Instituto de Biociências - Seção Técnica de Pós-Graduação Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-970 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu PG-BGA Efeitos da ingestão de simbiótico e indol-3-carbinol sobre o processo de carcinogênese química de cólon em ratos Wistar alimentados com dieta contendo heme. Nelci Antunes de Moura Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Dr. Luís Fernando Barbisan BOTUCATU – SP 2015 Instituto de Biociências - Seção Técnica de Pós-Graduação Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-970 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Efeitos da ingestão de simbiótico e indol-3-carbinol sobre o processo de carcinogênese química de cólon em ratos Wistar alimentados com dieta contendo heme. Nelci Antunes de Moura Prof. Dr. Luís Fernando Barbisan ORIENTADOR Prof. Dr. Robson Francisco Carvalho COORIENTADOR Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre (ou Doutor) no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Dr. Luís Fernando Barbisan BOTUCATU – SP 2015 Instituto de Biociências - Seção Técnica de Pós-Graduação Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-970 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM.DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 Moura, Nelci Antunes de. Efeitos da ingestão de simbiótico e indol-3-carbinol sobre o processo de carcinogênese química de cólon em ratos Wistar alimentados com dieta contendo heme / Nelci Antunes de Moura. - Botucatu, 2015 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Luís Fernando Barbisan Coorientador: Robson Francisco de Carvalho Capes: 20603002 1. Cólon (Anatomia) - Câncer. 2. Carcinogênese. 3. Câncer - Quimioprevenção. 4. Heme. Palavras-chave: Carcinogênese de cólon; Heme; Indol 3-carbinol; Quimioprevenção; Simbiótico. Resumo O ferro heme presente na carne vermelha está associado ao aumento da incidência do câncer colorretal (CCR). O heme pode catalisar a formação de compostos nitrosos e a peroxidação lipídica no lúmen intestinal. No entanto, os efeitos pró-carcinogênicos do heme podem ser inibidos por alguns compostos como os sais de cálcio, clorofila entre outros. Sabe-se que o indol-3-carbinol (I3C), presente nas plantas da família das Brassicas e os simbióticos são compostos promissores na prevenção do câncer de cólon, atuando em via de proliferação, apoptose e modulação da microbiota intestinal. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi o de avaliar os efeitos da ingestão de simbiótico (prebiótico inulina associado ao probiótico Bifidobacterium lactis bb-12) e de I3C, isolados ou em associação sobre o processo de carcinogênese de cólon induzido pela 1,2-dimetilhidrazina (DMH) em ratos Wistar alimentados ou não com dieta suplementada com heme. Os animais foram alocados em 9 grupos, os grupos 1 a 8 (n=12) receberam quatro doses de DMH (40 mg/Kg) nas duas semanas iniciais do experimento. Os grupos 1 e 9 (n=12 e 5) receberam ração basal até o final do experimento e os grupos 2 a 8 receberam ração basal suplementada com heme, heme+I3C, heme+simbiótico, heme+I3C+simbiótico, I3C, simbiótico e I3C+simbiótico, respectivamente. A eutanásia ocorreu ao final da 25ª semana. Neste momento foi realizada a coleta do cólon com os respectivos tumores e amostras de fezes do ceco. Em seguida, procedeu-se a medida dos tumores e coleta de amostras para biologia molecular. Após a fixação em formalina tamponada e a retirada dos tumores, realizou-se a contagem de focos de criptas aberrantes (FCA) pela coloração de azul de metileno. Realizou-se a análise histológica dos tumores e a análise da expressão de 95 genes relacionados a via da carcinogênese colônica, pela técnica Taqman Low Density Array, e a expressão proteica da E-caderina, TGFB1 (Transforming growth factor beta 1) e RAF1 (Serine/threonine-protein kinase) por Western Blotting. Foram analisados os índices de proliferação celular e apoptose pelo PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) e caspase 3-clivada, respectivamente, tanto nos cólons como em tumores, e a expressão de β-catenina e E-caderina nos tumores, por imunoistoquímica. Células da linhagem Caco-2 foram incubadas com água fecal extraída das fezes do ceco e submetidas a testes de citotoxicidade e genotoxidade pelos testes do MTT (mitochondrial tetrazolium test) e Cometa, respectivamente. Os dados foram comparados utilizando-se o software Sigma Stat 3.5 e Expression Suíte para expressão gênica. Foi observado aumento significativo no número de criptas aberrantes (CA) no grupo que recebeu heme (G2) quando comparado ao grupo que recebeu apenas ração basal (G1). Redução significativa no número de CA foi observada no grupo que recebeu heme+I3C (G3) e heme+simbiótico (G4) quando comparado ao grupo que recebeu heme (G2). O número de FCA totais com ≥ 9 criptas aberrantes foi significativamente menor no grupo que recebeu heme+simbiótico (G4) quando comparado ao grupo que recebeu heme (G2). Entretanto, aumento significativo no número de tumores com mais de 60 mm 3 foi observado no grupo suplementado com heme+I3C+simbiótico (G5), quando comparado ao grupo que recebeu heme (G2). Além disso, foi observado aumento significativo na incidência de tumores invasivos no grupo que recebeu heme+I3C+simbiótico (G5) quando comparado ao grupo que recebeu heme (G2). Os tumores do grupo suplementado com heme+I3C+simbiótico (G5) apresentaram baixa expressão dos genes Cdh1, Tgfb1, Appl1 e alta expressão do Raf1, já os tumores do grupo suplementado com heme +I3C (G3) apresentaram baixa expressão do Cdh1. A água fecal do grupo que recebeu heme (G2) apresentou significativamente maior citotoxicidade e genotoxicidade quando comparado ao grupo que recebeu ração basal (G1). Com relação aos tratamentos, a água fecal do grupo que recebeu heme+I3C (G3) e heme e simbiótico (G4) apresentaram água fecal significativamente com menor potencial genotóxico quando comparada ao grupo que recebeu heme (G2). No entanto, o grupo que recebeu heme+I3C+simbiótico (G5) apresentou aumento significativo na genotoxicidade da água fecal. Dessa forma, concluímos que o heme associado a uma dieta com níveis normais de cálcio não é um potente indutor de FCA, mas aumenta a citotoxicidade e genotoxicidade da água fecal. No entanto, tanto o I3C como o simbiótico reduzem os efeitos citotóxicos/genotóxicos da ingestão de heme. Contudo, a associação do heme+I3C+simbiótico apresentou efeito promotor da carcinogênese de cólon. Palavras-chave: carcinogênese de cólon; heme; indol 3-carbinol; quimioprevenção; simbiótico. Abstract Colorectal cancer (CRC) is the third most common type of cancer worldwide. Hemin iron, which is found in red meat, catalyzes the formation of carcinogenic N-nitroso compounds and lipid peroxidation end-products in the colon lumen. The procarcinogenic effect of hemin is known to be inhibited by molecules, such as calcium, chlorophyll and others. However, the preventive effect of indole 3-carbinol and synbiotics on colon carcinogenesis remains uninvestigated. The aim of this study was to assess the modifying effects of a synbiotic (inulin+ Bifidobacterium lactis) and/or I3C against dimethylhidrazine (DMH)-induced colon carcinogenesis in hemin-fed male Wistar rats. Nine groups of animals were evaluated. Groups 1–8 received a total of four s.c. DMH injections (40 mg/kg b.w.) over 2 weeks, whereas group 9 was given EDTA solution (vehicle). Two weeks after DMH-initiation, G1 and G9 were fed a basal diet while groups G2, G3, G4, G5, G6, G7 and G8 received a basal diet containing hemin, hemin+I3C, hemin+synbiotic, hemin+I3C+synbiotic, I3C, synbiotic and I3C+synbiotic, respectively, during 23 weeks. At 25 week, all animals were killed and their colons were removed. Cecal contents were collected to determine fecal water cytotoxicity and genotoxicity (DNA damage) in Caco-2 cells. Colon tumors were measured and samples were collected and stored at -80 0 C. The colons were fixed flat in 10% buffered formalin for 24 h and stained with 1.0% methylene blue for classical ACF analysis and quantification. Tumor incidence and multiplicity were assessed after histopathological analysis. Gene and protein expression were determined in tumor samples alone. The total number of aberrant crypts (AC) was significantly higher (p= 0.03) in the hemin group (G2) than in the group fed basal diet (G1). AC number in both hemin+I3C (G3) and hemin+synbiotic (G4) groups was also significantly lower than in the group fed hemin (G2). Tumor volume was higher in the hemin+I3C+ synbiotic (G5) group and invasive adenocarcinoma was more frequent in the hemin+I3C+synbiotic group (G5) than in the group fed hemin (G2). Colon tumor expression analysis showed that in comparison with the group fed hemin (G2), Cdh1, Tgfb1 and Appl1 were downregulated while Raf1 was upregulated in the group hemin+I3C+synbiotic (G5), and Cdh1 was down-regulated in the group hemin+I3C (G3). Fecal water cytotoxicity in the hemin group (G2) was higher than in groups fed basal diet (G1) and hemin+I3C (G3). Fecal water genotoxicity was also significantly higher in the group fed hemin alone (G2) than in the basal diet group (G1), as well as, in groups fed hemin+I3C (G3) and hemin+synbiotics (G4). However, when compared to hemin alone (G2), fecal water from group hemin+I3C+ synbiotics (G5) presented the highest DNA damage levels. Our