�� � � Máira Gazzola Arroyo� “Água de soluções alternativas: estudo da diversidade de espécies fúngicas” São José do Rio Preto 2013 �� � Máira Gazzola Arroyo� “Água de soluções alternativas: estudo da diversidade de espécies fúngicas” Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção de título de Mestre junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus São José do Rio Preto. Orientador: Profa. Dra Margarete Teresa Gottardo de Almeida São José do Rio Preto 2013 �� � Arroyo, Máira Gazzola Água de soluções alternativas: estudo da diversidade de espécies fúngicas/ Máira Gazzola Arroyo. – São José do Rio Preto: [s.n.], 2013. 97 f. :14 il. ; 30 cm. Orientador: Margarete Teresa Gottardo de Almeida Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Fungos. 2. Água de solução alternativa. 3. Poços regulares e irregulares I. Margarete Teresa Gottardo de Almeida. II. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU – 582.28 �� � Máira Gazzola Arroyo� “Água de soluções alternativas: estudo da diversidade de espécies fúngicas” Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção de título de Mestre junto ao Programa de Pós- Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus São José do Rio Preto. Banca Examinadora Profa. Dra. Margarete Teresa Gottardo de Almeida UNESP – São José do Rio Preto Orientador(a) Prof. Dra. Márcia de Souza Carvalho Melhem Instituto Adolfo Lutz de Rio Claro/SP Prof. Dr. Samir Felício Barcha Laboratório de Geologia Ambiental-GEA- São José do Rio Preto UNESP/IBILCE-São José do Rio Preto São José do Rio Preto 27 de junho de 2013 �� � DEDICATÓRIA Dedico este trabalho a minha família, principalmente aos meus pais e irmão, pois a ajuda e apoio de vocês foram essenciais para a realização deste trabalho! �� � AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus pelo dom da vida, por me guiar e me dar forças durante todo este período! Aos meus pais: A vocês que me deram a vida e me ensinaram a vivê-la com dignidade não bastaria um obrigada! A vocês que se doaram inteiros e renunciaram seus sonhos para que realizasse os meus. A vocês que iluminaram meus caminhos quando estes se tornaram obscuros e difíceis de lidar. Obrigada por sempre me incentivarem a nunca perder a fé e manter a cabeça erguida acima de tudo! Obrigada pela compreensão durante toda essa trajetória e por acreditar no meu potencial! Ao meu irmão: Meu amigo de todas as horas, que sempre me apoiou, ajudou e incentivou na execução deste trabalho. Por acreditar em mim e principalmente por ajudar nas dúvidas sobre a formatação do trabalho! A toda minha família, primos(as), tios(as), vó por sempre torcerem pela realização de meus sonhos! À minha orientadora pela oportunidade, ajuda, apoio, dedicação e atenção para que esse trabalho pudesse ser realizado. Muito obrigada por todo ensinamento e por fazer parte do meu crescimento pessoal e profissional. Às minhas amigas de Rio Preto pela amizade, companheirismo, por sempre me apoiarem e pela compreensão nos momentos de ausência. Em especial àquelas que ajudaram na formatação das figuras deste trabalho. Às amigas de Maringá que mesmo longe, continuaram torcendo para que mais uma etapa de minha carreira profissional fosse realizada. A todos os meus amigos que sempre me apoiaram e incentivaram. Aos amigos do laboratório: Luciângela, Simone, Ju, Maísa, Natalia, Luciani, Eduardo, Luis Paulo, João Paulo e Matheus, que compartilharam comigo ótimos momentos de muita descontração durante esses dois anos, que direta ou indiretamente me ajudaram na realização deste projeto. Em especial a Natalia por me ensinar dia a dia com muita calma, paciência e �� � dedicação todo o aprendizado para execução deste trabalho e a Luciângela por sempre estar pronta a me ouvir e esclarecer minhas dúvidas! À Luceli, técnica do laboratório, meu muito obrigada por ser tão prestativa em todos os momentos que precisei. Às professoras Dra. Mara Corrêa Lelles Nogueira e a Dra. Elza Maria Castilho por participarem da banca de qualificação, contribuindo para melhorar o projeto. Ao Dr. Maurício Lacerda Nogueira por ceder seu laboratório para as análises de biologia molecular. À Jaqueline Tanury Macruz Peresi por ser tão bondosa, prestativa e sempre pronta em me ajudar. Por sanar minhas dúvidas com muita paciência e dedicação! À Margarida Georgina Bassi, diretora do Instituto Adolfo Lutz de São José do Rio Preto por aceitar a parceira do projeto. À Heloisa da Silveira Paro Pedro por sempre acreditar no meu potencial, pelas dicas e por todo apoio durante o mestrado. A todos do Adolfo Lutz de São José do Rio Preto que direta ou indiretamente participaram e contribuíram para execução deste trabalho. Ao Wilson Roberto Faim e todos da Vigilância Sanitária de São José do Rio Preto pela realização das coletas e por toda ajuda. À Dra. Márcia de Souza Carvalho Melhem e ao Dr. Samir Felício Barcha que aceitaram dispensar seu tempo na correção deste trabalho, adicionando experiência e conhecimento no mesmo. Ao Dr. José Antônio Cordeiro pela ajuda na execução das análises estatísticas. Ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do IBILCE que contribuíram para meu conhecimento científico e à Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto pela disponibilidade do espaço físico para execução do projeto. À CAPES pelo apoio financeiro. Meus sinceros agradecimentos! �� � Seja quem você for, seja qual a posição social que tenha na vida, a mais alta ou a mais baixa, tenha sempre como meta muita força, determinação e sempre faça tudo com muito amor e fé em Deus, que um dia você chega lá. De qualquer maneira você chega lá! Ayrton Senna � � RESUMO Uma das maiores preocupações para os consumidores é a qualidade da água potável relacionada aos padrões microbiológicos, pois esta é um dos principais veículos de transmissão de patógenos: vírus, bactérias, protozoários e fungos. A atual Portaria nº 2.914/11 do Ministério da Saúde inclui aspectos normativos para os padrões microbiológicos e físico- químicos para as análises de água e define ainda, os tipos de solução alternativa coletiva (SAC) e individual (SAI), destacando alguns pontos de coleta que devem ser contemplados. É possível verificar nesta Portaria a ausência de análises de fungos em água para consumo humano. Águas subterrâneas têm sido usadas como fonte de abastecimento, sendo que seu uso e a construção de poços regulares requerem autorização junto aos órgãos governamentais e cadastro no Sistema de Vigilância Sanitária. No entanto, em alguns Municípios como no caso de São José do Rio Preto muitos poços são construídos de forma irregular, favorecendo a entrada de micro-organismos na água. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo avaliar a ocorrência de espécies fúngicas em água proveniente de soluções alternativas (poços regulares e irregulares) do Município de São José do Rio Preto e correlacionar aos parâmetros físico-químicos e biológicos de susceptibilidade antimicrobiana e ainda, analisar a distribuição de genótipos clonais das leveduras. No período de setembro de 2011 a junho de 2012, 500 ml de água foram coletadas e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto sendo: 52 amostras de água de poços regulares e 107 de poços irregulares. Características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas foram utilizadas para definição das espécies fúngicas e análise de susceptibilidade antimicrobiana. As leveduras que apresentaram mais de um isolado foram submetidas ao teste molecular (RAPD). Paralelamente mais 500 ml de água foram coletados e encaminhados ao Instituto Adolfo Lutz de São José do Rio Preto para as análises físico-químicas. Outros parâmetros também foram avaliados: tipo de água (SAC ou SAI), ponto de coleta, concomitante presença de bactérias, estações do ano e ocorrência de chuvas. Poços regulares e irregulares apresentaram contaminação por fungos patogênicos, que independente da origem dos poços, o crescimento fúngico foi observado mesmo em águas com os padrões físico- químicos dentro do limite estabelecido pela Portaria nº 2.914/11. Tipo de água (SAC e SAI), pontos de coleta, concorrência com bactérias, estações do ano e chuva interferem na distribuição de fungos em água, considerados os padrões biológicos individuais. Água dos � � poços apresentou positividade para fungos resistentes aos antifúngicos utilizados em prática clínica. Também foi demonstrada a ocorrência de tipos fúngicos clonais em água de ambos os poços, o que sugere contato e dispersão microbiana a partir de uma mesma fonte comum de água. A ocorrência de fungos patogênicos resistentes aos antimicrobianos em água de poços implica na criação de novos documentos regulatórios com a inclusão da análise micológica. Palavras-chave: fungos, água de solução alternativa, poços regulares e irregulares ��� � ABSTRACT One of the greatest concerns for consumers is the quality of drinking water related to microbiological standards, because this is one of the most important vehicles of pathogen transmission: viruses, bacteria, protozoa and fungi. The current Directive nº 2.914/11 of Ministry of Health includes normative aspects for microbiological and physico-chemical standards for analysis of water and also defines the types of alternative solutions collective and individual, emphasizing some collection points that must be considered. It is possible to verify in this Directive the absence of analysis of fungi in drinking water. Groundwater it has been used as a source of supply and the use of groundwater and the construction of regular wells requires authorization from governmental agencies and registration in the Health Surveillance System. In some cities, however, such as in São José do Rio Preto many wells are built in an irregular way, facilitating the entry of microorganisms in water. Thus this study aims to evaluate the occurrence of fungal species in water from alternative solutions (regular and irregular wells) in São José do Rio Preto and to correlate to physic-chemical and biological of antimicrobial susceptibility and also to analyze the distribution of clonal genotype of yeasts. From September 2011 to June 2012, 500 ml of water were collected and sent Microbiology Laboratory of Medical School: 52 samples of water from regular wells and 107 from irregular wells. Morphological, physiological and biochemical characteristics were used for definition of fungal species and for analyses of antimicrobial susceptibility. The yeasts that presented more than one isolated were subjected to molecular test (RAPD). At the same time another 500 ml of water were collected and sent to Adolfo Lutz Institute for physic- chemical analyzes. Other parameters were also evaluated: type of water (SAC or SAI), collection points, concomitant presence of bacteria, seasons and rainfall. Regular and irregular wells were contaminated by pathogenic fungi that regardless of the origin of the wells, the fungal growth was observed even in waters with the physico-chemical standards were within the limits established by Directive nº 2.914/11. Type of water (SAC or SAI), collection points, competition with bacteria, seasons and rainfall interfere in the distribution of fungi in water, considering the individual biological standards. Water from wells was positive to fungi resistant to anti-fungal used in clinical practice. It was also demonstrated the occurrence of clonal fungal types in water from both of the wells, suggesting contact and microbial dispersion from a single common source of water. The occurrence of pathogenic fungi resistant to antimicrobial in water from wells implies the creation of new regulatory ��� � documents including the mycological analysis. Keywords: fungi, alternative water solution, regular and irregular wells ��� � LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Localização do Aquífero Guarani na América do Sul ............................................ 