UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE MEDICINA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Marcela Alexandrino 

 
 
 
 

Análise Espacial e Pesquisa Molecular do Complexo 
Mycobacterium tuberculosis em Amostras de Leite 
Bovino de Tanques de Resfriamento de Pequenas 

Propriedades de Agricultura Familiar  
 
 
 
 
 
 

Dissertação apresentada à Faculdade de 
Medicina, Universidade Estadual Paulista 
“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de 
Botucatu, para obtenção do título de Mestre 
em Doenças Tropicais 

  
  
  
 
 
 

 

Orientadora: Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis 
Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Mattos dos Santos 

Coorientadora: Dra. Maria Izabel Merino de Medeiros 
 
 
 
 
 

Botucatu 
2023 

 



 
2 

 

Marcela Alexandrino 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
ANÁLISE ESPACIAL E PESQUISA MOLECULAR DO COMPLEXO 

Mycobacterium tuberculosis EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO DE 
TANQUES DE RESFRIAMENTO DE PEQUENAS PROPRIEDADES DE 

AGRICULTURA FAMILIAR 
  
  

 
 
 
 

Dissertação apresentada à 
Faculdade de Medicina, 
Universidade Estadual Paulista 
“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus 
de Botucatu, para obtenção do 
título de Mestre em Doenças 
Tropicais.  

  
  
  
  
 
 
 
 
 
 

Orientadora: Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis 
Coorientador: Prof. Dr. Rodrigo Mattos dos Santos 

Coorientadora: Dra. Maria Izabel Merino de Medeiros 
 
 
 
 

Botucatu 
2023 



FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. 

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP 

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651  
 

   

 Alexandrino, Marcela. 
   Análise espacial e pesquisa molecular do complexo 

Mycobacterium tuberculosis em amostras de leite bovino de 

tanques de resfriamento de pequenas propriedades de 

agricultura familiar / Marcela Alexandrino. - Botucatu, 2023 

 

   Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista 

"Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de Botucatu 

   Orientador: Simone Baldini Lucheis 

   Coorientador: Rodrigo Mattos dos Santos 

   Coorientador: Maria Izabel Merino de Medeiros 

   Capes: 40101096 

 

   1. Mycobacterium bovis. 2. Mycobacterium tuberculosis.  

3. Zoonoses. 4. Leite. 5. Agricultura familiar. 

 

 

Palavras-chave: Leite; Mycobacterium bovis; Mycobacterium 

spp.; Tanque de expansão; Zoonose. 
 

 



 
3 

 

Marcela Alexandrino 

 

ANÁLISE ESPACIAL E PESQUISA MOLECULAR DO COMPLEXO 
Mycobacterium tuberculosis EM AMOSTRAS DE LEITE BOVINO DE 
TANQUES DE RESFRIAMENTO DE PEQUENAS PROPRIEDADES DE 

AGRICULTURA FAMILIAR 
  
  

 
 
 
 

Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual 
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título 

de Mestre em Doenças Tropicais. 
  
  

 
 
Orientadora: Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis 
 
 

Comissão Examinadora 
 

 
Profa. Dra. Simone Baldini Lucheis 
Presidente e Orientadora 
Departamento de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva 
FMVZ – UNESP – Botucatu 
 
Profa. Dra. Cilmery Suemi Kurokawa 
Membro 
Departamento de Pediatria 
FMB - UNESP – Botucatu 
 
Dra. Vera Cláudia Lorenzetti Magalhães Curci 
Membro 
Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo 
Instituto Biológico/Araçatuba-SP  
 

 

Botucatu, 24 de fevereiro de 2023 



 
4 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedicatória 



 
5 

 

 

 

 

 

 

Aos meus pais, Adriana e Valdir, 

Por serem a minha base de vida, pelo amor incondicional a mim dedicado, pelas conversas e 

conselhos, por toda intercessão e oração, por todo apoio e compreensão, por serem meu porto 

seguro. Pela oportunidade que me proporcionaram de estudar e me mostrarem que tenho um lugar 

para retornar quando necessário. 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
6 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Agradecimentos 



 
7 

 

Agradeço à Deus, pois ele é minha força diária e sem Ele eu não estaria aqui. Pela proteção diária e 

livramento de todos os perigos. Agradeço a Nossa Senhora, pois sem a intercessão dela não 

conseguiria finalizar esse mestrado. Sem Eles eu não sou nada! 

 

Agradeço a minha mãe, Adriana, e meu pai, Valdir! Vocês são as minhas jóias raras e minha base. 

Tudo que tenho e o que sou hoje é graças a vocês! Agradeço ao meu irmão, Lucas, pelo 

companheirismo, pelas risadas e conselhos, direcionamentos e correções! Vocês são meu refúgio onde 

posso voltar sempre que precisar e sei que sempre estaremos juntos! Vocês são meus exemplos. Eu os 

admiro muito! Obrigada por me permitirem dar mais um passo na minha carreira. Sem vocês nada 

seria possível! Amo muito vocês! 

 

Agradeço ao meu namorado, Fábio, pelo apoio em todas as fases desse processo, por estar sempre ao 

meu lado nos dias tristes e felizes, por todo o companheirismo, por sempre me incentivar e por me 

amar do jeito que sou! Por ser meu ponto de paz e por sempre me acolher quando não estou bem. 

Pela história de vida que estamos contruindo, pelos ensinamentos e amadurecimento. Te amo! 

 

A todos meus familiares que sempre se preocuparam comigo e me acompanharam e me apoiaram 

em todo o meu processo de aprendizado. Gratidão eterna! 

 

À Doutora Simone Baldini Lucheis por acreditar no meu potencial. Por ter me dado a oportunidade 

de seguir em frente com o mestrado, pela paciência e compreensão em todos os momentos. Por todo 

o conhecimento científico passado, pelas conversas e por não desistir de mim. Mais que orientadora, 

tenho-te como exemplo! Obrigada! 

 

A meu coorientador Rodrigo Mattos dos Santos, que me acompanhou em todo o processo da 

especialização e me apresentou a Simone, possibilitando novos processos de aprendizagem. Pelo 

conhecimento e pelos conselhos profissionais e pessoais passados durante todo esse processo, além 



 
8 

 

de acreditar e confiar no meu potencial. Gratidão! 

 

À minha coorientadora Maria Izabel Merino de Medeiros, por me receber tão bem no APTA-Bauru e 

sempre me incentivar, mesmo quando os processos não estavam dando certo. Meus sinceros 

agradecimentos! 

 

À minha amiga de especialização e pós-graduação, Daniela Filadelfo Sanches. Por todo 

companheirismo, risadas, lanches, conversas e todos os momentos de apoio. Com sua amizade tudo 

ficou mais fácil e leve. Presente da Unesp para a vida! Gratidão! 

 

À Suzane Manzini, por ter me recebido tão bem no LASAB e por todo conhecimento e auxílio durante 

os processos práticos da pesquisa. Por me ensinar biologia molecular e por toda paciência em ensinar. 

Pelas conversas, risadas, conselhos e incentivos. Obrigada por se preocupar comigo nos dias de chuva 

na pista.  Adorei te conhecer! Grata por tudo! 

 

 À Ana Paula Flaminio, por me receber tão bem no laboratório de Análises Moleculares de 

Micobactérias do Departamento de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva da FMVZ e 

me ensinar técnicas de biologia molecular, além de ser um aprendizado novo a cada conversa nossa. 

Por ter paciência comigo e possibilitar o aprendizado da técnica de PCR em tempo real. Agradeço 

por todas as dicas e ajuda em todos os processos do trabalho. Nossas conversas e trocas de 

conhecimento ficará sempre marcada em minha memória. Adorei te conhecer! Eterna gratidão! 

 

À Maria Eduarda Cavalheiro, pelas conversas, cafés e trocas de conhecimentos. Você é uma pessoa 

incrível! Gratidão! 

 

À Thainá Valente Bertozzo, pelas conversas, risadas e por toda ajuda. Obrigada! 

 



 
9 

 

À Jackieline Sampaio Steinle, pelas conversas, risadas, pela espontaneidade e pela ajuda. Obrigada! 

 

Ao Instituto Adolf Lutz – Sorocaba, pela concessão dos controles de Mycobacterium tuberculosis e 

ao Latoratório de Análises Moleculares de Micobactérias do Departamento de Produção Animal e 

Medicina Veterinária Preventiva da FMVZ, por conceder a cepla AN5 de Mycobacterium bovis. 

 

À Faculdade de Medicina de Botucatu – FMB – UNESP, pela oportunidade de ingressar no 

Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais. 

 

Aos membros da banca examinadora, da qualificação e defesa, sendo titulares e suplentes, os quais 

foram escolhidos à dedo para este momento importante em minha vida! Agradeço por 

compartilharem todo o conhecimento de vocês! 

