1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP – CAUNESP PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA Aspectos morfológicos e filogenéticos de Calyptospora (Apicomplexa: Calyptosporidae) no Médio Tietê–SP Karen Dayana Prada Mejia Médica Veterinária e Zootecnista JABOTICABAL – SÃO PAULO 2021 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” CENTRO DE AQUICULTURA DA UNESP –CAUNESP PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AQUICULTURA Aspectos morfológicos e filogenéticos de Calyptospora (Apicomplexa: Calyptosporidae) no Médio Tietê–SP Karen Dayana Prada Mejia Orientadora: Dra. Fabiana Pilarski Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Aquicultura como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Aquicultura. JABOTICABAL – SÃO PAULO 2021 3 Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Jaboticabal/SP – Karina Gimenes Fernandes - CRB 8/7418 Prada-Mejia, Karen Dayana P896a Aspectos morfológicos e filogenéticos de Calyptospora (Apicomplexa: Calyptosporidae) no Médio Tietê–SP / Karen Dayana Prada Mejia. – – Jaboticabal, 2021 106 p. : il., tabs., fotos, mapas Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Centro de Aquicultura, 2021 Orientador: Fabiana Pilarski Banca examinadora: Ricardo Massato Takemoto, Reinaldo José da Silva Bibliografia 1. Coccidiose. 2. Filogenia. 3. Relação hospedeiro-parasito. I. Título. II. Jaboticabal-Centro de Aquicultura. CDU 639.3.43 4 5 “Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo o propósito debaixo do céu: há tempo de nascer e tempo de morrer; tempo de plantar e tempo de arrancar o que se plantou”. Eclesiastes 3:1 6 Dedicatória À Deus, Aos meus pais Edgar Antonio Prada Gamboa e Luz Marina Mejia Castilla Ao Marcelo Berriel (“In Memorian”) Gratidão. 7 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus que nunca me desamparou, pelas vitórias de cada dia, pelo aprendizado com os tropeços e, principalmente, pelo crescimento humano; Aos meus pais e irmãos, que mesmo na distância me apoiam em minhas decisões, são meu porto seguro e minha motivação, obrigada por sempre acreditarem em mim; Ao Centro de Aquicultura da UNESP, pela oportunidade de Pós-graduação; À minha orientadora, profa. Dra. Fabiana pilarski, por me receber desde longe, pela oportunidade, pelos valorosos conselhos, dedicação, por todo o carinho e apoio durante esses anos; À Suzana, Evandro, Lindomar e Thaís pela amizade, carinho, parceria, paciência, por me acolher nesse caminhar, por todos os momentos compartilhados, não tenho palavras para agradecer tudo que fizeram, guardo vocês no meu coração; Aos colegas do Laboratório de Microbiologia e Parasitologia de Organismos Aquáticos (LAPOA), que fizeram e fazem parte da minha trajetória na pós-graduação; Aos colegas discentes, funcionários e professores do CAUNESP; Ao Prof. Diogo Teruo Hashimoto e a equipe do Laboratório de Genética em Aquicultura e Conservação do CAUNESP, também ao Prof. Fernando José Zara e a equipe do Laboratório de Morfologia de Invertebrados da UNESP/FCAV- Jaboticabal; Aos proprietários e funcionarios da piscicultura, pelo apoio e disposição na coleta dos peixes, especialmente ao Romulo Elines Ribeiro e FernandoPenteado; A todos aqueles que contribuíram para a minha formação profissional e pessoal... O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. 8 ÍNDICE CAPITULO I ............................................................................................................................. 13 RESUMO ................................................................................................................................... 13 1. INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................. 15 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 18 2.1. Ictiofauna e pesca no rio Tietê .................................................................................... 18 2.2 Área de estudo ............................................................................................................. 20 2.2.1 Médio Tietê ......................................................................................................... 20 2.3 Invasão parasitária e hospedeiros ................................................................................ 20 2.4 Caracterização das espécies de estudo ........................................................................ 23 2.4.1 Serrasalmus maculatus Kner, 1858 ..................................................................... 24 2.4.2 Serrasalmus marginatus Valenciennes, 1837 ..................................................... 26 2.5 Parasitas do filo Apicomplexa ..................................................................................... 27 2.5.1 Gênero Calyptospora Overstreet, Hawkins & Fournie, 1984 ............................. 31 3. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 36 CAPITULO ll ............................................................................................................................ 51 Relação parasita-hospedeiro, prevalência, morfologia e caracterização molecular de Calyptospora (Apicomplexa: Calyptosporidae) infectando serrasalmídeos na bacia do Médio Tietê– SP .................................................................................................................................... 51 RESUMO ................................................................................................................................... 51 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 52 2. MATERIAS E MÉTODOS .............................................................................................. 53 2.1. Área de estudo e captura dos peixes ........................................................................ 53 2.2. Identificação morfológica dos parasitas .................................................................. 55 2.3. Histopatologia do fígado ........................................................................................... 56 2.4. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) ....................................................... 56 2.5. Análise molecular ...................................................................................................... 56 2.5.1. Extração de DNA e sequenciamento ................................................................... 56 2.5.2. Alinhamento da sequência e análise filogenética ................................................ 58 2.6. Análises estatística ..................................................................................................... 60 3. RESULTADOS .................................................................................................................. 60 4. DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 68 5. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 71 9 CAPITULO lll ........................................................................................................................... 77 Primeira ocorrência de coccidiose hepática em Serrasalmus marginatus Valenciennes, 1837, espécie invasora da bacia do Rio Tietê – SP ........................................................................... 77 RESUMO ................................................................................................................................... 77 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 78 2. MATERIAS E MÉTODOS .............................................................................................. 79 2.1. Coleta de peixes e parasitas ...................................................................................... 79 2.2. Identificação morfológica do parasita e histopatologia ......................................... 81 2.3. Variáveis limnológicas .............................................................................................. 82 3. RESULTADOS .................................................................................................................. 82 4. DISCUSÃO ........................................................................................................................ 89 5. CONCLUSSÃO ................................................................................................................. 92 6. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 92 10 Jaboticabal, 16 de fevereiro de 2021. fa. Dra. Paola Castro Moraes Vice-Coordenadora – CEUA CEUA – COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS C E R T I F I C A D O Certificamos que o projeto de pesquisa intitulado “Peixes alóctones e seus parasi- tas: aspectos morfológicos e filogenéticos de Calyptospora (Apicomplexa: Calyptospidae) no Médio Tietê - SP”, protocolo nº 349/21, sob a responsabilidade da Profa. Dra. Fabiana Pilarski, que envolve a produção, manutenção e/ou utilização de animais pertencentes ao Filo Chordata, subfilo Vertebrata (exceto o homem), para fins de pesquisa científica (ou ensino) - encontra-se de acordo com os preceitos da lei nº 11.794, de 08 de outubro de 2008, no decreto 6.899, de 15 de julho de 2009, e com as normas editadas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), e foi aprovado pela COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS (CEUA), da FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS, UNESP - CÂMPUS DE JABOTICABAL-SP, em reunião ordinária de 11 de fevereiro de 2021. Vigência do Projeto 01/03/2019 a 01/07/2021 Espécie / Linhagem Serrasalmus marginatus Serrasalmus maculatus Nº de animais 120 (entre as duas espécies) Peso / Idade 15 – 550gr Sexo Diversos (macho e fêmea) Origem Trecho médio rio Tietê, Município de Arealva – SP Pro Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Setor de Solos e Adubos Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n CEP 14884-900 Jaboticabal/SP - Brasil Tel (16) 3209 7406 e-mail: solos.fcav@unesp.br - www.fcav.unesp.br Câmpus de Jaboticabal 11 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1. Parasitas coccídeos do gênero Calyptospora registrados na Ámerica. .......... 32 Tabela 2. Número de acesso do GenBank para as sequências de nucleotídeos depositadas. ........................................................................................................................................ 60 Tabela 3. Prevalência (%) de Calyptospora sp. nos meses de outubro de 2020 e Março de 2021. .......................................................................................................................... 61 Tabela 4. Análise de covariância (ANCOVA), comparando o índice hepatossomático de Serrasalmus maculatus parasitadas e não-parasitadas e com relação ao sexo. .............. 61 Tabela 5. Comparação morfométrica de oocistos e esporocistos de Calyptospora spp. em diferentes espécies de peixes de água doce no Brasil. .................................................... 64 Tabela 6. Número de espécimes de Serrasalmus marginatus capturados no período de amostragem e índice parasitário (P) de Calyptospora sp. ............................................... 82 Tabela 7. Parâmetros morfométricos das espécies descritas da família Calyptosporidae em peixes de água doce. ................................................................................................. 83 Tabela 8. Variáveis limnológicas estudadas no médio Tietê durante as coletas. .......... 89 12 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Possíveis cenários da introdução de peixes e seus parasitos.. ..................................... 22 Figura 2. Filet de Serrasalmus maculatus utilizada na alimentação de comunidades ribeirinhas do trecho Médio do Rio Tiete. (Fonte: Prada-Mejia, K D). ........................................................ 24 Figura 3. Exemplar de Serrasalmus maculatus coletado no trecho médio Tietê, município de Arealva-SP. (Fonte: Prada-Mejia, K D). ..................................................................................... 25 Figura 4. Exemplar de Serrasalmus marginatus coletado no trecho médio Tietê, município de Arealva-SP. (Fonte: Prada-Mejia, K D). ..................................................................................... 27 Figura 5. Fases do ciclo de vida do Calyptospora spinosa. ....................................................... 31 Figura 6. Fotomicrografia de oocistos fresco. ............................................................................ 35 Figura 7. Desenho esquemático da organização morfológica de um grupo de oocistos ............ 35 Figura 8. Local da amostragem realizada no trecho médio do Rio Tietê, município de Arealva- SP, próximo a Piscicultura Toca da Tilápia.. .............................................................................. 54 Figura 9. Análise de regressão (ANCOVA) para o índice hepatossomático de Serrasalmus maculatus entre os indivíduos parasitados e não-parasitados. .................................................... 62 Figura 10. Análise de regressão (ANCOVA) comparando o índice hepatossomático de Serrasalmus maculatus entre machos e fêmeas. ......................................................................... 62 Figura 11. Fígado de Serrasalmus maculatus. ........................................................................... 63 Figura 12. Calyptospora sp., localizado no parênquima hepático de Serrasalmus maculatus.. 63 Figura 13. Cortes histológicos realizados no fígado de Serrasalmus maculatus corados com Haematoxilina-Eosina. ................................................................................................................ 65 Figura 14. Árvore filogenética enraizada inferida pelos métodos de Máxima Verossimilhança (ML) e Inferência Bayesiana (BI) com base em análises de sequências do gene 18S rRNA de Calyptospora isolados de peixes ................................................................................................. 67 Figura 15. a) Observação a fresco de oocistos de Calyptospora sp. (seta), parasitando o fígado de Serrasalmus marginatus. ............................................................................................................. 84 Figura 16. a) Fígado de Serrasalmus marginatus, com multiplos pontos amarelados de padrão difuso. .......................................................................................................................................... 85 Figura 17. Cortes histológicos do hepatopáncreas de Serrasalmus marginatus na coloração Tricômico de Masson .................................................................................................................. 86 Figura 18. Análise de Componentes Principais (PCA) dos parâmetros morfométricos de oocistos e esporocistos de coccídeos do gênero Calyptospora. ................................................................ 87 Figura 19. Dendograma de similaridade.. .................................................................................. 88 13 CAPITULO I RESUMO A introdução de organismos aquáticos em novos ambientes vem ocorrendo há muito tempo, e o sucesso no estabelecimento da espécie depende de inúmeros fatores. Todavia, a movimentação de uma espécie traz consigo uma parte ou todos os seus parasitas nativos que podem causar danos aos peixes já existentes em determinado local. A classe Coccidia compreende um grupo diverso de protozoários parasitas que impactam os estoques naturais de muitas espécies de peixes, demostrando características de invasão e transmissão parasitária que a torna um grupo perfeito para estudar fenômenos evolutivos do complexo parasita-hospedeiro. Neste trabalho foi registrada a primeira ocorrência da infecção por coccídeos do gênero Calyptospora infectando dois novos hospedeiros, Serrasalmus marginatus e Serrasalmus maculatus além de ser o primero registro de uma espécie desse gênero parasitando peixes da bacia hidrográfica do Rio Tietê, São Paulo. Os peixes capturados não apresentavam sinais clínicos de doenças, porém, quando submetidos à necropsia e biópsia, evidenciaram manchas esbranquiçadas em algumas regiões do fígado, identificando a presença de oocistos de coccídeos sob microscópio de luz, presuntivo para o gênero Calyptospora. Estudos morfométricos e ultraestruturais do parasita e histopatológicos foram realizados nos peixes, assim como análise molecular e correlações filogenéticas comparadas quanto à similaridade com sequências do grupo coccidia disponíveis no GenBank®. Nossos dados representam uma importante contribuição sobre a diversidade e dinâmica desses organismos parasitas na região do médio Tietê, uma vez que estudos sobre essa classe de parasitas são escassos e também questiona o estabelecimento do filo Apicomplexa no Rio tietê. Palavras-chave: Calyptospora, coccidiose, invasão parasitária, Serrasalmus spp., rio Tietê. 