RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/03/2020. UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Laura Andrea González Maldonado Eferocitose de células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço por macrófagos: influência da galanina, dos produtos solúveis secretados por células tumorais e do fenótipo dos macrófagos Araraquara 2018 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Laura Andrea González Maldonado Eferocitose de células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço por macrófagos: influência da galanina, dos produtos solúveis secretados por células tumorais e do fenótipo dos macrófagos Dissertação apresentada ao programa de Pós- Graduação em Odontologia, Área de Periodontia, da Faculdade de Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para obtenção do título de Mestre em Odontologia. Orientador: Prof. Dr. Carlos Rossa Jr Coorientadora: Profa. Dra. Morgana Rodrigues Guimarães Stabili Araraquara 2018 González Maldonado, Laura Andrea Eferocitose de células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço por macrófagos: influência da galanina, dos produtos solúveis secretados por células tumorais e do fenótipo dos macrófagos / Laura Andrea González Maldonado. – Araraquara: [s.n.], 2018 58 f.; 30 cm Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientador: Prof. Dr. Carlos Rossa Jr Coorientadora: Profa. Dra. Morgana Rodrigues Guimarães Stabili 1. Neoplasias bucais 2. Macrófagos 3. Fagocitose 4.Galanina I. Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C.C. Montagnoli, CRB-8/5646 Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Laura Andrea González Maldonado Eferocitose de células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço por macrófagos: influência da galanina, dos produtos solúveis secretados por células tumorais e do fenótipo dos macrófagos Comissão julgadora Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Odontologia Presidente e orientador: Prof. Dr. Carlos Rossa Jr 2º Examinador: Profa. Dra. Alexandra Ivo de Medeiros 3º Examinador: Prof. Dr. Ricardo Della Coletta Araraquara, 28 de março de 2018. DADOS CURRICULARES Laura Andrea González Maldonado NASCIMENTO: 13.02.1990 – Armenia – Quindio – Colômbia FILIAÇÃO: Elsa Clara Maldonado Rodríguez Jorge Iván González Vargas 2008 – 2014: Curso de Graduação Facultad de Odontologia – Universidad Nacional de Colombia 2016 – 2018: Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Periodontia Nível: Mestrado Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP Dedicado a mi abuelita Mari Vargas Motta de González AGRADECIMENTOS À CAPES, pelo apoio financeiro durante a realização do Mestrado. González-Maldonado LA. Eferocitose de células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço por macrófagos: influência da galanina, dos produtos solúveis secretados por células tumorais e do fenótipo dos macrófagos [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2018. RESUMO Os macrófagos representam uma das principais pontes entre imunidade inata e adaptativa e estão presentes em grande número tanto no estroma circundando tumores sólidos quanto no interior da massa tumoral (TAMs, tumor-associated macrophages), onde podem representar até 50% da massa da lesão. Nos carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço (HNSCC), TAMs apresentam predominantemente o perfil M2 (pró-tumoral), e a quantidade de TAMs é inversamente relacionada ao prognóstico. A efetividade do tratamento não-cirúrgico (quimio/radioterapia ou imunoterapia) dos tumores sólidos é diretamente relacionada à indução de morte das células neoplásicas. No processo de reparo, as células apoptóticas são removidas por fagocitose por outros tipos celulares, num processo denominado eferocitose. Embora seja um processo importante para o reparo e homeostasia tecidual, a eferocitose pode afetar o fenótipo dos macrófagos, favorecendo a polarização para o perfil M2, associado à progressão de HNSCC. A galanina é um peptídeo de 29 aminoácidos amplamente distribuída no organismo e com amplo espectro de efeitos biológicos. A expressão constitutiva de galanina por células de OSCC está associada à maior agressividade do