UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS SISTEMAS NANOESTRUTURADOS ESTABILIZADOS COM ÁLCOOL CETÍLICO ETOXILADO E PROPOXILADO CONTENDO FLUCONAZOL POTENCIALMENTE ATIVO CONTRA DERMATOMICOSES HILRIS ROCHA E SILVA ORIENTADOR: Profa. Dra. Maria Palmira Daflon Gremião CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Georgino Honorato de Oliveira ARARAQUARA - SP 2011 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS SISTEMAS NANOESTRUTURADOS ESTABILIZADOS COM ÁLCOOL CETÍLICO ETOXILADO E PROPOXILADO CONTENDO ÓLEO DE COPAÍBA E FLUCONAZOL POTENCIALMENTE ATIVO CONTRA DERMATOMICOSES HILRIS ROCHA E SILVA Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. ORIENTADOR: Profa. Dra. Maria Palmira Daflon Gremião CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Georgino Honorato de Oliveira ARARAQUARA - SP 2011 Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Silva, Hilris Rocha e S586s Sistemas nanoestruturados estabilizados com álcool cetílico etoxilado e propoxilado contendo óleo de copaíba e fluconazol potencialmente ativo contra dermatomicoses / Hilris Rocha e Silva – Araraquara, 2011 188 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas Orientador: Maria Palmira Daflon Gremião Co-orientador: Georgino Honorato de Oliveira . 1. Fluconazol. 2. Óleo de copaíba. 3. Dermatomicoses. 5. Microemulsões. 6. Cristais líquidos. I. Gremião, Maria Palmira Daflon, orient. II. Oliveira, Georgino, Honorato, co-orient.. III. Título. CAPES: 40300005 HILRIS ROCHA E SILVA “SISTEMAS NANOESTRUTURADOS ESTABILIZADOS COM ÁLCOOL CETÍLICO ETOXILADO E PROPOXILADO CONTENDO ÓLEO DE COPAÍBA E FLUCONAZOL POTENCIALMENTE ATIVO CONTRA DERMATOMICOSES” A Comissão Julgadora dos trabalhos de defesa da Tese de Doutorado, em sessão pública realizada em 26/08/2011, considerou a candidata Hilris Rocha e Silva: ( ) REPROVADA ( X ) APROVADA 1) Examinadora (Profa. Dra. Sílvia Stanisçuaski Guterres) _______________________ 2) Examinadora (Profa. Dra. Nereide Santos Magalhães) _______________________ 3) Examinadora (Prof. Dr. Renata Fonseca Vaz Lopez) _______________________ 4) Examinador (Prof. Dr. Marlus Chorilli) _______________________ 5) Presidente (Profa. Dra. Maria Palmira Daflon Gremião) _______________________ Dedicatória __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva ““Paciência e perseverança têm o efeito mágico de fazer as dificuldades desaparecerem e os obstáculos sumirem.” John Quincy Adams Dedicatória __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva DEDICATÓRIA A DEUS Que me deu a vida, cheia de oportunidades de aprender e ajudar as pessoas, como esta que concretizo, me deu sabedoria, muitos momentos felizes e nunca me deixou nos difíceis!! E por me dar uma Mãe, que intercede pelos planos Dele em minha vida! Maria, passa na frente! " Para todo esforço há fruto" Pr 14,23 AO MEU ESPOSO LUCIANO Por ter abraçado esta oportunidade comigo, abdicando de muitas coisas; por estar comigo principalmente nestes quase quatro anos de doutorado que coincidem com nossos quatro anos de casados, onde estive tantas vezes ausente e ele compreendeu com seu amor, paciência e seus cuidados! Obrigada, meu benzinho, te amo muito! “O verdadeiro amor nunca se desgasta. Quanto mais se dá mais se tem.” Antoine de Saint-Exupéry AOS MEUS PAIS E IRMÃOS A minha mãe, Irisdalva, por ser minha maior educadora e incentivadora nesta etapa, sempre me amando e escutando meus desabafos, pela sua presença constante, mesmo distante. Ao meu pai, Hilson, por, a seu modo, me amar e apoiar sempre que precisei. Aos meus irmãos, Juliana e Arthur (e Rita!), por sempre se preocuparem comigo, mesmo a distância, por me incentivarem e ajudarem muito nesta etapa e por acreditarem sempre em mim!!! Se eu fosse agradecer por cada ajuda que me deram desde o primeiro dia que me mudei para Araraquara, não teriam folhas suficientes.... Amo muito vocês!!! “O amor humano tem a capacidade de ser amor de Deus em nossa vida porque ele nos elege.” Pe. Fábio de Melo A MINHA FAMÍLIA Aos meus avós (in memorian), aos meus tios (a quem saúdo nos nomes dos meus tios Valdo, Tales e Dalvinha que me ajudaram muito na minha mudança pra cá) e primos, por tudo que fizeram por mim para eu realizar este sonho, pela torcida constante, pelas palavras de incentivo, pelas orações!!! A minha sogra, Onorina e meus cunhados, pessoas especiais na minha vida que estão sempre preocupados comigo e torcem pela minha felicidade e do Lu. “Se pela força da distância tu te ausentas, pelo poder que há na saudade voltarás”. Pe. Fábio de Melo Agradecimentos __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva AGRADECIMENTOS A minha estimada orientadora, Profa. Palmira, por tudo que fez por mim desde o dia que cheguei em Araraquara, por sempre estar disposta a me ouvir, por me transmitir muitos conhecimentos profissionais e pessoais, por ser um exemplo de pessoa ética e profissional. Agradeço muito a paciência e confiança em mim. Levo comigo sempre estes anos que convivemos. Ao meu co-orientador, Prof. Georgino, pela ótima convivência e pelos conhecimentos transmitidos. Em especial meu obrigado por me ensinar a trabalhar com animais e pela disponibilidade sempre que precisei. Aos Professores Wagner Vilegas e Marlus Chorilli, pela valiosa contribuição no Exame de Qualificação. Ao amigo Marlus pela imensa ajuda na finalização deste trabalho e disponibilidade sempre que precisei e pelas conversas que me ensinaram muito! Aos Professores Nereide Stela Santos Magalhães, Silvia Stanisçuaski Guterres, Renata Fonseca Vianna Lopez e Marlus Chorilli, por aceitarem o convite para participar da minha banca e desde já pelas importantes contribuições dadas. A Profa. Dra. Marcela Longhi por me acolher no Laboratório de Ciências Química da Universidade de Córdoba e pelos conhecimentos transmitidos. As alunas do laboratório Caro, Lichi, Júlia, Cláudia e Ariana pela amizade e ajuda durante meu estágio. A técnica Glória Maria Bonetto pelas análises de RMN. A profa. Dra. Amélia M. Lopes Dias da Silva por me receber tão bem no Centro de Investigação e Tecnologia de Ciências Agro-ambientais e Biológicas (CITAB), Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (UTAD), Vila Real, Portugal, para realizar os experimentos de citotoxicidade. As alunas Ana Luíza e Tatyana pela ajuda e amizade! A Ana Luisa, Pollyana e Patrícia pelos ótimos dias de convivência. Aos amigos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Fernanda Kolenyak, Ana Luíza, Flávia Chiva, Cristina Franzini, Priscileila, Fernanda Carbinatto, Liliane, Charlene, Márcia, Beatriz, Flávio, Gustavo, Joceana, Cristina Bruno, Giselle, Graziele, Mariana, Andréia, Fabíola e tantos outros que fizeram dos dias de trabalho mais prazerosos. Obrigada pela ajuda, amizade e torcida, em especial das amigas Fernanda Kolenyak e Ana Luíza que foram verdadeiras irmãs para mim em diversos momentos desta etapa. As minhas queridas estagiárias Gabriela, Bruna, Fernanda, Natália e Mariane, que me ensinaram muito e com que pude exercitar a vida acadêmica na orientação dos seus projetos. De modo especial agradeço a Gabi, por estar Agradecimentos __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva comigo desde o primeiro mês que iniciei no laboratório, me ajudando em muitos experimentos. Aos amigos da pós-graduação, Flávia Angélica, Lucélia, Eliete, Lucas, Marcelo, Guilherme, Ana Paula, Bruna, Letícia, Ademir, Jemima, Juliana, Eloísa, Juliana Assumpção, Priscila, Geisy, Josilene e muitos outros que levo em meu coração, pela amizade, ajuda e torcida!! Muito obrigada a todos!!! Ao professor Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento pela colaboração nas análises por SAXs e pela ajuda em toda parte de caratcerização das amostras. Pela amizade, correções e ajuda, obrigada!!! Aos professores Hérida Regina, Vera Isaac, Vírginia, Iracilda, Luís Vítor, Rosângela e Leila Chiavacci, por pela ajuda quando eu precisei e por abrirem as portas de seus laboratórios para que eu pudesse realizar experimentos. A aluna da Profa. Iracilda Lívia Ribeiro, pela valorosa ajuda nos experimentos de atividade anti-inflamatória, meu muito obrigada!!!! Aos professores Ana Dóris de Castro, Raul César e Anselmo Gomes pela ótima convivência no laboratório e pela ajuda quando precisei. À Coordenadora da Pós-Graduação, Profa. Hérida Regina N. Salgado, pelo exemplo de dedicação e justiça e pelas conversas que tanto me ensinaram. A profa. Dra. Monica Freiman de Souza Ramos pela doação das amostras de óleo de copaíba obtidas de cooperativas do Acre. Às secretárias da Seção de Pós-Graduação – Cláudia, Sônia, Laura, Márcia e Joyce, pela atenção e ajuda sempre que precisei. As funcionárias Margareth, Fátima, Maria, Queila e Angélica pela imprescindível colaboração nas horas necessárias e pelas conversas divertidas e agradáveis. Ao Sr. Orandi, da UNESP de Jaboticabal pela valorosa contribuição nos ensaios de histopatologia. A Neusa, zeladora, que com tanta dedicação na limpeza me animava a cada dia de trabalho. A todo o pessoal da portaria, em especial a Olívia e Tiana, que sempre me acolhiam muito bem e me ajudavam quando necessário. Aos porteiros da noite, por sempre me acolherem bem quando eu precisava ficar durante as madrugadas ou vir aos finais de semana. Aos amigos piauienses residentes aqui Magela, Lima Neto, José Renato e Aline pela amizade e por ajudarem a dmininuir a saudades da nossa terra Agradecimentos __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva querida! E as minhas amigas de Teresina, que sempre estiveram torcendo por mim. A FAPESP pela bolsa concedida! Enfim, a todos de que alguma forma passaram pela minha vida nesses quase quatro anos e deixaram sua contribuição para que esse trabalho se realizasse. “Unir-se é um bom começo; manter a união é um progresso, e trabalhar em conjunto é a vitória.” Henry Ford Resumo __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva RESUMO Nas últimas décadas, tem ocorrido um aumento expressivo na incidência de infecções fúngicas. Por outro lado, o tratamento das micoses nem sempre é efetivo, pois os fármacos antifúngicos disponíveis apresentam espectro de atividade e perfil farmacocinético inadequados, em especial no tratamento das lesões cutâneas. