RESSALVA

Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto

completo desta tese será disponibilizado

somente a partir de 25/01/2025.



  
 

 

 

 

 

 

 

ESTUDOS SOBRE O EFEITO DO NOCAUTE E DA 

SUPEREXPRESSÃO DO COMPONENTE RNA DA 

TELOMERASE (LeishTER) NOS TELÔMEROS, NO 

DESENVOLVIMENTO E NA SOBREVIDA DE Leishmania major 
 

 

 

 

 

 

BEATRIZ CRISTINA DIAS DE OLIVEIRA 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BOTUCATU, SP 

2024 



  
 

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“Julio de Mesquita Filho” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU 

 

 

ESTUDOS SOBRE O EFEITO DO NOCAUTE E DA 

SUPEREXPRESSÃO DO COMPONENTE RNA DA 

TELOMERASE (LeishTER) NOS TELÔMEROS, NO 

DESENVOLVIMENTO E NA SOBREVIDA DE Leishmania major 
 

 

 

 

 

NOME DO CANDIDATO: BEATRIZ CRISTINA DIAS DE OLIVEIRA 

ORIENTADOR: MARIA ISABEL NOGUEIRA CANO 

 

 

 

 

Tese apresentada ao Instituto de Biociências, 

Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do 

título de Doutora no Programa de Pós-graduação 

em Ciências Biológicas (Genética). 

 

 

 

 

BOTUCATU, SP 

2024 

 



 Oliveira, Beatriz Cristina Dias de.   
Estudos sobre o efeito do nocaute e da superexpressão do 

componente RNA da telomerase (LeishTER) nos telômeros, no 

desenvolvimento e na sobrevida de Leishmania major / Beatriz 

Cristina Dias de Oliveira. - Botucatu, 2024 

 

Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio 

de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu 

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano 

Capes: 20202008 

 

1. Telomerase. 2. Telômero. 3. Autofagia. 4. Fatores de 

virulência. 5. Leishmania major. 

 

 
  

 
 

Palavras-chave: Autofagia; Baixo índice de infectividade; 

Encurtamento dos telômeros; L. major TER nocaute; SHAPE-MaP. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO 

TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP 

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA A. CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188    

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 
 

 

 

  

 

 

 



 

 
 

 



Dedicatória 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedico este trabalho ao meu avô, José 

Chrispim da Silva, que plantou a sementinha da 

pós-graduação em minha cabeça com um de seus 

poemas. À minha mãe que sempre enfatizou que a 

coisa mais valiosa que ela poderia proporcionar a 

mim e a minha irmã era o estudo, pois isso 

ninguém tira de nós. E aos meus sobrinhos, 

Carolina, Eduardo e Gael que representam o futuro 

e a esperança em minha vida. 

 

Eu amo vocês. 

 

 



Agradecimentos 

 

Durante todo esse período de pós-graduação tive a sorte de ter ao meu lado pessoas que de 

alguma forma deixaram essa caminhada mais leve. Dessa forma não poderia deixar de destacar 

meus mais profundos agradecimentos: 

À Deus, por guiar meus passos e por me abençoar durante todo meu caminho.  

À minha família, por todo apoio e incentivo aos estudos, pelos ensinamentos e pelo amor. Em 

especial agradeço minha mãe Sol, meu pai Cláudio, minha irmã Aline, meus sobrinhos Carolina 

e Eduardo, meu cunhado Ricardo e meu vô Zé. Essas pessoas tiveram um papel muito 

importante na minha formação, seja na vida pessoal como na profissional. Estiveram sempre 

me apoiando e torcendo por mim. Minha conquista também é de vocês. E aos meus doguinhos, 

Floquinho e Belinha, que me alegravam toda vez que eu chegava em casa cansada e estressada.  

Ao meu esposo, Victor de Oliveira Esteves por me apoiar desde o início e por sempre ter 

acreditado em mim quando nem eu mesma acreditava. Obrigada por sempre me falar o quanto 

tinha orgulho de mim, pelas massagens nos meus ombros e braços cansados do trabalho, e por 

entender que em muitos dias o que eu queria era apenas dormir e comer. Você é um dos pilares 

da minha vida e seu apoio foi fundamental.  

À minha segunda família, Oliveira e Esteves, que me acolheram de braços abertos. Uma 

grande, alegre e amorosa família.  

Aos meus amigos, que ao longo da jornada escutaram minhas reclamações e vibraram com 

minhas vitórias. Em especial aos meus amigos do LabTelo, com os quais compartilhei minhas 

frustações, alegrias, bancada, soluções e experimentos. 

À minha orientadora, Dra. Maria Isabel Nogueira Cano, que me acolheu em seu laboratório de 

braços abertos, e que durante todos esses anos sempre me incentivou a voar alto, a dar o meu 

melhor e a não desistir. Posso dizer que tive muita sorte de ter a Bel como orientadora, pois ela 

realmente me orientou, me desafiou, me ajudou, confiou em meu trabalho e sempre se fez 

presente. Tenho uma profunda admiração pela profissional que ela é, pelo coração gigante que 

possui e pelo senso de justiça.  

À UNESP e ao Instituto de Biociências de Botucatu. Sempre foi meu sonho fazer parte dessa 

instituição, e esse sonho se tornou realidade na pós-graduação. Foram anos incríveis, com 

profissionais excelentes que contribuíram para minha formação.  



Ao Chakrabarti’s lab da University of North Carolina at Charlotte (UNCC) por me receberem 

durante seis meses de estágio. Em especial ao Dr. Kausik Chakrabarti pelos muitos 

ensinamentos.  

Às agências de fomento que tornaram possível minha jornada acadêmica: ao CNPq (Conselho 

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), processo n° 143311/2019-0 - 

GM/GD-Cotas do Programa de Pós-Graduação, pelo apoio durante os 4 meses de mestrado, 

que antecedeu a transição para o doutorado direto; à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento 

de Pessoal de Nível Superior) – Código de Financiamento 001, processo n° 

88887.470062/2019-00, pelo suporte nos dois primeiros meses de doutorado; e à FAPESP 

(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), processo n° 2019/25985-6, pela 

concessão de bolsa no país, e processo n° 2022/05039-1, pela concessão de bolsa de estágio no 

exterior (BEPE). Expresso minha sincera gratidão e reconhecimento a essas agências, cujo 

apoio é fundamental para o avanço científico do nosso país. Que continuem sendo reconhecidas 

e valorizadas por seu papel essencial na promoção da pesquisa e do desenvolvimento científico. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Epígrafe 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima.” 

Louis Pasteur 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resumo 

 

Parasitos do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença tropical negligenciada que 

afeta pessoas em todo o mundo. A doença apresenta diferentes manifestações clínicas, alta taxa 

de incidência e vai desde lesões auto curáveis até a forma letal, conhecida como leishmaniose 

visceral. Apesar de muitos esforços, até agora não existem vacinas e protocolos de tratamento 

eficientes disponíveis e, portanto, encontrar novos alvos terapêuticos é crucial. Os telômeros, 

extremidades físicas dos cromossomos de eucariotos, são essenciais para manter a estabilidade 

do genoma e têm sido considerados alvos potenciais contra parasitos. Em Leishmania spp. os 

telômeros são compostos por repetições conservadas do tipo TTAGGG, mantidas pela 

telomerase, uma ribonucleoproteína minimamente composta pelos componentes TERT 

(transcriptase reversa da telomerase) e TER (RNA da telomerase). Na maioria dos eucariotos o 

TER é uma molécula única e contém a sequência molde copiada pela TERT durante a elongação 

dos telômeros. Sua estrutura secundária contém domínios com funções de controle da inserção 

de nucleotídeos pela TERT, reconhecimento da sequência telomérica e de ligação com 

proteínas acessórias. Em 2014 nosso grupo identificou e caracterizou parcialmente o 

componente TER da telomerase de Leishmania (LeishTER). O presente trabalho visa desvendar 

os papéis biológicos desempenhados pelo componente TER de Leishmania major (LeishTER) 

na homeostase do parasito. Para isso obtivemos uma linhagem celular knockout (LmTER-/-) que 

apresentou alterações no perfil de proliferação do parasito, divisão celular e replicação do DNA, 

principalmente nas primeiras passagens in vitro. Durante o crescimento contínuo, LmTER-/- 

apresentou arrest parcial do ciclo celular G0/G1, encurtamento progressivo dos telômeros e 

maior porcentagem de fosforilação da histona γH2A. Além disso, alterações ultraestruturais 

características da autofagia foram detectadas sem que as células apresentassem danos no DNA 

ou fenótipos de apoptose. LmTER-/- promastigotas diferenciam-se em metacíclicos 

apresentando índice de infectividade in vitro menor que o controle Lm007. Curiosamente, o 

addback de LeishTER não retornou o comprimento dos telômeros aos níveis do tipo selvagem, 

corroborando resultados preliminares que mostram que a expressão epissomal de TER, 

semelhante à sua ablação, tem um efeito negativo dominante na vida do parasito, o que pode 

ser um potencial alvo terapêutico contra a leishmaniose. Além disso, resultados preliminares 

que visam acessar a estrutura secundária de LeishTER através da acilação seletiva de 2'-

hidroxila analisada por extensão de primer e perfil mutacional (SHAPE MaP) com o uso de 2-

metilnicotínico imidazolide (NAI) confirmaram algumas estruturas já descritas pelo nosso 

grupo, incluindo a Hélice II (TBE), o molde e a hélice proximal ao modelo (TPH). A estrutura 

inicial de ~100 nt de LeishTER se assemelhou à de TbTR (TER de Trypanosoma brucei), com 

um motivo 5' CCGUCA 3' na extremidade 3' proximal a TBE, similar a TBE de Tetrahymena 

thermophila. Nucleotídeos na base de TPH mostraram baixa reatividade, indicando rigidez, 

enquanto o ápice apresentou reatividade. O molde de LeishTER compreende principalmente 

elementos de cadeia simples, exceto por alguns nucleotídeos que sugerem envolvimento em 

interações de longo alcance ou transitórias. Entretanto, experimentos adicionais são necessários 

para confirmação e uma compreensão completa da estrutura de LeishTER. 