results suggest that although hemin in a regular-calcium diet was not a powerful ACF promoter, it increased fecal water citotoxicity and genotoxicity. On the other hand, hemin associated with either I3C or synbiotics prevented ACF promotion. Nonetheless, a synergistic interaction among hemin, I3C and synbiotic did promote DMH-induced tumorigenesis. Keywords: colon carcinogenesis, hemin, indole 3-carbinol, chemoprevention, synbiotics. Dedicatória Dedico este trabalho a toda minha família que sempre foi o alicerce da minha vida. “Sem Deus não há vida, sem família não há base e sem amigos não há mundo colorido.” (Verena) http://pensador.uol.com.br/autor/verena/ Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida , por me proporcionar saúde e caminhar comigo a todo instante! Aos meus pais Oracy e Ruth pelo amor incondicional e apoio em tudo! Aos meus irmãos: Milton e Silas, às minhas irmãs: Maria, Silmara e Mariza pelo companheirismo, amor e amizade. A todos meus demais familiares e amigos de Itaberá. Ao meu namorado Marcos (Spike) pelo companheirismo, amor e disposição em me ajudar sempre! Ao meu orientador professor Dr. Luís Fernando Barbisan, exemplo de humildade e dedicação em tudo que faz, agradeço pelos ensinamentos, paciência e confiança. Ao meu coorientador prof. Dr. Robson Francisco Carvalho pela orientação na etapa das análises de expressão gênica, uma área até então desconhecida para mim. Ao aluno de IC, Brunno Felipe Ramos Caetano, que foi muito mais que um aluno de iniciação científica, mas um amigo e colaborador de verdade executando seu trabalho com dedicação e responsabilidade. Ao colega Leonardo do Laboratório do Músculo Estriado pela ajuda nas reações de RT-qPCR e análise dos dados. Ao bioterista do Departamento de Patologia da FMB Paulo Cesar Georgete (PC) pela amizade e cuidados com os animais. A todos os colegas do Laboratório de Carcinogênese Química Experimental, Tony, Flávia, Joyce , Mariana Fragoso, Mariana Tablas, Renata, Guilherme, Brunno e Muriele. Aos colegas e funcionários do Departamento de Morfologia pela convivência harmoniosa e agradável. Às colegas Flávia e Joyce agora colegas de casa pela amizade sincera, conversas e muitas risadas. À Fundação de Amparo á Pesquisa (FAPESP) pela concessão do auxlio e bolsa de doutorado. Agradeço a todos que direta ou indiretamente contribuíram para realização desse trabalho. Obrigada! Sumário Resumo............................................................................................................................................ 2 Abstract........................................................................................................................................... 4 Lista de Figuras............................................................................................................................... 11 Lista de Tabelas............................................................................................................................... 12 Lista de Anexos............................................................................................................................... 13 Lista de Abreviaturas...................................................................................................................... 14 Introdução....................................................................................................................................... 15 Capítulo 1........................................................................................................................................ 16 Revisão de Literatura...................................................................................................................... 17 1. Câncer colorretal: epidemiologia e fatores de risco............................................................ 17 2. Carcinogênese: aspectos gerais........................................................................................... 19 2.1.Carcinogênese experimental de cólon............................................................................... 22 3. Heme e carcinogênese de cólon.......................................................................................... 24 4. Quimioprevenção do câncer: aspectos gerais..................................................................... 28 5. Indol 3-carbinol, simbióticos: aspectos gerais e potencial quimiopreventivo.................... 29 6. Justificativa e hipótese do trabalho científico.................................................................... 36 7. Referências.......................................................................................................................... 36 Capítulo 2 ....................................................................................................................................... 47 1. Objetivo............................................................................................................................... 48 2. Material e métodos.............................................................................................................. 48 2.1. Dietas.................................................................................................................................. 48 2.2. Delineamento experimental................................................................................................ 49 2.3. Avaliação do consumo de ração e água.............................................................................. 50 2.4. Eutanásia dos animais e coleta de amostras....................................................................... 50 2.5. Análise macroscópica de tumores...................................................................................... 51 2.6. Análise de focos de criptas aberrantes (FCA) no cólon..................................................... 51 2.7. Processamento histológico dos tumores e do cólon........................................................... 52 2.8. Análise histopatológica do cólon e tumores...................................................................... 53 2.9. Reações de imunoistoquímica para PCNA , caspase-3 clivada e β-catenina e E- caderina....................................................................................................................................... 54 2.10. Avaliação da expressão gênica por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real após Transcrição Reversa (RT-qPCR).......................................................................................... 54 2.10.1. Extração e quantificação de RNA total das amostras tumorais...................................... 54 2.10.2. Análise da qualidade de RNA das amostras tumorais.................................................... 55 2.10.3. Reação de Transcrição Reversa...................................................................................... 55 2.10.4. PCR quantitativo em Tempo Real.................................................................................. 55 2.11. Western Blotting................................................................................................................ 56 2.12. Preparo da água fecal......................................................................................................... 57 2.13. Cultura Celular e exposição á água fecal........................................................................... 57 2.14. Análise de Genotoxicidade da água fecal pelo Teste do Cometa ..................................... 57 2.15. Análise de Citotoxicidade da água fecal pelo teste do MTT............................................. 58 2.16. Análise estatística.............................................................................................................. 58 3. Resultados............................................................................................................................ 59 3.1. Observações gerais.............................................................................................................. 59 3.2. Peso corpóreo e consumo de ração..................................................................................... 59 3.3. Focos de criptas aberrantes (FCA)...................................................................................... 60 3.4. Histopatologia do cólon....................................................................................................... 63 3.5. Análise macroscópica e microscópica dos tumores............................................................. 64 3.6. Proliferação celular, apoptose e acúmulo de β-catenina...................................................... 67 3.7. Expressão gênica e proteica................................................................................................. 70 3.8. Citotoxicidade da água fecal................................................................................................ 72 3.9. Genotoxicidade da água fecal.............................................................................................. 72 4. Discussão............................................................................................................................... 73 5. Referências............................................................................................................................ 