21 Figura 2 - Representação do Aquífero Bauru no Estado de São Paulo ................................... 22 Figura 3 - Representação gráfica da distribuição de poços de água regulares de São José do Rio Preto e identificação quanto à positividade/negatividade de isolamento fúngico ............. 45 Figura 4 - Representação gráfica da distribuição de poços de água irregulares de São José do Rio Preto e identificação quanto à positividade/negatividade de isolamento fúngico ............. 46 Figura 5 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à Candida guilliermondii .................................................................................. 64 Figura 6 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à Candida tropicalis .......................................................................................... 65 Figura 7 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à Candida glabrata ........................................................................................... 65 Figura 8 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à Candida intermedia ........................................................................................ 65 Figura 9 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à Candida famata .............................................................................................. 65 Figura 10 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à Candida lusitaniae ....................................................................... 66 Figura 11 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à T. asahii e T. mucoides ................................................................ 66 Figura 12 - Dendrograma obtido pelo método de análise de grupos UPGMA para o coeficiente de Dice frente à Candida parapsilosis ................................................................... 66 Figura 13 - Representação gráfica da distribuição de poços de água regulares e irregulares de São José do Rio Preto e identificação quanto à positividade/negatividade de isolamento fúngico e representação das amostras com correlações genéticas ............................................ 67 Gráfico 1 - Percentual de águas contaminadas segundo a origem...........................................44 � � � � ��� � LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Padrões de corte para definição de sensível, sensível dose dependente e resistente segundo o protocolo M44-A2 ................................................................................................... 37 Tabela 2 - Padrões de corte para definição de sensível, sensível dose dependente e resistente segundo o protocolo M27-A3 ................................................................................................... 39 Tabela 3 - Valores de ponto de corte sugeridos para interpretação de testes de susceptibilidade de filamentosos .............................................................................................. 40 Tabela 4 - Distribuição de espécies fúngicas segundo origem da água ................................... 48 Tabela 5 - Tipo de água segundo origem, poços, pontos de coleta e crescimento fúngico......................................................................................................................................52 Tabela 6 - Padrões físico-químicos e crescimento fúngico em amostras com valores dentro do limite estabelecido pela Portaria nº 2.914/11............................................................................53 Tabela 7 – Média das temperaturas segundo origem dos poços..............................................56 Tabela 8 – Presença de bactérias e concomitância com fungos .............................................. 56 Tabela 9 - Coleta e positividade das amostras nas 4 estações do ano segunda origem dos poços.........................................................................................................................................57 Tabela 10 – Chuva nas 24 horas antecedente a coleta e positividade das amostras................58 Tabela 11 - Perfil de susceptibilidade de leveduras de poços regulares e irregulares frente aos antifúngicos testados.................................................................................................................59 Tabela 12 - Perfil de susceptibilidade de filamentosos de poços regulares e irregulares frente aos antifúngicos testados...........................................................................................................62� ��� � LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ATCC - American Type Culture Collection C. - Candida CE - Comunidade Européia CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute DAEE – Departamento de Água e Energia Elétrica DNA - Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucleico) dNTP - Desorribonuleotídeo Trifosfatado (Desoxynucleoside Triphosphate) EPA - United States Environmetal Protection Agency FAMERP – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto g – grama ºC – Graus Celsius HIV - Vírus da Imunodeficiencia Humana (Human Immunodeficiency Vírus) KCl - Cloreto de Potássio km2 – quilômetro quadrado l- litro M – Molar mcg – microgramas mg – miligrama MgCl2 - Cloreto de Magnésio MIC – Concentração Inibitória Mínima > - maior � - maior ou igual ® - Marca Registrada < - menor � - menor ou igual μg - micrograma μl – microlitro ��� � ml – mililitro mm – milímetro mM – milimolar MS – Ministério da Saúde NaCl - Cloreto de Sódio ng – nanogramas nm – nanômetro pmol - picomol PCR – Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia de Polimerase) % - porcentagem pH – Potencial Hidrogeniônico RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA rpm - rotações por minuto SAC – Solução Alternativa Coletiva SAI – Solução Alternativa Individual SDD – Sensível Dose Dependente sp. - espécie UFC – Unidade Formadora de Colônia UH – Unidade de Hazen UPGMA - Unweighted Pair-Group Method Arithematic averages UT – Unidade de Turbidez UV – Ultravioleta V. - Volts VMP - Valor Máximo Permitido ��� � SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19� 1.1 CONTROLE DA QUALIDADE DA ÁGUA - HISTÓRICO......................................... ...19�� 1.2 ÁGUA SUBTERRÂNEA .................................................................................................. 21� 1.3 ÁGUA E FUNGOS ............................................................................................................ 23� 1.4 FUNGOS E RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA .......................................................... 25� 1.5 GENÉTICA MOLECULAR .............................................................................................. 26� 2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ................................................................................ 29� 3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 31� 3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................... 31� 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................. 31� 4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 32� 4.1 COLETA DA ÁGUA E FILTRAÇÃO .............................................................................. 33� 4.2 IDENTIFICAÇÃO DAS LEVEDURAS............................................................................ 34� 4.2.1 Características morfológicas ........................................................................................ 34� 4.2.2 Microcultivo em Corn-Meal com Tween 80 ................................................................ 34� 4.2.3 Provas fisiológicas da identificação das leveduras ..................................................... 34� 4.2.3.1 Teste de assimilação de diferentes fontes de carbono .................................................. 34� 4.2.3.2 Teste de assimilação de diferentes fontes de nitrogênio............................................... 35� 4.2.3.3 Identificação pelo ID 32C (BioMérieux)...................................................................... 36� 4.3 IDENTIFICAÇÃO DE FILAMENTOSOS........................................................................ 36� 4.3.1 Características morfológicas ........................................................................................ 36� 4.4 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS ............................................................... 36� 4.4.1 Método de difusão em disco .......................................................................................... 37� 4.4.2 Método de microdiluição para leveduras .................................................................... 38� 4.4.3 Método de microdiluição para fungos filamentosos ................................................... 39� 4.5 BIOLOGIA MOLECULAR ............................................................................................... 40� 4.5.1 Extração do DNA genômico para leveduras ............................................................... 40� ��� � 4.5.2 Técnica de RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA .......................................... 41� 4.5.2.1 Interpretação dos dados de polimorfismos gerados pelo RAPD .................................. 41 4.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ............................................................................................ 42� 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ...................................................................................... 44� 5.1 PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS E FÍSICO-QUÍMICOS VERSUS FUNGOS .... 44� 5.2 SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE FUNGOS LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS .................................................................................................................... 59� 5.3 PERFIL GENOTÍPICO DAS LEVEDURAS .................................................................... 63� 6 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 69� 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 71� 8 ANEXOS .............................................................................................................................. 