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver e caracterizar sistemas nanoestruturados estabilizados com álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP (PROC) contendo fluconazol (FLU), empregando ácido oléico (AO) e óleo de copaíba como fases oleosas. A caracterização química, seguida de ensaios biológicos, dos óleos de copaíba de diferentes fontes, foi determinante para a escolha do óleo a ser usado no desenvolvimento das formulações. A construção de diagramas de fases com ambos os óleos mostrou que diferentes sistemas como microemulsões (ME) e cristais líquidos (CL) podem ser formados. A caracterização físico-química (MLP, SAXS e Reologia) mostrou que na região de 40% de PROC, o aumento da quantidade de água favorece a formação de sistemas mais estruturados como CL de fase lamelar e hexagonal quando se utiliza AO e óleo de copaíba procedente de Cooperativas do Acre (OC) e Sigma (OS). O estudo reológico evidenciou que ocorre diminuição da viscosidade das formulações à medida que aumenta a quantidade de fase oleosa e diminui a fase aquosa. As formulações analisadas não provocaram sinais de toxicidade dérmica após administração em ratos, resultados confirmados através da avaliação histológica, pela qual se verificou aumento significativo da espessura da derme e epiderme, além de contagem de leucócitos estatisticamente iguais ao controle. Os testes de atividade antifúngica contra Candida albicans mostraram que o fluconazol incorporado nas formulações apresentou melhores resultados, provavelmente devido às propriedades dos sistemas de liberação como ME e CL. Os ensaios de liberação in vitro mostraram que as formulações contendo AO e OS podem controlar a liberação de fluconazol. Os ensaios de permeação cutânea mostraram que os sistemas analisados promoveram a retenção do fármaco nas camadas da pele. Os resultados apresentados sugerem que esses sistemas podem ser promissores na administração cutânea de fluconazol para o tratamento de dermatomicoses. Abstract __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva ABSTRACT In the last decades, there has been an expressive increase in incidence of fungal infections. On the other hand, the treatment of mycoses is not always effective, because available antifungal drugs show inappropriate activity spectrum and pharmacokinetic profile. The aim of this work was to develop and characterize nanostructured systems stabilized by propoxyl (5OP) ethoxyl (20 OE) cethyl alcohol (PROC) containing fluconazole, using oleic acid and copaiba oil from different origins as oily phases. Chemical and biological characterization of copaiba oils from different origins was decisive for the choice of oil to be used in the development of the formulations. The construction of phase diagrams with studied copaiba oils showed that different systems such as microemulsions (ME) and liquid crystals (CL) can be formed. The characterization by polarized light microscopy, rheological behavior and SAXS confirmed the results obtained in phase diagrams, showing that in the region of 40% of PROC, the increase in the quantity of water favors the formation of more structured systems as CL of lamellar and hexagonal phase when using AO and copaiba oil Cooperatives founded in Acre (OC) and Sigma (OS). The formulations did not show signs of Acute Dermal Toxicity after dermal administration in rats. This result was confirmed by histological evaluation, for which there was significant increase in dermis and epidermis thickness, and present leukocytes count lesser than the control. The antifungal activity essay against C. albicans showed that the formulations presented significantly higher inhibition halo, suggesting that the components of the systems can improve the drug diffusion, providing better use of their properties and increasing antifungal activity. The in vitro release tests showed that the formulations containing OS and AO can control the drug release. Cutaneous permeation tests showed that the analyzed systems promoted the drug retention in the skin layers. The presented results suggest that these systems may be promising in cutaneous administration of fluconazole in the treatment of dermatomicoses. Lista de figuras __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva LISTA DE FIGURAS Figura 1. Principais antifúngicos usados no tratamento de micoses superficiais e sistêmicas.......................................................................................................... 26 Figura 2. Estrutura da pele.................................................................................. 28 Figura 3. Absorção percutânea e liberação transdérmica. Absorção pode ocorre através dos ductos sudoríparos (1); regiões do estrato córneo (2) e através dos folículos pilosos (3).......................................................................... 29 Figura 4. Vias de permeação de fármacos através do estrato córneo (adaptado de MOSER et al., 2001)..................................................................... 29 Figura 5. Representação esquemática das três microestruturas mais comuns de microemulsões: (a) óleo em água, (b) microemulsão bicontínua e (c) microemulsão água em óleo (Adaptado de LAWRENCE; REES, 2000) ............ 34 Figura 6. Representação esquemática das estruturas mais comuns formadas, dependendo do parâmetro de empacotamento (ditado pela geometria da molécula), teor de água e temperatura................................................................ 37 Figura 7. Representação esquemática de um diagrama de fases...................... 39 Figura 8. Estrutura molecular do PPG-5-CETETH-20......................................... 41 Figura 9. Estrutura molecular do ácido oléico..................................................... 42 Figura 10. Equipamento automatizado de permeação cutânea (Hanson Corporation) e Célula de Difusão de Franz com demonstração do compartimento doador e receptor e disposição da membrana............................................................................................................ 80 Figura 11. Cromatograma de Íons Totais do Óleo-Resina de Copaifera sp (OC) ..................................................................................................................... 84 Figura 12. Cromatograma de Íons Totais do Óleo-Resina de Copaifera sp (OS)...................................................................................................................... 84 Figura 13. Cromatograma de Íons Totais do óleo-resina de Copaifera sp (OE). 84 Figura 14. Principais constituintes encontrados nos óleos de copaíba analisados............................................................................................................ 85 Figura 15. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de OC................................. 90 Figura 16. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3) de OC................................ 91 Figura 17. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de CS................................. 92 Lista de figuras __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Figura 18. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3) de CS................................ 93 Figura 19. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de OE................................. 94 Figura 20. Espectro de RMN 13C (100 MHz, CDCl3) de OE................................ 95 Figura 21. Espectro de RMN 1H (400 MHz, CDCl3) de (1) OE e (2) Óleo de soja....................................................................................................................... 96 Figura 22. Resposta de OC, OS e OE sobre a viabilidade celular de macrófagos peritoneais de camundongos Swiss................................................. 98 Figura 23. Efeito de OC, OS e OE sobre a produção de NO em culturas de macrófagos peritoneais....................................................................................... 99 Figura 24. Efeito de OC, OS e OE sobre a inibição de NO em culturas de macrófagos peritoneais........................................................................................ 100 Figura 25. Efeito da concentração de OC no crescimento da linha celular HepG2. Células HepG2 em placas de cultura de 96-poços foram expostas a OC 24 h antes de se adicionar o AB. O efeito das várias concentrações de OC foi avaliado ao longo de 7 dias............................................................................. 103 Figura 26. Efeito da concentração de OS no crescimento da linha celular HepG2. Células HepG2 em placas de cultura de 96-poços foram expostas a OC 24 h antes de se adicionar o AB. O efeito das várias concentrações de OC foi avaliado ao longo de 7 dias............................................................................. 103 Figura 27. Efeito da concentração de OE no crescimento da linha celular HepG2. Células HepG2 em placas de cultura de 96-poços foram expostas a OC 24 h antes de se adicionar o AB. O efeito das várias concentrações de OC foi avaliado ao longo de 7 dias............................................................................. 103 Figura 28. Diagrama de fases do sistema estabilizado com PROC, AO e fase aquosa. As áreas delimitadas representam: ME – microemulsão, CL – cristal líquido, EM – emulsão e SF – separação de fases. Os pontos assinalados representam as formulações estudadas.............................................................. 107 Figura 29. Diagrama de fases do sistema estabilizado com PROC, OC e fase aquosa. As áreas delimitadas representam: ME – microemulsão, CL – cristal líquido, EM – emulsão, SF – separação de fases e DA – diluição aquosa. Os pontos assinalados representam as formulações estudadas.............................. 107 Figura 30. Diagrama de fases do sistema estabilizado com PROC, OS e fase Lista de figuras __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva aquosa. As áreas delimitadas representam: ME – microemulsão, CL – cristal líquido, EM – emulsão e SF – separação de fases. Os pontos assinalados representam as formulações estudadas.............................................................. 108 Figura 31. Diagrama de fases do sistema estabilizado com PROC, OE e fase aquosa. As áreas delimitadas representam: ME – microemulsão, CL – cristal líquido, EM – emulsão e SF – separação de fases. Os pontos assinalados representam as formulações estudadas.............................................................. 108 Figura 32. Índice de refração das formulações e seus compoentes, em relação a concentração de fase aquosa, empregando as 3 fases oleosas: (A) sistemas contendo OC ; (B) sistemas contendo OS e (C) sistemas contendo AO........................................................................................................................ 113 Figura 33. Fotomicrografias correspondentes a MLP das formulações contendo OS........................................................................................................ 115 Figura 34. Fotomicrografias correspondentes a MLP das formulações contendo OC........................................................................................................ 116 Figura 35. Fotomicrografias correspondentes a MLP das formulações contendo AO........................................................................................................ 117 Figura 36. Espectros de SAXS de sistemas tensoativos contendo OS, com e sem fluconazol................................................................................................... 121 Figura 37. Espectros de SAXS de sistemas tensoativos contendo OC, com e sem fluconazol................................................................................................... 