RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 24/02/2025 Maria Letícia Duarte Lima Avaliação da atividade antiviral de peptídeos sintéticos contra o Zika vírus São José do Rio Preto 2023 Maria Letícia Duarte Lima Avaliação da atividade antiviral de peptídeos sintéticos contra o Zika vírus Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientadora: Profa. Dra. Paula Rahal Coorientadoras: Dra. Cintia Bittar Dra. Mariana Nogueira Batista São José do Rio Preto 2023 L732a Lima, Maria Letícia Duarte Avaliação da atividade antiviral de peptídeos sintéticos contra o Zika vírus / Maria Letícia Duarte Lima. -- São José do Rio Preto, 2023 99 f. : il., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientadora: Paula Rahal Coorientadora: Cintia Bittar Oliva 1. Microbiologia. 2. Virologia. 3. Vírus da Zika. 4. Agentes antivirais. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Maria Letícia Duarte Lima Avaliação da atividade antiviral de peptídeos sintéticos contra o Zika vírus Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Comissão Examinadora Profa. Dra. Paula Rahal UNESP – Câmpus de São José do Rio Preto Orientadora Prof. Dr. Bruno Moreira Carneiro Universidade Federal de Rondonópolis Profa. Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto UNESP – Câmpus de Botucatu Profa. Dra. Paola Jocelan Scarin Provazzi Trabulsi Instituto Municipal de Ensino Superior de Catanduva - IMES Catanduva Prof. Dr. Guilherme Rodrigues Fernandes Campos Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP São José do Rio Preto 24 de fevereiro de 2023 Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Regina Duarte Lima e Celso Raimundo Lopes Lima, por serem meus maiores incentivadores, meus exemplos e que, com todos os seus esforços e ensinamentos, me permitiram chegar até aqui. AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus por toda força e sabedoria durante esse percurso, por sempre estar ao meu lado, cuidando de cada detalhe, me fortalecendo em meios as adversidades; À minha orientadora Profa. Dra. Paula Rahal por abrir as portas para a minha trajetória científica, me acolhendo em seu laboratório em 2014 e, desde então, me ensinando e colaborando muito com meu desenvolvimento profissional e pessoal até aqui, ensinamentos que, com certeza, levarei para a minha vida; À minha coorientadora Dra. Cintia Bittar Oliva por estar sempre disposta a me ouvir, me ensinar e me ajudar, especialmente em meio as dificuldades em meio ao percurso; À minha coorientadora Dra. Mariana Nogueira Batista pela colaboração; À Profa. Dra. Marília de Freitas Calmon por todo suporte e ajuda no desenvolvimento deste trabalho e no dia a dia do laboratório; A todos os colegas e amigos do grupo do Laboratório de Estudos Genômicos: Ana Júlia, Camila, Dayla, Gabriela, Mariah, Nikolas, Pâmela, Tamara, Thalissa, Vivaldo e Yasmin, por compartilharem tantos momentos de bons, de troca de conhecimentos, risadas e colaborações no dia a dia; As minhas amigas Day, Gabi, Pâm e Tamarinha por serem tão presentes e pontos de apoio para mim durante esse percurso, por me darem forças, me ouvirem, me darem suporte. Por toda amizade, por todas as risadas e companheirismo. Estarão sempre em meu coração; As amigas Carina, Fran, Stephane, que, em algum momento, compartilharam dessa caminhada no laboratório, seja durante minha iniciação científica ou mestrado, sendo amizades que prevalecem até hoje e que são importantes demais para mim; A UNESP/IBILCE por ser minha segunda casa por quase 11 anos, local onde passei, aprendi, superei muitas coisas e que será sempre um lugar especial para mim. A todos os professores que passaram por mim nessa trajetória e que, com certeza, deixaram suas marcas em minha vida e sua colaboração em toda minha formação. E também a turma 57 de Ciências Biológicas, do ano de 2012, e a todos os colegas e amigos ibilceanos que fiz durante todo esse tempo; Aos professores Dr. Eduardo Maffud Cilli, do laboratório de Síntese, Estrutura e Aplicação de Biomoléculas (LASEBio), do Instituto de Química e o Prof. Dr. Paulo Ricardo da Silva Sanches, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, ambos da UNESP campus Araraquara, e equipe pelo desenho, síntese e fornecimento dos peptídeos, que permitiram com que esse trabalho acontecesse; A todos os colaboradores e parceiros deste trabalho; À comissão examinadora: Prof. Dr. Bruno Moreira Carneiro, Profa. Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto, Profa. Dra. Paola Jocelan Scarin Provazzi Trabulsi, Prof. Dr. Guilherme Rodrigues Fernandes Campos, membros titulares da banca; e aos suplentes: Prof. Dr. Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez, Profa. Dra. Lívia Sacchetto, Prof. Dr. Paulo Inácio da Costa; por aceitarem nosso convite e contribuírem com este trabalho; Aos meus pais, Maria Regina Duarte Lima e Celso Raimundo Lopes Lima, por todo amor, esforço, cuidado e apoio durante o doutorado e em todos os momentos da minha vida. Foram eles que me fizeram chegar até aqui e eu não teria palavras para descrever o quanto sou grata a eles. Ao meu irmão Lucas também por ser meu parceiro de vida, compartilhar bons momentos e boas risadas. Eu amo vocês! Aos meus avós Constantina, Antônio, Olávia, Orlando por serem meu colo e refúgio, por me proporcionarem um amor que só avós podem proporcionar e, por me incentivarem e me mostrarem, com suas vidas, como permanecer firme independente do que aconteça; O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. “Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”. Madre Teresa de Calcutá RESUMO O Zika vírus (ZIKV) é um arbovírus pertencente à família Flaviviridae, genêro Flavivirus. Teve seu primeiro caso de transmissão autóctone relatado no Brasil em 2015 e, nesse mesmo período, espalhou-se para outros países e casou um grande surto nas Américas. A infecção por ZIKV é, em sua maioria, assintomática ou possui sintomas leves, porém esse vírus é capaz de causar complicações que envolvem alterações neurológicas, causando um impacto significativo na saúde pública. Uma delas é a Síndrome Congênita do Zika em bebês de mulheres infectadas durante à gestação. Além disso, esse vírus pode causar a Síndrome de Guillain-Barré em adultos. Atualmente, não há vacinas ou medicamentos específicos para o ZIKV, fazendo-se necessário a busca pelos mesmos. Na procura por novas terapêuticas, peptídeos tem se mostrado moléculas com grande potencial para essa finalidade, inclusive na busca por antivirais, já que tem sido observado que fazem inibição seletiva e apresentado relativas tolerabilidade e segurança. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial antiviral dos peptídeos sintéticos AG-peptídeo (GA-KKALKKLKKALKKAL-CONH2) e (pBthTX-I)2K [(KKYRYHLKPFCKK)2] em células Vero infectadas pelo ZIKV. Para isso, primeiramente foi avaliada a citotoxicidade dos peptídeos nessas células por meio do ensaio de MTT, tendo sido determinada a máxima concentração não-tóxica de 25µM para ambos os peptídeos, e foi esta a concentração utilizada para os ensaios antivirais. Foi então realizado um ensaio de triagem a fim de avaliar se os peptídeos possuíam efeito antiviral contra o ZIKV. O AG-peptídeo demonstrou inibição de 88,57% dos níveis de RNA viral e para o (pBthTX-I)2K foi de 67,28%. Confirmada a atividade antiviral, foram realizados ensaios para compreender em que etapas do ciclo replicativo os peptídeos estão agindo. Ambos os peptídeos mostraram proteger as células Vero contra a infecção por ZIKV. O AG-peptídeo apresentou efeito virucida e também atuou inibindo a entrada de ZIKV nas células, especificamente as etapas de adsorção e internalização. Finalmente, tanto o AG-peptídeo quanto o (pBthTX-I)2K foram capazes de inibir o ZIKV em etapas pós-entrada nas células Vero. Em conclusão, ambos os peptídeos se mostraram potenciais antivirais contra o ZIKV in vitro, sendo que o AG-peptídeo teve ação em todas as etapas do ciclo replicativo viral analisadas no presente trabalho, enquanto o (pBthTX-I)2K foi capaz de proteger as células Vero da infecção por ZIKV e atuar nas etapas após a entrada viral nas células. Apesar de mais ensaios são necessários para determinar o mecanismo de ação desses peptídeos, o presente trabalho demonstrou moléculas com grande potencial para o desenvolvimento de antivirais contra o ZIKV. Palavras-chave: Zika vírus. ZIKV. Antiviral. Peptídeo. ABSTRACT Zika virus (ZIKV) is an arbovirus with a positive-sense single-stranded RNA genome which belongs to the Flaviviridae family, genus Flavivirus. It had its first case of autochthonous transmission reported in Brazil in 2015, and in the same period, it spread to other countries and caused a large outbreak in the Americas. ZIKV infection is majority asymptomatic or has mild symptoms, but this virus is capable of causing complications involving neurological alterations, causing a significant impact on public health. Congenital Zika Syndrome is one of them and can occur in babies of women infected during pregnancy. Furthermore, this virus can cause Guillain-Barré Syndrome in adults. Currently, there are no vaccines or specific drugs for ZIKV, making it necessary to search for them. In the seeking for new therapies, peptides have shown to be molecules with great potential for this purpose, including the search for antivirals, since it has been observed that they perform selective inhibition and present relative tolerability and safety. In this context, this work aimed to evaluate the antiviral potential of the synthetic peptides GA-peptide (GA-KKALKKLKKALKKAL-CONH2) and (pBthTX-I)2K [(KKYRYHLKPFCKK)2] in Vero cells infected with ZIKV. For this, the cytotoxicity of the peptides in these cells was first evaluated using the MTT assay, and the maximum non-toxic concentration was 25µM for both peptides, which was the concentration used for antiviral assays. Then, a screening assay was performed to assess whether the peptides had an antiviral effect against ZIKV. GA-peptide demonstrated inhibition of 88.57% of viral RNA levels, and for (pBthTX-I)2K it was 67.28%. Once confirmed the antiviral activity some experiments were carried out to understand which stages of the replicative cycle the peptides are acting. Both peptides were capable to protect Vero cells against ZIKV infection. GA-peptide exhibited a virucidal effect and inhibited the entry of ZIKV into cells, specifically in attachment and internalization steps. Finally, both GA-peptide and (pBthTX-I)2K were able to inhibit ZIKV in post-entry steps in Vero cells. Concluding, both peptides exhibited antiviral potential against ZIKV in vitro. The GA-peptide had action in all stages of the viral replicative cycle analyzed in the present work, while (pBthTX-I)2K was able to protect Vero cells from ZIKV infection and act in the steps