmak (2010) adapatado.
A celulose é o biopolímero renovável mais disponível no mundo,
correspondendo aproximadamente a 40% de toda a reserva de carbono
disponível na biosfera. A celulose possui uma cadeia linear formada por
unidades de D-glicose ligadas por ligações β-1,4 unidas paralelamente por
ligações de hidrogênio intramolecurares e intermoleculares, e forças de Van der
Walls na estrutura cristalina, denominada fibrila elementar altamente ordenada,
consistindo em cerca de 40 cadeias de glicano, formando as fibrilas da celulose.
A junção destas fibrilas dá a formação das microfibrilas, onde distinguem-se
regiões cristalinas que são conhecidas por serem de elevada organização, onde
a fibra tem maior resistência à tração, ao alongamento e à solvatação devido à
grande quantidade de ligações de hidrogênio presente e regiões amorfas, menos
organizadas, onde a fibra apresenta maior grau de flexibilidade devido ao menor
27
número de ligações de hidrogênio presente (COSTA FILHO, 2021; RABELO,
2010; JEFFRIES, 1990; BAYER; LAMED, 1992; BIDLACK; MALONE; BENSON,
1992; SILVA, 2010).
Responsável por aproximadamente 30% do carbono orgânico na biosfera,
a lignina é o segundo biopolímero mais abundante da biomassa lignocelulósica.
Sua principal atuação é como componente estrutural, adicionando força e rigidez
às paredes celulares, permitindo, também, o transporte de água e solutos
através do sistema das plantas e fornecendo barreiras físicas contra invasões de
fitopatógenos e outros estresses ambientais (COSTA FILHO, 2021; EUDES et
al., 2014; RAGAUSKAS et al., 2014).
A hemicelulose é outro constituinte da matriz lignocelulósica presente em
toda a parede celular vegetal intimamente ligada a celulose e lignina,
correspondendo de 15 a 45% da biomassa lignocelulósica, sendo caracterizado
pela insolubilidade em água e solubilidade em soluções alcalinas. (GUIMARÃES
et al., 2013).
1.1. Hemicelulose
As unidades constituintes das hemiceluloses podem consistir em
unidades repetidas de pentoses (D-xilose e L-arabinose), hexoses (D-galactose,
D-glicose e D-manose) e ácidos urônicos, sendo os principais constituintes os
polissacarídeos denominados xilanas e heteroxilanas. Ainda no que diz respeito
ao sabugo de milho, tem sido considerado que as xilanas apresentam, em geral,
uma estrutura química formada por ácido 4-O-metil-D-glucorônico, L-arabinose
e D-xilose, na proporção 2:7:19 (GÍRIO et al., 2010; QASEEM; SHAHEEN; WU,
2021; CAPETTI et al., 2021; SENATORE et al., 2021; AGRAWAL et al., 2021;
SANTOS, 2021; MARABEZI, 2009; MILÉO, 2011; SILVA et al.,1998).
Com base na estrutura, as hemiceluloses são classificadas de acordo com
o resíduo de açúcar principal, que são β-glucanas (Figura 4 A), xilanas (Figura 4
B), xiloglucanas (Figura 4 C) e mananas (Figura 4 D). A xilana é o polímero
predominante na estrutura da hemicelulose que forma a parede celular da planta.
28
É o segundo polímero mais abundante na natureza, depois da celulose,
correspondendo cerca de 33% da biomassa lignocelulósica e é formada por
unidades de D-xilose (oligômeros dessas unidades são conhecidos como
xilooligossacarídeos) unidas por ligações glicosídicas β (1-4) na cadeia principal.
Os xilooligoassacarídeos (XOS) podem ser obtidos a partir da hidrólise da xilana
utilizando enzimas do complexo xilanolítico (KAUSHAL et al., 2021; SILVA et al.,
1998; QASEEM, SHAHEEN e WU, 2021).
Figura 4. Classes das Hemiceluloses: A- β-glucanas; B- xilanas; C- xiloglucanas
e D- mananas.
Fonte: Qaseem, Shaheen e Wu (2021), adaptado.
As β-glucanas (Figura 4 A) e xiloglucanas (Figura 4 C), assim como a
celulose, possuem um importante papel na estrutura e função da parede celular,
uma vez que elas estão envolvidas no suporte e reticulação da matriz celulósica
através de ligações de hidrogênio com a celulose, com outras hemiceluloses e
pectinas. Estruturalmente elas são similares à celulose, pois seus esqueletos
são formados por ligações β-glicosídicas (OGEDA; PETRI, 2010; QASEEM,
29
SHAHEEN e WU, 2021). As β-glucanas, antes consideradas específicas das
paredes celulares de gramíneas, são agora identificadas em muitos outros
grupos de plantas e até mesmo em organismos como algas, líquens, fungos e
briófitas. Geralmente, consistem em cadeias de glicose unidas por ligações β-
1,4 e interrompidas por ligações β-1,3 (QASEEM, SHAHEEN e WU, 2021).