 

À Seção Técnica de Pós-Graduação em especial a Tatiane de Fátima Pineiz, pelo auxílio durante esses 

dois anos. 

 

À biblioteca do campus pelo suporte técnico. 

 

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxilio financeiro 

concedido. 

 

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo Auxílio a Pesquisa Regular 

– processo 2020/09409-2, o qual contribuiu para a compra de reagentes. 

 

Meus sinceros agradecimentos a todos que passaram durante todo esse processo de aprendizado e 

puderam contribuir com meu crescimento pessoal e profissional! 

 



 
10 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Aqueles que se sentem satisfeitos sentam-se e nada fazem. Os insatisfeitos são os únicos benfeitores 

do mundo.” -  Walter S. Landor 

 

“Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina.” – Cora Coralina 

 

 

 



 
11 

 

 RESUMO   

A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa que corresponde um 

importante problema de saúde publica global, causada por um agente do 

complexo Mycobacterium tuberculosis (CMT). A TB zoonótica ou bovina tem 

Mycobacterium bovis como agente e tem dentre seus hospedeiros animais 

silvestres, humanos e animais de produção, como bovinos. Esse patógeno 

infecta os seres humanos, principalmente pelo consumo de leite cru e seus 

derivados. Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi pesquisar bactérias do 

CMT, especificamente Mycobacterium bovis e Mycobacterium tuberculosis, 

patógenos de maior importância em saúde pública, empregando-se as técnicas 

de biologia molecular, PCR convencional e PCR em tempo real, com o uso de 

primers específicos para o CMT e para os patógenos de interesse do estudo, em 

102 amostras de leite cru bovino, coletados a partir de tanques de expansão 

individuais, em pequenas propriedades rurais da região Centro-Oeste Paulista. 

Como resultado das análises, todas as amostras de leite testadas foram 

negativas para o CMT, Mycobacterium tuberculosis e para Mycobacterium bovis. 

Não obstante, há uma grande importância na constante vigilância epidemiológica 

destes patógenos pelo fato do leite cru ainda ser muito consumido e ter um forte 

potencial infeccioso, bem como a sua utilização na fabricação de sub-produtos, 

como queijo e manteiga, fontes de renda para o pequeno produtor, constituindo-

se em risco para a saúde pública. 

Palavras-chave: Mycobacterium spp.; Mycobacterium bovis; zoonose; leite; 

tanque de expansão.  



 
12 

 

ABSTRACT 

Tuberculosis (TB) is an infectious disease that corresponds to an important global 

public health problem, caused by an agent of the Mycobacterium tuberculosis 

complex (CMT). Zoonotic or bovine TB has Mycobacterium bovis as an agent and 

has among its hosts wild animals, humans and production animals, such as cattle. 

This pathogen infects humans mainly through the consumption of raw milk and 

its derivatives. Given the above, the objective of this study was to investigate CMT 

bacteria, specifically Mycobacterium bovis and Mycobacterium tuberculosis, 

pathogens of greatest importance in public health, through molecular biology 

techniques, conventional PCR and real-time PCR, using specific primers for CMT 

and for the pathogens of interest in the study, in 102 samples of raw bovine milk, 

collected from individual expansion tanks, in small rural properties in the Midwest 

region of São Paulo. As a result of the analyses, all milk samples tested were 

negative for CMT, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis. 

However, there is great importance in the constant epidemiological surveillance 

of these pathogens due to the fact that raw milk is still widely consumed and has 

a strong infectious potential, as well as its use in the manufacture of by-products, 

such as cheese and butter, sources of income for the small producer, constituting 

a risk to public health. 

Keywords: Mycobacterium spp.; Mycobacterium bovis; zoonosis; milk; bulk tank. 

  



 
13 

 

Lista de Figuras 

Figura 1: Ciclo de transmissão da tuberculose zoonótica...................................23 

Figura 2: Mapa do Brasil. Fonte: Qgis................................................................37 

Figura 3: Mapa do Estado de São Paulo, Brasil. Fonte: Qgis.............................38 

Figura 4: Mapa de localização dos municípios das propriedades de coleta das 

amostras de leite. Fonte: QGIS..........................................................................38 

Figura 5: Quantificação de DNA das amostras extraídas………………………..40 

Figura 6: “A”: Bancada para a preparação do gel de agarose a 1,5%. “B”: 

Homogeneização do amplificado com tampão de corrida. “C”: colocação das 

amostras no gel de agarose. Fonte: arquivo 

pessoal…………………………………………………………………………...……43 

Figura 7: Preparação do pool de amostras para corrida de qPCR para 

bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis. Fonte: arquivo pessoal...45 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 



 
14 

 

Lista de Tabelas 

Tabela 1: Quantificação de DNA total a partir da extração das amostras de leite 

de tanque de expansão………………………………………………………….......72 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
15 

 

Lista de Abreviaturas e Símbolos 

APTA - Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios 

BAAR – Bacilo Álcool-ácido Resistente 

CMT – complexo Mycobacterium tuberculosis 

cPCR – Reação em Cadeia da Polimerase convencional 

EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária 

FAO - Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação 

HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana 

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística 

IS – Sequência de Inserção  

M. bovis – Mycobacterium bovis 

M. tuberculosis – Mycobacterium tuberculosis 

OIE - Organização Mundial da Saúde Animal 

OMS – Organização Mundial da Saúde  

PCR - Reação em Cadeia da Polimerase 

PNCEBT - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e 

Tuberculose 

PPD - Derivado Proteico Purificado 

qPCR – Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real 

TB – Tuberculose 

TBb – Tuberculose bovina 

TCC - Teste Cervical Comparativo 

TCS - Teste Cervical Simples 



 
16 

 

The Union - União Internacional Contra Tuberculose e Doenças Pulmonares 

TPC - Teste da Prega Caudal 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
17 

 

Sumário 

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 20 

2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 21 

2.1 Classificação e propriedades das micobactérias ..................................... 21 

2.2 Tuberculose bovina ................................................................................. 22 

2.3 Diagnóstico da tuberculose bovina e o Programa Nacional de Erradicação 
e Controle da Tuberculose e Brucelose Animal (PNCEBT) ........................... 25 

2.4 Tuberculose zoonótica ............................................................................ 28 

2.5 O leite e a tuberculose zoonótica ............................................................ 30 

3. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO ..................................................................... 32 

4. OBJETIVO .................................................................................................... 34 

5. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 36 

5.2 Local de realização dos exames ............................................................. 36 

5.3 Amostras de leite bovino a partir de tanques de expansão ..................... 36 

5.4 Exames Moleculares ............................................................................... 39 

5.4.1 Extração de DNA ............................................................................... 39 

5.4.2 Quantificação do DNA ....................................................................... 39 

5.4.3 Reação em Cadeia da Polimerase Convencional – cPCR – Complexo 
Mycobacterium tuberculosis ....................................................................... 40 

5.4.4 Eletroforese em gel de agarose ........................................................ 42 

5.4.5 Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real – qPCR .............. 44 

5.4.6 Controles ........................................................................................... 46 

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 48 

6.1 Extração e quantificação das amostras ................................................... 48 

6.2 Reação em Cadeia da Polimerase .......................................................... 48 

7. DESAFIOS E LIMITAÇÕES DO ESTUDO ................................................... 55 

8. CONCLUSÃO ............................................................................................... 57 

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 59 

10. ANEXOS ..................................................................................................... 69 

10.1 Anexo 1: Certificado de aprovação da pesquisa pela Comissão de Ética 
no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Medicina da Universidade 
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Botucatu, São Paulo. ............... 69 

10.2 Anexo 2: Protocolo de extração das amostras de leite com o Kit 
comercial Illustra Blood GenomicPrep (GE Healthcare®). ............................ 70 

10.3 Anexo 3: Quantificação de DNA a partir da extração das amostras de 



 
18 

 

leite de tanque de expansão.......................................................................... 72 

 

 

 

 

 



 
19 

 

 

 

INTRODUÇÃO 

 

 

 

 

 

 



 
20 

 

1. INTRODUÇÃO 

A tuberculose (TB) é uma doença infectocontagiosa que corresponde um 

importante problema de saúde publica global. Caracteriza-se por uma infecção 

granulomatosa necrosante causada por um agente do complexo Mycobacterium 

tuberculosis (CMT) (DHEDA; BARRY; MAARTENS, 2016).  

A TB zoonótica ou bovina é uma enfermidade infectocontagiosa causada 

pelo Mycobacterium bovis (M. bovis). Essa doença acomente uma infinidade de 

hospedeiros, dentre eles animais silvestres, como observado nas Américas, em 

raposas, quatis, coiotes, gambás e ursos; pode também infectar principalmente 

animais de produção e também infecta seres humanos (DOMINGOS et al., 2019; 

SEVERINO et al., 2020; GARCIA et al., 2021).  