tumor e tem sido estudado como marcador prognóstico de agressividade do tumor e também como um possível alvo terapêutico de HNSCC. O objetivo do presente trabalho é determinar a influência dos produtos secretados pelas células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, bem como da galanina isoladamente, no fenótipo de macrófagos e atividade de eferocitose. Para determinar a influência dos produtos secretados no perfil fenotípico dos macrófagos por células tumorais (independentemente do contato direto célula:célula) e da galanina, as células foram tratadas com meio condicionado (CM) contendo os produtos secretados das linhagens tumorais UM-SCC-1 e UM-SCC-22B. Adicionalmente, para avaliar efeito do contato célula:célula e dos produtos secretados sobre a expressão gênica e na eferocitose dos macrófagos ‘pré-polarizados’ em M1 ou M2, foi realizada a co-cultura com as linhagens celulares tumorais apoptóticas UM-SCC-1 e UM-SCC-22B. O perfil fenotípico (M1/M2) foi determinado por RT-qPCR e a modulação na eferocitose dos macrófagos pela citometria de fluxo e microscopia de fluorescência. Os produtos secretados pelas células tumorais, assim como o contato direto célula:célula influenciam a expressão de TNF e IL10 em macrófagos, com aumento significativo da expressão global de TNF e IL10 em co-culturas de macrófagos com as linhagens tumorais UM-SCC-1 e UM-SCC-22B (P<0.05). Por outro lado, o pré- condicionamento dos macrófagos com produtos solúveis das células tumorais antes da co- cultura (contato célula:célula) levou à uma diminuição da expressão de TNF e IL10 (sem diferença significativa com os macrófagos M0). Na eferocitose, os macrófagos polarizados para o perfil M2 apresentaram uma maior atividade da eferocitose de células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço do que macrófagos polarizados para o perfil M1 (31.38% de macrófagos M2 eferocitóticos versus 15,90% para macrófagos M1em co-cultura com çélulas UM-SCC-1, P<0.05). Adicionalmente, verificou-se que a eferocitose de células tumorais influencia o fenótipo dos macrófagos. Palavras-chave: Neoplasias bucais. Macrófagos. Fagocitose. Galanina. González-Maldonado LA. Efferocytosis of squamous cell carcinoma cells by macrophages: influence of galanin, tumor cell-secreted soluble products and phenotype [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2018. ABSTRACT Macrophages are a major link between innate and adaptive immunity and are present both in the surrounding stroma and within various solid tumors (when they are denominated tumor- associated macrophages, TAMs), where these cells may represent up to 50% of the tumor mass. In head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC), TAMs are predominantly of the M2 phenotype and the prognosis is inversely correlated with their abundance. The effectiveness of non-surgical treatment of solid tumors (chemotherapy/radiotherapy) is directly related to the induction of neoplasic cell death. In the repair process, apoptotic/dead cells must be removed by phagocytosis by other cell types (particularly macrophages), in a process called efferocytosis. Although this is a critical step in the repair and reestablishment of tissue homeostasis, efferocytosis itself may affect the phenotype of macrophages, skewing the cells towards an M2 phenotype, which is deemed as a 'pro-tumoral' phenotype. Galanin is a 29 aminoacid peptide of 29 produced by various cell types and with a broad spectrum of biological effects. The constitutive expression of galanin by head and neck cancer cells is associated with the increased of tumor aggressiveness and has been proposed as a biomarker of tumor aggressiveness and also as a possible therapeutic target in HNSCC. Thus, the goal of the present study was to determine the role of secreted products from head and neck cancer cells, and of galanin independently, on macrophage phenotype and efferocytosis. In order to determine the influence of secreted products from tumor cells and of galanin in the phenotypic profile of the macrophages (independent of cell-to-cell contact), the cells were treated with conditioned medium (CM) prepared from tumor cell lines UM-SCC- 1 and