As xilanas são hemiceluloses lineares de paredes secundárias de plantas,
com a cadeia principal constituída de resíduos de xilose unidos por ligações β-
1,4. A cadeia principal é frequentemente substituída por várias pequenas
moléculas de oligossacarídeos, incluindo xilose, ácido glicurônico arabinose,
glicose, entre outros (QASEEM, SHAHEEN e WU, 2021).
A xiloglucana é um polissacarídeo diverso, pois está presente em quase
todas as plantas, com quantidades menores de 2% na parede celular da grama
até 25% nas paredes celulares primárias de angiospermas. Os resíduos de β-D-
glucopiranosil constituem a cadeia principal da xiloglucana e são substituídos por
muitos poli ou oligossacarídeos curtos, como arabinopiranosil, galactosil e
arabinofuranosil. A maioria das xiloglucanas é classificada em duas categorias
principais: tipo I XXXG-fucogalactoxiloglucana, mais comuns em parede celular
de dicotiledôneas e tipo II XXGGn – acetoxiloglucana, mais comuns em parede
celular de gramíneas (QASEEM, SHAHEEN e WU, 2021).
As mananas são heteroglicanos hemicelulósicos estruturalmente
complexos envolvidos na manutenção do armazenamento e estrutura da parede
celular em plantas. Estruturalmente, as mananas são classificadas em quatro
tipos: homomanana, galactoglucamanana, glucomanana e galactomanana. Na
homomanana e galactomanana, a cadeia principal consiste exclusivamente de
resíduos de manose ligados por ligações β-1,4, enquanto que em glucomanana
e galactoglucomanana, a cadeia principal da manose é interrompida por padrões
não repetidos de glicose. Além disso, resíduos de galactose também estão
ligados a resíduos de cadeia principal de manosil (QASEEM, SHAHEEN e WU,
2021).
Como observado, as hemiceluloses possuem em sua estrutura uma
variedade de sacarídeos que podem ser obtidos por meio de hidrólise
enzimática, utilizando diversas enzimas que constituem o complexo xilanolítico.
30
1.2. Complexo xilanolítico
As principais enzimas do complexo xilanolítico são as endo 1,4-β-D-xilanases
(EC 3.2.1.8), β-D-xilosidases (EC 3.2.1.37), α-L-arabinofuranosidases (EC
3.2.1.55), acetil-xilana esterases (EC 3.1.1.72), feruloil estereases (EC 3.1.1.73),
α-D-galactosidases (EC 3.2.1.22), α-glucuronidases (EC 3.2.1.139) e p-cumárico
esterases (EC 3.1.1.10). Estas enzimas atuam sinergicamente hidrolisando de
forma randômica as ligações tanto ao longo da cadeia principal, liberar XOS de
diferentes tamanhos, quanto sobre as cadeias laterais (Figura 5) (CAPETTI et
al., 2021; LI et al., 2019; KAUSHAL et al., 2021; MOREIRA; FILHO, 2016).
Figura 5. Hidrólise da hemicelulose pelo complexo xilanolítico.
Fonte: Souza (2013), adaptado.
As endo 1,4-β-D-xilanases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas
internas da cadeia principal, liberando XOS, xilobiose e xilose e as β-D-
xilosidases atuam sobre os XOS e a xilobiose, liberando xilose. Já a remoção
dos grupos substituintes é catalisada pelas enzimas acessórias: as α-L-
31
arabinofuranosidases remove resíduos de arabinose, as α-glucuronidases
liberam ácido glucurônico ou metilglucurônico, as acetil-xilana esterases
hidrolisam ligações acetil-éster, as α-galactosidases removem resíduos de
galactose e as p-cumárico esterases e feruloil estereases hidrolisam ligações p-
cumaroil-éster e feruloiléster, respectivamente (MOREIRA; FILHO, 2016;
POLIZELI et al., 2005).