122 Figura 38. Espectros de SAXS de sistemas tensoativos contendo AO, com e sem fluconazol................................................................................................... 123 Figura 39 Reogramas de ensaios de fluxo de sistemas tensoativos contendo AO, com e sem fluconazol................................................................................. 125 Figura 40. Reograma de ensaios de fluxo de sistemas tensoativos contendo OC, com e sem fluconazol................................................................................. 126 Figura 41. Reogramas de ensaios de fluxo de sistemas tensoativos contendo OS, com e sem fluconazol................................................................................. 127 Figura 42. Reogramas de varredura de frequência de sistemas tensoativos contendo AO, com e sem fluconazol. G’ – módulo de armazenagem; G’’ – módulo de perda.................................................................................................. 128 Lista de figuras __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Figura 43. Reogramas de varredura de frequência de sistemas tensoativos contendo OS, com e sem fluconazol. G’ – módulo de armazenagem; G’’ – módulo de perda.................................................................................................. 129 Figura 44. Reogramas de varredura de frequência de sistemas tensoativos contendo OC, com e sem fluconazol. G’ – módulo de armazenagem; G’’ – módulo de perda.................................................................................................. 130 Figura 45. Fotografia representativa do escore 0 do ensaio de TDA: normal; animal com pele intacta, presença de pequenas manchas características da pele; constituição do epitélio sem alterações. 44A - Antes e 44B - após a administração da substância (dia 1)..................................................................... 136 Figura 46. Fotografia representativa do escore 1 do ensaio de TDA: Coceira, pele áspera e mais escurecida que as outras regiões, manchas podem estar mais visíveis, com coloração marrom, pêlos da região como em camadas, podendo ocorrer vermelhidão.............................................................................. 137 Figura 47. Fotografia representativa do escore 2 do ensaio de TDA: pequenas feridas formando escaras leves. 46A e 46B - Escore 2 para OC; 46C - Escore 2 para CB............................................................................................................. 137 Figura 48. Fotografia representativa do escore 4 do ensaio de TDA: escaras graves, com desprendimento de crosta e ferida exposta Escore 4 para CB........................................................................................................................ 137 Figura 49. Fotografia representativa do escore 4 do ensaio de TDA: escaras graves, com desprendimento de crosta e ferida exposta Escore 4 para CB........................................................................................................................ 138 Figura 50. Fotomicrografia evidenciando epiderme de ratos após os tratamentos: (A)- controle; (B) – AO; (C) – PROC; (D) – OS (E) – OC........................................................................................................................ 142 Figura 51. Fotomicrografia evidenciando epiderme de ratos após os tratamentos: A - controle; (B) – AO3F; C – OS3F; D – OC3F ............................. 142 Figura 52. Fotomicrografia evidenciando a derme papilar de ratos após os tratamentos: (A)- controle; (B)- AO3F; (C) – OC3F; (D) – OS3F......................... 144 Figura 53. Placas representativas dos testes antifúngicos frente aos componentes das formulações: AO, OC, OS, e PROC....................................... 148 Lista de figuras __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Figura 54. Placas representativas dos testes antifúngicos de sinergismo dos óleos (OC, OS, OE e AO) com fluconazol........................................................... 149 Figura 55. Placas representativas dos testes antifúngicos de sinergismo das formulações com e sem fluconazol...................................................................... 150 Figura 56. Valores de halo de inibição das formulações e controle positivo frente à Candida albicans. ................................................................................... 151 Figura 57. Perfil de liberação in vitro (% de liberação) do fluconazol incorporado nas fases oleosas AO, OS e no controle PG................................... 153 Figura 58. Perfil de liberação in vitro (% de liberação) do fluconazol incorporado em formulações contendo OS como fase oleosa (média de n=6)... 154 Figura 59. Perfil de liberação in vitro (% de liberação) do fluconazol incorporado em formulações contendo AO como fase oleosa (média de n=6)... 156 Figura 60. Retenção cutânea, no estrato córneo (EC) e na epiderme +derme (μg/cm2), de fluconazol incorporado em formulações contendo AO.................... 159 Figura 61. Retenção cutânea, no estrato córneo (EC) e na epiderme +derme (μg/cm2), de fluconazol incorporado em formulações contendo OS........................................................................................................................ 161 Figura 62. Curva analítica do fluconazol, equação da reta (y) e coeficiente de correlação (r2)....................................................................................................... 183 Figura 63. Cromatograma referente injeção de solução tampão fosfato pH 7,4 contendo fluconazol (150 μg.mL-1)....................................................................... 186 Figura 64. Cromatograma de solução das formulações selecionadas contendo fluconazol (150 μg.mL-1)....................................................................................... 187 Figura 65. Curva analítica de fluconazol em tampão fosfato 0,01 M pH 7,4...... 188 Lista de tabelas __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva LISTA DE TABELAS Tabela 1. Proporção dos componentes empregados na construção do diagrama de fases por titulação aquosa.................................................................................... 65 Tabela 2. Condições analíticas empregadas nos estudos de liberação, permeação e retenção in vitro do fluconazol............................................................. 68 Tabela 3. Escala utilizada nos testes de toxicidade dérmica.................................... 73 Tabela 4. Principais constituintes voláteis detectados no óleo-resina Copaifera sp (OC)............................................................................................................................ 86 Tabela 5. Principais constituintes voláteis detectados no óleo-resina Copaifera sp (OS) ........................................................................................................................... 87 Tabela 6. Viabilidade celular em macrófagos peritoneais murinos, após exposição às amostras, OC, OS e OE........................................................................................ 97 Tabela 7. Produção de NO em cultura de macrófagos peritoneais após exposição às amostras OC, OS, OE.......................................................................................... 99 Tabela 8. Avaliação da inibição da produção de NO em cultura de macrófagos peritoneais após exposição às amostras OC, OS, OE.............................................. 101 Tabela 9. Composição (%) das formulações para caracterização física do sistema 110 Tabela 10. Índice de refração dos componentes das formulações........................... 111 Tabela 11. Índice de refração das formulações contendo OC.................................. 111 Tabela 12. Índice de refração das formulações contendo OS................................... 112 Tabela 13. Índice de refração das formulações contendo AO................................... 112 Tabela 14. Composição (%) das formulações para caracterização física do sistema e resultados de MLP..................................................................................... 119 Tabela 15. Parâmetros para determinação estrutural dos sistemas......................... 120 Tabela 16. Solubilidade do fluconazol nos componentes empregado nas formulações mediante ensaio prévio ........................................................................ 132 Tabela 17. Solubilidade do fluconazol nas formulações mediante ensaio prévio... 133 Tabela 18. Resultados obtidos para o ensaio de quantificação do fluconazol nas formulações................................................................................................................ 134 Tabela 19. Escores de toxicidade em ratos após administração de Prop 2000 mg/Kg (controle negativo) ......................................................................................... 135 Lista de tabelas __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Tabela 20. Escores de toxicidade em ratos após administração de CB 15% (1700 mg/Kg) (controle positivo) ......................................................................................... 135 Tabela 21. Escores de toxicidade em ratos após administração de PROC 2000 mg/Kg......................................................................................................................... 135 Tabela 22. Escores de toxicidade em ratos após administração de OC 2000 mg/Kg......................................................................................................................... 135 Tabela 23. Escores de toxicidade em ratos após administração de OS 2000 mg/Kg......................................................................................................................... 136 Tabela 24. Escores de toxicidade em ratos após administração de AO 2000 mg/Kg......................................................................................................................... 136 Tabela 25. Espessura da epiderme e derme (média ± DP) para os diferentes grupos experimentais................................................................................................. 140 Tabela 26. Contagem de leucócitos e fibroblastos (média ± DP) para os diferentes grupos experimentais................................................................................................. 145 Tabela 27. Halos de inibição obtidos para os óleos puros, óleos com fluconazol e controle positivo fluconazol contra C. albicans.......................................................... 147 Tabela 28. Halos de inibição obtidos para as formulações testadas contra C. albicans...................................................................................................................... 150 Tabela 29. Quantidade de fluconazol liberado a partir de formulações contendo OS, por área e porcentagem liberada, após 24h de experimento............................. 