after viral entry into cells. Even though more assays are needed to determine the mechanism of action of these peptides, this work brought molecules with great potential to the development of antivirals against ZIKV. Keywords: Zika virus. ZIKV. Antiviral. Peptide. LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I – Considerações gerais Figura 1 – Tipos de ciclo de arbovírus em que pode ocorrer transbordamento para humanos...23 Figura 2 – Distribuição de alguns arbovírus emergentes ao redor do mundo...........................24 Figura 3 – Representação da partícula madura de Zika vírus....................................................25 Figura 4 – Proteínas de ZIKV e organização do genoma..........................................................26 Figura 5 – Ciclo replicativo de Zika vírus.................................................................................28 Figura 6 – Más-formações congênitas que podem ocorrer em bebês com a Síndrome Congênita do Zika...........................................................................................................................................32 Figura 7 – Moléculas já descritas na literatura por inibir o ZIKV e as etapas do ciclo replicativo nas quais elas atuam...................................................................................................................34 CAPÍTULO II – Artigo científico I Figura 1 – Citotoxicidade do AG-peptídeo, potencial inibitório contra o ZIKV e análise de dose-dependência......................................................................................................................58 Figura 2 – Ensaio virucida e de pré-tratamento do GA-peptídeo contra ZIKV........................59 Figura 3 – Análise da ação do AG-peptídeo sobre as etapas de entrada, adsorção e internalização do GA-peptídeo..................................................................................................60 Figura 4 – Avaliação do efeito do AG-peptídeo nas etapas pós-entrada de ZIKV em células Vero...........................................................................................................................................61 CAPÍTULO II – Artigo científico II Figura 1 – Avaliação do potencial antiviral do peptídeo (pBthTX-I)2K contra os vírus CHIKV e ZIKV.......................................................................................................................................79 Figura 2 – Análise do efeito protetivo e virucida do peptídeo (pBthTX-I)2K contra o CHIKV e ZIKV.........................................................................................................................................80 Figure 3 – Avaliação do efeito do (pBthTX-I)2K nos estágios iniciais da replicação de CHIKV e ZIKV.......................................................................................................................................81 Figura 4 – Análise da ação do (pBthTX-I)2K nas etapas pós-entrada de CHIKV e ZIKV nas células........................................................................................................................................83 CAPÍTULO II – Artigo científico II - Material suplementar Figura S1 – Citotoxidade do peptídeo (pBthTX-I)2K nas linhagens celulares BHK-21 e Vero...........................................................................................................................................92 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II – Artigo científico I Tabela 1 - Sequência de aminoácidos e massa massa molecular do AG-peptídeo....................54 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS (pBthTX-I)2K - peptídeo (KKYRYHLKPF)2K +ssRNA - positive-sense single-strand RNA 7DMA - o 7-deaza-2'- C -metil-D-adenosina AG-Hecate - peptídeo Hecate conjugado ao ácido gálico AG-peptídeo - peptídeo (GA-KKALKKLKKALKKAL-CONH2) AmphB - amphotericin B AMPs - antimicrobial peptides BHK-21 - Baby hamster kidney fibroblast cells BthTX-I - Bothropstoxin-I C - proteína do capsídeo CC50 - concentração citotóxica em 50% das células cDNA - DNA complementar CHIKV - vírus Chikungunya CMC - carboxymethylcellulose CMV - human cytomegalovirus CPPs - cell-penetrating peptides Ct - cycle threshold CZS - Congenital Zika Syndrome DENV - vírus da dengue DMEM - Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO - dimetilsulfóxido E - proteína do envelope EC50 - concentração efetiva em 50% de vírus EEEV - vírus da encefalite equina oriental EGCG - epigalocatequina-galato FBS - fetal bovine sérum GAGs - glicosaminoglicanos GA-peptide - (GA-KKALKKLKKALKKAL-CONH2) peptide GB - síndrome de Guillain-Barré H.p.i. - hours post-infection HCV - vírus da hepatite C HIV - vírus da imunodeficiência humana HSV-1 - vírus herpes simplex tipo I IC – intracelular JEV – vírus da encefalite japonese L15 - meio Leibovitz M - proteína de membrana do vírus MAYV - vírus Mayaro MNTC - maximum non-toxic concentration MOI - multiplicity of infection MTase - domínio da metiltransferase MTT - brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio NLuc - NanoLuciferase OMS - Organização Mundial da Saúde ORF - open reading frame OROV - vírus Oropouche P/S - penicilina e estreptomicina PAHO - Organização Pan-Americana da Saúde PBS - phosphate buffered saline PFU - plaque forming units PHB1 - type 1 prohibition prM - proteína pré-membrana qRT-PCR- real-time quantitative reverse transcription PCR RE - retículo endoplasmático ROCV - vírus rocio RpRd - RNA polimerase dependente de RNA RT - room temperature RVFV - Rift Valley Fever Virus SARS-CoV-2 - coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 SCZ - Síndrome Congênita do Zika SD - standard deviation SI - selectivity index SLEV - vírus da encefalite de Saint Louis SN - sobrenadante SPPS - solid-phase synthesis TIM-1 - T-cell immunoglobulin and mucin domain protein 1 VC - vehicle control VEEV - vírus da encefalite equina venezuelana WNV - vírus da febre do Oeste do Nilo YFV - vírus da febre amarela ZIKV - Zika vírus ZIKVBR - cepa brasileira de Zika vírus SUMÁRIO CAPÍTULO I – ....................................................................................................................... 21 Considerações gerais .............................................................................................................. 21 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 22 1.1. Arbovírus .................................................................................................................. 22 1.2. Arbovírus no Brasil ................................................................................................. 24 1.3. O Zika vírus .............................................................................................................. 25 1.4. Histórico e epidemiologia ........................................................................................ 29 1.5. Transmissão .............................................................................................................. 30 1.6. Sintomas e complicações ......................................................................................... 30 1.7. Tratamento e a busca por antivirais ...................................................................... 33 1.8. Peptídeos para fins terapêuticos ............................................................................. 35 2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 36 2.1. Objetivo geral ........................................................................................................... 36 2.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 36 3. REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 37 CAPÍTULO II – ...................................................................................................................... 49 Artigos científicos ................................................................................................................... 49 Manuscrito I ............................................................................................................................ 49 Manuscrito I ........................................................................................................................ 50 ABSTRACT ........................................................................................................................ 51 INTRODUCTION .............................................................................................................. 52 MATERIALS AND METHODS ....................................................................................... 53 Cell culture .......................................................................................................................... 53 Viral stock preparation ...................................................................................................... 53 Peptide synthesis ................................................................................................................. 53 Cell viability assay .............................................................................................................. 54 RNA extraction, cDNA synthesis, and quantitative reverse transcription PCR (qRT- PCR) ..................................................................................................................................... 54 Evaluation of the inhibitory potential of the GA-peptide against the ZIKV ................ 55 Dose-dependence assay ...................................................................................................... 55 Virucidal assay .................................................................................................................... 55 Pretreatment assay ............................................................................................................. 56 Entry assay .......................................................................................................................... 56 Attachment assay ................................................................................................................ 56 Internalization assay .......................................................................................................... 56 Postentry assay .................................................................................................................... 57 Statistical analysis ............................................................................................................... 57 RESULTS ............................................................................................................................ 57 The synthetic GA-peptide has antiviral activity against ZIKV ...................................... 