No processo de hidrólise, pode ocorrer inibição das endo-xilanases pelos
produtos finais de reação (xilobiose e XOS curtos). Entretanto, como as endo-
xilanases e β-xilosidases atuam sinergeticamente, as β-xilosidases
desempenham papel importante minimizando a inibição das endo-xilanases, o
que possibilita maior eficiência no processo como um todo. Forte sinergismo
também é observado entre as endo-xilanases e as enzimas acessórias. Por
exemplo, a presença de ramificações de arabinose pode dificultar o acesso das
endo-xilanases à cadeia principal e a ação das α-L-arabinofuranosidases
removendo resíduos de arabinose potencializa a ação das endo-xilanases
(LAGAERT et al., 2014)
1.3. Produção de xilanases
Muitos estudos reportam que as xilanases podem ser produzidas por
diferentes organismos como fungos filamentosos, leveduras, bactérias, algas
marinhas, sementes, crustáceos e caracóis. Contudo, as principais fontes de
enzimas são os fungos e as bactérias. Vale ressaltar que as enzimas produzidas
podem ter características diferentes umas das outras, de acordo com a fonte
produtora, que as torna úteis em várias aplicações (NAMNUCH;
THAMMASITTIRONG; THAMMASITTIRONG, 2021; MANDAR, 2015; POLIZELI
et al., 2005; BURLACU; CORNEA; ISRAEL-ROMING, 2016).
Os fungos Aspergillus spp., Fusarium spp. e Penicillium spp. são
reconhecidos como produtores importantes da xilanase devido ao alto
rendimento extracelular da enzima. Além disso, xilanases produzidas por fungos
tem atividades catalíticas superiores quando cultivados em fermentação no
estado sólido, por exemplo, se comparadas com as das xilanases de bactérias
e de leveduras. Dentre os gêneros fúngicos mencionados, o Aspergillus se
32
destaca por conter no seu genoma vários genes de xilanases, codificando
múltiplas xilanases (MAKELA; HILDÉN; VRIES, 2014; BURLACU, CORNEA e
ISRAEL-ROMING, 2016)
1.3.1. Aspergillus labruscus ITAL 22.223
O gênero Aspergillus, primeiramente descrito por Micheli em 1729,
consiste de fungos filamentosos, anamorfos (reprodução assexuada) e de
dispersão cosmopolita, podendo ser encontrados principalmente em material
vegetal em decomposição. Em relação à morfologia, as colônias apresentam
uma ampla variação na coloração, sendo a principal característica macroscópica
utilizada para classificação, em tons de verde, amarelo, cinza, marrom, preto e
branco (BENNETT, 2010; SCHUSTER et al, 2002).
Novas espécies têm sido descobertas anualmente em todo o mundo.
Aspergillus labruscus ITAL 22.223 é uma espécie isolada da superfície da uva
Baga (Vitis labruscas L.), muito utilizada para produção de suco de uva
concentrado, na região sul do Brasil, pertencendo ao subgênero Circumdati
seção Nigri (Figura 6) (FUNGARO et al., 2017).
Figura 6. Crescimento de Aspergillus labruscus ITAL 22.223 em
meio BDA em tubo de ensaio.
Fonte: Autora.
Existe uma grande dificuldade de identificação de Aspergillus seção Nigri
devido as sutis diferenças morfológicas entre as espécies. Devido a esta
dificuldade, os autores Fungaro et al. (2017) fizeram a identificação molecular da
33
linhagem isolada. Tal linhagem, denominada Aspergillus labruscus, apresentou
de 85-88% de similaridade com as linhagens Aspergillus homomorphus CBS
101889, Aspergillus aculeatus CBS 172.66 e Aspergillus japonicus CBS 114.51.
Com relação à análise de metabólitos, Aspergillus labruscus produz ácido
secalônico D e neoxalina, e não produz ocratoxina A e fumonisinas, que são
micotoxinas cancerígenas. Em comparação com as linhagens filogeneticamente
relacionadas, Aspergillus saccharolyticus difere de Aspergillus labruscus por
produzir aculeno A e B e homomorfosinas, e a linhagem Aspergillus
homomorphus produz ácido secalônio D, assim como A. labruscus, mas difere
produzindo homomorfosinas e 3-methoxy-5-hydroxy-9-phenyl-2,4,6,8-
nanotetranoic acid lactone (FUNGARO et al., 2017).
Segundo os autores Fungaro et al. (2017), as análises macromorfológicas
indicaram que os diâmetros de colônias de A. labruscus, quando cultivado em
meio Czapeck à 25 ºC por 7 dias, variam de 70-77 mm, sendo o micélio amarelo
e com baixa esporulação. Nas análises micromorfológicas, a estrutura do
conidióforo é unisseriada, com cabeças conidiais esféricas, vesículas 43 x 60
µm, fiálide 7,2-7,8 x 3,8 µm, conídios esféricos 6,5-8 x 6,1-6,9 µm e de coloração
preta, aparentemente rugoso. Morfologicamente, A. labruscus é semelhante ao
Aspergillus sclerotioniger, que também possui micélio amarelo, baixa
esporulação nas mesmas condições de cultivo e conídios ásperos. A principal
diferença entre as duas linhagens é que Aspergillus sclerotioniger tem
conidióforo bisseriado e produz ocratoxina A (FUNGARO et al., 2017).