14 ABSTRACT The introduction of aquatic organisms into new environments has been taking place for a long time, and success in establishing the species depends on numerous factors. However, the movement of a species brings with it a part or all of its native parasites that can damage fish that already exist in a given location. The Coccidia class comprises a diverse group of parasitic protozoa that impact the natural stocks of many fish species, showing characteristics of invasion and parasitic transmission that make it a perfect group to study evolutionary phenomena of the host-parasite complex. In this work, the first occurrence of infection by coccidia of the genus Calyptospora infecting two new hosts, Serrasalmus marginatus and Serrasalmus maculatus was registered, besides being the first record of a species of this genus parasitizing fish from the Tietê River basin, São Paulo. The captured fish did not show clinical signs of disease, however, when submitted to necropsy and biopsy, they showed whitish spots in some regions of the liver, identifying the presence of coccidian oocysts under a light microscope, presumptive for the genus Calyptospora. Morphometric and ultrastructural studies of the parasite and histopathological studies were performed in fish, as well as molecular analysis and phylogenetic correlations compared for similarity with sequences from the coccidia group available in GenBank®. Our data represent an important contribution on the diversity and dynamics of these parasitic organisms in the middle Tietê region, since studies on this class of parasites are scarce and also question the establishment of the Apicomplexa phylum in the Tietê River. Keywords: Calyptospora, coccidiosis, parasitic invasion, Serrasalmus spp., Tietê river. 15 1. INTRODUÇÃO GERAL A biodiversidade de peixes é abundante, sendo que, a maior riqueza de espécies encontra-se em águas tropicais (LOWE-MCCONNELL, 1999), particularmente na região Neotropical, onde são descritas cerca de 4.475 espécies válidas em água doce (REIS; KULLANDER; FERRARIS JR, 2003). O Brasil possui o maior número de peixes de água doce, com 2.587 espécies catalogadas, representando 21% das espécies do mundo (BUCKUP; MENEZES; GHAZZI, 2007). Diversas comunidades de peixes de água doce estão presentes nas bacias hidrográficas do Estado de São Paulo, com aproximadamente 391 espécies, o que corresponde a 15% do total estimado para todo o território brasileiro (OYAKAWA; MENEZES, 2011). O Tietê é o segundo maior rio do estado de São Paulo, com nascente localizada no município de Salesópolis, a 840 m de altitude na Serra do Mar, a 22 km do Oceano Atlântico, percorrendo por volta de 1.150 km e desembocando no Alto rio Paraná na divisa com o estado do Mato Grosso do Sul, em Itapura (ALMEIDA et al., 1981). É considerado um dos rios mais importantes economicamente para o estado de São Paulo e região Sudeste, banhando no seu trajeto numerosos municípios ribeirinhos (RIBEIRO, 2004). Porém, devido aos diversos impactos ambientais que vem sofrendo, possui elevada concentração de poluentes a partir da cidade Mogi das Cruzes, atravessando a capital paulista e sua região metropolitana, com maior quantidade de poluentes (fósforo total e nitrogênio amoniacal) nesse trecho, sendo classificado pela Companhia Ambiental do Estado de São Paulo- CETESB no último relatório sobre o Índice de Qualidade das Águas (IQA) e Índice de qualidade das águas para a proteção da vida aquática (IVA) como água ruim e péssima, de modo que o aumento do grau de trofia passou de mesotrófico para eutrófico e supereutrófico no ano de 2019 (CETESB, 2020). O curso do rio Tietê é em sistema de cascata nos trechos médio e baixo, nas represas de Barra Bonita, Bariri, Ibitinga, Promissão, Nova Avanhandava e Três Irmãos (CASTRO et al., 2008). Como o rio está submetido a múltiplos represamentos, também oferece condições para atividades piscícolas em seus cursos médio e baixo, pois abrange uma grande diversidade de peixes, ao ponto de abrigar não só as atividades de pesca (pescadores amadores e profissionais) e pisciculturas em tanques- 16 rede (MARUYAMA et al., 2010a), mas também outras atividades tais como abastecimento urbano, irrigação e navegação (TUNDISI, 1999; TUNDISI et al., 2008). Ao longo dos anos, a bacia hidrográfica do rio Tietê vem apresentando alterações drásticas e mudanças na dinâmica de toda a biota, incluindo variações na composição e abundância de espécies de peixes, por fragmentação dos habitats devido a construção de inúmeras barragens hidrelétricas de grande porte (GIAMAS et al., 2004; AGOSTINHO; PELICICE; GOMES, 2008). Apesar de importantes vantagens para o desenvolvimento econômico, os barramentos promovem a introdução de peixes no sistema, seja por deslocamento ou migração de uma bacia para outra, quando veem-se obrigados, como ocorreu com a Serrasalmus marginatus Valenciennes, 1837 após a construção do reservatório de Itaipu, no rio Paraná (AGOSTINHO; JÚLIO, 2002; AGOSTINHO, 2003; ALEXANDRE et al., 2004) e/ou por políticas governamentais para o uso das águas dos reservatórios, através de repovoamentos (com espécies nativas da região), introdução de espécies (com espécies oriundas de outras bacias ou exóticas) e instalação de sistemas produtivos piscícolas, comprometendo os recursos hídricos tradicionalmente explorados e afetando os estoques de peixes nativos (AGOSTINHO; GOMES, 1997; AGOSTINHO; GOMES; PELICICE, 2007; AGOSTINHO; PELICICE; GOMES, 2008). Assim, o resultado é o depauperamento da diversidade com consequências deletérias a médio e longo prazo (RAMBALDI; OLIVEIRA, 2003). Entre as espécies que tiveram sua introdução bem sucedida nos cursos do rio Tietê destacam-se as tilápias Oreochromis niloticus Linnaeus, 1758 e Tilapia rendalli Boulenger, 1897, espécies exóticas oriundas da África, e igualmente espécies alóctones originárias de outras bacias como a sardela Triportheus angulatus Spix and Agassiz, 1829, sendo estas três as principais espécies capturadas tanto em importância numérica quanto em peso, seguido de outras como o tucunaré Cicha piquiti Kullander and Ferreira, 2006, corvina Plasgioscion squamosissimus Heckel, 1840, apaiarí Astronotus ocellatus Agassiz, 1831, porquinho Geophagus proximus Castelnau, 1855, papa-terra Satanoperca pappaterra Heckel, 1840, piauçu Leporinus macrocephalus Garavello and Britski, 1988 (TORLONI et al., 1993; MARUYAMA et al., 2010a, 2010b; DAVID et al., 2016), piranha amarela S. marginatus, carpa 17 Cyprinus carpio Linnaeus, 1758 (MARUYAMA et al., 2010a), cascudo preto Lipossarcus cf. anisitsi Holmberg, 1893, carpa prateada Hypophthalmichthys molitrix Valenciennes, 1844 e carpa cabeça-grande Hypophthalmichthys nobilis Richardson, 1845 (NOVAES, 2008), entre outros, sendo que hoje estão presentes no trecho médio do rio Tietê. Dentro dos diferentes fins, a translocação de espécies em um novo ambiente ocorre não somente para sua movimentação, mas também consegue trazer consigo uma parte ou todos seus parasitas nativos, podendo causar a disseminação de doenças em populações nativas ou parasitas nativos também podem colonizar esses novos hospedeiros não nativos introduzidos no ambiente, interangindo com a complexa relação parasita–hospedeiro (GALLI et al., 2005; LACERDA et al., 2013). Os organismos do filo Apicomplexa Levine, 1970 estão entre os mais importantes agentes etiológicos responsáveis por doenças em vertebrados e invertebrados, incluindo os humanos, com implicações ambientais e econômicas (RALPH LAINSON, 1992; MORRISON, 2009; SILVA et al., 2012). A classe Coccidia compreende um grupo diverso de protozoários parasitas (TENTER et al., 2002) que impactam os estoques naturais de várias espécies de peixes, com importantes características de invasão parasitária e ecologia de transmissão (NEGRÃO et al., 2019), que o torna um grupo ideal para estudar fenômenos evolutivos do complexo parasita-hospedeiro, e compreender a diversidade real e as relações filogenéticas existentes. Desta forma, este estudo é o primeiro no Brasil a descrever a ocorrência de coccídeos do gênero Calyptospora infectando dois novos hospedeiros, S. marginatus e Serrasalmus maculatus Kner, 1858, além de ser o primero registro de uma espécie desse gênero parasitando peixes da bacia do rio Tietê. 