155 Tabela 30. Quantidade de fluconazol liberado por área e porcentagem liberada, a partir de formulações contendo AO, após 24h de experimento................................. 157 Tabela 31. Quantidade de fluconazol, incorporado em formulações contendo AO como fase oleosa retido e permeado na pele após 6 ou 12h de experimento.......... 158 Tabela 32. Quantidade de fluconazol, incorporado em formulações contendo OS como fase oleosa retido e permeado na pele após 6 ou 12h de experimento.......... 161 Tabela 33. Resultados obtidos para o ensaio de linearidade.................................... 184 Tabela 34. Resultados obtidos para o ensaio de precisão por repetibilidade........... 184 Tabela 35. Resultados obtidos para o ensaio de precisão intermediária.................. 185 Tabela 36. Resultados obtidos para o ensaio de exatidão........................................ 186 Lista de abreviaturas e siglas __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AO – ácido oléico CB – cloreto de benzalcônio CL – cristal líquido DA – diluição aquosa EM - emulsão F (presente em siglas como AOF, OSF, AO1F, OS1F, etc..) - Fluconazol LPS - lipopolissacarídeo bacteriano ME - microemulsão MLP – Microscopia de Luz Polarizada NO – óxido nítrico OC – óleo de copaíba obtido de Cooperativas do Acre. OE – óleo de copaíba obtido comercialmente OS – óleo de copaíba obtido da Sigma PROC – álcool cetílico etoxilado e propoxilado Prop – propilenoglicol RMN – Ressonância Magnética Nuclear SAXS – Espalhamento de raios-X a baixo ângulo SF – separação de fases TDA – Toxicidade Dérmica Aguda TDDR – Toxicidade Dérmica por dose repetida TMS – Trimetilsilano Sumário __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO………………………………………………….……………….......... 22 24 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.....……………………………………………............. 24 2.1 DERMATOMICOSES: CONSIDERAÇÕES GERAIS……………….............. 24 2.2 VIA CUTÂNEA…………………........................................................................ 27 2.3 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS: MICROEMULSÕES E CRISTAIS LÍQUIDOS…........................................................................................... 32 2.3.1 DIAGRAMA DE FASES…………………......................................................... 38 2.3.2 COMPOSIÇÃO DOS SISTEMAS………………….......................................... 39 2.3.3 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO QUÍMICA DE SISTEMAS COLOIDAIS………. 44 2.3.3.1 Microscopia de Luz Polarizada…………………........................................... 45 2.3.3.2 Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) …………………............. 46 2.3.3.3 Comportamento Reológico…………………................................................. 48 2.4 TOXICIDADE DÉRMICA AGUDA…………………............................................. 49 3 OBJETIVOS……………………………………………………………….................. 53 4 MATERIAIS E MÉTODOS………………………………………………………....... 54 4.1 MATERIAIS…………………............................................................................... 54 4.2 EQUIPAMENTOS…………………..................................................................... 55 4.3 Animais…………………..................................................................................... 55 4.4 Células e Cepas ……………………………………………………….................... 56 4.3 MÉTODOS........................................................................................................ 56 4.3.1 CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEOS DE COPAÍBA DE DIFERENTES FONTES………………….......................................................................................... 56 4.3.1.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA…………………........................................... 56 4.3.1.1.1 CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG/EM) …………………................................. 56 4.3.1.1.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR…………………...................... 57 4.3.1.2 ENSAIOS BIOLÓGICOS………………….................................................... 57 Sumário __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva 4.3.1.2.1 ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA DOS ÓLEOS DE COPAÍBA............. 57 4.3.1.2.1.1 Animais…………………......................................................................... 58 4.3.1.2.1.2 Amostras…………………....................................................................... 58 4.3.1.2.1.3 Obtenção das células do exsudato peritoneal....................................... 58 4.3.1.2.1.4 Obtenção do sobrenadante de cultura de macrófagos.......................... 59 4.3.1.2.1.5 Avaliação da viabilidade celular de células do exsudato peritoneal...... 59 4.3.1.2.1.6 Determinação da produção de óxido nítrico.......................................... 60 4.3.1.2.1.7 Inibição da produção de óxido nítrico.................................................... 61 4.3.1.2.1.8 Análise estatística.................................................................................. 62 4.3.1.2.2 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE EM CÉLULAS HEPG2............................ 62 4.3.1.2.2.1 Cultura celular........................................................................................ 62 4.3.1.2.2.2 Tratamento das células.......................................................................... 63 4.3.1.2.2.3 Ensaio de citotoxicidade utilizando Alamar Blue®.................................. 63 4.3.2 DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DOS SISTEMAS................... 64 4.3.2.1 DIAGRAMA DE FASES............................................................................... 64 4.3.2.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS COLOIDAIS...... 65 4.3.2.2.1 Índice de refração..................................................................................... 66 4.3.2.2.2 Determinação do pH................................................................................. 66 4.3.2.2.3 Microscopia de Luz Polarizada (MLP) ..................................................... 66 4.3.2.2.4 Espalhamento de Raios-X a baixo ângulo (SAXS) .................................. 66 4.3.2.2.5 Comportamento Reológico....................................................................... 67 4.3.3 AVALIAÇÃO DA INCORPORAÇÃO DO FLUCONAZOL NOS SISTEMAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)....................... 68 4.3.3.1 Linearidade.................................................................................................. 69 4.3.3.2 Precisão....................................................................................................... 69 4.3.3.4 Exatidão....................................................................................................... 69 4.3.3.5 Especificidade ou seletividade..................................................................... 69 4.3.3.6 Limite de detecção e limite de quantificação............................................... 70 4.3.3.7 Robustez...................................................................................................... 70 4.3.3.8 Avaliação da incorporação de fluconazol..................................................... 70 4.3.4 TOXICIDADE DÉRMICA................................................................................. 71 4.3.4.1 Toxicidade Dérmica com componentes e formulações............................... 71 Sumário __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva 4.3.4.2 Análise estatística........................................................................................ 73 4.3.4.3 Avaliação histológica.................................................................................... 74 4.3.4.1 Análise histométrica..................................................................................... 74 4.3.4.2 Análise histopatológica................................................................................ 75 4.3.5 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DOS COMPONENTES E FORMULAÇÕES....... 75 4.3.5.1 Preparo das amostras.................................................................................. 76 4.3.5.2 Preparo do inóculo fúngico.......................................................................... 76 4.3.5.3 Preparo dos discos...................................................................................... 77 4.3.5.4 Ensaios de difusão....................................................................................... 77 4.3.5.5 Análise estatística........................................................................................ 77 4.3.6 AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO, PERMEAÇÃO E RETENÇÃO CUTÂNEA in vitro........................................................................................................................... 78 4.3.6.1 Curva analítica de fluconazol em tampão fosfato 0,01 M pH 7,4................. 78 4.3.6.2 Estudo de solubilidade do fluconazol em tampão fosfato 0,01 M pH 7,4..... 79 4.3.6.3 Liberação in vitro.......................................................................................... 79 4.3.6.4 Permeação e retenção cutânea in vitro....................................................... 81 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................... 83 5.1 CARACTERIZAÇÃO DE ÓLEOS DE COPAÍBA DE DIFERENTES PROCEDENCIAS..................................................................................................... 83 5.1.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA....................................................................... 83 5.1.1.1 CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA (CG/EM)............................................................. 83 5.1.1.2 RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR 1H E 13C.................................... 88 5.1.2. ENSAIOS BIOLÓGICOS................................................................................ 97 5.1.2.1 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI-INFLAMATÓRIA.................................. 97 5.1.2.1.1 Avaliação da viabilidade celular................................................................ 97 5.1.2.1.2 Determinação da produção de óxido nítrico 98 5.1.2.1.3. Determinação da inibição da produção de óxido nítrico.......................... 100 5.1.2.2. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE EM CÉLULAS HEPG2.............................. 102 5.2. DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DOS SISTEMAS..................... 106 5.2.1 DIAGRAMA DE FASES.................................................................................. 106 5.2.2 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS SISTEMAS.............................. 110 Sumário __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva 5.2.2.1 Índice de refração (IR) ................................................................................ 