78 6. Anexos.................................................................................................................................... 82 Lista de Figuras Capítulo 1 Figura 1 – Números estimados (milhares) de incidência e mortalidade em homens em regiões mais desenvolvidas e menos desenvolvidas no mundo em 2012.................................................. 17 Figura 2 – Transição adenoma-adenocarcinoma........................................................................... 22 Figura 3 – Estrutura molecular do ferro heme.............................................................................. 25 Figura 4 – Absorção intestinal do ferro heme............................................................................... 27 Figura 5 – Principais mecanismos de ação do heme sobre a carcinogênese colorretal................ 27 Figura 6 – Transformação metabólica do indol 3-carbinol........................................................... 30 Figura 7 – Possíveis vias pelos quais I3C / DIM exerce efeitos anticarcinogênicos .................... 31 Figura 8 – Digestão de prebióticos através do trato gastrointestinal............................................ 33 Capítulo 2 Figura 1 – Delineamento experimental......................................................................................... 50 Figura 2 – Cólon preso à prancha de isopor mostrando vários tumores macroscópicos.............. 51 Figura 3 – Focos de criptas aberrantes (FCA) identificados pela coloração de azul de metileno 63 Figura 4 – Cortes histológicos corados em HE mostrando focos de criptas aberrantes.............. 63 Figura 5 – Dados de volume dos tumores................................................................................... 65 Figura 6 – Cortes histológicos corados em HE de tumores de cólon............................................ 67 Figura 7 – Marcação imunoistoquímica em criptas de aparência normal e tumores.................... 68 Figura 8 – Marcação imunoistoquímica em criptas de aparência normal e tumores.................... 69 Figura 9 – Marcação imunoistoquímica para β-catenina e e-caderina em tumores...................... 70 Figura 10 – Expressão gênica relativa nos diferentes grupos experimentais............................... 71 Figura 11 – Análise de citotoxicidade pelo teste do MTT........................................................... 72 Figura 12 – Micrografias dos cometas representativos, corados com SyberGold®..................... 73 Figura 13 –Análise de genotoxicidade pelo teste do cometa, para o parâmetro momento da cauda.............................................................................................................................................. 73 Lista de Tabelas Capítulo 2 Tabela 1– Composição das dietas.................................................................................................. 48 Tabela 2 – Peso corpóreo dos animais dos diferentes grupos experimentais ao longo do experimento................................................................................................................................... 59 Tabela 3 – Consumo de água, ração dos animais dos diferentes grupos ao longo do período experimental.................................................................................................................................. 60 Tabela 4 – Efeitos das dietas contendo heme, I3C e simbióticos e suas associações sobre o desenvolvimento de focos de criptas aberrantes............................................................................ 62 Tabela 5 – Efeitos das dietas contendo heme, I3C e simbióticos e suas associações sobre o desenvolvimento de FCA displásicos induzidos pela DMH no cólon de ratos Wistar................. 64 Tabela 6 – Efeitos da dieta contendo heme, I3C e simbióticos sobre o desenvolvimento de tumores colônicos induzidos pela DMH no cólon de ratos Wistar............................................... 66 Lista de anexos Anexo 1 – Certificado de aprovação pela Comissão de Ética em Experimentação Animal.......... 82 Anexo 2 – Análise das amostras de RNA dos diferentes grupos.................................................... 83 Anexo 3 – Lista de genes selecionados no cartão Taqman Low Density Array (TLDA).............. 84 Anexo 4 – Genes diferencialmente expressos entre os diferentes grupos experimentais............... 87 Lista de abreviaturas CCR – Câncer colorretal FAP – Polipose Adenomatosa Familiar, do inglês Familial adenomatous polyposis HNPCC – Câncer Coloretal Hereditário Não-Poliposo, do inglês Hereditary Non poliposis Colorectal Câncer ROS - Espécies reativas de oxigênio, do inglês Reactive Oxigen Species DMH – 1,2 dimetilhidrazina AOM – Azoximetano FCA – Focos de criptas aberrantes CA – Criptas aberrantes BCAC – cripta com acúmulo de beta-catenina, do inglês beta-catenin-accumulated crypts MDF – Foco com depleção de mucina, do inglês Mucin-depleted foci NOCs - compostos N-nitrosos, do inglês N-nitroso compounds MDA – malondialdeído 4- HNE – 4-Hidroxinonenal I3C – Indol 3-carbinol DIM – Diindolimetano FOS – Frutooligossacarídeo AGCC – Ácidos graxos de cadeia curta HDACs – Histona desacetilase EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético, do inglês Ethylenediamine tetra acetic acid PCNA – Antígeno nuclear de proliferação celular, do inglês Proliferating cell nuclear antigen RIN – Número de integridade do RNA do inglês RNA integrity number TLDA – do inglês Taqman Low Density Array MTT – do inglês mitochondrial tetrazolium test. 15 Introdução O câncer colorretal (CCR) é o terceiro tipo de câncer mais incidente em homens e o segundo em mulheres segundo as últimas estimativas mundiais. A distribuição geográfica desse tipo de câncer tem sofrido alterações nas últimas décadas, sua incidência que era maior em países desenvolvidos, sofreu um aumento também em países em desenvolvimento, o que pode ser expilicado principalmente pelo aumento na expectativa de vida e exposição à diferentes fatores de riscos. Entre os principais fatores de risco para o desenvolvimento do CCR, pode-se destacar: o sedentarismo, o tabagismo, o alcoolismo e um dos fatores mais notáveis: os hábitos alimentares inadequados. Padrão alimentar baseado em alto consumo de gorduras, carnes vermelhas, carnes processadas, carboidratos refinados e baixa ingestão de fibras, vegetais, frutas e verduras estão assocciados à maior incidência de CCR. Recentemente a International Agency for Research on Cancer (IARC) baseado em evidências, classificou a carne vermelha processada e a carne vermelha como cancerígena e com provável potencial cancerígeno, respectivamente (Press release nº 240, IARC, disponível em http://www.iarc.fr/en/media-centre/pr/2015/pdfs/pr240_E.pdf). Um dos principais mecanismos considerado responsável pelo efeito carcinogênico da carne vermelha é a presença de grande quantidade de ferro heme que pode catalisar a formação de compostos nitrosos e a peroxidação lipídica que resulta em produtos pro-carcinogênicos. No entanto, alguns estudos experimentais já demonstraram que os efeitos pró-carcinogênicos do heme podem ser inibidos por alguns compostos como o cálcio, a clorofila, vitaminas C e E e polifenóis como a quercetina, α-tocoferol, ou polifenóis presentes no vinho tinto. O cálcio pode precipitar moléculas de heme e os demais compostos podem inibir a peroxidação lipídica ou a formação de compostos nitrosos e assim inibir o efeito citotóxico. Contudo a maioria dos estudos avaliaram os efeitos do heme após exposição a curto prazo e associado à dietas com potencial de risco para o câncer de cólon, e.g.dieta com altos nívies de gordura ou com baixo teor de cálcio. Faltam estudos que avaliam os efeitos do heme por um longo período de exposição associado a dietas com níveis normais de gordura e cálcio. Sabendo que o indol-3-carbinol (I3C), presente nas plantas da família das Brassicas e principalmente os simbióticos são compostos promissores na prevenção do câncer de cólon , atuando em via de proliferação, apoptose e modulação da microbiota intestinal, visto que algumas bactérias tem a capacidade de favorecer a manutenção da barreira de muco protetora na mucosa colônica, o presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito da ingestão do ferro heme, de forma isolada ou associado a esses agentes quimiopreventivos adicionados à dieta com níveis normais de cálcio, sobre a etapa de promoção carcinogênese de cólon induzida pela 1,2 dimetilhidrazina (DMH). 