18 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Ictiofauna e pesca no rio Tietê A ictiofauna encontrada no estado de São Paulo é caracterizada por espécies de médio e grande porte, divididas em 10 ordens e 39 famílias. A família Characidae é constituída por 83 espécies e a família Loricariidae por 81, sendo as mais numerosas, com uma ampla distribuição geográfica entre quatro bacias hidrográficas principais: Alto Paraná, Paraíba do Sul, Ribeira de Iguape e as Drenagens Costeiras (OYAKAWA; MENEZES, 2011). A bacia do rio Tietê, é uma das principais afluentes do Rio Paraná, possui no seus cursos de água várias espécies de pequeno, médio e grande porte, com importância econômica para a pesca comercial e de subsistência (MARUYAMA et al., 2010a). Também possui uma composição ictiofaunística bastante peculiar em cada um dos seus trechos, na sua maioria distinta daquelas encontrada nas cabeceiras da bacia do Alto rio Paraná, com espécies não descritas, destas exóticas e alóctones, em comparação com levantamentos anteriores (GIAMAS et al., 2004; MARCENIUK; HILSDORF; LANGEANI, 2011). As informações disponíveis sobre a pesca em reservatórios brasileiros são geralmente incompletas e/ou inconsistêntes, resultado da falta de monitoramento no país, de políticas públicas para obtenção de dados e erros na destinação de recursos (AGOSTINHO; GOMES; PELICICE, 2007). O que também impossibilita o monitoramento da pesca é a dispersão dos pescadores ao longo da região como um todo, muitos deles sem carteira profissional e a grande extensão dos reservatórios, tornando imprescindével a realização de um censo estrutural por região e/ou sub-regiões (CASTRO et al., 2008). A pesca artesanal é uma atividade extrativista, e geralmente é a única fonte de geração de renda e sustento de famílias com baixos recursos, que vivem às margens dos reservatórios (AGOSTINHO; GOMES; PELICICE, 2007). Um levantamento realizado em 2001 no Médio e Baixo Rio Tietê identificou 47 pontos de desembarque principais (regularmente operantes) sendo onze no reservatório de Barra Bonita, quatro no de Bariri, cinco em Ibitinga, onze em Promissão, três em Nova Avanhandava e treze em Três Irmãos. Igualmente, foi calculada uma estimativa do número de pescadores presentes no reservatório e sua contribuição percentual nos núcleos pesqueiros identificados. A 19 intensidade de pesca (ind./km2), mostrou uma redução em Barra Bonita (1,18 pescador/km2) e Três Irmãos (0,22 pescador/km2), devido principalmente a atividade de turismo nesses pontos e à inexistência de apoio governamental (CASTRO; MARUYAMA; PAIVA, 2008). No trecho médio, 31 espécies de peixes pertencentes a quatro ordens e 13 famílias são aproveitadas pela pesca artesanal. Dentre elas, 24 são nativas e sete não nativas, com predominância da família Cichlidae com cinco espécies, e das famílias Characidae e Sciaenidae, com uma espécie cada (DAVID et al., 2016). O grupo das tilápias (O. niloticus e T. rendalli) representaram juntas, mais do 85% de toda produção do reservatório de Barra Bonita no ano 2003 e cerca de 70% no ano de 2004 (MARUYAMA et al., 2010a); no entanto, a principal espécie capturada tanto em importância numérica quanto em peso entre 2008-2009, foi a sardela T. angulatus (DAVID et al., 2016); seguido por outras espécies relevantes como o mandi Pimelodus maculatus Lacepède, 1803, cascudo Liposarcus sp., Hypostomus sp., curimbatá Prochilodus lineatus Valenciennes, 1847 e corvina P. squamosissimus (NOVAES, 2008; MARUYAMA et al., 2010a), e algumas outras com valores percentuais inferiores a 1% da produção total porém, uma fonte de alimento e subsistência, tais como: Hoplias malabaricus Bloch, 1794, Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887, Salminus maxillosus Valenciennes, 1840, Pseudoplatystoma corruscans Spix and Agassiz, 1829, G. proximus, A. ocellatus, Serrasalmus sp., Cichla sp., etc (MARUYAMA et al., 2010a; DAVID et al., 2016). No reservatório de Bariri, a produção da tilápia tende a ser menor que no de Barra Bonita, e mais baixa ainda no reservatório de Ibitinga, com participação de 48,7% e 15,7%, respectivamente, na produção total de 2004; superando a corvina (P. squamosissimus) com número de captura com 25,7%, em Ibitinga (MARUYAMA et al., 2010a). O último monitoramento pesqueiro registrado por DAVID et al., (2016), entre agosto de 2008 e outubro de 2009 nos reservatórios de Barra Bonita e Bariri, constatanto que as cinco espécies mais relevantes quanto ao peso para sua comerzialização totalizou 78,6% das capturas por T. angulatus, T. rendalli, O. niloticus, P. maculatus e P. squamosissimus respectivamente, bem como a participação de espécies de menor porte, como os lambaris Astyanax sp., com importância numerica. 20 2.2 Área de estudo 2.2.1 Médio Tietê O Estado de São Paulo, para fins de gestão de recursos hídricos, foi dividido em 22 Unidades de Gerenciamento de Recursos Hídricos (UGRHI), das quais seis dessas unidades fazem parte da Bacia Hidrográfica do Tietê: Alto Tietê, Tietê/Sorocaba, Piracicaba/Capivari/Jundiaí, Tietê/Jacaré, Tietê/Batalha e Baixo Tietê; sob a Lei n 9.034/1994 (SIGRH, 2017). A UGRHI 13 – Tietê/Jacaré localiza-se na região central do Estado de São Paulo, e é composta por 34 municípios, entre eles o municipio de Arealva (área de estudo). O município possui uma área de drenagem de 11.749 km2, 1.555.463 habitantes e abriga cerca de 3,6% da população do estado. A bacia compreende três rio importantes: rio Tietê (150 km da barragem de Barra Bonita até a barragem da Ibitinga), rio Jacaré-Guaçu e rio Jacaré-Pepira, e abrange os reservatórios de Bariri, Ibitinga e Lobo (SIGRH, 2017). O clima dessa unidade de gestão, pela classificação de Koppen, está entre tropical úmido (de outubro a março) e inverno seco (de abril a setembro). As principais atividades econômicas estão ligadas principalmente à agroindústria (açúcar, álcool e processamento de cítricos) (TUNDISI et al., 2008). 2.3 Invasão parasitária e hospedeiros A distribuição natural das espécies nos ecossistemas é influenciada por diversos fatores bióticos e abióticos, e as barreiras físicas operam como filtro para a dispersão (ESPÍNOLA; FERREIRA; JUNIOR, 2007). As introduções, tanto intencionais como acidentais de peixes implicam na movimentação de espécies (potencialmente invasoras) efetuada pelo homem para outro ecossistema ou região onde estas não são historicamente encontradas (GIDO; SCHAEFER; PIGG, 2004). O termo espécie introduzida, não tem distinção entre espécies exóticas e alóctones (espécies regionais não nativas), dado que podem ter impactos similares representando o mesmo risco (RICHARDSON et al., 2000). As introduções vem ocorrendo há muito tempo, com diversos propósitos, como aumento da riqueza de espécies local, repovoamento, aquarismo comercial, pesca 21 esportiva, controle biológico, hidroeléctricas (barragem), fins produtivos, entre outros (ORSI; AGOSTINHO, 1999; TROCA; VIEIRA, 2012), cenário que acontece no mundo todo e nas diferentes bacias hidrográficas do Brasil. A globalização torna-se também, um fator predisponente, e proteger as fronteiras nacionais contra invasões biológicas se faz cada vez mais difícil, já que as pessoas responsáveis por essas ações raramente são legalmente responsabilizadas, fazendo referência ao "princípio do poluidor-pagador" proposto por PERRINGS et al. (2005). O impacto causado por espécies invasoras, influencia profundamente a composição e a estrutura organizacional dos peixes, resultando na redução da diversidade genética, na perda de funções e processos da cadeia trófica, na destruição do habitat, modificações nas pressões evolutivas, redução de estoques de espécies nativas e sua possível extinção, além da diminuição na qualidade dos recursos pesqueiros, comprometendo o mercado de peixes nativos e a fonte alimentar de populações locais (CANONICO et al., 2005; VITULE, 2009; VITULE; FREIRE; SIMBERLOFF, 2009; CUCHEROUSSET; OLDEN, 2011; TROCA; VIEIRA, 2012) e um potencial para o desequilíbrio das interações parasita-hospedeiro. As invasões biológicas devem ser consideradas, uma vez que, além de indicar a movimentação de espécies em um novo território, também podem carregar consigo seus parasitas, formando uma éspecie de unidade biótica (GALLI et al., 2005), as quais podem infectar as espécies pertencentes ao ambiente introduzido e adicionalmente, parasitas nativos também podem ou não colonizar o hospedeiro introduzido (Fig. 1) (AZEVEDO et al., 2012; LACERDA et al., 2012; BITTENCOURT et al., 2014). ROCHE et al. (2010) compararam o parasitismo entre ciclídeos nativos e introduzidos na bacia do Canal do Panamá e observaram que O. niloticus foi infectada por uma única espécie de parasita de distribuição nativa, mas compartilhou oito espécies de parasitas com o peixe nativo Vieja maculicauda Regan, 1905. SMIT; MALHERBE; HADFIELD (2017) através de um levantamento bibliográfico sobre a introdução de parasitas em peixes nativos e exóticos sugeriram que a ocorrência de 23 parasitas exóticos em determinado ambiente é baixa, quando se considera que pelo menos 17 espécies de peixes invasores de água doce são estabelecidos nas águas sul-africanas, proporcionando a translocação um risco ecológico e econômico secundário, mas muitas vezes desconsiderado. 