Thales Reggiani de Moura Compostos de Pd(II) contendo ligantes N,S-doadores: síntese, caracterização e estudo da atividade citotóxica Araraquara 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE QUÍMICA – ARARAQUARA Thales Reggiani de Moura Compostos de Pd(II) contendo ligantes N,S-doadores: síntese, caracterização e estudo da atividade citotóxica Prof. Dr. Adelino Vieira de Godoy Neto (Orientador) Prof. Dr. Fillipe Vieira Rocha (Coorientador) (88 páginas) Araraquara 2016 Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. DADOS CURRICULARES DADOS PESSOAIS Nome: Thales Reggiani de Moura Data de Nascimento: 29 de Outubro de 1989 Naturalidade: São José do Rio Preto – SP Nacionalidade: Brasileira Filiação Pai – Antonio Carlos de Moura Mãe – Elaine Aparecida Reggiani de Moura Endereço para Correspondência: Av. Mario Ybarra de Almeida, 1812 Bairro: Vila Bela Vista – CEP: 14800-436 Araraquara – SP e-mail: thales4014@gmail.com FORMAÇÃO ACADÊMICA 2009-2013 Bacharelado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Araraquara. Título: Compostos de paládio (II) contendo tiocarbamoilpirazolinas: síntese, caracterização e investigação da atividade biológica.. Orientador: Adelino Vieira de Godoy Netto. Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP, Brasil. PUBLICAÇÕES 1. BARRA, C. V.; TREU FILHO, O.; ROCHA, F. V.; MOURA, R. T.; NETTO, A. V. G.; MAURO, A. E.; PINHEIRO, J. C.; KONDO, R. T. Experimental and DFT study on the compounds [PdCl2L2] (L =4-methylpyrazole, 4-iodopyrazole). Acta Chim. Slov., v. 62, 2015. TRABALHOS APRESENTADOS EM CONGRESSOS 1. MOURA, T. R.; ROCHA, F. V.; BARRA, C. V.; NETTO, A. V. G.; MAURO, A. E.; FREM, R. C. G.; MANENTE, F. A.; CARLOS, I. Z. “Structure, cytotoxic activity and DNA binding of novel thiocarbamoylpyrazoles Pd(II) complexes: the structure activity relationship between pyrazoles compounds”. International Conference on Medicinal Chemistry – RICT 2015, Avignon – França, de 1º a 3 de julho de 2015. 2. MOURA, T. R.; ROCHA, F. V.; BARRA, C. V.; NETTO, A. V. G.; MANENTE, F. A.; CARLOS, I. Z. “Novos complexos de Pd(II) contendo trifenilfosfina e derivado de tiocarbamoilpirazol: síntese, caracterização e atividade biológica”. 38ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia - SP, 25 a 28 de maio de 2015. 3. MOURA, T. R.; ROCHA, F. V.; BARRA, C. V.; NETTO, A. V. G. “Síntese de novos complexos de paládio(II) contendo tiocarbamoíl pirazolinas”. XXV CIC - Congresso de Iniciação Científica da UNESP, Barra Bonita – SP, 10 a 12 de novembro de 2013. BOLSAS Bolsa de Mestrado (MS) concedida pelo CNPq de março de 2014 à fevereiro de 2016 Bolsa de iniciação científica sob o tema “Complexos de paládio(II) contendo tiocarbamoilpirazóis: síntese, caracterização e investigação da atividade biológica”, concedida pela FAPESP entre fevereiro de 2013 à Julho de 2013. Bolsa de iniciação científica sob o tema “Compostos de paládio(II) contendo ligantes sulfurados: síntese, caracterização e investigação da atividade biológica” concedida pelo CNPq entre agosto de 2012 à dezembro de 2012. FORMAÇÃO COMPLEMENTAR: Minicurso intitulado "Química Medicinal", realizado na 43ª Semana da Química do IQ- UNESP/Araraquara, 2013. Duracao: 12h Minicurso intitulado "Compostos polifenólicos naturais e sintéticos: Da indústria alimentar à farmacêutica", realizado na 38ª RASBQ, Águas de Lindóia, SP, 2015. Duracao: 6h Minicurso intitulado "Química na elucidação de crimes", realizado na 41ª Semana da Química do IQ-UNESP/Araraquara, 2011. Duracao: 28h Minicurso intitulado "Química Verde", realizado na 40ª Semana da Química do IQ- UNESP/Araraquara, 2010. Duracao: 20h Minicurso intitulado "Química Farmacêutica: Pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos orgânicos e inorgânicos", realizado na 39ª Semana da Química do IQ- UNESP/Araraquara, 2009. Duracao: 20h Agradecimentos À Karine, pelos cafés, cervejas, carinho, sinceridade, paciência e personalidade única. Ao prof. Dr. Adelino Vieira de Godoy Netto e prof. Dr. pai Fillipe Vieira Rocha pela orientação e apoio prestado para o desenvolvimento da pesquisa e pela amizade. Aos amigos de laboratório, principalmente ao Rafael, Jéssica e Rodrigo, pelos momentos de descontração, infravermelhos, “bagunça” seguida de botar ordem no lab, sinceridade e sínteses, sínteses e sínteses. “Obrigado, vcs”. À professora Regina Célia Galvão Frem pelas aulas, conversas, dicas, momentos culinários e confraternizações. Ao Grupo de Química de Coordenação e Organometálicos, Carol, Gabi, Nathália, Gibbs, Jader, Elaine, Marcelo, Ronan, Gis, Renata, além da “velha guarda”, Daniel, Rodrigo, Caio, Sahra entre outros. Ao Dr.s Nivaldo Boralle e Lucinéia, ajudas e dicas na obtenção de espectros de RMN, além das sugestões do Nivaldo no Exame de Qualificação. Ao prof. Dr. Sergio Leite pela ótima convivência e sugestões no Exame de Qualificação. Ao prof. Dr. Victor Deflon pela resolução das estruturas moleculares por difração de raios X de monocristal Aos funcionários do Departamento de Química Geral e Inorgânica, À prof. Dr. Iracilda Zeppone Carlos e doutoranda Francine Alessandra Manente pela ajuda nos ensaios de citotoxicidade. À Dr. Bianca Ferreira pela ajuda nos experimentos