 

Palavras-chave: L. major TER nocaute; alteração da proliferação; encurtamento dos telômeros; 

sinalização de danos ao DNA; autofagia; baixo índice de infectividade; CRISPR/Cas9; SHAPE-

MaP. 

 

 



Abstract 

 
Parasites of the genus Leishmania cause leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects 

people worldwide. The disease has different clinical manifestations, a high incidence rate and 

ranges from self-healing lesions to the lethal form known as visceral leishmaniasis. Despite 

many efforts, until now there are no vaccines and efficient treatment protocols available and 

therefore finding new therapeutic targets is crucial. Telomeres, the physical ends of eukaryotic 

chromosomes, are essential for maintaining genome stability and have been considered 

potential targets against parasites. In Leishmania spp. telomeres are composed of conserved 

TTAGGG-like repeats maintained by telomerase, a ribonucleoprotein minimally composed of 

TERT (telomerase reverse transcriptase) and TER (telomerase RNA) components. In most 

eukaryotes, TER is a single molecule and contains the template sequence copied by TERT 

during telomere elongation. Its secondary structure contains domains with functions to control 

the insertion of nucleotides by TERT, recognition of the telomeric sequence and binding with 

accessory proteins. In 2014 our group identified and partially characterized the TER component 

of Leishmania telomerase (LeishTER). The present work aims to unravel the biological roles 

played by the TER component of Leishmania major (LeishTER) in the parasite's homeostasis. 

For this, we obtained a knockout cell line (LmTER-/-) that showed alterations in the profile of 

parasite proliferation, cell division and DNA replication, mainly in the first passages in vitro. 

During continuous growth, LmTER-/- showed partial arrest of the G0/G1 cell cycle, progressive 

telomere shortening and a higher percentage of histone γH2A phosphorylation. Furthermore, 

ultrastructural alterations characteristic of autophagy were detected without the cells showing 

DNA damage or apoptosis phenotypes. LmTER-/- promastigotes differentiate into metacyclics 

with an in vitro infectivity index lower than the Lm007 control. Interestingly, the LeishTER 

addback did not return telomere length to wild-type levels, corroborating preliminary results 

showing that episomal TER expression, similar to its ablation, has a dominant negative effect 

on parasite lifespan, which may be a potential therapeutic target against leishmaniasis. 

Additionally, preliminary results aiming to access the secondary structure of LeishTER through 

selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE 

MaP) using 2-methyl nicotinic imidazolide (NAI) confirmed some structures previously 

described by our group, including Helix II (TBE), the template, and the template proximal helix 

(TPH). The initial structure of ~100 nt of LeishTER closely resembled that of TbTR 

(Trypanosoma brucei TER), with a 5' CCGUCA 3' motif at the 3' end proximal to TBE, similar 

to TBE in Tetrahymena thermophila. Nucleotides at the TPH base showed low reactivity, 

indicating rigidity, while the apex exhibited reactivity. The LeishTER template mainly 

comprised single-stranded elements, except for a few nucleotides suggesting involvement in 

long-range or transient interactions. However, additional experiments are needed for 

confirmation and a comprehensive understanding of the LeishTER structure. 

 

Keywords: L. major TER knockout; alteration of proliferation; telomere shortening; DNA 

damage signaling; autophagy; low infectivity rate; CRISPR/Cas9; SHAPE-MaP. 

 

 

 

 

 



Resumo para a sociedade 

 

Vocês já ouviram falar das leishmanioses? Elas são doenças causadas por um ser vivo bem 

pequeno impossível de observar a olho nu, chamado Leishmania. Esses organismos são parasits 

e são transmitidos através da picada do mosquito palha infectado. Existem vários tipos de 

leishmanioses, como por exemplo: leishmaniose cutânea, caracterizada por feridas na pele; e a 

leishmaniose visceral que ataca órgãos muito importantes para nossa sobrevivência, como o 

fígado e o baço, podendo levar a morte. O tipo de leishmaniose que a pessoa infectada pode 

desenvolver depende de como está seu sistema imunológico e qual tipo de Leishmania a 

infectou. Além disso, a leishmaniose é considerada uma zoonose que afeta principalmente cães 

domésticos, os quais atuam como reservatórios da doença. A Organização Mundial da Saúde 

declarou as leishmanioses como doenças de grande impacto e importância, porém elas ainda 

são negligenciadas, ou seja, mesmo afetando milhões de pessoas no mundo, incluindo o Brasil, 

ainda não há vacinas nem tratamentos eficazes para combatê-las. 

Dessa forma, é importante estudar esses parasitos para tentar encontrar um de seus pontos fracos 

que possam ser utilizados para lutar contra eles. Apesar da Leishmania ser um organismo 

unicelular e diferente de nós humanos em muitos aspectos, nós compartilhamos muitas coisas 

em comum. Então, para criar um medicamento ou uma vacina eficaz, precisamos tomar cuidado 

para encontrar algo que ataque apenas a Leishmania e que não faça mal aos seres humanos.  

Pensando nisso, nós no Laboratório de Telômeros estudamos os telômeros e a telomerase de 

Leishmania como potenciais alvos terapêuticos. Mas o que são telômeros e telomerase? 

Você já deve ter ouvido falar do DNA, nosso material genético. O DNA é como um livro de 

receitas. Nele há todas as informações necessárias para fazer você ser você. Ele é o centro de 

informações das nossas células (pequenos “blocos” que constroem nosso corpo). O DNA em 

nossas células, assim como na Leishmania estão organizados em moléculas lineares 

denominadas cromossomos. E assim como um livro possui capa, nosso DNA também tem uma 

“capa” para protegê-lo, chamada de “Telômeros”. Esses telômeros ficam nas pontas dos 

cromossomos protegendo todas as informações contidas nele. Porém, assim como as capas dos 

livros vão se desgastando ao longo do tempo, os telômeros também vão, e nesse caso seu 

desgaste causa seu encurtamento. Se esses telômeros ficarem bem curtinhos, isso pode ser um 

problema para a célula, já que seu centro de informações, o DNA, ficará desprotegido, com 

possibilidade de perdê-las. Para tentar resolver essa situação, temos a participação de uma 

personagem muito importante, a telomerase. Ela funciona como uma máquina de elongar 

telômeros e consegue produzir mais telômeros nas pontas do DNA, ajudando-o a recuperar o 

que estava sendo perdido/desgastado.  

Essa telomerase é composta por algumas peças: uma peça se chama TERT e a outra se chama 

TER. A TERT é quem coloca a “mão na massa” e produz mais telômeros, enquanto o TER tem 

um molde que a TERT utiliza para essa produção. É como se a TERT fosse a boleira e o TER 

a forma do bolo. E da mesma forma que há várias formas de bolo, essa peça chamada de TER 

também varia muito, sendo exclusiva em cada ser vivo. Ou seja, TER de Leishmania é diferente 

do TER de humanos, apesar de terem a mesma função. E com isso, ele pode ser o “ponto fraco” 

que procuramos para combater a Leishmania e consequentemente as leishmanioses.  

Sabendo disso, o meu projeto de doutorado busca estudar: 

• Os efeitos que a retirada e a produção em excesso do TER causa nos telômeros de 

Leishmania, e como isso afeta o desenvolvimento e o seu poder de infecção; 

• Analisar a estrutura do TER de Leishmania. 



Para tentar responder essas perguntas, muitos experimentos foram realizados, e chegamos 

aos seguintes resultados: a ausência do TER influencia no tamanho dos telômeros de forma 

negativa, ou seja, ao longo do tempo os telômeros das Leishmanias que não tem o TER vão 

encurtando, e isso prejudica seu crescimento populacional. Além disso, identificamos 

mudanças nas estruturas interiores da célula de Leishmania, mas sem afetar o material genético. 

As Leishmanias com telômeros curtos também apresentaram um baixo poder de infecção 

quando comparada com as Leishmanias controles (aquelas que ainda possuem o TER e 

telômeros intactos). Também verificamos que a superprodução do TER nas Leishmanias acaba 

tendo um efeito dominante negativo, o que significa que sua superprodução atrapalha o 

funcionamento normal da Leishmania, fazendo com que ela apresente características similares 

as Leishmania que não possuem o TER.  