16 Capítulo 1 17 Revisão de Literatura 1. Câncer colorretal: epidemiologia e fatores de riscos Estudos populacionais apontam para crescimento nas taxas de morbidade e mortalidade por neoplasias no mundo. De acordo com dados do GLOBOCAN 2012 estimou-se 14,1 milhões de novos casos e 8,2 milhões de mortes por câncer comparado com 12,7 milhões de novos casos e 7,6 milhões de mortes em 2008 no mundo (Ferlay, et al., 2015). O câncer colorretal (CCR) é o terceiro mais incidente em homens e o segundo em mulheres com 1,2 milhões de novos casos e 608.700 mortes no mundo (Siegel et al., 2015, Ferlay, et al., 2015). No Brasil, segundo dados do INCA (Instituto Nacional do Câncer), as estatísticas para o CCR se comportam da mesma forma do restante do mundo, para 2014 estimou-se 15.070 casos novos em homens e 17.530 em mulheres. Segundo as últimas estimativas mundiais, tem se observado uma mudança nos padrões geográficos quanto à incidência de CCR. Em países asiáticos onde se tinha um baixo risco tem se observado uma tendência de aumento dessa neoplasia, enquanto em países considerados de alto risco houve uma estabilização ou até mesmo queda na incidência (Figura 1). Essas disparidades são afetadas pelas práticas de detecção precoce da doença, mais disponibilidades de tratamentos e exposição a fatores de risco (Fedewa et al., 2015, Lansdorp-Vogelaar et al., 2015). Figura 1 – (a) Números estimados (milhares) de incidência e mortalidade em homens em regiões mais desenvolvidas e menos desenvolvidas no mundo em 2012. (b) Números estimados (milhares) de incidência e mortalidade mulheres em regiões mais desenvolvidas e menos desenvolvidas no mundo em 2012. Fonte: Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Fonte: Ferlay et al., Int. J. Cancer: 136, E359–E386, 2015. Este tipo de câncer apresenta bom prognóstico quando diagnosticado em estágios iniciais, porém 40% dos casos são diagnosticados quando o câncer está instalado, sendo assim a sobrevida média estimada de 5 anos fica em torno de 55% em países desenvolvidos e 40% em países em 18 desenvolvimento (INCA, 2014). Através da detecção precoce pode-se prevenir a doença pela identificação e remoção de pólipos pré-cancerosos ou pela detecção de lesões malignas em estágios iniciais (Del Vecchio et al., 2015). O CCR é tradicionalmente dividido em casos hereditários (20%), onde há uma susceptibilidade genética, e esporádicos (80%), resultante de mutações somáticas (de la Chapelle, 2004). Os casos resultantes de predisposição genética compreendem as poliposes e não poliposes além de doenças colônicas inflamatórias hereditárias. As poliposes compreendem a Polipose Adenomatosa Familiar (FAP) e a Polipose Hemartomatosa, que são caracterizadas pelo aparecimento de centenas de pólipos, os quais se não tratados, poderão evoluir para adenocarcinoma (de la Chapelle, 2004; Zhu & Li; 2008; Valle, 2014). O tipo não poliposo é representado pelo CCR hereditário não associado à polipose (HNPCC) ou Síndrome de Lynch caracterizada por alterações nos genes de reparo do DNA (Bonis et al., 2007). Entre as doenças inflamatórias intestinais podemos citar a doença de Crohn e a colite ulcerativa, ambas envolvidas na etiologia do CCR (Pereira et al., 2015). Entres os principais fatores de risco para o desenvolvimento do CCR, responsáveis em grande parte pelas diferenças geográficas de ocorrência dessa neoplasia, pode-se destacar: o sedentarismo, o tabagismo, o alcoolismo e um dos fatores mais notáveis: os hábitos alimentares inadequados (Khan et al., 2010). Estudos demonstram que a prática regular de atividade física pode prevenir o desenvolvimento do câncer por diversos mecanismos. O exercício pode alterar a iniciação do tumor por aumentar a atividade de enzimas seletivas para a detoxificação de carcinógenos além de reduzir danos oxidativos por aumentar a atividade de enzimas antioxidantes (Khan et al., 2010). Além de alterar a etapa de iniciação, são descritos também mecanismos de ação sobre a promoção e progressão, com relatos de alteração de proliferação celular, apoptose, diferenciação, diminuição da inflamação e aumento da função imunológica (Demarzo et al., 2008; Rogers et al., 2008). No contexto da obesidade, o balanço positivo de energia gera estresse metabólico levando ao aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) e hiperinsulinemia, sendo que a concentração elevada de IGF-1 circulante em mulheres obesas pode ser um preditor de proliferação celular (Sung et al., 2011). A prática do tabagismo pode estar relacionada com o aparecimento precoce do CCR em fumantes (Buc et al., 2006). Em uma pesquisa de meta-análise com 36 estudos científicos foi examinada a associação entre tabagismo e CCR em termos de incidência e mortalidade, onde observou-se que os fumantes apresentavam risco significativamente maior para o desenvolvimento de CCR que os não fumantes (Liang et al., 2009). 19 Outro fator de risco para o desenvolvimento do CCR é o alcoolismo, sendo os principais mecanismos o efeito genotóxico do acetaldeído, principal metabólito do etanol, produção de ROS e mudanças no metabolismo do folato (Boffetta & Hashibe, 2006). Contudo, o fator de risco mais notável para o desenvolvimento do CCR é o padrão alimentar baseado no alto consumo de gorduras, carnes vermelhas, carnes processadas, carboidratos refinados e baixa ingestão de fibras, vegetais, frutas e verduras. O alto consumo de gorduras leva a uma maior liberação de ácidos biliares os quais podem ser convertidos em agentes carcinogênicos, enquanto que o consumo de fibras solúveis e insolúveis podem agir como protetoras, acelerando o trânsito intestinal , reduzindo o tempo de contato da mucosa com possíveis agentes mutagênicos (Khan et al., 2010; Murphy et al., 2012; Zeng et al., 2014). Além disso, alguns alimentos possuem compostos com capacidade de modular a microbiota intestinal de forma que há redução de bactérias produtoras de substâncias carcinogênicas e aumento de espécies não patogênicas produtoras de ácidos graxos de cadeia curta como o ácido butírico, um importante composto com propriedades apoptóticas, que pode atuar na diferenciação e parada do ciclo celular e até mesmo na regulação epigenética (Pool-Zobel et al., 2005; Rajendran et al., 2011). Todos esses fatores de riscos são modificáveis, portanto, mudanças no estilo de vida podem estar relacionados à menor incidência de CCR na população. 2. Carcinogênese: aspectos gerais O desenvolvimento de uma neoplasia é um processo longo e em múltiplas etapas, nas quais modificações genéticas (mutações pontuais, amplificações e deleções gênicas) e epigenéticas (metilação do DNA e metilação e acetilação de histonas) são progressivamente acumuladas no genoma das células (Irigaray & Belpomme, 2010). O acúmulo de mutações em genes que regulam o crescimento, proliferação e diferenciação celulares, gerando instabilidade genômica, têm sido detectados no genoma de células neoplásicas (Schulte-Hermann et al., 1999). Os genes alterados em neoplasias e diretamente envolvidos na transformação maligna são conhecidos como oncogenes e supressores tumorais (Rundle, 2006; Ushijima et al., 2006). O resultado da expressão diferenciada desses genes é o crescimento descontrolado e anárquico de células neoplásicas que demonstram uma desorganização estrutural tecidual (displasia), alteração na comunicação célula-célula e célula- matriz extracelular e desbalanço entre proliferação celular e apoptose (Majno & Joris, 1996). As células neoplásicas também apresentam outras características malignas que lhes conferem uma maior capacidade adaptativa comparada às células normais. As principais são auto-suficiência a sinais de crescimento, insensibilidade a sinais anti-proliferativos, baixa diferenciação celular (anaplasia), capacidade de evasão da apoptose e da vigilância imunológica, potencial replicativo 20 ilimitado pela reposição de telômeros, angiogênese sustentada e capacidade invadir e colonizar tecidos distantes do hospedeiro (Kroemer & Pouyssegur, 2008; Majno & Joris, 1996). A carcinogênese química é um complexo processo de alterações genéticas que pode ser dividido em três ou quatro etapas: iniciação, promoção, progressão e metástase (Dragan & Pitot, 1991). A iniciação é caracterizada pela exposição de células normais a uma dose mínima de um ou mais agentes cancerígenos, resultando em alterações na sequência de bases nitrogenadas do DNA dessas células. Essa interação resulta em alterações profundas nas moléculas-alvo que podem levar a célula à morte celular pela destruição drástica de proteínas e lipídeos, fabricação de proteínas anômalas ou a aquisição de mutações no material genético celular. Dessa forma as células-alvo normais se tornam células iniciadas (ou neoplásicas) apenas quando sobreviverem ao estímulo mutagênico em seu DNA e tais mutações não são reparadas (Schulte-Hermann et al., 1999). Estas mutações, não reparadas, acabam sendo fixadas no DNA após a fase “S” do ciclo celular, no qual ocorre duplicação de todo o material genético da célula. A partir desse momento, a célula encara a mutação como material genético intrínseco e transcreve a nova sequência como se fosse o DNA original da célula. Com o passar do tempo e ainda na presença do insulto mutagênico ou genotóxico, a célula acumula progressivamente numerosas mutações no seu genoma (Vincent & Gatenby, 2008). Na segunda etapa do desenvolvimento neoplásico, a promoção, as células iniciadas sofrem um processo de expansão clonal, originando as lesões pré-neoplásicas. Nessa fase, a presença de agentes promotores é essencial para o desenvolvimento de lesões proliferativas, anaplásicas e displásicas. Os agentes promotores apresentam mecanismos de ação não genotóxicos (ou epigenéticos) como a ativação de proteínas-quinases envolvidas na fosforilação de substratos das vias de transdução de sinais de resposta a fatores de crescimento (Herman, 2005). A resposta aos agentes promotores é diferente nas células iniciadas e normais, resultando na expansão celular clonal seletiva das células iniciadas. A multiplicação seletiva dos clones de células iniciadas resulta no acúmulo progressivo de mais mutações e aumento na instabilidade genética que culminam com o desenvolvimento de células anaplásicas e malignas (Pitot, 1991, Vincent & Gatenby, 2008). A