de espectrometria de massas. Às funcionárias da biblioteca pela Aos amigos de infância de SJRP, Lucas, Rodrigo, Cesar, Bigols, Saboga, Faria, Bolacha... Aos amigos da Pepperstation, Alex, Vini, Seiti, Xinto, Matheuzão e Guisnow pelos momentos de “Standing in line to see the show tonight, and there's a light on...” entre outras do setlist. À família Sathiko-Seiti, pelo apoio, carinho e amizade. Aos integrantes da rep, Ovídio, Irã e Teddy, pelo apoio e ótima convivência... o último apenas pela convivência. Aos professores e funcionarios do DQGI, sobretudo aos professores Mauro, Vânia e Clayston pela conversa e ótima convivência. E ao Marisco pelos momentos de descontração. A minha família pelo apoio dado, incluindo Whisky e a Sara. Ao CNPq pela bolsa de mestrado (...e aos que estou esquecendo!!!) “We sail Through endless skies Stars shine like eyes The black night sighs The moon In silver trees Falls down in tears Light of the night The earth A purple blaze Of sapphire haze In orbit always While down Below the trees Bathed in a coll breeze Silver starlight, breaks down the night And so We pass on by The crimson eye Of great God Mars As we travel The universe” “Planet Caravan” Black Sabbath, 1970 "E para que serve a utopia? Eu dou um passo, o teatro dá dois passos. Eu dou dois passos, o teatro dá quatro passos. A utopia serve para isso: continuar caminhando" Antônio Abujamra (in memoriam) RESUMO Nos últimos anos, o interesse na obtenção de novos fármacos à base de metais visando o tratamento de cânceres vem aumentando consideravelmente. A descoberta da atividade antitumoral da cisplatina e seu subsequente sucesso como fármaco no tratamento do câncer inspirou o estudo de inúmeros complexos análogos, que apresentaram, em geral, padrões similares de atividade antitumoral e susceptibilidade à resistência. Por apresentarem mesmas configuração eletrônica e geometria em relação à compostos de Pt(II), compostos de coordenação contendo o íon Pd(II) foram amplamente estudados, sendo reconhecido para os compostos de Pd(II) contendo ligantes N,S-doadores, modos de ação distintos em relação ao compostos de Pt(II). Neste trabalho foram sintetizados e caracterizados 4 novos complexos de paládio(II) do tipo [PdX(tedmPz’)(PPh3)] {tedmPz’ = N-etil-1-iminotiolato-3,5-dimetilpirazol; X = Cl-, Br-, I-, SCN-; PPh3 = trifenilfosfina}. Os complexos foram caracterizados pelas técnicas de espectroscopia vibracional na região do IV e RMN de 1H e 13C, análise elementar, espectrometria de massas ESI/MS e difração de raios X de monocristal, indicando um ambiente quadrático plano ao redor do metal, com seus sítios de coordenação ocupados pela trifenilfosfina, e pelo ligante tedmPz coordenado de maneira N,S-aniônica e ligante tiocianato ligado de modo N-terminal. Também é descrita a síntese e caracterização espectroscópica na região do IV e RMN de 1H e 13C do ligante tedmPz. A citotoxicidade in vitro do ligante e de todos os complexos foi avaliada pelo método do MTT, frente as culturas celulares de tumores murinos MCF-7 (adenocarcinoma mamário humano). Todos os compostos tiveram sua capacidade de interação com um nucleosídeo (guanosina) investigada com o objetivo de avaliar sua possível interação covalente com o DNA. Os resultados obtidos indicaram que a variação dos ligantes haletos não interferiu na citotoxicidade dos complexos, bem como os compostos sintetizados não apresentaram capacidade de interagir com a guanosina, sendo esta uma evidência preliminar de que a interação covalente entre os compostos sintetizados e a guanina presente no DNA não é o mecanismo de citotoxicidade destes. Vale destacar que todos os compostos foram mais citotóxicos que a cisplatina, obtendo-se em média valores de IC50 de até 2,4 vezes menor que o fármaco de comparação. Palavras-chave: paládio(II), atividade antitumoral, tiocarbamoilpirazóis, trifenilfosfina. ABSTRACT In the last years, the interest of new drugs based on metals in order to treat cancers has been increasing considerably. The discovery of cisplatin antitumor activity and its subsequent success as a cancer treatment drug has inspired the study of several analogous compounds, which presented, in general, similar patterns of antitumor activity and susceptibility to resistance. By presenting the same electronic configuration and geometry of Pt(II) complexes, coordination complex containing Pd (II) ion have been extensively studied, and recognized different activity patterns for these compounds containing ligands N,S-donor in relation to compounds of Pt (II). In this work, were synthesized and characterized four novel complexes of palladium(II) type [PdX(tedmPz')(PPh3)] {tedmPz' = N-ethyl-1-iminothiolate-3,5-dimethylpyrazole; X = Cl- , Br-, I-, SCN-; PPh3 = triphenylphosphine}. The complexes were characterized by vibrational spectroscopy techniques in the IV region and 1H NMR and 13C NMR, elemental analysis, mass spectrometry ESI / MS and X-ray diffraction of single crystal, indicating a square planar environment around the metal with its sites coordination occupied by triphenylphosphine, the N,S-anionic coordination of tedmPz ligand, the N-terminal coordination mode of thiocyanate. It is also