Ainda temos resultados preliminares, porém ao analisarmos uma parte da estrutura do TER 

vimos que ele se parece com o TER de outro parasito chamado Trypanosoma brucei, causador 

da doença do sono. Porém, mais pesquisas estão em andamento para desvendar a estrutura 

completa do TER de Leishmania.  

Assim, esses achados indicam que o componente TER se destaca como um alvo promissor 

na busca por medicamentos inovadores contra a leishmaniose 

 

 

 
Card gerado na disciplina de “Divulgação Científica” 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Lista de figuras 

 

 

1 Introdução  

Figura 1. Principais formas do parasito do gênero Leishmania nos diferentes 

ambientes durante o ciclo de desenvolvimento............................................................. 

 

18 

Figura 2. Ciclo de vida de Leishmania spp.................................................................... 19 

Figura 3. Mapa mundial contendo dados reportados de países e territórios sobre o 

estado de endemicidade das leishmanioses.................................................................... 

 

20 

Figura 4. Manifestações clínicas da leishmaniose......................................................... 22 

Figura 5. Representação dos telômeros de Leishmania spp........................................... 24 

Figura 6. Replicação semiconservativa do DNA telomérico e seu processamento........ 26 

Figura 7. Ação da telomerase nos telômeros................................................................. 27 

Figura 8. Estrutura primária do componente TERT...................................................... 29 

Figura 9. Esquema da estrutura secundaria do TER de humanos, S. cerevisiae e T. 

thermophila.................................................................................................................... 

 

31 

Figura 10. Modelo da estrutura predita para o TER de L. major (LeishTER) e TER 

de T. brucei (TbTER)..................................................................................................... 

 

32 

3.1 Capítulo 1 - The impact of knocking out the Leishmania major 

telomerase RNA (LeishTER): from altered cell proliferation to 

decreased parasite infectivity 

 

Fig 1. Knockout of LeishTER induces growth defects and arrest in the G0/G1 phase, 

mainly at early passages………………………………………………….…………… 

 

44 

Fig 2. Ablation of LeishTER causes telomere shortening in LmTER-/- during 

continuous in vitro passages…………………………………………………………...  

 

47 

Fig 3. Lower expression of TERRA29 was observed in LmTER-/- at P50……………... 48 

Fig 4. The addback of LeishTER has a dominant negative effect and did not restore 

the telomere length to the Lm007 level………………………………………………... 

 

50 

Fig 5. LmTER-/- shows higher phosphorylation of histone γH2A, although no other 

DNA damage or apoptosis signal was detected……………………………………….. 

 

52 

Fig 6. LmTER-/- exhibits intracellular alterations that indicate an autophagic process... 54 



Fig 7. LmTER-/- retains the ability to transform into metacyclic form, but its in vitro 

infectivity index is compromised…………………………………………………… 

 

56 

S1 Fig. Epissomal expression of Cas9 does not interfere with proliferation and cell 

cycle progression in L. major…………………………………………………………. 

 

81 

S2 Fig. Generation of LeishTER double knockout (LmTER-/-) was successfully 

achieved……………………………………………………………………………….  

 

83 

S3 Fig. The creation of a LeishTER overexpressor lineage, known as LmpXTER, has 

a dominant negative effect on the parasite similar to the depletion of LeishTER……… 

 

85 

S4 Fig. The reduced infectivity of BMDM by LmTER-/- was validated through a 

subsequent in vitro experiment using RAW 264.7 cells………………………...……..  

 

87 

3.2 Capítulo 2 - Structural assessment of the core domains of 

Leishmania major telomerase RNA (LeishTER) 

 

Figure 1. Strategy to map the entire LeishTER sequence……………………………... 103 

Figure 2. Confirmation of LeishTER expression in LmWT cells……………………... 106 

Figure 3. Confirmation of the presence of pTB007 plasmid in the Lm007 population... 106 

Figure 4. Quality analysis of the pre-made libraries………….……………………….  107 

Figure 5. Quality analysis of the sequencing data…………………….……………….  109 

Figure 6. SHAPE-MaP reactivity profiles……………………….……………………  110 

Figure 7. Histograms generated by ShapeMapper indicate the success of the NAI 

treatment……………………………………………………………………………… 

 

111 

Figure 8. Predicted LeishTER secondary structure obtained in-silico and by chemical 

probing………………………………………………………………………………... 

 

113 

3.3 Capítulo 3 - Geração de linhagem de Leishmania major duplo 

nocaute para o TER e para a TERT 

 

Figura 1. Mapas esquemáticos do lócus da TERT antes e depois do nocaute e 

confirmação via PCR e RT-PCR do nocaute da TERT................................................... 

 

128 

Figura 2. Confirmação do nocaute do gene da TERT por sequenciamento Sanger........ 129 

 

 

 

 



Lista de tabelas 

 

 

3.1 Capítulo 1 - The impact of knocking out the Leishmania major 

telomerase RNA (LeishTER): from altered cell proliferation to 

decreased parasite infectivity 

 

 

S1 Table. Oligonucleotide sequences……………………………………………....… 88 

S2 Table. Flow-FISH (MESF ± SD analysis) of Lm007, LmTER-/-, LmpXØ and 

LmpXTER cells.....................................................................……………...………..…  

 

91 

S3 Table. In Vitro Infectivity Assessment of LmTER-/-, Lm007 (P5 and P50), and 

LmAddBack (P50) on Balb/c Bone Marrow-Derived Macrophages (BMDM)……….. 

 

92 

  

3.2 Capítulo 2 - Structural assessment of the core domains of 

Leishmania major telomerase RNA (LeishTER) 

 

Table 1. Concentration and purity of pre-made libraries……………………………… 107 

Table S1. Oligonucleotide sequences……………………………….………………...  116 

Table S2. Information about the TruSeq barcodes……………………………….…… 116 

  

3.3 Capítulo 3 - Geração de linhagem de Leishmania major duplo 

nocaute para o TER e para a TERT 

 

Tabela 1. Sequência dos moldes sgRNAs utilizados..................................................... 126 

Tabela 2. Sequência dos iniciadores utilizados..............................................................  127 

 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Sumário 

 

 

1 Introdução.............................................................................................. 17 

1.1 O parasito Leishmania spp. e as leishmanioses......................................................... 17 

1.2 Ciclo biológico dos parasitos do gênero Leishmania................................................  18 

1.3 As leishmanioses...................................................................................................... 20 

1.4 Telômeros e telomerase............................................................................................ 23 

1.4.1 Telômeros............................................................................................................. 23 

1.4.2 Telomerase............................................................................................................ 26 

1.4.2.1 O componente Transcriptase Reversa da Telomerase (TERT)........................... 28 

1.4.2.2 O componente RNA da telomerase (TER)..........................................................  29 

1.4.2.2.1 TER em organismos modelos.......................................................................... 29 

1.4.2.2.2 TER de protozoários........................................................................................ 31 

1.4.2.2.3 Comprometimento da ação do componente RNA da telomerase causa o 

encurtamento progressivo dos telômeros....................................................................... 

 

32 

1.5 Caracterização da estrutura secundária de LeishTER através de SHAPE-MaP........ 33 

1.6 Justificativa para a investigação do RNA da Telomerase em Leishmania................ 34 

2 Objetivos................................................................................................. 35 

2.1 Geral........................................................................................................................ 35 

2.2 Específicos.............................................................................................................. 35 

2.3 Suplementares......................................................................................................... 35 

3 Materiais, métodos, resultados e discussão: introdução aos 

capítulos..................................................................................................... 

 

36 

3.1 Capítulo 1 - The impact of knocking out the Leishmania major telomerase RNA 

(LeishTER): from altered cell proliferation to decreased parasite infectivity………… 

 

37 

3.2 Capítulo 2 - Structural assessment of the core domains of Leishmania major 

telomerase RNA (LeishTER)………………………………………………………… 

 

94 

3.3 Capítulo 3 - Geração de linhagem de Leishmania major duplo nocaute para o 

TER e para a TERT........................................................................................................ 

 

122 

4 Conclusões.............................................................................................. 134 



5 Referências............................................................................................. 135 

Apêndice 1. Artigo publicado em: Frontiers in Cell and 

Developmental Biology…………………………………………………. 

 

145 

Apêndice 2. Capítulo de livro publicado em: Human Genome 

Structure, Function and Clinical Considerations................................... 

 

146 

Apêndice 3. Artigo publicado em: Cells.................................................. 147 

Apêndice 4. Capítulo de livro publicado em: Methods in Molecular 

Biology....................................................................................................... 

 

148 

Apêndice 5. Preprint publicado em: BioRxiv........................................ 149 

Apêndice 6. Preprint publicado em: BioRxiv........................................ 150 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 
 

 

17 

1 Introdução 

 

1.1 O parasito Leishmania spp. e as leishmanioses 

O gênero Leishmania recebe esse nome em homenagem a Major William Leishman, 

que em 1903 descreveu detalhadamente características de corpúsculos ovais, os quais ele 

acreditava se tratar de resíduos de tripanossomas, encontrados no baço post-mortem 

pertencente a um soldado que havia morrido em decorrência da “kala-zar”, uma febre negra 

popularmente conhecida na Índia. A descoberta de uma nova espécie e um novo gênero se 

concretizou após os estudos de Leishman serem analisados juntamente aos estudos do Capitão 

Charles Donavan por Major Ross que após observar as amostras, chegou à conclusão que não 

se tratava de fragmentos de tripanossomas e sim de uma nova espécie de organismo, o qual 

nomeou de Leishmania donovani, criando assim o gênero Leishmania (Cupolillo et al., 2014; 

Ross, 1903).  

