Alana Evangelista Honório
Prospecção química e biológica do fungo
endofítico Saccharicola sp. isolado de
Eugenia jambolana (Myrtaceae).
Dissertação apresentada ao Instituto
de Química, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em
Química.
Orientadora: Profa. Dra. Angela Regina Araujo
Araraquara
2013
UNESP - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Julio de Mesquita Filho”
Programa de Pós-graduação em Química
Data de Ingresso no Programa: 08/08/2011
Alana Evangelista Honório
Prospecção Química e Biológica do Fungo
Endofítico Saccharicola sp. isolado de
Eugenia jambolana (Myrtaceae)
Orientadora: Profa. Dra. Angela Regina Araujo
Araraquara
2013
DADOS CURRICULARES
DADOS PESSOAIS
Nome: Alana Evangelista Honório
Filiação: Manoel Augusto Honório e Margareth Martins Evangelista
Data de Nascimento: 25 de fevereiro de 1987
Naturalidade: São João da Boa Vista - SP
Nacionalidade: Brasileira
ENDEREÇO PROFISSIONAL
NuBBE – Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais.
Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho,
Instituto de Química de Araraquara
Rua Prof. Francisco Degni, n. 55 – Araraquara-SP,
CEP: 14081-970, SP - Brasil
Telefone: 16 3301-9600 (ramal 9793)
e-mail: lana_quim@yahoo.com.br
FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO
2011 - 2013
Mestrado em Química
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP – Araraquara, SP.
Título: Prospecção química e biológica do fungo endofítico Saccharicola sp. isolado de
Eugenia jambolana (Myrtaceae).
(Ano de obtenção: 2013)
Orientadora: Profa. Dra. Angela Regina Araujo
Bolsista: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
2006 - 2010
Graduação em Licenciatura Química.
Universidade Estadual Paulista – UNESP- Araraquara, SP.
BOLSAS CONCEDIDAS
(1) Bolsista de Mestrado – CAPES (2011-2013)
Título do projeto: Prospecção química e biológica do fungo endofítico Saccharicola sp.
isolado de Eugenia jambolana (Myrtaceae).
Orientação: Profa. Dra. Angela Regina Araujo
(2) Bolsista de Extensão – CNPQ (2009-2009)
Título do projeto: Síntese Eletroquímica de Nano partículas de Magnetita e
Funcionalização com Polietilenoglicol para uso em Biomedicina, voltado principalmente
para utilização em tratamento antitumoral.
Orientação: Prof. Dr. Miguel Jafellici
(3) Bolsista de Extensão – BAE (2007-2009)
Título do projeto: Prospecção química e biológica do fungo endofítico AM-01 isolado de
Alibertia macrophylla (Rubiaceae).
Orientação: Profa. Dra. Angela Regina Araujo
(4) Bolsista de Extensão Centro de Ciências de Araraquara – BAE (2006-2007)
Título do projeto: Ciência Viva (programa de visitação ao Centro de Ciências de
Araraquara de alunos de escolas públicas e privadas, comunidade em geral).
Elaboração de jogos didáticos.
Plantão de dúvidas (programa de tira-dúvidas destinado aos estudantes do Ensino
Fundamental, Médio e de Cursos Pré-Vestibulares).
Ciência Vai à Escola (laboratório volante visitando as escolas com experimentos e
recursos audiovisuais nas diferentes áreas da ciência).
Orientação: Prof. Dr. Luiz Antonio Andrade de Oliveira
PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA
(1). HONÓRIO, A.E.; GUBIANI, J. R.; CHAPLA, V.M.; ARAUJO, A. R.; BOLZANI, V. S.;
CAVALHEIRO, A. J. Saccharicola sp. um endófito de Eugenia jambolana, um
prolífico produtor de metabólitos bioativos. In: 36ª Reunião da Sociedade Brasileira
de Química, 2013, Águas de Lindóia.
(2). ROMERO, J. H. S.; BONI, A. C; HONORIO, A. E; BOCANEGRA, C. H.; ZANON, D.
A. V. Era uma vez em atomolândia: o lúdico para contextualizar o ensino de Química.
2010. (Apresentação de Trabalho/Congresso).
(3). Oliveira, Camila M.; SILVA, G. H.; REGASINI, L. O.; ZANARDI, L. M.;
EVANGELISTA, A. H.; Young, Maria C.M.; Bolzani, Vanderlan da S.; ARAUJO, A. R.
Bioactive metabolites produced by Penicillium sp.1 and sp.2, two endophytes
associated. Zeitschrift für Naturforschung. C, A Journal of Biosciences, v. 64, p. 824-
830, 2009.
ORGANIZAÇÃO DE EVENTO
(1). Honorio. A.E. VII Evento de Educação em Química - VII EVEQ (Comissão
Organizadora), 2009. (Congresso).
http://lattes.cnpq.br/9385808202043341
http://lattes.cnpq.br/0992736452764550
http://lattes.cnpq.br/5196668492543194
http://lattes.cnpq.br/3354457350968761
http://lattes.cnpq.br/0037579054083160
Aos meus queridos e amados pais Margareth e Manoel (in memoriam) por todo
apoio, incentivo e amor. Vocês são meu alicerce.
A minha irmã Paula pela amizade e carinho e por sempre apoiar meus sonhos.
Ao meu namorado Ronaldo por todo amor, apoio, companheirismo e por sempre
estar ao meu lado.
A minha orientadora Angela pela amizade, respeito e ensinamentos.
Amo muito vocês.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Margareth e Manoel Augusto (in memoriam), por todo
apoio, incentivo, amor e carinho. Por sempre acreditarem em mim e nos meus
sonhos; por estarem sempre ao meu lado e me incentivar a seguir em frente; por
nunca me deixarem desistir nos momentos difíceis e serem meus melhores
amigos. Sem o apoio e a força de vocês não teria chego até aqui.
A minha irmã Paula por todo carinho, amizade, lealdade e cumplicidade.
Por todas as coisas que superamos juntas e estarmos sempre unidas.
A minha prima Jennifer por toda amizade, companheirismo, e por todas as
risadas que demos juntas.
Ao meu namorado Ronaldo por todo amor, incentivo, paciência, amizade e
companheirismo. Obrigada por estar ao meu lado em todos os momentos e
dividir a vida comigo. Você é o amor que eu sempre quis.
A todas as pessoas da família do meu namorado por me acolher, apoiar e
por todo carinho nesses 5 anos.
A minha querida orientadora Angela, pelos ensinamentos, confiança,
amizade e carinho. Por todo apoio e por sempre me acalmar e dar diferentes
perspectivas. Não podia ter escolhido uma orientadora melhor.
Aos professores do Instituto de Química pelos conhecimentos transmitidos,
em especial aos professores Mauro, Miguel Jafellici e Rodrigo (Jataí) por toda
amizade e carinho durante todos esses anos.
Aos queridos Nivaldo, Lucineia, Silvia, Jú Rodrigues, João, Marquinhos e
Albertinho por todo apoio, ajuda, carinho e por todas as risadas e conversas.
A Camila Martins e Lisinéia Zanardi por todo apoio e ensinamentos no
inicio da minha trajetória.
Aos amigos dentro e fora do laboratório, Juzinha, Vanessa e Fernandinho
pela amizade, risadas, conversas e confraternizações, por sempre me incentivar,
apoiar e principalmente me acalmar. É fácil trabalhar quando se tem pessoas
como vocês ao lado. Agradeço em especial a Juzinha que foi meu braço direito e
esquerdo, sempre me apoiando e ajudando. Sem você não seria a mesma coisa.
Aos amigos de graduação que duram até hoje e que espero que dure para
sempre, Carol, Susi, Nathalia, Lucy, Gislaine, Daniely, Sara e Joãoo, por todas
as risadas, alegria, brincadeiras, conversas e piadas e principalmente por
mantermos essa amizade e estarmos sempre ao lado um do outro, mesmo com
a distancia que às vezes nos separa.
Ao colégio Integral São João e a todos os professores e funcionários, em
especial aos queridos Ana Claudia, Frank e Rodrigo por acreditarem em mim,
por me incentivar e pelas oportunidades que me deram. Toda minha formação e
conquistas agradeço a vocês.
Ao Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química – UNESP -
Araraquara pela possibilidade de realização deste projeto.
Ao Núcleo de Bioensaio, Biossintese e Ecofisiologia de Produtos Naturais –
NuBBE, pelo aceite no grupo de pesquisa, pelo desenvolvimento deste trabalho
e por ter sido cenário de mais uma etapa importante da minha vida.
A todos os funcionários da biblioteca que sempre foram muito solícitos,
educados, sempre prontos para nos ajudar e auxiliar.
Aos professores membros da banca que gentilmente aceitaram o convite
para avaliação desta dissertação.
Á CAPES pela bolsa concedida e a FAPESP e CNPQ pelo financiamento.
E, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento
deste trabalho. Muito obrigada.
“O cientista não é o homem que fornece as
verdadeiras repostas; é quem faz as
verdadeiras perguntas” (Claude Lévi-
Strauss).
“A persistência é o menor caminho para o
êxito” (Charles Chapplin).
HONÓRIO, Alana Evangelista. Prospecção Química e Biológica do Fungo
Endofítico Saccharicola sp. isolado de Eugenia jambolana (Myrtaceae) 2013.
Dissertação de Mestrado em Química, Instituto de Química de Araraquara – UNESP.
RESUMO
O projeto proposto tem como objetivo principal a obtenção de substâncias
bioativas a partir do estudo químico e biológico do extrato bruto produzido pelo fungo
endofítico Saccharicola sp. isolado do caule da espécie vegetal Eugenia jambolana. O
extrato bruto foi analisado por RMN de 1H e HPLC-DAD, objetivando a avaliação do
perfil químico e assim, definir a metodologia de isolamento das substâncias. A seguir, o
extrato bruto foi submetido a técnicas cromatográficas e espectrométricas para o
isolamento e a determinação estrutural das substâncias isoladas, respectivamente.
Uma das substâncias isoladas é inédita, com esqueleto também inédito na literatura e
produzida em grande quantidade, a outra é conhecida como acido anofínico,
pertencente a classe dos cromenos, com poucos trabalhos descritos e através de ESI-
MS foram identificadas as substâncias ácido 4-hidróxi-3-prenilbenzóico, ácido 4-hidróxi-
3-(3-metil-3-buten-1-il) benzóico, ácido 2,2-dimetil-2H cromeno-6-carboxílico além de
outras três pertencentes a classe da substância inédita.
Palavras-chave: Fungo endofítico. Saccharicola sp.. Eugenia jambolana.
Honorio, Alana Evangelista. Chemical and Biological Evaluation of Endophytic
Fungus Saccharicola sp. isolated from Eugenia jambolana (Myrtaceae). 2013.
Dissertation in Chemistry, Institute of Chemistry of Araraquara - UNESP.
ABSTRACT
The proposed project's main objective is to obtain bioactive substances from
chemical and biological study of the crude extract produced by the endophytic fungus
Saccharicola sp. isolated from the stem of the plant species Eugenia jambolana. The
crude extract was analyzed by 1H NMR and HPLC-DAD, aiming at assessing the
chemical profile and thus define the methodology for isolation of substances. Next, the
crude extract was subjected to chromatographic and spectrometric techniques for the
isolation and structural determination of individual substances, respectively. One of the
isolated substance is unique, with skeleton also unprecedented in the literature, which
was produced in large quantities, and another one known as anofinic acid belonging to
the class of chromenes, with few studies in the literature, and by ESI-MS were identified
substances 4-hydroxy-3-prenilbenzóico acid, 4-hydroxy-3-(3-methyl-3-buten-1-yl)
benzoic acid, 2,2-dimethyl-2H-chromene-6-carboxylic acid plus three others belonging
to the class of novel substance.