O leite é uma das principais fontes de proteína e gordura, sendo 

consumido por mais de seis bilhões de pessoas em todo o mundo. Contudo, o 

leite também é um meio latente para a TB zoonótica, visto que M. bovis pode 

infectar as glândulas mamárias do animal causando mastite e infecções 

cutâneas.  Sendo assim a infecção de M. bovis em seres humanos ocorre, 

principalmente, pelo consumo de leite cru bovino e seus derivados provindos de 

fêmeas bovinas infectadas. (ZUMÁRRAGA et al., 2012; LIMA; JUNQUEIRA 

JÚNIOR, 2019; TAO et al., 2020). 

A infecção pela via oral é subnotificada sendo necessária maiores 

pesquisas nessa área.  Sabe-se que essa bactéria pode acometer os seres 

humanos por outras vias que não a aérea, como exemplo o consumo de leite cru 

e seus derivados sem inspeção, como queijos artesanais, iogurtes além de 



 
21 

 

carnes contaminadas, bem como pela água e fômites contaminados; além disso, 

essa bactéria pode durar anos no meio ambiente, apresentando uma enorme 

resistência ambiental e a produtos químicos (FLAMINIO, 2019). 

No mundo, em 2020, aproximadamente 9,9 milhões de indivíduos foram 

acometidos pela doença, sendo responsável por 1,3 milhão de óbitos de pessoas 

não infectadas pelo HIV. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), até 

2019 a TB era a primeira causa de óbitos por um único agente infeccioso, tendo 

sido ultrapassada pela Covid-19 em 2020. No Brasil, cerca de 68 mil novos casos 

de TB foram notificados em 2021, conferindo um coeficiente de incidência de 32 

casos por 100 mil habitantes (BRASIL, 2022a). 

 

2. REVISÃO DE LITERATURA 

2.1 Classificação e propriedades das micobactérias 

As micobactérias pertencem à família Mycobacteriaceae e gênero 

Mycobacterium. O termo micobactéria significa fungo-bactéria, em razão da 

estrutura de sua parede celular única e complexa, pois possui um conteúdo 

lipídico correspondente a 60% do peso seco da célula micobacteriana. Não se 

coram pelo método de Gram, mas são considerados Gram positivos. Coram-se 

por vários corantes básicos, porém não se descoram com a solução de álcool-

ácido. Isto ocorre pela presença de ácido micólico, que faz parte dos lipídios que 

compõem a parede celular, impedindo a remoção do corante pelo álcool-ácido 

que os caracteriza como bacilos álcool-ácido-resistentes (BAAR) – técnica de 

coloração de Ziehl-Neelsen - permitindo sua identificação por microscopia direta 



 
22 

 

(COUSINS et al. 2003; BRASIL 2006; PAES; FRANCO, 2016; PROCOP et al., 

2018). 

Segundo o National Library of Medicine (NCBI), o CMT é composto pelas 

espécies Mycobacterium tuberculosis (causa a TB humana), Mycobacterium 

bovis (causador da TB em bovinos), Mycobacterium caprae (causador da doença 

em caprinos, bovinos e humanos), Mycobacterium canettii (variante de M. 

tuberculosis encontrada na região de Djibouti e Somália), Mycobacterium 

africanum (responsável por casos de TB humana no continente Africano), 

Mycobacterium microti (causa TB em roedores), Mycobacterium pinnipedii 

(causador da TB em leões marinhos e em humanos), Mycobacterium bovis BCG, 

Mycobacterium mungi (isolado em uma população de mangustos em Botswana 

no sul da África), Mycobacterium orygis (causa TB em antílope (órix) , 

rinocerontes, gado leiteiro, macacos rhesus e humanos)  (FLAMINIO, 2019; 

NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE, 2020).   

 

2.2 Tuberculose bovina 

A tuberculose bovina (TBb) é uma doença economicamente importante e 

disseminada em bovinos, causada pelo M. bovis (ARNOT; MICHEL, 2020).  

Essa doença pode afetar os humanos, bovinos, animais domésticos e 

silvestres caracterizando-se como uma importante zoonose, atual e ainda 

negligenciada (Figura 1). Os animais silvestres agem na disseminação da 

doença atuando como reservatórios, pois normalmente não são incluídos nos 

programas de vigilância e controle, expondo a saúde pública a um grande risco 



 
23 

 

por oferecerem perigo aos humanos (ALBERTTI, 2014; DUARTE et al., 2019). 

Contato 
Direto

Direto Contato

Contaminação Alimentar

Água Contaminada

Contato Direto
Leite Cru
Lacticínios

Alimentar

 

Figura 1: Ciclo de transmissão da tuberculose zoonótica. Fonte: Adaptado de HASIB, 
2016. 
 
 

A transmissão do patógeno para os bovinos ocorre majoritariamente pela 

via respiratória, pela inalação de gotículas infectadas eliminadas pela tosse ou 

da secreção nasal de um animal com TB ativa. Entretanto, a transmissão também 

acontece por via oral, principalmente por bezerros com a ingestão de leite de 

vacas tuberculosas, e também por vias congênitas, cutâneas e venéreas, ou seja 

a contaminação pode acontecer pela urina, sêmen e fezes, que podem 

contaminar o meio ambiente e fômites (MURAKAMI et al., 2009; SIBHAT et al., 

2017). 

O principal meio no qual a doença é introduzida nos rebanhos é pela 

aquisição de animais doentes, portadores inaparentes, sem o teste de 

tuberculina ou um teste mal realizado. A introdução do patógeno nas 

propriedades depende de vários fatores, como o tamanho do rebanho, unidade 

de criação, e, principalmente, das práticas zoonóticas e sanitárias. A doença é 



 
24 

 

mais frequente em rebanhos leiteiros do que em rebanhos de corte (BELCHIOR 

et al., 2016; BRASIL, 2022b). 

A patogenia da TB nos bovinos depende da via de infecção e pode causar 

uma grande diversidade de sinais clínicos; no entanto, causam muito pouco ou 

nenhum sintoma ou sinal clínico. No caso da inalação do patógeno, os bacilos 

irão se alojar no pulmão, promovendo uma reação inflamatória, determinando 

uma pneumonia e, por se tratar de uma doença granulomatosa, há formação de 

nódulos caseosos, com diversos tamanhos, tomando o parênquima pulmonar, 

originando lesões cavitárias. Quando a infecção ocorre por outros meios de 

transmissão, as lesões iniciais podem não ser percebidas; no entanto, as lesões 

de aspecto caseoso são mais observadas nos linfonodos de cabeça, pescoço, 

mediastínicos e mesentéricos, intestino, fígado, baço, pleura e peritônio (ROXO, 

1996; MURAKAMI et al., 2009). 

Trata-se de uma das doenças em rebanhos que mais causa perda 

econômica e atinge uma quantidade significativa de bovinos leiteiros, 

observando que a TBb é mais frequente em rebanhos leiteiros do que em 

rebanhos de corte, podendo apresentar até 15% de infecções em um rebanho.  

A introdução e manutenção da doença em um rebanho necessita de 

algumas características da unidade de criação, destacando-se o tipo de 

exploração, o tamanho do rebanho, a densidade populacional e as práticas 

zootécnicas e sanitárias (RAMOS et al., 2015; BRASIL, 2022b). 

O Brasil apresenta um dos maiores rebanhos bovinos no mundo. Segundo 

dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), em 2020 foram 



 
25 

 

contabilizados cerca de 218 milhões de animais no país. Estima-se que cerca de 

1,3% dos rebanhos bovinos sejam acometidos pela TBb. Levando-se em 

consideração a saúde pública, a infecção por micobactérias em bovinos 

envolvem a condenação das carcaças em matadouros, além da redução na 

produção leiteira e de carne (BOLAÑOS et al., 2017; INSTITUTO BRASILEIRO 

DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2022; CICARNE, 2021). 

 

2.3 Diagnóstico da tuberculose bovina e o Programa Nacional de 

Erradicação e Controle da Tuberculose e Brucelose Animal (PNCEBT) 

O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) 

reconheceu a tuberculose e a brucelose como problema de saúde pública no 

Brasil, por se apresentarem como zoonoses geradoras de prejuízos econômicos 

e sociais devido ao impacto na produtividade dos rebanhos e dos riscos inerentes 

a saúde humana, criando assim, em 2001, o Programa Nacional de Controle e 

Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) (BRASIL, 2006). 

O PNCEBT tem como objetivo diminuir a incidência e a prevalência da 

brucelose e da tuberculose com a meta de erradicação das duas doenças, sendo 

as medidas deste programa aplicadas em bovinos e bubalinos (BRASIL, 2017). 