Desde então mais de 50 espécies de Leishmania foram descritas e classificadas. As 

espécies que infectam o ser humano são divididas em dois subgêneros: Viannia e Leishmania 

(Pacheco e Carvalho-Costa, 2014), sendo o subgênero Viannia restrito ao Novo Mundo, e o 

subgênero Leishmania presente tanto no Velho Mundo como no Novo Mundo (Akhoundi et 

al. 2016; Kerr, 2000; Lainson e Shaw, 1987).  

Os parasitos do gênero Leishmania pertencem a família Trypanosomatidae e ordem 

Kinetoplastida (Silva et al., 2014) que também engloba outros parasitos de importância médica 

como Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei, causadores das doenças de Chagas e do sono, 

respectivamente. Organismos pertencentes a ordem Kinetoplastida se diferenciam dos demais 

eucariotos pela presença de cinetoplasto, o qual está localizado dentro da única mitocôndria do 

parasito, que contém DNA mitocondrial em alto número de cópias (kDNA) (Neves, 2005; Silva 

et al., 2014). 

As Leishmanias são parasitos digenéticos, os quais necessitam de um hospedeiro 

invertebrado e um vertebrado para completar seu ciclo de desenvolvimento (Cupolillo et al., 

2014; Silva et al., 2014). Durante o ciclo, os parasitos passam por três principais estágios de 

desenvolvimento morfologicamente distintos, sendo eles:  

• Promastigota procíclica: possui alta capacidade proliferativa, é alongada, 

extracelular, possui um flagelo para auxiliar na mobilidade e encontra-se no trato digestório do 

hospedeiro invertebrado (insetos das espécies Lutzomya ou Phlebotomus), popularmente 

conhecido como mosquito-palha (Fig. 1) (Neves, 2005; Silva et al., 2014). 



 
 

 

 

18 

• Promastigota metacíclica: é a forma infectante do parasito sendo transmitida aos 

hospedeiros vertebrados durante o repasto sanguíneo da fêmea do inseto. Embora possua 

características similares à promastigota procíclica, seu corpo é menos alongado e seu flagelo 

mais longo, além de não serem proliferativas, ou seja, não se dividem. As metacíclicas podem 

ser encontradas no trato digestivo anterior do inseto (Fig. 1) (da Silva e Sacks, 1987; Lainson 

e Shaw, 1987; Neves, 2005).  

• Amastigota: encontrada no meio intracelular do hospedeiro vertebrado, é 

altamente proliferativa, arredondada e seu flagelo é inaparente, pois não se exterioriza (Fig. 1) 

(Neves, 2005; Silva et al., 2014).  

 

 

Figura 5. Principais formas do parasito do gênero Leishmania nos diferentes ambientes durante o ciclo de 

desenvolvimento. Imagem extraída e traduzida de Karamysheva et al. (2020).  

 

A capacidade que o parasito possui de se diferenciar, deve-se principalmente a 

alterações da expressão gênica ocasionada devido ao estresse causado por mudanças como 

diferença de temperatura, pH e nutrientes, no meio onde se encontra o parasito (Karamysheva 

et al. 2020). 

 

1.2 Ciclo biológico dos parasitos do gênero Leishmania  

Durante a hematofagia do inseto (flebotomíneo) infectado, o parasito na sua forma 

metacíclica penetra na pele do hospedeiro mamífero sendo fagocitado por neutrófilos e depois 

por macrófagos periféricos recrutados no local da lesão. Uma vez dentro do macrófago, o 

parasito se diferencia na forma amastigota, e começa a se multiplicar por fissões binárias 

sucessivas, os quais após causarem o rompimento da membrana do macrófago, são liberados 

na corrente sanguínea, podendo infectar novas células, ou serem sugados por uma nova fêmea 

do flebotomíneo durante o repasto sanguíneo (Chappuis et al., 2007). Dentro do inseto, os 

parasitos na forma amastigota se agrupam, e após aproximadamente 12 horas, eles começam a 



 
 

 

 

19 

se diferenciar em promastigotas procíclicas (Morea et al., 2021), os quais migram para o 

epitélio do trato digestório e começam a se multiplicar sucessivamente por divisão binária, 

aderindo ao epitélio pelo flagelo. Alguns parasitos podem ser eliminados com as fezes do 

mosquito, e os demais migram para a região anterior do intestino até a válvula estomodeal, 

onde se concentram e passam pela diferenciação celular denominada metaciclogênese, em que 

o tamanho do corpo celular diminui e o flagelo aumenta. As formas promastigotas metacíclicas 

resultantes dessa transformação, são extremamente móveis e infectivas e migram para a 

probóscide do inseto sendo regurgitadas e transmitidas ao hospedeiro vertebrado através da 

picada, reiniciando um novo ciclo de transmissão (Fig. 2) (Neves, 2005). Todo o ciclo de 

desenvolvimento do parasito pode ser replicado in vitro em culturas axênicas (Bates, 1994), 

facilitando a manipulação e estudos sobre a biologia, desenvolvimento e interações do parasito 

com o meio e seus hospedeiros. 

 

 

Figura 6. Ciclo de vida de Leishmania spp. Durante o repasto sanguíneo, insetos fêmeas das espécies Lutzomya 

(Velho Mundo) ou Phlebotominae (Novo Mundo), infectados com parasitos do gênero Leishmania, regurgitam 

as formas promastigotas metacíclicas no hospedeiro mamífero. Estas são fagocitadas por macrófagos e dentro da 

célula se diferenciam em amastigotas. As amastigotas se multiplicam e causam a lise celular podendo infectar 

outras células do hospedeiro ou ser absorvidas durante a hematofagia por outros insetos. Uma vez dentro do inseto, 

as amastigotas se diferenciam em promastigotas procíclicas, as quais se dividem e se diferenciam em metacíclicas, 

migrando para a probóscide do mosquito, sendo regurgitadas durante o repasto sanguíneo e assim, reiniciando o 

ciclo. Imagem extraída e traduzida de Assis et al. (2021).   

 

 

 



 
 

 

 

20 

1.3 As leishmanioses 

As Leishmanias têm uma grande importância médica, uma vez que causam 

leishmanioses, endêmicas em mais de 80 países (Fig. 3A e 3B) e caracterizadas pela sua 

complexidade e diversidade (Desjeux, 1992; WHO, 2021; Pace, 2014). Embora seja 

considerada pela Organização Mundial da Saúde doenças tropicais de grande impacto em 

países subdesenvolvidos, elas também podem ser encontradas em países desenvolvidos como 

França, Grécia e Itália (Chappuis et al., 2007; Nascimento e Santos, 2020; Pace, 2014).  

 

 

 

Figura 7. Mapa mundial contendo dados reportados de países e territórios sobre o estado de endemicidade 

das leishmanioses. a) Endemicidade da leishmaniose cutânea em 2021; b) Endemicidade da leishmaniose visceral 

em 2021. Em vermelho: países endêmicos; em rosa: casos previamente reportados; em branco: não há casos 

autóctones relatados; em cinza: não aplicável. (Fonte: 

http://apps.who.int/neglected_diseases/ntddata/leishmaniasis/leishmaniasis.html). 

 

Atualmente sabe-se que aproximadamente 20 espécies de protozoários flagelados do 

gênero Leishmania são patogênicas para o ser humano (Chappuis et al., 2007; Desjeux, 1992; 

Nascimento e Santos, 2020), cuja transmissão ocorre por aproximadamente 30 espécies de 

insetos do gênero Phlebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo) (Desjeux, 1992; 

Steck, 1974). Além do ser humano, animais domésticos e silvestres também podem ser 

https://pt.wikipedia.org/wiki/Phlebotomus
https://pt.wikipedia.org/wiki/Lutzomyia


 
 

 

 

21 

infectados, tornando-se reservatórios da doença, o que destaca sua importância veterinária 

(Desjeux, 1992).  

As diversas manifestações clínicas das leishmanioses podem variar de acordo com a 

interação entre a espécie infectante e o sistema imune do organismo infectado (Pace, 2014; 

Reithinger et al., 2007), podendo ficar restritas ao local da picada ou induzir metástase via 

sistema linfoide do hospedeiro (Steck, 1974). Os tipos de leishmanioses são diferenciados pelas 

suas características clínicas e epidemiológicas, onde podemos destacar cinco grupos principais: 

• Leishmaniose cutânea (LC): caracterizada por lesões pontuais na pele onde 

ocorreu a picada. Elas podem variar no grau de severidade e duração, e em muitos casos a cura 

pode ocorrer sem a necessidade de tratamento (Fig. 4A) (Chappuis et al., 2007; Desjeux, 1992; 

Galvis-Ovallos et al., 2020).  