110 5.2.2.2 Determinação do pH.................................................................................... 113 5.2.2.3 Microscopia de Luz Polarizada.................................................................... 114 5.2.2.4 Espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS)....................................... 120 5.2.2.5 Comportamento Reológico.......................................................................... 123 5.3 AVALIAÇÃO DA INCORPORAÇÃO DE FLUCONAZOL NAS FORMULAÇÕE 131 5.4 TOXICIDADE DÉRMICA AGUDA...................................................................... 135 5.4.1 Toxicidade Dérmica com componentes e formulações.................................. 135 5.4.2 Avaliação histológica....................................................................................... 139 5.4.2.1 Análise histométrica..................................................................................... 139 5.4.2.2 Análise histopatológica................................................................................ 143 5.5 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DOS COMPONENTES E FORMULAÇÕES......... 147 5.5.1 Avaliação da atividade antifúngica dos componentes dos sistemas nanoestruturados..................................................................................................... 147 5.5.2 Avaliação da atividade antifúngica das formulações contendo fluconazol..... 149 5.6 AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO, PERMEAÇÃO E RETENÇÃO CUTÂNEA in vitro........................................................................................................................... 151 5.6.1 Estudo de solubilidade do fluconazol em tampão fosfato 0,01 M pH 7,4....... 152 5.6.2 Liberação in vitro............................................................................................. 152 5.6.3 Permeação e retenção cutânea in vitro.......................................................... 157 6. CONCLUSÕES……………………………………………………………..……....... 163 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICA……………………………….......................... 166 APÊNDICE..................................................……………...................................... 182 Introdução 22 ____________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva 1 INTRODUÇÃO As infecções fúngicas são consideradas um dos maiores problemas para a saúde pública. Dentre estas infecções, destacam-se as dermatomicoses, que envolvem a pele, principalmente o estrato córneo e apêndices como unhas, cabelo e mucosas (oral e vaginal) (NEGRONI, 2010; CRESPO-ERCHIGA et al., 2005). O tratamento das micoses humanas não é sempre efetivo e em muitos casos os antifúngicos tópicos são ineficazes e os sistêmicos, embora mais eficientes, apresentam uma série de efeitos colaterais, obrigando a uma análise risco/benefício da sua utilização (SIZENANDO NETO; SVIDZINSKI, 2002). Por esta razão, há uma busca contínua de novos medicamentos antifúngicos mais potentes, mas, sobretudo, mais seguros que os existentes. O tempo necessário e o elevado custo são os principais fatores limitantes para o sucesso terapêutico no tratamento das micoses (SIZENANDO NETO; SVIDZINSKI, 2002). Além disso, muitas infecções fúngicas provocam aparecimento de lesões cutâneas ou subcutâneas que demoram a desaparecer mesmo em tratamentos longos (REX, 2001; FENNER et al., 2006). Por outro lado, o desenvolvimento de um agente antifúngico representa um grande desafio para todos os pesquisadores da área, uma vez que, por tratar-se de célula eucariótica, compartilha com a maior parte dos alvos potenciais de ação com as células do hospedeiro, conferindo altos níveis de toxicidade (SIZENANDO NETO; SVIDZINSKI, 2002). Por esta razão, há uma busca contínua de novos fármacos e medicamentos antifúngicos mais potentes, e, sobretudo, mais seguros que os existentes. Assim, nas ultimas décadas tem ocorrido um grande interesse no desenvolvimento de produtos para serem administrados na pele ou mucosas, para exercer ação local ou sistêmica. A pele apresenta inúmeras vantagens tanto para a liberação tópica quanto para a permeação cutânea de fármacos (URBAN, 2004; NARISHETTY; PANCHAGNULA, 2004; THOMAS; PANCHAGNULA, 2003; LEHMANN et al., 2001). O fármaco ao se difundir na pele pode ficar retido no estrato córneo, na epiderme+derme, caracterizando a retenção cutânea do fármaco ou ainda se permear para as camadas mais profundas, podendo atingir a circulação sistêmica. Entretanto, devido à estrutura e composição lipídica da epiderme, mais Introdução 23 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva especificamente do estrato córneo, existe uma grande dificuldade na difusão dos fármacos através da pele. Por conseguinte, a penetração através da pele e permeação do fármaco após aplicação tópica depende das propriedades físico- químicas do fármaco, coeficiente de partição O/A, propriedades de superfícies, entre outras (BAROLI, 2000; PROW et al., 2011; MULLER et al., 2003; MULLER; GOYMANN, 2004; MAGHRABY, 2008). Assim, a habilidade de se conseguir concentrações terapêuticas de fármaco nas diversas camadas do tecido cutâneo ou lesão, acompanhado por baixas concentrações sanguíneas, evitando-se, desta forma, os efeitos farmacológicos, adversos e tóxicos em outras regiões do corpo, pode melhorar a eficiência de tratamento de algumas patologias como a dermatomicoses. Muitas das alternativas tecnológicas empregadas na modulação da penetração e permeação do fármaco pela pele têm sido focadas no desenvolvimento de sistemas nanoestruturados, como os lipossomas, as nanopartículas lipídicas sólidas, as micro e nanopartículas, as microemulsões e os cristais líquidos, devido às suas propriedades favoráveis de transporte, direcionando mais especificamente o fármaco para o local de ação, além da facilidade de solubilização de fármacos, melhorando as propriedades biofarmacêuticas dos mesmos. As microemulsões (ME) e cristais líquidos (CL) têm sido amplamente estudados no desenvolimento de novas formulações para administração tópica, em especial a cutânea (HEUSCHKEL et al., 2008; MÜLLER-GOYMANN, 2004). ME são sistemas estáveis, consituídos por um tensoativo e/ou co-tensoativo, uma fase oleosa e a fase aquosa, propriedades que facilitam a solubilização de fármacos lipofílicos, possibilitando incoporação, se necessário, de concentração mais elevada que a preconizada. A interação fármaco com o sistema também proporciona um controle da liberação do fármaco, bem como o direcionamento do mesmo ao local de ação. Dependendo da composição, estes sistemas podem interagir com a pele, facilitando a interação com o estrato córneo e proporcionando melhor aproveitamento da dose administrada do fármaco (BAROLI, 2000). Com base no exposto, torna-se interessante a busca de novas alternativas tecnológicas para o tratamento de dermatomicoses envolvendo estudos relacionados à nanotecnologia. O presente trabalho propõe a pesquisa de ME e CL para adminitração cutânea de fluconazol no tratamento de dermatomicoses. Revisão Bibliográfica 24 ____________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 DERMATOMICOSES: CONSIDERAÇÕES GERAIS As dermatomicoses são definidas como dermatites crônicas localizadas, causada pela invasão de dermatófitos, podendo acometer pele, cabelos, unhas, canal auditivo externo, mucosas e áreas adjacentes (LACAZ et al., 2002). São doenças de ocorrência mundial, com maior prevalência em regiões com clima quente e úmido (SAMPAIO; RIVITTI, 2002). Nas últimas décadas, tem se verificado um grande aumento na incidência de infecções fúngicas, sendo as dermatomicoses as principais responsáveis por este aumento expressivo. Dentre os fatores relacionados a esta ocorrência, os principais são: o melhor diagnóstico laboratorial e clínico, o aumento da sobrevida de pacientes com doenças imunossupressoras ou que utilizam medicamentos imunossupressores e o uso indiscriminado de fármacos que têm permitindo a instalação de microorganismos convencionalmente saprófitos. Além das infecções em humanos, os animais também podem ser atacados por fungos muito difíceis de serem combatidos, tornando-se foco de transmissão (FENNER et al., 2006). As infecções fúngicas que acometem a pele são divididas em micoses subcutâneas ou sistêmicas. As primeiras resultam de infecção traumática causada pelo fungo no tecido subcutâneo, desenvolvendo doenças localizadas, com eventual disseminação linfática. A esporotricose é uma das infecções mais comuns desta classe e, embora antes considerada doença do meio rural, está cada vez mais frequente em grandes centros urbanos (ARAÚJO et al., 2001). As micoses sistêmicas ou profundas ou disseminadas compreendem as infecções fúngicas que atingem os órgãos internos do corpo ou se difundem pela circulação sanguínea, como por exemplo, a coccidioidomicose, histoplasmose e candidíase sistêmica (ERCHIGA, 2008). A maioria das doenças fúngicas tem sido tratadas com medicamentos administrados por via oral ou venosa, entretanto, observam-se limitações nas opções terapêuticas disponíveis. Outro agravante é que muitas destas infecções provocam aparecimento de lesões cutâneas ou subcutâneas que demoram a Revisão Bibliográfica 25 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva desaparecer mesmo com tratamentos em longo prazo, podendo se tornar focos de transmissão (REX, 2008; FENNER et al., 2006). O tratamento das micoses nem sempre é efetivo, pois os fármacos antifúngicos disponíveis possuem um perfil farmacocinético inadequado, promovendo recorrência ou resistência, além de apresentarem toxicidade. Além disso, em muitos casos os antifúngicos tópicos são ineficazes e os sistêmicos, embora mais eficientes, apresentam uma série de efeitos colaterais, obrigando a uma análise risco/benefício da sua utilização (SIZENANDO NETO; SVIDZINSKI, 2002). Por esta razão e levando em conta o fato de que a introdução de novos fármacos na terapêutica tem se tornado um processo muito oneroso, a pesquisa de novas alternativas tecnológicas que aumentem a eficiência e segurança dos fármacos já disponíveis tem sido intensificada. O antifúngico ideal deve ter amplo espectro de atividade e ação fungicida ao invés de fungistática, estar disponível em formulações tópicas e orais, apresentar poucas interações medicamentosas, ser seguro em doses eficazes, ter custo acessível e não apresentar resistência (SIZENANDO NETO; SVIDZINSKI, 2002). A anfotericina B e os derivados azólicos, como itraconazol, cetoconazol e fluconazol (Figura 1), são os fármacos mais eficazes disponíveis no arsenal terapêutico da atualidade para o tratamento de infecções fúngicas. Dentre os derivados azólicos pertencentes à classe dos triazóis, o fluconazol, desenvolvido na década de 1980, foi o primeiro a integrar a classe dos triazóis e surgiu após anos de pesquisas com modificações moleculares a partir dos fármacos imidazólicos, como um promissor antifúngico graças à ótima combinação de eficácia, características farmacocinéticas, solubilidade