O diagnóstico precoce da TBb é uma importante ferramenta para sustentar 

o planejamento e as atividades de controle da doença. Pode ser realizada por 

métodos diretos e indiretos, sendo os diretos a pesquisa e identificação do 

agente etiológico em material biológico e os indiretos investigar a resposta 

imunológica do hospedeiro contra o patógeno (BRASIL, 2006). O diagnóstico no 



 
26 

 

post-mortem é realizado com a avaliação das lesões, de forma macroscópica e 

microscópica, que podem ser submetidas a histopatologia ou podem ser 

realizadas as técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (SOUZA et 

al., 2016). 

Como teste direto, pode ser realizado o teste de biologia molecular (PCR) 

em amostras biológicas suspeitas, como o leite, que permite a obtenção de um 

resultado mais rápido. Além do resultado mais rápido, a PCR é mais específica 

e sensível, permitindo a distinção entre as diferentes espécies de micobactérias 

mais importantes na saúde pública pela utilização de primers específicos para 

cada micobactéria (SILVA et. al., 2016). 

O método oficial adotado pelo PNCEBT é baseado na reação de 

hipersensibilidade tardia, mais conhecida como teste da tuberculina, que 

consiste em uma injeção intradérmica de PPD - Derivado Proteico Purificado, 

realizado no animal vivo e indicado principalmente para bovinos. Esse teste é 

capaz de revelar infecções no início, com 3 a 8 semanas após o contato com o 

patógeno, além de ser um exame de baixo custo e com alta disponibilidade. 

(RAMOS et al., 2015).  

Ao injetar a tuberculina em um animal infectado por micobactérias irá 

ocorrer uma resposta de hipersensibilidade tardia, podendo ser observada pelo 

endurecimento e edema progressivo no local da inoculação, com pico máximo 

em 72 horas e uma variação de até 6 horas para mais ou para menos. O 

resultado é obtido com a mensuração da intensidade da reação cutânea, 

observando o tamanho do endurecimento ou do engrossamento da pele 



 
27 

 

(BRASIL, 2006). Importante salientar que animais com tuberculose avançada 

podem desenvolver o fenômeno da anergia, que se caracteriza pela ausência de 

reatividade ao teste cutâneo tuberculínico, produzindo resultados falso-negativos 

(GORMLEY et al., 2006). Ainda, nos casos em que a infecção pelo M.bovis tenha 

ocorrido há menos de 40 dias e em fêmeas no período compreendido entre 30 

dias antes e 30 dias após o parto (SALAZAR; GUIMARÃES, 2006). 

Segundo o PNCETB, os testes de rotina utilizados para detecção da TBb 

são pela tuberculinização, a saber: o teste cervical simples (TCS), o teste da 

prega caudal (TPC) e o teste cervical comparativo (TCC). Assim quando um 

animal apresentar positividade para a doença, após a realização destes testes e 

contra-provas requeridas, este deve ser identificado na face direita com um “P” 

de Positivo, ser isolado do rebanho, afastado da produção leiteira e abatido em 

até 30 dias após o diagnóstico nos estabelecimentos sob serviço de inspeção 

official. A comunicação aos órgãos oficiais deve ser realizada, pois trata-se de 

uma doença de notificação compulsória (BRASIL, 2017). 

A Febre Aftosa, Tuberculose, Brucelose, Raiva, Influenza Aviária e 

Doença de Newcastle, são exemplos que compõe uma lista de Doenças Animais 

de Notificação Obrigatória elencadas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e 

Abastecimento (MAPA) e que devem ser comunicadas imediatamente a Agência, 

de acordo com a Instrução Normativa Nº 50, de 24 de setembro de 2013 

(BRASIL, 2019c). 

 

 



 
28 

 

2.4 Tuberculose zoonótica  

Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), as zoonoses são 

definidas como qualquer doença ou infecção compartilhada naturalmente entre 

os animais vertebrados e seres humanos, sendo os patógenos zoonóticos de 

natureza bacteriana, como o caso da TBb por M. bovis, bem como patógenos 

virais ou parasitários (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020a). 

Apesar da TB humana ter como principal agente M. tuberculosis, o ser 

humano pode ser infectado pelo M. bovis, caracterizando a TB zoonótica. A 

manifestação mais comum desse tipo de doença é a extrapulmonar, devido aos 

meios de transmissão mais comuns. Essa doença pode se manifestar em 

diferentes partes do organismo humano, como ossos, linfonodos, intestino, 

sistema urinário e outros (LIMA; JUNQUEIRA-JÚNIOR, 2019; ASSI et al., 2021). 

A alta densidade humano-animal, consumo de leite cru não pasteurizado 

e produtos lácteos feitos com esse leite, contato físico próximo e frequente entre 

humanos e animais infectados e medidas inadequadas de controle da doença 

são os principais fatores de risco para TB zoonótica (COLLINS et al., 2022) 

A transmissão do M. bovis para os seres humanos pode acontecer por via 

direta, pela inalação do patógeno ou por via indireta, com o consumo de leite cru 

contaminado que não passou por nenhum processo de tratamento térmico. 

Ainda, a infecção pode acontecer pelo consumo de carne crua contamida ou mal-

cozida, derivada de abate clandestino e/ou sem inspeção, porém é menos 

frequente (GARCIA et al., 2021). O contato de indivíduos que trabalham no abate 

e nas fazendas (médicos veterinários, funcionários de abatedouro, produtores de 

leite, ordenhadores e outros) com os animais infectados pode estabelecer uma 



 
29 

 

via de transmissão, sendo direta ou indireta, classificando a TB zoonótica como 

uma doença ocupacional (ROBINSON et al., 1988; CUNHA et al., 2012; BRASIL, 

2019a). 

As informações epidemiológicas da TB zoonótica no Brasil e na América 

Latina são deficientes e subnotificadas. As notificações normalmente são 

relatadas como uma proporção do número total de tuberculose humana e 

geralmente são provindas de estudos envolvendo apenas grupos específicos e 

selecionados de pacientes (OLEA-POPELKA et al., 2017; ASSI et al., 2021).  

A partir da publicação da Instrução Normativa 50 (IN50), publicada em 

setembro de 2013 e que determina quais doenças são de notificação obrigatória 

ao Serviço Veterinário Oficial, a Coordenadoria de Defesa Agropecuária (CDA) 

da Secretaria de Agricultura e Abastecimento (SAA) conta com o apoio da 

população em geral (veterinários, produtores, pesquisadores, estudantes) para 

a identificação de focos de doenças/síndromes em animais terrestres em todo o 

Estado de São Paulo.  A notificação deve ser feita preferencialmente através do 

Sistema Brasileiro de Vigilância e Emergências Veterinárias (e-SISBRAVET) ou, 

caso o meio eletrônico não seja acessível, a notificação pode ser feita em uma 

das regionais da Defesa (COORDENADORIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA 

DO ESTADO DE SÃO PAULO, 2022a). 

Segundo dados da Defesa Agropecuária do Estado de São Paulo, em 

2022, foram notificados e investigados dez focos de tuberculose bovina, 

abrangendo os municípios de Cunha, com 3 ocorrências; São Carlos, com duas; 

Taquarituba, com duas; Itapetininga, um caso; Joanópolis, um caso e Barretos, 



 
30 

 

com um caso, perfazendo um total de 42 bovinos positivos (COORDENADORIA 

DE DEFESA AGROPECUÁRIA DO ESTADO DE SÃO PAULO, 2022a). 

 

2.5 O leite e a tuberculose zoonótica 

O leite é considerado uma commodities agropecuária, com maior 

importância no mundo, estando entre os cinco produtos mais comercializados. 

No mundo, cerca de 1 bilhão de pessoas são dependentes do leite para 

sobreviver e há cerca de 133 milhões de fazendas leiteiras ao redor do mundo 

(SIQUEIRA, 2019). 

Esse alimento contém proteínas, açúcares, lipídios, e outros nutrientes 

necessários para o ser humano; assim, é considerado alimento completo para 

adultos, crianças e idosos. Entretanto, tais nutrientes constituintes do leite 

servem como substrato para o metabolismo de diversos patógenos (FRANCO et 

al., 2013). Por ser um alimento muito consumido, a qualidade higiênica do leite e 

seus derivados é de extrema importância na saúde pública, pois ingerir o leite 

contaminado pode causar infecções aos seres humanos e em outros animais 

(ABRAHÃO et al., 2005).  

A tuberculose é uma das principais zoonoses transmitidas pelo consumo 

de leite bovino, pois M. bovis é altamente capaz de sobreviver no leite e em 

outros produtos lácteos, sendo encontrados em forma de bacilos viáveis em 

requeijão e e iogurtes produzidos a partir de leite cru sem pasteurização por mais 

de 14 dias e na manteiga por mais de 100 dias (FRANCO et al., 2013). 