86� � � � INTRODUÇÃO � � � 1 INTRODUÇÃO 1.1 CONTROLE DA QUALIDADE DA ÁGUA - HISTÓRICO A qualidade da água tornou-se relevante e de importância para a saúde pública no final do século XIX e começo do século XX em razão das doenças por ela veiculadas (FREITAS; FREITAS, 2005). No Brasil, na década de 1970, iniciou-se a primeira normatização para a qualidade da água para consumo humano com o Decreto Federal nº 79.367 de 9 de março de 1977, no qual define que o Ministério da Saúde junto de outros órgãos, estabeleça a aprovação de normas relacionadas à proteção de mananciais, serviços de abastecimento público, instalações prediais e o controle da qualidade da água. Em 1986, cria-se o Programa Nacional de Vigilância da Qualidade da Água para Consumo Humano, cujos principais objetivos foram delineados para prestar auxílio técnico as Secretarias Estaduais de Saúde e definir estratégias a fim de obter apoio para análises físico- químicas e microbiológicas (BRASIL, 2004a). Foi no ano de 1990, com a criação da Portaria nº 36/MS/GM/90, que o padrão de potabilidade da água foi determinado, sendo que a água potável para estar em condições adequadas ao consumo humano deve atender os padrões físico-químicos e microbiológicos (BRASIL, 1990). Dez anos mais tarde, precisamente em 29 de dezembro de 2000, um comitê especializado cria a Portaria nº 1.469, que identifica novos critérios à primeira, e, propõe mudanças quanto ao padrão de potabilidade e normas técnicas para os processos de desinfecção. Paralelamente, surgem novas regras para criação dos sistemas de abastecimento de água e soluções alternativas: o primeiro é toda instalação composta por conjunto de obras civis, materiais e equipamentos, destinada à produção e à distribuição canalizada de água potável para populações, sob a responsabilidade do poder público; ao segundo, que inclui toda modalidade de abastecimento coletivo diferente do sistema de abastecimento, como fontes, poços comunitários, instalações de reservatórios de água em condomínios horizontais e verticais (BRASIL, 2000). Essa Portaria determina ainda que os responsáveis das soluções alternativas de abastecimento mantenham a qualidade da água potável para a população consumidora e ��� � realizem uma avaliação sistemática da qualidade da água, sob perspectiva dos riscos à saúde (BRASIL, 2000). Em 25 de março de 2004, a Portaria nº 518 define novos conceitos e exigências sobre a Portaria 1.469, com objetivos agora mais restritos (BRASIL, 2004b). Recentemente, a Portaria MS/GM nº 2.914, de 12 de dezembro de 2011 revoga a Portaria nº 518 (BRASIL, 2011) subdivide os tipos de soluções alternativas coletivas (SAC) e individuais (SAI); ao primeiro, caracterizado como abastecimento coletivo destinado a fornecer água potável, com captação subterrânea ou superficial, com ou sem canalização e sem rede de distribuição; ao segundo, abastecimento de água particular, pertencente aos domicílios residenciais com uma única família. Ainda nesta Portaria, são contemplados alguns pontos de coleta para análise de água: cavaletes e demais pontos de consumo. Nesta mesma proposta, são incluídos aspectos normativos para os padrões microbiológicos e físico- químicos, conforme seguem: Padrões microbiológicos: a água para consumo humano deve estar ausente de Escherichia coli e coliformes totais em 100 ml. Padrões físico-químicos: o potencial hidrogeniônico (pH), condição ácida ou alcalina do meio com atividade de íons H+ deve apresentar-se no intervalo de 6,0 a 9,5; a cor, resultante da dissolução de substâncias na água, principalmente de matéria orgânica com Valor Máximo Permitido (VMP) de 15UH(Unidade de Hazen: mg Pt-Co/L); a turbidez, relacionada com a transparência, de acordo com a presença de partículas suspensas na água, com VMP de 5UT (Unidades de Turbidez), o nitrato (N) com VMP de 10mg/L e o cloro residual livre deve estar no limite de 0,2 mg/L a 2 mg/L. Em relação aos padrões microbiológicos internacionais para água de consumo humano, de acordo com a Directiva 98/88/CE da Comunidade Européia e da Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (United States Environmetal Protection Agency- EPA) os critérios microbiológicos consistem numa investigação mais detalhada de determinados grupos microbianos como: E. coli, coliformes totais, Cryptosporidium sp, Giardia lamblia, Legionella sp, Enterococos e alguns grupos virais (DIRECTIVA 98/88/CE, 1998; EPA, 2009). Pode-se observar que tanto os parâmetros nacionais e internacionais não contemplam as análises de fungos filamentosos e leveduras. � ��� � 1.2 ÁGUA SUBTERRÂNEA � A garantia da saúde humana está relacionada a diversos fatores, entre eles, à qualidade da água. Esta, para estar em condições ideais para o consumo deve atender além dos parâmetros físico-químicos, os padrões microbiológicos que funcionam como indicadores de contaminação (BRASIL, 2011; WHO, 2001). No Brasil, tem-se utilizado a água subterrânea como fonte de abastecimento público, sendo o Estado de São Paulo o maior usuário deste recurso, com aproximadamente 80% das cidades deste Estado, utilizando total ou parcialmente fontes subterrâneas como forma de abastecimento. O monitoramento dos lençóis freáticos é um importante instrumento para a gestão da qualidade dos recursos hídricos, principalmente em função da expansão das captações e a interconexão entre as águas superficiais e as subterrâneas (CETESB, 2010; RODRIGUES, 2004). A água subterrânea usada para consumo humano também necessita atender aos parâmetros físico-químicos e microbiológicos. Para tanto, a preocupação com a contaminação desta fonte hídrica, está diretamente relacionada com a qualidade de água dos Aquíferos que proporcionam este recurso. O Aquífero Guarani é considerado o maior manancial em extensão de água doce subterrânea do mundo, situando-se na região centro-leste da América do Sul, e ocupa uma área de 1,2 milhões de Km², estendendo-se pelo Brasil (Estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Minhas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Goiás), Paraguai, Uruguai e Argentina, Figura 1 (GIARDIN; FACCINI, 2011). Figura 1 - Localização do Aquífero Guarani na América do Sul � ������������������������������������������������ � Fonte: CETESB, 2011. � � A fonte hídrica resp e de várias cidades do oest de São Paulo, é o Aquífer Figura 2 (MODESTO et al. Figura 2 - Representação d Fonte: IR Embora considera filtração do solo, a contam surgir. Este evento é comum irregular, e a água localizad para doenças, o que coloca 2011) tornando-se necess estabelecidos pelas Secretar O uso da água a p Departamento de Águas e E fiscalização da qualidade da Foi através deste envolvendo águas subterrâ não havia registros ou do exploração racional e econô para perfurações dos poços a implantação de regras go poços a atingir o Aquífero Prudente, Ribeirão Preto e Com o crescimen ponsável por grande parte do abastecimento p te paulista, incluindo a cidade de São José do ro Bauru, que ocupa cerca de 40% do territó ., 2009; OLIVEIRA; WEDLAND, 2004). do Aquífero Bauru no Estado de São Paulo RITANI; EZAKI, 2008. ando segura a origem da água subterrâne minação externa por micro-organismos e o m quando os poços de captação de água são c da na superfície do poço, pode conter micro- a em risco a saúde da população (AYACH, sário a criação de protocolos de supervi rias Estaduais de Saúde mediante Portarias do partir de fontes subterrâneas requer autorizaç Energias Elétricas (DAEE), cabendo a este ór a água (DAEE, 2011a). Departamento, que se iniciaram no Brasil e âneas, a fim de avaliar a qualidade da mesm ocumentos sobre a hidrologia dos locais p ômica dos recursos naturais, nem tampouco t , o que levou à má utilização de recursos púb overnamentais, é liberada autorização de per o Guarani, e neste contexto, destacam-se as São José do Rio Preto (BORGUETTI et al., nto urbano, destituído de um planejament ��� público dos Municípios o Rio Preto, no Estado ório representado pela ea dado ao poder de outros elementos pode construídos de maneira -organismos potenciais et al. 2012; CETESB, isão constantes, hoje o Ministério da Saúde. ção e outorga junto ao rgão, a administração e em 1972 as pesquisas ma. Até este momento, para que permitisse a técnicos especializados blicos e privados. Após rfuração dos primeiros cidades de Presidente 2004, DAEE, 2011b). o, surgem habitações ��� � subnormais, denominados loteamentos clandestinos que, habitualmente, carecem de infraestrutura relacionada ao saneamento básico. Dada a esta irregularidade, seguem-se outras, comprometendo a saúde da população que ali reside, a saber: perfuração irregular de poços, ausência de procedimentos de rotina para avaliação da qualidade da água, bem como da investigação dos recursos de implantação (canos perfurados, proximidade com esgoto etc.) (FREITAS, 2000). Como resultante, tem-se água para consumo humano, contaminada e saúde da população comprometida. Reforça-se aqui, a obrigatoriedade de supervisão destas áreas pelos órgãos públicos, para posterior liberação de licenças e aprovação de obras para infraestrutura (FREITAS, 2000). 1.3 ÁGUA E FUNGOS A potabilidade da água está relacionada principalmente aos padrões microbiológicos, uma vez que patógenos como algas, bactérias, helmintos, protozoários, vírus e fungos, quando presentes, são prejudiciais à saúde (BARRETO, 2009; BRASIL, 2011; INGERSON- MAHAR; REID; 2012; MACÊDO, 2000; SIQUEIRA et al., 2010). No entanto, segundo a Portaria MS/GM nº 2.914, para qualificação da água, tais padrões valorizam apenas a ocorrência de alguns grupos bacterianos (BRASIL, 2011). Nas últimas décadas, o encontro de fungos em água tem recebido maior atenção como contaminante de água hospitalar ou de consumo humano. Por serem ubíquos, quando presentes na água podem disseminar os propágulos aos diversos nichos ecológicos e a partir destes contaminarem superfícies, animais e humanos (ANAISSIE et al., 2003; HAGESKAL; LIMA; SKAAR, 2009). De fato, vários estudos demonstraram a ocorrência de fungos em água potável, em sistema de distribuição, unidades de diálise, tanques de armazenamento de água hospitalar, de torneiras e chuveiros presentes em hospitais (DEFRA, 2011; FIGEL, 2011, WARRIS, et al. 2010). Os ambientes aquáticos favorecem a sobrevivência dos fungos, uma vez que em condições ideais de nutrientes e físico-químicas: pH, temperatura, umidade, os fungos são capazes de se reproduzirem (KASPRZYK, 2008). E como consequência, redes de conexão, reservatórios, caixa d’agua, torneiras e chuveiros, superfícies animadas ou inanimadas, podem albergar diferentes espécies, o que torna esta via, potencial transmissora de doenças ��� � (ANAISSIE, et al., 2002; ANAISSIE; COSTA, 2001; BITTON, 2005; HAGESKAL; LIMA; SKAAR, 2009; LATGÉ; STEINBACH, 2009; TOTHOVA; MOGONOVA; FRANKOVA, 2001; WARRIS, et al., 2001; WARRIS, et al. 2003). A relação de fungos com o homem, muitas vezes é prejudicial. Assim, o espectro clínico das infecções fúngicas é bastante variável: superficiais, subcutâneas, sistêmicas ou oportunistas, com padrões leves, graves até mortais. Em paralelo, outros acometimentos podem surgir: alergias e intoxicações (HAGESKAL; LIMA, SKAAR, 2009 SOMENZI; RIBEIRO; MENEZES, 2006). Valorizados os padrões biológicos dos micro-organismos, muitos se qualificam como patógenos primários, acarretando severos problemas, já que produzem vários fatores de virulência. Outros, dada à debilidade imunológica do hospedeiro (homem e animais), se identificam como oportunistas (CASTRO et al. 2006; GIRMENIA, et al. 2006) Diversos ambientes, inclusive a água podem se constituir como principal via de aquisição. Uma vez presentes na água, os esporos de fungos filamentosos podem ser inalados pelos indivíduos se instalando no trato respiratório causando infecções na face e pulmões, e, sequencialmente outros órgãos são acometidos: cérebro, fígado, rins, etc. (CARENZI, et al., 2011). De fato, aspergilose broncopulmonar, sinusite alérgica, pneumonia, irritação das mucosas, representam as entidades clínicas mais comuns. Destaca-se aqui, prevalência para os fungos filamentosos: Aspergillus sp, Penicillium sp. (CÁRDENAS; CORTES; PARRA, 2008; KANZLER et al., 2008; KUMAR, et al., 2005; REICHENBERGER, et al., 2002; VOJDANI et al., 2003). Em relação aos fungos leveduriformes, diversas espécies de Candida vêm sendo descritas como mais comum etiologia de doenças fúngicas em humanos e animais. Este evento traz Candida albicans e não albicans como micro-organismos prevalentes em micoses superficiais, subcutâneas, sistêmicas e oportunistas (JAWETZ; MELNCICK; ADELBERG, 2009; MADIGAN, et al, 2010; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). Após a ingestão de água com leveduras, e subsequente presença no sistema gastrointestinal, estas, por translocação atingem a corrente sanguínea, disseminando-se para outros órgãos. Esta condição clínica é mais grave se presente em pacientes submetidos ao tratamento quimioterápico, ou que tenha alguma outra doença de base que comprometa o sistema imunológico (FRIDKIN; JARVIS, 1996; KOH, et al., 2008). Não menos importante, a referência de outros gêneros e espécies fúngicas representarem potencial risco à saúde, considerados os fatores de virulência dos fungos ou a ��� � debilidade imunológica do hospedeiro (CASTRO et al. 2006; GIRMENIA, et al. 2006; HAGESKAL; LIMA, SKAAR, 2009). Além destas severidades, alguns fungos são capazes de formar biofilmes, polímeros extracelulares que favorecem a aderência a diversos tipos de superfícies. Neste sistema especializado, os fungos têm maior resistência aos produtos de desinfecção, e vivos, liberam seus produtos metabólitos secundários (micotoxinas, antimicrobianos etc.) comprometendo a qualidade da água, tornando-se um problema de saúde pública (HAGESKAL; LIMA; SKAAR, 2009; KELLEY et al. 2003; PERKINS, et al., 2009). 