Com relação à produção de enzimas por A. labruscus, Fungaro et al.
(2017) analisaram a produção de tanases e proteases obtendo resultados
satisfatórios para ambas enzimas. Maestrello e Guimarães (2018) identificaram
que Aspergillus labruscus ITAL 22.223 produz xilanase e celulase.
1.3.2. Fermentação em Estado Sólido
Considerando a importância da degradação de biomassa lignocelulósica
em processos biotecnológicos, estas podem ser realizadas por via enzimática e
a produção de enzimas por fungos filamentosos pode ser conduzida de
diferentes formas como, por exemplo, a Fermentação em Estado Sólido (FES).
34
O desenvolvimento de bioprocessos em FES está ligado a vários
aspectos gerais, que incluem adequação de diferentes tipos de microrganismos,
substratos e parâmetros de processo. Fungos do gênero Aspergillus são
comumente relatados nesse tipo de fermentação, uma vez que a FES pode
fornecer um habitat natural similar (YAZID et al., 2017).
Em FES, o crescimento do microrganismo ocorre sobre e entre as
partículas porosas do substrato, onde a água livre apresenta-se escassa, porém
com umidade suficiente, existente na forma adsorvida na matriz sólida. As
enzimas produzidas por microrganismos nessa condição, geralmente, são mais
estáveis a temperatura e ao pH, e são menos susceptíveis a problemas de
inibição pelo substrato (HOLKER; LENZ, 2004; PANDEY; RADHAKRISHNAN,
1992; SOCCOL; VANDENBERGHE, 2003).
Em relação aos substratos, estes devem ser selecionados
cautelosamente pois desempenham um papel importante para a produção
eficiente e econômica do produto final desejado. Deve ser levar em conta,
também, a garantia da disponibilidade e custo desses substratos, visando
fornecer nutrientes e suporte físico para o desenvolvimento dos microrganismos.
Resíduos agrícolas, industriais e alimentícios são os substratos mais adequados
para serem utilizados devido à sua abundância com baixo ou nenhum custo e
sua composição química. Além disso, o uso destes pode contribuir para a
redução dos problemas de poluição ambiental (YAZID et al., 2017).
Além da seleção dos substratos, outros parâmetros importantes devem
ser avaliados para melhorar a eficiência da FES, como umidade inicial do cultivo,
tamanho da partícula, pH, temperatura, composição do meio, esterilização,
atividade de água, densidade do inóculo e extração do produto. Com relação ao
tamanho das partículas, em especial, é evidente que partículas pequenas de
substrato podem fornecer uma grande área superficial de suporte à fixação do
microrganismo. Entretanto, partículas extremamente pequenas podem resultar
na aglomeração do substrato e interferir na oxigenação do meio de cultivo,
prejudicando o desenvolvimento do microrganismo. O contrário também pode
ocorrer com partículas maiores que, embora ofereça maior aeração, podem
limitar a área de superfície para a fixação microbiana (PANDEY, 2003; YAZID et
al., 2017; CHEN; HE, 2012; DE CASTRO; SATO, 2015).
35
O teor de umidade também tem um papel significativo na FES, uma vez
que fungos necessitam de umidade em torno de 40-60%. Além disso, a alta
umidade pode interferir na difusão do oxigênio. Por outro lado, baixa umidade
pode limitar a solubilidade dos nutrientes, dificultando o crescimento microbiano
(YAZID et al., 2017; MARTINS et al., 2011; SINGHANIA et al., 2009).
As principais vantagens na utilização da FES são sua simplicidade e o uso
de substratos sólidos de baixo custo. Além disso, a ausência de uma fase líquida
reduz o risco de contaminação bacteriana e geração de águas residuais ao final
do processo. Vale ressaltar, também, a redução do uso de reagentes, e baixo
consumo de energia, uma vez que a agitação não é necessária. No entanto,
algumas desvantagens podem ser citadas, como por exemplo, impossibilidade
de controlar o pH e aeração do meio de cultivo. (VINIEGRA-GONZÁLEZ et al.,
2003; HOLKER; HOFER; LENZ, 2004; GABELLE et al., 2012; QUIROZ et al.,
2015).