 
31 

 

A realização de testes de triagem em amostras de leite vem sendo 

utlizadas para limitar a propagação de doenças infecciosas, incluindo as doenças 

causadas por micobactérias (FRANCO et al., 2013). A Resolução SAA – 28, de 

09/03/2022 visa estabelecer os procedimentos e prazos relacionados a 

vacinação, aos exames e à certificação de estabelecimento livres de Brucelose 

e Tuberculose, segundo o PNCETB no Estado de São Paulo, colocando-se no 

Artigo 8º que os produtores de leite in natura devem realizar os exames 

diagnósticos das patologias em bovinos destinados à produção leiteira e 

devendo apresentar os resultados desses testes aos laticínios e outros 

estabelecimentos processadores de leite, sendo essa obrigatória a partir do dia 

1º de julho de 2023 (COORDENADORIA DE DEFESA AGROPECUÁRIA DO 

ESTADO DE SÃO PAULO, 2022b). 

No Brasil, o consumo de leite per capita está próximo de 170 litros/ano, 

sendo possível aumentar ao menos 100 litros per capita/ano, pois nos países 

desenvolvidos o volume de leite consumido anualmente, na forma fluida e de 

derivados, é de 278 litros (MARTINS, 2022). 

No Brasil, desde 1950, a inspeção de produtos de origem animal, incluindo 

o leite e derivados, é obrigatória desde o Decreto nº 923/1969 de 10 de outubro 

de 1969, bem como a comercialização do leite cru é proibida em todo o território 

nacional; porém, a produção de leite clandestina (sem pasteurização) e 

procedente da agricultura familiar é disseminada (BRASIL, 1950; BRASIL, 1969; 

BARCELLOS et al., 2019). 



 
32 

 

Em 2019, o setor formal de laticínios aumentou em 2,3%; entretanto, o 

comércio informal e a produção do leite e derivados ainda são presentes 

(EMBRAPA 2020). Segundo dados da Empresa Brasileira de Pesquisa 

Agropecuária - EMBRAPA (2022), em 2021 houve um consumo de leite informal 

de 9.621 milhões de litros per capita (MAGALHÃES JÚNIOR et al., 2022). 

Cerca de 33% de todo o leite produzido no Brasil não recebe nenhum tipo 

de fiscalização higiênica e sanitária; assim, a comercialização ocorre para a 

população de modo informal, observando-se também que uma parte do leite 

produzido é para consumo interno, bem como para a comercialização para 

geração de renda informal. Na área rural, a porcentagem de leite informal 

comercializado e o seu consumo torna-se maior, especialmente, em cidades de 

pequeno e médio porte (ALMEIDA et al., 2016; FLORINDO et al., 2021). 

O consumo de leite cru, mesmo proibido por legislação no Brasil, ainda 

ocorre. Esse leite pode trazer muitos riscos a saúde de quem o consome pelo 

grande potencial de transmissão da TB zoonótica e de outros patógenos, como 

Yersinia enterocolitica (BERTOLINI et al., 2019); Listeria monocytogenes 

(STEINLE, 2022); Toxoplasma gondii (MANZINI, 2022); Salmonella; Shigella; Es-

cherichia coli (BELOTI, 2015). 

 
3. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO 

Tendo em vista a importância da tuberculose como doença infecciosa 

nos rebanhos e sua importância como doença zoonótica e o desconhecimento 

de dados acerca do diagnóstico molecular de M. tuberculosis e M. bovis em leite 

de tanque nas propriedades rurais avaliadas, propusemos esta pesquisa. 



 
33 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

OBJETIVO 

 

 

 

 

 



 
34 

 

4. OBJETIVO  

 

Pesquisar bactérias do complexo Mycobacterium tuberculosis, em 

amostras de leite cru bovino, especificamente Mycobacterium bovis e 

Mycobacterium tuberculosis, a partir de tanques de expansão em pequenas 

propriedades rurais da região Centro-Oeste Paulista. 

 

 

 

 

 

 

 



 
35 

 

 

 

 

MATERIAL E MÉTODOS 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
36 

 

5. MATERIAL E MÉTODOS 

 

5.1 Comitê de Ética 

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética - CEUA - da 

Faculdade de Medicina de Botucatu – FMB – UNESP sob o número 1390/2021 

(ANEXO 1).  

 

5.2 Local de realização dos exames 

O procedimento molecular de Reação em Cadeia da Polimerase 

convencional – cPCR foi realizado no Laboratório de Sanidade Animal da 

Unidade Regional de Pesquisa e Desenvolvimento - APTA/SAA - SP (Agência 

Paulista de Tecnologia dos Agronegócios), situada na cidade Bauru-SP. O 

procedimento de PCR em tempo real (qPCR) foi realizado no Laboratório de 

Análises Moleculares de Micobactérias do Departamento de Produção Animal e 

Medicina Veterinária Preventiva da FMVZ – UNESP – Botucatu.  

 

5.3 Amostras de leite bovino a partir de tanques de expansão 

 Devido a situação da pandemia por COVID-19, a proposta de ida 

presencial às propriedades leiteiras para coleta de material não foi possível, pois 

seria inapropriado ao controle sanitário dentro das propriedades e à proteção à 

saúde dos produtores e funcionários pelas medidas de isolamento. Portanto, 

amostras de leite bovino, devidamente armazenadas no Laboratório de Sanidade 

Animal da APTA Centro-Oeste – Bauru, em freezer a -20º C, procedentes de 102 



 
37 

 

tanques de expansão individuais, foram aproveitadas para este estudo.  

 As amostras de leite eram procedentes de pequenas propriedades 

leiteiras, localizadas em oito diferentes municípios da região Centro-Oeste 

Paulista, apresentadas nas figuras a seguir, sendo coletado uma amostra de leite 

por propriedade: Anhembi (13 amostras), Avaré (47 amostras), Arandu (quatro 

amostras), Bofete (sete amostras), Botucatu (duas amostras), Bauru (três 

amostras), Cerqueira Cesar (dez amostras) e Pardinho (16 amostras).  

 
Figura 2: Mapa do Brasil. Fonte: Qgis. 



 
38 

 

 
Figura 3: Mapa do Estado de São Paulo, Brasil. Fonte: Qgis. 

 
Figura 4: Mapa de localização dos municípios das propriedades de coleta das amostras de 
leite. Fonte: Qgis.  



 
39 

 

 

Os tanques se apresentavam em uma temperatura máxima de 4°C, e não 

armazenavam leite de ordenhas realizadas a mais de 48 horas (dois dias). 

Previamente à coleta, o agitador do tanque era ligado para que o leite fosse 

homogeneizado por pelo menos cinco minutos e, após este período, com um 

auxílio de uma concha de inox previamente esterilizada, coletou-se o volume de 

250 mL de leite cru para um frasco plástico estéril, o qual foi acondicionado em 

caixa isotérmica contendo gelo reciclável e em seguida encaminhado ao 

laboratório. 

As amostras de leite coletadas no tanque de resfriamento nas 

propriedades rurais não haviam passado pelo processo de pasteurização, tendo 

em vista que eram encaminhadas ao laticínio para que pudessem então ser 

pasteurizadas. 

 

5.4 Exames Moleculares 

5.4.1 Extração de DNA  

Para as amostras de leite, foi utilizado Kit comercial Illustra Blood Geno-

micPrep (GE Healthcare®), de acordo com o protocolo indicado pelo fabricante 

e com modificações de Cunha et al. (2006). (ANEXO 2). 

 

5.4.2 Quantificação do DNA  

Para quantificar o DNA em cada amostra, foi utilizado o aparelho 

Quantificador NanoVue Plus® da GE Healthcare, Bioscience/UK. (Figura 5) 

(ANEXO 3). 



 
40 

 

 
Figura 5: Quantificação de DNA das amostras extraídas. Fonte: arquivo pessoal. 

 
 
 

5.4.3 Reação em Cadeia da Polimerase Convencional – cPCR – 

Complexo Mycobacterium tuberculosis 

 

Foi realizada a identificação molecular pela cPCR para o CMT, utilizando-

se o alvo IS6110, segundo Liébana et al. (1996). Inicialmente as amostras foram 

testadas para a sequencia de inserção IS6110, utilizando os primers descritos a 

seguir, os quais identificam as amostras positivas ao complexo M. tuberculosis: 

 

INS–1 CGTGAGGGCATCGAGGTGGC 

INS–2 GCGTAGGCGTCGGTGACAAA 

 

As reações foram realizadas seguindo as condições: cada tubo de reação 

de 0,2 mL recebeu tampão de PCR (50 mM KCl, 20 mM de Tris-HCl), 0,75 mM 

de MgCl2, 0,5 mM de dNTPs, 0,5 μL de Taq-polimerase (Platinum® Taq DNA 



 
41 

 

Polymerase, Invitrogen®), 0,5 μM de cada primer, 2 μL da amostra testada e 17,5 

μL de água ultrapura (MIX-PCR). Desta forma, cada tubo apresentou 23 μL do 

MIX-PCR e 2 μL do produto de extração do DNA.  