progressão é caracterizada pela presença de numerosas células neoplásicas transformadas com elevado grau de anaplasia, desequilíbrio entre proliferação celular e apoptose . O agente cancerígeno promotor se torna dispensável nessa etapa da carcinogênese, pois as células que atingiram esse estágio de desenvolvimento tumoral são auto-suficientes a estímulos de crescimento e multiplicação celulares e resistentes à mecanismos de indução apoptótica intrínsecos de células normais. Com o acúmulo de novas mutações em genes específicos que controlam a capacidade invasiva das células, processo facilitado nessa etapa devido ao elevado número de mitoses, as http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vincent%20TL%22%5BAuthor%5D http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vincent%20TL%22%5BAuthor%5D 21 células neoplásicas adquirem o fenótipo maligno. O próximo passo das células malignas é a infiltração vascular e linfática e colonização de tecidos distantes do hospedeiro (focos secundários de tumores). Esse é o estágio terminal da carcinogênese, denominado de metástase (Pitot, 1991). Para a carcinogênese colônica, dados clínicos e histopatológicos sugerem que a grande maioria dos carcinomas colorretais se originam de lesões benignas, os adenomas. Existe um modelo genético proposto por Fearon & Vogelstein para a o desenvolvimento do câncer de cólon que ficou conhecido como sequência adenoma-adenocarcinoma (Figura 2). O processo se inicia com uma mutação no gene APC, aproximadamente 80% dos pacientes com câncer de cólon e portadores de FAP apresentam mutação no APC (Fodde et al., 2001, Jasperson & Burt, 2015). A proteína codificada por esse gene está envolvida na regulação da β-catenina, esta por sua vez é a mediadora central da via de sinalização Wnt capaz de controlar a transcrição de genes durante o desenvolvimento normal ou maligno. A via canônica de sinalização Wnt controla processos de proliferação celular, diferenciação e motilidade; na ausência de sinalização Wnt a β-catenina é mantida em baixos níveis, uma vez que é recrutada para a degradação por um complexo ubiquitina- proteossoma pela proteína APC (Jamieson et al., 2012) Na presença da sinalização Wnt a β- catenina é estabilizada em forma hipofosforilada, sendo assim, não é degradada sendo translocada para o núcleo onde estimula fatores de transcrição de genes como da família LEF/ TCF responsáveis por regular ciclo celular, motilidade e diferenciação. A via Wnt/ β-catenina é ativada por perda de função por mutação do APC, na carcinogênese essa via está constantemente ativada (MacDonald et al., 2009, Kim & Jim, 2013). Posteriormente à mutação do APC ocorre a mutação do gene K-RAS, essa mutação bloqueia a ação de enzimas GTPase permitindo uma ativação descontrolada da cascata Ras o que resulta em inibição da apoptose e aumento da proliferação celular. Na sequencia, a mutação do gene pró- apoptótico p53, marca o limite da transição adenoma-adenocarcinoma (Fearon & Vogelstein, 1990; Vogelstein et al., 1998). 22 Figura 2 – Transição adenoma-adenocarcinoma. Sequência de mutações que caracterizam a transição do epitélio colônico normal para adenoma e adenocarcinoma invasivo. Perda da função do gene APC que codifica proteína envolvida na adesão e transcrição, encontrada em 85% dos casos de câncer colororetal (CCR). KRAS uma GTPase que controla proliferação é mutada em 50 a 60% dos casos de CCR, acompanhada da perda da expressão da glicoproteína de adesão E-caderina. Mutação nos genes de reparo MLH1 e MSH2 contribuem para instabilidade genética. SMAD4 envolvida no controle da proliferação e apoptose. Mutação na TP53 levam no aumento à resistência à apoptose.Fonte: Clinical development of gene therapy for colorectal cancer.Fonte: David Kerr. Nature Reviews Cancer 3, 615-622, 2003. Os adenomas são pólipos com crescimento benigno que podem sofrer transformação maligna. São lesões definidas pela formação de neoplasia intraepitelial com células com núcleo hipercromático com vários graus de estratificação e perda de polaridade. Podem ser sésseis ou pedunculados e são classificados basicamente em tubulares, vilosos ou tubulovilosos. Enquanto, a definição de adenocarcinoma é dada aos tumores que tem a capacidade de invadir a camada muscular da mucosa. Os tumores que não tem essa capacidade são denominados adenocarcinomas in situ. Os adenocarcinomas podem ser classificados basicamente em tubulares, mucinosos e carcinoma com células em anel de sinete (Hamilton & Aaltonen, 2000). 2.1. Carcinogênese experimental de cólon Existem alguns carcinógenos químicos bastante utilizados para induzir a carcinogênese de cólon em roedores. Eles podem ser diretos ou indiretos, os diretos não requerem catálise por ação de enzimas para formar espécies reativas. Já os indiretos, requerem ação enzimática para serem convertidos em espécies eletrofílicas que irão reagir com o DNA e formar adutos em bases específicas, o que irá conduzir uma célula normal à uma célula transformada (Tanaka, 2009). 23 A 1,2-dimetilhidrazina (DMH) e seu metabólito o azoximetano (AOM) são os carcinógenos mais usados em estudos de carcinogênese colônica. Ambos são de ação indireta, e sua ativação se inicia por uma série de reações oxidativas que ocorrem no fígado via CYP 2E1 e seus metabólitos são transportados pelo sangue ou pela bile para o intestino grosso, o principal alvo de ação desse agente (Newell & Heddle, 2004, Tanaka, 2009). Os produtos do metabolismo desses compostos induzem a formação de adutos de grupos metil no DNA, mutações pontuais, separação aberrante de cromátides irmãs e induz apoptose no cólon, aumentando a proliferação de colonócitos. A DMH é usada como agente carcinogênico completo, pois induz as etapas de iniciação e promoção e possui alta especificidade para o cólon de várias espécies de roedores (Newell & Heddle, 2004). As lesões iniciais que surgem no cólon dos roedores denominam-se focos de criptas aberrantes (FCA). Estas são consideradas lesões pré-neoplásicas e marcadores do câncer de cólon e utilizada como biomarcador em estudos experimentais de quimioprevenção (Corpet, 2005). Essas lesões são encontradas no cólon de roedores tratados com cancerígenos DMH/AOM e nos seres humanos acometidos pela polipose ou câncer de cólon (Raju, 2008). As criptas aberrantes (CA) foram primeiramente descritas por Bird em 1987 e podem ser identificadas na mucosa do cólon com uma abertura luminal alterada, mais espessas e maiores que as adjacentes, podem ser únicas ou formar focos (Tudek et al., 1989). Estas são observadas, com maior freqüência, no cólon médio e distal tanto em roedores como no homem e são consideradas precursoras da carcinogênese de cólon (Di Gregorio et al., 1997; Bononi et.al., 1999; Rodrigues et al., 2002). Em ratos com predisposição ao CCR observa-se criptas displásicas com acúmulo de β-catenina, chamadas de BCAC, no entanto não é claro se esses focos são um subgrupo de FCA (Tanaka, 2009). Os FCA apresentam índices de proliferação celular maiores que os da mucosa normal (Polyak et al., 1996; Shpitz et al., 1997). Além disso, foi também observado que os FCA apresentam mudanças no padrão de atividade enzimática, como redução das taxas da hexosaminidase (Barrow et al., 1990; Pretlow et al., 1990) e da produção de mucinas, com aumento de sialomucinas e perda de sulfomucinas, fenômeno geralmente associado ao grau de displasia e multiplicidade das criptas. Os FCA displásicos com redução na quantidade de mucinas são denominados MDF (Mucin-Depleted Foci) (Uchida, 1997; Femia, 2004; Yoshimi, 2004). Experimentalmente, essas lesões são quantificadas na mucosa colônica corada com azul de metileno em roedores expostos à carcinógenos, no entanto nem sempre existe uma boa correlação entre o desenvolvimento de FCA e o desenvolvimento de tumores em ratos (Tanaka, 2009). Existem muitas similaridades entre os tumores colônicos em seres humanos e os induzidos pela DMH em roedores, entre elas a cinética da proliferação celular e a síntese de mucina mostram alterações análogas entre o câncer humano e o induzido quimicamente. Com o uso da DMH é 24 possível boa taxa de tumores em um período curto de latência, o que pode ser conseguido com uma dose única ou com uma série de doses semanais equivalentes (Newell & Heddle, 2004; Kamaleeswari et al., 2006). 3. Heme e carcinogênese de cólon Pesquisas recentes de meta-análises têm demonstrado a associação entre o alto consumo de carne vermelha, tanto fresca como processada e o CCR (Sandhu et al., 2001; Norat et al., 2002; Larsson & Wolk, 2006). Alguns mecanismos são explorados com relação ao risco de CCR e o consumo de carne vermelha, entre eles pode-se citar: 1) A produção de aminas heterocíclicas mutagênicas durante o cozimento a altas temperaturas. 2) Alta quantidade de gordura saturada. 3) Produção de compostos nitrosos (CN). 