• Leishmaniose cutânea difusa (LCD): manifesta-se através de lesões espalhadas 

pela pele cuja severidade depende da condição imunológica do paciente (Fig. 4B) (Carregal et 

al., 2019).  

• Leishmaniose mucocutânea (LMC): caracteriza-se pelas lesões nas mucosas do 

nariz, boca, faringe e laringe, o que pode levar a destruição do septo nasal, e outras estruturas 

da nasofaringe (Fig. 4C) (Chappuis et al., 2007; Desjeux, 1992; Pace, 2014). 

• Leishmaniose visceral (LV): também conhecida como leishmaniose calazar, é a 

manifestação mais severa da doença e foi descrita pela primeira vez na Índia. Entre os sintomas 

dessa doença podemos destacar a febre prolongada, hepatomegalia e esplenomegalia (aumento 

do fígado e do baço, respectivamente), pancitopenia, anemia, perda de peso e quando não 

tratada pode levar a morte (Fig. 4D) (Chappuis et al., 2007; Desjeux, 1992; Galvis-Ovallos et 

al., 2020; Nascimento e Santos, 2020).  

• Leishmaniose dérmica pós-calazar (LDPC): considerada uma complicação da 

leishmaniose visceral, ela pode se manifestar meses ou até anos após o término do tratamento 

da LV, sendo caracterizada por erupções cutânea, pápulas ou nódulos na pele. Esse tipo de 

manifestação é mais comumente observado em regiões da África e Ásia (Fig. 4E) (OP, 2020; 

Pace, 2014). 



 
 

 

 

22 

 

Figura 8. Manifestações clínicas da leishmaniose. a) Leishmaniose cutânea; b) Leishmaniose cutânea difusa; c) 

Leishmaniose mucocutânea; d) Leishmaniose calazar, e) Leishmaniose dérmica pós-calazar. Fonte: Atlas 

interactivo de leishmaniasis en las Américas: aspectos clínicos y diagnósticos diferenciales. 

 

Segundo a Organização Pan-Americana de Saúde (OPAs), 90% dos casos de 

leishmaniose visceral estão concentrados no Brasil, Índia, Sudão, Sudão do Sul, Etiópia e 

Quênia; e 75% dos novos casos de leishmanioses cutâneas no mundo ocorrem em cinco países: 

Afeganistão, Brasil, Iran, Iraque e Síria. Já as leishmanioses mucocutâneas ocorrem 

majoritariamente na América, se destacando Brasil, Bolívia e Peru (Reithinger et al., 2007). 

Aproximadamente 30 mil novos casos de leishmaniose visceral e um milhão de casos de 

leishmaniose cutânea são registrados anualmente e entre 20.000 a 30.000 mortes ocorrem por 

ano (OPAs, 2020).  

Os tratamentos disponíveis para leishmanioses baseiam-se principalmente no uso de 

antimoniais pentavalentes (Carregal et al., 2019; Nascimento e Santos, 2020), embora 

apresentem alta toxicidade causando efeitos colaterais indesejados, e além de desenvolver 

resistência do parasito ao fármaco, eles vêm sendo utilizados há mais de 60 anos como 

tratamentos de primeira linha (Reis-Cunha et al., 2016). Outros medicamentos alternativos para 

tratar as leishmanioses incluem a anfotericina B e a miltefosina, sendo o primeiro um 

medicamento de alto custo o que o torna inviável em muitos países, e o segundo possui ação 

teratogênica, o que restringe seu uso (Nascimento e Santos, 2020; Reis-Cunha et al., 2016). 

Como não há protocolos eficazes de tratamento e profilaxia disponíveis, torna-se crucial 

encontrar novos alvos terapêuticos para combater a doença (Carregal et al., 2019).  

 

 

 



 
 

 

 

23 

1.4 Telômeros e telomerase 

1.4.1 Telômeros 

Telômeros, do grego “telos” que significa fim e “meros” parte, são estruturas 

nucleoproteicas presentes nas extremidades de cromossomos lineares (Xu, 2011), formadas por 

sequências curtas de DNA não codificante repetidas em tandem, as quais possuem uma alta 

conservação entre os eucariotos (Blackburn, 1991; Griffiths et al., 2016). Sequências do tipo 5' 

TTAGGG 3' compõem os telômeros de vertebrados e protozoários tripanosomatídeos, 

incluindo Leishmania (Cano, 2001). Os telômeros caracterizam-se pela presença de uma fita 

rica em G, que se estende além da sua fita complementar rica em C, formando assim uma 

protusão conhecida como 3' G – overhang (Blackburn et al., 2015). 

Nos terminais cromossômicos há sítios específicos de interação com proteínas 

teloméricas, tanto no DNA simples-fita como no dupla-fita, formando uma estrutura 

nucleoproteica dinâmica (Dmitriev et al., 2003). Essas proteínas, que podem interagir 

diretamente com o DNA ou se associarem a outras proteínas teloméricas, aparentemente 

influenciam no tamanho, estabilidade e proteção dos telômeros (Dmitriev et al., 2003; 

Fernandes et al., 2020). Em humanos, essas proteínas formam o complexo shelterin, composto 

por: TRF1 e TRF2, Protection of telomeres 1 (POT1), TRF1-e TRF2-Interacting Nuclear 

protein 2 (TIN2), Repressor / Activator Protein 1 (RAP1) e TIN2 e POT1 interacting Protein 

1 (TPP1). Já em Leishmania amazonensis, tripanosomatídeo com  complexo telomérico melhor 

caracterizado, podemos destacar algumas proteínas que interagem com a telomerase e com a 

fita simples de DNA rica em G: proteína de ligação de RNA 38 (LaRBP38), as proteínas de 

replicação A1 (LaRPA-1) e “calmodulin-like protein” (LCaLA) (Lira et al., 2007; Morea et al., 

2017; Neto et al., 2007) e as proteínas que se associam com a dupla fita de DNA telomérico: 

proteína de ligação de telômeros 1 (LaTBP1) (Lira et al., 2007) e a proteína fator de ligação a 

repetição telomérica (LaTRF) (da Silva et al., 2010) (Fig. 5). 

Além das proteínas do complexo telomérico, RNAs longos não codificantes conhecidos 

como TERRA (Telomere Repeat containing RNA) (Fig.5) foram caracterizados em diversos 

organimos modelos como humanos, camundongos e leveduras de brotamento (S. cerevisiae) 

(Azzalin et al., 2007; Schoeftner & Blasco, 2008; Luke et al., 2008). A transcrição desses RNAs 

se inicia nas regiões subteloméricas e continua até as extremidades dos cromossomos, 

resultando em variabilidade na porção 5’ da molécula e conservação na região 3’, composta 

por repetições teloméricas (Rivosecchi et al., 2024). Entre as funções atribuídas aos TERRAs, 

podemos destacar sua importância na regulação telomérica e estabilidade auxiliando na 

regulação da estrutura da cromatina telomérica, na replicação do DNA nos telômeros, no 



 
 

 

 

24 

processamento das extremidades cromossômicas e na atividade da telomerase (Rivosecchi et 

al., 2024). Ademais, os TERRAs podem formam híbridos de DNA:RNA denominados R-loops 

e assumir a estrutura de RNA G4 (rG4), os quais facilitam interações com proteínas associadas 

ao TERRA. Já os R-loops também podem facilitar a recombinação homóloga nos telômeros, 

contribuindo para a estabilidade telomérica por meio de mecanismos alternativos de 

alongamento telomérico (ALT) (Rivosecchi et al., 2024). Transcritos TERRA também foram 

caracterizados em T. brucei e Leishmania spp. e em ambos os casos eles parecem também estar 

envolvidos com a manutenção dos telômeros (Damasceno et al., 2017; Morea et al., 2021). 

 

 

Figura 5. Representação dos telômeros de Leishmania spp. Os telômeros de Leishmania são formados por 

regiões subteloméricas (LCTAS), DNA dupla fita e simples fita, formando o último uma protusão conhecida como 

3’ G overhang e proteínas associadas (TBP1, RBP38, TRF, LCalA, RPA). RNAs longos não codificantes TERRA 

são transcritos a partir dos telômeros e estão envolvidos com a regulação do tamanho dos telômeros, os quais 

podem ser elongados através da ação da enzima telomerase, composta principalmente pelo componente TERT e 

TER. Imagem extraída de Assis et al. (2021).   

 

O complexo telomérico possui funções fundamentais na estabilidade do genoma, 

prevenindo que as extremidades cromossômicas sejam reconhecidas como quebra de DNA em 

dupla fita, impedindo assim, que ocorra degradação do material genético, recombinação e fusão 

dos terminais cromossômicos. Danos na estrutura telomérica ou a depleção de proteínas que 

compõe esta maquinaria, podem levar a célula ao estado de senescência ou apoptose 

(Blackburn et al., 2015; Eisenberg, 2011). Fenômeno semelhante é observado normalmente em 

células somáticas humanas que apresentam perda gradual dos telômeros após sucessivas 

duplicações (Barbé-Tuana et al., 2021; Giardini et al., 2014).  