Keywords: Endophytic fungus. Saccharicola sp.. Eugenia jambolana.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fungo endofítico Penicillium notatum e estrutura da penicilina. Pág. 23
Figura 2- Substâncias isoladas de fungos Pág. 24
Figura 3- Substâncias anticâncer produzidas por fungos endofíticos Pág. 27
Figura 4- Modos de infecção da planta hospedeira pelo fungo endofítico. Pág. 28
Figura 5- Frutos e folhas, árvore e flores de Eugenia jambolana. Pág. 29
Figura 6- Metodologia de isolamento, purificação e preservação dos fungos
endofíticos
Pág. 35
Figura 07- Saccharicola sp. Pág. 39
Figura 08- Crescimento do fungo endofítico Saccharicola sp. em meio líquido. Pág. 39
Figura 09- Comparação entre os cromatogramas obtidos em Malte Pág. 55
Figura 10- Cromatograma da Substância 1 registrado em 228 nm. Pág. 57
Figura 11- Cromatograma da Substância 2 registrado em 261 nm. Pág. 57
Figura 12- Espectro de IV da substância 1. Pág. 58
Figura 13- Espectro de RMN de 1H da Substância 1 (DMSO- d6, 600 MHz) Pág. 60
Figura 14- Espectro de RMN de 1H com D2O da Substância 1 (DMSO- d6,
600 MHz)
Pág. 61
Figura 15- Espectro de RMN de 13C da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz) Pág. 62
Figura 16- Espectro de DEPT 135 da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz) Pág. 63
Figura 17- Mapa de correlação H-C a uma ligação (HSQC) da Substância 1
(DMSO- d6, 150 MHz)
Pág. 64
Figura 18- Mapa de correlação H-C a longa distancia (HMBC) da Substância
1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Pág. 65
Figura 19- Ampliação mapa de correlação H-C a uma ligação (HMBC) da
Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Pág. 66
Figura 20- Estrutura parcial A da substância 1 Pág. 67
Figura 21- Estrutura parcial B da substância 1 Pág. 68
Figura 22- Mapa de correlação (COSY) da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz) Pág. 69
Figura 23- Ampliação Mapa de correlação COSY da Substância 1 (DMSO- d6,
150 MHz
Pág. 70
Figura 24- Estrutura parcial C da substância 1 Pág. 71
Figura 25- Estrutura parcial D da substância 1 Pág. 71
Figura 26- Substância 1 e as principais correlações em HMBC. Pág. 72
Figura 27- Espectro de UV da substância 1. Pág. 72
Figura 28- Correlações observadas por NOESY entre H-12↔H-2. Pág. 74
Figura 29- Correlações observadas por NOESY entre H-12↔H-6 Pág. 75
Figura 30- Correlações observadas por NOESY entre H13↔H2/H6/H15 Pág. 76
Figura 31- Correlações observadas por NOESY entre H6↔H5 Pág. 77
Figura 32- Mapa de correlação HSQC TOCSY da Substacia 1 (DMSO-d6, 150
MHz)
Pág. 78
Figura 33- Mapa de correlação HSQC TOCSY Ampliado da Substacia 1
(DMSO-d6, 150 MHz)
Pág. 79
Figura 34- Correlações observadas em NOESY 1D para 1 Pág. 80
Figura 35- Configuração relativa proposta para substância 1 Pág. 80
Figura 36- Espectro de IV da substância 2. Pág. 81
Figura 37- Espectro de RMN de 1H da Substância 2 (DMSO- d6, 300 MHz) Pág. 83
Figura 38- Espectro de RMN de 1H com D2O da Substância 2 (DMSO- d6,
300 MHz)
Pág. 84
Figura 39- Espectro de RMN de 13C da Substância 2 (DMSO- d6, 75 MHz) Pág. 85
Figura 40- Mapa de correlação H-C a uma ligação (HSQC) da Substância 2
(DMSO- d6, 100 MHz)
Pág. 86
Figura 41- Mapa de correlação H-C a longa distancia (HMBC) da Substância
2 (DMSO- d6, 100 MHz)
Pág. 87
Figura 42- Espectro de UV da substância 2. Pág. 88
Figura 43- Substância 2 e as principais correlações em HMBC. Pág. 89
Figura 44- Configuração trans da substância 2. Pág. 90
Figura 45- Configuração cis da substância 2. Pág. 90
Figura 46- Substâncias identificadas por de ESI-MS Pág. 92
Figura 47- Atividade antifúngica dos extratos brutos, frações e substâncias
puras de Saccharicola sp.
Pág. 93
Figura 48-Atividade anticolinesterásica dos extratos brutos, frações e
substâncias puras de Saccharicola sp.
Pág. 94
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Resultado do ensaio antitumoral dos endófitos isolados de E.
jambolana.
Pág. 37
Tabela 2- Resultado do ensaio antitumoral dos extratos obtidos nos diferentes
meios de cultivo.
Pág. 38
Tabela 3- Dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) da substância 1 em
DMSO- d6.
Pág. 67
Tabela 4- Dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (100MHz) da substância 2 em
DMSO- d6.
Pág. 88
Tabela 5- Atividade antitumoral do extrato bruto, frações e substâncias puras
de Saccharicola sp.
Pág. 95
Tabela 6- Concentrações inibitórias mínimas (CIM) dos compostos frente aos
bacilos M. tuberculosis
Pág. 96
Tabela 7-Atividade tripanocida das substâncias 1 e 2 isoladas de Saccharicola
sp..
Pág. 97
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1- Obtenção e triagem dos extratos brutos obtidos de E.
jambolana
Pág. 36
Fluxograma 2- Metodologia de obtenção do Extrato bruto Ssp-AcOEt-1 e
Extrato bruto Ssp-AcOEt-2 para avaliação do perfil químico e
biológico
Pág. 40
Fluxograma 3 - Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-1 Pág. 42
Fluxograma 4 - Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-2 Pág. 43
Fluxograma 5 - Fracionamento da Fração Ssp-Si-Fr8 Pág. 46
Fluxograma 6- Fracionamento cromatográfico de Ssp-C18-Fr1 Pág. 47
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AchE – Enzima acetilcolinesterase
AcOEt - Acetato de etila
MeOH – Metanol
BDA – Batata-dextrose-ágar
CC – Cromatografia em coluna
CCDC – Cromatografia em camada delgada comparativa
C18 - Sílica gel de fase reversa tipo octadecil silano
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HPLC-DAD - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de
Diodos
CIM- Concentração Inibitória Mínima
CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute
CPQBA - Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
DAD – Detector de Arranjo de Diodos
DEPT – Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO-d6 – Dimetilsulfóxido Deuterado
d – Dubleto
dd – Duplo - dubleto
ddd – Duplo – duplo – dubleto
dt – Duplo-tripleto
EM – Espectrometria de Massas
E. jambolana– Eugenia jambolana
Ejc – Eugenia jambolana caule
Extr- extrato bruto
Fr – Fração
δ – Deslocamento químico
gCOSY – Gradient Correlated Spectroscopy
gHMBC - Gradient Heteronuclear Multiple Bond Correlation
gHMQC - Gradient Heteronuclear Multiple Quantum Correlation
Hex – Hexano
IC50 – Concentração Inibitória
IQAr – Instituto de Química de Araraquara
IV – Infravermelho
J – Constante de Acoplamento
m – Multipleto
MHz - Megahertz
min. – Minutos
MTT - sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium
m/z – Relação massa-carga
NaClO – Hipoclorito de sódio
nm – Nanômetro
NOESY 1D – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy em uma dimensões
NuBBE – Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais
pág. - Página
ppm – Parte por milhão
q – Quarteto
RMN de 1H – Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
RMN de 13C - Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13
s – Simpleto
sl – Simpleto largo
Subst- Substância
t – Tripleto
TMS – Tetrametilsilano
UV – Ultravioleta
v/v – Volume/volume
λ – Comprimento de onda
μm – Micrometro
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO Pág. 21
1.1 Produtos Naturais como Fontes de Substâncias Bioativas Pág. 21
1.2 Fungos, uma Fonte Promissora de Metabólitos Bioativos Pág. 21
1.3 Fungos endofíticos Pág. 24
1.4 Espécie vegetal hospedeira: Eugenia jambolana
Pág. 27
2 OBJETIVOS Pág. 29
2.1 Objetivo Geral Pág. 29
2.2 Objetivos Específicos
Pág. 29
3 PARTE EXPERIMENTAL Pág. 30
3.1 Materiais, Equipamentos e Técnicas Utilizadas Pág. 30
3.1.1 Meio de cultivo do micro-organismo Pág. 30
3.1.2 Esterilização dos materiais Pág. 30
3.1.3 Manipulação do micro-organismo Pág. 30
3.1.4 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) Pág. 30
3.1.5 Cromatografia em coluna (CC) Pág. 31
3.1.6 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) Pág. 31
3.1.7 Análise de ressonância magnética nuclear (RMN de 1H e RMN
de 13C)
Pág. 31
3.1.8 Preparo das amostras para análise via HPLC (clean-up) Pág. 32
3.1.9 Análise de Infravermelho (IV) Pág. 32
3.1.10 Solventes utilizados Pág. 32
3.1.11 Outros equipamentos Pág. 32
3.2. Obtenção do Material Vegetal e Isolamento da Cepa Fúngica Pág. 33
3.2.1 Seleção e coleta da espécie vegetal Pág. 33
3.2.2 Obtenção e cultivo do endófito Pág. 33
3.3 Escolha do Fungo Endofítico. Pág. 34
3.3.1 Cultivo dos fungos endofíticos em escala reduzida para avaliação dos
extratos brutos.
Pág. 34
3.3.2 Classificação do fungo endofítico Pág. 36
3.3.3 Escolha do meio de cultivo* Pág. 36
3.3.4 Cultivo do fungo endofítico Saccharicola sp. e obtenção do
extrato bruto.
Pág. 37
3.3.5 Crescimento do endófito e obtenção dos extratos brutos para
avaliação do perfil químico e biológico e isolamento dos metabólitos
secundários.
Pág. 38
3.3.6 Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-1 produzido por
Saccharicola sp. em extrato de malte.
Pág. 40
3.3.7 Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-2 produzido por
Saccharicola sp. em extrato de malte.
Pág. 40
3.3.8 Purificação das frações obtidas do fracionamento do extrato bruto
Ssp-AcOEt-1 produzido por Saccharicola sp.
Pág. 43
3.3.8.1 Purificação da fração Ssp-Si-Fr-17 Pág. 43
3.3.8.2 Purificação da fração Ssp-Si-Fr-13 Pág. 43
3.3.9 Purificação das frações obtidas do fracionamento do Extrato Bruto
Ssp-AcOEt-2 produzido por Saccharicola sp..
Pág. 43
3.3.9.1 Purificação da fração Ssp-C18-Fr1 Pág. 43
3.10 Análises químicas e avaliação do perfil químico do extrato bruto
AcOEt de Saccharicola sp.
Pág. 47
3.10.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
(CCDC).
Pág. 47
3.10.2 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector
de Arranjo de Diodos (HPLC-DAD).
Pág. 47
3.10.3 Análise por RMN de 1H. Pág. 48
3.11 Avaliação do perfil biológico dos extratos, frações e substâncias puras
obtidos de Saccharicola sp.
Pág. 48
3.11.1 Avaliação da Atividade Antifúngica. Pág. 48
3.11.2 Avaliação da Atividade Anticolinesterásica Pág. 49
3.11.3 Avaliação da Atividade Antitumoral Pág. 50
3.11.4 Avaliação da Atividade Tripanocida utilizando MTT Pág. 51
3.11.5 Avaliação da atividade anti-tuberculose
Pág. 52
4 Resultados e Discussão Pág. 54
4.1 Análise do extrato AcOEt obtido do cultivo em Extrato de Malte do
fungo endofítico Saccharicola sp. por HPLC-DAD.
Pág. 54
4.2 Análise do extrato AcOEt obtido em Extrato de Malte por RMN de 1H. Pág. 55
4.3 Fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt obtido em malte de
Saccharicola sp. e obtenção das substâncias puras
Pág. 55
4.4 Determinação Estrutural das Substâncias Isoladas Pág. 57
4.4.1 Determinação Estrutural da Substância 1 Pág. 57
4.4.2 Determinação Estrutural da Substância 2 Pág. 77
4.5 Avaliação das substâncias encontradas no extrato bruto por ESI-MS. Pág. 87
4.6 Ensaios biológicos dos extratos brutos Ssp-AcOEt-1 e Ssp-AcOEt-2,
frações e das substâncias puras 1 e 2.
Pág. 89
4.6.1 Avaliação da Atividade Antifúngica* Pág. 89
4.6.2 Avaliação da Atividade Anticolinesterásica* Pág. 90
4.6.3 Avaliação da Atividade Antitumoral Pág. 90
4.6.4 Avaliação da Atividade antituberculose Pág. 91
4.6.5 Avaliação da Atividade Tripanocida utilizando MTT
Pág. 92
5 Conclusões
Pág. 94
Referências Pág. 95
24
1 INTRODUÇÃO
1.1 Produtos Naturais como Fontes de Substâncias Bioativas
A pesquisa em produtos naturais é uma das áreas mais tradicionais da Química
no Brasil, devido principalmente à grande biodiversidade do país. A maioria dos
trabalhos está voltada para o isolamento e a identificação de substâncias, muitas vezes
associados a ensaios biológicos ou estudos quimiotaxonômicos (PUPO; GALLO;
VIEIRA, 2007).
Plantas, fungos, insetos, organismos marinhos e bactérias são fontes importantes
de substâncias biologicamente ativas, sendo que a maioria dos fármacos em uso
clínico ou são de origem natural ou foram desenvolvidos por síntese química planejada
a partir de produtos naturais (BARREIRO; BOLZANI, 2009).
As fontes naturais ainda estão disponíveis em abundância e oferecem as
melhores possibilidades de encontrar substâncias de interesse terapêutico (HARVEY,
2008).
Dos anos quarenta até os dias atuais, um bom exemplo da importância dos
produtos naturais no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos está no
tratamento de câncer. Dos 155 fármacos utilizados, 73% são sintéticos, sendo que
desses aproximadamente 47% foram baseados em produtos naturais ou derivados de
produtos naturais (CRAGG; NEWMAN, 2012).