UM- SCC-22B. Furthermore, to evaluate the effect of cell-to-cell contact and secreted products on the gene expression and efferocytosis of 'pre-polarized' M1 or M2 macrophages, co-cultures with tumor cell lines UM-SCC-1 and UM-SCC-22B with UV-induced apoptosis were performed. The phenotypic profile (M1 / M2) was determined by RT-qPCR and eferocytosis was assessed by flow cytometry and fluorescence microscopy. Products secreted by tumor cells, as well as direct cell:cell contact influence the expression of TNF and IL10 in macrophages. Our results shows an increased expression of TNF and IL10 when macrophages were co-cultured with UM-SCC-1 and UM-SCC-22B tumor cells (P <0.05). However, when macrophages were pre-conditioned with soluble products of these tumor cell lines, there was a decrease in gene expression of TNF and IL10 (without significant difference versus M0 macrophages). M2 macrophages (31.38%) were more effective in the efferocytosis of head and neck squamous cell carcinoma cells than M1 macrophages (31.38% of efferocytotic M2 macrophages versus 15,90% of M1 macrophages for the UM-SCC-1 cell line, P< 0.05). In addition, it was observed that the efferocytosis of tumor cells influences the phenotype of the macrophages. Keywords: Mouth neoplasms. Macrophages. Phagocytosis. Galanin. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 7-AAD: 7-aminoactinomycin D APC: antigen-presenting cels (células apresentadoras de antígeno) ARG1: Arginase 1 cDNA: complementary deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico complementar) DNA: deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico) FBS: fetal bovine serum (soro fetal bovino ) HNC: head and neck cancer (câncer de cabeça e pescoço) HNSCC: head and neck squamous cell carcinomas (carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço) IGF-I: insulin-like growth factor-1 (fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1) IL10: interleukin-10 (interleucina-10) IL12: interleukin-12 (interleucina-12) IL1ra: interleukin-1 receptor antagonista (receptor antagonista da interleucina-1) IL23: interleukin-23 (interleucina-23) CM: conditioned médium (Meio condicionado) MHC: complexo principal de histocompatibilidade (major histocompatibility complex) OSCC: oral squamous cell carcinomas (carcinomas espinocelulares de orofaringe) P/S: Penicillin - Streptomycin (Penicilina - Estreptomicina) PCR: polymerase chain reaction (reação de polimerase em cadeia) PDGF: platelet derived growth factor (Fator de crescimento derivado de plaquetas) PMA: forbol-12-miristato-13-acetato RNAm: messenger ribonucleic acid (ácido ribonucleico mensageiro) RT-qPCR: real time quantitative polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase quantitativo em tempo real) TAM: tumor-associated macrophages (macrófagos associados a tumores) TGF-beta: transforming growth factor beta (fator de transformação do crescimento beta) TNF: tumor necrosis fator (fator de necrose tumoral) UV: ultraviolet (ultravioleta ) VEGF: vascular endothelial growth factor (fator de crescimento do endotélio vascular) ΔCt: delta threshold cycle (comparativo Ct) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 10 2 PROPOSIÇÃO ................................................................................................................. 17 3 MATERIAL E MÉTODO .............................................................................................. 19 3.1 Linhagens Celulares...................................................................................................... 19 3.2 Diferenciação de Monócitos em Macrófagos .............................................................. 19 3.3 Meio Condicionado das Linhagens Celulares Neoplásicas........................................ 20 3.4 Polarização Fenotípica dos Macrófagos e Estímulo com Meio Condicionado (CM) e Galanina .................................................................................. 20 3.5 Indução de Apoptose nas Linhagens Celulares Tumorais e Co-cultura Macrófagos:Células Neoplásicas................................................................................. 21 3.6 Extração de RNA Total e RT-qPCR ........................................................................... 