A amplificação foi realizada no termociclador Mastercycler Pro gradiente 

(Eppendorf®) com a ciclagem segundo Hermans et al. (1990) com adaptações. 

Desta forma, o ciclo consistiu em uma desnaturação inicial a 94ºC durante 10 

minutos e, após esse período, a amplificação durante 35 ciclos iniciando com a 

desnaturação a 94ºC por 1 minuto, anelamento dos primers ao DNA alvo em 

65ºC 1 minuto; em seguida, ocorreu aumento na temperatura, chegando a 72ºC, 

permanecendo por 2 minutos, até à extensão da nova fita de DNA com o ciclo de 

extensão final por 10 minutos a 72 oC. Após isso, a mistura foi refrigerada a 4 oC. 

As amostras foram testadas também para a identificação molecular de 

Mycobacterium bovis, utilizando o gene oxy R, utilizando-se um volume final de 

reação de 25µL.  

oxyRMB-1 (5′-GCACGACGGTGGCCAGGCA-3′) 

oxyRMB-2.1 (5′-TGGCCGGGCTTCGCGT-3′) 

As reações foram realizadas nas seguintes condições: cada tubo de 

reação de 0,2 mL recebeu tampão de PCR (50 mM KCl, 20 mM de Tris-HCl), 0,75 

mM de MgCl2, 0,5 mM de dNTPs, 0,5 μL de Taq-polimerase (Platinum® Taq DNA 

Polymerase, Invitrogen®), 0,5 μM de cada primer, 2 μL da amostra testada e 17,5 

μL de água ultrapura (MIX-PCR). Desta forma, cada tubo apresentou 23 μL do 

MIX-PCR e 2 μL do produto de extração do DNA. A amplificação gera um 

fragmento de 270 pb. O processo de ciclagem ocorre inicialmente a 95ºC por 12 



 
42 

 

minutos, seguidos por 30 ciclos de duas etapas incluindo desnaturação a 94ºC 

por 45 segundos e o anelamento mais extensão a 70ºC por 1 minuto e 30 

segundos (ESPINOSA DE LOS MONTEROS et al., 1998). 

 

5.4.4 Eletroforese em gel de agarose 

Alíquotas de 10 μL das amostras amplificadas foram homogeneizadas 

com 2 μL de tampão de corrida (0,25% azul de bromofenol, 0,25% xileno cianol, 

30% glicerol, 70% água ultrapura) e submetidas à eletroforese em cuba 

horizontal contendo TBE 1X (0,1M Tris, 0,09M de ácido bórico e 0,001M de 

EDTA) (Figura 6).  



 
43 

 

 

Figura 6: “A”: bancada para a preparação do gel de agarose a 1,5%. “B”: 
homogeneização do amplificado com tampão de corrida. “C”: colocação das amostras 
no gel de agarose. Fonte: arquivo pessoal. 
 
 

A identificação dos produtos amplificados foi feita em eletroforese em gel 

de agarose a 1,5%, corado com Syber Safe® (Invitrogen) 0,1 µL/mL. A voltagem 

utilizada foi de 100V por 90 minutos (1h30min). Para o padrão de peso molecular, 

foi utilizado o LowRanger 100 bp DNA Ladder (Norgen) e o tamanho dos 

fragmentos amplificados, foram comparados visualmente com os padrões de 



 
44 

 

peso molecular das cepas padrão utilizadas como controles positivos com o uso 

de luz UV e a imagem capturada pelo sistema Major ScienceTM, a qual foi 

documentada utilizando-se o software Vision Works LS. 

 

5.4.5 Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real – qPCR 

Para a realização da qPCR foi utilizado o método descrito por Flaminio 

(2019), com uso de primers para a sequência de inserção (IS) IS1081 do CMT, 

cujo marcador é encontrado em várias cópias no genoma de M. bovis.  Foram 

utilizados para as amplificações o sistema: GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, 

USA), realizadas no esquipamento 7500 Fast Real Time PCR System com o 

7500 Software v.2.3 (Applied Biosystems).  

A reação total foi de 20 μL, sendo composta por: 10μL de GoTaq® qPCR 

Master Mix (Promega, USA), 0,4 µL (200nM) de primer Foward e 0,4 μL (200nM) 

de primer Reverse acrescidos de H2O Nuclease Free para completar 15 μL de 

reação mais 5 μL da amostra a ser pesquisada, conforme FLAMINIO (2019).   

Para a realização da qPCR as 102 amostras foram aliquotadas em pools, 

totalizando 20 reações de qPCR, sendo 16 pools com 5 amostras e 4 pools com 

3 amostras (Figura 7). 

 

 



 
45 

 

 

Figura 7: Preparação do pool de amostras para corrida de qPCR para bactérias do 
complexo Mycobacterium tuberculosis. Fonte: arquivo pessoal. 
 

A sequência do primers (oligonucleotídeos) utilizada foi: 

IS1081-1 F GGCTGCTCTCGACGTTCA 

IS1081 -1 R CGCTGATTGGACCGCTCA 

A programação estabelecida para o DNA foi de 95 °C por 10 minutos 

(desnaturação inicial), seguido por 45 ciclos de 95 °C por 15 segundos 

(desnaturação) e 60 °C por 60 segundos (transcrição). Sendo ao final, 

determinada a curva de dissociação (Melting), por meio da detecção da 



 
46 

 

fluorescência do SYBR Green (intercalante de DNA), durante aumento gradual 

de temperatura entre 60 e 95 °C, conforme descrito por Flaminio (2019). 

 

5.4.6 Controles 

Como controles positivos foram utilizadas cepas AN5 de M. bovis 

provindos de culturas, gentilmente cedidos pelo Laboratório de Análises 

Moleculares de Micobactérias da FMVZ – UNESP – Botucatu. Como controle de 

M. tuberculosis foram utilizadas amostras de escarros humanos, gentilmente 

cedidos pelo Instituto Adolfo Lutz de Sorocaba-SP, comprovadamente positivas 

para M. tuberculosis pela técnica de qPCR segundo Flamínio (2019). Para o 

controle negativo, utilizou-se H2O Nuclease Free. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
47 

 

 

RESULTADOS  

E  

DISCUSSÃO 



 
48 

 

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 

 

6.1 Extração e quantificação das amostras 

 

Utilizou-se a relação 260/280, com o resultado entre 1.800 e 2.000 

indicando uma confiabilidade no processo de extração do DNA das amostras de 

leite, evidenciando pouca ou nenhuma interferência de inibidores. A quantidade 

de DNA encontrada em cada amostra quantificada foi considerada satisfatória 

para dar seguimento as etapas da biologia molecular (ANEXO 3). 

 

6.2 Reação em Cadeia da Polimerase 

Todas as 102 amostras de leite mostraram-se negativas à cPCR para o 

complexo Mycobacterium tuberculosis, assim como para a qPCR para M. bovis. 

O método diagnóstico que apresenta mais confiabilidade para doenças 

causadas por micro-organismos é o isolamento e identificação do agente. Apesar 

da TBb apresentar a cultura microbiológica como padrão ouro, é recomendado a 

realização a partir de amostras teciduais, associado ao exame histopatológico, 

que permite a confirmação do diagnóstico; entretanto, esses métodos 

tradicionais para o crescimento de micro-organismos em condições laboratoriais 

ainda são ineficientes e demorados, e a bactéria precisa estar viva para que 

ocorra seu crescimento; ainda, a obtenção de amostras e a escassez de M. bovis 

nas secreções bovinas tornam pouco viável a utilização dessa técnica. Assim, as 

técnicas de PCR comparadas com a cultura e a tuberculinização apresentam 

melhor especificidade e sensibilidade para identificar infecções associadas a M. 



 
49 

 

bovis em amostras de sangue, leite e muco nasal (FIGUEIREDO et al., 2008; 

FLAMINIO, 2019). 

Apesar das técnicas utilizadas apresentarem alta sensibilidade e 

especificidade para detecção das espécies de M. bovis e M. tuberculosis, pode 

haver uma limitação devido ao fato de as amostras terem sido coletadas do 

tanque de expansão e essas serem constituídas de um complexo de micro-

organismos, tornando difícil a detecção das micobactérias nesse ambiente. Não 

obstante, os primers, bem como a técnica escolhida, apresentam sensibilidade e 

especifidade para o agente da TBb, como já testado em amostras clínicas de 

linfonodos em carcaças condenadas pelo SIF para TBb, conforme descrito por 

Flaminio (2019), apresentando que há positividade do teste se houver pelomenos 

uma cópia de DNA de M. bovis na amostra. 