described the synthesis and spectroscopic characterization in the IV region and 1H NMR and 13C for the tedmPz compound. The in vitro cytotoxicity of the ligand and all of the complexes were evaluated by the MTT method, against the cell cultures of murine tumors MCF-7 (human breast adenocarcinoma). All compounds had their ability to interact with a nucleoside (guanosine) investigated with the objective of evaluating their possible covalent interaction with DNA. The results indicated that the variation of halide ligands did not affect the cytotoxicity of the complexes and the synthesized compounds showed no ability to interact with guanosine, which is a preliminary evidence that covalent interaction between the synthesized compounds and the DNA is not the main source of cytotoxicity of these. It is noteworthy that all the compounds were more cytotoxic than cisplatin, obtaining an average of IC50 values of up to 2.4 times lower than the comparison drug. Keywords: palladium(II), antitumoral activity, thiocarbamoylpyrazoles, triphenylphosphine. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Dados globais referente ao cancer, no ano de 2012. Verifica-se nele a taxa de 16 indicência (em azul) e mortalidade (em vermelho) referente a diversos tipos de cancer a cada 100.000 Figura 2 – Dados globais referente ao cancer, no ano de 2012. Verifica-se nele a taxa 17 de indicência (em azul) e mortalidade (em vermelho) separado por regiões globais por 100.000 Pessoas Figura 3 – Estágios de formação de um câncer: transformação de uma célula normal 19 (acima) em cancerosa e estágios de progressão Figura 4 – Algumas estruturas dos fármacos e possível fármaco (BBR 3464) de platina(II) 20 Figura 5 – Coordenação da(s) guanina(s) a platina(II) via N7 e formação de ligação 22 hidrogênio entre os grupos NH3 da cisplatina Figura 6 – Formação de aduto entre a cisplatina e o DNA de modo 1,2-intrafita, indicando 22 a posição N7 da guanina mais desimpedida que outros nitrogênios Figura 7 – Etapas de dissociação de um ligante quelante em uma reação de aquação 25 Figura 8 – Estrutura de um dos complexos contendo ligantes N,S-doadores estudado por 26 Das e Livingstone Figura 9 – Fórmula estrutural geral das tiossemicarbazonas e tiocarbamoilpirazóis 28 Figura 10 – Modos de coordenação de ligantes 1-(N-substituído)tiocarbamoilpirazóis 28 Figura 11 – Compostos [CoL3] e [NiL2], sendo L = 3,5-dimetil-1-(N-etil)tiocarbamoilpirazol 29 Figura 12 – Fórmula estrutural geral dos compostos de Pd(II) contendo o ligante 30 1-N-substituido tiocarbamoil-3,5-difenil-2-pirazolina Figura 13 – Fórmulas estruturais dos complexos [Pd(L1)2] (L1 = 5-fenil-3-oxo-2-tiocarbamoil- 30 pirazolonato); [Pd(L2)2] (L2 = 4-etil-5-metil-3-oxo-2-tiocarbamoilpirazolonato) Figura 14 – Síntese dos complexos [PdX2(tmdmPz)] {X = Cl (1), Br (2); I (3); SCN (4); 31 tmdmPz = N-metil-3,5-dimetil-1-tiocarbamoilpirazol} Figura 15 – Ação dos complexos 1-4 no DNA plasmideal pNFkB–Luc 32 Figura 16 – Índices de citotoxicidade (IC50) de complexos de fórmula [PdX2(tdmPz)], 33 [PdX2(tmdmPz)] e [PdX2(tfdmOH)], sintetizados pelo grupo, frente a linhagem de adenocarcinoma mamário murino LM3 Figura 17 – Representação da retrodoação do metal para o átomo de fósforo 34 Figura 18 – Mecanismo associativo para substituição de ligantes em complexos d8 34 Figura 19 – Design de uma nova família de complexos [PdX(T)(PPh3)]X {X = Cl- (1), 35 Br- (2); I- (3); SCN- (4); T = tiossemicarbazidas} a partir dos protótipos [PdX2(tmdmPz)] Figura 20 – Síntese dos complexos [PdX(4-PhT)(PPh3)]X {X = Cl- (1), Br- (2); I- (3); 35 SCN- (4); 4-PhT = N-fenil-tiossemicarbazida} Figura 21 – Estrutura do complexo [PdI(PPh3)(4-PhT)]I (3) 36 Figura 22 – Reação entre os complexos 1-4 e a guanosina 37 Figura 23 – Incubação do plasmídeo com os complexos 1-4 e cisplatina por 24 h. 38 Linha 1: plasmídeo em água. Linha 2: plasmídeo em água/dmf (2.5%) Figura 24 – Incubação do plasmídeo com os complexos 1 e 2 e a topo II por 40 min em 39 diferentes concentrações, C-, controle negativo e C+, controle positivo Figura 25 – Estratégia relacionando-se estrutura-atividade para os tiocarbamoil pirazóis 39 monoquelatos Figura 26 – A estrutura, a priori pretendida, dos quelatos de Pd(II) sintetizados e estudados 40 neste trabalho Figura 27 – Mecanismo de reação entre acetilacetona e hidrazinas 48 Figura 28 – Espectros vibracionais no comprimento de onda do infravermelho para o 49 reagente (4-etil-3-tiossemicarbazida) e composto orgânico tedmPz Figura 29 – Espectro de RMN-1H do composto tedmPz realizado em clorofórmio-d1 50 Figura 30 – Formas possíveis para o ligante tedmPz 51 Figura 31 – Espectro de RMN-13C do composto tedmPz realizado em clorofórmio-d1 51 Figura 32 – Ampliação do espectro de RMN-1H do composto tedmPz realizado em 52 clorofórmio-d1, destacando os sinais referentes aos hidrogênios H7 e H8 Figura 33 – Espectro vibracional da trifenilfosfina na região do infravermelho 53 Figura 34 – Estruturas de ressonância da tioamida 54 Figura 35 – Espectros vibracionais no comprimento de onda do infravermelho para os 56 compostos trifenilfosfina, tedmPz e os complexos sintetizados na região de 4000-400 cm-1 Figura 36 – Espectros de RMN-1H para os complexos sintetizados em clorofórmio-d1 58 Figura 37 – Espectro de RMN de 13C do complexo [PdCl(PPh3)(tedmPz')] (1). 