Estas perdas ocorrem devido a uma inabilidade da DNA polimerase em completar a 

síntese de moléculas lineares (Ohki e Ishikawa, 2004). Este fenômeno é conhecido como “end 



 
 

 

 

25 

replication problem”, em português “problema do final da replicação” (Fig. 6) (Chan e 

Blackburn, 2004; Eisenberg, 2011; Olovnikov, 1973; Watson, 1972), na qual a DNA 

polimerase, que apresenta síntese de modo direcional (5' – 3'), não consegue realizar uma 

síntese regular na fita descontínua do DNA, a qual é orientada no sentido 3' – 5'. Dessa forma, 

faz-se necessário a síntese repetida de iniciadores RNA na região 5' do local de iniciação, de 

modo que a DNA polimerase consiga sintetizar novas sequências (fragmentos de Okazaki), de 

forma descontínua (Griffiths et al., 2016; Martínez e Blasco, 2015). Neste caso, o último 

iniciador envolvido na replicação da fita descontínua, próximo da extremidade 3', ao ser 

removido, não é reposto pela DNA polimerase deixando um intervalo na fita complementar 

(Griffiths et al., 2016; Martínez e Blasco, 2015). Isto gera uma protrusão simples fita na 

extremidade telomérica conhecida como 3' G-overhang (fita rica em G) (Martínez e Blasco, 

2015). Também é sabido que mesmo as fitas de síntese contínua, ao final da replicação são 

processadas por nucleases, como Apollo and Exo I, as quais promovem a ressecção do terminal 

da fita contínua (fita telomérica rica em C) de forma a gerar um terminal 3' G-overhang também 

nessa fita (Fig. 6) (Martínez e Blasco, 2015; Wu et al., 2012). Desta maneira, o encurtamento 

dos telômeros pode ocorrer nos terminais 3' das duas fitas do DNA. Assim, quando as células 

com telômeros curtos atingem o número máximo de divisões celulares, conhecido como “limite 

de Hayflick”, elas entram no estado de senescência replicativa (Chan e Blackburn, 2004; 

Eisenberg, 2011; Olovnikov, 1973; Watson, 1972). Além da divisão celular, outros fatores 

endógenos e exógenos podem influenciar o encurtamento dos telômeros tais como estresse 

oxidativo causado por processos metabólicos, ação de nucleases e agentes físicos ou químicos 

(Blackburn et al., 2015; Eisenberg, 2011). Por outro lado, sabe-se que eucariotos unicelulares, 

células germinativas, células tronco embrionárias e células somáticas altamente proliferativas 

conseguem manter o tamanho dos telômeros por ação de uma enzima especializada em 

adicionar repetições teloméricas nas extremidades 3' G overhang, conhecida como telomerase 

(Autexier e Lue, 2006).  



 
 

 

 

26 

 

Figura 6. Replicação semiconservativa do DNA telomérico e seu processamento. A replicação 

semiconservativa do DNA telomérico ocorre por meio da maquinaria de replicação convencional, onde a fita 

contínua e a fita descontínua são sintetizadas pela DNA polimerase de modo unidirecional (5' – 3'). O início da 

síntese depende de um primer de RNA (linhas pontilhadas verde), o qual confere um grupo -OH livre na 

extremidade 3' para que a DNA polimerase possa começar a síntese da nova fita. Devido ao sentido da fita 

descontínua (3' – 5'), é necessário a síntese de vários primers de RNA durante sua replicação, que servem como 

iniciadores para a síntese dos fragmentos de Okazaki. Esses primers são degradados e repostos por DNA, exceto 

o último primer, que não pode ser substituído. O primer final de RNA na fita descontínua não é terminal, mas 

posicionado aleatoriamente 70-100 nucleotídeos (nt) das extremidades e, portanto, as protusões da fita G já 

exibem um tamanho quase maduro imediatamente após a replicação, onde fica evidente a especificidade da 

sequência na extremidade 5' da fita C (ATC 5'). Já a síntese da fita contínua resulta em extremidades cegas (blunt 

ends) ou apresentam uma saliência de 1 ou 2-nt consistentes com o conceito de que a máquina de replicação se 

esgota e se dissocia dos terminais cromossômicos. A fita gerada durante a síntese contínua é processada por 

nucleases 1–2 h após a replicação do telômero, para gerar uma protrusão 3' G-overhang e as fitas ricas em C 

adquirem a especificação ATC 5' no final da fase S / G2. Imagem extraída e traduzida de Martínez e Blasco 

(2015).  

 

1.4.2 Telomerase 

A possibilidade de uma célula resolver o problema do encurtamento dos telômeros 

através da adição de repetições teloméricas na extremidade 3' rica em G dos cromossomos foi 

descoberta em 1978 por Elizabeth Blackburn e Joseph Gall, ao estudarem o ciliado unicelular 

Tetrahymena thermophila. Depois foi confirmada em 1985 por Blackburn & Grieder, quando 

descobriram que esse processo era realizado por uma enzima, nomeada primeiramente de 

telomere terminal transferase, e posteriormente de telomerase.  



 
 

 

 

27 

A telomerase é um complexo ribonucleoproteico (RNP) com função de transcriptase 

reversa, possuindo um núcleo catalítico composto por uma subunidade proteica conhecida 

como transcriptase reversa da telomerase (TERT), que possui a função de adicionar as 

repetições teloméricas na extremidade 3' G–overhang, e a subunidade RNA da telomerase 

(TER), um RNA longo não codificante, que contém o molde utilizado pela TERT para realizar 

a síntese de novas repetições teloméricas além de auxiliar na processividade da enzima (Fig. 

7). Embora esses dois componentes sejam suficientes para a replicação telomérica in vitro 

(Collins, 1999), in vivo, a telomerase contém proteínas acessórias espécie-específicas que 

auxiliam na biogênese e na regulação da atividade da enzima (Lue, 2004; Webb and Zakian, 

2016). Como exemplos podemos citar as subunidades da telomerase de leveduras, a Est1p e 

Est3p, ambas importantes para o funcionamento da enzima in vivo (Giardini et al., 2014). Est1p 

interage com Cdc13 (proteína ligante do terminal 3' G-overhang) recrutando a telomerase para 

elongar os terminais dos cromossomos (Giardini et al., 2014; Yang et al., 2006). Em humanos, 

a proteína EST1A, ortóloga à Est1p, está relacionada tanto com a proteção das extremidades 

cromossômicas como pela elongação telomérica (Giardini et al., 2014). Outros exemplos de 

proteínas acessórias do complexo telomerase estão descritas na seção 1.4.2.2.1.  

 

Figura 7. Ação da telomerase nos telômeros. Na etapa de ligação (binding), a TERT interage com a repetição 

telomérica e permite que o componente TER se acople a protusão 3’G. Em seguida, a TERT sintetiza uma cópia 

de repetição telomérica na extremidade 3’OH do DNA telomérico utilizando o molde contido no TER (extension 

- extensão). Ao término da adição de uma repetição, a TERT se desloca e se reposiciona em relação a repetição 

telomérica (translocation - translocação) para dar início a um novo ciclo de amplificação. Imagem extraída de 

Giardini et al., 2014). 

 

Além da telomerase, há outros métodos alternativos para elongar telômeros (ALT, 

Alternative Lengthening of Telomeres), os quais utilizam a maquinaria de recombinação 

homóloga, de forma que uma fita de DNA homólogo é utilizada como molde para o 

elongamento de outra fita (Autexier e Lue, 2006; Podlevsky e Chen, 2016; Xu, 2011).  



 
 

 

 

28 

 

1.4.2.1 O componente Transcriptase Reversa da Telomerase (TERT) 

O componente TERT é uma DNA polimerase dependente de RNA, com função de 

transcriptase reversa, a qual utiliza o grupo 3'-OH presente no 3' G-Overhang como iniciador 

da síntese de novas sequências teloméricas (Autexier e Lue, 2006). A TERT é altamente 

conservada entre os diferentes grupos de organismos, e apresenta quatro domínios estruturais 

e funcionais e 11 motivos canônicos, onde alguns são únicos das TERTs e outros conservados 

entre as transcriptases reversas (Fig. 8) (Autexier e Lue, 2006; Zhang et al., 2011). Entre os 

domínios exclusivos das TERT pode-se citar os domínios funcionais N-Terminal (TEN - 

Telomerase Essential N-terminal) e o domínio de ligação ao RNA da telomerase (TRBD - 

Telomerase RNA Binding Domain), ambos encontrados na região amino-terminal da TERT 

(Autexier e Lue, 2006), que além de serem exclusivos das telomerases, também são essenciais 

na interação com ácidos nucleicos (DNA telomérico e o TER) e com proteínas do complexo 

telomerase (Jacobs et al., 2006).  