1.4 FUNGOS E RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA Nos últimos anos cresce a ocorrência de micro-organismos resistentes aos antimicrobianos utilizados abusivamente na prática clínica para o controle das infecções (COSTA, 2006; GARCÍA-MARTOS, et al., 2001; GUITIÉRREZ-MARTÍNEZ, et al., 2012; NUNES, et al., 2011; SANTOS, et al., 2009). Quando o paciente apresenta características clínicas particulares, o uso da terapia empírica é universalmente aceito, antes do diagnóstico adequado. O uso de antimicrobianos de espectro estendido constante e de forma inadequada tem levado à seleção de cepas resistentes, o que agrava o controle das infecções microbianas (JÚNIOR, 2008). Diversos alvos de ação antifúngica são descritos na literatura científica: inibição da síntese de parede celular, membrana, síntese protéica etc.. No entanto, a maioria dos antifúngicos atua impedindo a formação da biossíntese de ergosterol, que é o principal esterol da membrana celular dos fungos. Conhecidos como azólicos, representados por itraconazol, fluconazol, cetoconazol, entre outros, são normalmente eficazes contra uma grande diversidade de fungos patogênicos, bem tolerados no organismo, e assim, considerados a classe de antifúngicos mais utilizados (COWEN, 2008). De baixa toxicidade, o itraconazol tem demonstrado resultados satisfatórios contra diversos tipos de fungos, principalmente para as espécies de Candida, sendo que na maioria dos casos a resistência dos isolados é pouco observada (CASTRO, et al., 2006; GAVALDA; RUIZ, 2003; MENEZES; MENDES; CUNHA, 2009; MÍMICA, et al. 2009). Em se tratando de fungos filamentosos, e à exceção do gênero Aspergillus, o itraconazol é o antifúngico mais usado depois de anfotericina B para o tratamento de infecções causadas por esses fungos ��� � (MELLADO; CUENCA-ESTRELLA; RODRÍGUEZ-TUDELA, 2002; MOSQUERA; DENNING, 2002). O fluconazol, por ter espectro estendido, é o principal fármaco utilizado no tratamento de infeções fúngicas causadas por leveduras oportunistas, entretanto, cepas resistentes a este azólico já foram descritas (ARAÚJO, et al., 2005; NOGUEIRA, 2012). Apresenta ação limitada contra fungos filamentosos: Aspergillus sp., Fusarium sp., Scedosporium sp. e Penicillium sp (CARRILLO-MUÑOZ, 2006 ; CATALÁN-MONTEJO, 2006; CLSI, 2008b; SANTOS-JÚNIOR, et al., 2005; MELLADO; CUENCA-ESTRELLA; RODRÍGUZ- TUDELA, 2002). Em relação ao cetoconazol, apresenta amplo espectro de atividade frente a diversas espécies de Candida, sendo os casos de resistência raros (BRITO, et al., 2009; MANZANO- GAYOSSO, et al., 2011). Sua ação frente aos fungos filamentosos também é considerada limitada (CARRILLO-MUÑOZ, 2006; MELLADO; CUENCA-ESTRELLA; RODRÍGUEZ- TUDELA, 2002). Considerado anfotericina B, antifúngico eficaz contra a maioria das espécies fúngicas e, em especial ao gênero Candida, é altamente tóxico para o organismo e o fenótipo de resistência é evento raro (BATISTA, BIRMAN; CURY, 1999; CASTRO et al., 2006; GOMES, et al., 2010; MENEZES, MENDES, CUNHA, 2009). Recomenda-se seu uso como tratamento de aspergilose, zigomicose, histoplasmose, paracoccidioidomicose, etc. (CATALÁN; MONTEJO, 2006; SEVERO; GUAZELLI; SEVERO, 2010). Entretanto, já foram descritas cepas resistentes de Aspergillus terreus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium sp e Fusarium sp (BLUM, et al; 2008; THERESE, et al., 2006). 1.5 GENÉTICA MOLECULAR A genética molecular vem sendo adotada como ferramenta diagnóstica em estudos epidemiológicos para identificação e correlação microbiana. Neste sentido, seguem-se vários métodos investigativos, alguns factíveis para rotina laboratorial: RAPD (random amplified polymorphic DNA), PFGE (pulsed field gel electrophoresis), RFLP ( restriction fragment length polymorphism). Embora uma variedade de estratégias da reação de PCR (polimerase chain reaction) tenha surgido, a RAPD caracteriza-se como o método mais popular de análise genética de fungos (CAIXETA, et al., 2006; PFALLER, 1990; SOLL, 2000). Usando-se iniciadores aleatórios de aproximadamente 10 pares de base, o DNA do ��� � genoma é alvo a ser amplificado. Diferentemente, a aplicação da técnica RFLP, fornece maior detalhamento da constituição genética, uma vez que permite reconhecer dentro das regiões amplificadas, subáreas do genoma, pós utilização de enzimas de restrição. Objetivando analisar o cariótipo, portanto, fragmentos maiores que constituem o genoma microbiano, a eletroforese em campo pulsado (PFGE) destaca-se como melhor ferramenta (BART- DELABESSE, et al. 1993; CAETANO-ANOLLES, 1993). � � � RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA � � � 2 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA A inexistência de protocolos no âmbito mundial que avaliem a qualidade da água quanto aos parâmetros micológicos, justifica a relevância deste estudo, uma vez que existe um potencial risco para doenças em humanos e animais, a partir desta origem. A prática abusiva de abertura de poços em áreas urbanas e rurais, aliada a não regularização e supervisão dos mesmos frente aos órgãos governamentais, pode se constituir em um problema de saúde pública, uma vez que a partir destas fontes, muitas doenças infecciosas, alérgicas e intoxicações poderão surgir��� Nesse sentido, tornam-se necessárias pesquisas que avaliem a ocorrência, distribuição e a variedade de fungos em água de consumo humano, para posterior adoção de medidas de controle de sua disseminação. ��� � OBJETIVOS 3 OBJETIVOS ��� � 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar a distribuição de espécies fúngicas na água de soluções alternativas (poços regulares e irregulares) do Município de São José do Rio Preto e correlacionar aos parâmetros físicos, químicos e biológicos. � 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS � • Caracterizar e comparar as espécies fúngicas isoladas de poços regulares e irregulares;� • Correlacionar a distribuição dos fungos com tipos de água (SAC ou SAI) e pontos de coleta; � • Correlacionar os parâmetros físico-químicos e microbiológicos da água (pH, cor, turbidez, nitrato, cloro residual livre, temperatura, bactérias) com fungos; • Correlacionar a presença de fungos com estações do ano e a ocorrência de chuvas;� • Estudar o fenótipo de susceptibilidade antimicrobiana de fungos leveduriformes e filamentosos; • Investigar a ocorrência de tipos clonais de fungos leveduriformes por biologia molecular. ��� � MATERIAIS E MÉTODOS 4 MATERIAIS E MÉTODOS ��� � 4.1 COLETA DA ÁGUA E FILTRAÇÃO � No período de setembro de 2011 a junho de 2012, 159 amostras de água foram coletadas: 52 coletas de poços regulares (com cadastro junto ao Sistema de Vigilância Sanitária) e 107 coletas de poços irregulares (sem cadastro). Após fluxo contínuo de escoamento de água, 500 ml foram coletados e encaminhados ao Instituto Adolfo Lutz de São José do Rio Preto para as análises físico-químicas: cor, turbidez e nitrato, de acordo com as normas do Instituto Adolfo Lutz (2005). O pH, cloro residual livre e a temperatura foram medidos no momento da coleta pelos profissionais da Vigilância Sanitária. Paralelamente, 500 ml da mesma amostra de água foram coletadas e encaminhadas ao Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP) para as análises micológicas. Seguiu-se o transporte da água em caixas isotérmicas, de acordo com método internacional Standard Methods for Examination of Water and Wastewater (2012). Para filtração da mesma, utilizaram-se membranas de celulose de 0,45μm de poro e 47 mm de diâmetro, com subsequente colocação na superfície de meio de cultura Ágar Sabouraud OXOID® e Mycobiotic ACUMEDIA®, mantendo-se a temperatura 30ºC por 15 dias de incubação (LACAZ, et al. 2002). Após o crescimento dos fungos, foram selecionadas todas as colônias distintas morfologicamente e quando idênticas, apenas um isolado foi considerado. Dados de origem da água (SAC ou SAI), ponto de coleta (cavalete, ponto de consumo e direto do poço), presença de bactérias, estações do ano e presença de chuvas nas 24 horas antecedentes a coleta de cada amostra foram registrados. Todas as amostras de água são de origem subterrânea, entretanto foram coletadas amostras em ponto de consumo superficiais. 4.2 IDENTIFICAÇÃO DAS LEVEDURAS � ��� � 4.2.1 Características morfológicas � As espécies foram identificadas inicialmente segundo os critérios macromorfológicos: seca, úmida, mucóide, sem relevo, presença ou não de pigmento e micromorfológicos: presença de pseudo-hifa e tubo germinativo. Paralelamente padrões bioquímicos foram investigados após triagem estabelecida por CHROMagar Candida HIMEDIA® de acordo com Lacaz et al. (2002). 4.2.2 Microcultivo em Corn-Meal com Tween 80 � A técnica é baseada no princípio de que a incubação das leveduras em meio Tween 80 sob baixa tensão de oxigênio estimula a produção de conídios e/ou pseudo-filamentação. Após o preparo do ágar fubá com Tween 80, distribuído em lâminas, a semeadura do fungo foi realizada com alça de platina estéril, em 3 estrias paralelas sobre o ágar, de 4 a 4 cm de extensão e equidistantes de 3 a 4 mm umas das outras. As estrias foram recobertas na sua porção central, com lamínula esterilizada. Seguiu-se a incubação em câmara úmida a 30ºC por tempo aproximado de 5 dias (LACAZ, et al. 2002). 4.2.3 Provas fisiológicas de identificação das leveduras Para a identificação das leveduras seguiram-se as provas de assimilação das fontes de carbono e nitrogênio. 4.2.3.1 Teste de assimilação de diferentes fontes de carbono O teste consiste na habilidade de uma levedura crescer aerobicamente na presença de carboidrato fornecido como única fonte de carbono. Para assimilação em meio sólido foi empregado ágar destituído de qualquer fonte de carbono, adicionado à suspensão da levedura e distribuído em placa. A positividade foi avaliada pela observação do halo de crescimento da levedura frente aos carboidratos: dextrose, galactose, trealose, xilose, lactose, sacarose, celebiose, inositol, melibiose, rafinose, dulcitol e maltose. Uma suspensão de levedura de ��� � cultura recente (24 a 48 horas) foi preparada em 2 ml de água destilada esterilizada, ajustando-se posteriormente a turbidez de acordo com o padrão da escala de McFarland (5). O meio Yeast Nitrogen Base, preparado de acordo com as normas do fabricante (0,5g de sulfato de magnésio heptahidratado-Synth; 1,0g de fosfato de magnésio monobásico- Merck; 20,0g de dextrose- Synth; 20,0g de ágar- Himedia e 1000 ml de água destilada) foi distribuído em tubos de 20 x 200 mm, contendo 30 ml do meio, a 4ºC. No momento do uso, os tubos foram submetidos a uma temperatura de 50ºC em banho-maria. Após a estabilização da temperatura, 1,5 ml da suspensão da levedura foi adicionado ao meio e vertido em placa de Petri esterilizada (150 x 15 mm). Após solidificar, a placa foi disposta sobre cartela-guia, com os nomes dos açúcares. As placas ficaram incubadas a 25-30ºC, durante 24 a 48 horas e a leitura realizada após 48 horas, sendo a positividade observada através do surgimento de halo de crescimento, na área correspondente ao carboidrato assimilado. A dextrose foi utilizada como controle positivo para avaliar a viabilidade do inóculo da levedura (LACAZ, et al. 2002). 