22 COLAUTTI et al. (2004) propuseram que o rápido estabelecimento e proliferação de espécies invasoras ocorre pela perda de seus inimigos naturais (patógenos, parasitas e predadores) durante a movimentação do hospedeiro (Hipótese do Escape do Inimigo- HEI). Pois, se a espécie invasora não traz seus inimigos naturais consigo, ela deve sofrer certo alívio em sua nova distribuição geográfica. Estudos desde o ponto biogeográfico tem demonstrado que os níveis de infecção por vários parasitas diminuem à medida que a espécie invasora se espalha desde o ponto de introdução (PERKINS et al., 2017; SELECHNIK et al., 2017), e pelas características do hospedeiro que são mais propensas a determinar as interações parasita-parasita, uma vez que várias espécies de parasitas que infectam simultaneamente um hospedeiro, podem interagir umas com as outras, para um maior sucesso na invasão do hospedeiro (PERKINS et al., 2017). Por tanto, a perda dos inimigos naturais nem sempre pode facilitar imediatamente o estabelecimento de espécies exóticas, pois o processo de invasão ocorre gradualmente dependendo diretamente das interações entre o hospedeiro, parasitas e o ambiente (POULIN, 2017). Figura 1. Possíveis cenários da introdução de peixes e seus parasitos. a) O peixe não está parasitado em seu ambiente de origem e assim é transportado. No ambiente invadido, o peixe pode seguir sem parasitas, ou adquirir parasitas de peixes nativos do ambiente invadido. b) O peixe está parasitado em seu ambiente de origem, podendo perder ou não seus parasitas durante 23 o transporte. c) No primeiro caso, o peixe introduzido pode continuar não parasitado ou ser colonizado por parasitas de peixes do ambiente invadido. d) No segundo caso, o parasita é transportado junto com o peixe e pode ou não se estabelecer no ambiente invadido. e) Se o parasito não tem sucesso no ambiente invadido, o peixe pode seguir livre de parasitas ou ser parasitado por parasitas de peixes nativos do ambiente invadido. f) Se o parasita for bem sucedido no ambiente invadido, o peixe introduzido pode manter sua fauna parasitária de origem no novo ambiente, com possibilidade de adquirir parasitas de peixes nativos da nova área. Há ainda a possibilidade de parasitas introduzidos colonizarem peixes nativos da região invadida, independentemente do sucesso dos peixes introduzidos no novo ambiente (in LACERDA et al., 2013). 2.4 Caracterização das espécies de estudo O gênero Serrasalmus, pertence à familia Serrasalmidae, ordem Characiformes, e abriga 28 espécies válidas, ocorrendo em águas doces, as quais estão distribuídas pela maior parte das bacias hidrográficas Sul-americanas. No Brasil, a bacia do rio Amazonas abriga todos os gêneros de serrasalmídeos e apenas seis ocorrem na bacia Paraná-Paraguai e três na bacia do rio São Francisco (JÈGU, 2003). Além da grande distribuição geográfica, os serrasalmídeos ocupam uma extensa diversidade de habitats, estando presentes desde planícies, lagos e florestas alagadas até correntezas e quedas de água em cabeceiras de rios (GÉRY, 1977). A ‘piranha’, como é popularmente conhecida, tem sido encontrada habitando locais diferentes dos acima mencionados, também como as bacias hidrograficas do Alto Paraná e do Baixo- Médio Tietê (PELICICE; AGOSTINHO; GOMES, 2005; MARUYAMA et al., 2010a; OYAKAWA; MENEZES, 2011; DAVID et al., 2016). A participação das piranhas (cinco espécies) na pesca comercial é baixa em Manaus, representando menos de 5% da produção total de pescado, sendo considerado sutil seu grau de importância econômica (SANTOS; FERREIRA; ZUANON, 2006). MARUYAMA et al. (2010a) reportaram uma produção pesqueira menor que 2% de Serrasalmus sp. nos reservatórios do médio rio Tietê nos anos 2003-2004. Todavia, em 24 conversa com pescadores artesanais que auxiliaram na coleta de exemplares deste estudo, as piranhas fazem parte da alimentação (caldo e filet) das comunidades ribeirinhas às margens dos rios (Fig. 2). Mundialmente famosas por lendas sobre sua ferocidade, possuem uma série de espinhos em forma de serra na linha mediana da bariga e uma única fileira de dentes em cada mandíbula, afiados e com cúspides (dentes tricuspidados) (BRITSKI; SILIMON; LOPES, 2007). Possuem hábito alimentar piscívoro, se alimentando de pedaços de nadadeiras, escamas e outras partes do corpo de suas presas e também de artrópodos, microcrustáceos e material vegetal (AGOSTINHO; HAHN; MARQUES, 2003). Apresentam coloração bastante variada em função do estágio de desenvolvimento e da coloração da água em que vive (SANTOS; FERREIRA; ZUANON, 2006). Figura 2. Filet de Serrasalmus maculatus utilizada na alimentação de comunidades ribeirinhas do trecho Médio do Rio Tiete. (Fonte: Prada-Mejia, K D). 2.4.1 Serrasalmus maculatus Kner, 1858 Serrasalmus maculatus pertence à ordem Characiformes e família Serrasalmidae. É conhecida localmente como Piranha, Piranha-amarela, Pirambeba, Catirina ou Piranha- mafura (Fig. 3). Pertencente ao rio Guaporé, Mato Grosso, Brasil, mas hoje encontra-se distribuída também pelos rios Amazonas e Orinoco, ocorrendo na Argentina, Bolívia, Brasil, Colômbia, Paraguai, Peru e Uruguai (JÈGU, 2003). Até recentemente essa espécie era denominada como S. spilopleura habitando a bacia Paraná-Paraguai (BRITSKI; https://es.wikipedia.org/wiki/Orden_(biolog%C3%ADa) https://es.wikipedia.org/wiki/Characiformes https://es.wikipedia.org/wiki/Familia_(biolog%C3%ADa) https://es.wikipedia.org/wiki/Serrasalmidae 25 SILIMON; LOPES, 2007; GRAÇA; PAVANELLI, 2007) e rio Uruguai (SVERLIJ et al., 1998; BEHR; SIGNOR, 2008), bem como em toda região do alto Paraná (COSTA et al., 2005). Apresentam características de peixes tanto de ambientes lênticos quanto lóticos, comuns em reservatórios e regiões alagadas (SAZIMA; MACHADO, 1990; VILLARES; GOMIERO; GOITEIN, 2008). São peixes sociais, que formam pequenos cardumes de até 20 indivíduos. Serrasalmus maculatus pode ser diferenciada de seus congêneres pela combinação de caracteres: nadadeira caudal com margem distal hialina, precedida por uma faixa escura transversal (GRAÇA; PAVANELLI, 2007); faixa de escamas na base da nadadeira anal cobrindo no máximo um terço do comprimento dos raios (OTA et al., 2013); perfil dorsal da cabeça pouco côncavo, quase reto na região interorbital (BRITSKI; SILIMON; LOPES, 2007) e espaço interorbital estreito. Quando viva ou recém-coletada, essa espécie apresenta escamas com reflexos amarelo-prateados (SANTOS; FERREIRA; ZUANON, 2006). Os adultos, podem alcançar até 34,5 cm de comprimento (MARQUES et al., 2016). Figura 3. Exemplar de Serrasalmus maculatus coletado no trecho médio Tietê, município de Arealva-SP. (Fonte: Prada-Mejia, K D). A dieta de S. maculatus é variada e de estratégia alimentar altamente oportunista, que inclui mimetismo agressivo (SAZIMA; MACHADO, 1990); mostra predoninância piscívora, exclusiva para exemplares com comprimento superior a 22 cm. Itens como 26 nadadeiras de peixes, insetos aquáticos e crustáceos são ingeridos por exemplares de tamanhos menores (2-4 cm de comprimento padrão), os quias são substituídos por fragmentos de peixes à medida que o comprimento corporal é ≥ 12cm de comprimento. Padrão ontogenético trófico relatado por vários autores (SAZIMA; MACHADO, 1990; AGOSTINHO; HAHN; MARQUES, 2003; COSTA et al., 2005; BEHR; SIGNOR, 2008; VILLARES; GOMIERO; GOITEIN, 2008). O consumo de vegetais aquáticos pela espécie é considerado acidental durante o ato predatório (COSTA et al., 2005). 