22 3.7 Eferocitose...................................................................................................................... 25 3.8 Análise dos Dados.......................................................................................................... 28 4 RESULTADO .................................................................................................................. 29 4.1 Expressão Gênica das Linhagens Tumorais Após Indução de Apoptose Com Luz UV .......................................................................................................................... 29 4.2 Macrófagos Diferenciados a Partir de Monócitos (U937) Aumentam a Expressão de TNF e IL10 Quando estão em Co-cultura com Células Apoptóticas das Linhagens Neoplásicas UM-SCC-1 e UM-SCC-22B................................................. 30 4.3 Produtos Secretados por Células de Câncer de Cabeça e Pescoço e Galanina Afetam a Expressão Gênica de TNF e IL10............................................................... 31 4.4 Influência da Co-Cultura com Linhagens Tumorais Apoptóticas na Resposta de Macrófagos M0, M1 e M2 ...................................................................... 33 4.5 Influência da Exposição aos Produtos Secretados Pelas Células Tumorais e à Galanina na Co-cultura De Macrófagos com Células Neoplásicas Apoptóticas ................................................................................................................... 35 4.6 Eferocitose de Células UM-SCC-1 e UM-SCC-22B Pelos Macrófagos .................... 36 4.7 O Fenótipo dos Macrófagos Influencia a Eferocitose de Células Tumorais de Cabeça e Pescoço ..................................................................................................... 38 5 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 42 6 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 48 REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 50 APÊNDICE A – RESULTADOS PRELIMINARES.................................................. 56 10 1 INTRODUÇÃO O câncer representa uma das principais causas de mortalidade no mundo, com estimativa de 1.685.210 novos casos diagnosticados apenas nos EUA em 2016, sendo que destes estima-se que 595.690 morreriam por causa da doença1. Câncer é a denominação coletiva para uma multitude de doenças que apresentam como características centrais comuns: i. proliferação celular descontrolada e ilimitada; ii. auto-suficiência em sinais necessários para a proliferação; iii. insensibilidade aos sinais inibitórios da proliferação; iv. evasão da morte celular programada (apoptose); v. angiogênese alterada suportando a proliferação descontrolada; vi. capacidade de invasão e disseminação à distância (metástase); vii. instabilidade genômica e mutação; viii. modulação de processos inflamatórios que influenciam a promoção de tumores; ix. reprogramação do metabolismo da energia celular; e x. evasão dos ataques e tentativas de eliminação por células imunes2, 3 (Figura 1). Figura 1 - Representação esquemática das características centrais do câncer, envolvendo alterações genéticas e epigenéticas Fonte: Adaptado de Hanahan e Weinberg2,p.668. O câncer de cabeça e pescoço (Head and neck cancer, HNC) é a denominação comum para um conjunto de condições neoplásicas afetando os tecidos e estruturas da cabeça e 11 pescoço. HNC está entre os 8 tipos mais comuns de câncer e, fundamentalmente, é associado com elevados custos econômicos e sociais uma vez que o tratamento não apresentou avanços significativos nas últimas 5 décadas. Mesmo quando bem-sucedido, o tratamento de escolha (ressecção cirúrgica, associada ou não à quimio e radioterapia) causa elevada morbidade em casos mais avançados ou com lesões extensas. Embora no período entre 2005-2011 as estatísticas indiquem que praticamente todos os tipos de câncer tenham apresentado melhora nas taxas de sobrevida em 5 anos, o prognóstico de HNC continua sendo tão ruim ou pior do que o prognóstico de câncer de mama, próstata ou cólo de útero1, 4. A maior parte (>90%) dos HNC são carcinomas de células espinocelulares (head and neck squamous cell