1.2 Fungos, uma Fonte Promissora de Metabólitos Bioativos
Certamente, foram os antibióticos que mais contribuíram para o interesse do setor
farmacêutico pelos produtos naturais. Diversos metabólitos secundários com
importantes propriedades farmacológicas foram isolados de espécies de bactérias e
fungos (BARREIRO; BOLZANI, 2009).
Desde a descoberta da penicilina, isolada por Fleming, do fungo Penicillium
notatum (Figura 1, pág. 23), inúmeros esforços, têm-se concentrado no isolamento de
metabólitos secundários de origem microbiana.
Devido a sua diversidade, capacidade de adaptação e modo a colonizar diferentes
ecossistemas, os micro-organismos representam um importante componente da
biodiversidade da Terra (LEFEVRE, 2008).
25
Figura 1- Fungo endofítico Penicillium notatum e estrutura da penicilina.
Fonte: A autora
A partir dessa descoberta foi dado maior ênfase ao estudo desses micro-
organismos que são uma das fontes mais prolíficas de produtos naturais.
Outro aspecto importante, no isolamento de metabólitos de origem microbiana é a
possibilidade de controle sobre os processos operacionais de maneira relativamente
simples. Em comparação com as plantas, os fungos apresentam crescimento mais
rápido, em menor tempo e espaço. Além disso, as condições de cultivo (tempo, pH,
nutrientes, temperatura e aeração) podem ser modificadas, a fim de aumentar ou
direcionar a produção de metabólitos de interesse (ALY et al. 2011; PEARCE, C.1997).
Os fungos podem ser filamentosos, constituídos por filamentos longos e
ramificados denominados hifas; leveduriformes, constituídos por células individuais que
se reproduzem por brotamento ou fissão binária; ou dimorfos, que podem ser
filamentosos ou leveduriformes dependendo das condições ambientais, principalmente
a temperatura (ESPOSITO, AZEVEDO, 2010).
Ocorrem em três modos de vida: saprófitos que são micro-organismos que se
nutrem de restos de material orgânico de organismos mortos; parasitas que vivem à
custa de outros seres vivos e somente o fungo se beneficia; e simbiótico que se
associam a outros seres e ambos se beneficiam com essa interação.
Os fungos tem demonstrado grande potencial como uma importante fonte de
compostos biologicamente ativos com aplicações alimentícias, agrícolas e medicinais
(ZHANG et al. 2006; ALY et al. 2011), como por exemplo na indústria alimentícia, na
fabricação de pães, queijos, vinhos e outras bebidas alcoólicas.
Na agricultura através da produção de micoinseticidas, que são produtos a base
de fungos benéficos utilizados no controle de insetos-praga podendo desempenhar um
importante papel no futuro de uma agricultura moderna e sustentável. O Brasil é um
26
grande exemplo de utilização de controle biológico em escala ampliada, como o uso do
Baculovirus anticarsa para o controle da lagarta da soja, entre outros (ALVES, 2010).
Na indústria farmacêutica tem demonstrado uma crescente importância através da
produção de metabólitos secundários bioativos como, por exemplo, a ciclosporina, que
é uma droga imunossupressora isolada do fungo Tolypocladium Inflatum que suprime
as reações imunológicas que causam rejeição de órgãos transplantados (CORDEIRO,
et al. 2005; BAEDE VAN DIJK et al., 2000).
Estudos realizados com fungos na prospecção de metabólitos secundários
bioativos demonstraram que esses micro-organismos produzem substâncias com uma
enorme diversidade estrutural, as quais têm fornecido produtos muito importantes na
indústria farmacêutica (Figura 2, pág. 24), incluindo agentes antibacterianos, como as
penicilinas (obtidas de espécies de Penicillium), cefalosporinas (Cephalospporium
crytosporium), aminoglicosídeos, tetraciclinas e outros polipeptídeos de vários tipos
estruturais (Actinomycetales), agentes redutores de colesterol, tais como mevostatina
(compactina) e lovastatina (da espécie Penicillium) (GRAGG e NEWMAN, 2005;
GREVE et al., 2010) .
Figura 2- Substâncias isoladas de fungos
Fonte: A autora
27
Plantas superiores são um complexo habitat que abrigam vários tipos de micro-
organismos. Dentre estes, os fungos são componentes dominantes nas associações
com as espécies vegetais, podendo ser encontrados colonizando superfícies vegetais
(epifíticos), tecidos internos (endofíticos), o interior ou superfícies das raízes
(micorrízicos) ou ainda desenvolvendo-se no solo próximo as raízes (rizosfera),
(STONE, J. K.; POLISHOOK, J. D.; WHITE, J. F. Jr., 2004).
Dentre todas as espécies de fungos, os endofíticos constituem o grupo mais
produtivo quimicamente entre os outros fungos filamentosos, apresentando uma
produção de metabólitos secundários bioativos 73% superior aos demais (DREYFUSS,
M. M.; CHAPELA, I. H, 1994).
1.3 Fungos endofíticos
Fungos endófitos são micro-organismos que colonizam os tecidos internos das
plantas hospedeiras sem causar efeitos negativos imediatos (KHARWAR et al., 2011) e
representam uma fonte inexplorada de produtos naturais novos e bioativos, com
diversas substâncias descritas (OWNLEY, GWINN 2010). Destas, 51% apresentam
estruturas inéditas e 80% atividade biológica, evidenciando o seu potencial biológico e
biossintético (YANG et al., 2012; PARANAGAMA et al., 2007).
A especificidade de um endófito em relação a uma espécie vegetal pode ser
influenciada pelas condições ambientais (ZHANG; SONG; TAN, 2006). Essa
especificidade pode trazer grandes perdas da biodiversidade, uma vez extinguindo-se
uma espécie vegetal, estará eliminando toda sua flora microbiana (GUNATILAKA,
2006).
Durante o longo período de co-evolução, fungos endofíticos têm se adaptado aos
seus microambientes pela variação genética, incluindo a absorção de alguns
segmentos de DNA da planta hospedeira em seus genomas próprios, bem como a
inserção de seus próprios segmentos de DNA no genoma do hospedeiro. Este fato
pode ter levado certos endófitos a apresentar a capacidade de biosintetizar alguns
metabólitos secundários bioativos originalmente obtidos da planta hospedeira (ZHANG;
SONG; TAN, 2006).
A associação planta micro-organismo sugere que estes co-evoluíram com os seus
hospedeiros, apresentando uma relação simbiótica onde os endófitos recebem
nutrientes, água e proteção enquanto a planta tem vantagens decorrentes dessa
interação, como maior resistência a fatores bióticos, como insetos, herbívoros,
28
parasitas e outros micro-organismos e fatores abióticos, como pH, temperatura e
estresse hídrico (SANTOS, L.C; et al. 2013).
A maioria das variações de uma interação simbiótica para uma interação parasita
são caracterizados pelos fatores genéticos, desequilíbrio na troca de nutrientes ou
variações ambientais. A mudança do tipo de interação está associado ao fato de a
planta estar submetida a um estresse simbiótico ou senescência (ALY et al., 2011). Em
conclusão, as interações simbióticas entre os fungos endofíticos e a planta hospedeira
são compreendidos como um equilíbrio, que está sob controle ambiental, fisiológico e
genético, resultando em benefício para ambos (ALY et al., 2011 ).
Alguns estudos demonstram que os fungos endofíticos são capazes de produzir
um grande número de importantes metabólitos secundários bioativos, conhecidos
apenas em plantas, sugerindo dessa forma que os endófitos são uma fonte alternativa
na produção destes metabólitos (ALY et al., 2011; PRITI et al. 2009).
Um exemplo é o taxol (paclitaxel) utilizado no tratamento de diversos tipos de
câncer, sendo isolada na quantidade 0,01 a 0,03 % das cascas de Taxus brevifolia,
uma espécie vegetal em extinção, que também é produzida pelo fungo endofítico
Taxomyces andreanae obtido de Taxus brevifolia (GRAGG e NEWMAN, 2007).
O paclitaxol é um diterpenóide tetracíclico altamente bioativo, e inicialmente
isolado da casca de Taxus brevifolia em 1971. É um medicamento usado, em conjunto
com outros medicamentos, tendo aplicação no tratamento de uma variedade de
cânceres, incluindo o de ovário, de mama, leucemias, linfomas, testicular e de pulmão
(ZHAO, 2011). O modo de ação ocorre quando o paclitaxol se liga à β-tubulina e
impede a despolimerização durante o processo de divisão celular (ZHAO, 2011).
No entanto, para a surpresa dos pesquisadores, em 1993, o paclitaxol foi isolado
do extrato bruto produzido por Taxonomyces andreanae, um fungo endofítico isolado
de Taxus brevifolia, evidenciando que o fungo endofítico isolado da planta apresenta a
mesma capacidade que seu hospedeiro em biosintetizar o paclitaxol (ZHAO, 2011).
Outro exemplo de produto natural isolado tanto da espécie vegetal, quanto do
fungo endofítico que a habita, é a camptotecina (Figura 3, pág. 27) um alcalóide
pentacíclico que inibe a topoisomerase I, uma enzima envolvida na replicação do DNA.
O composto age como um potente agente antineoplásico, exercendo seu efeito
citotóxico, inibindo a dissociação dos complexos de DNA-topoisomerase I durante a
replicação (KHARWAR, 2011). A camptotecina foi isolada pela primeira vez da espécie
vegetal Camptotheca acuminata e, apresentou potente atividade antitumoral e
29
antileucêmica. Mais tarde, em 2005, a camptotecina, também, foi isolada de um fungo
endofítico, sendo este, pertencente à família Phycomycetes e, identificado como
Entrophospora infrequens, o qual foi isolado do interior da casca de Nothapodytes
foetida (ZHAO, 2011).
Vincristina, outra droga anticâncer originalmente obtida de Catharanthus roseus
(Apocynaceae), foi detectada em culturas do fungo endofítico Fusarium oxysporum
isolado da mesma planta (ALY et al., 2011; LINGQI et al., 2000). Este composto
anticancerígeno inibe a mitose por ligação a dímeros de tubulina e inibindo a sua
montagem para estruturas de microtúbulos.
Plantas da espécie Podophyllum são conhecidas por produzir podofilotoxina, o
precursor das drogas anticâncer utilizadas clinicamente, etoposídeo e teniposideo.
Ambas as drogas inibem a topoisomerase II, bloqueando assim o passo de ligação do
ciclo celular, prejudicando a integridade do genoma e, subsequentemente, levando à
morte celular. Mais tarde essa substância foi relatada de Trametes hirsuta e
Phialocephala fortinii, que são endófitos isolados de Phialocephala hexandrum e
Phialocephala peltatum, respectivamente (ALY et al, 2011; EYBERGER et al. 2006;.
PURI et al., 2006).
Figura 3- Substâncias anticâncer produzidas por fungos endofíticos
Fonte: A autora
30
Os fungos endofíticos podem infectar a planta hospedeira de dois modos (Figura
4, pág. 28).
Horizontalmente, através de lesões naturais como estômatos e crescimento das
raízes, e artificialmente através de fissuras causadas por práticas agrícolas. A infecção
também pode ocorrer verticalmente através das sementes do hospedeiro, neste caso o
endófito pode se instalar na planta por toda sua vida (ALY et al., 2011).
Uma vez dentro do tecido do hospedeiro, eles assumem um estado de repouso
(latente) quer para toda a vida da planta hospedeira ou por um período de tempo
prolongado, ou seja, até que as condições ambientais sejam favoráveis para o fungo
(ALY et al. 2011; SIEBER 2007).
Figura 4- Modos de infecção da planta hospedeira pelo fungo endofítico.
Fonte: SAIKKONEN, K.et al. 2004.
1.4 Espécie vegetal hospedeira: Eugenia jambolana
Devido ao enorme número de espécies de plantas no mundo, algumas estratégias
de seleção podem ser utilizadas na busca por fungos endofíticos produtores de
substâncias bioativas (STROBEL, 2004), tais como: plantas com história etnobotânica
que relata uso e aplicação específica de partes do vegetal; plantas endêmicas que
ocupam solos mais antigos, plantas nativas de áreas com grande biodiversidade,
plantas de habitats extremos, entre outras, pode nos garantir oportunidade de
isolamento de novas espécies e genêros de fungos endofiticos.
31
Para este trabalho a espécie escolhida pertence ao gênero Eugenia, amplamente
conhecida por ser utilizada no tratamento de diabetes (SHARMA et al., 2008). A
espécie vegetal Eugenia jambolana (Figura 5, pág. 29) pertence a família Myrtaceae, e
é encontrada em todo o continente asiático, na África Oriental, América do Sul e
Madagascar (BALIGA et al., 2011). Muitos produtos naturais isolados de E. jambolana
apresentaram diferentes atividades biológicas como hipoglicêmica, adstringente,
diurética, antidiabética, antioxidante, antibiótica e anti-inflamatória e tem sido utilizada
na medicina tradicional por apresentar essas propriedades (VASI et al., 2009; SANTOS
et al., 2012).