2.4.2 Serrasalmus marginatus Valenciennes, 1837 A piranha S. marginatus, da ordem Characiformes, família Serrasalmidae, pertence a região Neotropical. Amplamente distribuída pelos rios do Pantanal e na bacia do rio Paraguai-Paraná (SAZIMA; MACHADO, 1990). Nativa da bacia do baixo rio Paraná e desde a década de 1980 é invasora da bacia do alto rio Paraná (AGOSTINHO; JÚLIO; PETRERE, 1994; AGOSTINHO; JÚLIO, 2002), colonizando até o trecho Médio do rio Tietê (presente estudo). O sucesso da invasão de S. marginatus à outras bacias hidrográficas pode ser explicado por sua agressividade em estabelecer territórios de alimentação (AGOSTINHO, 2003; AGOSTINHO; HAHN; MARQUES, 2003) e por seu longo período reprodutivo associado à agressividade em relação à proteção da prole, o que garante a perpetuação da espécie (DE MELO; DE SANTANA; DEI TOS, 2017). Morfologicamente, apresenta um conjunto de características comuns as suas congêneres Serrasalmus, como tamanho médio, com corpo alto e comprimido lateralmente; presença de uma série de espinhos formando uma quilha ventral e presença de um espinho pré-dorsal anteriormente direcionado. Possui apenas uma série de seis dentes triangulares cortantes, pontiagudos e alinhados (OTA et al., 2013); com variação na coloração dos olhos, que podem ser vermelhos ou amarelos (RAICK et al., 2020). Difere das suas congêneres com uma margem da nadadeira caudal escura em extensão variável, podendo estender-se até a base dessa nadadeira; perfil dorsal da cabeça muito côncavo; várias manchas escuras de tamanhos e formas variadas no corpo; nadadeiras caudal e anal total ou parcialmente escuras; demais nadadeiras claras ou amareladas, com poucos pigmentos escuros dispersos (GRAÇA; PAVANELLI, 2007) (Fig. 4). 27 Figura 4. Exemplar de Serrasalmus marginatus coletado no trecho médio Tietê, município de Arealva-SP. (Fonte: Prada-Mejia, K D). São predadores piscívoras e solitários, com preferência por peixes inteiros, pedaços de barbatanas, partes do corpo de suas presas, insetos e ingestão acidental de fragmentos de plantas, no entanto, diferenças significativas na dieta estão associadas à época do ano e ao desenvolvimento ontogenético da espécie (AGOSTINHO; HAHN; MARQUES, 2003; CARVALHO et al., 2007; FERREIRA et al., 2014). Para conseguir se alimentar, S. marginatus, aproxima-se da sua presa com um movimento lento e furtivo por trás ou por baixo, atingindo a cauda ou nadadeira anal da presa, da qual um pedaço é cortada com um movimento brusco do corpo. O período de atividade é diurna e durante a noite abriga-se entre a vegetação, embora alguns peixes grandes (15-20 cm de comprimento) estendam sua atividade de forrageamento ao anoitecer (cerca de 18:00- 19:00 h) (SAZIMA; MACHADO, 1990). 2.5 Parasitas do filo Apicomplexa Os protistas do filo Aplicomplexa Levine, 1970, infrafilo Sporozoa, estão entre o grupo de microrganismos que inclui formas patogênicas e parasitárias que ocorrem em uma grande variedade de organismos vertebrados (heterotérmicos e homeotérmicos) e invertebrados (CREMONTE; BALSEIRO; FIGUERAS, 2005; MAIA, 2015). Desse 28 modo, os parasitas do filo Apicomplexa têm recebido atenção nos últimos anos, devido sua importância para os humanos e saúde veterinária (SLODKI et al., 2011; TALEVICH; MIRZA; KANNAN, 2011). As doenças causadas pelas espécies parasitas deste filo ainda são consideradas negligenciadas (BARTOŠOVÁ-SOJKOVÁ et al., 2015), pelo número reduzido de estudos sobre a diversidade e dinâmica desses organismos parasitas (SILVA et al., 2019a). São todos parasitas intracelulares obrigatórios, cujos estágios móveis invasivos são caracterizados pela presença de um complexo apical evolutivamente único (organelas secretoras subjacentes à estrutura oral) (LEVINE et al., 1980; SOUZA et al., 2010). O complexo inclui um conoide, compreendendo microtúbulos espiralados, um ou mais anéis polares, micronemas, roptrias e microtúbulos que se estendem em direção à parte posterior do pólo anterior (MOLNÁR, 2006; STEINHAGEN; DAVIES, 2008). Este complexo apical facilita a penetração dos parasitas nas células hospedeiras, pois está associado à motilidade, adesão, invasão e estabelecimento de um vacúolo parasitóforo, nos estágios de esporozoíto, merozoíto e gamonte. (SOLDATI; FRANCOIS; LEBRUN, 2001; TOMLEY et al., 2001; DOGGA et al., 2015). Estas estruturas são visíveis apenas ao microscópio eletrônico de transmissão. Em peixes, o número de apicomplexanos que ocorrem nas classes Coccidea Leuckart, 1897 e Haematozoa Vivier, 1982 não é bem conhecido. A maioria dos estudos taxonômicos sobre coccídios limitam-se a descrições inadequadas das espécies com base na morfologia de seus estágios exógenos (ou seja, oocistos), e há falta de informações sobre o ciclo de vida e patogenecidade da maioria das espécies (FOURNIE; HAWKINS; OVERSTREET, 1985; JIRKŮ et al., 2009; BARTOŠOVÁ-SOJKOVÁ et al., 2015). Mesmo nos coccídios mais estudados (de roedores), apenas cerca de 8% são conhecidas, e estudos moleculares têm sido cada vez mais utilizados para entender as relações filogenéticas entre protozoários deste filo (TENTER et al., 2002). A classificação taxonômica deste filo tem evoluído ao longo dos tempos, embora com várias modificações realizadas. O filo Apicomplexa é constituído por quatro grupos claramente definidos: os coccídios, os gregarinos, os hemósporos e os piroplasmídeos (ADL et al., 2005), sendo que, a classificação destes grupos foi baseado primariamente em suas características fenotípicas, como seu hospedeiro e / ou vetor associado, e órgão 29 alvo, descrevendo apenas sua estrutura organizacional, sem refletir sua história evolutiva (Tenter et al., 2002; Morrison, 2009). O esquema organizacional do filo (descrito abaixo) é proposto por STEINHAGEN; DAVIES (2008), no qual são consideradas duas classes Coccidea e Haematozoa em peixes: Classe Coccidea Leuckart, 1897 Ordem Eucoccidiorida Léger & Duboscq, 1910 Subordem Adeleorina Léger, 1911 Família Dactylosomatidae Jakowska & Nigrelli, 1955 Gênero Dactylosoma Labbé, 1894 Gênero Babesiosoma Jakowska & Nigrelli, 1956 Família Haemogregarina Danilewsky, 1885 Gênero Haemogregarina Danilewsky, 1885 Gênero Cyrilia Lainson, 1981 Gênero Desseria Siddall, 1995 Subordem Eimeriorina Léger, 1911 Família Cryptosporidiidae Léger, 1911 Gênero Cryptosporidium Tyzzer, 1907 Família Eimeriidae Minchin, 1903 Gênero Eimeria Schneider, 1875 Gênero Epieimeria Dyková & Lom, 1981 Gênero Goussia Labbé, 1899 Gênero Isospora Schneider, 1881 Família Calyptosporiidae Overstreet, Hawkins & Fournie, 1984 Gênero Calyptospora Overstreet, Hawkins & Fournie, 1984 Classe Haematozoa Vivier, 1982 Ordem Haemospororida Danilewsky, 1885 Família Plasmodiidae Mesnil, 1903 Gênero Mesnilium Misra, Haldar & Chakravarty, 1972 30 A ordem Eucoccidiorida, conhecida como coccidia, é taxonomicamente a mais diversa dentro da classe Coccidiasina, infectando peixes marinhos e de água doce, incluindo numerosas famílias e gêneros, com relações filogenéticas obscuras e ancestralidade compartilhada (JIRKŮ et al., 2009; MOLNÁR et al., 2012) e implicações sanitárias e econômicas (SANTIAGO et al., 2012; FRIEND; LOVY; HERSHBERGER, 2016; XAVIER et al., 2020). Os coccídios sensu stricto contêm dois subgrupos, ou seja, os coccídios adeleides e eimerídeos (COX, 1994). Seu ciclo de vida típico possui três fases: sofrem multiplicação sucessiva por merogonia (divisões assexuadas produzindo merontes com merozoítos), seguido por gamogonia (fusão de dois tipos de gametas resultando em um oocisto) e esporogonia (reprodução assexuada produzindo esporozoítos) (DAVIES; BALL, 1993). Em outros grupos de coccídios, a gamogonia é caracterizada pelo desenvolvimento independente de macrogametas (fêmeas) e microgametas (machos), sendo este último móvel e frequentemente produzidos em grande número. Além disso, os esporozoítos são tipicamente finalizados em esporocistos que se formam dentro de oocistos que são liberados no ambiente como um estágio resistente (LEVINE et al., 1980; TENTER et al., 2002). O intestino é o local preferido para a esporogonia, mas os coccídios piscinos são caracterizados por seu desenvolvimento extraintestinal frequente, com esporulação exógena (fora do hospedeiro) ou endógena (dentro do hospedeiro) (DAVIES; BALL, 1993; BARTOŠOVÁ-SOJKOVÁ et al., 2015) (Fig. 5). Coccidianos parasitas de hospedeiros heterotérmicos diferem dos homeotérmicos por (1) oocistos de paredes finas sem micrópila (uma abertura da parede do oocisto), (2) macrogamontes sem corpos formadores de parede, (3) esporocistos com estruturas de excistação (suturas) e projeções da parede do esporocisto (véus membranáceos, esporópodes) e (4) localização epicelular frequente (BARTOŠOVÁ-SOJKOVÁ et al., 2015; VALIGUROVÁ et al., 2015). 