57 GA-peptide showed virucidal activity and protects the cells against ZIKV infection . 58 The GA-peptide inhibits the initial steps of the ZIKV replicative cycle........................ 59 The GA-peptide also interferes with the postentry steps of ZIKV ................................ 61 DISCUSSION ...................................................................................................................... 62 REFERENCES ................................................................................................................... 65 CAPÍTULO II – ...................................................................................................................... 68 Artigos científicos ................................................................................................................... 68 Manuscrito II* ........................................................................................................................ 68 Manuscrito II ....................................................................................................................... 69 ABSTRACT ........................................................................................................................ 70 INTRODUCTION .............................................................................................................. 71 MATERIAL AND METHODS ......................................................................................... 72 Peptide ................................................................................................................................. 72 Cells ...................................................................................................................................... 73 Viruses ................................................................................................................................. 73 Viral stock preparation ...................................................................................................... 73 Cytotoxicity analysis ........................................................................................................... 74 Analysis of activity of CHIKV-NLuc encoded reporter.................................................. 74 ZIKV RNA yield inhibition assay using reverse transcription quantitative RT-PCR (qRT-PCR) .......................................................................................................................... 75 Primary antiviral screening of (p-BthTX-I)2K against CHIKV and ZIKV .................. 75 Analysis of the protective action of (p-BthTX-I)2K against CHIKV and ZIKV infection .............................................................................................................................................. 76 Investigation of the virucidal effect of (p-BthTX-I)2K .................................................... 76 Evaluation of the antiviral activity of (p-BthTX-I)2K on the CHIKV and ZIKV entry into the cells ......................................................................................................................... 77 Analysis of an impact of (p-BthTX-I)2K on the CHIKV attachment to the cells ......... 77 Evaluation of the antiviral action of (p-BthTX-I)2K on the CHIKV internalization in cells ....................................................................................................................................... 77 Analysis of the antiviral activity of (p-BthTX-I)2K on the postentry steps of the CHIKV and ZIKV infection ............................................................................................................. 78 Statistical analysis ............................................................................................................... 78 RESULTS ............................................................................................................................ 78 p-Bth peptide has antiviral activity against CHIKV and ZIKVBR ................................ 78 Prophylactic effect of the (p-BthTX-I)2K against CHIKV and ZIKVBR infection ....... 79 Virucidal effect of the (p-BthTX-I)2K peptide on the CHIKV and ZIKV extracellular particles ............................................................................................................................... 80 (p-BthTX-I)2K peptide inhibits the early stages of the CHIKV infection, but not of the early stages of ZIKV infection ........................................................................................... 81 MR1903 peptide affects both the attachment and internalization of the CHIKV ....... 82 (p-BthTX-I)2K peptide inhibits postentry stages of the ZIKV, but not of the CHIKV infection ............................................................................................................................... 82 DISCUSSION ...................................................................................................................... 83 REFERENCES ................................................................................................................... 87 Supplementary Material ...................................................................................................... 92 CAPÍTULO III – .................................................................................................................... 94 Conclusão ................................................................................................................................ 94 1. CONCLUSÃO .............................................................................................................. 95 CAPÍTULO IV – ..................................................................................................................... 96 Artigos publicados e patente .................................................................................................. 96 1. ARTIGOS PUBLICADOS ......................................................................................... 97 2. PATENTE .................................................................................................................... 98 CAPÍTULO I – Considerações gerais 22 1. INTRODUÇÃO 1.1. Arbovírus Os arbovírus são vírus cuja a transmissão ocorre por vetores artrópodes hematófagos, como mosquitos e carrapatos, para hospedeiros vertebrados (WEAVER; REISEN, 2010). Estes vírus se mantêm em um ciclo de transmissão em que eles se replicam em vetores hematófagos, que adquiriram o vírus ao se alimentar do sangue de um hospedeiro vertebrado infectado, e são capazes de transmitir a um novo hospedeiro pela saliva, durante o repasto sanguíneo (WEAVER; BARRETT, 2004; MUELLER; CAO-LORMEAU, 2018). Inicialmente, esses vírus são mantidos em ciclo de transmissão silvestre enzoótico, tendo como reservatórios hospedeiros vertebrados como primatas não-humanos, aves e roedores (MUELLER; CAO-LORMEAU, 2018). Porém, pode ocorrer um transbordamento desse ciclo silvestre para os seres humanos, podendo causar doenças (WEAVER; BARRETT, 2004; WEAVER et al., 2018). Isso pode ocorrer por três mecanismos: o primeiro deles é através de transbordamento direto de um vetor enzoótico ou ponte que transmite o vírus de um hospedeiro silvestre para o homem. Já o segundo ocorre quando o arbovírus é amplificado em animais domésticos e depois ocorre o spillover para humanos. O terceiro ocorre quando há uma transição do ciclo enzoótico para um ciclo urbano, onde humanos infectados servem como hospedeiros desses vírus e mosquitos antropofílicos fazem a transmissão para outras pessoas (Figura 1) (WEAVER et al., 2018). 23 Figura 1 – Tipos de ciclo de arbovírus em que pode ocorrer transbordamento para humanos. Fonte: Adaptado de WEAVER et al., 2018. Os arbovírus possuem distribuição mundial, sendo encontrados principalmente em regiões tropicais (Figura 2). Parâmetros ecológicos restringem a distribuição geográfica de cada um desses vírus, sendo que tais parâmetros regem seu ciclo de transmissão (GUBLER, DUANE J., 2001). A vegetação, temperatura e precipitação são fatores que têm influência sobre a distribuição do vetor, bem como do hospedeiro reservatório, sendo este necessário para a manutenção viral (GUBLER, DUANE J., 2001). Esses vírus são um grupo com diversidade taxonômica, sendo que a maioria desses arbovírus pertencem às famílias Peribunyaviridae, Flaviviridade e Togaviridae, mas também há representantes em menor número em outras famílias, como Sedoreoviridae e Orthomyxoviridae (KARABATSOS, 1985; GUBLER, DUANE J., 2001). Há mais de 540 espécies suspeitas de serem arbovírus e dessas, para mais de 150 há registros de infecções em humanos (KARABATSOS, 1985; GUBLER, DUANE J., 2001; CLETON et al., 2012). 24 Figura 2 – Distribuição de alguns arbovírus emergentes ao redor do mundo. JEV: vírus da encefalite japonesa; DENV: vírus da dengue; YFV: vírus da febre amarela; ZIKV: Zika vírus; CHIKV: vírus chikungunya; RVFV: vírus da febre do Vale do Rift; MAYV: vírus Mayaro; OROV: vírus Oropouche. Fonte: (WEAVER et al., 2018). 1.2.Arbovírus no Brasil O Brasil é um país de grande extensão territorial, predominantemente tropical, cujo clima, biodiversidade de fauna e vegetação, além número de habitantes e distribuição populacional, sendo que a maior parte vive em ambientes urbanos, fazem com que este país tenha grande potencial para ocorrência de arboviroses (FIGUEIREDO, 2000; FIGUEIREDO, 2007). O fato de grande parte da população brasileira viver em ambientes urbanos favorece a ocorrência de vetores de arbovírus adaptados a essas regiões, como as espécies de mosquitos Culex e Aedes (FIGUEIREDO, 2007). Há diversas arboviroses emergentes ou reermegentes responsáveis por causar infecções em humanas que circulam no país, sendo as principais distribuídas entre as famílias: Togaviridae, Peribunyaviridae e Flaviviridae. O vírus Mayaro (MAYV), Chikungunya (CHIKV), encefalite equina oriental (EEEV) e Encefalite equina venezuelana (VEEV) são vírus do gênero Alphavirus e representantes da família Togaviridae. Na família Peribunyaviridae está o vírus Oropouche (OROV), do gênero Orthobunyavirus. Com relação à família 25 Flaviviridae, os representantes pertencem ao gênero Flavivirus e são os vírus da dengue (DENV), da febre do Oeste do Nilo (WNV), da febre Amarela (YFV), encefalite de Saint Louis (SLEV), vírus Rocio (ROCV) e, o mais recente, o Zika vírus (ZIKV) (FIGUEIREDO, 2007; 2015). O primeiro caso de transmissão autóctone de ZIKV foi relatado no Brasil em 2015 (ZANLUCA et al., 2015). 