e perfil de segurança (PEREIRA, 2007). É metabolizado de forma mais lenta e, quando comparado aos imidazólicos, age na inibição da síntese de esteróide fúngico e praticamente não altera a síntese do ergosterol dos mamíferos, sendo menos tóxico e melhor absorvido que os outros azóis, razão principal pelas quais os triazóis são os principais fármacos antifúngicos em pesquisa e desenvolvimento (PARK et al., 2007). O fluconazol (P.M. 306, 27 g/mol), é um pó branco, ligeiramente solúvel em água (8 mg/mL), solúvel em etanol e acetona, facilmente solúvel em metanol e muito pouco solúvel em tolueno. A presença de dois anéis triazólicos em sua estrutura é responsável por sua menor lipofilicidade (Figura 1). É considerado uma base fraca Revisão Bibliográfica 26 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva com constante de ionização (pka) medida em NaOH 1,1M de 1,76 + 0,1, com protonação no nitrogênio 4 (O´NEIL, 2006; DASH; ELMQUIST, 2001). Seu mecanismo de ação, assim como dos outros azóis, está ligado à sua capacidade de alterar a permeabilidade da membrana das leveduras e outros fungos, inibindo a síntese do ergosterol. A inibição do P-450-14-alfa- demetilase dependente de lanosterol causa acúmulo de esteróis metilados, depleção de ergosterol e inibição do crescimento celular (SIZENANDO NETO; SVIDZINSKI, 2002). Figura 1. Principais antifúngicos usados no tratamento de micoses superficiais e sistêmicas. Anfotericina B Dependendo do tipo de dermatomicose, existem os fármacos de escolha, entretanto, em alguns casos pode-se observar intolerância, resistência e diversos efeitos colaterais, que podem aumentar o tempo de tratamento, que pode durar três Itraconazol Fluconazol Cetoconazol Revisão Bibliográfica 27 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva meses ou mais, principalmente quando não há administração de antifúngico por via tópica (KWON et al., 1998; HAN, 2007; BONIFAZ et al., 2007). O fluconazol é utilizado quando ocorre intolerância. É utilizado também por apresentar menor número de efeitos colaterais. Entretanto, o tratamento é muito longo, principalmente quando há presença de lesões cutâneas, sendo que a dose quase sempre é aumentada devido à resposta inadequada do tratamento, necessitando assim de mais estudos para determinação de dose ideal e duração do tratamento. Devido à importância das infecções antifúngicas dentro do cenário de saúde pública, destacando o papel dos azóis como agentes antifúngicos, é necessário buscar novas alternativas tecnológicas, que engloba inclusive outras vias de administrações, para o uso destes fármacos no tratamento de doenças antifúngicas, que possibilitem aumentar a eficiência dos mesmos na terapia e forneça aos clínicos e pacientes uma maior diversidade de tratamento. 2.2 VIA CUTÂNEA A pele, considerada o maior órgão do corpo humano, pode ser descrita como um órgão estratificado com três camadas: epiderme, derme e tecido subcutâneo, além dos apêndices como folículos pilosos e glândulas sebáceas e sudoríparas (Figura 2). A epiderme é composta externamente do estrato córneo (cerca de 10 μm de espessura), conhecido como epiderme não viável e considerado a principal barreira limitante à absorção percutânea de fármacos, o que se justifica pelo seu espaço intercelular, rico em lipídios, que compreende matrizes lamelares com camadas hidrofílicas e camadas duplas lipofílicas alternantes formadas durante o processo de queratinização. Além dessa estrutura, o estrato córneo possui células queratinizadas sobrepondo-se umas às outras, ligadas por pontes intercelulares (corneócitos) e comprimidas em cerca de 15 camadas. Ele requer no mínimo 10% de umidade para que sua flexibilidade seja mantida, e a camada de lipídios intercelulares é a responsável direta por evitar a perda de água transcutânea (WALTERS; ROBERTS, 2002; BLOCK, 2005). Revisão Bibliográfica 28 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Figura 2. Estrutura da pele (Fonte: BLOCK, 2008). Apesar da grande utilização e vantagens que a via oral oferece, vários fármacos, quando administrados por esta via podem ser inativados no trato gastrintestinal ou apresentarem extenso metabolismo hepático. Assim, nas últimas décadas tem ocorrido um grande interesse no desenvolvimento de produtos para serem administrados por outras vias de administração, como a cutânea. Para isso, muitos trabalhos têm sido realizados no sentido de conhecer mais os mecanismos de permeabilidade cutânea das substâncias ativas (KOVACEVIK et al., 2011; BAROLI, 2009). O uso de medicamentos administrados pela via cutânea tem se evidenciado ao longo dos anos. Existem relatos de efeitos sistêmicos de agentes hormonais e antimicrobianos quando administrados por via tópica, desde o século anterior. Os medicamentos são aplicados na pele com o objetivo de alcançar um ou mais dos seguintes efeitos: efeitos de superfície (fotoprotetores); efeitos locais (corticosteróides para dermatite); permeação para atingir efeitos sistêmicos (adesivos transdérmicos de nicotina) e tecidos mais profundos (anti-inflamatórios não-esteroidais) (BLOCK, 2005; WALTERS; ROBERTS, 2002; ROBERTS; CROSS; PELLET, 2002). As Figuras 3 e 4 resumem o processo permeação e penetração do fármaco através da pele através do estrato córneo. Esta última pode ocorrer intracelularmente através da matriz lipídica entre os corneócitos ou pela via transcelular entre os corneócitos e a matriz lipídica (Figura 4) (MOSER et al., 2001). Apesar da grande utilização e vantagens que a via oral oferece, vários fármacos, quando administrados por esta via, podem ser inativados no trato gastrintestinal ou apresentarem extenso metabolismo hepático. Assim, nas ultimas Revisão Bibliográfica 29 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva décadas tem ocorrido um grande interesse no desenvolvimento de produtos para serem administrados por outras vias de administração, como a cutânea. Para isso, muitos trabalhos têm sido realizados no sentido de conhecer melhor os mecanismos de permeabilidade cutânea das substâncias ativas (KOVACEVIK et al., 2011; BAROLI, 2009; PROW et al., 2011). Figura 3. Absorção percutânea e liberação transdérmica. Absorção pode ocorre através dos ductos sudoríparos (1); regiões do estrato córneo (2) e através dos folículos pilosos (3) (adaptado de Walters, 2002). Figura 4. Vias de permeação de fármacos através do estrato córneo (adaptado de MOSER et al., 2001). A via cutânea apresenta inúmeras vantagens tanto para a liberação tópica quanto para a permeação cutânea de fármacos, uma vez que o metabolismo pré- Revisão Bibliográfica 30 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva sistêmico do fármaco pode ocorrer antes que este alcance a circulação sistêmica, além de maior conforto e adesão do paciente ao tratamento (BAROLI et al., 2000; KREILGAARD, 2002). Entretanto, devido à estrutura e composição lipídica da epiderme, mais especificamente do estrato córneo, existe uma grande dificuldade na difusão dos fármacos através da pele. Um produto farmacêutico tópico ideal é aquele capaz de liberar o fármaco no local de ação na concentração terapêutica por um período de tempo tão longo quanto necessário (SERQUEIRA, 1990). Assim, pode-se afirmar que o sucesso terapêutico para alguns produtos está relacionado com a habilidade de se conseguir concentrações terapêuticas de fármaco no tecido cutâneo ou lesão, acompanhado por baixas concentrações sanguíneas, evitando-se, desta forma, os efeitos farmacológicos, adversos ou tóxicos, em outras regiões do corpo (NACHT, 1996). Segundo Suhonen et al. (1999), o aumento da permeação cutânea se dá por agentes específicos chamados de promotores de permeação, que interagem com o estrato córneo, alterando sua resistência à penetração de substâncias exógenas. São exemplos, dimetil-sufóxido (DMSO), ácido lático, ácido oléico, ácido salicílico, uréia, solventes orgânicos (etanol, metanol e acetona) e os tensoativos, os quais podem interagir com o estrato córneo quando incorporados em formulações de uso tópico, facilitando a difusão do fármaco. A interação da água presente na bicamada lipídica com as cabeças polares do tensoativo permite a entrada de substâncias polares, devido ao intumescimento dessas cabeças, induzindo alterações na estrutura do estrato córneo, aumentando a permeação (SUHONEN et al., (1999). Devido às suas propriedades favoráveis de transporte e solubilização de fármacos, os sistemas de liberação controlada de fármacos têm se tornado um foco de maior interesse na aplicação tópica, com o objetivo de se obter um efeito mais localizado. Na aplicação cutânea de antifúngicos para algumas infecções, o aumento da distribuição e do acúmulo desses fármacos no estrato córneo ou em camadas da pele como epiderme e derma é mais importante para a eficácia e segurança do tratamento que o aumento da absorção percutânea e/ou sistêmica. (HASHIGUCHI et al., 1997). A eficácia clínica de terapia tópica antifúngica depende da habilidade do fármaco penetrar no estrato córneo e do tempo de residência (PIÉRARD et al., 1996). O fluconazol é um antifúngico de amplo espectro que tem sido usado para Revisão Bibliográfica 31 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva administração oral (KLEIN, 2007). Após administração oral, podem ocorrer efeitos adversos como cefaléia, desconforto epigástrico, diarréia, náuseas, icterícia, e, além disso, pode acumular-se no suor e estrato córneo (FAERGEMANN, 1999), além de favorecer o aparecimento de cepas resistentes ao fármaco (BORECKÁ- MELKUSOVÁ et al., 2008). Ele pode acumular em tecidos queratinizados mesmo durante semanas após o término do tratamento, ficando muito tempo em locais que em alguns casos seria necessário (FAERGEMANN, 1999). Por um bom tempo, acreditou-se que o mecanismo pelo qual algumas substâncias administradas por via sistêmica alcançavam as camadas mais superficiais da pele era pelo mecanismo de difusão. Por este mecanismo, a substância era lentamente transportada para as camadas queratinizadas e corneócitos pelo processo de renovação natural da pele. Entretanto, este processo leva cerca de 3-4 semanas, o que contraria as evidências de que algumas substâncias, como o fluconazol, administrada sistemicamente são capazes de atingir a pele muito mais rapidamente que a renovação celular. Outra evidência de que o transporte destas substâncias deve ocorrer por outros mecanismos é a ausência de vasos sanguíneos nesta região. Em um bom trabalho de revisão, Patzelt e colaboradores (2008) discutem os mecanismos que podem explicar porque algumas substâncias administradas por via sistêmica atingem rapidamente as camadas mais externas da pele. Segundo estes autores, o transporte pode ocorrer por dois mecanismos que dependem das características da substância a ser transportada. A retenção do fluconazol na pele tem sido atribuída à alta afinidade ao estrato córneo devido a uma interação entre o fármaco e queratina (KLIMKE; SCHAFER- KORTING, 1997). Com o acúmulo na pele, cabelo ou unhas, o fluconazol dificilmente irá atingir camadas mais profundas e posteriormente a circulação sistêmica, devido a sua alta afinidade ao estrato córneo, até mesmo quando é administrado pela via oral (DE DONCKER et al., 1997). Esse alto tropismo do fluconazol pela queratina é um importante fator para sua ação contra infecções da pele (SOBUE; SEKIGUCHI; NABESHIMA, 2004), no entanto precisa atingir as outras camadas da pele, como epiderme e derme para ter maior efeito sobre os fungos. Entretanto, sua administração tópica tem sido pouco investigada, apesar das vantagens apresentadas. Revisão Bibliográfica 32 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Deste modo, entender como estes mecanismos ocorrem é importante para que sistemas mais adequados possam ser desenvolvidos. Principalmente no caso dos antifúngicos que, para algumas patologias, o alvo pode ser as diferentes camadas da pele ou ainda a lesão, que, em geral, apresenta um meio muito hidrofílico com uma grande riqueza de organismos, que poderiam não receber concentrações adequadas de fármaco. 