Figura 5- Frutos e folhas, árvore e flores de Eugenia jambolana.
Fonte: DAMETTO (2010)
Estudos realizados por DAMETTO (2010) com os frutos de E. jambolana permitiu
a identificação de várias antocianinas. As análises preliminares com os extratos e
frações de E. jambolana mostraram que esta espécie apresenta elevada ação
sequestradora de radicais livres e quimiopreventiva, atividade antimalárica, antifúngica
contra patógenos-humanos e anticolinesterásica.
Considerando o potencial dos micro-organismos endofíticos na produção de
substâncias potencialmente bioativas e o fato de que os micro-organismos endofíticos
associados a espécies vegetais da flora brasileira permanecem, praticamente, sem
qualquer estudo químico e biológico nos propomos neste trabalho ao estudo de
Saccharicola sp. associado a E. jambolana, objetivando estabelecer correlação entre as
substâncias produzidas pelo endófito e a espécie vegetal.
32
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos Geral
Isolamento, identificação e avaliação das atividades antifúngica, anticancerígena,
tripanocida, anti-tuberculose e anticolinesterásica dos metabólitos secundários
produzidos pelo fungo endofítico Saccharicola sp..
2.2 Objetivos Específicos
Cultivo em escala ampliada de Saccharicola sp. no meio líquido de extrato de
Malte para a obtenção do extrato bruto;
Triagem química e biológica do extrato bruto obtido por RMN de 1H e
HPLC/DAD.
Fracionamento do extrato bruto obtido por técnicas cromatográficas
convencionais até o isolamento de metabólitos secundários;
Elucidação ou determinação estrutural das substâncias isoladas por técnicas
espectrométricas de RMN uni e bidimensionais, EM, UV, IV;
Avaliação das substâncias puras isoladas para verificar a potencialidade
biológica;
Contribuir para uma melhor compreensão da relação ecológica entre os fungos
endofíticos e as espécies vegetais hospedeiras
33
3.1 Materiais, Equipamentos e Técnicas Utilizadas
3.1.1 Meio de cultivo do micro-organismo
Para cultivo dos microrganismos foram utilizados os meios:
BDA (Acumedia): Batata Dextrose Ágar: 39 g L-1 de água;
YM: Extrato de Levedura (3g), Extrato de Malte (3g), Peptona (5g), Dextrose
(10g), 21 g L-1 de água.
Malte: Extrato de Malte 20 g L-1 de água
Os meios de cultura líquidos foram submetidos à esterilização em autoclave a
121oC por 20 minutos.
3.1.2 Esterilização dos materiais
A esterilização de todo material utilizado na manipulação do micro-organismo, e
também os meios de culturas preparados, foi realizada em autoclave, sendo mantidos à
temperatura de 121oC por aproximadamente 20 minutos.
3.1.3 Manipulação do micro-organismo
Todo o procedimento de esterilização do material vegetal e manipulação do micro-
organismo foram realizados em Capela de Fluxo Laminar.
3.1.4 Cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC)
Nas análises por CCDC foram utilizadas placas comerciais da Merck, com sílica
de fase normal (sílica G TLC Plates W/UV 254, 200μm) e sílica de fase reversa (C18
sílica TLC Plates w/UV; 150μm). Os solventes utilizados nos sistemas cromatográficos
foram selecionados de acordo com a fase estacionária.
As revelações foram obtidas por exposição à irradiação ultravioleta (UV 254 e 365
nm) e nebulização com anisaldeído seguido de aquecimento.
34
3.1.5 Cromatografia em coluna (CC)
Nas separações cromatográficas em coluna aberta ou sob pressão foram
utilizadas colunas de vidro de diferentes diâmetros interno e comprimentos.
Fases estacionárias utilizadas:
Sílica gel C18 (tamanho da partícula: 40-63 μm; Merck);
Sílica gel fase normal (tamanho da partícula: 0,060–0,200 μm; diâmetro do poro
6nm; ACROS organics).
3.1.6 Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
Para as análises do perfil químico, otimização e isolamento das substâncias por
HPLC foram utilizados equipamentos Varian ProStar com detectores de arranjos de
diodo (DAD), Shimadzu com detector de arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu SPD-
M20A), com degaiseificador DGU-20A3 e injetor automático Shimadzu SIL-20A e
Shimadzu (CBM-20A) com detector ultravioleta em arranjo de diodos (DAD) (Shimadzu
SPD-M20A). O tratamento dos dados foi obtido através de um microcomputador,
utilizando o software Shimadzu LC solution (versão 1.23 SP1).
Colunas utilizadas:
Analítica:
Luna Phenomenex C18 (250,0 x 4,60mm; 5μm; 100A)
Preparativa:
Luna Phenomenex C18 (150,0 x 21,20mm, 5μm)
3.1.7 Análise de ressonância magnética nuclear (RMN de 1H e RMN de 13C)
Os espectros de RMN de 1H e 13C unidimensionais foram realizados em
espectrômetro Varian INOVA-300 operando em 300 MHz (1H) e em 75 MHz (13C) e
Bruker Avance III HD operando em 600 MHz (1H) e em 200 MHz (13C). Os espectros de
RMN de 1H e 13C bidimensionais foram realizados em espectrômetro Bruker Avance III
HD operando em 600 MHz (1H) e em 200 MHz (13C), Bruker Avance DRX operando em
500 MHz, 500 MHz (1H), 125 MHz (13C), (Campo magnético 11,75 T) e Bruker Avance
DRX operando em 400 MHz, 400 MHz (1H), 100 MHz (13C), (Campo magnético 9,4 T).
Foi utilizado TMS como referência interna.
35
3.1.8 Preparo das amostras para análise via HPLC (clean-up)
Os extratos brutos e as substâncias puras obtidos em meios líquidos foram
submetidos à análise por HPLC-DAD em gradiente exploratório. Antes das análises as
amostras foram solubilizadas em CH3OH:H2O (95:05) e submetidas a um “clean up”
utilizando cartuchos de sílica C-18 acoplado em membrana Millipore® (0,2 mm). Após
este procedimento, as amostras (1,5 mg mL-1) foram armazenadas em frascos, para
posterior injeção.
3.1.9 Análise de Infravermelho (IV)
Os espectros de IV foram obtidos em pastilhas de KBr no espectrômetro FT-IR,
Spectrum 2000 da Perkin Elmer, Série 1600 sob as seguintes condições: porcentagem
de transmitância (%T) com um acúmulo de 32 varreduras, com resolução de 1 cm-1, na
faixa de absorção de 4000-400 cm-1.
3.1.10 Solventes utilizados
Para a obtenção dos extratos brutos, partição líquido-líquido, fracionamentos em
coluna aberta, corridas cromatográficas em placas comparativas e preparativas, foram
utilizados Hexano (Hex), Acetato de Etila (AcOEt), Metanol (MeOH) e Clorofórmio
(CHCl3) da marca J. T. Baker.
Para as análises por HPLC-DAD (cromatografia líquida de alta eficiência
acoplada a detector de arranjo de diodo) e Espectrometria de Massas (EM) foi utilizado
Metanol grau HPLC das marcas Merck, J. T. Baker e Panreac.
Nas análises por RMN foi utilizado DMSO-d6 (dimetilsulfoxido) das marcas CIL e
DECROS.
3.1.11 Outros equipamentos
Evaporador rotatório – Buchi;
Balança analítica – Mettler Toledo;
Autoclave vertical – Quimis Aparelhos Científicos Ltda;
Câmara de Fluxo laminar vertical – PACHANS;
36
3.2. Obtenção do Material Vegetal e Isolamento da Cepa Fúngica
3.2.1 Seleção e coleta da espécie vegetal
Folhas e caules saudáveis de E. jambolana foram coletadas na cidade de
Araraquara-SP, em abril e dezembro de 2010 pela doutoranda Vanessa Mara Chapla.
Para isolamento dos fungos endofíticos, foi selecionada a mesma espécime utilizada
para o estudo fitoquímico, pelo grupo da Profa. Dra. Dulce Helena S. Silva.
A classificação foi realizada por Inês Cordeiro do Instituto de Botânica de São
Paulo e classificado como SP 384109.
3.2.2 Obtenção e cultivo do endófito*
Folhas, caules e frutos jovens e saudáveis foram selecionados para o isolamento
dos endófitos seguindo o procedimento: a superfície do material foi lavada com água
corrente e sabão neutro, e esterilizada por imersão em uma solução de NaClO 1% (1
minuto), etanol aquoso 70% (1 minuto), seguida de uma dupla lavagem em água estéril
(5 minutos) e posterior secagem. A seguir, pedaços de folha e caule foram seccionadas
assepticamente (3 a 4 de 0,5 cm) e transferidos para placas de Petri contendo BDA
(Batata Dextrose e Agar), ao qual foi adicionado, após esterilização em autoclave,
antibiótico sulfato de gentamicina (100 μg mL-1) para evitar o crescimento de bactérias.
O crescimento dos fungos foi monitorado e repiques sucessivos foram realizados
até a obtenção das linhagens puras, que foram preservadas em frascos com água
esterilizada (LANDECKER, E. M., 1996) e depositadas na micoteca do Departamento
de Química Orgânica, IQ-UNESP, conforme pode ser visualizado na Figura 6 (pág. 35).
37
Figura 6- Metodologia de isolamento, purificação e preservação dos fungos
endofíticos*
Procedimento realizado pela doutoranda Vanessa Mara Chapla
3.3 Escolha do Fungo Endofítico.
3.3.1 Cultivo dos fungos endofíticos em escala reduzida para avaliação dos
extratos brutos.
Os fungos endofíticos isolados do caule, folha e frutos foram repicados para
placas de Petri contendo BDA e incubados por 7 dias. A seguir cada fungo foi inoculado
em 2 frascos de Erlenmeyer (500 mL) contendo 200 mL de meio de cultivo Czapek,
preparado na concentração de 35 g L-1, os quais foram mantidos sobre a bancada a
25oC por 28 dias, com agitações manuais a cada 24 horas. Após esse período o caldo
foi separado do micélio por filtração. O caldo fermentado foi submetido a uma partição
líquido/líquido com AcOEt (3 x 200 mL) e concentrado, fornecendo o extrato bruto
AcOEt de cada fungo (Fluxograma 1, pág. 36).
38
Os extratos brutos foram submetidos a avaliação química, por CCDC utilizando
placas de sílica gel e fase móvel [Hex:AcOEt (3:7 v/v)], HPLC-DAD e RMN de 1H.
O perfil cromatográfico obtido em equipamento de HPLC-DAD foi realizado em
gradiente exploratório, utilizando como fase estacionária uma coluna analítica
Phenomenex (tipo Gemini, C18) e eluição em gradiente de H2O:CH3OH (95:05 v/v a
0:100% em 40 minutos permanecendo nesta condição por mais 10 min.), com uma
vazão de 1,0 mL min -1.
Os extratos brutos AcOEt foram submetidos a avaliação antitumoral (Tabela 1,
pág. 37) para verificar o potencial biológico de cada fungo.
Fluxograma 1- Obtenção e triagem dos extratos brutos obtidos de E. jambolana
*Processo realizado pela Doutoranda Vanessa Mara Chapla.
39
Tabela 1- Resultado do ensaio antitumoral dos endófitos isolados de E. jambolana
*Processo realizado pela Doutoranda Vanessa Mara Chapla.
Após análise dos resultados deste ensaio o fungo endofítico codificado como Ejc-
04 foi selecionado para ser estudado devido a sua promissora atividade antitumoral.
3.3.2 Classificação do fungo endofítico
Saccharicola sp. foi isolado da espécie Eugenia jambolana coletada na cidade de
Araraquara-SP e identificado, por taxonomia molecular, pela funcionária Fabiana F.
Garboggini do CPQBA (Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e
Agrícolas) em Paulínia-SP, e depositado na micoteca do NuBBE com o código Ejc-04.
3.3.3 Escolha do meio de cultivo*
Saccharicola sp. foi cultivado em 3 meios líquidos, Czapek, Yeast Medium (YM) e
Extrato de Malte (EM) e 2 meios sólidos, Milho e Arroz, a fim de verificarmos a sua
produção metabólica nos diferentes meios de cultivo.
Após obtenção de todos os extratos brutos, estes foram enviados para ensaio
antitumoral onde pudemos observar que os meios EM, YM, Milho e Arroz apresentaram
40
uma promissora atividade antitumoral (Tabela 2, pág. 38), sendo escolhido para
continuidade desse trabalho o meio líquido EM.
Tabela 2- Resultado do ensaio antitumoral dos diferentes meios de cultivo
*Variação do meio de cultivo foi realizado pelo aluno de inciação André Iagalo.
3.3.4 Cultivo do fungo endofítico Saccharicola sp. e obtenção do extrato
bruto.