1.3. O Zika vírus O ZIKV (Figura 3) é um flavivírus que foi isolado pela primeira vez em 1947 em macacos rhesus sentinela na floresta Zika, na Uganda (DICK;KITCHEN; HADDOW, 1952). É um vírus envelopado, com genoma de RNA fita simples polaridade positiva com 10,8 kb, aproximadamente (CHAMBERS et al., 1990; KUNO; CHANG, 2007). O genoma possui um único sítio aberto de leitura (do inglês, open reading frame - ORF) com regiões não traduzíveis nas duas extremidades. Esta ORF codifica uma poliproteína que é clivada em três proteínas estruturais: C (capsídeo), prM (pré-membrana) e E (envelope); e sete não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (CHAMBERS et al., 1990; KNIPE; HOWLEY, 2013). Quanto à expressão proteica, o genoma se organiza da seguinte maneira: 5'-C-prM-E-NS1- NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3' (KNIPE; HOWLEY, 2013; WHITE, MARTYN K. et al., 2016) (Figura 4a e 4b). Figura 3 – Representação da partícula madura de Zika vírus. Fonte: Modificado de (SAIZ et al., 2017). Com relação às proteínas estruturais, a proteína do capsídeo (C) é uma proteína com grande basicidade e se liga ao genoma viral para formar o nucleocapsídeo, já a membrana 26 externa do virion trata-se de uma bicamada lipídica composta pelas proteínas de membrana do vírus (M) e do envelope (E). A proteína M expressa-se como uma glicoproteína precursora de M (prM), sendo sintetizada durante a maturação dos virions e a E é a principal proteína de superfície dos virions (KNIPE; HOWLEY, 2013; WHITE, MARTYN K. et al., 2016). Figura 4 – Proteínas de ZIKV e organização do genoma. (a) Representação esquemática do vírus Zika, com a organização de suas proteínas estruturais e seu genoma de RNA de fita simples polaridade positiva. (b) Organização das proteínas estruturais e não-estruturais no genoma de ZIKV. Fonte: Adaptado de (ABBINK;STEPHENSON; BAROUCH, 2018). As proteínas não-estruturais estão envolvidas no processo de replicação do genoma viral no citoplasma da célula hospedeira, bem como no empacotamento do genoma e também atua na modulação imune do hospedeiro (SIROHI; KUHN, 2017). A proteína NS1 faz parte do processo replicativo, além de possuir atividades imunomoduladoras (SAIZ et al., 2017). A proteína NS2A está envolvida no rearranjo da membrana do retículo endoplasmático (RE) 27 durante a replicação, parece ter relação com a evasão do sistema imunológico do hospedeiro, além de estar envolvida na montagem viral e síntese de RNA (FAJARDO- SÁNCHEZ;GALIANO; VILLALAÍN, 2017). A NS2B faz com que ocorra a ativação da NS3, levando a formação do complexo NS2B-NS3, exercendo atividade de protease, clivando a poliproteína viral nas proteínas que atuam na replicação. Além disso, a NS3 atua como helicase, sendo necessário para o que o intermediário de RNA de fita dupla, formada no processo de síntese do genoma, se desenrole. Além disso, ela também tem função de RNA triofosfatase e nucleosídeo. Essa proteína se envolve na formação de novas partículas, além da replicação (BYLER;OGUNGBE; SETZER, 2016; WHITE, MARTYN K. et al., 2016). As proteínas não-estruturais NS4A e NS4B fazem parte do complexo replicativo associado ao RE. A NS5 possui o domínio da metiltransferase (MTase), cuja a função é metilar a estrutura cap do RNA do vírus e também possui o domínio RNA polimerase dependente de RNA (RpRd), nas quais dão início e catalisam a replicação (BYLER;OGUNGBE; SETZER, 2016; WANG, LILI et al., 2019). O ZIKV possui tropismo para vários tipos de tecidos e células. Hepatócitos, fibroblastos, células renais, trofoblastos, células endoteliais da placenta, células de Houfbauer, células do sistema genital masculino e feminino, células neuronais, astrócitos, vários tipos de células epiteliais, células dendríticas, entre outras, são alguns tipos celulares permissivos à infecção por ZIKV (NGONO; SHRESTA, 2018; SHAILY, S.; UPADHYA, A., 2019). Para se replicar, o ZIKV se liga, por meio de sua glicoproteína E, à receptores específicos na membrana celular, tais como o AXL, DC-SIGN, TIM-1 e Tyro (SMIT et al., 2011; HAMEL, RODOLPHE et al., 2015; MUSSO; GUBLER, 2016). A partir disso, os vírions entram na célula por endocitose mediada por receptores, acessando o citoplasma celular por invaginações que formam vesículas revestidas por clatrina. Após isso, essas vesículas carregando os vírus são entregues a endossomos iniciais, que depois amadurecem para endossomos tardios (GOLLINS; PORTERFIELD, 1985; VAN DER SCHAAR et al., 2008; SMIT et al., 2011; KNIPE; HOWLEY, 2013). Com acidificação do endossomo, ocorrem mudanças conformacionais na proteína viral E, levando à fusão desta com a membrana endossomal, ao desnudamento da partícula e liberação do RNA do vírus no citoplasma da célula (SMIT et al., 2011; KNIPE; HOWLEY, 2013). No citoplasma, tem-se início à tradução das proteínas virais a partir do único ORF presente no RNA de fita simples polaridade positiva, que atua como RNA mensageiro, 28 ocorrendo a formação de uma poliproteína. Esta é clivada co- e pós-traducionalmente por proteases virais e celulares, gerando, então, as três proteínas estruturais (C, prM e E) e a sete não-estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5), levando à replicação do genoma viral (KNIPE; HOWLEY, 2013; WHITE, MARTYN K. et al., 2016). A fita negativa é sintetizada, direcionando para a síntese de novas fitas de RNA positivas e a replicação ocorre associada a uma rede membranosa induzida pelo vírus, provenientes do retículo endoplasmático. Algumas novas fitas de RNA positivas precisam ser empacotadas na progênie de vírions que brotam do RE, formando vírions envelopados imaturos, enquanto outras serão direcionadas ao início do ciclo, para a tradução de mais proteínas virais. Os vírions empacotados no RE seguem para a via secretora da célula, e, na rede trans-Golgi, ocorrerá a clivagem da proteína prM em M para a maturação dos vírions, com posterior liberação dos novos vírions da célula infectada, sendo estes liberados por exocitose (KNIPE; HOWLEY, 2013; ROBY et al., 2015; SAIZ et al., 2016; WHITE, MARTYN K. et al., 2016). O ciclo replicativo de Zika vírus está representado na Figura 5. Figura 5 – Ciclo replicativo de Zika vírus. Fonte: Adaptado de (SHANKAR;PATIL; SKARIYACHAN, 2017). 29 1.4. Histórico e epidemiologia Após o isolamento em macacos rhesus em 1947 (DICK;KITCHEN; HADDOW, 1952), poucos casos de infecção em humanos foram relatados até 2007, quando, naquele ano, ocorreu uma epidemia nas Ilha Yap, Estados Federados da Micronésia. No ocorrido, aproximadamente três quartos da população local apresentaram infecção por ZIKV, que casou uma doença amena com duração de vários dias, mas que não levou a mortes ou hospitalizações das pessoas infectadas (DUFFY et al., 2009). Em 2013-2014 ocorreu outro surto na Polinésia Francesa, espalhando-se para outras ilhas do Pacífico, tais como Nova Caledônia, Ilhas Cook, Vanatu, Ilhas de Salomão e Ilha de Páscoa (MUSSO;NILLES; CAO-LORMEAU, 2014; MUSSO, 2015). Em 2015 foi relatado o primeiro caso de transmissão autóctone de ZIKV no Brasil (ZANLUCA et al., 2015) e se espalhou para outros países da América do Sul e América do Norte e Central (HENNESSEY;FISCHER; STAPLES, 2016; SIKKA et al., 2016). Análises retroativas de amostras coletadas em 2013, no Rio de Janeiro, em pacientes febris e negativos para a dengue, demonstraram que três delas foram positivas para o ZIKV (PASSOS et al., 2017). Além disso, um programa de vigilância epidemiológica de mosquitos também no Rio de Janeiro, realizado de 2014 a 2016, realizou análises filogenéticas e filogeográficas com os pools positivos para ZIKV e sugeriram que este vírus pode ter sido introduzido entre maio a novembro de 2013 neste estado brasileiro (AYLLÓN et al., 2017). Outros estudos filogenéticos demostraram que a variante desse vírus que circula no Brasil pertence à linhagem asiática e assemelha-se em 99% com a sequência nucleotídica de uma amostra isolada de um paciente da Polinésia Francesa (CAMPOS;BANDEIRA; SARDI, 2015). Segundo a Organização Pan-Americana da Saúde (PAHO)/Organização Mundial da Saúde (OMS), entre as semanas epidemiológicas 1 a 50 de 2022, foram registrados mais de 36 mil casos de ZIKV na região das Américas, sendo que quase 91% foram registrados somente no Brasil (ORGANIZATION, P. A. H., 2023b). Ainda segundo a OMS, até o momento foram relatadas evidências de transmissão vetorial em 89 países e territórios distribuídos pelas Américas, África, Sudeste Asiático e Pacífico Ocidental (ORGANIZATION, 2019; ORGANIZATION, W. H., 2023). Além disso, o ZIKV continua na lista de doenças prioritárias para pesquisa e desenvolvimento em contextos de emergência da OMS (ORGANIZATION, 2018). 30 1.5. Transmissão A transmissão de ZIKV ocorre principalmente por vetores, sendo estas mosquitos fêmeas de espécies do gênero Aedes, principalmente as espécies Aedes aegypti e Aedes albopictus (GRARD et al., 2014; VASCONCELOS; CALISHER, 2016). Esse vírus também pode ser transmitido por via vertical (materno-fetal) (BESNARD et al., 2014) e via transfusão sanguínea e de hemocomponentes (MUSSO et al., 2014). A transmissão sexual de ZIKV também pode ocorrer e tem sido relatada por diversas vezes na literatura. Os relatos mostram casais que geralmente são de países onde não há a circulação do vetor, porém um deles viajou para um país onde há a transmissão autóctone, e o outro não havia viajado, mas ambos apresentaram sintomas e tiveram a infecção por ZIKV confirmada (MUSSO et al., 2015; ARSUAGA et al., 2016; D'ORTENZIO et al., 2016; DECKARD et al., 2016; TURMEL et al., 2016). A transmissão sexual aumenta a problemática do ZIKV, pois pode expandir a transmissão deste vírus a países que não possuem o vetor (STASSEN et al., 2018). Além disso, estudos mostraram a ocorrência de alta persistência deste vírus no sêmen, sendo que o RNA viral foi encontrado no sêmen de um homem infectado por ZIKV por até 62 dias após o desaparecimento dos sintomas, enquanto que outro em até 370 dias, porém que a carga viral foi reduzida após 3 meses neste caso (NICASTRI et al., 2016; BARZON et al., 2018). Isso mostra que o trato genital masculino pode ser uma fonte de tal vírus por um longo período de tempo, o que aumenta a preocupação com relação à transmissão sexual (STASSEN et al., 2018). 