4.2.3.2 Teste de assimilação de diferentes fontes de nitrogênio A assimilação do nitrogênio permite que as leveduras cresçam aerobicamente na presença de um composto nitrogenado inorgânico fornecido como única fonte de nitrogênio, assim, o teste tem a capacidade de detectar a assimilação de diferentes fontes de nitrogênio para cada espécie. Empregou-se ágar destituído de qualquer fonte de nitrogênio, adicionado da suspensão da levedura, e distribuído em placa. Após a solidificação, foram distribuídos os compostos nitrogenados: nitrato de potássio e peptona sobre o ágar. Preparou-se uma suspensão recente da levedura (24 a 48 horas) em 1 ml de água destilada esterilizada, ajustando-se posteriormente a turbidez, de acordo com o padrão número 5 da escala de McFarland. Para tal, o meio Yeast Carbon Base foi previamente preparado, de acordo com as normas do fabricante (0,5g de sulfato de magnésio heptahidratado-Synth; 1,0g de fosfato de potássio monobásico-Merck; 5,g de sulfato de amônio-Vetec; 20g de ágar-Himedia e 1000ml de água destilada) e armazenado em tubos de 20 x 200 mm, contendo 20 ml do meio, a 4ºC. No momento do uso, os tubos foram submetidos a uma temperatura de 50ºC em banho-maria. Após a estabilização da temperatura, 1 ml da suspensão da levedura foi adicionado a 20 ml do meio e vertidos em placa de Petri de 90 x 15 mm esterilizada. Após ��� � solidificação do meio, a placa ficou disposta sobre cartela-guia, onde pequenas alíquotas de fontes de nitrogênio foram distribuídas equidistantes sobre o ágar. As placas foram incubadas a 25-30ºC, durante 24 a 48 horas com leitura feita por meio de um halo de crescimento em torno das fontes nitrogenadas. A peptona foi utilizada como controle de crescimento do fungo (LACAZ, et al. 2002). 4.2.3.3 Identificação pelo ID 32C (BioMérieux) O teste de identificação miniaturizado ID32C (BioMérieux) foi realizado nas amostras que não foram identificadas pelas provas descritas acima, com critérios de execução segundo o fabricante. Assim, após o cultivo de 24-48 horas em meio Ágar Sabouraud, colônias foram isoladas e adicionadas a uma ampola do meio de suspensão API® (2mL de solução salina 0,85%), com opacidade equivalente a escala 2 de McFarland. Transferiu-se 250μL desta suspensão para o meio de cultivo API® Meio C. Após homogeneização, foi adicionado 135μL desta suspensão em cada cúpula da galeria do ID 32C. A galeria foi incubada em estufa de 29ºC ± 2, por 72 horas, com leitura visual e, em paralelo, identificação através do programa apiwebTM da BioMérieux. 4.3 IDENTIFICAÇÃO DE FILAMENTOSOS 4.3.1 Características morfológicas A identificação de fungos filamentosos inicia-se pela observação da morfologia da colônia como cor, textura, superfície, pigmento difusível no meio de cultura, entre outros, seguida das características micromorfológicas (microcultivo) como: tipo de hifa (hialina ou demácea, septada ou cenocítica, forma, disposição) e morfologia dos esporos. O tempo de crescimento foi utilizado para identificação da espécie (LACAZ, et al, 2002). 4.4 SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIFÚNGICOS ��� � 4.4.1 Método de difusão em disco As leveduras isoladas da água foram suspensas em solução salina até alcançar a turbidez de uma solução padrão de McFarland 0,5 (inóculo de 1x106 a 5x106 células/mL). O meio utilizado foi Mueller-Hinton (HIMEDIA ®) acrescido de 2% de glicose e 0,5�g/mL de azul de metileno. Após preparo, o meio foi distribuído em placas de Petri de modo a formar uma camada de aproximadamente 4 mm. Os inóculos foram aplicados com swab e após 15 minutos de estabilidade, os discos (CECON ®), contendo os antifúngicos itraconazol 10mcg, fluconazol 25mcg, cetoconazol 50mcg e anfotericina B100mcg foram colocados na superfície do meio. As placas foram invertidas e incubadas a 35ºC por 24h e 48 horas. As cepas de referência American Type Culture Collection (ATCC) foram utilizadas como controle: C. glabrata (2001), C. parapsilosis (22019), C. tropicalis (13803). Os critérios de corte para definição de sensível, sensível dose dependente e resistente, foram considerados conforme a Tabela 1, segundo o documento do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M44-A2 (CLSI, 2010). Tabela 1 - Padrões de corte para definição de sensível, sensível dose dependente e resistente segundo o protocolo M44-A2 Susceptibilidade Antifúngicos – Difusão em Disco (mm) Itraconazol Fluconazol Cetoconazol Anfotericina B Sensível �20 �19 >20 �10 SDD 19 a 12 18 a 15 20 a 10 _ Resistente �11 �14 <10 <10 SDD – sensível dose-dependente. mm– milímetros � – menor ou igual a � – maior ou igual a 4.4.2 Método de microdiluição para leveduras � � � Os micro-organismos previamente identificados como sensíveis dose-dependentes e resistentes foram reavaliados por microdiluição em caldo, segundo o documento M27-A3 (CLSI, 2008a). Para tal, foi utilizado meio líquido RPMI-1640 (SIGMA ®) tamponado com ácido morfopropileno sulfônico (MOPS; SIGMA®) e glicose 2%. As leveduras foram previamente subcultivadas em Ágar Sabouraud-Dextrose (OXOID ®) e incubadas por 24 horas a 35º C. A padronização dos inóculos foi realizada utilizando a escala 0,5 de MacFarland e ajuste no espectrofotômetro (Biospectro) em comprimento de onda de 530nm. Os antifúngicos utilizados foram: anfotericina B (SIGMA®), cetoconazol (Janssen Pharmaceutica, Belgium®), fluconazol (PFIZER®) e itraconazol (Janssen Pharmaceutica, Belgium®). As concentrações variaram de 0,25 a 128 μg/ml para o fluconazol e de 0,03 a 16 μg/ml para itraconazol, cetoconazol e anfotericina B. Foram utilizadas microplacas estéreis com 96 poços (Cralplast) inoculando-se apenas um antifúngico por placa, da menor para a maior diluição. As dez concentrações de cada antifúngico preparadas foram colocadas em sentido vertical na placa, nas colunas de 2 a 11. Cada coluna correspondeu a uma concentração diferente. As colunas 1 e 12 foram utilizadas como controle, a 1 controle de esterilidade e a 12, controle de crescimento. O inóculo foi dispensado na quantidade de 100 μl, nas colunas de 2 a 12. As placas foram agitadas em agitador de Micro Placas (MA 562 Marconi) e incubadas a 35°C por 24-48 horas. A leitura foi realizada através do leitor ELISA (Labtech LT-4000 Microplate Reader. As cepas de referência American Type Culture Collection (ATCC) foram utilizadas como controle: C. glabrata (2001), C. parapsilosis (22019), C. tropicalis (13803). Os critérios de corte para definição de sensível, sensível dose dependente e resistente, foram considerados conforme a Tabela 2, segundo o documento M27-A3 do CLSI 2008a. Tabela 2 – Padrões de corte para definição de sensível, sensível dose dependente e resistente segundo o protocolo M27-A3 � � � Susceptibilidade Antifúngicos - CIMs (μg/ml) Itraconazol Fluconazol Cetoconazol Anfotericina B* Sensível � 0,125 � 8 � 0,125 <1 SDD 0,25 e 0,5 16 e 32 0,25 e 0,5 _ Resistente � 1 �64 � 1 � 1 SDD – sensível dose-dependente. μg/ml – micrograma por mililitro � – menor ou igual a � – maior ou igual a * Anfotericina B não possui pontos de corte pelo documento CLSI, 2008. Será utilizado o critério de susceptibilidade segundo estudo de Klein; Ribeiro, 2006. � 4.4.3 Método de microdiluição para fungos filamentosos O documento M38-A2 (CLSI, 2008b) foi utilizado como ferramenta metodológica de investigação da susceptibilidade antifúngica. Após crescimento fúngico em ágar batata- dextrose (OXOID ®) por 7 dias para a maioria das espécies e para Fusarium sp, a incubação ocorreu de 48 a 72 horas, a 35° C, e, depois, até o sétimo dia, a temperatura de 25 a 28°C. Cobriu-se cada colônia com 1 mL de solução salina estéril 0,85% e uma suspensão foi preparada com movimentos delicados sobre a cultura (capela de Segurança biológica II- Pachane-Pa40). Para os inóculos de Aspergillus sp, adicionou-se subsequentemente uma gota (0,01mL) de Tween 20. Após deposição das partículas mais pesadas no fundo do tubo (5 minutos), o sobrenadante foi transferido para um tubo estéril e mantido sob agitação constante por 15 segundos. As amostras foram ajustadas em espectrofotômetro (530 nm) e densidade de 0,09 a 0,11(transmitância de 80-82%) para espécies de Aspergillus e S. schenckii e de 0,15 a 0,17 (transmitância de 68-70%) para as espécies de Fusarium, P. boydii e R. arrhizus (inóculo de 0,4 x 104 a 5 x 104 UFC/mL). Submeteu-se este inóculo às placas de microdiluição com incubação a 35°C de 46 a 50 horas. A leitura foi feita visualmente e os padrões de corte para itraconazol e anfotericina B foram definidos de acordo com Espinel-Ingroff et al. (2007) como demonstrado na Tabela 3. Tabela 3 – Valores de ponto de corte sugeridos para interpretação de testes de susceptibilidade de filamentosos Susceptibilidade Antifúngicos - CIMs (μg/ml) ��� � Itraconazol Anfotericina B Sensível � 1 � 1 SDD 2 2 Resistente �4 �4 SDD – sensível dose-dependente. μg/ml – micrograma por mililitro � – menor ou igual a � – maior ou igual a 4.5 BIOLOGIA MOLECULAR Para avaliação da ocorrência de clones, dentro do grupo de leveduras, a técnica de RAPD foi utilizada segundo protocolo descrito por Mariano et al. (2003) com adaptações. 4.5.1 Extração do DNA genômico para leveduras Uma colônia isolada de cada espécie leveduriforme foi semeada em placa de ágar Sabouraud Dextrose e incubada por até 96 horas a 30ºC e a extração de DNA ocorreu segundo protocolo de Bolano et al. (2001) com adaptações. Todas as colônias foram transferidas para um tubo de microcentrífuga de 2 ml, contendo 500 μl de tampão de lise TENTS e em seguida, adicionou-se um volume de aproximadamente 200 μl de pérolas de vidro (2 mm de diâmetro) e posteriormente foi acrescentado 500 μl de fenol e 500 μl de clorofórmio, respectivamente. Os tubos foram agitados em vórtex por 2 minutos para a obtenção de uma solução homogênea, e, em seguida, centrifugados a 13.000 rpm por 15 minutos em temperatura ambiente. Transferiu-se a fase superior a um novo tubo (2 ml), sendo adicionado 500 μl de etanol 100% (Merck gelado a - 20ºC). O DNA foi precipitado a -20ºC overnight, com posterior centrifugação a 13.000 rpm por 15 minutos (temperatura ambiente). Após descarte do sobrenadante, o sedimento foi suspenso em 500 μl do tampão TE com RNAse A (Fermentas; 10 mg/ml) e incubado a 37ºC por 30 minutos em banho-maria (B.M. EV: 015). Procedeu-se com adição de 500 μl de fenol e 500 μl de clorofórmio, respectivamente. Nova centrifugação, a fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo (1,5 ml) previamente identificado e adicionado 20 μl de NaCl (5M), seguido por 500 μl ��� � de etanol 100% (Merck gelado a -20ºC). O DNA foi precipitado a -20ºC por uma hora. Seguiu-se ao processo de centrifugação, onde o sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado com 500 μl de etanol 70% (Merck gelado a -20ºC) centrifugado a 13.000 rpm por 15 minutos e após a remoção do sobrenadante, o sedimento foi ressuspenso em 40 μl de tampão (TE). Para analisar a pureza do DNA, foi utilizado espectrofotômetro com comprimento de onda 260/280 nm (Biophotometer Eppendorf). 4.5.2 Técnica de RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA Para investigação dos polimorfismos, utilizou-se o iniciador constituído pela sequência é 5'-GATCAAGTCC-3', segundo Mariano et al. (2003) com adaptações. Do total de DNA, 40ng foi adicionado a 25μl da reação contendo 12,7μl de água Milli Q; 2,5μl do tampão KCL; 4ul de dNTP mix (1,25mM de cada dNTP); 3,5 de MgCl2 a 25 mM; 0,5μl (50pmol) de primer B14; 0,13 μl de Tween 20 e 1 unidade de Taq DNA Polymerase (Fermentas) e 1μl de DNA (40ng) foi usado na reação para cada amostra. O programa de amplificação das amostras seguiu-se com desnaturação a 94ºC por 1 minuto, 45 ciclos sendo 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 40ºC; 2 minutos a 72ºC, uma extensão final de 10 minutos a 72ºC. - Termociclador Bio Rad T 100TM Termo Cycler. Os produtos foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TBE 1x, por 30 minutos a 100V e 150 minutos a 50V, corados com 2μl de brometo de etídio e comparados com o marcador molecular de bandas DNA Ladder de 1 Kb. Uma amostra de Saccharomyces cerevisae foi utilizada como controle externo. 