Saccharicola sp. preservado em “slants” foi repicado em placas de Petri contendo
meio YM (Figura 07, pág. 39 ) e incubado por quinze dias a 25oC. O cultivo em meio
liquido (Figura 08, pág. 39) foi realizado em frascos de Erlenmeyer (500 mL) contendo
6g de Extrato de Malte e 300 mL de água cada (num total de 16 frascos de
Erlenmeyer). Estes meios foram autoclavados à temperatura de 121 oC, por 40 minutos.
Após resfriamento os meios foram inoculados com o endófito e incubados a 25 oC em
modo estático por 28 dias. Terminado o período de incubação, as culturas foram
filtradas, e o caldo fermentado foi particionado com AcOEt (3 x 1L), em seguida o
solvente foi evaporado fornecendo o extrato AcOEt.
41
Figura 07- Saccharicola sp.
Fonte: A autora
Figura 08- Crescimento do fungo endofítico Saccharicola sp. em meio líquido.
Fonte: A autora
3.3.5 Crescimento do endófito e obtenção dos extratos brutos para avaliação
do perfil químico e biológico e isolamento dos metabólitos secundários.
O cultivo em meio líquido foi realizado duas vezes de acordo com o Fluxograma 2
pág. 40, fornecendo os extratos brutos codificados Ssp-AcOEt-1(1,4g) e Ssp-AcOEt-2
(1,2g).
42
Fluxograma 2– Metodologia de obtenção do Extrato bruto Ssp-AcOEt-1 e Extrato bruto
Ssp-AcOEt-2 para avaliação do perfil químico e biológico
Fonte: A autora
Ambos os extratos AcOEt foram submetidos à análise do perfil químico por HPLC-
DAD e RMN de 1H. O sistema utilizado para análise em HPLC-DAD foi coluna analítica
Luna Phenomenex tipo octadecil silano (C-18) e eluição em gradiente H2O/MeOH
(95:050:100) por 40 min., permanecendo nesta condição por mais 10 min., com fluxo
de 1,0 mL/min. e λ de 254 nm para posterior escolha do melhor comprimento de onda.
Os extratos brutos foram enviados para análise das atividades antifúngica frente a
fungos fitopatogênicos, antitumoral e anticolinesterásica.
43
3.3.6 Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-1 produzido por
Saccharicola sp. em extrato de malte.
O extrato bruto Ssp-AcOEt-1 obtido do fungo endofítico Saccharicola sp. foi
analisado por HPLC-DAD e posteriormente fracionado em CC utilizando sílica gel de
fase normal como fase estacionária e como eluentes AcOEt/Hexano e MeOH/AcOEt
em gradiente de polaridade de acordo com o Fluxograma 3, pág. 42.
As frações obtidas foram analisadas por CCDC para avaliar o grau de pureza e
após união das frações iguais estas foram analisadas por RMN de 1H e HPLC-DAD
para avaliação do perfil químico, utilizando coluna analítica Luna Phenomenex tipo
octadecil silano (C-18) e eluição em gradiente H2O/MeOH (95:050:100) por 40 min.,
permanecendo nesta condição por mais 10 min., com fluxo de 1,0 mL/min. em vários
comprimentos de onda.
As dezenove frações obtidas do fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-1
foram codificadas como Ssp-Si-Fr1 a Ssp-Si-Fr19 e analisadas por RMN de 1H e CCDC
utilizando CHCl3/MeOH (95:05), utilizando como revelador luz ultra-violeta nos
comprimentos de onda 254 e 366nm e anisaldeído, seguido de aquecimento.
3.3.7 Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-2 produzido por
Saccharicola sp. em extrato de malte (Fluxograma 3).
O extrato bruto Ssp-AcOEt-2 foi analisado por HPLC-DAD e posteriormente
fracionado em CC utilizando sílica de fase reversa C-18 como fase estacionária e como
eluentes H2O:MeOH e MeOH/AcOEt em gradiente de polaridade de acordo com o
Fluxograma 4, pág. 43.
As dez frações obtidas foram codificadas como Ssp-C18-Fr1 a Ssp-C18-Fr10 e
analisadas por CCDC para avaliar o grau de pureza e analisadas por RMN de 1H e
HPLC-DAD para avaliação do perfil químico, utilizando coluna analítica Luna
Phenomenex tipo octadecil silano (C-18) e eluição em gradiente H2O/MeOH
(95:050:100) por 40 min., permanecendo nesta condição por mais 10 min., com fluxo
de 1,0 mL/min. em vários comprimentos de onda.
44
Fluxograma 3 - Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-1
45
Fluxograma 4 - Fracionamento do extrato bruto Ssp-AcOEt-2
46
3.3.8 Purificação das frações obtidas do fracionamento do extrato bruto Ssp-
AcOEt-1 produzido por Saccharicola sp.
3.3.8.1 Purificação da fração Ssp-Si-Fr-17
Análise desta fração por CCDC indicou tratar-se de uma substância pura, sendo
confirmada por RMN de 1H, RMN de 13C e HPLC-DAD, fornecendo a substância 1. A
substância foi enviada para ensaios antitumoral, anticolinesterásico, antifúngico,
tripanocida e antituberculose.
3.3.8.2 Purificação da fração Ssp-Si-Fr-13
A fração Ssp-Si-Fr-13 foi analisada por CCDC para avaliar o grau de pureza e a
polaridade da substância majoritária e posteriormente submetida à cromatografia em
coluna, onde utilizou-se sílica gel como fase estacionária e eluentes CHCl3/CH3OH em
gradiente de polaridade. Foram coletadas dez subfrações, codificadas como Ssp-Si-
Fr13-1 a Ssp-Si-Fr13-10 como visualizado na Fluxograma 5, pág. 46.
Estas foram analisadas por RMN de 1H e CCDC utilizando uma série de eluentes,
e anisaldeído seguido de aquecimento como revelador. Após esta análise, verificou-se
que a subfração Ssp-Si-Fr13-8 e Ssp-Si-Fr13-9 apresentavam-se puras. Estas foram
analisadas por CCDC onde observou-se tratar da mesma substância. Esta foi
submetida à análise de RMN de 1H e de 13C uni e bidimensionais, HPLC-DAD e EM
para auxiliar na determinação estrutural, fornecendo a substância 2.
3.3.9 Purificação das frações obtidas do fracionamento do Extrato Bruto
Ssp-AcOEt-2 produzido por Saccharicola sp..
3.3.9.1 Purificação da fração Ssp-C18-Fr1
A fração Ssp-C18-Fr1 foi analisadas por CCDC para avaliar o grau de pureza e a
polaridade das substâncias majoritárias. Em seguida foi submetida à CC sob pressão,
onde utilizou-se como fase estacionária sílica de fase reversa C18 e eluentes
H2O/MeOH em gradiente. Foram obtidas nove subfrações (Ssp.C18-Fr1-1 a Ssp-C18-
47
Fr1-9) como visualizado na Fluxograma 6, pág. 47. Estas foram analisadas por RMN
de 1H e CCDC utilizando uma série de eluentes, e anisaldeído seguido de aquecimento
como reveladores. Após esta análise verificou-se que as subfrações Ssp-C18-Fr1-2,
Ssp-C18-Fr1-3 e Ssp-C18-Fr1-4 apresentaram-se puras. Estas foram submetidas a
análises de RMN de 1H e 13C uni e bidimensionais e EM para auxiliar na determinação
estrutural, no entanto após determinação estrutural concluímos tratar-se de apenas
uma substância com mesma estrutura da substância isolada da fração Ssp-Si-Fr17
codificada 1.
48
Fluxograma 5 - Fracionamento da Fração Ssp-Si-Fr8
Fonte: A autora
49
Fluxograma 6- Fracionamento cromatográfico de Ssp-C18-Fr1.
Fonte: A autora
50
3.10 Análises químicas e avaliação do perfil químico do extrato bruto AcOEt
de Saccharicola sp.
O extrato AcOEt obtido do fungo endofítico Saccharicola sp. foi submetido à
análises químicas utilizando as seguintes técnicas:
3.10.1 Análise por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa
(CCDC).
Esta técnica tem o objetivo de estabelecer condições primárias de separação
cromatográfica, obtendo indícios da natureza química das substâncias presentes no
extrato.
As análises do extrato AcOEt realizadas por CCDC foram otimizadas utilizando
sílica de fase normal e fase reversa (C18) como fases estacionárias e misturas binárias
dos solventes AcOEt, Hex, CH3OH e CHCl3 para a seleção da fase móvel. O sistema
que apresentou melhor separação e resolução cromatográfica foi sílica de fase normal
como fase estacionária e eluição com CHCl3:CH3OH (90:10 v/v).
3.10.2 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector
de Arranjo de Diodos (HPLC-DAD).
A submissão do extrato AcOEt à HPLC-DAD foi importante para se verificar a
adequação desta técnica cromatográfica ao trabalho experimental, e também contribuir
para o conhecimento da natureza química das substâncias presentes, auxiliando na
escolha das fases movéis para separação em CC.
Nas análises do perfil químico do extrato AcOEt realizadas por HPLC-DAD, as
amostras foram submetidas à eluição em gradiente exploratório com coluna analítica
Luna Phenomenex tipo octadecil silano (C18) e eluição em gradiente H2O/CH3OH
(95:05/0:100) por 40min., permanecendo nesta condição por mais 10min., com fluxo de
1,0 mL/min. e λ de 254nm para posterior escolha do melhor comprimento de onda.
51
3.10.3 Análise por RMN de 1H.
O objetivo desta técnica é a obtenção de indícios sobre a natureza química dos
hidrogênios presentes nos metabólitos produzidos pelo endófito no extrato AcOEt.
Para obtenção dos espectros de RMN de 1H do extrato AcOEt, as amostras foram
submetidas à análise utilizando DMSO-d6 como solvente.
3.11 Avaliação do perfil biológico dos extratos, frações e substâncias puras
obtidos de Saccharicola sp.
As análises biológicas realizadas para os extratos AcOEt, frações oriundas do
fracionamento e as substâncias puras obtidas do cultivo em Extrato de Malte do
endófito Saccharicola sp. foram:
3.11.1 Avaliação da atividade antifúngica.
Diversas doenças que ocorrem em plantas, animais e humanos são causadas por
fungos fitopatogênicos e patogênicos, respectivamente. Esse fato associado a
quantidade de metabólitos diferentes isolados de plantas e micro-organismos tem
incentivado pesquisas na busca de novas substâncias antifúngicas de origem natural
(CARDOSO,2003).
Considerando esta necessidade e a ecologia química relacionada com os fungos
endofíticos que habitam ambientes propícios ao ataque de fitopatógenos, foram
realizados ensaios da atividade antifúngica com os extratos brutos, frações e
substâncias puras produzidas pelo endófito Saccharicola sp.
Os ensaios de atividade antifúngica foram desenvolvidos no Instituto de Botânica
de São Paulo – Seção de Fisiologia Vegetal, sob supervisão da Dra. Maria Claudia
Marx Young.
A atividade antifúngica foi determinada por bioautografia pela nebulização dos
fungos Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum (concentração
de 5x107 esporos mL-1 em solução de glicose e sais) em placas de CCDC contendo as
frações de interesse, previamente eluídas com CHCl3:CH3OH (9:1). As placas foram
incubadas a 25ºC por 48 horas, na ausência de luz. Após este período verificou-se a
presença de halos de inibição do crescimento dos fungos, em comparação com o
padrão positivo nistatina 1μg (RAHALISON, 91).
52
3.11.2 Avaliação da Atividade Anticolinesterásica
A doença de Alzheimer é uma patologia neurodegenerativa, progressiva, que
causa comprometimento da memória, dificuldade no raciocínio e alterações
comportamentais. De todas as alternativas terapêuticas possíveis, as mais eficientes
disponíveis no mercado funcionam corrigindo uma deficiência de acetilcolina no
processo sináptico (TABARRINI, 2001).
Com o crescente impacto da doença de Alzheimer e os poucos agentes
terapêuticos seguros, há uma grande procura por substâncias potencialmente ativas.
A partir disso os extratos brutos, frações e substâncias puras produzidas pelo
endófito Saccharicola sp foram testados a fim de avaliar a possível potencialidade de
inibição da enzima acetilcolinesterase.
Os ensaios de atividade anticolinesterásica foram desenvolvidos no Instituto de
Botânica de São Paulo – Seção de Fisiologia Vegetal, sob supervisão da Dra. Maria
Claudia Marx Young.
O ensaio qualitativo e quantitativo por bioautografia (Cromatografia em Camada
Delgada – CCD) consiste na eluição de uma cromatoplaca da substância em análise,
juntamente com um controle positivo inibidor da enzima acetilcolinesterase (AChE),
galantamina. As amostras e o controle foram aplicados em placas de sílica com eluente
adequado [CHCl3:CH3OH (9:1)], objetivando encontrar a menor quantidade inibidora da
AChE, que possa ser observada visualmente. Após o desenvolvimento da
cromatografia, a placa foi borrifada com a solução da enzima AChE (6,66U) (solução
A). A placa cromatográfica foi incubada em câmara úmida fechada a 37C por 20
minutos, e em seguida borrifada com a (solução D) (MARSTON et al., 2002).