As amostras de leite coletadas de tanque de expansão, comparadas a 

amostras de leite coletadas individualmente dos tetos dos animais, podem 

apresentar algumas limitações, tendo em vista o grande número de micro-

organismos no leite do tanque; todavia, podem também ser utilizadas para a 

detecção de micobactérias com sucesso, como trabalho de Zumarraga et al. 

(2012), em que foram avaliados 257 amostras de leite de tanque de expansão 

na região de Santa Fé, Argentina, procedentes de 177 rebanhos certificados 

livres de TB e de 80 rebanhos não certificadas, tendo-se verificado 38% de 

positividade em rebanhos certificadas livres de tuberculose e em 44% de 

rebanhos não certificadas livres de tuberculose. Os autores colocam ainda, que 

a coleta de leite a partir de tanques de resfriamento deve ser aplicada na 



 
50 

 

inspeção oficial de rebanhos leiteiros, o que aumentaria a eficácia diagnóstica, 

com o uso de provas moleculares em detrimento do PPD tradicional, realizado 

em apenas um número pequeno de vacas (10%).  

 A partir do momento da detecção de amostras positivas no tanque, o 

diagnóstico deve ser confirmado testando-se individualmente os animais do 

rebanho. No entanto, as Informações sobre teste tuberculínico realizado no 

rebanho bovino das propriedades avaliadas não foram solicitadas, tendo em vista 

que as amostras de leite coletadas inicialmente do tanque de resfriamento foram 

conduzidas com a finalidade de pesquisa de outra bactéria. 

Franco et al. (2013) verificaram que, a partir de 300 amostras de leite de 

tanques de expansão individuais e coletivos e amostras obtidas do comércio 

informal, da região Sudeste do Estado de São Paulo, a partir do isolamento e 

provas moleculares, foram identificadas 15 espécies distintas de Mycobacterium, 

sendo apenas uma amostra positiva para M. bovis, procedente de tanque de 

expansão individual. 

A detecção de M. bovis a partir de 77 vacas negativas ao teste 

tuberculínico foi observado no trabalho de Zarden et al. (2013), tendo-se coletado 

leite de oito vacas em lactação. A partir da PCR para M. bovis, quatro amostras 

foram positivas e uma amostra positiva ao isolamento. 

Apesar dos resultados negativos obtidos nesta pesquisa, a vigilância 

epidemiológica é de grande importância para o produtor e para a saúde pública, 

visto que M. bovis é um patógeno zoonótico com alta possibilidade de 

transmissibilidade para o ser humano pelo consumo de leite cru e seus derivados 



 
51 

 

e pelo consumo de carne contaminada.  Além disso, os animais infectados 

representam importantes fontes de infecção para os profissionais que trabalham 

nas cadeias produtivas (ABRAHÃO et al., 2005). 

Segundo a Lei nº 8.080/90 a Vigilânica Epidemiológica é: 

“um conjunto de ações que proporcionam o conhecimento, a detecção 
ou prevenção de qualquer mudança nos fatores determinantes e 
condicionantes de saúde individual ou coletiva, com a finalidade de 
recomendar e adotar as medidas de prevenção e controle das doenças 
ou agravos.” (BRASIL, 1990)   

 

Portanto, encontrar uma amostra positiva em um tanque de expansão re-

presenta um grande problema de saúde pública. Para isso, faz-se necessário a 

vigilância epidemiológica constante e ativa (ALMEIDA et al., 2016). 

Em países em desenvolvimento, há fatores de risco potenciais 

associados, que demonstraram serem propícios à disseminação e persistência 

da TBb, como por exemplo hábitos alimentares, havendo uma cultura de que o 

leite cru é mais rico, nível educacional como pouco conhecimento a respeito 

dessas doenças transmitidas de animais para seres humanos, estilo de vida, 

status socioeconômico, cultura, entre outros (KEMAL et al., 2019). 

A agricultura familiar é caracterizada como uma agricultura de subsistên-

cia, de pequena produção e de pobreza rural e é a principal responsável pela 

produção dos alimentos direcionados para o consumo da população (BRASIL, 

2019b). A pesquisa de micobactérias a partir de leite procedente de pequenas 

propriedades com estas características é importante e necessária, tendo em vista 

que há a utilização do leite cru para uma complementação de renda, em que 



 
52 

 

alguns pequenos produtores comercializam o leite cru e também produzem deri-

vados deste leite, como queijo e manteiga, o que pode se constituir em um trans-

missor potencial da tuberculose zoonótica.  

O leite bovino e a cadeia produtiva do leite são relevantes para o agrone-

gócio brasileiro, sendo o produto final e os derivados de leite de extrema impor-

tância para o ser humano, além da atividade leiteira possibilitar a geração de 

renda. Um importante fator na produção leiteira brasileira é ser predominante-

mente de pequenas e médias propriedades, sendo a mão-de-obra estritamente 

familiar, de onde vem a principal fonte de renda Além disso, de acordo com o 

Censo Agropecuário as pequenas propriedades de característica de agricultura 

familiar correspondem a 57% de toda a produção de leite do país (INSTITUTO 

BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA, 2017; BARCELLOS et al., 

2019). 

Alguns estudos demonstram a cultura do leite cru como sendo mais “rico” 

e nutritivo, predominando em algumas populações, como relatam Ribeiro Júnior 

et al. (2020) em seu trabalho, em que cerca de 7,3% de 2.052 pessoas ainda 

consomem o leite cru (vendido em garrafas pet); ainda, Pieri et al. (2014) relata-

ram que, 18,5% das pessoas entrevistadas em Minas Gerais consomem leite cru. 

As amostras de leite coletadas de fazendas leiteiras para realização de triagem 

têm sido utilizadas para controlar a transmissão de doenças infecciosas, inclu-

indo a tuberculose zoonótica (FRANCO et al., 2013). 

Badini et al. (1996) conduziram um estudo identificando dez produtores 

rurais que comercializavam o leite cru nos municípios de Botucatu e São Manuel 



 
53 

 

(SP). Desses produtores, apenas cinco amostras de leite de um total de 60, apre-

sentavam características microbiológicas dentro dos padrões legais, evidenci-

ando a má qualidade do leite comercializado de forma incorreta. Considerando 

que o leite é comercializado de forma clandestina, desobedecendo a legislação, 

sabe-se que o consumo deste produto expõe a saúde do consumidor a riscos.  

Trabalho desenvolvido por Cezar et al. (2016), dentre 802 amostras de 

leite bovino analisadas, verificou-se uma amostra (0,25%) e oito amostras de 

sangue (2%) positivas para M. bovis pela qPCR, o que demonstra a necessidade 

da constante vigilância para a tuberculose nos rebanhos, tendo em vista a 

gravidade desta doença para a saúde pública. 

O avanço e desenvolvimento das técnicas de biologia molecular podem 

ajudar a determinar fontes de infecções e surtos, além de possibilitar entender a 

relação entre diferentes surtos e identificar reservatórios de M. bovis em animais 

selvagens (RAMOS et al., 2014). Esse método diagnóstico para a TBb nos 

rebanhos tornou possível o avanço das pesquisas e o conhecimentos sobre a 

complexidade do processo imunológico na tuberculose; assim, há possibilidade 

de ter conhecimento da infecção por M. bovis nos animais antes do aparecimento 

de lesões e o encaminhamento de bovinos infectados para o abate, evitando o 

surgimento de um problema de saúde pública (FLAMINIO, 2019).  Além disso, os 

estudos epidemiológicos moleculares visam fornecer a caracterização completa 

dos agentes infecciosos, com o objetivo de identificar as fontes físicas, vias de 

transmissão, gênes de virulência, resistência a drogas, entre outros (EL-SAYED 

et al., 2016). 



 
54 

 

Um estudo conduzido por Almeida (2021) revelou uma prevalência de 

2,65% de M. bovis carcaças de bovinos no estado de São Paulo; já no estudo de 

Maurélio (2014) foi encontrado uma prevalência de 0,8% de animais reagentes 

em pequenas propriedade rurais do município de Botucatu-SP. Há a necessidade 

de mais estudos para que haja o monitoramento da infecção nos rebanhos 

bovinos, principalmente devido ao comércio clandestino de leite cru e fabricação 

de derivados com o uso do leite não pasteurizado.   

Segundo dados da OMS, dentre 10 milhões de pessoas que 

apresentavam TB, em 140.000 tratava-se de casos de TB zoonótica, dos quais 

cerca de 11.400 vieram a óbito (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2020b). 

Observando o grande número de novos casos de tuberculose zoonótica, a 

constante inspeção das fazendas leiteiras e o seguimento dos protocolos 

impostos pelo PNCEBT são de extrema importância, principalmente por ainda 

existir consumo e comércio informal do leite. 