4.5.2.1 Interpretação dos dados de polimorfismos gerados pelo RAPD As bandas de DNA foram visualizadas sob iluminação UV e a imagem do gel capturada pelo aparelho L-PIX – Loccus biotecnologia Molecular Imaging-Transilliminator. Os perfis obtidos para cada isolado foram comparados visualmente e analisados por dendrogramas pelo programa GEL COMPAR II versão 6.6 Bionumerics (Apllied Maths, Kortrijk, Bélgica) de acordo com a similaridade de bandas. O Dice metric foi o método ��� � estatístico escolhido para calcular a similaridade dos coeficientes de pares de amostras. Dendrogramas baseados numa matriz de distância de pares de DNA foram geradas pelo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method, Arithematic averages) considerando uma tolerância de 2% para comparação das bandas (SOLL, 2000). As amostras foram classificadas como idênticas (correlação de 100% de similaridade), altamente relacionadas (90%), moderadamente relacionadas (80%) e amostras não relacionadas (<70%) (SOLL, 2000). 4.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS As análises estatísticas seguiram os testes qui-quadrado de Pearson; qui quadrado da distância de Hellinger, qui-quadrado da razão de máxima verossimilhança e teste de Fisher dependendo da necessidade de cada um para conclusão. Quando p � 0,05 foi considerada evidência de diferença estatística. � ��� � RESULTADOS E DISCUSSÕES 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS E FÍSICO-QUÍMICOS VERSUS FUNGOS ��� � O encontro de fungos em água potável tem aumentado cada vez mais e chamado atenção dos consumidores, entretanto ainda não existem protocolos que avaliem níveis de esporos fúngicos em água para consumo humano (HAGESKAL, et al., 2008). Na presente investigação foi possível observar que a contaminação fúngica ocorreu para a maioria das amostras investigadas (80%), oriundas de soluções alternativas coletivas e individuais. A análise parcial segundo origem – poços regulares e irregulares - revelou valores percentuais altos quanto à positividade de isolamento fúngico: 41 (78,84%) aos poços regulares e 87(81,30%) aos irregulares, como demonstrados no Gráfico 1. Gráfico 1 - Percentual de águas contaminadas segundo a origem A localização dos poços regulares e irregulares com e sem crescimento fúngico é demonstrada nas Figuras 3 e 4, respectivamente. 78,84% 81,30% 21,16% 18,70% 0,00% 10,00% 20,00% 30,00% 40,00% 50,00% 60,00% 70,00% 80,00% 90,00% Poços Regulares Poços Irregulares P er ce nt ua l d e ág ua s co nt am in ad as Positivos Negativos � F ig ur a 3 - R ep re se nt aç ão g rá fi ca d a di st ri bu iç po si ti vi da de /n eg at iv id ad e de is ol am en to f ún gi F on te : P re fe it ur a M un ic ip alçã o de p oç os d e ág ua r eg ul ar es d e Sã o Jo sé d o R io P re to e id en t ic o l d e Sã o Jo sé d o R io P re to . �� � tif ic aç ão q ua nt o à � Figura 4 - Representação g Rio Preto e identificação qu Fonte: Prefeitura Mu gráfica da distribuição de poços de água irregu uanto à positividade/negatividade de isolamen unicipal de São José do Rio Preto. ��� ulares de São José do nto fúngico ��� � O controle do crescimento microbiano em sistemas de distribuição de água é essencial para limitar a disseminação de patógenos de veiculação hídrica. Embora, existam protocolos de políticas governamentais sobre abertura e supervisão de poços de água, a análise de fungos na água não é contemplada por nenhum deles. A detecção de fungos oportunistas ou patógenos primários em água nesta pesquisa, independente da origem, regular ou irregular, ressalta a importância da implantação de novas medidas de controle microbiológico da água de consumo humano. De fato, apesar de poços regulares receberem supervisão periódica quanto à qualidade física e química da água, fica evidente que os parâmetros microbiológicos de qualidade de água não são satisfatórios, uma vez que os fungos ocorreram de modo significativo. Embora sejam escassos os estudos epidemiológicos que documentem a ligação direta de doenças com sistemas de distribuição de água, os patógenos de veiculação hídrica são capazes de persistirem e reproduzirem neste nicho levando a ocorrência de infecções no trato gastrointestinal, pele, etc. (SZEQZYK, et al., 2000). Os dados da presente investigação apoiam esta afirmativa, uma vez que diversas espécies fúngicas (42 espécies), algumas patogênicas clássicas, foram prevalentes em diversas amostras de água como demonstrado na Tabela 4. É possível verificar a presença de 6 isolados leveduriformes e 47 filamentosos para poços regulares e 38 leveduras e 127 filamentosos para irregulares. � � � Tabela 4 - Distribuição de espécies fúngicas segundo origem da água Espécies e gêneros identificados n (%) Poços regulares (%) Poço irregular (%) Absidia sp 1 (0,45) - 1 (0,60) Acremonium hyalinum 8 (3,66) 4 (7,54%) 4 (2,42) Acremonium potronii 1 (0,45) - 1 (0,60)� Alternaria sp 1 (0,45) - 1 (0,60)� Aspergillus caesiellus 2 (0,91%) 1 (1,88) 1 (0,60)� Aspergillus candidus 1 (0,45) - 1 (0,60)� Aspergillus clavatus 2 (0,91%) - 2 (1,21) Aspergillus flavus 4 (1,83) 1 (1,88) 3 (1,81) Aspergillus fumigatus 49 (22,47%) 28 (52,83) 21 (12,72) Aspergillus japonicus 6 (2,75) 2 (3,77) 4 (2,42) Aspergillus penicillioides 8 (3,66) 3 (5,66) 5 (3,03) Aspergillus versicolor 1 (0,45) - 1 (0,60) Aureobasidium pullulans 8 (3,66) 1 (1,88) 7 (4,24) Basidiobolus sp 5 (2,29) - 5 (3,03) Blastoschizomyces capitatus 1 (0,45) 1 (1,88) - Candida famata 2 (0,91%)� - 2 (1,21)� Candida glabrata 2 (0,91%)� - 2 (1,21)� Candida guilliermondii 8 (3,66) 3 (5,66) 5 (3,03) Candida intermedia 4 (1,83) - 4 (2,42) Candida lusitaneae 2 (0,91%) - 2 (1,21) � Candida parapsilosis 3 (1,37) 1 (1,88) 2 (1,21)� Candida silvicola 1 (0,45) - 1 (0,60) Candida tropicalis 3 (1,37) - 3 (1,81)� Curvularia sp 4 (1,83) 1 (1,88) 3 (1,81)� Fusarium sacchari 1 (0,45) - 1 (0,60)� Fusarium hyalinum 1 (0,45) - 1 (0,60)� � � � Continuação da Tabela 4 - Distribuição de espécies fúngicas segundo origem da água Espécies e gêneros identificados n (%) Poços regulares (%) Poço irregular (%) Fusarium incarnatum 7 (3,21) 1 (1,88) 6 (3,63) Fusarium solani 1 (0,45) - 1 (0,60)� Kodamae ohmeri 1 (0,45) - 1 (0,60)� Micélio estéril 13 (5,96) 2 (3,77) 11 (6,66) Mucor sp 1 (0,45) - 1 (0,60)� Paecilomyces marquandii 2 (0,91%) 1 (1,88) 1 (0,60)� Penicillium citrinum 4 (1,83) - 4 (2,42) Penicillium commune 19 (8,71%) - 19 (11,5) Penicillium decumbens 8 (3,66) - 8 (4,84) Penicillium expansum 7 (3,21) 1 (1,88) 6 (3,63) Penicillium lilacinus 1 (0,45) - 1 (0,60) Penicillium marneffei 2 (0,91%) 2 (3,77) - Penicillium purpurogenum 3 (1,37) - 3 (1,81) Penicillium spinulosum 4 (1,83) - 4 (2,42) Penicillium verruculosum 1 (0,45) - 1 (0,60)� Rhodotorula glutinis 1 (0,45) - 1 (0,60)� Rhodotorula minuta 1 (0,45) - 1 (0,60)� Scedosporium apiospermum 1 (0,45) - 1 (0,60)� Scedosporium dehoogii 1 (0,45) - 1 (0,60) Scytalidium hyalinum 3 (1,37) - 3 (1,81) Trichoderma sp 1 (0,45) - 1 (0,60) Trichosporon asahii 4 (1,83) - 4 (2,42) Trichosporon mucoides 2 (0,91%) - 2 (1,21) Zygosaccharomyces sp 1 (0,45) - 1 (0,60) Total 218 53 165 ��� � O encontro de fungos em água foi demonstrado previamente por outros estudos cuja origem das amostras foi variável: bebedouros, água de hemodiálises, de instalações hospitalares, potável e de esgoto doméstico (HAGESKAL, et al., 2006, LEAL et al., 2010, PIRES-GONÇALVES, et al., 2008; SESSEGOLO et al., 2011; VARO et al., 2007). Corroborando com estes dados, a detecção de espécies de fungo nas águas localizadas superficialmente nos poços pode estar relacionada com fontes externas de contaminação, como ar, insetos, solo e até ao inadequado estado de conservação dos sistemas de canalização que chegam ao consumidor final (COSTA, 2010). A persistência e crescimento de patógenos na água é uma preocupação central em sistemas de distribuição de água. Por exemplo, as espécies de Aspergillus e Penicillium, fungos prevalentes nesta investigação independente de sua origem, já foram previamente descritas em estudos de caracterização fenotípica e genotípica, revelando alto potencial patogênico (REMENTERIA et al., 2005). Ainda, ponderada a espécie mais comum, Aspergillus fumigatus, uma ampla variedade de doenças podem concorrer: micotoxicose, reações alérgicas e doenças sistêmicas com altas taxas de mortalidade (CÁRDENAS; CORTES; PARRA, 2008; REICHENBERGER, et al., 2002; VOJDANI et al., 2003). Portanto, fica explicita a necessidade de revisão dos documentos formais sobre qualidade microbiológica da água, sugerindo a inclusão de métodos diagnósticos para fungos. Adicionalmente, nova atenção deve ser dada para elevado número de espécies de Penicillium isoladas no estudo atual (9), representada como prevalente: Penicillium commune, em águas de poços irregulares. No trabalho de Hageskal, et al. (2006), Penicillium sp representou o grupo dominante em água, com destaque à habilidade para formação de biofilme, evento descrito previamente por Doggett et al. (2000). É conhecido que fungos do gênero Aspergillus possuam maior adaptação aos ambientes de alta umidade, e ao Penicillium, a capacidade de sobreviver em águas tratadas (SAMSON; HOEKSTRA; FRISVAD; 2000). Aí permanecendo, aumentam a chance para formação de biofilme, e consequentemente, a sua manutenção em superfícies inertes. Embora neste estudo, Penicillium commune, tenha sido segunda espécie de maior ocorrência (poços irregulares), não há relatos na literatura de isolados desta espécie em água de consumo humano. Nesta pesquisa, não menos importante, a distribuição de outras espécies de fungos filamentosos em águas, não exclui sua participação como potencial etiologia das doenças infecciosas em humanos e animais, evento também descrito nos estudos de Leal et al. (2010), Pereira et al. (2010) e Quadros et al. (2009). Assim, tanto para poços cadastrados ou não, ��� � espécies ubíquas de água, ar, solo etc. foram aqui reveladas: Aspergillus flavus, Aspergillus japonicus, Curvularia sp, Alternaria sp, Acremonium sp, Fusarium sp, Paecilomyces sp Penicillium expansum e Micélio estéril. Além disso, fontes hídricas, de proximidade aos diferentes nichos ecológicos contaminados, podem receber propágulos fúngicos dispersos por vetores, como insetos ou outros animais (ANAISSIE et al., 2003; HAGESKAL; LIMA; SKAAR, 2009; LACAZ et al., 2002; MENEZES; CARVALHO; TRINDADE, 2006; VECCHIA; CASTILHO-FORTES, 2007). Embora, em episódios menores, a diversidade de espécies de leveduras, aqui observada, corrobora com dados obtidos por pesquisadores europeus. Estas investigações comprovaram que diversas fontes de água na França, de origem potável clorada, apresentaram mais de 50% de leveduras, com destaque ao gênero Candida (HINZELIN; BLOCK, 1985). Ainda que os estudos de Costa (2010) e Figel et al. (2011) tenham sido conduzidos de origem hídrica distinta, os valores percentuais de isolamento de leveduras foram semelhantes aos da pesquisa atual. Mesmo assim, destaca-se pelo presente estudo que a água dos poços cadastrados e não cadastrados apresentaram positividade para fungos filamentosos e leveduras: 39 e 4 aos primeiros e 80 e 27 aos últimos, respectivamente. A detecção de Aureobasidium pullulans em água de ambos os poços, corrobora com o resultado do estudo de Costa (2010). Comprova-se ainda, pelo estudo de Rosenzweig, Minnigh, Pipes (1983, 1986) que algumas espécies de leveduras apresentam relativa resistência à