O aparecimento de manchas brancas sobre um fundo de coloração roxa indica
que houve inibição da atividade da enzima acetilcolinesterase.
Soluções:
Solução A: Acetilcolinesterase (1000U, Sigma, produto no C2880)
foi dissolvida em 150mL do tampão Tris-HCl (0,05M; pH=7.9), a solução estoque
e foi armazenada a 4C e no momento do uso foi adicionado 0,1% de albumina
de soro bovino;
Solução B: 250mg de acetato de 1-naftila em 100mL de etanol;
Solução C: 400mg do sal Fast Blue B em 160mL de água
destilada;
Solução D: mistura de 10mL da solução B + 40mL da solução C.
53
3.11.3 Avaliação da Atividade Antitumoral
Os ensaios antitumorais foram desenvolvidos no Laboratório de Oncologia
Experimental, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do
Ceará, sob supervisão do Prof. Dr. Paulo Michel Pinheiro Ferreira.
A análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no programa
de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que testa mais de
10.000 amostras a cada ano (SKEHAN et al., 1990). É um método rápido, sensível e
barato. Foi descrita primeiramente por Mosman (1983), tendo a capacidade de analisar
a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica baseada na
conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazolium (MTT)
em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes somente nas células
metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT permite definir
facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação (BERRIDGE et al., 1996).
As substâncias previamente diluídas em DMSO puro estéril para a concentração
estoque de 10 mg/mL e adicionadas à placa de 96 poços (50 μg/mL - 100 μL/poço)
usando sistema automatizado de plaqueamento (High Throughput Screening). O
quimioterápico doxorrrubicina (Dox) foi usado como controle positivo na concentração
de 0,3 μg/mL. Após um período de incubação de 69 h, as placas foram retiradas e
centrifugadas a 1500 rpm/15 min. O sobrenadante foi aspirado e foram adicionados 200
μL de solução de MTT 10 % em RPMI 1640, sendo a placa colocada na estufa a 5 %
de CO2 por 3 h. Em seguida, as placas foram novamente centrifugadas, o
sobrenadante foi aspirado e precipitado foi ressuspendido em 150 μL de DMSO e
agitado por 10 min até completa dissolução dos cristais de formazan. As placas foram
lidas em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 595 nm.
As linhagens tumorais utilizadas, OVCAR (carcinoma de ovário), HCT-116 (cólon
– humano) e SF-295 (glioblastoma – humano) foram cedidas pelo Instituto Nacional do
Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de
soro fetal bovino e 1 % de antibióticos, mantidas em estufa a 370C e atmosfera
contendo 5% de CO2.
As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril para a concentração estoque
de 10 mg/mL.
As substâncias foram testadas em duplicata. Os valores dos resultados e seus
respectivos intervalos de confiança (IC 95 %) foram calculados a partir de regressão
não-linear utilizando o programa Prism versão 3.0 (GraphPad Software).
54
3.11.4 Avaliação da atividade Tripanocida utilizando MTT
Atualmente, cerca de 16 a 18 milhões de pessoas na América Latina estão
infectadas com o protozoário do gênero Trypanosoma, causador da doença de Chagas,
transmitida pelo inseto barbeiro. A terapêutica continua parcialmente ineficaz, apesar
dos esforços de pesquisadores. Na literatura atual, encontram-se investigações sobre a
atividade tripanocida com uma grande variedade de produtos naturais (CICARELLI,
2010).
Os ensaios Tripanocida utilizando MTT (Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-
difeniltetrazólio), foram desenvolvidos na Faculdade de Ciencias Farmacêuticas da
Unesp Araraquara-SP, sob supervisão da Profa Dra. Regina Maria Cicarelli.
Após observação de ausência de contaminação na cultura de T. cruzi, os
parasitas foram tratados como descrito a seguir, para contagem em câmara de
Neubauer para leitura em microscópio óptico comum.
Em um tubo de 1,5 mL, adicionou-se:
Solução A: 0,5 μL de formol
Solução B: 19 μL de meio de cultura
Solução C: 1 μL de parasita (diluição 1:20)
Obs.: o formol tem a finalidade de imobilizar os parasitos para facilitar sua contagem.
Para substâncias puras, iniciou-se com uma diluição de 5 mg/ml, colocada no
poço H: 10 μL 20mg/ml (estoque) + 30 μL DMSO.
Adicionar 3 μL de cada uma das concentrações nos poços da nova placa em
triplicatas (fileiras A a G, colunas 1 a 6). Em seguida, adiciona-se 97 μL de meio de
cultura contendo parasitas nas colunas 1, 2 e 3 e apenas meio de cultura nas colunas
4, 5 e 6 (controle). A fileira H serve como controle: colunas 1 a 3, contendo somente
parasitas, sem substância; e 4 a 6, somente meio de cultura, sem substâncias.
A seguir, incuba-se as placas em câmara úmida a 28°C (BOD) por 72 horas. Após
este período adiciona-se 10μL de solução MTT + PMS por orifício (2,5mg/mL de MTT e
0,22 mg/mL de PMS), repetindo-se a incubação por mais 1h15min ao abrigo da luz,
seguido da adição de 100 μL de solução SDS 10%/HCl 0,01M para dissolver os cristais
de formazana; incuba-se por mais 30 min.
A leitura da Densidade Optica (DO) é realizada em leitor de Elisa (BioRad) a 595
nm. Com as absorbâncias obtidas elabora-se gráficos para determinação da CI50
(concentração que mata 50% dos parasitas).
55
3.11.5 Avaliação da atividade anti-tuberculose
A tuberculose, chamada antigamente de "peste cinzenta" (HARAKI, 2010),
conhecida também em português como tísica pulmonar (BUENO, 2010) ou "doença do
peito", é uma das doenças infecciosas documentadas desde mais longa data e que
continua a afligir a Humanidade nos dias atuais.
Essa doença é causada pelo Mycobacterium tuberculosis, também conhecido
como bacilo de Koch.
Os ensaios do REMA (Resazurin Microtiter Assay) foram desenvolvidos na
Faculdade de Ciencias Farmacêuticas da Unesp Araraquara-SP, sob supervisão do
Prof Dr. Fernando Rogério Pavan.
Para o ensaio do REMA foi utilizado como substância reveladora a Resazurina na
concentração de 0,01% em água destilada estéril, que possui potencial REDOX (Óxido-
Redução), com mudança colorimétrica e um indicador de fluorescência em resposta ao
metabolismo celular (PAVAN, 2009).
A cepa padrão de M. tuberculosis H37Rv - ATCC 27294 foi utilizada na técnica do
REMA, para determinar CIM (Concentração Inibitória Mínima) de todas as amostras
analisadas. A cultura bacilar foi mantida congelada a -80° C até o momento do uso.
Na coluna 12 de uma microplaca estéril de 96 orifícios foi depositado 200 µL de
água destilada estéril, para evitar a desidratação do meio de cultura no ensaio durante
a incubação na estufa. A substância testada foi diluída em DMSO, obtendo
solução estoque de 10 mg/mL. Em seguida, foram realizadas diluições seriadas destas
soluções na própria microplaca, de maneira a se obter concentrações variáveis de
rifampicina (fármaco controle) (de 1 a 0,03µg/mL) e da substância testada (de 25µg/mL
a 0,09 µg/mL). O primeiro orifício da microplaca contendo cada composto a
ser analisado foi utilizado para controle de contaminação do composto. Neste orifício foi
adicionado apenas o meio de cultura e a amostra na diluição de 1/4, onde espera-se
não haver crescimento de nenhuma espécie bacteriana. A cepa de M. tuberculosis
H37RV ATCC 27294 congelada foi utilizada no início do ensaio na concentração de
10^5 UFC/mL para que no final do experimento fosse obtido população de
10^7 UFC/mL. 100 µL da diluição de 10^5 UFC/mL foi inoculada em cada um dos
orifícios contendo a substância em análise e a rifampicina. A microplaca foi selada
com parafilme e incubada a 37ºC. Após sete dias de incubação foi adicionado no
orifício de controle de cepa micobacteriana e no orifício de controle de meio, o volume
de 30 μL da resazurina 0.01% (PAVAN, 2009).
http://pt.wikipedia.org/wiki/Doen%C3%A7a
http://pt.wikipedia.org/wiki/Humanidade
http://pt.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis
http://pt.wikipedia.org/wiki/Bacilo_de_koch
56
Leitura da placa foi feita no aparelho SpectraFluor PLUS (tecan) com filtros de
excitação e emissão de 530nm e 590nm.
A CIM foi definida como a menor concentração do composto capaz de inibir a
multiplicação de 90% das células de M. tuberculosis. A porcentagem de inibição da
multiplicação bacteriana foi determinada aplicando-se a fórmula a seguir,
considerando a igual à média da leitura dos orifícios controle-positivos (orifícios apenas
com bactéria e meio de cultura) e b o resultado de cada orifício com a respectiva
diluição do composto analisado (PAVAN, 2009).
100 X (1- b/a) = % de Inibição da Multiplicação Bacteriana.
57
4 Resultados e Discussão
4.1 Análise do extrato AcOEt obtido do cultivo em Extrato de Malte do fungo
endofítico Saccharicola sp. por HPLC-DAD.
O extrato AcOEt foi submetido à análise do perfil químico por HPLC-DAD para
verificar a adequação desta técnica cromatográfica no trabalho experimental e, também
contribuir para uma avaliação prévia da natureza química das substâncias presentes.
No cromatograma obtido em gradiente exploratório foi observada uma grande
variedade metabólica, com bandas cromatográficas com diferentes tempos de
retenção, variando de média a alta polaridade. O estudo dos tempos de retenção nos
auxiliaram na escolha das condições da fase movél para o fracionamento por CC
usando sílica comum para o extrato bruto Ssp-AcOEt 1 e de fase reversa (C-18) para o
extrato bruto Ssp-AcOEt 2.
Uma comparação entre o cromatograma do extrato bruto e o obtido do branco
(Figura 09, pág. 55) revelou que a variedade dos sinais corresponde somente aos
metabólitos produzidos pelo fungo, uma vez que o cromatograma do branco apresentou
picos não coincidentes com os do extrato AcOEt obtido do endófito Saccharicola sp.
Figura 09- Comparação entre os cromatogramas obtidos em Malte
Fonte: A autora
58
4.2 Análise do extrato AcOEt obtido em Extrato de Malte por RMN de 1H.
O extrato AcOEt foi submetido à análise de RMN de 1H com o objetivo de obter
indícios sobre a natureza química dos hidrogênios presentes nos metabólitos
produzidos pelo fungo endofítico.
De um modo geral, o espectro de RMN de 1H evidenciou sinais em uma ampla
faixa espectral demonstrando a presença de substâncias aromáticas, sinais de
hidrogênios carbinólicos, metílicos, metilênicos, metínicos, entre outros. A diversidade
de sinais ressalta a grande diversidade química do extrato AcOEt produzido pelo fungo
endofítico Saccharicola sp.
4.3 Fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt obtido em malte de
Saccharicola sp. e obtenção das substâncias puras
Após análise por HPLC-DAD, o extrato Ssp-AcOEt-1 foi fracionado em CC
utilizando sílica de fase normal como fase estacionaria e sistema de eluição Hex:AcOEt
e AcOEt:MeOH em gradiente, levando a obtenção de dezenove frações (Ssp-Si-Fr1 a
Ssp-Si-Fr19). O extrato bruto Ssp-AcOEt-2 foi fracionado em CC sob-pressão,
utilizando sílica de fase reversa (C-18) como fase estacionária e sistema de eluição
H2O:MeOH em gradiente, levando a obtenção de dez frações (Ssp-C18-Fr1 a Ssp-C18-
Fr10). Todas as frações foram analisadas por CCDC para avaliar o grau de pureza e
em seguida foram analisadas por HPLC-DAD e por RMN de 1H. As frações que
apresentavam-se puras foram codificadas como substância 1 e substância 2 e
analisadas por HPLC-DAD (Figuras 10-11, pág. 57) e demais técnicas
espectrométricas para determinação estrutural.
59
Figura 10- Cromatograma da Substância 1 registrado em 228 nm.
Fonte: A autora
Figura 11- Cromatograma da Substância 2 registrado em 261 nm.
Fonte: A autora
60
4.4 Determinação Estrutural das Substâncias Isoladas
4.4.1 Determinação Estrutural da Substância 1
CH3H3C
OH
HO
O
CH3
OH
OH
1
2
3
4
5
6
7
8 9
10
11
12
13
14
15 16
Fonte: A autora
Considerando que após um levantamento bibliográfico ter sido realizado nas
bases de dados Scinfinder e Web of Science e não encontrarmos a substância descrita
acima, e sequer esqueleto básico parecido propomos uma numeração (que pode ser
modificada) apenas para efeito de determinação estrutural.
O espectro de IV (Figura 12, pág. 58) exibiu uma banda larga em 3300 cm-1
característico de hidroxila, uma banda fina e fraca em aproximadamente 2150 cm-1
característico de uma ligação tripla, banda em 1650 cm-1 característico de ligação dupla
e banda em 775 cm-1 característico de um epóxido dissubstituído.