4) Grande quantidade de ferro heme disponível no lúmen (Sinha et a.l, 1994,1998, Santarelli et al., 2008, Alexander et al., 2009, Bastide et al., 2015). No entanto, já se sabe que as carnes brancas são as maiores responsáveis pela produção de aminas heterocíclicas, porém, não há relação entre o consumo de carne branca e a incidência de CCR (Sinha et al., 1994). A relação entre consumo de gordura saturada e CCR, segundo alguns pesquisadores, também não está claramente estabelecida (Clinton et al., 1992, Alexander et al., 2009). Dessa forma, alguns pesquisadores sugerem que o principal fator responsável pela associação da ingestão de carne vermelha com CCR é a presença do ferro heme, abundante na carne vermelha (Santarelli et al., 2008; Bastide et al., 2011, 2015). O heme constitui 95% do ferro funcional no organismo humano bem como dois terços da ingestão média de uma pessoa em países desenvolvidos. O ferro é essencial para a vida dos organismos e serve como cofator para diversos processos biológicos como metabolismo energético, respiração celular, transporte de oxigênio, síntese de DNA e crescimento celular (Papanikolaou & Pantopoulos, 2005). Sendo assim, alguns estudos têm examinado a associação da ingestão de heme, com riscos de doenças comuns como CCR, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, diabetes tipo 2 e doenças cardíacas. Por outro lado, é importante notar que a deficiência de heme pode causar doenças como anemias e doença de Alzheimer (Bastide et al., 2011; Hooda et al., 2014). O ferro heme é formado por um grupo prostético composto de protoporfirina IX e um Fe (II) (Figura 3). O anel tetrapirrólico de porfirina é sintetizado a partir do precursor do ácido 5- aminolevulínico (ALA) por uma série de reações no citoplasma e nas mitocôndrias (Papanikolaou & Pantopoulos, 2005). O heme está inserido nas hemoproteínas, hemoglobina, mioglobina e em citocromos. A elevada concentração de mioglobina é responsável pela coloração vermelha da carne; na carne vermelha processada o ferro heme é nitrosilado devido à presença de nitritos e nitratos (Bastide et al., 2011). 25 Figura 3- Estrutura molecular do ferro heme, presente na carnes frescas e nitrosil heme presente nas carnes processadas. Fonte: Bastide et al., Cancer Prev Res,4(2):177-84. 2011. O heme é liberado devido ao baixo pH e pela ação de enzimas proteolíticas presentes no estômago. Como demonstrado na Figura 4, o heme pode ser absorvido de diferentes maneiras pelo enterócito. A absorção pelos enterócitos pode ser facilitada pelo sistema de transporte vesicular através da proteína carreadora de heme HRG-1 ou ainda ser importado diretamente através da proteína carreadora de heme HCP1. Tanto o heme importado diretamente como o heme no interior das vesículas poderão ser metabolizados pela heme oxigenase (HO-1) presente no retículo endoplasmático, essa enzima é responsável pela liberação do Fe 2+ do anel porfirínico. O Fe 2+ é transportado para o citoplasma pelo transportador de metal divalente (DMT1) o qual junta-se ao conjunto de ferro no citoplasma. O Fe 2+ é liberado na corrente sanguínea pelos enterócitos através da ferroportina presente na membrana basolateral. Uma parte do heme intacto pode ser transportado diretamente para a corrente sanguínea através do transportador de heme FLVCR1 presente na membrana basolateral. O transportador de heme FLVCR1 também é responsável em transportar o heme em excesso para fora da célula a fim de evitar citotoxicidade (Hooda et al., 2014). 26 Figura 4 – Absorção intestinal do ferro heme. O heme é liberado da hemoglobina e mioglobina pela ação de proteases do estômago e intestino. A absorção do heme pelos enterócitos pode ser facilitada pelo sistema de transporte vesicular ou pelo transportador de heme. Além disso ele pode ser diretamente importado paro os enterócitos pelo HCP1. Ele é transportado do citoplasma das vesículas possivelmente pelo HRG-1 e em seguida, é metabolizado por HO-1 presente no retículo endoplasmático. Alternativamente, o heme no interior das vesículas pode ser metabolizado pela ação de HO-2 presente na membrana da vesícula, e o ferro (Fe2 +) é transportado para o citoplasma por transportador de metal DMT1 para juntar o conjunto de ferro no citoplasma. O Ferro é liberado na corrente sanguínea através da ferroportina presente na membrana basolateral. Uma fração do heme intacto pode ser absorvido diretamente para a corrente sanguínea através do transportador FLVCR1. FLVCR1 pode exportar o heme em excesso para dentro do lúmen para evitar toxicidade. HCP1, proteína transportadora de heme 1; HRG-1, heme gene responsivo-1; FLVCR1, receptor da superfície celular para o vírus da leucemia felina, subgrupo C; HO-1/2, heme oxigenase-1/2; DMT1, transportador de metal divalente; FPN1, ferroportina-1; ER, retículo endoplasmático. Fonte: Hooda et al., Nutrients, 13;6(3):1080-102, 2014. Desta forma, o heme não absorvido e o liberado pela descamação do epitélio reage no lúmen. Estudos demonstram que o heme irrita o epitélio resultando em aumento na proliferação celular dos colonócitos (Sesink et al., 1999, 2000; Oates & West, 2006). A Figura 5 ilustra os principais mecanismos que suportam a hipótese de associação do heme livre no lúmen com o risco de CCR que são basicamente: catalisar a formação de compostos nitrosos e a peroxidação lipídica resultando em produtos genotóxicos e citotóxicos no lúmen (Sesink et al., 1999; Santarelli et al, 2008; Bastide et al., 2011). O heme pode catalisar a formação de compostos nitrosos que são produzidos pela reação de nitrito e óxidos de nitrogênio com aminas secundárias e N-alquilamidas, resultando na formação de agentes alquilantes que podem reagir com DNA (Santarelli et al., 2009). A produção de compostos nitrosos pode aumentar significativamente na presença do heme, sendo assim é comum a adição de ácido ascórbico na carne processada como um aditivo antioxidante a fim de diminuir a ação desse composto no lúmen intestinal (Cross et al., 2003; Cross & Sinha, 2004). 27 Outra importante reação catalisada pelo heme no intestino é a peroxidação lipídica. Os resíduos de ácidos graxos poli-insaturados de fosfolipídios são extremamente sensíveis aos processos de oxidação. A peroxidação lipídica é iniciada pelo ataque de um radical livre aos lipídeos da membrana ou provenientes da dieta, essa reação é catalisada pelo heme através da seguinte reação: LOOH (lipídeo hidroperóxido)+Fe heme = LOOHFe= LO + OFe. Os produtos iniciais são lipídeos hidroperóxidos que são rapidamente reduzidos pela glutationa peroxidase e reagem com metais para produzir uma variedade de compostos reativos como epóxidos e aldeídos. Os principais aldeídos produtos da peroxidação lipídica são os malondialdeídos (MDA) e o 4- hidroxinonenal (4-HNE) (Marnett, 2000, Bastide et al., 2011). O MDA induz dano de DNA e é mutagênico em cultura de células humanas, esse aldeído é capaz reagir com o DNA e formar adutos como malondialdeído-deoxiguanosina já encontrado em biópsias de CCR humano (Leuratti et al., 2002, Niedernhofer et al., 2003). Em contraste com o MDA, o 4-HNE é fracamente mutagênico, no entanto, parece ser o principal produto tóxico da água fecal resultante da peroxidação lipídica e que pode induzir apoptose e necrose em células de carcinoma humano pela ativação da caspase-3 (Awasthi et al., 2003). Figura 5- Principais mecanismos de ação do heme sobre a carcinogênese colorretal. O heme catalisa a formação de ATNC e produtos finais da peroxidação lipídica. Os efeitos catalíticos do heme podem ser inibidos pelo cálcio e clorofila, a formação endógena de ATNC é inibida por vitaminas C e E , e os polifenóis podem inibir a peroxidação lipídica. Fonte: Bastide et al., Cancer Prev Res,4(2):177-84. 2011. 28 A associação entre ingestão de heme e CCR tem sido amplamente explorada em diferentes condições e modelos experimentais. Sesink e colaboradores observaram que dieta suplementada com heme por 14 dias foi responsável por aumentar a peroxidação lipídica, citotoxicidade da água fecal e proliferação epitelial por 70% em ratos (Sesink et al., 1999). Pierre et al., 2003 também mostraram que dieta com baixo teor de cálcio e suplementada com heme e hemoglobina foi capaz de aumentar o número de FCA em ratos . De acordo com Ijssennagger et al., 2013 heme na ração associada à dieta ocidental por 14 dias foi capaz de causar hiperproliferação nas células da mucosa colônica de camundongos C57Bl6/J . De Vogel et al., 2005, em estudo com ratos Wistar, alimentados com dieta com baixo teor de cálcio e suplementada com heme na ração por 14 dias, observaram aumento de citotoxicidade e hiperproliferação dos colonócitos . Em conclusão, o heme catalisa a formação de compostos genotóxicos e mutagênicos, o que pode suportar a hipótese de associação do consumo de carne vermelha e CCR. No entanto, os efeitos pró-carcinógenos do heme podem ser inibidos por alguns compostos, os sais de cálcio e a clorofila podem precipitar moléculas de heme e inibir o efeito citotóxico e hiperproliferativo do heme no epitélio colônico de rato (de Voge et al., 2000; Sesink et al., 2001, Pierre et al., 2003, Balder et al., 2006, Pierre et al., 2008). Além disso, a formação endógena de compostos nitrosos é inibida pelas vitaminas C e E e a lipoperoxidação é inibida por polifenóis como a quercetina, α- tocoferol, ou polifenóis presentes no vinho tinto (Ross & Kasum, 2002, Vulcain et al., 2005, Gorelik et al., 2008). 