inativação e sobrevivência frente ao cloro. Esta sobrevivência pode levar a acumulação em sistemas de distribuição de água. Esta espécie fúngica é encontrada em diversos nichos ambientais, o que favorece seu achado em fontes hídricas (ANDERSEN et al., 2011). Paralelamente, frente à espécie C. guilliermondii, descrita previamente a partir de água potável de creches e asilos (NUNZIO; YAMAGUCHI; 2010), no atual estudo, este achado foi comum, independente de sua origem, o que revela potencial risco à saúde. Dessa forma, pode- se perceber a presença destes fungos na água de diversas origens. A tabela 5 demonstra o número de coletas segundo tipo de água, poços, pontos de coleta e positividade de crescimento fúngico. ��� � Tabela 5 - Tipo de água segundo origem, poços, pontos de coleta e crescimento fúngico SAC SAI PR PI PR PI PC CA DP PC CA DP PC CA DP PC CA DP Número de amostras coletadas 36 15 0 16 54 1 1 0 0 31 5 0 Amostras com crescimento fúngico 27 13 0 15 43 1 1 0 0 24 4 0 SAC: Solução Alternativa Coletiva; SAI: Solução Alternativa Individual; PR: poços regulares; PI: poços irregulares; PC: ponto de consumo; CA: cavalete; DP: direto do poço Águas de solução alternativa coletiva (SAC) e individual (SAI) apresentam-se como potencial fonte de aquisição e disseminação de fungos para população, Tabela 5. Se irregulares, as instalações, muitas vezes são precárias, a inexistência de protocolos de manutenção e o manuseio dos reservatórios perante os responsáveis (BRASIL, 2004a; BRASIL, 2005), aumentam a contaminação. No entanto, valoriza-se a maior distribuição de fungos quando as amostras de água foram originárias de pontos de consumo e cavaletes. Na atual investigação, a presença de Aspergillus fumigatus, foi maior em águas de poços regulares ou irregulares nos SACs (p=0,02), e para A. pullulans de mesma origem, porém somente aos irregulares (p=0,043). Em relação a SAI, essa forma de abastecimento, na maioria das vezes, pode apresentar risco à saúde da população que consome esta água, dado a ausência de um responsável técnico e de controle de qualidade da mesma (SILVA, 2009). Aqui, as leveduras representaram grupo microbiano prevalente nesses sistemas (p=0,05) em ambos os poços. Considerado o trajeto de distribuição de água a partir de poços (SAC e SAI), seguem os reservatórios, torneiras e até cavaletes. De fato, os micro-organismos presentes em água de poços ou nos reservatórios, contaminam a tubulação, chegando imprópria para o consumo nos cavaletes dos domicílios (LEAL, et al., 2010; SESSEGOLO, et al., 2011). Diferença estatística significante (p=0,042) foi observada para C. guilliermondii, sendo que sua presença marcante ocorreu no ponto de consumo de ambos os poços. Já, para A. fumigatus (poço irregular), seu isolamento foi determinante em cavaletes (p=0,037). Os fungos presentes no solo e no ar podem entrar em contato com a água de poços durante sua construção, quando elaborada sem critérios técnicos (MACHADO, 2006). Não somente esta etapa seja crítica, mas as torneiras ou cavaletes contaminados com micro-organismos podem constituir-se como fonte de doença infecciosa ou intoxicação. ��� � Reitera-se a afirmativa de que, a limpeza contínua dos pontos de consumo, como torneiras e chuveiros, deva compor a rotina de higienização doméstica, evitando assim o estabelecimento e formação de biofilme. Verifica-se que a ocorrência de fungos em vários locais, pois estes no decurso da evolução foram capazes de explorar uma grande variedade de habitats. Espécies diferentes, portanto, exigem diferentes condições de crescimento ideal. O modo como os fatores físicos e químicos afetam o crescimento de fungos diferentes tem que ser considerado. A temperatura, a concentração de íons de hidrogénio (pH), a umidade e a luz são alguns dos parâmetros que têm de ser mantidos e controlados (CARLILE, WATKISON; GOODAY, 2001; CHANG; MILES, 2004). A Tabela 6 demonstra o número de amostras dos padrões físico-químicos dentro e fora dos limites estabelecido pela Portaria nº 2.914/11 e o crescimento fúngico quando os valores apresentaram-se dentro do limite. Os correspondentes valores de cada variável estudada estão presentes nos Anexos 1 e 2. Tabela 6 - Padrões físico-químicos e crescimento fúngico em amostras com valores dentro do limite estabelecido pela Portaria nº 2.914/11 Padrões físico- químicos Amostras fora do limite PR PI � Amostras dentro do limite PR PI Crescimento fúngico em amostras dentro do limite PR PI pH 2 0 50 107 39 87 Cor 6 26 46 81 36 69 Turbidez 3 4 49 103 39 84 Nitrato 8 5 44 102 34 83 Cloro 26 107 26 0 20 0 PR: poços regulares, PI: poços irregulares É provável que sendo satisfeitos os requisitos nutricionais, a maioria dos fungos se desenvolva bem numa ampla gama de pH desde ácido até à neutralidade, por exemplo, pH 4- 7. Alguns fungos, tais como os que produzem ácidos orgânicos, são capazes de tolerar mais condições de acidez (CARLILE, WATKISON; GOODAY, 2001; CHANG; MILES, 2004; KAVANAGH, 2005; LEONI, et al., 1999). Segundo a Portaria nº 2.914/11 do Ministério da Saúde sobre parâmetros de qualidade de água de consumo humano a concentração hidrogeniônica (pH) deve estar nos limites de 6 a ��� � 9,5. No presente estudo, à exceção de apenas 2 amostras de poços regulares com pH fora do limite, a maioria apresenta crescimento fúngico, fato observado para as demais amostras dentro dos limites. A dissolução de substâncias na água, principalmente de matéria orgânica é considerada outro parâmetro de qualidade da água com critérios estabelecidos pela Portaria nº 2.914 do Ministério da Saúde. De acordo com este documento, o valor máximo permitido de cor na água é de 15,0 mg Pt-Co/L (Miligramas de Platino-Cobalto por Litro). Paralelamente, a turbidez, parâmetro de aspecto estético de aceitação ou rejeição do produto, é a medição de resistência da água a passagem de luz provocada pela presença de partículas em suspensão na água, cujo valor máximo permitido é de 5,0 UT. Tanto para cor quanto turbidez (Tabela 6), a maioria, dentro dos limites permitidos pela Portaria, independente da origem (regulares ou irregulares), apresentou crescimento fúngico. Mais uma vez adverte-se para a necessidade de criar inspeção periódica junto aos programas municipais ou estaduais no que tangue a avaliação de águas de poços privados ou públicos. Ainda, a tubulação também pode interferir na alteração de cor e turbidez, sendo que, quando são liberados sais de ferro e manganês, estes são dissolvidos na água, elevando os valores destes parâmetros (BARCHA, 1998), o que traduz a falta de limpeza e manutenção dos poços (CASALI, 2008). A assimilação do nitrato pelos fungos é o principal processo pelo qual o nitrogênio inorgânico é convertido à forma orgânica (MADIGAN, et al, 2010; TRABULSI; ALTERTHUM, 2008). O aumento da concentração de nitrato em águas subterrâneas pode significar proximidade com áreas de lançamento de esgoto em locais onde há falta de saneamento básico, como no caso dos loteamentos clandestinos (LOPES; CAVASOTTO, 2011; PEREIRA-RAMIREZ, et al., 2003; SILVA, et al., 2009). Em área urbana o excesso de nitrato também pode estar vinculado as regiões antigas da cidade onde as tubulações são mais velhas e em locais densamente habitados (BARCHA, 1998). Na presente investigação, amostras de água de poços regulares e irregulares apresentam concentrações de nitrato fora do limite permitido, valor maior que 10mg/L, como demonstrado na Tabela 6. Diferenças estatísticas significantes (p=0,001) ocorreram para grupos de fungos leveduriformes em águas com padrões de nitrato acima do normal, evento esperado segundo características biológicas individuais. Aqui, também é possível observar crescimento fúngico mesmo com a maioria das amostras dentro do limite estabelecido pela Portaria. ��� � Em relação a cloração, esta é o método mais usado na desinfecção da água para consumo humano (LAURENT, 2005). No presente estudo, foi possível observar que metade das amostras dos poços regulares estava com o cloro fora do limite estabelecido pela Portaria, sendo que, a exceção de uma, todas estava com cloro abaixo do permitido. Frente à água coletada de poços irregulares, todas apresentavam concentração de cloro residual livre abaixo do limite estabelecido (Tabela 6). A comparação de poços regulares quanto à supervisão da qualidade de água, revela a necessidade de adoção de alternativas mais eficazes de controle microbiano, e aos irregulares, dada ao excedente número de isolamento fúngico, o conhecimento e instituição de práticas de desinfecção da água. Na água, sempre avaliado o tempo de exposição, componentes químicos (orgânicos, inorgânicos) e condições físicas (temperatura, pH, etc), interferem diretamente sobre o metabolismo das células microbianas (ROSENZWEIG; MINNIGH; PIPES, 1983; SAMMON et al., 2011). A sobrevivência microbiana está baseada na interação de uma ou mais variáveis acima citadas, e, além disso, tipo e concentração de substância antimicrobiana presente neste ambiente. Neste estudo, mesmo em água previamente tratada com cloro, alguns fungos filamentosos foram prevalentes sobre os demais, como demonstrados na Tabela 4. Aqui, conceitos biológicos devem ser considerados, explicitando a resistência e a sobrevivência fúngica: estabelecimento de biofilme, concomitante liberação de metabólitos secundários com ação inibitória para alguns e indutores de crescimento para outros, presença de fatores de virulência que favoreçam a presença de grupos individuais, etc.(HAGESKAL et al., 2006; PEREIRA, et al., 2013; PERKINS, et al., 2009). Corroborando com os estudos de Pereira et al. (2013), Rosenzweig, Minnigh e Pipes (1983), aqui também se comprova a maior resistência de A. fumigatus em água clorada, com diferença estatística significante (p=0,001). Assim, nesses estudos de Rosenzweig, Minnigh, Pipes (1983) e Pereira (2013), A. fumigatus foi capaz de sobreviver numa concentração de 1,9mg/l e 1mg/l de cloro durante 60 minutos, respectivamente. No presente estudo, frente à espécie P. commune (p=0,042) e aos grupos leveduriformes (p=0,006), a ação inibitória do cloro ficou evidente. Ressalta-se a importância da cloração monitorada, que em alguns casos pode ser eficaz (LEAL, et al., 2010). De todos os fatores que afetam o crescimento de fungos, a temperatura é certamente um dos mais importantes (COSTA, 2010). Os extremos de temperatura (máxima e mínima) são de grande relevância na determinação da sobrevivência e na distribuição das espécies de fungos na natureza. Temperaturas altas resultam numa inativação enzimática, com um efeito ��� � resultante sobre o metabolismo e, consequentemente, sobre o crescimento (KAVANAGH, 2005; INGERSON-MAHAR; REID; 2012). Evento observado na presente pesquisa revelou que as temperaturas obtidas garantem a presença e sobrevivência fúngica (Tabela 7). Tabela 7 - Média das temperaturas segundo origem dos poços Embora neste estudo, não foi realizada a identificação e contagem de bactérias, sua detecção ocorreu como demonstrado na Tabela 8. Nas 30 amostras que cresceram apenas grupos bacterianos, o crescimento fúngico poderia ter ocorrido, uma vez que a presença de vários organismos num mesmo local pode levar a alterações na taxa de crescimento para ambos devido à competição por nutrientes e condições físico-químicas ideais (MADIGAN, et al., 2010). Tabela 8 – Presença de bactérias e concomitância com fungos Amostras com crescimento bacteriano Amostras com crescimento bacteriano e fúngico Amostras apenas com crescimento bacteriano Poços regulares 32 22 10 Poços irregulares 105 85 20 Total 137 107 30 Neste sentido, quando se comparam poços positivos e negativos para isolamento fúngico, em concomitante análise para bactérias, observa-se que ocorre maior isolamento aos primeiros, quando da ausência de bactérias (p=0,042). Valorizando-se características biológicas individuais, fica explicito que a interferência acima descrita para algumas espécies microbiana é positiva e para outras, negativa. Aqui, A. fumigatus (ambos os poços) (p=0,001) e leveduras (ambos os poços) (p=0,005) foram isoladas preferencialmente em água sem grupos bacterianos. Já, P. commune (poços irregulares) foi comum em água positiva para bactérias (p=0,036). Novamente estima-se que metabólitos secundários de alguns micro- organismos potencializam o desenvolvimento de outros. Média das Temperaturas Poços regulares 27,2ºC Poços irregulares 26,31ºC ��� � Novamente, a falta de inspeção periódica da qualidade de água, bem como inexistência de protocolos de desinfecção, implica em sua maior contaminação. De fato, a falta de manutenção nos sistemas de distribuição e armazenamento de água aumenta os riscos de contaminação por substâncias que ficam suspensas na água, servindo de nutriente para diversos micro-organismos, como as bactérias (CASALI, 2008). Ainda, a composição química dos tubos que se constitui como canais de distribuição de água podem favorecer o desenvolvimento de grupos bacterianos, pois se os elementos ferro, hidrogênio e fosfatos forem liberados, há promoção do crescimento microbiano, diferentemente ocorre quando a tubulação é composta por cobre, inibindo o crescimento de bactérias (INGERSON-MAHAR; REID; 2012). Dado ao fato que as variações climáticas estejam fortemente associadas às comunidades de plantas, esta relação, muitas vezes, afeta a natural composição do solo: carbono, temperatura, água, etc.