Figura 12- Espectro de IV da substância 1.
Fonte: A autora
61
O espectro de RMN de 1H (Figura 13, pág. 60) da substância 1 apresentou sinais
referentes a três metilas H 1,59 (s, H-15), H 1,69 (s, H-16 e H 1,30 (s, H-11) sendo
duas sobre carbono sp2 e uma sobre carbono carbinólico, cinco hidrogênios
carbinólicos H 3,13 (s, 1H, H-6), H 4,45 (sl, 1H, H-5) e H 3,90 (d, J=8,0Hz, 1H, H-2) e
dois hidrogênios metínicos de carbono sp2 em H 5,13 (t, J=7,0Hz, H-13) e H 5,57 (sl,
H-4).
Adicionalmente, foram observados um tripleto em 4,88, um simpleto em 5,22, dois
dubletos em 5,31 e 5,38, sem correlação no experimento de HSQC sendo portanto
atribuídos aos hidrogênios ligados ao oxigênio nas hidroxilas OH10, OH9, OH5 e OH2
respectivamente, sendo confirmados através do desaparecimento dos mesmos quando
foram submetidos a analise por RMN de 1H na presença de D2O (Figura 14, pág. 61).
O espectro de RMN de 13C (Figura 15, pág. 62) com auxílio de experimento de
DEPT (Figura 16, pág. 63) evidenciou seis carbonos carbinólicos sendo atribuídos a
três carbonos metínicos (C 59,2, C, 64,8 e C 67,7), um metilênico (C 70,1) e dois
quaternários (C 61,7, C 68,1), sendo que o observado em C 61,7 foi atribuído ao
carbono carbinólico de um epóxido.
Com auxílio do experimento de HSQC (Figura 17, pág. 64) foi possível atribuir
todos átomos de hidrogênios aos respectivos carbonos.
Na análise dos mapas de correlação no experimento de HMBC (Figura 18, pág.
65), foi observado a correlações dos hidrogênios H-16 e H-15 com os carbonos C-13 e
C-14, hidrogênio H-13 com os carbonos C-15 e C-16 e hidrogênio H-12 com os
carbonos C-1, C-13 e C-14, e através da ampliação (Figura 19, pág. 66) foi possível
atribuir também as hidroxilas, como observado na Tabela 3 (pág. 67) evidenciando uma
unidade prenila como mostrado na estrutura parcial A (Figura 20, pág. 67).
62
Figura 13- Espectro de RMN de 1H da Substância 1 (DMSO- d6, 600 MHz)
Fonte: A autora
63
Figura 14- Espectro de RMN de 1H com D2O da Substância 1 (DMSO- d6, 600 MHz)
Fonte: A autora
64
Figura 15-Espectro de RMN de 13C da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
65
Figura 16- Espectro de DEPT 135 da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
66
Figura 17- Mapa de correlação H-C a uma ligação (HSQC) da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
67
Figura 18- Mapa de correlação H-C a longa distancia (HMBC) da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
68
Figura 19- Ampliação mapa de correlação H-C a uma ligação (HMBC) da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
69
Tabela 3- Dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) da substância 1 em
DMSO- d6.
Posição
1H () 13C () gHMBC
Posição G
1 - 61,7 -
2 3,90 (d, 8Hz) 67,7 C-1; C-3; C-6
3 - 121,8 -
4 5,57 (t, 1,29/1,32Hz) 134,6 C-5; C-6; C-7
5 4,45 (dq) 64,8 -
6 3,13 (ddd, 1,2/0,54/1,17Hz) 59,2 C-4; C-5
7 - 82,9 -
8 - 92,8 -
9 - 67,7 -
10 3,32* 70,1 C-8; C-9; C-11
11 1,30 (s) 26,8 C-8; C-9; C-10
12 a 2,70 (dd, 7Hz) 29,9 C-1; C-13; C-14
12 b 2,18 (dd, 7Hz) 29,9 C-1; C-13; C-14
13 5,13 (ddqq, 7Hz) 118,6 C-15; C-16
14 - 134,7 -
15 1,58 (s) 18,3 C13; C-14; C-16
16
OH-2
OH-5
OH-9
OH-10
1,70 (s)
5,38
5,31
5,22
4,88
26,8
67,7
64,8
67,7
70,1
C-13; C-14; C-15
-
-
-
-
*(encoberto pela água)
Figura 20- Estrutura parcial A da substância 1
CH3H3C
Fonte: A autora
70
Os valores de deslocamentos químicos em C 82,9 e C 92,8 associados à
ausência de hidrogênio, como visualizado no experimento de HSQC e DEPT,
evidenciaram a presença de uma ligação tripla. Correlações observadas em HMBC do
hidrogênio H-11 com os carbonos C-8 e C-10, associado aos valores de deslocamento
químico de carbono e hidrogênio e as respectivas multiplicidades permitiram propor a
estrutura parcial B (Figura 21, pág. 68).
Figura 21- Estrutura parcial B da substância 1
CH3
OH
OH
Fonte: A autora
Analise do experimento de COSY (Figura 22, pág. 69) evidenciou correlações
entre os hidrogênios H-6, H-5 e H-4 e entre o hidrogênio H-2 com a hidroxila OH2 como
observado na ampliação (Figura 23, pág.70), o que associado com as correlações
observadas em HMBC entre o hidrogênio H-2 com os carbonos C-1 e C-6, hidrogênio
H-4 com o carbono C-6 e do hidrogênio H-6 com o carbono C-4, juntamente com os
valores dos deslocamentos químicos de RMN de 1H e 13C nos permitiram propor a
estrutura parcial C (Figura 24, pág. 71).
71
Figura 22- Mapa de correlação COSY da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
72
Figura 23- Ampliação Mapa de correlação COSY da Substância 1 (DMSO- d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
73
Figura 24 Estrutura parcial C da substância 1
OH
HO
H
H
O
1 2 3 4 5
6
HH
Fonte: A autora
A junção de C-6 e C-5 foi realizada com base nas correlações observadas em
HMBC do hidrogênio H-4 com o carbono C-6 e do hidrogênio H-6 com o carbono C-4,
dando origem a estrutura parcial D (Figura 25, pág. 71).
Figura 25- Estrutura parcial D da substância 1
OH
HO
O
H
H
H
H
1
6
5
4
3
2
Fonte: A autora
A junção entre as estruturas parciais A, B e D foi realizada com base nas
correlações observadas em HMBC do hidrogênio H-12 com o carbono C-1 e do
hidrogênio H-4 com o carbono C-7 fornecendo a estrutura final da substância 1 (Figura
26, pág. 72).
74
Figura 26- Substância 1 e as principais correlações em HMBC.
Fonte: A autora
No espectro de UV em MeOH grau HPLC da substância 1 (Figura 27, pág. 72)
observamos um máximo de absorção em 228 nm característico de uma ligação dupla
conjugada com uma ligação tripla.
Figura 27- Espectro de UV da substância 1.
200 300 400 nm
0
50
100
150
200
250
300
350
mAU
23.29
22
8
Fonte: A autora
75
Para a confirmação da estrutura proposta, a substância 1 foi analisada por ESI-
MS de alta resolução, no modo positivo, onde a presença do pico base em m/z em
317,1356 (100%) indicando a formação aduto sódio [M+Na+]. Verificou-se também a
presença do pico em m/z 611,2839 [2M+Na+], confirmando a massa molecular da
substância. Ao analisarmos o Índice de Deficiência de Hidrogênio (IDH) verificamos a
presença de 6 insaturações. Após analisarmos todas essas informações confirmamos a
fórmula molecular C16H22O5.
A estereoquímica relativa de 1 foi definida com base nos experimentos de NOESY
1D onde observou-se que a irradiação relativa dos sinais em 2,70 ppm e 2,18 ppm,
atribuídos aos hidrogênios H-12 intensificava por NOE os sinais em 3,90 ppm e 3,13
ppm, atribuídos aos hidrogênios H-2 e H-6 respectivamente (Figura 28, pág. 74/ Figura
29, pág. 75), a irradiação relativa do sinal em 5,13 ppm atribuído ao hidrogênio H-13
intensificava por NOE os sinais em 3,90 ppm, 3,13 ppm e 1,70 atribuídos aos
hidrogênios H-2, H-6 e H-16,respectivamente (Figura 30, pág. 76), a irradiação relativa
do sinal em 3,1 ppm atribuído ao hidrogênio H-6 intensificava por NOE o sinal em 4,45
ppm atribuído ao hidrogênio H-5 (Figura 31, pág. 77).
O epóxido poderia ser posicionado entre C-1/C-6 ou C-5/C-6, no entanto a
segunda hipótese foi descartada devido às interações observadas no experimento de
HMBC entre o hidrogênio H-4 com o carbono C-6 e a correlação em COSY do
hidrogênio H-5 com a hidroxila OH-5.
Através do experimento de HSQC TOCSY (Figura 32, pág. 78) podemos observar
um sistema de spin entre os hidrogênios H-4, H-5 e H-6, e outro sistema de spin entre
os hidrogênios H-13 e os dois hidrogênios H-12. Também é possível observar
interações entre a hidroxila OH-5 com os hidrogênios H-4, H-5 e H-6, além de
interações entre a hidroxila OH-2 com o hidrogênio H-2 (Figura 33, pág. 79),
confirmando, portanto, tanto a posição das hidroxilas quanto a do epóxido, como
proposto entre os carbonos C-1/C-6, permitindo propor para a substância 1 (Figura 34,
pág. 80) a estereoquímica relativa (Figura 35, pág. 80) demonstrada abaixo.
76
Figura 28- Correlações observadas por NOESY entre H-12↔H-2.
Fonte: A autora
77
Figura 29- Correlações observadas por NOESY entre H-12↔H-6
Fonte: A autora
78
Figura 30- Correlações observadas por NOESY entre H13↔H2/H6/H15
Fonte: A autora
79
Figura 31- Correlações observadas por NOESY entre H6↔H5
Fonte: A autora
80
Figura 32: Mapa de correlação HSQC TOCSY da Substacia 1 (DMSO-d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
81
Figura 33: Mapa de correlação HSQC TOCSY Ampliado da Substacia 1 (DMSO-d6, 150 MHz)
Fonte: A autora
82
Figura 34- Correlações observadas em NOESY 1D para 1
H
OH
H H
HO
H
O
HH
CH3
OH
OH
Correlações observadas em NOESY 1D
2
456
12a12b
Fonte: A autora
Figura 35- Configuração relativa proposta para substância 1
Fonte: A autora
Levantamento bibliográfico realizado até o momento na Web of Science e
Scinfinder indica tratar-se de uma substância inédita.
83
4.4.2 Determinação Estrutural da Substância 2
O CH3
CH3
OH
H
H
H
H
O
HO
OHH
1
2
3
4
5
6
7 8
9
10 11
12
Fonte: A autora
O espectro de IV (Figura 36, pág. 81) exibiu uma banda larga em 3350 cm-1
característico de hidroxila, uma banda associada à carbonila em 1700 cm-1, banda
pequena em 1150 cm-1 característico de éter e uma banda de forte absorção em 1600
cm-1 característico de anel aromático.
Figura 36- Espectro de IV da substância 2.
Fonte: A autora
84
O espectro de RMN de 1H (Figura 37, pág. 80) da substância 2 apresentou sinais
característicos de hidrogênios aromáticos em H 6,76 (d, J=8,0Hz,1H, H-5), H 7,69 (dd,
J=8,0 e 2,0Hz, 1H, H-6) e H 8,04 (d, J=2,0Hz, 1H, H-2) indicando um anel aromático
1,3,4 trissubstituído. Foram observados, dois sinais em H 1,14 (s, 3H, H-11) e H 1,38
(s, 3H, H-12) atribuídos a duas metilas ligadas a um carbono carbinólico quaternário
sp3, um tripleto em H 4,34 (t, J=7,0 Hz, 1H) que devido ao valor do deslocamento
químico foi atribuído a um hidrogênio oxibenzílico. Adição de D2O simplifica este tripleto
para dubleto (d, J=8,0Hz), evidenciando que o mesmo estava acoplando com –OH8.
Com auxilio do experimento de HSQC, foi observado um sinal em H 3,50 (encoberto
pela água do DMSO), atribuído a outro hidrogênio carbinólico. Adicionalmente, foram
observados dois dubletos em 5,53 (d, J=6,0Hz, 1H, O-H8) e 5,65 (d, J=6,0 Hz, 1H, O-
H9), estes dois sinais foram atribuídos aos hidrogênios ligados ao oxigênio devido a
falta de correlação em HSQC e ao desaparecimento dos mesmos quando foram
submetidos a analise por RMN de 1H na presença de D2O (Figura 38, pág. 84).
No espectro de RMN de 13C (Figura 39, pág. 85) foram visualizados seis carbonos
aromáticos, dois metílicos, três carbinólicos sendo um oximetínico, outro metílico e o
terceiro quaternário aos quais foram atribuídos aos respectivos hidrogênios com base
nas correlações observadas nos experimento de HSQC (Figura 40, pág. 86).