Substratos agrícolas têm sido amplamente usados em FES,
principalmente para obtenção de enzimas fúngicas do complexo celulolítico e
hemicelulolítico, que apresentam ampla variedade de aplicações, como é o caso
das xilanases.
1.4. Aplicação das xilanases
As xilanases são consideradas como uma das enzimas industriais mais
importantes e, as produzidas por microrganismos, têm atraído grande atenção
do mercado pela sua aplicação biotecnológica em diversos processos, como nas
indústrias de alimentos, rações e papel e celulose. (BURLACU, CORNEA e
ISRAEL-ROMING, 2016).
Na indústria de papel e celulose, a xilanase é utilizada no processo de
remoção da xilana da superfície e dos poros da fibra, que está ligada as camadas
de celulose e lignina. A ruptura da xilana leva à separação entre esses
componentes, aumentando assim o inchaço na parede da fibra, melhorando a
extração de lignina da polpa e facilitando o branqueamento subsequente, uma
vez que a enzima é utilizada para melhorar o efeito de branqueamento,
36
reduzindo o nível de produtos químicos convencionais utilizados para este fim
(SHARMA et al., 2020; THOMAS et al., 2015; KAUSHAL et al., 2021).
Na indústria têxtil, a fabricação do tecido é realizada em etapas, onde a
fibra passa, em um primeiro momento, pela fiação, engomagem e tecelagem,
recebendo o nome de tecido cru. As três etapas seguintes consistem em
desengomagem, lavagem e branqueamento do fio, obtendo-se o tecido
acabado. Anteriormente, o método convencional de desengomagem envolvia a
aplicação de altas temperaturas em um ambiente alcalino sob influência de
agente oxidantes, causando danos ao componente celulósico útil da fibra,
enfraquecendo assim a resistência da fibra. Mais tarde, foi substituído por
tratamento enzimático com xilanase termotolerante e alcalina, sendo um método
mais adequado e ecologicamente correto para desengomagem (BAJPAI, 2014;
KAUSHAL et al., 2021).
Estudos relatam que a utilização das xilanases como pré-tratamento de
culturas de forragem melhoram as propriedades nutricionais da silagem agrícola
e grãos de alimentos, provocando a melhora na digestibilidade dos alimentos
pelos animais, devido a quebra dos complexos arabinoxilanos (WHITING;
ROSE; MACKENZIE, 2019). A inclusão de xilanases em dieta a base de centeio
para frangos de corte resulta na redução da viscosidade intestinal, melhorando
tanto o ganho de peso quanto a sua eficiência de conversão alimentar
(BEDFORD e CLASSEN, 1992).
Na indústria de fermentação, como as cervejeiras, xilanases são usadas
como pré-tratamento dos substratos contendo arabinoxilanos (cevada, trigo)
reduzindo a viscosidade e aumentando a eficiência do processo
(SUBRAMANIYAN e PREMA, 2002). Na panificação, a xilanase, quando
combinada com a amilase, proporciona melhoria das características da massa,
como extensabilidade, maciez e elasticidade, além de aumentar o volume do
pão. O trigo utilizado na fabricação do pão consiste em hemicelulose como a
arabinoxilana. A xilanase é capaz de solubilizar em água a arabinoxilana não
extraível em arabinoxilana extraível, que ajuda na distribuição uniforme da água
em toda a massa (KAUSHAL et al., 2021; BAJAJ; MANHAS, 2021).
37
Xilanases combinadas com celulases e pectinases ajudam na clarificação de
mostos e sucos, estabilização da polpa das frutas e redução na viscosidade,
hidrolisando substâncias que dificultam a depuração física ou química do suco,
que pode causar turbidez no concentrado (POLIZELI et al., 2005; BEG et al.,
2001). Particularmente, α-L-arabinofuranosidase e β-D-glucopiranosidase são
usadas para aromatizar mostos, vinhos e sumos de frutas. Além disso, as
enzimas xilanolíticas são empregadas na extração de café, óleos vegetais e
amidos (SPAGNA et al., 1998; SUBRAMANIYAN e PREMA, 2002).
Outra aplicação da xilanase é na indústria de detergentes, pois a sua
utilização proporciona produtos mais eficazes para limpeza de manchas de
frutas, vegetais, solos e gramas (DHIMAN; SHARMA; BINDU, 2008).