(KASPRZYK, 2008; WALDROP; FIRESTONE 2006). Assim como, as estações do ano também podem interferir na ocorrência de determinados grupos fúngicos. No presente estudo, as coletas foram feitas em diferentes estações do ano como demonstrado na Tabela 9. Tabela 9 - Coletas e positividade das amostras nas 4 estações do ano segundo origem dos poços Estações do ano Coletas PR PI Total Positividade para fungos PR PI Total Inverno 3 5 8 0 5 5 Outono 0 44 44 0 36 36 Primavera 27 18 45 21 14 35 Verão 22 40 62 20 32 52 PR: poços regulares, PI: poços irregulares Os resultados mostraram diferença estatística significante para os fungos filamentosos, no inverno (p=0,006). Dada à ampla ocorrência de fungos em diversos nichos ambientais, no inverno, o vento desempenha importante papel na dispersão de propágulos até as fontes de água (CASA; REIS; ZAMBOLIM, 2004). Embora, consideradas amostras de origem distinta, a detecção de fungos na água nos estudos de Sales et al. (2011) foi também maior no inverno. Paralelamente, alterações na biomassa microbiana podem surgir em períodos quentes e úmidos, favorecidas pela adaptação e reprodução de espécies fúngicas, e subsequente � � � dispersão dos mesmo até a água da superfície dos poços (GALLARDO; SCHLESINGER, 1990). Neste sentido, diferenças metabólicas individuais justificam sobrevivência de alguns grupos microbianos em detrimento de morte a outros. De fato, nos estudos conduzidos por Mezzari (2005), Lobato; Vargas e Silveira (2009) e aqui, algumas espécies de fungos filamentosos foram prevalentes no verão, com destaque para A. fumigatus (ambos os poços) (p=0,005) e Penicillium commune (poços irregulares) (p=0,007). Em relação aos fungos leveduriformes isolados de ambos os poços, o outono se destacou como estação de maior identidade com presença fúngica (p=0,007), dado discordante com alguns estudos (LEITE, 2009; LOBATO; VARGAS; SILVEIRA, 2009). Reforça-se aqui, que cada espécie apresenta variações metabólicas e fisiológicas facultando sua permanência e reprodução em diversos ambientes (FLORES; ONOFRE, 2010). Assim como as estações do ano, a umidade é um fator ambiental importante no desenvolvimento dos fungos, pois estes necessitam da água para germinação e esporulação (EMBRAPA, 2009). A Tabela 10 demonstra o número de coletas nos dias em que choveu e não choveu nas 24 horas antecedentes a coleta e a positividade das amostras. Comparados e analisados os parâmetros chuva versus espécie fúngica foi possível encontrar diferença estatística significante (p=0,04) para espécie A. fumigatus isolado de ambos os poços. Neste sentido, quando não choveu, diminuiu a frequência de isolamento deste fungo nas amostras de água de ambos os poços. De fato, de acordo com Samson; Hoekstra e Frisvad (2000), A. fumigatus possui maior adaptação para sobrevivência em ambientes de alta umidade. Quando os poços não são fechados corretamente, pode ocorrer da água da chuva entrar no poço trazendo organismos patogênicos e substâncias que favorecem o crescimento dos mesmos (FRANCO; BEUX, 2007). Tabela 10 - Chuvas nas 24 horas antecedentes a coleta e positividade das amostras Chuva nas 24 horas antecedente a coleta Coletas PR PI Total Amostras com crescimento fúngico PR PI Total Não choveu 30 90 120 23 71 94 Choveu 22 17 39 18 16 34 PR: poços regulares, PI: poços irregulares � � � 5.2 SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE FUNGOS LEVEDURIFORMES E FILAMENTOSOS O perfil de susceptibilidade antimicrobiana frente ao itraconazol, fluconazol, cetoconazol e anfotericina B das espécies de leveduras e de fungos filamentosos foi variável, sendo sensível, sensível dose dependente e resistente, dados apresentados na Tabela 11 e 12 e nos Anexos 3 ao 6. Tabela 11 - Perfil de susceptibilidade de leveduras de poços regulares e irregulares frente aos antifúngicos testados Antifúngicos Leveduras Itraconazol S SDD R Fluconazol S SDD R Cetoconazol S SDD R Anfotericina B S R Poços Regulares (n=6) C. guilliermondii (n=3) - - 3 2 1 - 3 - - 3 - Demais espécies (n=3) 3 - - 2 - 1 3 - - 3 - Poços Irregulares (n=38) A.pullulans (n=7) 7 - - 7 - - 7 - - 7 - C.guilliermondii (n=5) - - 5 5 - - 5 - - 5 - Demais espécies (n=26) 8 7 11 23 - 3 25 - 1 24 2 S: sensível; SDD: sensível dose-dependente; R: resistente De acordo com Castro et al. (2006), o itraconazol possui atividade contra muitas espécies de Candida. Entretanto, no presente estudo, o evento de resistência foi observado para todos os isolados de C. guilliermondii, independente da origem (regular ou irregular). Para regulares, as demais, A. pullulans, C. parapsilosis e B. capitatus apresentaram sensibilidade. Já, para as demais espécies dos poços irregulares 42,3% apresentaram isolados resistentes a este fármaco: C.lusitaneae (1), T.asahii (3), C. tropicalis (1), C.glabrata (1), R. minuta (1), T.mucoides (1), C. intermedia (2) e C. silvicola (1), com MICs entre 1 a >16μg/ml (Anexos 3 e 4). E em menor freqüência, foi observado o perfil de sensível dose dependência e sensibilidade: 26,93% e 30,77%, respectivamente. C. guilliermondii é uma das leveduras oportunistas mais frequentes em pacientes imunocomprometidos e com câncer (GIRMENIA, 2006), também isolada de água para ��� � consumo humano de creches e asilos (MACÊDO, et al., 2009; NUNZIO; YAMAGUCHI, 2010). Ponderada esta mesma espécie, o perfil de resistência, aqui revelado, difere de diversos estudos, embora com isolados clínicos Klein (2006), Moreira (2012) e Neufeld et al. (2009). A inexistência de relatos científicos sobre susceptibilidade de A. pullulans, a partir de fontes hídricas, obriga que um paralelo seja estabelecido, a partir de outras vias de aquisição. Assim, em sucos de fruta, ou isolados clínicos (onicomicose, fungemia), o fenótipo de sensibilidade ao itraconazol, foi comum (ARABATZIS, 2012; HAWKES, et al., 2005; MACIEL et al., 2013). Diferentemente, variações de susceptibilidade a este composto azólico foram descritos para isolados de C. lusitaniae, C. tropicalis, C. glabrata e R. minuta C. intermedia, T. mucoides e T. asahii a partir de fontes diversas (CHAGAS-NETO et al., 2009; COSTA, 2006; DIAS, et al., 2007; GARCÍA-MARTOS, et al. 2001; MACIEL, et al., 2013; NUNES, et al., 2011; SANTOS, et al., 2009). Dessa forma, pode-se observar que embora o itraconazol seja muito utilizado no controle de infecções fúngicas por ter baixa toxicidade e amplo espectro de ação, no presente estudo, valoriza-se a interpretação de susceptibilidade antimicrobiana desta espécie, dadas as mudanças aqui observadas (Tabela 11 e Anexos 3 e 4). O fluconazol constitue-se como fármaco de boa ação contra fungos oportunistas como C. neoformans e a maioria das espécies de Candida, embora relatos de resistência tenham sido descritos (ARAÚJO, et al., 2005; COLOMBO, et al., 2002; NOGUEIRA, 2012). Foi possível observar que o fenótipo de resistência ocorreu em menor frequência quando comparado ao itraconazol, independente da origem dos isolados. Em poços regulares, a exceção de um isolado B. capitatus (16,6%), o fenótipo sensível ao fluconazol ocorreu mojoritário. Aos irregulares, apenas 7,89% espécies foram resistentes: R. minuta (1), T. mucoides (1), C. intermedia (1). A atual pesquisa corrobora com dados da literatura científica segundo baixa frequência de resistência para maioria das espécies aqui encontradas (COLOMBO, et al. 2002; HAWKES, et al. 2005; LIMA, et al., 2009; MANZANO-GAYOSSO, et al., 2011. WINGETER, et al. 2007). À exceção de C. intermedia, ressalta-se, aqui em concordância com a literatura científica, a diversidade de espécies fúngicas e padrões de susceptibilidade antimicrobianos mais comuns, e sua participação como etiologia de muitas doenças fúngicas oportunistas (GARCÍA-MARTOS, et al., 2001; JAWETZ; MELNCICK; ADELBERG, 2009; ��� � JUNQUEIRA, et al., 2012; LACAZ, et al., 2002; MACIEL, et al., 2013; NETTLES, et al., 2003; RUAN, et al., 2010; SANCAK, et al., 2009). Em relação a T. mucoides, causador de pneumonias e infecções superficiais (JAWETZ; MELNCICK; ADELBERG, 2009), resultados contrários ao do presente estudo foram encontrados nos trabalhos de García-Martos et al. (2001) e Nettles et al. (2003), entretanto, para Rhodotorula minuta que está associada a diversos tipos de infecções, em particular as micoses oculares, o perfil de resistência frente ao fluconazol é considerado um evento comum, corroborando com a atual investigação (GALAN-SÁNCHEZ, et al., 1999; GARCÍA-MARTOS, et al., 2001; LACAZ, et al., 2002). Cetoconazol apresenta amplo espectro de atividade frente a diversas espécies de Candida, sendo os casos de resistência raros (BRITO, et al., 2009; MANZANO-GAYOSSO, et al., 2011). De acordo com alguns estudos (BRITO, et al., 2011, MANZANO-GAYOSSO, et al., 2011; SANTOS, et al., 2009) pode se observar, aqui, à exceção de 1(2,27%) isolado de T. mucoides (de poço irregular) que a atividade antimicrobiana deste imidazólico foi eficaz contra todas as leveduras, independente da origem. Em relação ao poliênico anfotericina B, na atual pesquisa, apenas 2(4,54%) espécies originárias de poços irregulares foram resistentes: T. mucoide e Rhodotorula minuta.� Independentemente da espécie, o raro fenótipo de resistência foi previamente descrito por outros investigadores (ANTUNES, et al., 2004; ARABATZIS, 2012; BATISTA, BIRMAN; CURY, 1999; CASTRO et al., 2006; GOMES, et al., 2010; MACIEL, et al., 2013; MENEZES, MENDES, CUNHA, 2009; WINGETER, et al., 2007). Em relação aos fungos filamentosos, a condução terapêutica preferencial é ou itraconazol ou anfotericina B, embora constatada a presença de cepas resistentes a estes fármacos (MELLADO; CUENCA-ESTRELLA; RODRÍGUEZ-TUDELA, 2002; MOSQUERA; DENNING, 2002). A Tabela 12 e os Anexos 5 e 6 demonstram os resultados do perfil de susceptibilidade de fungos filamentosos frente aos antifúngicos testados. ��� � Tabela 12 - Perfil de susceptibilidade de filamentosos de poços regulares e irregulares frente aos antifúngicos testados Antifúngicos Filamentosos Itraconazol S SDD R Anfotericina B S SDD R Poços Regulares (n=39) A. fumigatus (n=28) 8 13 7 28 - - Demais espécies (n=11) 5 3 3 5 2 4 Poços Irregulares (n=101) A.fumigatus (n=21) 7 8 6 21 - - P. commune (n=17) 2 5 10 7 2 8 Demais espécies (n=63) 19 13 31 42 4