1.6. Sintomas e complicações A infecção por esse vírus geralmente é assintomática, e quando há sintomas, em uma pequena parcela de infectados, eles são inespecíficos, como febre e erupções cutâneas (YE et al., 2016). Além disso, a infecção pode causar cefaleia, conjuntivite não purulenta, mialgia, artralgia e astenia. Esse conjunto de sintomas é semelhante ao de outras arboviroses, como as de doenças causadas pelos DENV e CHIKV, podendo dificultar o diagnóstico (ARAUJO;FERREIRA; NASCIMENTO, 2016). A infecção por ZIKV também tem sido relacionado a complicações neurológicas tanto em adultos quanto em fetos de gestantes infectadas por esse vírus durante a gravidez. Durante o surto que ocorreu na Polinésia Francesa em 2013/2014, observou-se um aumento de alterações neurológicas, citado anteriormente, como síndrome de Guillain-Barré (CONTROL, 31 2014). O mesmo foi observado no Brasil durante o surto deste vírus, onde houve claro aumento da ocorrência dessa síndrome (ARAUJO;FERREIRA; NASCIMENTO, 2016). Ademais, no período de 2014 a 2015 ocorreu um aumento em cerca de vinte vezes nos casos de microcefalia no Brasil, período este que coincide com o surto de ZIKV no país. Este fato levou profissionais da saúde a acreditarem na possível correlação da infecção das mulheres grávidas com ZIKV ao desenvolvimento da microcefalia em seus bebês (FAUCI; MORENS, 2016). Alguns estudos obtiveram resultados que sustentam tal hipótese, como o de Calvet e colaboradores (2016) que fizeram o teste para ZIKV em duas gestantes cujo os bebês foram diagnosticados com microcefalia e, em ambas, o RNA deste vírus foi detectado (CALVET et al., 2016). Outro estudo verificou a presença de ZIKV no cérebro de um feto abortado que havia sido diagnosticado com microcefalia (MLAKAR et al., 2016). Além da microcefalia, foram observados outros defeitos congênitos e esse conjunto da más-formações foi chamado de Síndrome Congênita do Zika (SCZ). Tal síndrome é descrita por cinco características: 1) grave microcefalia, na qual ocorreu parcial colapso do crânio; 2) redução do tecido cerebral com padrão específico de dano, o que inclui calcificações subcorticais; 3) cicatrizes maculares e manchas na retina pigmentar focal; 4) contraturas congênitas, tais como artrogripose (limitação dos movimentos de articulação) e pés tortos; 5) restrição do movimento do corpo logo após o nascimento, devido a hipertonia. Além disso, outras anormalidades foram relacionadas à SCZ, como tremores, convulsões, glaucoma, catarata, entre outras. Esta síndrome ocorre somente em fetos e bebês que foram infectados pelo Zika antes do nascimento (MOORE et al., 2017; PREVENTION, 2018) (Figura 6). 32 Figura 6 – Más-formações congênitas que podem ocorrer em bebês com a Síndrome Congênita do Zika. Fonte: Adaptado de (PREVENTION, 2017). Ademais, outras questões que merecem atenção com relação à infecção por ZIKV referem-se à transmissão sexual e ao fato de que o sistema genital masculino pode ser sítio de replicação e persistência deste vírus, podendo interferir na fertilidade masculina (STASSEN et al., 2018; KURSCHEIDT et al., 2019). Para investigar como o ZIKV pode atuar nos órgãos do sistema genital masculino e os potenciais danos que ele pode causar, modelos animais têm sido utilizados. Um estudo utilizando camundongos machos verificou que os animais apresentaram inflamação nos testículos e epidídimos, podendo levar a infertilidade (MA et al., 2016). Outro trabalho utilizou primatas não-humanas para avaliar a infecção em testículos, epidídimos, próstata e vesícula seminal, e observaram que o RNA de ZIKV persistiu por até 60 dias (testículo), variando de acordo com o órgão analisado. Já o vírus infeccioso foi isolado de amostras de todos esses órgãos, tendo uma menor taxa de cultivo de ZIKV isolados de próstatas. Além disso, os macacos que estavam na maturidade sexual demonstraram inflamação no epidídimo grave e/ou na próstata (BALL et al., 2022). Estudos com esses utilizando modelos animais, em especial primatas não-humanos, podem ajudar a entender melhor o impacto do ZIKV sobre a fertilidade masculina e na transmissão sexual. Inclusive, foi relatado o nascimento de um bebê com 33 síndrome congênita do Zika como resultado de uma infecção via sexual da mãe durante a gestação (YARRINGTON et al., 2019). Além desses danos neurológicos e no sistema genital masculino, o ZIKV se mostrou capaz de infectar também os olhos, podendo causar alterações oftalmológicas em bebês com SCZ, tais como anormalidades no nervo nervoso óptico, atrofia macular, glaucoma, catarata, como citadas anteriormente, dentre outras (DE PAULA FREITAS et al., 2017). Em adultos infectados por ZIKV também houveram relatos de alterações oftalmológicas, tais como conjuntivite não purulenta e uveíte (FURTADO et al., 2016; SUN et al., 2016; SHAILY, SANGYA; UPADHYA, ARCHANA, 2019). Por isso, apesar de muitos casos de ZIKV serem assintomáticos ou apresentarem doenças consideradas leves, esses agravamentos fazem desse vírus uma importante questão de saúde pública. 1.7. Tratamento e a busca por antivirais Não há antivirais específicos para ZIKV. O tratamento feito é somente para o controle dos sintomas mais severos através do uso de analgésicos e antitérmicos. Por isso, diversos estudos têm sugerido possíveis antivirais contra esse vírus, porém a maioria se encontra na fase pré-clínica de avaliação (WANG, LILI et al., 2019; FONG; CHU, 2022b). Um exemplo é o 7- deaza-2'- C -metil-D-adenosina (7DMA), que demonstrou ser um potente inibidor da replicação deste vírus em cultura celular e retarda a progressão da doença in vivo (ZMURKO et al., 2016). Outro composto que apresentou atividade parecida ao 7DMA, tanto in vitro, quanto in vivo, é o NITD008, um análogo de adenosina, que também se mostrou um ótimo inibidor de ZIKV, além de prevenir a morte de camundongos infectados com este vírus (DENG et al., 2016; GARCIA;PADILLA; CASTANO, 2017). Compostos naturais também demonstraram efeito antiviral contra o ZIKV, como o epigalocatequina-galato (EGCG) que apresentou efeito na entrada de ZIKV in vitro (CARNEIRO et al., 2016). Batista e colaboradores (2019) relataram que a emodina e a berberina, isolados de ervas chinesas, demonstraram um grande efeito virucida in vitro contra o vírus Zika. O extrato de bagaço de cranberry, também demonstrou atividade anti-ZIKV e anti- DENV em linhagens celulares humanas (TAMKUTĖ et al., 2022). Outros estudos mostraram que o Sofosbuvir, droga já aprovada para o tratamento contra o vírus da hepatite C (HCV), mostrou efeito de inibição na replicação de ZIKV in vitro (SACRAMENTO et al., 2017) e, in vivo, aumentou o percentual de sobrevivência dos camundongos e reduziu os níveis deste vírus no sangue e em alguns órgãos (FERREIRA et al., 34 2017). A anidulafungina, um medicamento aprovado para tratar diversas formas de infecções pelo fungo Candida, demonstrou ter efeito virucida sobre o ZIKV (LU et al., 2021). Seu tratamento associado ao T-1105, um inibidor da polimerase viral em que já havia sido demonstrado possuir atividade anti-ZIKV, tiveram atividade sinérgica na inibição viral (CAI et al., 2017; LU et al., 2021). No desenvolvimento de antivirais, muitos pesquisadores buscam moléculas capazes de inibir proteínas virais ou que tenham como alvo fatores do hospedeiro. Com relação ao ciclo replicativo viral, pretende-se interferir em uma ou mais etapas desses ciclo, podendo impedir a ligação viral a membrana da célula hospedeira e/ou sua entrada na célula, interferir no seu processo de replicação, montagem ou liberação, atuando sobre a maturação dos novos vírions que estão sendo formados (DE CLERCQ; LI, 2016; WANG, LILI et al., 2019). A Figura 7 demonstra algumas moléculas descritas na literatura por ter efeito anti-ZIKV e a etapa do ciclo replicativo nas quais cada uma delas atua. Alguns exemplos presentes na representação são os peptídeos Z2 e o P5 que interferiram na ligação de ZIKV à célula hospedeira, e outros como 7DMA, NITD008 e o sofosbuvir que atuaram sobre a replicação viral (Figura 7) (WANG, LILI et al., 2019). Figura 7 – Moléculas já descritas na literatura por inibir o ZIKV e as etapas do ciclo replicativo nas quais elas atuam. Fonte: Adaptado (WANG, LILI et al., 2019). 35 1.8. Peptídeos para fins terapêuticos Peptídeos têm sido alvos promissores no desenvolvimento de novas terapêuticas. São moléculas que fazem sinalização seletiva, se ligando especificamente a receptores celulares, como àqueles acoplados à proteína G e canais iônicos, que levam a efeitos intracelulares. Além disso, são seguros e apresentam boa tolerância (FOSGERAU; HOFFMANN, 2015). Tais moléculas tem mostrado efeito no tratamento de diversas doenças, como Alzheimer, diabetes tipo II, câncer e doenças infecciosas (FUNKE; WILLBOLD, 2012; FOSGERAU; HOFFMANN, 2015). Mais de 80 drogas peptídicas chegaram ao mercado global e muitas outras estão em análise pré-clínica ou clínica (WANG, L. et al., 2022). Além disso, com relação à terapia antiviral, peptídeos tem causada revolução nas busca desta área, já que eles têm se mostrado serem eficientes antagonistas e agonistas para receptores de ligação de vários agentes terapêuticos (KARWAL et al., 2020). Peptídeos com atividade antiviral já foram descritos contra o vírus Influenza, o WNV, vírus da imunodeficiência humana (HIV), HCV, entre outros (PORTAL-NUNEZ et al., 2003; BAI et al., 2007; JONES et al., 2011; NARUMI et al., 2012). O peptídeo Hecate demonstrou efeito contra o vírus herpes simplex tipo I (HSV-1), atuando como inibidor da fusão celular que é induzida por sincícios de HSV-1, além da expressão de suas proteínas, em associação com alterações na permeabilidade na membrana da célula hospedeira (BAGHIAN et al., 1997a). Um estudo recente (2018) demonstrou a eficiência do peptídeo AG-Hecate, sendo este o Hecate modificado com ácido gálico acoplado na região N-terminal, contra o HCV, membro da família Flaviviridae (BATISTA, M. N. et al., 2018). Sanches e colaboradores (2015) verificaram que o peptídeo em baixas concentrações poderia atravessar as membranas celulares da célula hospedeira e atuar somente sobre os componentes intracelulares (SANCHES;CARNEIRO;BATISTA;BRAGA;LORENZÓN; et al., 2015). A partir da Botropstoxina-I (BthTX-I) do veneno da serpente Bothrops jararacussu foi obtido o peptídeo (p-BthTX-I)2 [(KKYRYHLKPFCKK)2], que demonstrou atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (SANTOS-FILHO et al., 2015). Santos-Filho e colaboradores fizeram modificações no (p-BthTX-I)2, gerando o análogo peptídico (p-BthTX-I)2K [KKYRYHLKPF)2K], que melhorou a atividade antibacteriana (SANTOS-FILHO et al., 2022). Além disso, o (p-BthTX-I)2K, demonstrou atividade antiviral contra o coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2), atuando sobre a protease PLpro desse vírus (FREIRE et al., 2021). 