31 Figura 5. Fases do ciclo de vida do Calyptospora spinosa; 1- Zigoto (vacúolo parasitóforo*; CH; célula hospedeira); 2- Formação do esporoblasto; 3- esporoblastos jovens; 4-Esporoblasto maduro rodeado pelo véu, esporocisto. Fonte: AZEVEDO et al. (1995). 2.5.1 Gênero Calyptospora Overstreet, Hawkins & Fournie, 1984 O gênero Calyptospora pertencente à família Calyptosporidae, foi descrito pela primeira vez com Calyptospora empristica Fornie et al. 1985 em peixes teleósteos parasitando o tecido hepático de Fundulus notti no Mississipi, Estados Unidos (FOURNIE; HAWKINS; OVERSTREET, 1985). Esta família engloba um único gênero, Calyptospora, que tem, em sua maioria, registros na região tropical. Na última década, as técnicas filogenéticas moleculares forneceram uma riqueza de dados que puderam elucidar e auxiliar no entendimento da evolução dos coccídios, como a descoberta de novas espécies ou gêneros, uma vez que apenas critérios morfológicos, como a proporção de esporocistos e esporozoítos por oocisto não é suficiente (JIRKŮ et al., 2002; WHIPPS et al., 2012; BERTO; MCINTOSH; LOPES, 2014). Antigamente, o gênero Calyptospora era considerado como Eimeria, confundido pela similaridade com a espécie Eimeria funduli, infectando ‘Killifish do Golgo’ Fundulus grandis na área costeira do Mississippi, Estados Unidos (in Overstreet, Hawkins, and Fournie 1984). Mesmo com a ausência de dados sobre o ciclo de vida de todas as espécies, esta espécie foi alocada em um novo gênero, Calyptospora e em uma nova família Calyptosporidae de forma confiável (OVERSTREET, 1981; OVERSTREET; HAWKINS; FOURNIE, 1984; WHIPPS et al., 2012). O primeiro relato sobre a ocorrência de coccídios em peixes sul-americanos, foi sobre a presença de Calyptospora serrasalmi Cheung et al. 1986 no fígado da piranha preta Serrasalmus niger 32 Jardine, 1841 mantida em um aquário de Nova York (CHEUNG; NIGRELLI; RUGGIERI, 1986). Atualmente, a diversidade de espécies deste gênero ainda é pouco conhecida, incluindo apenas sete epécies descritas em peixes da região Amazônica (SILVA et al., 2020) (Tabela 1). Dentre elas, encontram-se o Calyptospora funduli Duszynski et al. 1979; C. empristica Fornie et al. 1985 e C. serrasalmi Cheung et al. 1986, descritas nos EUA; Calyptospora tucunarensis Békési and Molnár 1991; Calyptospora spinosa por Azevedo et al. 1993; Calyptospora paranaidji Silva et al. 2019 e Calyptospora gonzaguensis Silva et al. 2020, registradas no Brasil. São parasitas obrigatórios de tecidos e órgãos de peixes e invertebrados aquáticos, e tem como sítio de infecção o fígado, gônadas, vesícula biliar, tecido adiposo, coração, intestino e ovários (AZEVEDO et al., 1993; ALBUQUERQUE; BRASIL-SATO, 2010; NEGRÃO et al., 2019; SILVA et al., 2020). Um peixe parasitado pelas espécies parasitas deste gênero, ao observar após necrópsia apresenta fígado com manchas acinzentadas e coloração esbranquiçada nos lobos hepáticos (CHEUNG et al., 1986; VELASCO et al., 2012). Tabela 1. Parasitas coccídeos do gênero Calyptospora registrados na Ámerica. Espécie Hospedeiro Órgão alvo Local Autores C. funduli1 Fundulus sp. Fígado Mississipi/USA DUSZYNSKI; SOLANGI; OVERSTREET (1979) C. funduli2 Opsamum beta Fígado Mississipi/USA OLIVEIRA et al. (1993) C. empristica Fundulus nottii Fígado Mississipi/USA FOURNIE; HAWKINS; OVERSTREET (1985) C. serrasalmi Serrasalmus rhombeus Fígado Nova York/USA CHEUNG P J; NIGRELLI; RUGGIERI (1986) C. serrasalmi2 Serrasalmus striolatus Fígado Pará/BR CASAL et al. (2007) C. tucunarensis Cichla ocellaris Fígado Ceará/BR BÉKÉSI; MOLNÁR (1991) C. spinosa Crenicichla lepidota Fígado, gônada e ovários Pará/BR AZEVEDO; MATOS; MATOS (1993) 33 C. gonzaguensis Triportheus angulatus Fígado, vesícula biliar, tecido adiposo Divisa Maranhão e Tocantins/BR SILVA et al. (2020) C. paranaidji Cichla piquiti Fígado Divisa Maranhão e Tocantins/BR SILVA et al. (2019b) Calyptospora sp. Brachyplatystoma vaillantii Fígado Pará/BR SILVA et al. (2012) Tetragonopterus chalceus Intestino Minas Gerais/BR ALBUQUERQUE; BRASIL-SATO (2010) Triportheus guentheri Aspistor quadriscutis Fígado Pará/BR RAMOS et al. (2018) Arapaima gigas Manaus/BR BONAR et al. (2006) Crenicichla lepidota Amapá/BR NEGRÃO et al. (2019) Cichla ocelaris Hoplias malabaricus Hoplerythrinus unitaeniatus Hoplerythrinus unitaeniatus Satanoperca jurupari Heros efasciatus Mesonauta festivus Fígado,vesícula biliar Astronotus ocellatus Pterophyllum scalare Geophagus proximus Fígado,vesícula biliar, coração 34 Brachyplatystoma rousseauxii Fígado Pará/BR DIAS (2013) Hoplias malabaricus Pará/BR BARBOSA et al. (2002)* Rhamdia quelen - MURATORI et al. (2002)* Arapaima gigas Paraná/BR ALBUQUERQUE et al. (2007)* Cichla temensis Pará/BR VELASCO et al. (2012) Cichla temensis Isla Marajó/BR SANTIAGO et al. (2012) Aequidens plagiozonatus Pará/BR VIDEIRA et al. (2013) Serrasalmus rhombeus Pará/BR OLIVEIRA et al. (2021) (*) Tomado de EIRAS et al. (2012). 2.5.1.1 Morfologia Os oocistos de Calyptospora sp., quando observados em microscopia de luz (ML) formam vacúolos parasitóforos com quatro esporocistos (Fig. 6a), cada um coberto por um véu membranoso e contendo em seu interior dois esporozoítos. Em muitos casos, são observadas células iniciais do ciclo de vida ou já formando vacúolos parasitóforos, quando se encontram parasitas em diferentes fases do ciclo de vida, variando a forma dos esporocistos, de arredondada, a elipsoide e piriformes (AZEVEDO et al., 1993, 1995; CASAL et al., 2007) (Fig. 6b, e 7). Caracterizam-se pela falta de corpos de Stieda ou Sub- Stieda; ii) o esporocisto coberto por um véu fino apoiado por um ou mais esporópodes (projeções alongadas da parede do esporocisto), iii) matriz relativamente homogênea entre os véu e esporocistos, e iv) uma abertura coberta por membrana para liberação de esporozoítos (AZEVEDO et al., 1993, 1995; CASAL et al., 2007). 35 Figura 6. Fotomicrografia de oocistos fresco; a) com esporocistos dentro (seta) e imaturos (*) no tecido hepático de Serrasalmus maculatus, X 400. Fonte: Prada-Mejia, K D. b) SEM de um esporocisto isolado mostrando o corpo elipsoidal, o esporopódio e suas projeções esporopódicas laterais, X 9000. Fonte: AZEVEDO et al. (1993). Figura 7. Desenho esquemático da organização morfológica de um grupo de oocistos (a, b), e um oocisto (c) contendo quatro esporocistos (d, e), cada uma com dois esporozoítos. Fonte: CASAL et al. (2007). 36 2.5.1.2 Ciclo de vida O ciclo de vida é dixeno (EIRAS; TAKEMOTO; PAVANELLI, 2010), no entanto, foi observado em C. funduli parasitando peixe-sapo do Golfo, Opsanus beta que todas as fases do ciclo de vida ocorriam no fígado do hospedeiro (OLIVEIRA et al., 1993). Sabe-se que a merogonia e a gamogonia ocorrem em diferentes espécies de camarão da família Palaemonidae, o qual é infectado pela ingestão de restos de vísceras de peixes mortos contendo oocistos esporulados, enquanto a esporogonia ocorre no fígado de peixes teleósteos, pela ingestão do camarão infectado (FOURNIE; OVERSTREET, 1983; OVERSTREET; HAWKINS; FOURNIE, 1984; FOURNIE; HAWKINS; OVERSTREET, 1985; FOURNIE et al., 2000). Todavia, o ciclo de vida deste gênero ainda não está completamente elucidado, pois não se sabe ao certo quais hospedeiros invertebrados estão envolvidos nas diferentes espécies de Calyptospora descritas, visto que, uma ou mais espécies de camarões podem estar envolvidas nos ciclos de transmissão (NEGRÃO et al., 2019). 3. REFERÊNCIAS ADL, S. M. et al. The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the taxonomy of protists. Journal of Eukaryotic Microbiology, v. 52, n. 5, p. 399–451, 2005. ADLARD, R. D.; MILLER, T. L.; SMIT, N. J. 