carcinomas, HNSCC), os quais tem como característica uma alta agressividade relacionada à invasão loco- regional nos tecidos circundantes e metástases em órgãos distantes, as quais podem ocorrer mesmo em estágios iniciais, além de uma alta recorrência após tratamento5, 6. O microambiente tumoral inclui diferentes tipos celulares além das células neoplásicas, como células da resposta imune (linfócitos, macrófagos) e fibroblastos que vão interagir entre si e com a matriz extracelular. A heterogeneidade celular no microambiente tumoral vai dar a cada neoplasia características únicas que podem influenciar a progressão de cada neoplasia7. Com a progressão do tumor, o microambiente tumoral também se altera para um estado ‘ativo’ por meio de interações tumor-estroma5. A galanina é um peptídeo de 29 aminoácidos originalmente identificada como um neuropeptídeo. Existem três receptores distintos reconhecidos em ratos e humanos (GalR1, GalR2, GalR3) com diferentes afinidades pela galanina como ligante resultando na regulação de efeitos biológicos mediante diversas vias de sinalização8. A Expressão de galanina se encontra amplamente distribuído no sistema nervoso central e periférico, assim como em diferentes órgãos do sistema digestivo, pele e células cancerígenas8. Como resultado dos diferentes alvos pela ampla distribuição da galanina, se vem estudando possíveis efeitos terapêuticos em tratamento em patologias como alzhaimer, dor neuropático, diabetes9 e diagnóstico e tratamento de câncer como câncer de colón10, melanoma11, câncer de cabeça e pescoço12. A expressão constitutiva de galanina por células de câncer de cavidade oral está associada à maior agressividade do tumor, o que é suportado por estudos em modelo murino de câncer de células escamosas da cavidade oral, em que a expressão de galanina pelas células tumorais se correlaciona positivamente com o crescimento tumoral13. Estes dados indicam que a expressão de galanina pode ser um marcador prognóstico de agressividade do tumor e também um possível alvo terapêutico em HNSCC. 12 Macrófagos são derivados de um precursor mielóide comum que também dá origem a células dendríticas. Juntamente com as células dendríticas, os macrófagos são o protótipo das células apresentadoras de antígeno (APCs, antigen-presenting cels), realizando a ´´ponte`` entre resposta imune inata e adaptativa. Suas principais funções como APC são: 1) fagocitar e matar microrganismos invasores, e 2) ativar as células T por meio da apresentação de antígenos via complexo de histocompatibilidade (MHC) II e também pela secreção de citocinas imunomodulatórias e outras moléculas bioativas. No entanto, os macrófagos exercem outras funções de grande relevância na homeostase dos tecidos, por meio de seu papel nas fases de reparo após injúria de natureza estéril ou infecciosa. Este processo de reparo frequentemente envolve a fagocitose de células mortas, debris celulares, produtos de degradação tecidual e também pela estimulação da angiogênese e fibrose com a secreção de moléculas bioativas, como TGF-beta (fator de transformação do crescimento beta), PDGF(, Fator de crescimento derivado de plaquetas), IGF-I (fator de crescimento semelhante à insulina tipo) ou VEGF (fator de crescimento do endotélio vascular)14, 15 (Figura 2). Os macrófagos são extensamente estudados no contexto do câncer, em parte pela abundância relativa na resposta imune associada às neoplasias, já que podem representar até 50% da massa tumoral16. Quando presentes no interior da massa tumoral de tumores sólidos, são denominados macrófagos infiltrantes no tumor (TAMs, tumor-infiltrating macrophages). Existe evidência indicando que os TAMs têm, primariamente, um papel pró-tumoral ou de favorecimento da progressão do tumor, incluindo a redução da apoptose e promoção da proliferação de células tumorais, aumento da invasão e metástase7, 17, 18. De fato, existe uma correlação inversa entre a intensidade do infiltrado de macrófagos na massa tumoral e o prognóstico de diversos tipos de câncer, incluindo mama, colo-retal, estômago, próstata, pulmão, tireoide, vesícula, trato urinário e melanoma19-23. É preciso considerar também a possibilidade de diferentes fenótipos de macrófagos estarem associados à localização anatômica destas células: no interior da massa tumoral (TAMs) ou no estroma circundando a lesão24 25. A notável diferença nos microambientes do interior da massa tumoral e do estroma circundante suportam a possibilidade de variações fenotípicas nos macrófagos (Figura 2). A hipóxia, um fator ambiental de grande relevância no fenótipo de macrófagos, é muito acentuada no interior da massa tumoral em comparação ao estroma circundante. Macrófagos localizados no estroma circundante podem facilitar a invasão loco-regional dos tumores, degradando a matriz extracelular na ´´borda infiltrante`` do tumor; enquanto outros macrófagos presentes no interior da massa tumoral (TAMs) podem estimular a angiogênese e 13 favorecer a penetração de células neoplásicas nos vasos sanguíneos, estimulando a metástase26, 27. Uma meta-análise indica que o aumento da infiltração de macrófagos está associado com estágios mais avançados e reduzida sobrevida dos pacientes com tumores sólidos, incluindo carcinomas de cabeça e pescoço28. Um maior infiltrado de macrófagos é observado em casos de carcinoma de células escamosas de orofaringe metastáticos em comparação a casos sem metástase, e também está correlacionado diretamente com envolvimento nodal e reduzida sobrevida dos pacientes29, 30, dados que suportam o papel pró-metastático de macrófagos presentes no interior da massa tumoral (TAMs). Figura 2 - Representação esquemática de seis possíveis ações biológicas de macrófagos de relevância para a progressão de neoplasias Embora cada uma destas ações possa ser atribuída a uma subpopulação de macrófagos específica, a maior parte das ações pró-tumorais podem ser associadas ao fenótipo M2 ou de ativação alternativa. Fonte: Qian e Pollard31,p.25 Heterogeneidade e plasticidade são características fundamentais dos macrófagos, os quais se apresentam basicamente em dois tipos fundamentais: ``M1´´ ou clássicos/pró- inflamatórios (expressão de IL23 e de elevados níveis de IL12); e 'M2' ou alternativos/anti- inflamatórios (elevada expressão de IL10, IL1RA e baixa expressão de IL12). A polarização 14 para estes fenótipos é induzida por características e estímulos do microambiente. Produtos secretados por linhagens celulares de carcinoma de células escamosas de orofaringe aumentam a migração/quimiotaxia de macrófagos, indicando que o microambiente nestes tumores recruta, ativamente, macrófagos16. A efetividade do tratamento quimio/radioterápico e também da resposta imune anti- tumoral está diretamente relacionada ao aumento da morte celular de células neoplásicas. O microambiente tumoral após o tratamento anti-tumoral apresenta abundância de sinais de células em apoptose32. A remoção das células mortas ocorre por um processo denominado eferocitose, segundo o qual as células apoptóticas são fagocitadas por diversos tipos celulares, especialmente por macrófagos e células dendríticas33, 34. Este processo é regulado por sinais moleculares denominados ´´me coma`` (eat me), como a calreticulina35 e a fosfatidilserina36, 37 e ´´não me coma`` (don't eat me), como CD4738. A remoção das células apoptóticas e um processo fisiológico necessário (por ex., a desregulação/inibição deste processo está associada ao desenvolvimento de doenças auto-imunes como o lúpus eritematoso sistêmico e a doença pulmonar obstrutiva crônica), a eferocitose está associada ao processo de reparo e, portanto, a um microambiente ´´menos inflamatório`` ou de imunotolerância e, especificamente, a um perfil de ativação alternativo (M2) em macrófagos32, 39-41. O processo de eferocitose pode ser didaticamente dividido em quatro etapas principais42: I. liberação de sinais ´´me coma`` pelas células apoptóticas, II. reconhecimento específico da célula morta, III. envolvimento e degradação das células mortas; IV. efeitos posteriores à eferocitose (Figura 3). 