Em 2017, quatro parceiros da área da saúde, a OMS, a Organização 

Mundial da Saúde Animal (OIE), a Organização das Nações Unidas para 

Agricultura e Alimentação (FAO) e a União Internacional Contra Tuberculose e 

Doenças Pulmonares (The Union), se uniram para criar o primeiro roteiro para 

combater a TB animal e a sua transmissão para seres humanos. Esse roteiro 

propôs dez ações prioritárias, que devem ser realizadas para quebrar a cadeia 

de transmissão da tuberculose zoonótica e da tuberculose bovina. Essas ações 

baseiam-se em melhorar a base de evidências, aumentando as notificações de 

TB zoonótica em humanos e ampliando a disponibilidade de ferramentas 



 
55 

 

diagnósticas; na redução da transmissão entre animais e humanos 

desenvolvendo estratégias de segurança alimentar e a diminuição da prevalência 

da doença em bovinos, identificando as populações-chave e vias de risco para 

transmissão de TB zoonótica; o fortalecimento da colaboração intersetorial, 

através do aumento da conscientização sobre a TB zoonótica, desenvolvimento 

e implementação de políticas para a prevenção, vigilância e diagnóstico; e o 

compromisso político em financiar a abordagem da doença em nível global, 

regional e nacional. Isso deve-se ao fato da tuberculose zoonótica ir além da 

saúde humana, pois a prevenção e o controle da TBb no animal são de extrema 

importância para evitar a transmissão para o ser humano, além de melhorar a 

segurança alimentar (OIE, 2017). 

 

7. DESAFIOS E LIMITAÇÕES DO ESTUDO  

As amostras de leite bovino procedentes de tanques de expansão podem 

se constituir em uma triagem para a detecção de bactérias do complexo 

Mycobacterium tuberculosis; no entanto, tendo em vista que amostras de leite de 

tanque podem apresentar diversos contaminantes e um grande número de micro-

organismos, podem limitar ou dificultar a detecção das micobactérias. Para 

estudos posteriores na pesquisa de micobactérias, amostras de leite de tanque 

são uma alternativa válida, porém, havendo possibilidade, recomenda-se realizar 

mais de uma coleta de amostras. Ainda, para otimização dos testes moleculares, 

a centrifugação prévia das amostras de leite coletadas pode permitir uma 

otimização na extração do DNA.  



 
56 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CONCLUSÃO 
 

 

 

 

 

 

 

 



 
57 

 

8. CONCLUSÃO 

O universo amostral estudado não apresentou bactérias do complexo 

Mycobacterium tuberculosis. As amostras de leite analisadas a partir de técnicas 

moleculares e com o uso de primers específicos foram negativas. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 
58 

 

 

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68 

 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 

ANEXOS 

 
 
 
 
 



 
69 

 

10. ANEXOS 
 
10.1 Anexo 1: Certificado de aprovação da pesquisa pela Comissão 

de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Medicina da 

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Botucatu, São 

Paulo. 



 
70 

 

10.2 Anexo 2: Protocolo de extração das amostras de leite com o Kit 

comercial Illustra Blood GenomicPrep (GE Healthcare®). 

1. Em um microtubo de 1,5 mL, adicionar 900µL da amostra de leite. 

2. Centrifugar a 14.000g por 2 minutos. 

3. Eliminar o sobrenadante por inversão, deixando o pellet. Retirar a 

gordura da parede do tubo com swab estéril (individual) 

4. Adicionar ao pellet 40 µL de tampão de lisozima e misturar imedia-

tamente em vórtex. 

5. Adicionar 10 µL de lisozima (10mg/mL) e misturar em vórtex. 

6. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos, agitando-se oca-

sionalmente. 

7. Adicionar 10 µL da proteinase K (20mg/mL) e agitar em vórtex. 

8. Incubar a 56ºC por 15 a 30 minutos, agitando-se ocasionalmente 

9. Prossiga com a adição de 400 µL da Lysis Solution no microtubo. 

Homogeneize bem com vórtex por 15 segundos. 

10. Incube o microtubo em temperatura ambiente por 10 minutos com 

homogeneização intermitente para lise adicional. 

11. Centrifugue rapidamente a 5000 g (rcf) por 1 minuto (ou 7000 rpm 

em 1 minuto) para levar as amostras para baixo. 

12. Monte uma mini-coluna sobre o tubo de coleta fornecido. Use colu-

nas individuais para amostras individuais. Estas colunas dão descartáveis. 

13. Abra a tampa da coluna e transfira o lisado completo (450 µL) para 

a coluna usando a micropipeta. 



 
71 

 

14. Feche a tampa da coluna e transfira-a para uma microcentrífuga. 

Centrifugue a 11.000g por 1 minuto (ou a 10.400 rpm por 1 minuto). 

15. Remova o tubo da coleta contendo o líquido cuidadosamente, sem 

tocar a base da coluna. Descarte esse líquido. 

16. Adicione 500 µL da Lysis Solution na coluna e centrifugue a 

11.000g por 1 minuto. Este passo adicional garante a completa lise das células 

e desnatura qualquer proteína residual. 

17. Descarte o líquido. 

18. Adicione 500 µL de Wash Buffer à coluna e centrifugue a 11.000g 

por 3 minutos. 

19. Descarte o tubo de coleta com o líquido. 

Importante: não deve sobrar nenhuma solução de lavagem (etanólica) na 

coluna. Se isso ocorrer, descarte o líquido da coluna e centrifugue por mais 

1 minuto. O DNA preso à matriz de sílica está altamente puro e agora pronto 

para eluição. 

20. Transfira a coluna de purificação para um microtubo novo. 

21. Adicione 200 µL do Elution buffer (tampão de eluição) pré-aquecido 

a 70ºC diretamente na coluna. 

22. Incube a coluna por 1 minuto em temperatura ambiente. 

23. Centrifugue a 11.000g por 1 minuto para recuperar o DNA. 

24. O DNA eluído está pronto para as aplicações seguintes. Armazenar 

a -20ºC. 

 



 
72 

 

10.3 Anexo 3: Quantificação de DNA a partir da extração das 

amostras de leite de tanque de expansão. 

 

AMOSTRAS RELAÇÃO 260/280 DNA AMOSTRA (ng/ul) 

1 2.927 8.1 

2 2.060 15.6 

3 1.882 17.5 

4 2.234 15.3 

5 2.437 12.6 

6 2.148 16.0 

7 2.630 12.1 

8 2.036 17.0 

9 6.080 7.6 

10 2.060 20.5 

11 1.900 13.3 

12 1.963 26.5 

13 2.368 10.3 

14 2.289 9.5 

15 2.215 13.4 

16 2.185 16.5 

17 2.152 17.0 

18 2.171 16.5 

19 2.080 14.3 

20 2.176 18.5 

21 2.020 14.9 

22 2.036 17.0 

23 2.242 18.5 

24 2.090 18.5 

25 2.256 22.0 

26 2.374 16.5 

27 2.379 16.6 

28 2.143 21.0 

29 1.741 121.0 

30 2.312 18.5 

31 3.051 6.0 

32 2.404 5.7 



 
73 

 

33 1.980 4.9 

34 2.011 18.0 

35 1.648 21.5 

36 2.222 17.0 

37 1.809 18.0 

38 1.727 21.5 

39 1.600 76.00 

40 2.020 20.0 

41 1.860 15.9 

42 1.457 102.0 

43 2.112 8.5 

44 1.965 11.3 

45 2.571 7.2 

46 1.632 6.2 

47 1.534 56.0 

48 2.143 12.8 

49 2.539 11.3 

50 2.559 13.1 

51 2.268 9.3 

52 1.898 28.0 

53 2.062 26.5 

54 2.124 27.5 

55 1.835 25.5 

56 1.485 50.5 

57 2.147 24.5 

58 2.168 22.0 

59 1.212 31.5 

60 2.204 20.5 

61 2.018 22.5 

62 1.905 20.0 

63 1.866 10.5 

64 1.986 14.4 

65 2.071 8.8 

66 1.984 12.6 

67 1.553 8.0 

68 2.229 7.8 



 
74 

 

69 2.246 6.9 

70 2.012 8.2 

71 1.955 8.6 

72 1.783 8.2 

73 1.571 9.4 

74 1.104 18.0 

75 1.199 8.5 

76 1.092 7.7 

77 1.664 9.4 

78 1.676 8.8 

79 1.569 9.1 

80 1.773 9.8 

81 1.469 9.4 

82 1.811 10.1 

83 1.720 13.5 

84 1.756 18.0 

85 1.303 12.1 

86 1.316 15.6 

87 1.378 12.4 

88 1.174 8.8 

89 1.169 12.5 

90 1.297 12.7 

91 1.879 11.7 

92 1.204 5.6 

93 1.880 4.7 

94 2.054 5.8 

95 1.016 12.6 

96 1.831 5.4 

97 1.147 7.4 

98 1.643 92.0 

99 1.707 9.9 

100 1.694 9.4 

101 1.851 9.4 

102 1.873 5.9 

 

 


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