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Calyptosporidae, é a única família da classe Coccidea com apenas um gênero descrito, parasita de tecidos e órgãos de peixes e invertebrados aquáticos. Em contraste com outros apicomplexos da subordem Eimeriorina, a diversidade e ecologia das espécies de Calyptospora têm sido pouco investigada, com escasso conhecimento sobre suas relações filogenéticas, ciclo de vida e patogenecidade. Neste estudo, Serrasalmus maculatus foi coletada em diferentes períodos no rio Tietê, SP. O estudo taxonômico dos parasitas foi realizado a partir da análise morfológica, morfométrica, molecular e filogenética do parasita e patológica do fígado. Foram observados oocistos no tecido hepático de 64,7% das piranhas coletadas, com alterações leves a moderadas que não comprometeram a função do órgão. Tecidos hepáticos de S. maculatus infectados por Calyptospora foram utilizados para detectar os parasitas em PCR com primers específicos e amplificação de uma região do gene 18S rRNA. As sequências obtidas de S. maculatus foram idênticas e apresentaram 98% de similaridade com Calyptospora gonzaguensis e com Calyptospora serrasalmi. Este estudo é o primeiro a relatar a ocorrência de espécie de Calyptospora no tecido hepático de um novo hospedeiro em uma nova região geográfica. Palavras- chave: Apicomplexa, Calyptospora spp., gene 18S rRNA, piranha amarela, rio Tietê. 52 1. INTRODUÇÃO As invasões biológicas como consequência da ação antrópica devido à construção de barragens (AGOSTINHO; PELICICE; GOMES, 2008), comercialização de diferentes espécies de peixes, translocação global e a introdução de peixes de água doce em regiões não nativas, criaram uma oportunidade ideal para a introdução conjunta de seus parasitas (SMIT; MALHERBE; HADFIELD, 2017), bem como, um fator potencial para o desequilibrio nas interações parasita-hospedeiro (GALLI et al., 2005). As comunidades de peixes de água doce presentes nas bacias hidrográficas do estado de São Paulo são diversas. Existem cerca de 391 espécies, que correspondem a aproximadamente 15% do total estimado para todo o território brasileiro (OYAKAWA; MENEZES, 2011). No entanto, pouco se sabe sobre as relações parasitárias entre os coccidianos e a ampla diversidade de animais aquáticos no Brasil (EIRAS et al., 2012) e propiamente nos cursos hidrográficos do estado de São Paulo. Coccidianos do filo Apicomplexa são parasitas intracelulares obrigatórios, que infectam vertebrados (heterotérmicos e homeotérmicos) e invertebrados, com impacto econômico e sanitário nos humanos e animais (SLODKI et al., 2011; BARTOŠOVÁ- SOJKOVÁ et al., 2015; MAIA, 2015; SILVA et al., 2020). Em peixes, é considerada uma doença “negligenciada”, uma vez que o ciclo de vida desses parasitas ainda não foi totalmente elucidado (BARTOŠOVÁ-SOJKOVÁ et al., 2015). Como este parasita ainda é pouco estudado, entendimento sobre seu ciclo de vida e sua patogenecidade ainda não foram completamente entendidos. Em contrapartida, a complexa relação evolutiva entre esses parasitas foi amplamente discutida (TENTER et al., 2002; MORRISON, 2009; XAVIER et al., 2018). O clado Calyptospora revela um táxon monofilético distinto de outras espécies coccidianas (WHIPPS et al., 2012). Este gênero, tem como sítio de infecção o tecido hepático de peixes teleósteos de água doce e salgada (CHEUNG et al., 1986; SANTIAGO et al., 2012). No entanto, nos últimos anos, o interesse pela diversidade e dinâmica desses organismos parasitas, demonstrou características importantes de invasão parasitária e ecologia de transmissão (NEGRÃO et al., 2019), ocorrendo em orgãos tais como gônadas, vesícula biliar, tecido adiposo, coração, intestino e ovários de várias espécies de peixes 53 amazônicos (AZEVEDO et al., 1993; BONAR et al., 2006; ALBUQUERQUE; BRASIL- SATO, 2010; NEGRÃO et al., 2019; SILVA et al., 2020). Parasitas desse gênero são comumente encontrados parasitando peixes de águas tropicais da região amazônica, porém, relatos na literatura internacional sobre sua diversidade são escassos, sendo descritos apenas sete espécies em peixes nos Estados Unidos: Calyptospora funduli Duszynski et al. 1979, Calyptospora empristica Fornie et al. 1985 e Calyptospora serrasalmi Cheung et al. 1986 em S. niger e no Brazil: Calyptospora tucunarensis Békési and Molnár, 1991 em Cichla ocellaris Bloch and Schneider, 1801; Calyptospora spinosa Azevedo et al. 1993 em Crenicichla lepidota Heckel, 1840; Calyptospora paranaidji Silva et al. 2019b em Cichla piquiti Kullander and Ferreira, 2006; e Calyptospora gonzaguensis Silva et al. 2020 descrita em T. angulatus. Os avanços científicos sobre os caliptosporídeos em peixes são poucos e existem informações limitadas sobre a importância da coccidiose em peixes tropicais e os mecanismos de sua invasão parasitária. Desta forma, este estudo descreve pela primeira vez a ocorrência de espécies de Calyptospora no tecido hepático da piranha amarela Serrasalmus maculatus Kner, 1858, na bacia hidrográfica do Rio Tietê, São Paulo, bem como a interação entre o parasitismo, índice hepatossomático, sexo e comprimento. 2. MATERIAS E MÉTODOS 2.1.Área de estudo e captura dos peixes Este estudo foi realizado no trecho médio do rio Tietê, próximo a uma piscicultura comercial produtora de tilápia em tanque-rede, localizada no município de Arealva, no estado de São Paulo, Brasil (22°05'21.8"S 48°51'44.7"W) (Fig. 8). Um total de 88 exemplares de S. maculatus foram capturados em outubro de 2020 e março de 2021, pela equipe do Laboratório de Microbiologia e Parasitologia de Organismos Aquáticos (LAPOA) do Centro de Aquicultura da Unesp (CAUNESP), juntamente com o auxílio de pescadores locais, utilizando varas de pesca. A captura dos animais foi autorizada pelo Ministério do Meio Ambiente do Brasil (licença SISBIO nº 69947). 54 Figura 8. Local da amostragem realizada no trecho médio do Rio Tietê, município de Arealva- SP, próximo a Piscicultura Toca da Tilápia. Fonte: Google Maps; desenho tomado de VITTI et al. (2017). Imediatamente, após a captura dos animais, estes foram anestesiados em solução alcóolica de benzocaína (100 mg.L-1), aspergida diretamente nas brânquias com auxílio de um borrifador, para melhor manejo e bem estar dos peixes, afim de obter dados biométricos, como o peso (W em gr), comprimento total (TL em cm) e comprimento padrão (SL em cm). O fator de condição de Fulton foi determinado (K = W/TL × 100). Logo após, os peixes foram identificados, fotografados individualmente para caraterização taxonômica (a nível de espécie) e eutanasiados por comoção cerebral. Os peixes foram individualmente armazenados em sacos plásticos e mantidos sob 55 refrigeração em caixas de isopor contendo gelo, até serem transportados ao Laboratório de Microbiologia e Parasitologia de Organismos Aquáticos (LAPOA), Jaboticabal- SP, onde foram necropsiados. A identificação das espécies das piranhas coletadas neste estudo foi realizada pelo Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aquicultura da Universidade Estadual de Maringá, e amostras depositadas e cadastradas na coleção do Nupélia/UEM (lote do voucher NUP22739). Os exemplares de crustáceos coletados foram identificados pelo Laboratório de Morfologia de Invertebrados da UNESP/FCAV- Jaboticabal, SP. Todos os procedimentos com os animais seguiram os princípios éticos adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, sendo que o estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de animais (CEUA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal, São Paulo, Brasil (Protocolo nº 349/21). 2.2.Identificação morfológica dos parasitas Na identificação dos parasitas, os peixes foram dissecados e quando possível o fígado pesado (LW em gr) para o cálculo do índice hepatossomático (IHS = LW/W × 100). Pequenos fragmentos de tecido hepático foram macerados entre lâmina e laminula para observação dos oocistos em microscópio óptico (Nikon E200®). Os procedimentos de necropsia dos peixes, coleta, fixação, conservação e montagem dos parasitas para identificação foram realizados de acordo com EIRAS; TAKEMOTO; PAVANELLI, (2006). Após confirmação da infecção, as lâminas com o tecido hepático contendo oocistos foram fotografadas em microscópio óptico (Leica®DM2500), acoplado a um sistema de captura de imagens (Leica®DFC295), para determinar a morfometri