15 Figura 3 - Representação esquemática das quatro etapas principais na eferocitose Fonte: Adaptado de Tabas I42. A ativação da eferocitose é um possível mecanismo para a promoção do crescimento tumoral pela manutenção de um microambiente anti-inflamatório e com inibição da resposta imune. Assim, embora seja um processo necessário, a inibição da eferocitose em câncer (ao menos de forma controlada e por tempo limitado) pode ser uma estratégia de promoção da imunidade anti-tumoral, pró-inflamatória e associada ao perfil de ativação clássico/M1 em macrófagos43, 44, ou uma alteração de um microambiente imunosupressor (M2) para um amnbiente ´´imuno-ativo`` (M1)32. De fato, evidências recentes indicam que a eferocitose de células de câncer de próstata apoptóticas induz a polarização de macrófagos para o perfil M245; também que a inibição da eferocitose por macrófagos reduziu a metástase em modelo pré-clínico de câncer de cólon46. A literatura é escassa em informações sobre o papel da eferocitose na progressão de carcinoma espinocelular de orofaringe. Um dos poucos estudos sugerem que macrófagos M1 ou M2 podem fagocitar células apoptóticas de carcinoma espinocelular de língua47. Além disso, a metodologia de avaliação da eferocitose não é definitiva (marcação de lipídeos de membrana com fluoróforos) e pode representar apenas contato direto ou fusão entre macrófagos e células tumorais. Considerando i) a relevância dos macrófagos para a progressão de tumores sólidos; ii) a influência de mediadores biológicos secretados por células tumorais sobre o fenótipo de macrófagos; iii) a influência do fenótipo de macrófagos presentes no microambiente tumoral na produção de substâncias biologicamente ativas com efeitos anti- ou pró-tumorais; iv) a relevância da eferocitose no processo de reparo tecidual pós-tratamento de tumores sólidos; e 16 v) a relativa escassez de informações relacionadas especificamente à eferocitose em carcinomas espinocelulares de cabeça e pescoço, propomos avaliar a influência de produtos secretados por células tumorais, da galanina especificamente, e do contato direto célula-célula sobre o perfil fenotípico e a atividade de eferocitose de macrófagos. 48 6 CONCLUSÃO Em conclusão, nosso estudo demostrou que os produtos secretados por células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoco e o contato direito dos macrófagos com as células tumorais (célula-célula) pode influenciar a expressão genica de TNF e IL10 em macrófagos (Figura17). Os resultados também indicam que a eferocitose de células tumorais influencia o fenótipo dos macrófagos. Macrófagos polarizados para o perfil M2 tem uma maior atividade de eferocitose de células de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço do que macrófagos M0 ou macrófagos polarizados para o perfil M1 (Figura 18A), porem o microambiente contendo os produtos secretados pelas linhagens tumorais apresentou uma diminuição na atividade da eferocitose (Figura 18B). A literatura relata a relevância dos macrófagos para a progressão de tumores sólidos, conhecidos como TAM, e importante ressaltar nossos resultados na modulação no fenótipo dos macrófagos em carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, tanto pelos produtos secretados pelas células tumorais, quanto do contato célula:célula. Assim como o mecanismo na comunicação do macrófago para o reconhecimento da célula tumoral apoptóticas em diferentes tipos de câncer de cabeça e pescoço. A relevância da eferocitose e do fenótipo dos macrófagos no processo de reparo tecidual pós-tratamento de tumores sólidos e na progressão do tumor e de grande importância para o planejamento do tratamento, assim como o reconhecimento de possíveis alvos para o desenvolvimento de novas terapias para o câncer de cabeça e pescoço. Figura 17 - Representação esquemática da influência nos macrófagos dos produtos secretados pelas linhagens tumorais e a galanina favorecendo um perfil M2 ou pro-tumoral dos macrófagos Fonte: Adaptado de Hanahan e Weinberg2,p.662. 49 Figura 18: Representação esquemática da influência do perfil fenotípico do macrófago (M0, M1, M2), na eferocitose de células tumorais com marcado aumento na atividade do perfil M2 (Figura 18A). Sem embargo, se evidencia e diminuição da eferocitose quando os macrófagos foram expostos ao meio contendo os produtos solúveis das células tumorais UM-SCC-1 e UM-SCC-22B e a galanina Fonte: Elaboração própria 50 REFERÊNCIAS 1. 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