4. Quimioprevenção do câncer: aspectos gerais A quimioprevenção do câncer é definida como a utilização de compostos químicos específicos, naturais ou sintéticos com finalidade de prevenir, retardar ou reverter o processo de desenvolvimento de neoplasias. A atividade quimiopreventiva ou quimioprotetora já foi identificada para vários compostos sintéticos e naturais, como extrato de plantas medicinais e compostos químicos sintéticos (Wattemberg, 1996; Kelloff, 2000, Namasivayam, 2011). O maior desafio da quimioprevenção é justamente identificar e isolar os principais agentes químicos antitumorais presentes nos extratos de plantas medicinais, vegetais, e frutas, bem como, entender os mecanismos de ação envolvidos no processo. As substâncias químicas anticarcinogênicas mais conhecidas apresentam propriedades antioxidantes, antimutagênicas, estimuladoras da resposta imunológica antitumoral, estimuladoras do sistema de detoxificação de drogas, bloqueadoras da divisão celular e/ou antiangiogênicas (Tsuda et al, 2004, Pan & Ho, 2008). 29 Atualmente, mais de 20 classes diferentes de substâncias e compostos químicos já foram identificadas como agentes quimiopreventivos. Estes compostos químicos foram classificados como bloqueadores ou supressores de acordo com o estágio da carcinogênese em que atuam (Wattemberg, 1992, Tsuda et al., 2004). Os compostos quimiopreventivos enquadrados no grupo dos agentes bloqueadores são capazes de inibir a etapa de iniciação da carcinogênese química por impedirem o dano genotóxico causado pela interação dos carcinógenos com seus alvos celulares, principalmente o DNA. Eles ainda podem ser classificados, de acordo com seu mecanismo de ação antineoplásico, em três categorias: 1) agentes bloqueadores que inibem a ativação metabólica do carcinógeno; 2) agentes bloqueadores que aumentam a atividade de enzimas detoxificadoras; 3) agentes bloqueadores que capturam as formas reativas de cancerígenos (Wattenberg, 1993, Pan & Ho, 2008). Além dos agentes bloqueadores que inibem a iniciação da carcinogênese, existem outras classes de substâncias quimiopreventivas que tem a capacidade de modular os estágios subsequentes à etapa de iniciação da carcinogênese. Essas moléculas quimiopreventivas, denominadas agentes supressores tumorais, atuam prevenindo a evolução clonal das células transformadas durante as fases de promoção e progressão da carcinogênese (Manson et al., 2000; Wattenberg, 1993; Greenwald, 2001). Os supressores tumorais são diferenciados dos agentes bloqueadores por serem efetivos quando administrados após a exposição celular ao carcinógeno nos modelos de carcinogênese química experimental. Os agentes supressores tumorais atuam exatamente na etapa de promoção da carcinogênese. Essas moléculas são capazes de reverter ou prevenir os eventos de promoção ou atuar em vias específicas da evolução neoplásica. Os mecanismos de ação dos agentes supressores não são tão bem definidos como os dos agentes bloqueadores. Basicamente, os agentes supressores atuam de duas maneiras principais: 1) induzindo a diferenciação celular nos tecidos, inclusive nas células transformadas; ou 2) neutralizando o acúmulo de eventos genotóxicos nas células transformadas e a sua consequência como a ativação de oncogenes e inativação do gene P53, o “guardião do genoma” (Wattenberg, 1993). 5. Indol- 3-carbinol e simbióticos: aspectos gerais e potencial quimiopreventivo O indol-3-carbinol (I3C) é um composto derivado do glucosinolato encontrado naturalmente em uma série de plantas da família Brassicaceae particularmente do gênero Brassica que abrange uma série de plantas bastante comuns na alimentação humana como couve, repolho, couve-flor, brócolis, couve-de-bruxelas entre outras. O I3C é formado a partir da hidrólise do glucosinolato quando este é esmagado ou cozido (Aggarwal & Ichikawa, 2005). 30 Após a ingestão, em ambiente ácido do estômago, o I3C é convertido em compostos poliméricos que são as formas biologicamente ativas desse composto, sendo a principal delas o 3,3'- diindolimetano (DIM), como demonstrado na Figura 6 (Rogan, 2006). Esses compostos são absorvidos no intestino delgado e distribuídos pelos tecidos sendo possível a detecção no plasma até 8 horas após a administração de 400 mg de I3C em humanos voluntários (Arneson et al., 1999). Figura 6 – Transformação metabólica do indol 3-carbinol. Fonte: Weng et al., Cancer Lett. 18;262(2):153- 63, 2008. O I3C tem um grande número de mecanismos de ação associados com a quimioprevenção do câncer como demonstrado na Figura 7, entre eles, atividades antiproliferativas, pró-apoptóticas, indutoras de enzimas de detoxificação, anti-angiogênicas e antimetastáticas (Aggarwal & Shishodia, 2006). Alguns metabólitos do I3C tem atividade anti-estrogênica, competem pelo receptor de estrógeno. O estrógeno é um hormônio que modula o crescimento e diferenciação dos tecidos em condições normais, em tecidos tumorais esse hormônio estimula a proliferação celular, promovendo crescimento tumoral. Esses metabólitos podem reduzir a ação do estrógeno sobre essas células tumorais agindo como supressores em tecidos estimulados por estrógenos como, por exemplo, o tecido mamário (Riby et al., 2000). Outro mecanismo de ação do I3C é na indução de enzimas de detoxificação de carcinógenos. São enzimas de fase I do citocromo P450, a CYP 1 e a CYP2B e as de fase II, glutationa-S-transferase (GSTs) que são os dois principais grupos de enzimas capazes de realizar a biotransformação de agentes com potencial genotóxico (Pool-Zobel et al., 2005). Estudo com ratas Sprague-Dawley demonstrou que a administração de 250mg/kg de peso corpóreo de I3C por via 31 oral foi capaz de induzir a expressão dos genes CYP1A1, CYP1B1 and CYP2B1/2 no fígado e CYP1A1 na glândula mamária. Por isso, a atividade anticarcinogênica do I3C se dá pelo aumento do metabolismo e inativação de carcinógenos químicos e ainda redução da quantidade de carcinógenos que se ligam ao DNA prevenindo a formação de adutos (Horn et al., 2002). Além disso, já se sabe que o I3C pode agir sobre fatores de transcrição como o ER, Sp1 e NF-κB em diversas vias, agindo tanto de forma direta como indireta. Isso pode resultar na modulação da expressão de genes envolvidos no metabolismo de carcinógenos, reparo de DNA, progressão do ciclo celular e apoptose (Kim & Milner, 2005). Um dos maiores efeitos do I3C é bloquear a progressão do ciclo celular como visto em células de câncer de mama, próstata e queratinócitos, mediante a modulação da ciclina dependente de quinases (CDKs) além de alterar a expressão do fator de transcrição Sp1, ambos os genes críticos na progressão do ciclo celular (Cover et al., 1998, Chinni et al., 2001, Cram et al., 2001, Matsuzaki et al., 2004). Segundo Plate & Gallaher, o I3C pode ser um inibidor da carcinogênese no cólon por reduzir a incidência de FCAs e aumentar a expressão de enzimas de detoxificação de carcinógenos em ratos Wistar alimentados com 1,36 mmols/kg administrados duas semanas antes e 10 semanas após a administração do carcinógeno (Plate & Gallaher, 2006). Xu et al., 1996 também demonstraram redução de FCAs em estudo com ratos F344 após ingestão de 0,1% de I3C na dieta durante 8 semanas . Figura 7- Possíveis vias pelos quais I3C / DIM exerce efeitos anticarcinogênicos . I3C / DIM estão envolvidos em vias de progressão do ciclo celular, apoptose , metabolismo carcinogênico e reparo do DNA, além de agir sobre fatores de transcrição. Fonte: Kim & Milner / Journal of Nutritional Biochemistry 16 , 65–73, 2005. 32 No entanto alguns estudos demonstram efeito promotor do I3C sobre a carcinogênese química. Observou-se aumento de incidência e multiplicidade adenocarcinomas e de lesões hiperplásicas uterinas induzidas quimicamente em ratas alimentadas com dieta contendo 50 ou 200 ppm de I3C. Pence et al., 1986 estudaram a ação sinérgica do I3C com ácido cólico e sebo bovino sobre a carcinogênese de cólon induzida pelo DMH em ratos F344 e concluíram que o I3C é um importante fator para o desenvolvimento tumoral (Pence et al., 1986). Suziu et al., 2005 observaram aumento da multiplicidade e volume de tumores colônicos induzidos pelo AOM em ratos F344 alimentados com 0,01 e 0,05% de I3C na dieta (Suziu et al., 2005). Dessa forma o I3C é um composto que precisa ser mais estudado em diferentes modelos e protocolos experimentais a fim de elucidar seu em diversos órgãos. Outro composto que apresenta efeitos promissores na quimioprevenção da carcinogênese do cólon são os simbióticos, formados pela associação de prebióticos e probióticos. São agentes capazes de levar à alteração de atividades metabólicas da microflora intestinal, produção de ácidos graxos de cadeia curta e elevação da resposta imune entre outros mecanismos (Fotiadis et al., 2008). Segundo Gibson & Roberfroid, prebióticos são substâncias não digeríveis que quando consumidas conferem um efeito fisiológico benéfico ao hospedeiro, estimulando seletivamente o crescimento ou a atividade de um número limitado de bactérias autóctones do intestino grosso (Gibson & Roberfroid, 1995). Os prebióticos são os oligossacarídeos não-digeríveis, no entanto, é comum se classificar como prebióticos carboidratos como alguns tipos de fibras e amidos resistentes. Os prebióticos mais conhecidos são os frutooligossacarídeos (FOS), a oligofrutose e a inulina e são encontrados em alimentos como chicória, yacon, cebola, banana entre outros (Kelly, 2008, Vyas & Ranganathan, 2012). Já os probióticos, são microrganismos vivos que quando ingeridos melhoram a saúde do hospedeiro por promover o balanço da microflora intestinal, sendo os mais utilizados o Bifidobacterium sp e os Lactobacilus sp. Um probiótico deve ser não-patogênico e resistir ao baixo pH no estômago e à ação dos sais biliares (de Vrese & Schrezenmeir, 2008, Hardy et al., 2013). Combinações de prebióticos e