60 Solvente: CDCl3 Figura 38 – Espectro de RMN de 13C do complexo [PdBr(PPh3)(tedmPz')] (2). 60 Solvente: CDCl3 Figura 39 – Espectro de RMN de 13C do complexo [PdI(PPh3)(tedmPz')] (3). 61 Solvente: CDCl3 Figura 40 – Espectro de RMN - 13C do complexo [Pd(NCS)(PPh3)(tedmPz')] (4). 61 Solvente: CDCl3 Figura 41 – Espectro de massas obtido para o composto 1 64 Figura 42 – Espectro de massas calculado para íon molecular do composto 1 65 Figura 43 – Expansão do pico molecular (m/z = 588) do espectro de massas obtido 65 para o composto 1 Figura 44 – Espectro de massas obtido para o composto 2 66 Figura 45 – Expansão do pico molecular (m/z = 632) do espectro de massas obtido 66 para o composto 2 Figura 46 – Espectro de massas obtido para o composto 3 67 Figura 47 – Expansão do pico molecular (m/z = 678) do espectro de massas obtido 67 para o composto 3 Figura 48 – Espectro de massas obtido para o composto 4 68 Figura 49 – Expansão do pico molecular (m/z = 609) do espectro de massas obtido 68 para o composto 4 Figura 50 – Esquema do método de difusão de vapor visando a obtenção de monocristais 69 Figura 51 – Representação ORTEP da estrutura do complexo 2 71 Figura 52 – Representação ORTEP de N,S-complexos de paládio(II) contendo 74 trifenilfosfina Figura 53 – Proposta estrutural aos quelatos de Pd(II) sintetizados e estudados nesta 75 etapa do trabalho, sendo X = Cl-, Br-, I- ou NCS- Figura 54 – Valores de IC50 (µmol L-1) e seus respectivos desvios padrão para os 76 complexos sintetizados em comparação com a cisplatina, utilizando-se da linhagem MCF-7 de adenocarcinoma mamário humano Figura 55 – Estrutura da guanosina, destacando-se os átomos capazes de se coordenar 77 ao paládio(II) Figura 56 – Espectros de RMN-1H para os sólidos obtidos da reação entre complexos 78 e guanosina, em dmso-d6. LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Concetração inibitória (IC50) obtida para os complexos [MCl2(NS)] 27 {M = Pd(II), Pt(II), NS = fenilacetaldeído tiossemicarbazona}, cisplatina, adriamicina e etopósido Tabela 2 – Valores de IC50 (molL–1) para compostos 1-4 frente as linhagens LM3 e LP07 31 Tabela 3 – Valores de IC50 dos compostos [PdX(4-PhT)(PPh3)]X {X = Cl- (1), Br- (2); 36 I- (3); SCN- (4)} e da cisplatina contra as células tumorais murinas LM3 e LP07 após 24 h de exposição Tabela 4 – Procedência de solventes e reagentes 42 Tabela 5 – Proporção de hidrogênios obtida pelo espectro de RMN do ligante 50 Tabela 6 – Dados obtidos por espectroscopia vibracional no IV para trifenilfosfina e suas 53 atrubuições Tabela 7 – Dados obtidos por espectroscopia no IV referente ao ligante tedmPz, seus 57 complexos [PdX(PPh3)(tedmPz’)] (X = Cl-, Br-, I- e SCN-) e suas atribuições Tabela 8 – Dados referentes aos espectros de RMN-1H para o ligante livre e complexos 59 sintetizados Tabela 9 – Dados de RMN de 13C para os complexos 1-4 63 Tabela 10 – Composição dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio, em 64 porcentagem (m/m), calculados e obtidos via análise elementar, dados de temperatura obtidos nos experimentos de ponto de fusão utilizando-se taxa de aquecimento de 3,0 °C/min e condutividade molar em dmf Tabela 11 – Principais dados da coleta de intensidade e de refinamento das estruturas 70 cristalinas e molecular do complexo 2 Tabela 12 – Distâncias de ligação (Å) para o composto 2 71 Tabela 13 – Ligações de hidrogênio e distâncias interatomicas (Å) e seus ângulos (°) 72 para o composto 2 Tabela 14 – Ângulos de ligação (°) para o composto 2 72 Tabela 15 – Comprimentos (Å) e ângulos de ligação (°) de alguns N,S-complexos de 73 paládio(II) contendo trifenilfosfina Tabela 16 – Valores de IC50 (µmol L-1) e seus respectivos desvios padrão para 1-4 e 75 cisplatina, utilizando-se da linhagem MCF-7 de adenocarcinoma mamário humano LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A2780 – Linhagem tumoral de adenocarcinoma de ovário humano DMEM – Dulbecco`s Modified Eagle Medium, mistura de sais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para o crescimento celular da linhagem MCF-7 dmf – N,N-dimetilformamida dmso – dimetilsulfóxido EGFR – Receptor do fator de crescimento epidérmico IC50 – Concentração inibitória de 50% da viabilidade celular IV – infravermelho LM3 – Linhagem tumoral de adenocarcionoma mamário murino LP07 – Linhagem tumoral de adenocarcionoma pulmonar murino MCF-7 – linhagem tumoral humana de carcinoma mamário MeCN – acetonitrila MTT – Sal brometo de 3–(4,5–dimetiltiazol–2–il)–2–5–difeniltetrazólio OC – “opencircular”, DNA em sua forma relaxada ORTEP – Oak Ridge Thermal Ellipsoid Plot, uma representação da estrutura molecular determinada por difração de raios-X Pam 212 – Linhagem celular de tecido epitelial Pam-ras – Células de queratinócitos murinos transformados e resistentes ao cisplatina PPh3 – Trifenilfosfina RMN – Ressonância Magnética Nuclear SC – “supercoiled”, DNA em sua forma supertorcida tedmPz – 3,5-dimetil-1-(N-etil)tiocarbamoilpirazol tedmPz’ – N-etil-1-iminotiolato-3,5-dimetilpirazol tmdmPz – 3,5-dimetil-1-(N-metil)tiocarbamoilpirazol