A produção de biocombustíveis tem ganhado grande importância, pois os
recursos energéticos disponíveis estão diminuindo. A ação combinada da
xilanase com várias enzimas como a celulase, manase, ligninase, xilosidase,
glucanase e glucosidase, entre outras, pode ser utilizada para obtenção de
açúcares fermentescíveis, a partir da biomassa lignocelulósica que,
posteriormente, podem ser convertidos em biocombustíveis (bioetanol). Para
isso, a produção de bioetanol requer a deslignificação da lignocelulose para
liberar celulose e hemicelulose. Os passos seguintes incluem a quebra, pelas
enzimas, dos polímeros complexos de carboidratos em unidades monoméricas
de açúcares livres e a fermentação de pentose mista e hexoses para produzir o
bioetanol (CHAUDHARY et al., 2021; LEE, 1998; KAUSHAL et al., 2021).
A xilana está presente em grande quantidade de resíduos hemicelulósicos.
Com acúmulo dos resíduos da agricultura, silvicultura e resíduos sólidos
urbanos, faz-se necessário desenvolvimento de processos eficientes de hidrólise
enzimática, visando oferecer novas perspectivas para tratamento e utilização
desses resíduos, como é o caso da obtenção, pela ação das xilanases, dos XOS,
os quais podem ser utilizados na indústria farmacêutica devido as suas
propriedades anticancerígenas, imunomoduladoras, antimicrobianas e
antioxidantes (GUPTA et al., 2018; MONIZ; HO; DUARTE, 2016; KAUSHAL et
al., 2021; SUBRAMANIYAN e PREMA, 2002).
38
Apesar da ampla variedade de aplicações da xilanase, a enzima apresenta,
de modo geral, estabilidade térmica reduzida e alta sensibilidade as condições
industriais, o que contribui para desvantagens importantes no uso da xilanase
como catalisadora. Técnicas de melhoramento das propriedades enzimáticas,
como a imobilização, têm sido empregadas com sucesso para aumentar a
estabilidade das enzimas sob condições adversas como pH e temperaturas
extremas (ALAGOZ et al., 2022; KAPOOR e KUHAD, 2007; HOKANSON et al.,
2011; DAMIS et al., 2019).
1.5. Imobilização de enzimas
A imobilização enzimática apresenta-se como uma importante alternativa
biotecnológica para melhorar as caracaterísticas das enzimas e fazê-las atender
as demandas industriais. Neste método, a enzima pode ser confinada, ligada ou
retida em um determinado suporte/matriz, podendo sofrer modulações positivas
nas propriedades catalíticas. Algumas dessas propriedades são aprimoradas
com a imobilização, visando maior desempenho catalítico, estabilidade térmica,
variações de temperaturas e pH de reação, tolerância a diferentes faixas de pH.
Adicionalmente, oferece outras vantagens como o reuso do derivado, fácil
separação dos compostos de reação e redução da inibição. Os suportes a serem
utilizados, para viabilizar os processos biotecnológicos, devem possuir
resistência física a compressão, fácil derivação, biocompatibilidade, resistência
ao ataque microbiano e baixo custo (ASHKAN et al., 2021; SALEM et al., 2021;
HOARAU; BADIEYAN; MARSH, 2017; BILAL et al., 2018; ARAGON, 2013;
BRENA; BATISTA-VIERA, 2006; SOUZA et al., 2016). As técnicas mais
utilizadas para imobilização são, geralmente, adsorção física, ligação iônica,
ligação covalente e encapsulação ou aprisionamento (ALAGOZ et al., 2022;
WONG et al., 2019).
O método de encapsulamento é conhecido por aumentar a estabilidade
mecânica da enzima e seu tempo de vida operacional. É considerada a técnica
mais simples e econômica por não envolver modificações químicas tanto na
enzima quanto no suporte. No entanto, deve garantir que a enzima permaneça
39
retida na rede polimérica e que a livre difusão do substrato e dos produtos ocorra
sem barreiras (LAROSA et al., 2018; ADHIKARI; PRAMANIK, 2019; WONG et
al., 2019).
No método de adsorção, as enzimas são imobilizadas reversivelmente
nos suportes por interações hidrofóbicas, forças de Van der Waals e/ou ligações
de hidrogênio. Apesar de ser considerado um método simples e relativamente
barato, parâmetros como pH e temperatura podem facilmente enfraquecer as
ligações e ocasionar a dessorção da enzima do suporte. Diferente do método de
adsorção, no método de ligação covalente, a enzima é imobilizada ao suporte
por meio de grupos funcionais presentes em sua superfície, levando a maior
rigidez da estrutura enzimática e estabilidade a diferentes condições de reação
(temperatura, pH, presença de solventes). As ligações ocorrem entre os
aminoácidos presentes na cadeia lateral da enzima, como histidina, ácido
aspártico, arginina, entre outros, e os grupos funcionais do suporte. Entretanto,
estas ligações podem bloquear o sítio catalítico e ocasionar a perda da atividade
enzimática (SOUZA et al., 2016; ADHIKARI; PRAMANIK, 2019)
Para imobilização de enzimas por ligações iônicas, os suportes utilizados,
geralmente, são resinas cromatográficas que, apesar dos custos serem
relativamente altos, permitem regeneração após repetidos ciclos de utilização,
podendo ser recuperada, regenerada e utilizada novamente como suporte.