probióticos podem resultar em efeito aditivo ou sinérgico sobre a função gastrointestinal, o termo simbiótico foi proposto para a mistura de prebióticos e probióticos que afetam beneficamente o hospedeiro. A associação simbiótica favorece a implantação e sobrevivência dos organismos vivos no trato gastrointestinal, quando comparado com a administração de forma isolada (Fotiadis et al., 2008). Como demonstrado na Figura 8, os prebióticos resistem à digestão enzimática no trato gastrointestinal e chegam até o cólon intactos. No cólon eles passam pela fermentação bacteriana a 33 qual libera como produtos o dióxido de carbono e hidrogênio, lactato e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) como acetato, propionato e butirato (de Vrese & Schrezenmeir, 2008, Fotiadis et al., 2008, De Preter et al., 2011). Os AGCC por sua vez são responsáveis por abaixar o pH do lúmen intestinal além agir mais diretamente a nível celular, como discutido mais adiante. Além disso, ocorre aumento no número de bactérias probióticas, principalmente Bifididobacterium sp e Lactobacilos sp em detrimento às bactérias patogênicas, isso ocorre devido à maior oferta de substratos para fermentação (prebióticos) e ao ambiente acidificado proporcionado pela produção de AGCC (Gibson et al., 2005, De Preter et al., 2011). A capacidade de fermentação seletiva por Bifidobacterium sp e Lactobacilos sp difere os prebióticos das demais fibras alimentares (Tuohy et al., 2007). Figura 8 – Digestão de prebióticos através do trato gastrointestinal (TGI). Os prebióticos chegam instactos no intestino onde sofrem fermentação bacteriana. O produtos dessa fermentação são: dióxido de carbono e hidrogênio, lactato e ácidos graxos de cadeia curta, AGCC (acetato, propionato e butirato). FOS – Frutooligossacarídeos. Fonte: Arquivo pessoal. Como mencionado anteriormente alguns pesquisadores demonstram que a associação de prebióticos com probióticos tem efeitos aditivos ou sinérgicos. A combinação de inulina e B. Longum foi mais efetiva na redução de FCA induzida pelo AOM quando comparada com o tratamento com estes compostos de forma isolada (Rowland et al., 1998, Vyas & Ranganathan, 34 2012). No entanto há uma gama de estudos com esses compostos de forma isolada que demonstram seus efeitos benéficos para a saúde do trato gastrintestinal, assim pode-se dizer que esses estão interligados uma vez que o consumo de prebióticos favorece o crescimento de probióticos. O consumo de prebióticos faz com que haja uma diminuição do tempo de trânsito intestinal, consequentemente há uma redução do tempo de contato de agentes genotóxicos com a mucosa colônica prevenindo possíveis danos ao DNA dos colonócitos (Pool-Zobel et al., 2005, 2007). Esse efeito foi verificado em indivíduos sadios após consumo de 6,4g de FOS por 2 semanas através da ingestão de xarope de yacon, uma raiz com grande quantidade de FOS (Geyer et al., 2008). Além disso, o baixo pH do meio colônico inibe o crescimento de bactérias patogênicas produtoras de amônias e aminas tóxicas, assim pode-se dizer que há uma colonização por bactérias probióticas principalmente do gênero Bifidobacterium (Cuummings et al., 2001). Gibson et al., demonstraram o efeito bifidogênico (capacidade de estimular o crescimento de Bifidobacterium no cólon) em estudo com humanos sadios. O estudo mostrou que 15g por dia de FOS por 15 dias é capaz de modificar a composição da microbiota, o número total de Bifidobacterium excretado em 24 horas aumentou de cinco a oito vezes após o consumo de oligofrutose e inulina, respectivamente (Gibson et al., 1995). As bactérias do gênero Bifidobacterium sp produzem vitaminas do complexo B além de estimularem o ataque à células malignas agindo como imunomoduladoras, já os Lactobacilus sp, são capazes de modular a produção de citocinas inflamatórias. A administração de Lactobacilus casei shirota em roedores induziu a produção de diversas citocinas como IFN-γ, IL-1β and TNF-α, resultando em inibição do crescimento tumoral e aumento da sobrevivência dos animais. Além disso, a administração oral da mesma cepa de probióticos foi capaz de inibir o crescimento de tumores transplantados em roedores (Matsuzaki, 1998). Outro mecanismo potencial de prevenção pelos probióticos é a capacidade de aumentar a atividade de enzimas de detoxificação de carcinógenos como as do citocromo P450 e glutationa S- transferase (GSTs). Em estudo in vivo foi avaliada a capacidade de algumas espécies de Bifidobacterium e Lactobacilus em realizar a inativação de carcinógenos. Observou-se aumento nos níveis de NADPH-citocromo P450 redutase nas células do fígado e do cólon de ratos Sprague- Dawley após o consumo de L. Acidophilus (Pool-Zobel et al., 1996). A produção de AGCC é um mecanismo chave dos efeitos conferidos pela ingestão de prebióticos e probióticos isolados ou em associação simbiótica. Em testes in vitro, observou-se que o butirato é capaz de inibir proliferação celular e promover apoptose e em modelos animais já se observou redução de FCA e de tumores colônicos (Wong et al., 2005, Pool-Zobel et al., 2005). 35 Estudos demonstraram que população com baixa incidência de pólipos ou mesmo CCR (i.e, nativos africanos) tinham altas concentrações de AGCC (Ou et al., 2012, 2013). Em estudo in vitro foi investigada a capacidade antimutagênica dos AGCC sobre a ação de oito mutágenos, onde se observou que o ácido butírico foi capaz de inibir a ação deletéria de todos os mutágenos testados (Lankaputhra & Shah, 1998). O butirato tem a capacidade de estimular a produção de glutationa S- transferase (GSTs), enzima envolvida na detoxificação de compostos que podem causar dano oxidativo no DNA (Challa et al., 1997, Lo et al., 2002). Experimento in vitro demonstrou que o tratamento com butirato resultou em aumento na expressão e atividade das GSTs, o que levou a redução de genotoxicidade induzida pelo 4-hydroxy-2-nonenal em células HT 29, linhagem de células de câncer de cólon humano (Ebert et al., 2001). A indução de GSTs pode ser o mecanismo chave para entender o efeito antimutagênico do butirato o que evidencia o efeito quimiopreventivo dos prebióticos/ probióticos ou simbióticos no CCR. Como demonstrado por Challa et al., a administração de Bifidobacterium longum and lactulose inibiu a formação de FCA induzidas pelo AOM (Challa et al., 1997). O butirato pode ainda agir a nível de controle epigenético como inibidor da histona desacetilase (HDAC). Alterações epigenéticas podem ser críticas para o desenvolvimento do câncer, como as mudanças na atividade das HDACs (Chi & Wang, 2010). As caudas das histonas são carregadas positivamente o que facilita ligação com grupos fosfatos do DNA, carregados negativamente. A acetilação de histonas ocorre normalmente no DNA das células, ela neutraliza as cargas positivas na histona o que diminui a capacidade de ligar-se ao DNA, fazendo com que ocorra normalmente a transcrição gênica. A HDAC remove grupos acetil aumentando as cargas positivas da cauda da histona o que promove uma ligação de alta afinidade com o DNA, esse processo condensa a estrutura do DNA (cromatina) prevenindo a transcrição gênica, se isso ocorre em genes controladores do ciclo celular pode contibuir para a carcinogênese (Rajendran et al., 2011). As HDACs são superexpressas no CCR e o silenciamento delas tem sido associado às vias moleculares de regulação do ciclo celular, proliferação e apoptose (Wilson et al., 2008). Os inibidores de HDAC são clinicamente avaliados como agentes anticâncer (Ma & Diasio, 2009). A grande maioria dos estudos de quimioprevenção do câncer geralmente investiga os efeitos dos compostos isoladamente, no entanto a alimentação humana é variada, pode-se dizer que há uma mistura de compostos agindo conjuntamente. Não se sabe se os efeitos são potencializados, se há um sinergismo, ou se os mesmos são inibidos. Dessa forma são necessários estudos que avaliem a atividade conjunta de agentes quimiopreventivos a fim de investigar se os efeitos se comportam da mesma maneira. 36 6. Justificativas e hipótese do trabalho científico Poucos estudos de carcinogênese química de cólon em roedores trabalham com a interação de compostos biológicos/químicos indutores e/ou inibidores nas etapas de iniciação ou promoção tumoral. As associações de compostos biológicos/químicos podem levar a efeitos nulos, aditivos, sinérgicos ou antagônicos quando comparado com as administrações individualizadas. Assim, o desafio desta proposta de tese de doutorado foi a de avaliar efeitos de interações de compostos clássicos como o heme, I3C e uma associação simbiótica na etapa de promoção da carcinogênese de cólon iniciada pela DMH em ratos Wistar. 7. Referências Aggarwal BB1, Ichikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 4(9):1201-15, 2005. Aggarwal BB1, Shishodia S. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer. Biochem Pharmacol. 14;71(10):1397-421. 2006. Alexander DD, Cushing CA, Lowe KA, Sceurman B, Roberts MA. Meta-analysis of animal fat or animal protein intake and colorectal cancer. Am J Clin Nutr., 89:1402–9, 2009 Arneson DW, Hurwitz A, McMahon LM and Robaugh D: Presence of 3.3’-diindolylmethane in human plasma after oral administration of indole-3-carbinol. Proc Am Assoc Cancer Res., 40: 429, 1999. Awasthi YC, Sharma R, Cheng JZ, Yang Y, Sharma A, Singhal SS, et al. 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