tfdmOH – N-fenil-3,5-dimetil-5-hidróxi-1-tiocarbamoilpirazolina nJ – Acoplamento entre dois núcleos a “n” distâncias de ligação ν – Estiramento νas – Estiramento assimétrico γ e δ – Deformações angulares SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 16 1.1 O câncer: a doença e a quimioterapia 16 1.2 Compostos quelatos de Pd(II): uma alternativa promissora no 23 design de novos agentes citotóxicos a células tumorais 1.3 Compostos quelatos contendo ligantes N,S-doadores 26 1.4 Ligantes tiocarbamoilpirazóis 27 1.5 Ligantes fosfínicos 33 1.6 Princípios norteadores usados no planejamento de novos 39 compostos de coordenação 2. OBJETIVOS 41 3. PARTE EXPERIMENTAL 42 3.1 Procedência de solventes e reagentes 42 3.2 Metodologia de síntese 42 3.3 Síntese dos compostos 43 3.4 Métodos instrumentais 45 3.5 Testes biológicos com células tumorais 46 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 48 4.1 Caracterização espectroscópica do composto tedmPz (3,5-dimetil- 48 -1-(N-etil)tiocarbamoilpirazol) 4.2 Caracterização dos complexos do tipo [PdX(PPh3)(tedmPz’)] 52 {X = Cl; Br; I; SCN} 4.2.1 Espectroscopia vibracional na região do IV para os complexos 55 4.2.2 Espectroscopia de RMN-1H e 13C para os complexos 57 4.3 Resultados de análise elementar, ponto de fusão de condutividade 63 molar 4.4 Espectrometria de Massas 64 4.5 Difração de raios X de monocristal 69 4.5.1 Tentativa de obtenção de monocristais 69 4.5.2 Determinação estrutural via difração de raios X de monocristal 69 4.6 Proposição estrutural 75 4.7 Ensaios biológicos 75 4.8 Reação com o nucleosídeo guanosina 76 5. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS 79 Referências 81 16 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO 1. INTRODUÇÃO 1.1 O câncer: a doença e a quimioterapia O câncer é a principal causa de morte nos países desenvolvidos. Com mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo, estima-se que a doença alcançará quase 20 milhões de pessoas em 2020, segundo a União Internacional Contra o Câncer1. Assim como a maioria dos países em desenvolvimento, o câncer no Brasil representa a segunda causa de óbito na população adulta, segundo dados do INCA (Instituto Nacional do Câncer), totalizando 190 mil óbitos por ano, atrás apenas de doenças cardiovasculares2. A última estimativa de câncer no Brasil, lançada em novembro de 2015, prevê 596 mil novos casos da doença no país para o ano de 20162. Destacam-se os tipos de mama, próstata e pulmão por suas altas taxas de incidência. Figura 1 – Dados globais referente ao cancer, no ano de 2012. Verifica-se nele a taxa de indicência (em azul) e mortalidade (em vermelho) referente a diversos tipos de cancer a cada 100.000 Fonte: Adaptado de Globocan3 17 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Apesar da maior taxa incidência da doença em regiões desenvolvidas, a taxa de mortalidade é similar em todas as regiões no mundo (Figura 3). Um relatório da Globocan 2012, o mais completo sobre o ônus global do câncer no mundo, divulgado pela Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (IARC), da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostra que aproximadamente 70% dos 12,7 milhões de novos casos de câncer e 7,6 milhões de mortes pela doença em todo o mundo ocorreu em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento3. Dessa forma, a necessidade urgente de desenvolver terapias mais eficazes no combate ao câncer é justificada pelos enormes esforços e investimentos multibilionários destinados a pesquisas realizadas por multinacionais farmacêuticas e institutos de pesquisa. Figura 2 – Dados globais referente ao cancer, no ano de 2012. Verifica-se nele a taxa de indicência (em azul) e mortalidade (em vermelho) separado por regiões globais por 100.000 pessoas Fonte: Adaptado de Globocan3 18 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Caracterizada por uma população de células que cresce e se divide sem respeitar os limites normais dos órgãos, o câncer invade e destrói tecidos adjacentes e pode se espalhar para lugares distantes no corpo, sendo este último processo chamado metástase4. A posteriori o processo pode ser concatenado com a formação de uma nova lesão tumoral, mas sem continuidade entre as duas, resultando com que as células neoplásicas desprendidas do tumor inicial sejam levadas para um local distante, formando nesse local uma nova colônia. Este processo é inerente aos tumores malignos e não ocorre em tumores benignos, sendo o último auto-limitado em seu crescimento e não invasivos a tecidos adjacentes. O câncer pode afetar pessoas de todas as idades, sendo a incidência maior na população idosa5. Existem cerca de 200 tipos de câncer, sendo estes gerados por anomalias no material genético com a formação de células transformadas. Estas anomalias podem ser resultado dos efeitos de carcinógenos – ou fatores externos – como o tabagismo, radiação, substâncias químicas e agentes infecciosos5. Outros tipos de anormalidades genéticas podem ser adquiridos através de erros na replicação do DNA, ou são herdadas e por consequência estão presentes em todas as células do nascimento, estes são chamados de fatores internos. A classificação do câncer