No experimento de HMBC (Figura 41, pág. 87) foram observadas as correlações
entre o hidrogênio H-2 com os carbonos C-4 e C-6, e do hidrogênio H-5 com os
carbonos C-3 e C-4, o que, associado aos valores dos deslocamentos químicos,
confirmou a presença de um anel aromático 1,3,4 trisubstituído. Adicionalmente, a
correlação existente entre os hidrogênios H-12 e H-11 com os carbonos C-8 e C-9,
como observado na Tabela 4 (pág. 88), indicou tratar-se de um cromeno oxidado em C-
8 e C-9. Os valores de deslocamento químico dos átomos de carbono e de hidrogênio
permitiram posicionar uma carboxila em C-1.
85
Figura 37- Espectro de RMN de 1H da Substância 2 (DMSO- d6, 300 MHz)
Fonte: A autora
86
Figura 38- Espectro de RMN de 1H com D2O da Substância 2 (DMSO- d6, 300 MHz)
Fonte: A autora
87
Figura 39- Espectro de RMN de 13C da Substância 2 (DMSO- d6, 75 MHz)
Fonte: A autora
88
Figura 40- Mapa de correlação H-C a uma ligação (HSQC) da Substância 2 (DMSO- d6, 100 MHz)
Fonte: A autora
89
Figura 41- Mapa de correlação H-C a longa distancia (HMBC) da Substância 2 (DMSO- d6, 100 MHz)
Fonte: A autora
90
Tabela 4- Dados de RMN de 1H (300 MHz) e 13C (100MHz) da substância 2 em
DMSO- d6.
Posição
1H () 13C () gHMBC
Posição G
1 - 125 -
2 8,04 (dd, 0,87/0,57Hz) 132 C-4; C-6
3 - 127 -
4 - 157 -
5 6,76 (d, 8Hz) 118 C-3; C-4
6 7,69 (dd, 2/2Hz) 131 -
7 - 125 -
8 4,34 (t, 7/7Hz) 71 C-9
9 3,5 (s)* 75 C-8
10 - 81 -
11 1,14 (s) 21 C-8; C-9; C-10; C-12
12 1,38 (s) 28 C-8; C-9; C-10; C-11
-OH-8 5,53 (d, 5Hz)
-OH-9 5,65 (d, 6Hz)
*(encoberto pelo DMSO- d6)
Fonte: A autora
No espectro de UV em MeOH grau HPLC da substância 2 (Figura 42, pág. 88)
observamos um máximo de absorção em 251 nm característico de substâncias da
classe dos cromenos.
Figura 42- Espectro de UV da substâncias 2.
Fonte: A autora
91
Para a confirmação da estrutura proposta, esta foi analisada por ESI-MS, no modo
positivo, onde a presença do íon molecular em m/z 237,0792 está coerente com a
fórmula molecular C12H14O5 e com a estrutura proposta para a substância 2 (Figura 43,
pág. 89).
Comparando-se os dados espectrométricos com a literatura foi possível
identificar a substâncias 2 como sendo o ácido anofínico isolado pela primeira vez de
Anodendron afine (ABRAHAM, ARFMANN 1990). Essa substância foi relatada do fungo
Eutypa lata (DEFRANQ, ZESIGER, TABACCHI 1993) e do fungo Culvularia fallax
(ABRAHAM, ARFMANN 1990), e apresenta citotoxidade contra várias espécies de
Fusarium (CHRISTEN et al.,2005).
Figura 43- Substância 2 e suas principais correlações em HMBC.
Fonte: A autora
A estereoquímica relativa de H-8 e H-9 foi determinada como trans com base nas
constantes de acoplamento de 8,0 Hz (Figura 44, pág. 90) que foram observadas no
espectro de RMN de 1H da substância, pois se a relação entre H-8 e H-9 fosse cis
teríamos uma constante de acoplamento de 2,0 Hz (Figura 45, pág. 90).
Isso por ser confirmado também ao analisarmos a estabilidade das duas
configurações.
Na configuração Trans, observamos uma possível ligação de hidrogênio entre o
OH-8 e o H-9, além de termos os grupos maiores (OH-9 e CH3-10) nas posições
equatoriais, o que confere maior estabilidade a essa estrutura.
92
Já na configuração Cis, não observamos ligações de hidrogênio, e os grupos
maiores (OH-8 e CH3-10) estão na posição axial, o que confere menor estabilidade a
essa estrutura.
Figura 44- Configuração trans da substância 2.
O
HO
O
CH3
H
OH
H
OH
CH3
H
HO ~
H
OH~
8 Hz
Fonte: A autora
Figura 45- Configuração cis da substância 2.
O
HO
O
CH3
H
OH
OH
H
CH3
OH
H
H
OH~
~
2 Hz
Fonte: A autora
93
4.5 Avaliação das substâncias encontradas no extrato bruto por ESI-MS.
Considerando que nas análises dos experimentos de CCDC utilizando uma série
de eluentes e reveladores específicos, HPLC-DAD e RMN de 1H foram visualizadas
inúmeras substâncias, as quais não foram isoladas por encontrarem-se em menor
quantidade, inviabilizando a utilização de qualquer técnica cromatográfica para o
isolamento das mesmas, a técnica de desreplicação utilizando ESI-MS foi utilizada,
objetivando a identificação destas substâncias.
Deste modo, o extrato bruto produzido por Saccharicola sp. em Extrato de Malte
foi submetido a “clean up” e analisado por ESI-MS. Desta analise foram identificadas as
substâncias, substância 1, ácido anofínico (2), ácido 2,2-dimetil-2H cromeno-6-
carboxílico (3), ácido 4-hidróxi-3-prenilbenzóico (4) e ácido 4-hidróxi-3-(3´-metil-3´-
buten-1´-il) benzólico (5), (Figura 46, pág. 92) além de outras três substâncias
aparentemente da mesma classe da substância 1.
Os resultados encontrados sugerem que o meio de cultivo não esta influenciando,
diretamente, na produção metabólica de Saccharicola sp. apesar de diferenças
marcantes terem sido observadas na triagem realizada em diferentes meios de cultivo.
94
Figura 46- Substâncias identificadas por de ESI-MS
OH
OHO
CH3
CH3
O
CH3
CH3
HO
O
OH
HO O
CH3
CH2
O
CH3
CH3
HO
O OH
OH
CH3
OH
OH
OH
H
H
OH
O
H
CH3H3C
1
5
2
3
4
Fonte: A autora
95
4.6 Ensaios biológicos dos extratos brutos Ssp-AcOEt-1 e Ssp-AcOEt-2,
frações e das substâncias puras 1 e 2.
4.6.1 Avaliação da Atividade Antifúngica*
Os resultados da avaliação da atividade antifúngica contra os fungos
fitopatogênicos Cladosporium cladosporioides e C. sphaerospermum (Figura 47, pág.
93) evidenciaram que ambos os Extratos brutos, as frações Fr 4-Si, Fr 5-Si, Fr 6-Si, Fr
7-Si, Fr 8-Si e as substâncias puras 1 e 2 apresentaram fraco potencial antifúngico
contra Cladosporium cladosporioides e somente as frações Fr 4-Si, Fr 5-Si e Fr 6-Si
apresentaram fraco potencial antifúngico contra C. sphaerospermum.
Figura 47- Atividade antifúngica dos extratos brutos, frações e substâncias puras de
Saccharicola sp.
LEGENDA
* atividade fraca
** atividade média
*** atividade forte
*Os testes de atividade antifúngica foram feitos pela Dra. Maria Claudia Marx Young do Instituto
Botânico, SP.
96
4.6.2 Avaliação da Atividade Anticolinesterásica*
Este ensaio, realizado em CCDC, é qualitativo e é definido através do halo branco
em fundo roxo, para atividade inibitória positiva. De acordo com o observado nas
cromatoplacas (Figura 48, pág. 94) nenhuma amostra apresentou atividade,
evidenciando que esse fungo em questão não apresenta inibição da enzima
acetilcolinesterase.
Figura 48- Atividade anticolinesterásica dos extratos brutos, frações e substâncias
puras de Saccharicola sp..
LEGENDA
* atividade fraca
** atividade média
*** atividade forte
4.6.3 Avaliação da Atividade Antitumoral
Para realização deste ensaio, o extrato bruto AcOEt, algumas frações e as
substâncias puras 1 e 2 foram avaliadas, as demais substâncias não apresentaram
97
massa suficiente para realizar os ensaios, sendo que este ensaio requer uma
quantidade maior de massa quando comparado com os outros ensaios realizados.
O potencial antitumoral foi avaliado frente a três linhagens tumorais humanas e
comparadas com o controle positivo (doxorrubicina).
A atividade citotóxica das substâncias testadas está apresentada na Tabela 05
(pág. 95) com seus respectivos percentuais de inibição. Somente as substâncias que
apresentaram valores de inibição ≥ 75 % em pelo menos duas linhagens tumorais são
consideradas ativas, valor esse considerado como cut-off para o screening de novas
substâncias com potencial antitumoral.
Tabela 05- Atividade antitumoral do extrato bruto, frações e substâncias puras de
Saccharicola sp.
De acordo com o observado na tabela acima apenas a fração Ssp-Fr4 apresentou
potencial citotóxico relevante frente às linhagens tumorais testadas.
4.6.4 Avaliação da Atividade antituberculose
Atualmente há um crescente interesse pela busca de novas substâncias com
potencial antibiótica, sendo assim, as substâncias 1e 2 foram enviadas para ensaio de
inibição do crescimento do Mycobacterium tuberculosis, agente causador da
tuberculose humana, linhagem H37Rv ATCC – 27294. Os valores de CIM dos ensaios
98
estão apresentados na Tabela 6, pág. 96. Os valores encontrados para a concentração
inibitória mínima (CIM) representam a menor concentração da droga capaz de impedir
a multiplicação da micobactéria, eliminando pelo menos 90% das mesmas.
Tabela 06- Concentrações inibitórias mínimas (CIM) dos compostos frente aos bacilos
M. tuberculosis
Fonte: A autora
Na pesquisa de novos fármacos contra a tuberculose classificam-se como
promissores aqueles com atividades iguais ou inferiores a 10 μg/mL.
Os valores apresentados pelas substância 1 e 2 de CIM foram >25 μg/mL,
portanto, concluímos que essas substâncias não apresentam resultado positivo frente a
este bioensaio.
4.6.5 Avaliação da Atividade Tripanocida utilizando MTT
As substâncias 1 e 2 foram enviadas para ensaio tripanocida utilizando MTT
(Tabela 07, pág. 97).
O teste é realizado em triplicata, em varias concentrações. Para as substâncias
puras as concentrações realizadas são: 100, 50, 25, 10,5, 2,5 e 1 μg/ml.
99
Tabela 07- Atividade tripanocida das substâncias 1 e 2 isoladas de Saccharicola sp..
IC50 do benzonidazol: 9,01µg/mL
Fonte: A autora
Ao realizamos o calculo do IC50 observamos um valor acima de 100 μg/ml,
indicando que ambas as substâncias não possuem atividade tripanocida de interesse
farmacológico.
100
5 Conclusões
O meio de cultivo líquido Malte apresentou uma boa produção metabólica e perfil
químico promissor, visualizado pelo espectro de RMN de 1H e HPLC-DAD.
O fracionamento dos extratos brutos Ssp-AcOEt-1 e Ssp-AcOEt-2 nos conduziu
ao isolamento das substâncias 1 (inédita) e 2 (ácido anofínico).
Houve uma produção majoritária da substância 1 sugerindo que esta substância
esteja exercendo algum papel ecológico no nicho em que o micro-organismo se
encontra e aparentemente adaptado, uma vez que foi isolado de material saudável.
Até o momento não foi encontrada atividade biológica para as substâncias
isoladas, mas outros ensaios encontram-se em andamento, a fim de verificarmos a sua
função para o endófito e tentar compreender a relação endófito-planta hospedeira.
A fração Ssp-Si-Fr4 apresentou excelente atividade antitumoral e encontra-se em
fase de fracionamento cromatográfico objetivando o isolamento e a determinação
estrutural das substâncias responsáveis pela citotoxicidade observada.
Através de ESI-MS foi possível a identificação de outras 5 substâncias presentes
em menor quantidade no extrato bruto, além da presença de outras 3 substâncias
pertencentes a classe da substância 1.
As informações contidas nesse trabalho demonstraram a importância do estudo
de micro-organismos endofíticos, pois conduziram a significativos resultados,
proporcionando o conhecimento da composição química do fungo endofítico
Saccharicola sp. associados à espécie vegetal Eugenia jambolana.
Os resultados encontrados até o momento confirmam os fungos endofíticos como
fontes prolífica de metabólitos novos e bioativos e estruturalmente diversos.
101
Referências
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derivatives from Culvularia fallax. Phytochem. Rev., v. 29, n. 8, p. 264-2644, 1990.
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