2.3 SISTEMAS DE LIBERAÇÃO DE FÁRMACOS: MICROEMULSÕES E CRISTAIS LÍQUIDOS A pesquisa de novos sistemas de liberação de fármacos, ao longo dos anos, tem possibilitado contornar as limitações existentes, bem como melhorar as propriedades de medicamento com consequente direcionamento do fármaco (BLOCK, 2008). A acessibilidade da pele como via de administração de medicamentos, além de evitar efeitos adversos observados em outras vias, resultou em um número cada vez mais crescente de sistemas de liberação de fármacos e formas farmacêuticas aplicadas à pele, quer seja para efeitos locais ou sistêmicos (BLOCK, 2008; ROBERTS; CROSS; PELLET, 2002). Uma preparação farmacêutica ideal é aquela capaz de liberar a substância ativa no seu órgão alvo em doses terapeuticamente relevantes, com mínimos desconfortos e efeitos adversos para o paciente (KREILGAARD, 2002). Muitas das pesquisas de novas alternativas tecnológicas que aumentem a eficiência e segurança dos fármacos já disponíveis têm sido focadas no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos (BRUSCHI et al., 2008; MAINARDES et al., 2006; BRUSCHI et al., 2003). A nanotecnologia tem representado um grande avanço no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos, em especial na indústria farmacêutica. Esses sistemas se caracterizam pelo tamanho reduzido das partículas e principalmente pela compartimentalização de fármacos em ambientes restritos, podendo, com isso, direcioná-los para regiões específicas onde deverão exercer o efeito farmacológico, favorecendo a interação com sistemas biológicos, além de poder controlar a velocidade de liberação sem alterar a estrutura química da molécula transportada (MAINARDES et al., 2005, MOURÃO et al., 2005). Revisão Bibliográfica 33 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Além da vantagem econômica, o desenvolvimento de novos sistemas para liberação de fármacos, como lipossomas, microemulsões, cristais líquidos, micro/nanopartículas e dispersões sólidas, tem permitido o aumento da eficiência de fármacos utilizados na terapêutica atual, a re-introdução de outros anteriormente descartados por suas propriedades indesejáveis e o aprimoramento de novos fármacos antes que sejam utilizados na terapêutica (MAINARDES et al. 2006; URBAN, 2004). O estudo de microemulsões e cristais líquidos como alternativa de novos sistemas de liberação de componentes ativos tem se intensificado com os objetivos de aumentar a solubilidade e a estabilidade de componentes ativos, possibilitando a incorporação de componentes hidrofílicos ou lipofílicos, agindo como sistemas reservatórios, melhorando a biodisponibilidade e estabilidade dos fármacos, reduzindo a dose de fármacos (HOELLER; KLANG; VALENTA, 2008; HEUSCHKEL; GOEBEL; NEUBERT, 2008; FORMARIZ et al., 2005). Microemulsões (ME) são sistemas opticamente transparentes ou translúcidos, pouco viscosos, termodinamicamente estáveis e sua formação é acompanhada pela diminuição da tensão superficial do sistema, chegando a ficar próxima de zero (HOELLER; KLANG; VALENTA, 2008; HEUSCHKEL; GOEBEL; NEUBERT, 2008). São caracterizadas pela mistura de óleo, água e tensoativo, formando um sistema isotrópico e termodinamicamente estável, que se forma espontaneamente. Possuem grande capacidade de solubilização (compostos hidrofílicos e lipofílicos) e baixa viscosidade. Um filme interfacial flexível é formado e caracteriza-se por valores baixos de tensão interfacial (10-2 mN/m) (HOELLER; KLANG; VALENTA, 2008; FORMARIZ et al., 2005). Geralmente, as MEs são sistemas esféricos com diâmetro muito pequeno, na faixa de 100 a 1000 Å, enquanto que o diâmetro das gotículas de uma emulsão estável é da ordem de 5000 Å. As MEs são classificadas como sistemas coloidais com diâmetro de partícula menor que ¼ do comprimento de onda da luz incidente, e, portanto, não espalham luz. Este fato explica porque são sistemas opticamente transparentes (HOELLER; KLANG; VALENTA, 2008; HEUSCHKEL; GOEBEL; NEUBERT, 2008; FORMARIZ et al., 2005). As microemulsões (ME) podem ser de água em óleo (A/O, quando o volume de água é baixo) ou óleo em água (O/A, quando o volume de óleo é baixo), podendo Revisão Bibliográfica 34 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva inverter de um tipo para outro pela adição de uma fase ou alteração do tensoativo. A Figura 5 mostra uma representação esquemática da organização das microemulsões. Em sistemas nos quais as quantidades de água e óleo são similares, estruturas bicontínuas são formadas (LAWRENCE; REES, 2000). Essas diferentes microestruturas podem afetar significativamente a liberação de fármacos (CORREA et. al., 2005). Figura 5. Representação esquemática das três microestruturas mais comuns de microemulsões: (a) óleo em água, (b) microemulsão bicontínua e (c) microemulsão água em óleo (adaptado de LAWRENCE; REES, 2000). Os sistemas microemulsionados podem facilitar a permeação cutânea de fármacos (PADULA; NICOLI; SANTI, 2009), provavelmente devido ao fato de possuírem quantidade significativa de tensoativo, que pode interagir com o estrato córneo e desestruturar a camada lipídica da pele, fazendo com que os lipídios passem de uma forma cristalina para uma forma líquida desordenada, aumentando a permeabilidade cutânea e facilitando a penetração de substâncias que normalmente não atravessariam essa barreira (KREILGAARD, 2002). As microemulsões são exemplos de formulações que podem aumentar a penetração através do estrato córneo. Isto pode ocorrer pelos seguintes mecanismos: a composição e estrutura destes sistemas permitem incorporar quantidades de fármacos maiores que outras formulações tópicas convencionais, como loções, cremes e géis; podem aumentar a solubilidade de fármacos pouco solúveis em água através da fase oleosa; podem, através de sua composição, aumentar a estabilidade do fármaco, modificar a barreira de difusão da pele, podendo favorecer sua liberação na pele, sem, contudo, induzir alterações Revisão Bibliográfica 35 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva significantes e irreversíveis à função barreira da pele (BAROLI et al., 2000; URBAN, 2004). A composição e propriedades destes sistemas têm permitido uma melhor aplicabilidade e utilização das microemulsões como sistemas de liberação de fármacos em diferentes vias de administração (BAROLI et al., 2000). A utilização de microemulsões como sistemas capazes de modular a liberação transdérmica de fármacos e o potencial destes sistemas tem sido descrito e discutido por vários autores (HOELLER; KLANG; VALENTA, 2008; HEUSCHKEL; GOEBEL; NEUBERT, 2008; SARCIAUX et al., 1995; OLIVEIRA et al., 2004). Dependendo da composição da ME, a barreira difusional da pele pode ser modificada o que poderá favorecer o particionamento do fármaco na pele. Estes sistemas podem ainda modular a liberação local ou sistêmica de fármacos através de diferentes mecanismos. (HOELLER; KLANG; VALENTA, 2008; FORMARIZ et al., 2005; BAROLI et al., 2000). Por esta razão, esses sistemas têm se tornado foco de grande interesse para administração cutânea, com o objetivo de se obter um efeito do fármaco mais localizado, o que poderá ser acompanhado de uma diminuição da sua absorção sistêmica, uma vez que esta absorção muitas vezes não é necessária, como nas dermatomicoses. A organização espontânea de tensoativos em meios aquosos pode resultar em outras estruturas além de microemulsões, como por exemplo, fases líquido- cristalinas. Os cristais líquidos são estruturas ordenadas com arranjo molecular contendo regiões hidrofóbicas e hidrofílicas alternadas. Alterando a composição dos sistemas, podem ser formadas diferentes formas líquido-cristalinas, como lamelares, hexagonais e cúbicas. Os cristais líquidos são utilizados na liberação de fármacos devido a sua alta viscosidade, podendo prolongar a liberação dos mesmos. Além disso, possuem uma área interfacial interna, com características físico-químicas diferentes da área externa, formando microambientes distintos, que permitem compartimentalizar fármacos lipossolúveis e hidrossolúveis (BOYD et al., 2006; KREILGAARD, 2002). Os cristais líquidos são sistemas cujas características físicas os posicionam entre sólidos e fundidos, com parcial ordem/desordem das espécies moleculares. Por esse motivo, são também chamados de mesofases. Mesofases liotrópicas Revisão Bibliográfica 36 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva contêm, no mínimo, dois componentes: o componente orgânico, por exemplo, tensoativo e seu solvente. A porção orgânica deve exibir certa complexidade química, do contrário, o solvente iria simplesmente solubilizar a molécula, originando soluções de moléculas dispersas e desordenadas, e certamente não seriam formados cristais líquidos. A adição de um solvente, tal como a água, irá hidratar seletivamente a porção hidrofílica das moléculas de tensoativo, evitando as regiões hidrofóbicas (FORMARIZ et al., 2005; HYDE, 2001). As mesofases liotrópicas podem ser consideradas um arranjo molecular de micelas ordenadas, caracterizadas por domínios hidrofóbicos e hidrofílicos alternadamente. Conforme aumenta a concentração de tensoativo, diferentes mesofases líquido-cristalinas podem ser formadas, como lamelares, hexagonais e cúbicas (Figura 6). Materiais que formam cristais líquidos pela adição de solventes são chamados liotrópicos, enquanto os termotrópicos têm sua estrutura dependente da temperatura (GABBOUN et al., 2001). A fase lamelar é formada por camadas paralelas e planares de bicamadas de tensoativo separadas por camadas de solvente, formando uma rede unidimensional. Já na fase hexagonal, os agregados são formados pelo arranjo de cilindros longos formando estruturas bidimensionais. Nos sistemas de fase cúbica, as moléculas estão arranjadas numa estrutura tridimensional, a qual consiste de duas redes congruentes de canais de água envolvidos por bicamadas lipídicas ou de tensoativo (FORMARIZ et al., 2005). Revisão Bibliográfica 37 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Figura 6. Representação esquemática das estruturas mais comuns formadas, dependendo do parâmetro de empacotamento (ditado pela geometria da molécula), teor de água e temperatura. Adaptado de BORNÉ; NYLAMDER; KHAN (2001). Para entender a formação destas estruturas, deve-se levar em consideração a composição do sistema, presença de sais, óleos e co-tensoativos, temperatura e estrutura do tensoativo. Para formação de estruturas lamelares, os tensoativos normalmente têm a forma cilíndrica, e na formação da fase hexagonal e micelar, ele ocupa a área de um cone. Para entender qual tipo de estrutura do tensoativo é preferencial para formar determinado sistema, pode ser considerado o parâmetro de empacotamento crítico (PEC), definido como PEC=v/a.l, em que v é o volume da cadeia hidrofóbica, a é a área da cabeça polar e l é o comprimento da cadeia hidrofóbica. Como pode ser visto na Figura 6, há uma correlação direta entre os valores de PEC e o tipo de agregado formado (MALMSTEN, 2002). Esses sistemas nanoestruturados oferecem uma série de vantagens, como alto potencial de solubilização de fármacos pouco solúveis, estabilidade termodinâmica, transporte facilitado através de membrana, capacidade de agir como sistemas reservatórios e modificar a liberação, permitem a incorporação de grandes quantidades de fármacos e possibilitam a administração de componentes ativos por Revisão Bibliográfica 38 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva várias vias, como a oftálmica, oral, intravaginal, pulmonar, cutânea, transdérmica, periodontal e intranasal (URBAN, 2004; MAINARDES et al., 2006, BRUSCHI et al., 2006; BRINON et al., 1999; LEE; KELLAWAY, 2000; URBAN, 2004; FORMARIZ et al., 2005). As interações fármaco-sistema desempenham importante papel no controle da liberação. O perfil de liberação de fármacos incorporados em sistemas líquido cristalinos dependerá da estrutura da mesofase assim como das características físico-químicas do fármaco. Essas propriedades tornam possível a utilização de cristais líquidos como veículos transportadores de fármacos, os quais devem ser capazes de controlar a liberação das substâncias neles incorporados (GABBOUN et al., 2001). Como consequência da interação fármaco-solvente, fármacos incorporados nos sistemas podem induzir mudanças no empacotamento molecular do tensoativo na mesofase líquido cristalina (FARKAS et al., 2001). 2.3.1 DIAGRAMA DE FASES O comportamento de fase de um sistema microemulsionado ou de cristal líquido, constituído de óleo, água e tensoativo, pode ser representado por um diagrama de fase ternário, que descreve as condições em que os componentes devem ser combinados para formar um sistema específico. As microemulsões podem conter componentes adicionais como co- tensoativos. No caso em que quatro ou mais componentes estão sendo estudados, diagramas de fase pseudoternários são utilizados e um dos vértices do diagrama representa uma mistura binária de dois componentes como tensoativo/co-tensoativo, água/fármaco ou óleo/fármaco. A construção de diagrama de fases proporciona a visualização das diferentes fases formadas com o sistema (Figura 7) (SAULNIER et al., 2008; PAUL; MOULIK, 2001; LAWRENCE; REES, 2000). O procedimento mais empregado para a construção do diagrama de fases é a preparação de uma série de misturas binárias e titulação com o terceiro componente, avaliando a mistura após cada adição, podendo necessitar aquecimento ou sonicação (LAWRENCE; REES, 2000). Representados como triângulos equiláteros, a grande vantagem dos diagramas de fase é que eles mostram tanto a proporção de cada componente utilizado (diagrama de pontos), bem como as regiões de domínio dos diferentes Revisão Bibliográfica 39 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva sistemas encontrados (diagrama de linhas). A Figura 7 representa um modelo de diagrama de fases, com as linhas traçadas direcionadas ao infinito de fase aquosa, isto é, convergentes ao vértice do triângulo que representa 100% de fase aquosa, semelhante ao que ocorre na titulação. Figura 7. Representação esquemática de um diagrama de fases. 2.3.2 COMPOSIÇÃO DOS SISTEMAS Um parâmetro muito importante relacionado ao desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos é, sem dúvida, a escolha dos componentes da formulação. Essa escolha deve ser bastante criteriosa e atender alguns requisitos, em especial os relacionados à toxicidade, irritabilidade, capacidade de solubilização do fármaco a ser incorporado no sistema, bem como capacidade de formar o sistema desejado (KREILGAARD, 2002; LAWRENCE; REES, 2000). Os agentes tensoativos são fundamentais na estabilização dos sistemas coloidais. Sistemas de liberação de fármacos estabilizados com tensoativos não iônicos são, geralmente, menos afetados pela presença de aditivos (tampão, eletrólitos e conservantes) e mudanças no pH, quando comparados aos tensoativos iônicos, além de serem mais seguros e menos susceptíveis em causar irritação (GARTI et al., 2004; KREILGAARD, 2002). Revisão Bibliográfica 40 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva Quando os tensoativos são incorporados em misturas imiscíveis de óleo e água, a molécula de tensoativo forma um filme na interface óleo-água estabilizando a mistura tornando o sistema mais estável termodinamicamente. Quando dispersos em água, os tensoativos se auto-organizam em uma variedade de fases e a natureza desta organização depende de forças intermoleculares bem como da entropia do sistema (LAWRENCE; REES, 2000). Os tensoativos são substâncias caracterizadas pela presença de uma região polar e outra apolar em suas estruturas moleculares, as quais são definidas, principalmente, pelo equilíbrio apresentado entre a parte polar e a apolar do tensoativo empregado, denominado equílibrio-hidrófilo-lipófilo (EHL). Valores de EHL inferiores a dez indicam predominância da parte apolar nessas substâncias, tornando-as adequadas para o preparo de emulsões A/O. Ao contrário, valores superiores a oito ou dez apontam a prevalência da região polar e o emprego dessas substâncias na obtenção de emulsões O/A. No entanto, nem sempre o valor de EHL do tensoativo consegue explicar o fenômeno de formação de microemulsão. Por exemplo, para o tensoativo álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP (PROC), que apresenta EHL de 15, a região de microemulsão ocorre quando há o predomínio de certa quantidade de fase oleosa sobre aquosa. Assim, o mais importante para a estabilização deste sistema é a diminuição da tensão interfacial da dispersão, como forma de reduzir a energia livre derivada da expansão da área interfacial. A estabilidade de sistemas dispersos deverá ser maior, quanto menor for a energia livre remanescente da expansão da área interfacial, tendendo a um sistema termodinamicamente estável, caso o aumento da energia livre seja totalmente compensado pela diminuição da tensão interfacial. A estabilização destes sistemas requer que o tensoativo tenha baixa solubilidade nas fases aquosa e oleosa, resultando na adsorção deste na interface óleo-água para provocar abaixamento da tensão interfacial (OLIVEIRA et al., 2004; DÉBORA, 2002). Dentre os tensoativos, os derivados da classe dos polioxietilenos e polioxipropilenos têm sido muito utilizados. O álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP (Figura 8), cujo INCI (International Nomenclature of Cosmetic Ingredient) é PPG-5 CETETH-20 (PROC) e são comercializados com os nomes comerciais de Procetyl AWS® ou Acquasolv®, é um tensoativo não iônico, que se apresenta como um líquido transparente ou ligeiramente turvo, incolor, odor leve e Revisão Bibliográfica 41 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva característico, EHL=15, pH (sol. aquosa 3%, 25oC) = 5,5-7,5, densidade relativa = 1,050 e completamente solúvel em água e etanol. Não é irritante para pele e DL50 (oral, ratos) de 3050 mg.kg-1 (CRODA DO BRASIL, 2002). Figura 8. Estrutura molecular do PPG-5-CETETH-20. As características físicas, químicas e físico-químicas, tais como a solubilidade e coeficiente de partição óleo-água do tensoativo e das fases oleosa e aquosa, assim como as proporções dos componentes, são fatores essenciais na formulação destes sistemas nanoestruturados. Recentemente, foram desenvolvidos sistemas coloidais estabilizados com álcool cetílico etoxilado e propoxilado, água e diferentes fases oleosas. Alterando as fases oleosas, foi possível obter sistemas com diferentes formas de agregação, com diferentes concentrações dos componentes (CARVALHO et al., 2011; CARVALHO et al., 2009; LANDGRAF, 2006). Urban (2004) verificou que sistemas compostos por PROC, água e miristato de isopropila apresentaram sistemas com diferentes estruturas em função da variação da proporção entre os componentes. Foi observado também que a capacidade de solubilização da dexametasona nestes sistemas foi maior que em seus componentes isolados, sendo possível a incorporação de uma concentração 10 vezes maior que a dose farmacológica utilizada. Neste trabalho, observou-se que a formulação de cristal líquido promoveu maior permeação e retenção de dexametasona através da pele de orelha de porco que o creme empregando os mesmos componentes. Esse comportamento de fase, que forma sistemas mais estruturados dependendo da proporção de água e tensoativos, tem se mostrado bastante promissor nos sistemas de liberação de fármacos (CARVALHO, 2010a; CARVALHO, 2010b; URBAN, 2004). As fases oleosas devem ser compatíveis com o fármaco, principalmente se o fármaco de interesse é lipofílico. Moléculas oleosas grandes, de alto peso molecular, são geralmente capazes de dissolver compostos lipofílicos de vários tamanhos de Revisão Bibliográfica 42 __________________________________________________________ Hilris Rocha e Silva cadeia carbônica. Entretanto, para serem capazes de formar microemulsões, as moléculas da fase oleosa tem que estar associadas e penetrar no filme interfacial do tensoativo. Para facilitar a interação da fase oleosa com o filme interfacial do tensoativo, o tamanho da molécula de óleo não deve ser muito grande ou pelo menos conter ligações insaturadas (KREILGAARD, 2002). O ácido oléico, um ácido graxo monoinsaturado, também denominado ácido cis-9-octadecenóico (Figura 9), é muito utilizado como aditivo em bases de sabões e sabonetes e em cremes e emulsões cosméticas pelas suas propriedades emolientes e para recompor a oleosidade em peles ressecadas e com problemas de escamação. Ele vem sendo empregado no preparo de formulações farmacêuticas de liberação controlada, em especial para incorporação de fármacos lipofílicos (KLEIN, 2007). Figura 9. Estrutura molecular do ácido oléico. Klein (2007) verificou que formulações O/A contendo fluconazol aumentaram cerca de 4 a 5 vezes a absorção do fármaco pela membrana intestinal em comparação com solução aquosa de fluconazol. Este fármaco apresentou