também é dada de acordo com o tecido originado ou tipo de célula em que se assemelham. Se o câncer tem seu início em tecidos epiteliais, como pele ou mucosas, este é denominado carcinoma. São chamados de sarcoma os cânceres que têm origem em tecidos conjuntivos (osso, músculo e cartilagem) e adenocarcinoma aqueles que iniciaram de tecidos glandulares (mama, pâncreas, tireóide entre outros). Além destas características, são usadas para classificar o tipo de câncer outras variáveis, como velocidade de multiplicação das células e capacidade de invadir tecidos e órgãos distantes4. O processo de formação do câncer (Figura 2) se dá a partir de três etapas principais: I) Estágio de iniciação, em que células normais sofrem uma ação de agentes cancerígenos, causando-lhes modificações em seu material genético; II) Estágio de promoção, onde as células alteradas são transformadas lentamente em células malignas e III) Estágio de progressão, etapa em que células malignas se multiplicam e se acumulam nos tecidos, dando origem ao tumor6,7. Os principais tratamentos são: I) Cirurgia, onde envolve a remoção total do tumor caso este não esteja espalhado em órgãos vitais; II) Radioterapia, utilizando-se radiações para destruir um tumor ou impossibilitar que seu volume aumente e III) quimioterapia, baseado no uso de medicamentos que atuem no DNA ou outros alvos farmacológicos de células tumorais. Também são realizados a hormonioterapia e imunoterapia em casos específicos. Cada uma dessas modalidades apresenta vantagens e desvantagens, sendo que os resultados mais efetivos são alcançados a partir da combinação desses tratamentos. Apesar dos recentes avanços em 19 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO cirurgia e radioterapia, as mudanças mais revolucionárias que ocorreram nos últimos 40 anos no tratamento do câncer foram na área de quimioterapia. Figura 3 – Estágios de formação de um câncer: transformação de uma célula normal (acima) em cancerosa e estágios de progressão (abaixo) Fonte: Autor A descoberta da atividade antitumoral da cisplatina, o complexo cis-[PtCl2(NH3)2], nos anos 60 por Rosemberg8 e seu subsequente sucesso como fármaco no tratamento do câncer9 tornou a cisplatina um dos agentes quimioterápicos mais utilizados atualmente, sobretudo no tratamento de câncer de pulmão, cabeça, esôfago, estômago, mama, cérvix, bem como linfomas, melanomas e osteossarcomas10-12, atuando na maioria das vezes com bons percentuais de cura. A utilização deste fármaco foi protagonista de uma revolução no tratamento de câncer de testículo, com sucesso também contra alguns tumores de ovários e de colón8. Este composto de coordenação se tornou o quimioterápico mais utilizado no tratamento do câncer, sendo atualmente utilizado em conjunto com outros fármacos. Após a descoberta da cisplatina, um número significativo de complexos de platina foi sintetizado buscando investigar a atividade antitumoral dessas novas espécies, sendo alguns dos 20 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO análogos estudados aprovados para comercialização. A carboplatina (Figura 4), ou cis- [diamino(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platina(II)] possui importância no tratamento de câncer de ovário devido a sua menor nefrotoxicidade que a cisplatina13,14. A oxaloplatina (ou cis-[1,2- diamino(cicloexanooxalato) platina(II)], é utilizada no tratamento no câncer colorretal, em que a cisplatina não apresenta-se ativa15-17. Ainda há no mercado a cis-diaminoglicolatoplatina(II) (nedaplatina), que recebeu aprovação para uso clínico no Japão18, a lobaplatina, aprovada na China para o tratamento de alguns tipos de câncer em estágio avançado, e o BBR 3463, um complexo contendo três unidades de platina, o qual obteve-se resultados promissores em testes clínicos de fase I, porem foi inativo em testes de fase II 19. Figura 4 – Algumas estruturas dos fármacos e possível fármaco (BBR 3464) de platina(II) Fonte: Adaptado de FONTES et al.18 21 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Os esforços intensos direcionados em pesquisa na área da quimioterapia do câncer mediada por compostos de platina permitiu evidenciar que a cisplatina e seus análogos apresentam, em geral, padrões similares de atividade antitumoral e susceptibilidade à resistência, o que sugere que a maioria desses compostos possuem o mesmo mecanismo de ação. Apesar de uma vasta literatura sobre interações entre complexos metálicos e o DNA, a natureza destas ligações, bem como suas geometrias e mecanismos de ação associados a estes compostos é assunto de debate20. Por apresentarem um centro metálico catiônico, estes foram associados à capacidade de se ligar a biomoléculas negativamente carregadas, tornando proteínas e ácidos nucléicos alvos evidentes para estes compostos21. Dentre os diversos mecanismos discutidos referente a ação da cisplatina22,23, o mais compreendido é o de sua interação com as bases nitrogenadas do DNA. A priori, a cisplatina entra na célula por difusão passiva ou transporte ativo24, uma vez no interior da célula, o complexo tem um ou dois cloretos substituídos por moléculas de água (hidrólise), dando origem a moléculas positivamente