O domínio transcriptase reversa (RT - Reverse Transcriptase), está presente na região 

mais próxima ao carboxi-terminal, e é similar as transcriptases reversas clássicas em relação a 

estrutura, estando associado com a catálise enzimática. O domínio RT apresenta alta 

conservação estrutural contendo todos os motivos específicos das RTs (1, 2 e A-E), 

compreendidos dentro dos sub-domínios conhecidos como “dedos” (fingers) e “palma da mão” 

(palm), no qual o primeiro é responsável pela interação com ácido nucleico e o segundo contém 

o sítio catalítico da enzima (Hukezalie e Wong, 2013). O domínio CTE (C-Terminal Extention) 

representa o “polegar” (thumb) e apesar de ser importante na atividade enzimática, é uma região 

menos conservada entre os organismos de diferentes espécies, o que sugere que ele possui 

função espécie-específica (Barbé-Tuana et al., 2021; Hukezalie e Wong, 2013). 

A TERT de tripanosomatídeos, apresenta alta similaridade de sequência entre as 

espécies de Leishmania (em torno de 85 a 95%), e quando comparado ao componente TERT 

de outros organismos pode-se notar que ela apresenta características estruturais conservadas e 

substituições em resíduos de aminoácidos específicos ao gênero (Giardini et al., 2006). Assim 

como as TERTs de outros organismos, a de Leishmania é capaz de adicionar repetições 

teloméricas, nesse caso TTAGGG, na extremidade 3' da fita telomérica rica em G (Cano et al., 

1999; Giardini et al., 2006; Giardini et al., 2011). 

 



 
 

 

 

29 

 

Figura 8. Estrutura primária do componente TERT. Na região amino-terminal estão representados os 

domínios TEN e TRBD, essenciais na interação da TERT com ácidos nucleicos (DNA e RNA). Na fração carboxi-

terminal estão representados os domínios RT e CTE, sendo ambos importantes na atividade enzimática da 

telomerase. Os motivos conservados presentes em cada domínio (GQ, CP, QFP, T, 1, 2, A, B’, C, D E) estão 

mostrados. Imagem adaptada de Giardini et al. (2014). 

 

1.4.2.2 O componente RNA da telomerase (TER)  

1.4.2.2.1 TER em organismos modelos 

TER é um RNA longo não codificante que possui a sequência reversa complementar da 

repetição telomérica utilizada como molde pela TERT durante a síntese de DNA telomérico 

(Gilson e Géli, 2007). Além de ser importante na montagem do complexo ribonucleoproteico 

da telomerase, ele também auxilia na processividade da enzima (Sandhu et al., 2013; Zappulla 

e Cech, 2006). Portanto, mutações no TER podem prejudicar a interação TER-TERT levando 

ao encurtamento dos telômeros (Lin et al., 2004; Lue, 2004).  

Embora os principais elementos da estrutura secundária do TER sejam conservados 

entre diversas espécies, o tamanho e a composição da sequência variam (Theimer e Feigon, 

2006). A sequência primária pode variar de 150 nt em protozoários ciliados, a 450 nt em 

humanos, 1300 nt em leveduras de brotamento e > 2100-2200 nt em Leishmania e Plasmodium 

(Blackburn e Collins, 2011; Chen e Greider, 2004; Vasconcelos et al., 2014). 

Entre os elementos estruturais conservados pode-se citar o motivo TBE (Template 

Boundary Element) (Fig. 9), presente na porção 5' da molécula (Giardini et al., 2014) que 

fornece um local com alta afinidade de ligação com o domínio TRBD da TERT (Blackburn e 

Collins, 2011; Collins, 1999). O TBE também impede que a transcrição reversa pela TERT 

ocorra além do molde, também presente na porção 5' da molécula, próximo ao motivo TBE 

(Webb e Zakian, 2016). A região do molde (Fig. 9), na maioria dos organismos, é constituído 

por uma cópia e meia da sequência reversa da repetição telomérica, complementar a sequência 

do 3' G-overhang usado como substrato pela TERT para a adição de nucleotídeos nos telômeros 

(Lai et al., 2012). A interação TERT-TER expõe o molde contido no TER, facilitando o 

pareamento dele com a fita simples rica em G do DNA telomérico (3' G-overhang) (Webb e 

Zakian, 2016). Mutações ou deleções na sequência molde podem afetar a ação da telomerase 

causando encurtamento dos telômeros, conforme observado em Saccharomyces cerevisiae 

(Singer e Gottschling, 1994). 



 
 

 

 

30 

Outras regiões importantes para a interação TERT-TER são o pseudoknot e o STE (Stem 

Terminus Element) (Fig. 9). O pseudoknot, caracterizado como tripla hélice dentro do 

complexo RNP, forma o domínio central envolvido na interação com a TERT, juntamente com 

o motivo TBE e o molde, estando envolvidos, na montagem do complexo telomerase e sua 

atividade (Webb e Zakian, 2016; Wu et al., 2017). O STE, também denominado de CR4/CR5 

em humanos e TWJ (three-way junction) em S. cerevisiae, também está relacionado com a 

interação TERT-TER (Webb e Zakian, 2016). 

Ademais, dependendo do organismo, o TER pode se ligar a outras proteínas acessórias 

importantes para o funcionamento da telomerase in vivo, como é o caso da interação do TER 

(TLC1) com subunidades do heterodímero KU em Saccharomyces cerevisiae, que promove a 

síntese de novo de repetições teloméricas nos terminais cromossômicos (Giardini et al., 2014). 

Em Tetrahymena thermophila, a proteína p65, membro da LARP7 family, se liga no stem IV 

do componente TER (Fig. 9) auxiliando na sua biogênese, tornando-se fundamental para a 

montagem do complexo telomerase in vivo (Jiang et al., 2013).  

Já em seres humanos, o componente TER possui um domínio adicional, o domínio 

H/ACA box, presente na porção 3' do TER (Fig. 9), o qual contém o motivo CAB que interage 

com as proteínas acessórias DKC1, GAR1, NOP10 e NHP2 (Barbé-Tuana et al., 2021; Giardini 

et al., 2014), que auxiliam na montagem do complexo in vivo, o qual é então recrutado para os 

telômeros pela proteína TPP1 (POT1 interacting protein 1), integrante do complexo shelterin, 

sendo transportado pela proteína TCAB1 (Telomere Cajal Body protein 1) até os telômeros 

(Barbé-Tuana et al., 2021). Vale ressaltar que o domínio H/ACA box além de estar relacionado 

com a interação de proteínas acessórias, ele também é importante para a biogênese e 

estabilidade do TER, além de auxiliar na atividade da telomerase (Barbé-Tuana et al., 2021). 



 
 

 

 

31 

 

Figura 9. Esquema da estrutura secundaria do TER de humanos, S. cerevisiae e T. thermophila. Os TERs 

compartilham estruturas funcionais conservadas como o molde (azul), pseudoknot (laranja), motivo TBE 

(vermelho) e domínio de ligação à TERT (correspondente a CR 4/5 em H. sapiens, Stem IV em T. thermophila, 

e TWJ em S. cerevisiae) (verde). Em roxo, pode-se observar os sítios de ligação do TER às proteínas envolvidas 

na biogênese da telomerase. Imagem extraída de Wu. et al. (2017).  

 

1.4.2.2.2 TER de protozoários 

Em Tetrahymena o componente TER (159 nt) é transcrito pela RNA polimerase III e 

possui dois domínios principais: molde/pseudoknot e stem loop 4 (atuando como STE de 

ciliados) (Cash e Feigon, 2017; Greider e Blackburn, 1989). A sequência do molde é 

caracterizada como 5' CAACCCCAA 3' (Greider e Blackburn, 1989). Além disso, os ciliados 

também possuem o Template recognition element (TRE), o qual está localizado na porção 3' 

do molde, e é utilizado pela TERT para direcionar corretamente a transcrição reversa (Fig. 9) 

(Cash e Feigon, 2017). 

Já no protozoário flagelado T. brucei, TER possui ~900 nt (Fig. 9), é processado por 

trans-splicing e poliadenilado. TbTER interage com proteínas centrais do BOX C/D snoRNA 

e se associa à methyltransferase-associated protein (MTAP) (Gupta et al., 2013). O 

silenciamento ou mesmo nocaute de TbTER, levam ao encurtamento progressivo dos telômeros 

indicando que o TER é fundamental para o funcionamento da telomerase e consequentemente 

na manutenção dos telômeros em T. brucei (Gupta et al., 2013; Sandhu et al., 2013).  



 
 

 

 

32 

Em Leishmania major o componente TER caracterizado pelo nosso grupo de pesquisa 

(Fig. 10) (Vasconcelos et al., 2014), é codificado por um gene de cópia única, localizado no 

cromossomo 25. O gene também é transcrito pela RNA polimerase II o que difere dos TERs 

de ciliados, os quais são transcritos pela RNA polimerase III, como descrito acima (Greider e 

Blackburn, 1989). Em Leishmania, o transcrito gerado tem aproximadamente ~2100 nt, o qual 

é processado por trans-splicing, o que confere a molécula madura um 5' spliced leader (SL) 

cap, e uma cauda 3' poli-A comum a maioria dos TER de eucariotos (Barbé-Tuana et al., 2021; 

Vasconcelos et al., 2014). Segundo análises realizadas por Vasconcelos et al. (2014), a 

sequência do molde em LeishTER é 5' ACCUAACCCUA 3' localizada próximo ao motivo 

TBE que é altamente conservado entre os eucariotos (Podlevsky e Chen, 2016; Sandhu et al., 

2013). Além desses elementos, LeishTER também apresenta um BOX C/D snoRNA 

compartilhado com o TER de outros organismos que indica que a biogênese desse RNA pode 

ser conservada (Gupta et al., 2013; Vasconcelos et al., 2014). Ademais, em Leishmania major, 

evidenciou-se que LeishTER imunoprecipita com a TERT, co-localizando-se tanto com a 

TERT quanto com os telômeros no núcleo do parasito. (Vasconcelos et al., 2014). 