36 Peptídeos com atividade anti-ZIKV também foram descritos, como o peptídeo Yodha, um peptídeo de defesa de anfíbios, que demonstrou grande atividade virucida contra diversas cepas de Zika vírus (LEE et al., 2021). O peptídeo sintético Z2, extraído da proteína de envelope do ZIKV, inibiu a infecção por esse mesmo vírus in vitro, além de proteger fetos de camundongos C57BL/6 prenhas da transmissão vertical do vírus Zika (YU et al., 2017). Outro exemplo é um peptídeo catelidicina, do veneno da cobra marinha Hydrophis cyanocinctus, o Hc-CATH, que foi capaz de inibir a infecção por ZIKV in vitro, e também demonstrou proteção contra a infecção por ZIKV em camundongos previamente tratados, além de apresentar efeito terapêutico em animais infectados. Esse peptídeo causou diminuição na expressão de AXL, um dos tipos de receptores celulares nas quais o ZIKV se liga para entrar na célula hospedeira e também foi capaz de perturbar a membrana viral, atuando diretamente sobre a partícula viral (WANG, JING et al., 2022). Dada toda problemática do ZIKV, especialmente em relação à da Síndrome Congênita do ZIKV, bem como o risco de complicações neurológicas, oculares, entre outras, em adultos infectados, faz-se necessário a busca de inibidores efetivos contra o ZIKV, visto que ainda não existem fármacos específicos aprovados para tratar a infecção por esse vírus. Neste contexto, baseando-se nos benefícios e potencial de peptídeos na busca de novos agentes terapêuticos, a análise de peptídeos sintéticos como potenciais inibidores é importante e pode colaborar com avanços na área terapêutica contra esse vírus, bem como para outros flavivírus. 37 3. REFERÊNCIAS ABBINK, P.; STEPHENSON, K. E.; BAROUCH, D. H. Zika virus vaccines. Nature Reviews Microbiology, v. 16, n. 10, p. 594-600, 2018/10/01 2018. ISSN 1740-1534. Disponível em: https://doi.org/10.1038/s41579-018-0039-7. ARAUJO, L. M.; FERREIRA, M. L.; NASCIMENTO, O. J. Guillain-Barre syndrome associated with the Zika virus outbreak in Brazil. Arq Neuropsiquiatr, v. 74, n. 3, p. 253-255, Mar 2016. ISSN 1678-4227 (Electronic) 0004-282X (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27050856. ARSUAGA, M. et al. Probable sexual transmission of Zika virus from a vasectomised man. Lancet Infect Dis, v. 16, n. 10, p. 1107, Oct 2016. ISSN 1474-4457 (Electronic) 1473-3099 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27676342. AYLLÓN, T. et al. Early Evidence for Zika Virus Circulation among Aedes aegypti Mosquitoes, Rio de Janeiro, Brazil. Emerg Infect Dis, v. 23, n. 8, p. 1411-1412, 2017. ISSN 1080-6059 1080-6040. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28628464 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5547780/ . BAGHIAN, A. et al. An amphipathic alpha-helical synthetic peptide analogue of melittin inhibits herpes simplex virus-1 (HSV-1)-induced cell fusion and virus spread. Peptides, v. 18, n. 2, p. 177-183, 1997. ISSN 0196-9781 (Print) 0196-9781 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9149288. BAI, F. et al. Antiviral peptides targeting the west nile virus envelope protein. Journal of virology, v. 81, n. 4, p. 2047-2055, Feb 2007. ISSN 0022-538X (Print) 0022-538X (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17151121. BALL, E. E. et al. Zika virus persistence in the male macaque reproductive tract. PLoS Negl Trop Dis, v. 16, n. 7, p. e0010566, Jul 2022. ISSN 1935-2735 (Electronic) 1935-2727 (Print) 1935-2727 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35788751. BARZON, L. et al. Virus and Antibody Dynamics in Travelers With Acute Zika Virus Infection. Clin Infect Dis, v. 66, n. 8, p. 1173-1180, Apr 3 2018. ISSN 1537-6591 (Electronic) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27050856 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27676342 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5547780/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9149288 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17151121 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35788751 38 1058-4838 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29300893. BATISTA, M. N. et al. GA-Hecate antiviral properties on HCV whole cycle represent a new antiviral class and open the door for the development of broad spectrum antivirals. Sci Rep, v. 8, n. 1, p. 14329, Sep 25 2018. ISSN 2045-2322 (Electronic) 2045-2322 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30254334. BESNARD, M. et al. Evidence of perinatal transmission of Zika virus, French Polynesia, December 2013 and February 2014. Euro Surveill, v. 19, n. 13, Apr 3 2014. ISSN 1560-7917 (Electronic) 1025-496X (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24721538. BYLER, K. G.; OGUNGBE, I. V.; SETZER, W. N. In-silico screening for anti-Zika virus phytochemicals. J Mol Graph Model, v. 69, p. 78-91, Sep 2016. ISSN 1873-4243 (Electronic) 1093-3263 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27588363. CAI, L. et al. Viral polymerase inhibitors T-705 and T-1105 are potential inhibitors of Zika virus replication. Arch Virol, v. 162, n. 9, p. 2847-2853, 2017/09/01 2017. ISSN 1432-8798. Disponível em: https://doi.org/10.1007/s00705-017-3436-8. CALVET, G. et al. Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses with microcephaly in Brazil: a case study. Lancet Infect Dis, v. 16, n. 6, p. 653-660, Jun 2016. ISSN 1474-4457 (Electronic) 1473-3099 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26897108. CAMPOS, G. S.; BANDEIRA, A. C.; SARDI, S. I. Zika Virus Outbreak, Bahia, Brazil. Emerg Infect Dis, v. 21, n. 10, p. 1885-1886, Oct 2015. ISSN 1080-6059 (Electronic) 1080-6040 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26401719. CARNEIRO, B. M. et al. The green tea molecule EGCG inhibits Zika virus entry. Virology, v. 496, p. 215-218, 2016/09/01/ 2016. ISSN 0042-6822. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682216301544. CHAMBERS, T. J. et al. Flavivirus genome organization, expression, and replication. Annu Rev Microbiol, v. 44, p. 649-688, 1990. ISSN 0066-4227 (Print) 0066-4227 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2174669. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29300893 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30254334 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24721538 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27588363 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26897108 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26401719 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0042682216301544 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2174669 39 CLETON, N. et al. Come fly with me: Review of clinically important arboviruses for global travelers. Journal of Clinical Virology, v. 55, n. 3, p. 191-203, 2012/11/01/ 2012. ISSN 1386- 6532. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1386653212002570. CONTROL, E. C. F. D. P. A. Zika virus infection outbreak, French Polynesia - 14 February 2014. ECDC. Stockholm. 2014 D'ORTENZIO, E. et al. Evidence of Sexual Transmission of Zika Virus. N Engl J Med, v. 374, n. 22, p. 2195-2198, Jun 2 2016. ISSN 1533-4406 (Electronic) 0028-4793 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27074370. DE CLERCQ, E.; LI, G. Approved Antiviral Drugs over the Past 50 Years. Clinical microbiology reviews, v. 29, n. 3, p. 695-747, 2016. ISSN 1098-6618 0893-8512. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27281742 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4978613/. DE PAULA FREITAS, B. et al. Zika virus and the eye. Current Opinion in Ophthalmology, v. 28, n. 6, p. 595-599, 2017. ISSN 1040-8738. Disponível em: https://journals.lww.com/co- ophthalmology/Fulltext/2017/11000/Zika_virus_and_the_eye.9.aspx. DECKARD, D. T. et al. Male-to-Male Sexual Transmission of Zika Virus--Texas, January 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, v. 65, n. 14, p. 372-374, Apr 15 2016. ISSN 1545- 861X (Electronic) 0149-2195 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27078057. DENG, Y. Q. et al. Adenosine Analog NITD008 Is a Potent Inhibitor of Zika Virus. Open Forum Infect Dis, v. 3, n. 4, p. ofw175, Oct 2016. ISSN 2328-8957 (Print) 2328-8957 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27747251. DICK, G. W.; KITCHEN, S. F.; HADDOW, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg, v. 46, n. 5, p. 509-520, Sep 1952. ISSN 0035-9203 (Print) 0035-9203 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12995440. DUFFY, M. R. et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. N Engl J Med, v. 360, n. 24, p. 2536-2543, Jun 11 2009. ISSN 1533-4406 (Electronic) 0028-4793 (Linking). http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1386653212002570 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27074370 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4978613/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27078057 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27747251 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12995440 40 FAJARDO-SÁNCHEZ, E.; GALIANO, V.; VILLALAÍN, J. Spontaneous membrane insertion of a dengue virus NS2A peptide. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 627, p. 56-66, 2017/08/01/ 2017. ISSN 0003-9861. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003986117302229. FAUCI, A. S.; MORENS, D. M. Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat. N Engl J Med, v. 374, n. 7, p. 601-604, Feb 18 2016. ISSN 1533-4406 (Electronic) 0028-4793 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26761185. FERREIRA, A. C. et al. Sofosbuvir protects Zika virus-infected mice from mortality, preventing short- and long-term sequelae. Sci Rep, v. 7, n. 1, p. 9409, Aug 25 2017. ISSN 2045- 2322 (Electronic) 2045-2322 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28842610. FIGUEIREDO, L. T. Emergent arboviruses in Brazil. Rev Soc Bras Med Trop, v. 40, n. 2, p. 224-229, Mar-Apr 2007. ISSN 0037-8682 (Print) 0037-8682 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17568894. FIGUEIREDO, L. T. The recent arbovirus disease epidemic in Brazil. Rev Soc Bras Med Trop, v. 48, n. 3, p. 233-234, May-Jun 2015. ISSN 1678-9849 (Electronic) 0037-8682 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26107998. FIGUEIREDO, L. T. M. The Brazilian flaviviruses. Microbes and Infection, v. 2, n. 13, p. 1643-1649, 2000/11/01/ 2000. ISSN 1286-4579. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1286457900013204. FONG, Y. D.; CHU, J. J. H. Natural products as Zika antivirals. Med Res Rev, May 20 2022. ISSN 1098-1128 (Electronic) 0198-6325 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35593443. FOSGERAU, K.; HOFFMANN, T. Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discovery Today, v. 20, n. 1, p. 122-128, 2015/01/01/ 2015. ISSN 1359-6446. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359644614003997. FREIRE, M. et al. Non-Toxic Dimeric Peptides Derived from the Bothropstoxin-I Are Potent SARS-CoV-2 and Papain-like Protease Inhibitors. Molecules, v. 26, n. 16, Aug 12 2021. ISSN 1420-3049 (Electronic) http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003986117302229 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26761185 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28842610 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17568894 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26107998 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1286457900013204 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35593443 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359644614003997 41 1420-3049 (Linking). FUNKE, S. A.; WILLBOLD, D. Peptides for therapy and diagnosis of Alzheimer's disease. Curr Pharm Des, v. 18, n. 6, p. 755-767, 2012. ISSN 1873-4286 (Electronic) 1381-6128 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22236121. FURTADO, J. M. et al. Uveitis Associated with Zika Virus Infection. New England Journal of Medicine, v. 375, n. 4, p. 394-396, 2016. Disponível em: https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMc1603618. GARCIA, L. L.; PADILLA, L.; CASTANO, J. C. Inhibitors compounds of the flavivirus replication process. Virol J, v. 14, n. 1, p. 95, May 15 2017. ISSN 1743-422X (Electronic) 1743-422X (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28506240. GOLLINS, S. W.; PORTERFIELD, J. S. Flavivirus infection enhancement in macrophages: an electron microscopic study of viral cellular entry. J Gen Virol, v. 66 ( Pt 9), p. 1969-1982, Sep 1985. ISSN 0022-1317 (Print) 0022-1317 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4031825. GRARD, G. et al. Zika virus in Gabon (Central Africa)--2007: a new threat from Aedes albopictus? PLoS Negl Trop Dis, v. 8, n. 2, p. e2681, Feb 2014. ISSN 1935-2735 (Electronic) 1935-2727 (Print) 1935-2727 (Linking). GUBLER, D. J. Human Arbovirus Infections Worldwide. Annals of the New York Academy of Sciences, v. 951, n. 1, p. 13-24, 2001. ISSN 0077-8923. Disponível em: https://nyaspubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1749-6632.2001.tb02681.x. HAMEL, R. et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. Journal of virology, v. 89, n. 17, p. 8880-8896, 2015. ISSN 1098-5514 0022-538X. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26085147 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4524089/. HENNESSEY, M.; FISCHER, M.; STAPLES, J. E. Zika Virus Spreads to New Areas - Region of the Americas, May 2015-January 2016. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, v. 65, n. 3, p. 55-58, Jan 29 2016. ISSN 1545-861X (Electronic) 0149-2195 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26820163. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22236121 http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMc1603618 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28506240 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4031825 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4524089/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26820163 42 JONES, J. C. et al. Identification of the minimal active sequence of an anti-influenza virus peptide. Antimicrob Agents Chemother, v. 55, n. 4, p. 1810-1813, Apr 2011. ISSN 1098- 6596 (Electronic) 0066-4804 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21220525. KARABATSOS, N. International Catalogue of Arboviruses, 1985: Including Certain Other Viruses of Vertebrates. Subcommittee on Information Exchange of the American Committee on Arthropod …, 1985. KARWAL, P. et al. Therapeutic Applications of Peptides against Zika Virus: A Review. Curr Med Chem, v. 27, n. 23, p. 3906-3923, 2020. ISSN 1875-533X (Electronic) 0929-8673 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30636575. KNIPE, D. M.; HOWLEY, P. M. Fields Virology. 2013. 2582. KUNO, G.; CHANG, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol, v. 152, n. 4, p. 687-696, 2007. ISSN 0304-8608 (Print) 0304-8608 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17195954. KURSCHEIDT, F. A. et al. Persistence and clinical relevance of Zika virus in the male genital tract. Nature Reviews Urology, v. 16, n. 4, p. 211-230, 2019/04/01 2019. ISSN 1759-4820. Disponível em: https://doi.org/10.1038/s41585-019-0149-7. LEE, S. H. et al. The amphibian peptide Yodha is virucidal for Zika and dengue viruses. Sci Rep, v. 11, n. 1, p. 602, 2021/01/12 2021. ISSN 2045-2322. Disponível em: https://doi.org/10.1038/s41598-020-80596-4. LU, J.-W. et al. Synergistic in-vitro antiviral effects of combination treatment using anidulafungin and T-1105 against Zika virus infection. Antiviral Res, v. 195, p. 105188, 2021/11/01/ 2021. ISSN 0166-3542. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354221001789. MA, W. et al. Zika Virus Causes Testis Damage and Leads to Male Infertility in Mice. Cell, v. 167, n. 6, p. 1511-1524 e1510, Dec 1 2016. ISSN 1097-4172 (Electronic) 0092-8674 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27884405. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21220525 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30636575 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17195954 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0166354221001789 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27884405 43 MLAKAR, J. et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med, v. 374, n. 10, p. 951-958, Mar 10 2016. ISSN 1533-4406 (Electronic) 0028-4793 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26862926. MOORE, C. A. et al. Characterizing the Pattern of Anomalies in Congenital Zika Syndrome for Pediatric Clinicians. JAMA Pediatr, v. 171, n. 3, p. 288-295, Mar 1 2017. ISSN 2168-6211 (Electronic) 2168-6203 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27812690. MUELLER, C. G.; CAO-LORMEAU, V.-M. Chapter 8 - Insect-Borne Viruses and Host Skin Interface. In: BOULANGER N. (Ed.). Skin and Arthropod Vectors: Academic Press, 2018. p.275-292. ISBN 978-0-12-811436-0. MUSSO, D. Zika Virus Transmission from French Polynesia to Brazil. Emerg Infect Dis, v. 21, n. 10, p. 1887, Oct 2015. ISSN 1080-6059 (Electronic) 1080-6040 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26403318. MUSSO, D.; GUBLER, D. J. Zika Virus. Clinical microbiology reviews, v. 29, n. 3, p. 487- 524, 2016. ISSN 1098-6618 0893-8512. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27029595 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4861986/. MUSSO, D. et al. Potential for Zika virus transmission through blood transfusion demonstrated during an outbreak in French Polynesia, November 2013 to February 2014. Euro Surveill, v. 19, n. 14, Apr 10 2014. ISSN 1560-7917 (Electronic) 1025-496X (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24739982. MUSSO, D.; NILLES, E. J.; CAO-LORMEAU, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection, v. 20, n. 10, p. O595-O596, 2014/10/01/ 2014. ISSN 1198-743X. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X1465391X. MUSSO, D. et al. Potential sexual transmission of Zika virus. Emerg Infect Dis, v. 21, n. 2, p. 359-361, Feb 2015. ISSN 1080-6059 (Electronic) 1080-6040 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25625872. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26862926 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27812690 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26403318 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4861986/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24739982 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X1465391X http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25625872 44 NARUMI, T. et al. Conjugation of cell-penetrating peptides leads to identification of anti-HIV peptides from matrix proteins. Bioorg Med Chem, v. 20, n. 4, p. 1468-1474, Feb 15 2012. ISSN 1464-3391 (Electronic) 0968-0896 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22277590. NGONO, A. E.; SHRESTA, S. Immune Response to Dengue and Zika. Annu Rev Immunol, v. 36, n. 1, p. 279-308, 2018. Disponível em: https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-immunol-042617-053142. NICASTRI, E. et al. Persistent detection of Zika virus RNA in semen for six months after symptom onset in a traveller returning from Haiti to Italy, February 2016. Euro Surveill, v. 21, n. 32, Aug 11 2016. ISSN 1560-7917 (Electronic) 1025-496X (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27541989. ORGANIZATION, P. A. H. Epidemiological Update for Dengue, Chikungunya and Zika in 2022. Pan American Health Organization/World Health Organization01/23/2023. 2023 ORGANIZATION, W. H. Prioritizing diseases for research and development in emergency contexts 2018. ORGANIZATION, W. H. Countries and territories with current or previous Zika virus transmission. World Health Organization2 July 2019. 2019 ORGANIZATION, W. H. Zika virus disease 2023. PASSOS, S. R. L. et al. Detection of Zika Virus in April 2013 Patient Samples, Rio de Janeiro, Brazil. Emerg Infect Dis, v. 23, n. 12, p. 2120-2121, 2017. ISSN 1080-6059 1080-6040. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28953451 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5708232/. PORTAL-NUNEZ, S. et al. Peptide inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease. Antivir Chem Chemother, v. 14, n. 5, p. 225-233, Sep 2003. ISSN 0956-3202 (Print) 0956-3202 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14694985. PREVENTION, C. F. D. C. A. Vitas Signs - Zika virus. 2017. Disponível em: https://www.cdc.gov/vitalsigns/zika-babies/infographic.html. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22277590 http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev-immunol-042617-053142 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27541989 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5708232/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14694985 http://www.cdc.gov/vitalsigns/zika-babies/infographic.html 45 PREVENTION, C. F. D. C. A. Congenital Zika Syndrome and Other Birth Defects. 2018. Disponível em: https://www.cdc.gov/pregnancy/zika/testing-follow-up/zika-syndrome-birth- defects.html. ROBY, J. A. et al. Post-translational regulation and modifications of flavivirus structural proteins. J Gen Virol, v. 96, n. Pt 7, p. 1551-1569, Jul 2015. ISSN 1465-2099 (Electronic) 0022-1317 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25711963. SACRAMENTO, C. Q. et al. The clinically approved antiviral drug sofosbuvir inhibits Zika virus replication. Sci Rep, v. 7, p. 40920, Jan 18 2017. ISSN 2045-2322 (Electronic) 2045-2322 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28098253. SAIZ, J.-C. et al. Zika Virus: What Have We Learnt Since the Start of the Recent Epidemic? Frontiers in microbiology, v. 8, p. 1554-1554, 2017. ISSN 1664-302X. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28878742 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5572254/. SAIZ, J. C. et al. Zika Virus: the Latest Newcomer. Frontiers in microbiology, v. 7, p. 496, 2016. ISSN 1664-302X (Print) 1664-302X (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27148186. SANCHES, P. R. et al. A conjugate of the lytic peptide Hecate and gallic acid: structure, activity against cervical cancer, and toxicity. Amino Acids, v. 47, n. 7, p. 1433-1443, Jul 2015. ISSN 1438-2199 (Electronic) 0939-4451 (Linking). SANTOS-FILHO, N. A. et al. Synthesis and characterization of an antibacterial and non-toxic dimeric peptide derived from the C-terminal region of Bothropstoxin-I. Toxicon, v. 103, p. 160-168, Sep 2015. ISSN 1879-3150 (Electronic) 0041-0101 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26160494. SANTOS-FILHO, N. A. et al. Effect of C-terminal and N-terminal dimerization and alanine scanning on antibacterial activity of the analogs of the peptide p-BthTX-I. Peptide Science, v. 114, n. 2, p. e24243, 2022. ISSN 2475-8817. Disponível em: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pep2.24243. SHAILY, S.; UPADHYA, A. Zika virus: Molecular responses and tissue tropism in the mammalian host. Reviews in Medical Virology, v. 29, n. 4, p. e2050, 2019. ISSN 1052-9276. Disponível em: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/rmv.2050. http://www.cdc.gov/pregnancy/zika/testing-follow-up/zika-syndrome-birth-defects.html http://www.cdc.gov/pregnancy/zika/testing-follow-up/zika-syndrome-birth-defects.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25711963 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28098253 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5572254/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27148186 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26160494 46 SHAILY, S.; UPADHYA, A. Zika virus: Molecular responses and tissue tropism in the mammalian host. Rev Med Virol, v. 29, n. 4, p. e2050, Jul 2019. ISSN 1099-1654 (Electronic) 1052-9276 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31095819. SHANKAR, A.; PATIL, A. A.; SKARIYACHAN, S. Recent Perspectives on Genome, Transmission, Clinical Manifestation, Diagnosis, Therapeutic Strategies, Vaccine Developments, and Challenges of Zika Virus Research. Frontiers in microbiology, v. 8, p. 1761-1761, 2017. ISSN 1664-302X. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28959246 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5603822/. SIKKA, V. et al. The Emergence of Zika Virus as a Global Health Security Threat: A Review and a Consensus Statement of the INDUSEM Joint working Group (JWG). Journal of global infectious diseases, v. 8, n. 1, p. 3-15, Jan-Mar 2016. ISSN 0974-777X 0974-8245. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27013839 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4785754/. SIROHI, D.; KUHN, R. J. Zika Virus Structure, Maturation, and Receptors. J Infect Dis, v. 216, n. suppl_10, p. S935-S944, Dec 16 2017. ISSN 1537-6613 (Electronic) 0022-1899 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29267925. SMIT, J. M. et al. Flavivirus cell entry and membrane fusion. Viruses, v. 3, n. 2, p. 160-171, 2011. ISSN 1999-4915. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22049308 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3206597/. STASSEN, L. et al. Zika Virus in the Male Reproductive Tract. Viruses, v. 10, n. 4, Apr 16 2018. ISSN 1999-4915 (Electronic) 1999-4915 (Linking). SUN, J. et al. Presence of Zika Virus in Conjunctival Fluid. JAMA Ophthalmol, v. 134, n. 11, p. 1330-1332, Nov 1 2016. ISSN 2168-6173 (Electronic) 2168-6165 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27632055. TAMKUTĖ, L. et al. Cranberry Pomace Extract Exerts Antiviral Activity against Zika and Dengue Virus at Safe Doses for Adult Zebrafish. Viruses, v. 14, n. 5, p. 1101, 2022. ISSN 1999-4915. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35632841 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31095819 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5603822/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4785754/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29267925 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3206597/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27632055 47 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9147401/. TURMEL, J. M. et al. Late sexual transmission of Zika virus related to persistence in the semen. Lancet, v. 387, n. 10037, p. 2501, Jun 18 2016. ISSN 1474-547X (Electronic) 0140-6736 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27287833. VAN DER SCHAAR, H. M. et al. Dissecting the cell entry pathway of dengue virus by single- particle tracking in living cells. PLoS Pathog, v. 4, n. 12, p. e1000244, Dec 2008. ISSN 1553- 7374 (Electronic) 1553-7366 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19096510. VASCONCELOS, P. F.; CALISHER, C. H. Emergence of Human Arboviral Diseases in the Americas, 2000-2016. Vector Borne Zoonotic Dis, v. 16, n. 5, p. 295-301, May 2016. ISSN 1557-7759 (Electronic) 1530-3667 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26991057. WANG, J. et al. A cathelicidin antimicrobial peptide from Hydrophis cyanocinctus inhibits Zika virus infection by downregulating expression of a viral entry factor. Journal of Biological Chemistry, v. 298, n. 10, p. 102471, 2022/10/01/ 2022. ISSN 0021-9258. Disponível em: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822009140. WANG, L. et al. Development of Small-Molecule Inhibitors Against Zika Virus Infection. Frontiers in microbiology, v. 10, p. 2725-2725, 2019. ISSN 1664-302X. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31866959 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6909824/. WANG, L. et al. Therapeutic peptides: current applications and future directions. Signal Transduct Target Ther, v. 7, n. 1, p. 48, Feb 14 2022. ISSN 2059-3635 (Electronic) 2059-3635 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35165272. WEAVER, S. C.; BARRETT, A. D. T. Transmission cycles, host range, evolution and emergence of arboviral disease. Nature Reviews Microbiology, v. 2, n. 10, p. 789-801, 2004/10/01 2004. ISSN 1740-1534. Disponível em: https://doi.org/10.1038/nrmicro1006. WEAVER, S. C. et al. Zika, Chikungunya, and Other Emerging Vector-Borne Viral Diseases. Annual review of medicine, v. 69, p. 395-408, 2018. ISSN 1545-326X 0066-4219. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28846489 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6343128/. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9147401/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27287833 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19096510 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26991057 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925822009140 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6909824/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35165272 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6343128/ 48 WEAVER, S. C.; REISEN, W. K. Present and future arboviral threats. Antiviral Res, v. 85, n. 2, p. 328-345, Feb 2010. ISSN 1872-9096 (Electronic) 0166-3542 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19857523. WHITE, M. K. et al. Zika virus: An emergent neuropathological agent. Annals of neurology, v. 80, n. 4, p. 479-489, 2016. ISSN 1531-8249 0364-5134. Disponível em: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27464346 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5086418/. YARRINGTON, C. D. et al. Congenital Zika syndrome arising from sexual transmission of Zika virus, a case report. Fertil Res Pract, v. 5, p. 1, 2019. ISSN 2054-7099 (Print) 2054-7099 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30619616. YE, Q. et al. Genomic characterization and phylogenetic analysis of Zika virus circulating in the Americas. Infect Genet Evol, v. 43, p. 43-49, Sep 2016. ISSN 1567-7257 (Electronic) 1567-1348 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27156653. YU, Y. et al. A peptide-based viral inactivator inhibits Zika virus infection in pregnant mice and fetuses. Nature Communications, v. 8, n. 1, p. 15672, 2017/07/25 2017. ISSN 2041-1723. Disponível em: https://doi.org/10.1038/ncomms15672 . ZANLUCA, C. et al. First report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 110, n. 4, p. 569-572, Jun 2015. ISSN 1678-8060 (Electronic) 0074-0276 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26061233. ZMURKO, J. et al. The Viral Polymerase Inhibitor 7-Deaza-2'-C-Methyladenosine Is a Potent Inhibitor of In Vitro Zika Virus Replication and Delays Disease Progression in a Robust Mouse Infection Model. PLoS Negl Trop Dis, v. 10, n. 5, p. e0004695, May 2016. ISSN 1935-2735 (Electronic) 1935-2727 (Linking). Disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27163257. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19857523 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5086418/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30619616 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27156653 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26061233 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27163257 94 CAPÍTULO III – Conclusão 95 1. CONCLUSÃO Os peptídeos sintéticos AG-peptídeo e (p-BthTX-I)2 mostraram-se potenciais antivirais contra o ZIKV pela análise feitas em células Vero, sendo que o primeiro apresentou inibição de mais etapas do ciclo replicativo viral do que o segundo. O peptídeo inédito AG-peptídeo teve atividade virucida, mostrando capacidade de agir diretamente na partícula viral e também efeito protetivo das células Vero contra a infecção por ZIKV. Esse peptídeo também inibiu a entrada viral, mais especificamente as etapas de adsorção e internalização, apresentando ação mais acentuada na primeira. O AG-peptídeo também teve ação sobre os estágios pós-entrada do ZIKV nas células hospedeiras, esse feito pode ter sido sobre a replicação, montagem e/ou liberação, mas não parece estar relacionado a última etapa, devido ao fato de não ter ocorrido diferenças significativas nos níveis de RNA viral intracelulares e do sobrenadante dessas células. Com relação ao peptídeo (p-BthTX-I)2, este apresentou efeito protetivo contra o ZIKV e também inibiu as etapas pós-entrada, mas, mais uma vez, o efeito parece não estar relacionado a liberação pelo mesmo motivo que o peptídeo AG-peptídeo. Conclui-se então que, apesar de mais estudos serem necessários para determinar os mecanismos de ação de ambos os peptídeos, o presente trabalho apresentou dois peptídeos com potencial para desenvolvimento de antivirais contra o ZIKV. Um desses peptídeos, o AG- peptídeo, é inédito e teve atuação em praticamente todas as etapas do ciclo replicativo analisadas no trabalho e, futuramente, e pode ser testado contra outros flavívirus. O (p-BthTX- I)2 teve efeito em menos etapas da infecção viral comparado ao AG-peptídeo, mas também surge como uma alternativa ao tratamento contra o ZIKV, e de vírus pertencentes à outras famílias, como o CHIKV e o SARS-CoV-2, tendo potencial para o desenvolvimento de um antiviral de amplo espectro.