carregadas, cis-diaminoaquocloroplatina(II) e cis-diaminodiaquo platina(II) respectivamente. Este processo de hidrólise gera complexos mais reativos capazes de interagir covalentemente com o DNA. A formação de adutos platina-DNA é reconhecida por algumas proteínas, que poderão atuar reparando o DNA distorcido ou provocando a morte dessa célula em um processo chamado apoptose. Dentre as bases nitrogenadas do DNA, a principal neste processo da formação do complexo Pt-DNA são guanina e adenina, tanto por estarem mais disponíveis para a coordenação na estrutura do DNA quanto pela formação de ligação hidrogênio entre os grupos NH3 da cisplatina e os átomos de nitrogênio (amina primária) e oxigênio (amida, Figura 5) da adenina e guanosina, respectivamente25-27. As pesquisas realizadas referente à formação destes adutos permitem afirmar que o principal aduto formado entre cisplatina e DNA é do tipo 1,2- intrafita, formado pela ligação do metal e duas guaninas adjacentes26-29,23, conforme é indicado na Figura 6. 22 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 5 – Coordenação da(s) guanina(s) à platina(II) via N7 e formação de ligação hidrogênio entre os grupos NH3 do cisplatina Fonte: Adaptado de GIESE B. et al.27 Figura 6 – Formação de aduto entre a cisplatina e o DNA de modo 1,2-intrafita, indicando a posição N7 da guanina mais desimpedida que outros nitrogênios Fonte: Adaptado de WANG, D. et al.23 Um dos problemas encontrados no tratamento com a cisplatina é a vulnerabilidade ao ataque de substâncias encontradas no plasma sanguíneo, especialmente as que possuem grupos tiois, como albumina e cisteína. Isto ocorre devido a preferência de coordenação à platina, um ácido polarizável, ao enxofre, uma base polarizável30. Este processo faz com que após um dia de ser administrada, 65-98% do cisplatina se ligue a estes compostos, resultando na diminuição da concentração do fármaco ativo in vivo31. 23 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Além do surgimento de resistência celular e espectro de atividade insuficiente no tratamento da doença, há também graves efeitos colaterais, como neurotoxidez, nefrotoxidez e toxidez ao trato intestinal manifestada através de náuseas e vômitos intensos. Estes efeitos surgem também através da reatividade da cisplatina, tornando possível a platina se coordenar com diversas proteínas e peptídeos, resultando em atividade citotóxica considerável às células sadias. Assim, existe a possibilidade de que os futuros agentes antitumorais a base de metais de transição possam apresentar estruturas bem diferentes daquelas observadas em complexos tradicionais de platina. De acordo com a literatura, existe um número cada vez maior de evidências que o mecanismo de ação dos complexos não-convencionais – que violam as relações estrutura-atividade da cisplatina, como complexos catiônicos, quelatos entre outros – seja diferente daquele observado para a cisplatina e seus derivados. Além disso, o padrão de atividade antitumoral desses complexos também costuma ser diferente relacionado ao cisplatina. Assim, é possível criar estratégias para a projeção de complexos metálicos com diferentes espectros de citotoxicidade frente as linhagens tumorais sensíveis e resistentes ao cisplatina32,33. 1.2 Compostos quelatos de Pd(II): uma alternativa promissora no design de novos agentes citotóxicos às células tumorais O interesse crescente nas potencialidades farmacológicas de derivados de Pd(II) está associado ao fato desse íon ser isoeletrônico ao Pt(II), seus complexos também apresentarem a geometria de coordenação quadrática-planar e ambas as espécies possuem praticamente o mesmo raio iônico (Pt(II) = 0,74 Å e Pd(II) = 0,78 Å)34. Os primeiros ensaios citotóxicos não foram muito promissores, pois mostraram que os compostos de Pd(II) eram bem menos ativos em relação aos compostos de Pt(II). Muitos autores sugeriram que os avanços nesta área seriam limitados provavelmente em função de parâmetros cinéticos, uma vez que complexos de Pd(II) reagem ≈ 105 vezes mais rapidamente que seus análogos de Pt(II). Assim, a baixa atividade antitumoral de parte dos complexos de Pd(II) foi atribuída aos rápidos processos de hidrólise que conduziam à dissociação dos grupos abandonadores em solução e, consequentemente, à formação de espécies muito reativas incapazes de atingir seus alvos farmacológicos35. Utilizando-se argumentos da Química de Coordenação, uma alternativa para minimizar esse efeitos cinéticos consiste no planejamento de compostos quelatos de paládio(II). 