Esses três métodos (adsorção, ligação covalente e ligação iônica) imobilizam a
enzima externamente, o que possibilita o fácil acesso ao substrato (ADHIKARI;
PRAMANIK, 2019; BASSO; SERBAN, 2019; PAL; KHANUM, 2011).
A imobilização de xilanases tem sido descrita na literatura com grande
potencial de aplicação. A xilanase de Aspergillus tamarii Kita, quando imobilizada
em suporte glioxil-agarose, teve sua termoestabilidade melhorada até 80ºC,
produzindo com sucesso xilooligossacarídeos em altas temperaturas (HEINEN
et al., 2018). Xilanase de Penicillium janczewskii foi imobilizada e estabilizada
em glioxil-agarose, mantendo 70% da sua atividade inicial após 10 ciclos de
utilização do derivado, indicando grande estabilização da enzima (TERRASAN
et al., 2017).
40
O emprego de xilanases produzidas por fungos do gênero Aspergillus em
FES e imobilizadas, podem ser utilizadas em biorreatores, facilitando a hidrólise
de xilanas, para obtenção de XOS que, por sua vez, podem ser convertidos em
xilitol através de fermentação em processos biotecnológicos com o emprego de
microrganismos como leveduras do gênero Candida e alguns fungos
filamentosos, como Fusarium oxysporum (WINKELHAUSEN; KUZMANOVA,
1998; PANAGIOTOU; CHRISTAKOPOULOS, 2004).
1.6. Metabolismo de xilose
Os microrganismos que catabolizam xilose utilizam três vias distintas.
Leveduras e alguns fungos filamentosos empregam uma via oxido-redutora que
consiste em duas reações para utilização da xilose, como pode ser observado
na Figura 7.
41
Figura 7. Metabolismo de xilose. XR: xilose redutase; XDH: xilitol desidrogenase;
XI: xilose isomerase; XK: xiluloquinase; PK: fosfocetolase; PTA:
fosfotransacetilase; ACK: acetato quinase; ACS: acetil-CoA sintetase; XDH:
xilose desidrogenase; XL: xilonolactonase; XAD: xilonato desidratase; KDXA: 2-
oxo-3-desoxixilonato aldolase; KDXD, 2-oxo-3-desoxixilonato desidratase;
αKGSADH, α-oxoglutárico semialdeído desidrogenase
Fonte: Jagtap e Rao (2018), adaptado.
Através de uma reação de oxidação, a xilose é reduzida a D-xilitol pela
enzima xilose redutase (XR), usando NADH ou NADPH como cofator. Algumas
XRs utilizam apenas NADPH, enquanto que outras podem utilizar tanto NADPH
quando NADH, tipicamente com maior especificidade para o primeiro. Em
seguida, o D-xilitol é oxidado a D-xilulose pela xilitol desidrogenase (XDH)
estritamente dependente de NAD+. A D-xilulose é então fosforilada em D-
xilulose-5-fosfato pela xiluloquinase (XK). Leveduras metabolizam D-xilulose-5-
42
fosfato em vários açúcares fosforilados, como frutose-6-fosfato e gliceroldeído-
3-fosfato, que entra na via da glicólise (JAGTAP e RAO, 2018; JEFFRIES, 2006;
MOYSÉS et al., 2016; LEE, 1998; KOTTER et al., 1990; JIN et al., 2002).
As bactérias geralmente empregam a via isomerase para conversão de
xilose em D-xilulose, utilizando a xilose isomerase (XI). A D-xilulose é então
fosforilada pela XK, produzindo D-xilulose-5-fosfato, que então entra no
metabolismo central através da via de pentose fosfato (JAGTAP e RAO, 2018).