 

 

Figura 10. Modelo da estrutura predita para o TER de L. major (LeishTER) e TER de T. brucei (TbTER). 

Presença da Helix II (TBE) e a sequência do molde (template) utilizado pela TERT. As setas indicam as 

semelhanças entre as estruturas em forma de gancho imediatamente a jusante do modelo em ambos os TERs. 

Imagem extraída de Vasconcelos et al. (2014). 

 

1.4.2.2.3 Comprometimento da ação do componente RNA da telomerase causa o encurtamento 

progressivo dos telômeros 



 
 

 

 

33 

Para compreender melhor o funcionamento da telomerase vários estudos foram 

realizados. Dentre esses estudos, podemos ressaltar aqueles envolvendo o componente RNA 

da telomerase, como forma de melhor caracterizar sua importância no complexo RNP. Estudos 

com organismos modelos (Saccharomyces cerevisiae, células imortalizadas HeLa e 

camundongos) e organismos mais próximos evolutivamente de Leishmania spp. (Trypanosoma 

brucei) mostraram que a remoção, superexpressão ou o comprometimento da ação do TER 

causa o encurtamento progressivo dos telômeros. Estes estudos evidenciam que apesar da 

divergência em sequência e tamanho, TER possui função conservada entre os eucariotos, no 

que diz respeito à sua importância na formação do complexo telomerase e manutenção dos 

telômeros (Blasco, 2001; Feng et al., 1995; Sandhu et al., 2013; Singer e Gottschling, 1994).  

Além disso, sabe-se que muitas telomeropatias humanas podem estar associadas com 

mutações no TER, tais como: a) disceratose congênita autossômica dominante que causa 

leucoplasia em mucosas, pigmentação reticulada da pele e distrofia ungueal; b) anemia 

aplástica, caracterizada pela supressão da produção de células sanguíneas devido a destruição 

de células tronco hematopoética e c) fibrose pulmonar idiopática, que causa rigidez dos tecidos 

pulmonares podendo levar à morte (Armanios e Blackburn, 2012; Barbé-Tuana et al., 2021).   

 

1.5 Caracterização da estrutura secundária de LeishTER através de SHAPE-MaP 

Uma abordagem para investigar a estrutura secundária de uma molécula de RNA é a 

técnica denominada SHAPE-MaP (Acilação Seletiva de 2'-Hidroxila analisada por Extensão 

de Primer e Perfil Mutacional). Essa metodologia fornece esclarecimentos sobre a flexibilidade 

e reatividade de nucleotídeos individuais na cadeia de RNA, pois as sondas químicas utilizadas 

reagem com o RNA, induzindo modificações mapeáveis na molécula (STROBEL et al., 2018). 

Dentre as sondas químicas disponíveis, destaca-se o 2-metilnicotínico imidazolide (NAI), que 

atua de forma generalista, modificando a espinha dorsal do RNA por meio da acilação do grupo 

2'-hidroxila da ribose de nucleotídeos flexíveis (STROBEL et al., 2018). 

Considerando que a maior parte dos dados sobre a estrutura de LeishTER foi obtida 

predominantemente por meio de predições de modelagem estrutural in silico, torna-se 

imperativo buscar alternativas para esclarecer as estruturas do domínio central de LeishTER e, 

posteriormente, compará-las com os resultados previamente obtidos. Essas informações não 

apenas aprimoram nossa compreensão da estrutura molecular, mas também têm o potencial de 

contribuir para o estudo do complexo telomerase, identificando regiões de interação com outras 

proteínas do complexo além da TERT. 



 
 

 

 

34 

 

1.6 Justificativa para a investigação do RNA da Telomerase em Leishmania 

Apesar da significativa relevância da leishmaniose em âmbito global, ela continua 

sendo uma doença tropical negligenciada, carecendo de profilaxia e tratamentos eficazes, 

conforme ressaltado anteriormente (Carregal et al., 2019). Diante desse cenário, torna-se 

imperativo aprofundar a compreensão da biologia molecular do parasito, visando identificar 

novos alvos terapêuticos. 

A investigação do RNA da telomerase de Leishmania é essencial para desvendar os 

mecanismos moleculares pelos quais o parasito assegura a integridade dos telômeros, sendo 

esta capacidade importante para a estabilidade genômica. Uma característica do RNA da 

telomerase é que apesar de possuir uma função conservada, sua sequência e tamanho variam 

entre as espécies (Theimer e Feigon, 2006), sendo este componente considerado espécie-

específico, o que o torna um interessante alvo terapêutico. Desta forma, ao compreender melhor 

sua função e estrutura, podemos obter percepções valiosas para o desenvolvimento de 

estratégias terapêuticas específicas contra a leishmaniose.  

Em suma, o conhecimento adquirido sobre o RNA da telomerase de Leishmania 

auxiliará na compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na sua biogênese e do 

complexo ribonucleoproteico da telomerase e no enriquecimento do conhecimento sobre a 

importância dos telômeros na sobrevida do parasito.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
 

 

 

134 

4 Conclusões 

 
- A ausência de LeishTER causou encurtamento dos telômeros e comprometeu a 

proliferação dos parasitos, levando os mesmos a um estado semelhante a senescência 

replicativa, o que sublinha a importância de LeishTER na sobrevida do parasito. Aqui 

ressaltam-se que a ausência de LeishTER induziu alterações morfológicas e ativação de 

processos autofágicos, indicando adaptações celulares para manter a homeostase, sem 

evidências de apoptose. Embora a capacidade de transformação na forma infectiva metacíclica 

tenha sido preservada, a infectividade dos parasitos mutantes foi reduzida, sugerindo uma 

associação entre telômeros mais curtos e menor infectividade. Essas descobertas respaldam a 

noção de que a ausência de LeishTER é de certa forma deletéria para Leishmania. Além disso, 

a superexpressão de LeishTER teve um efeito dominante negativo nos parasitos, gerando 

fenótipos semelhantes aos observados nas linhagens duplo nocaute para LeishTER. Esses 

resultados evidenciam a importância da telomerase na sobrevivência e infectividade desses 

parasitos, abrindo caminho para investigações adicionais sobre os mecanismos moleculares 

subjacentes e suas possíveis implicações como potenciais alvos no tratamento da leishmaniose. 

- A técnica SHAPE-MaP usando NAI mostrou-se uma abordagem bem-sucedida para 

investigar a estrutura secundária de LeishTER. Os resultados preliminares confirmaram a 

presença de estruturas previamente preditas in silico, incluindo a Hélice II (TBE) e o molde, e 

mostram conservação da estrutura secundária do LeishTER com a de TbTR. Atualmente novos 

experimentos estão sendo conduzidos e esperamos desvendar em breve a estrutura secundária 

completa de LeishTER. 

- Estudos preliminares realizados nesse trabalho demonstraram que tanto o gene TER 

quanto o gene TERT não são essenciais para a sobrevivência do parasito, possibilitando a 

obtenção de linhagens nocautes para ambos os alelos de cada gene sem causar sua morte 

imediata. No entanto, é crucial investigar a longevidade desses parasitos em cultura e as sua 

possíveis implicações biológicas, comparando esses resultados com linhagens que têm apenas 

um dos genes ausentes. 

- Em síntese, os resultados obtidos ressaltam a importância do RNA da telomerase na 

manutenção dos telômeros, no crescimento celular e na capacidade infectiva de Leishmania 

major. Esses achados ampliam a compreensão do papel da telomerase na biologia do parasito 

e abrem caminhos para investigações futuras sobre a longevidade desses parasitos, bem como 

a presença ou ausência de mecanismos alternativos de elongamento telomérico por meio de 

recombinação homóloga.  



 
 

 

 

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	As Leishmanias têm uma grande importância médica, uma vez que causam leishmanioses, endêmicas em mais de 80 países (Fig. 3A e 3B) e caracterizadas pela sua complexidade e diversidade (Desjeux, 1992; WHO, 2021; Pace, 2014). Embora seja considerada pela...
	As diversas manifestações clínicas das leishmanioses podem variar de acordo com a interação entre a espécie infectante e o sistema imune do organismo infectado (Pace, 2014; Reithinger et al., 2007), podendo ficar restritas ao local da picada ou induzi...
	• Leishmaniose cutânea (LC): caracterizada por lesões pontuais na pele onde ocorreu a picada. Elas podem variar no grau de severidade e duração, e em muitos casos a cura pode ocorrer sem a necessidade de tratamento (Fig. 4A) (Chappuis et al., 2007; De...
	Cultivation and growth curves
	Establishment of experimental lineages
	Data availability
	Ethics statement
	Author contributions


	Linhagem de L. major duplo nocaute para a TERT e TER (LmTER-/-/LmTERT-/-) foram obtidas com sucesso