As Archaeas, juntamente com algumas bactérias, como Caulobacter
crescentus, possuem vias metabólicas oxidativas da xilose, chamadas de vias
de Weimberg e Dahms. Na via de Weimberg, a xilose é oxidada a D-
xilanolactona pela D-xilose desidrogenase (XDH), seguida por uma lactonase
(XL) para hidrolisar a lactona em D-xilonato. A xilonato desidratase (XAD) age
sobre o D-xilonato para produzir 2-keto-3-desoxi-D-xilonato e uma segunda
desidratase forma o α-cetosemialdeído. Em seguida, o α-cetosemialdeído é
oxidado ao α-cetoglutarato, um intermediário do ciclo do ácido tricarboxílico
(TCA). A via de Dahms é semelhante à via de Weimberg, exceto que o 2-ceto-
3-desoxi-D-xilonato sofre a ação de uma aldolase (KDXA) para formar piruvato
e glicoaldeído (JAGTAP e RAO, 2018; NUNN et al., 2010; STEPHEN DAHMS,
1974; WEIMBERG, 1961).
1.7. Produção de xilitol
O xilitol é um açúcar álcool de cinco carbonos (pentose), muito utilizado
na indústria alimentícia, como adoçante natural e indústria farmacêutica, como
na formulação de creme dental pelo seu poder de prevenção contra cárie. Ele
pode ser produzido a partir da xilose, quimicamente e biologicamente (JAGTAP
e RAO, 2018; SAHA et al., 2007; RAFIQUL; SAKINAH, 2012; ALBUQUERQUE
et al., 2014; JORDAN et al., 2012; LANE et al., 2018).
No caso das vias biológicas, em particular, muitas leveduras empregam a
via XR-XDH para o metabolismo de xilose, como é o caso de Candida tropicalis.
No metabolismo da xilose de C. tropicalis, a xilose é captada por uma transferase
43
específica e reduzida a xilitol por XR com NADPH, seguido de conversão em
xilulose pela XDH com NAD+. A xilulose é então usada para o crescimento celular
e regeneração do NADPH pela via das pentoses fosfato, após a conversão em
xilulose-5-fosfato por xilulose quinase com ATP como cofator. Para obter alto
rendimento de xilitol, o fluxo de xilose para xilulose deve ser controlado
fornecendo oxigênio suficiente para regeneração de NADPH e manutenção das
células. Baixos níveis de oxigênio também favorecem a produção de xilitol por
conta da menor razão NAD+/NADPH, que leva a reação catalisada por XDH e a
acumulação de xilitol, alterando a constante de equilíbrio (KIM, RYU e SEO,
1999; KIM et al., 2002). A produção de xilitol nessas leveduras é conhecida por
resultar de um desequilíbrio redox associado com as diferentes especificidades
de cofator para essas duas enzimas. Esses desequilíbrios tendem a ser
ampliados durante o crescimento sob condições limitadas de oxigênio devido à
incapacidade das células regenerarem NAD (JEFFRIES, 2006; MOYSÉS et al.,
2016; JAGTAP; RAO, 2018).
O xilitol é atualmente produzido em larga escala através da hidrogenação
química da xilose, utilizando Ni/Al2O3 como catalisador. O custo do processo
químico é elevado devido à dificuldade de purificação e separação do xilitol,
remoção de subprodutos de hidrolisados de hemicelulose e um baixo rendimento
(40-50%) com base em xilano. Processos biotecnológicos para produção de
xilitol utilizando leveduras na fermentação da xilose têm se mostrados
promissores em relação ao alto rendimento observado (KIM et al., 2002). A
utilização de resíduos lignocelulósicos vem ao encontro para complementação
na produção de produtos de alto valor agregado, como o xilitol.
93
5. CONCLUSÕES
Os estudos desenvolvidos propiciaram extração de xilana de sabugo
de milho, bem como sua caracterização físico-química, onde foi possível
identificar, através dos cromatogramas de espectro de infravermelho, picos
característicos de arabinoxilanas. A baixa contaminação de proteínas e
fenóis nas xilanas extraídas indicaram que o método de extração foi eficiente.
Foi possível constatar que as xilanases de Aspergillus labrucus ITAL
22.223, produzidas em FES, foram capazes de hidrolisar as xilanas extraídas
do sabugo de milho, obtendo-se xilose, xilobiose e xilotriose.
Visando a melhoria das propriedades enzimáticas, a xilanase de
A. labruscus foi imobilizada em diferentes suportes, com melhor resultado
obtido com o uso de DEAE-Celulose. O derivado DEAE-Celulose foi tilizado em
reator de leito fixo, hidrolisando eficientemente a xilana ABST extraída de
sabugo de milho.
A xilose então obtida foi utilizada em fermentação com Candida tropicalis
ATCC 750, com sua conversão em xilitol, um produto de grande interesse para
diferentes setores industriais. O presente trabalho revelou o potencial
biotecnológico da utilização de sabugo de milho para produção de subprodutos
de alto valor agregado, como o xilitol.
94
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