24 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Para se obter compostos quelatos, é necessário a utilização de ligantes que sejam capazes de se coordenar ao centro metálico através de 2 ou mais átomos. O efeito quelato termodinâmico torna os complexos quelatos mais estáveis termodinamicamente que os seus análogos constituídos por ligantes monodentados devido, em parte, a fatores entrópicos que acompanham a liberação dos ligantes da esfera de coordenação36. O efeito quelato também influencia os parâmetros cinéticos de complexos metálicos. A reação de substituição de um ligante quelato é geralmente mais lenta quando comparada a de um ligante monodentado. As explicações para esse efeito baseiam-se em dois fatores: a energia necessária para retirar o primeiro átomo coordenado e a probabilidade da reversão dessa primeira etapa37 (Figura 7). A variação de entalpia associada à remoção do primeiro átomo coordenado é maior do que para um ligante monodentado relacionado. Se esse átomo realmente se descoordenar, sua barreira cinética para religação subsequente é menor do que para um ligante monodentado análogo, pois o átomo descoordenado do ligante bidentado permanece muito próximo do centro metálico. Por exemplo, a reação de aquação envolvendo o ligante bidentado etilenodiamina (Figura 7) deve ter duas etapas de dissociação, uma para cada átomo coordenado (a adição de água nas etapas 2 e 4 deve ser provavelmente rápida, devido a sua alta concentração): 25 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 7 – Etapas de dissociação de um ligante quelante em uma reação de aquação Fonte: Adaptado de MIESSLER et al.37 A primeira etapa de dissociação (1) da etilenodiamina é esperada ser mais lenta que a dissociação similar da amônia, pois o ligante deve se dobrar e girar para afastar do metal o grupo amino livre. A segunda etapa de dissociação (3) também deve ser lenta uma vez que a concentração desse intermediário é baixa e porque também a primeira etapa de dissociação (1) pode ocorrer facilmente no sentido inverso. O nitrogênio descoordenado é mantido próximo ao metal pelo resto do ligante, fazendo com que a sua religação seja muito provável37. No geral, esse efeito quelato cinético reduz as velocidades de reações de aquação por fatores de 20 a 105. Uma estratégia empregada com sucesso no planejamento de compostos de Pd(II) com atividade citotóxica promissora frente as células tumorais e microorganismos patógenos foi inspirada no trabalho clássico de Das e Livingstone38 Após investigarem a atividade antitumoral de um grande número de quelatos metálicos contendo bases de Schiff derivados de S-alquilcarbazatos (exemplo na Figura 8), os autores concluíram que dentre os quelatos em que o ligante bidentado apresenta, no mínimo, um átomo de enxofre, os de Pd(II) são mais citotóxicos que os de outros metais. Segundo os autores, os N,S-quelatos de Pd(II) possuem uma cinética de substituição ideal para manter a integridade estrutural do complexo metálico tempo suficiente em solução, até alcançar e, posteriormente, interagir com o DNA das células cancerosas39. 26 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 8 – Estrutura de um dos complexos contendo ligantes N,S-doadores estudado por Das e Livingstone Fonte: Adaptado de DAS e LIVINGSTONE38 Dentre os ligantes N,S-doadores mais usados para sintetizar complexos de Pd(II) bioativos, destacam-se as tiossemicarbazonas e os ditiocarbazatos por apresentarem atividade frente a microorganismos patogênicos e células tumorais40. Muitos autores têm demonstrado que a citotoxicidade dos complexos de Pd(II) contendo tiossemicarbazonas é resultado, pelo menos em parte, da sua interação frente ao DNA. 1.3 Compostos quelatos contendo ligantes N,S-doadores A literatura recente também tem mostrado que complexos de paládio(II) de fórmula geral [PdCl2(NS)] (NS = tiossemicarbazonas) são ativos em células tumorais resistentes ao cisplatina39,41. Um exemplo ilustrativo é observado no trabalho de Quiroga et al.39, no qual foi descrito que complexos de fenilacetaldeído tiossemicarbazona do tipo [MCl2(NS)], M = Pd(II), Pt(II), foram citotóxicos frente a uma variedade de linhagens tumorais, com um bom índice terapêutico, isto é, valores de concentrações inibitórias (IC50) muito menores para células resistentes ao cisplatina (Pam-ras) do que para células normais (Pam 212) (Tabela 1). 27 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Tabela 1 – Concetração inibitória (IC50) obtida para os complexos [MCl2(NS)] {M = Pd(II), Pt(II), NS = fenilacetaldeído tiossemicarbazona}, cisplatina, adriamicina e etopósido39 IC50 (M)  sd Pam-ras HL 60 Pam 212 M=Pd 23  0,1 9  0,2 124  3 M = Pt 65  1 28  0,7 200  9 Cisplatina 157  6 7  0,2 164  6 Adriamicina 156  5 150  3 Etoposideo 136  10 180  12 Fonte: Adaptado de QUIROGA, A. G. et al Além de ser mais ativo que o seu análogo de Pt(II), o complexo [PdCl2(NS)] apresentou maior citotoxidade do que os fármacos etoposídeo e adriamicina35,39. Estudos de mecanismo de ação, através da análise da interação dos complexos com o DNA, indicaram que os complexos de Pd(II) e Pt(II) formam principalmente ligações interfitas, diferente do cisplatina, que realiza preferencialmente ligações intrafitas25,28. O complexo de paládio(II) exibe maior atividade citotóxica sobre as células resistentes e forma mais ligações interfitas do que o análogo de platina(II), provavelmente em razão da sua maior reatividade. 1.4 Ligantes tiocarbamoilpirazóis Nos últimos anos, os 1-tiocarbamoilpirazóis vêm atraindo cada vez mais interesse devido a sua analogia estrutural com relação às tiossemicarbazonas (Figura 9). Os 1- tiocarbamoilpirazóis possuem variados modos de coordenação, como mostra a Figura 10, sendo o mais comum em complexos de paládio(II), ou outros íons metálicos polarizáveis, pelo átomo de enxofre e pelo átomo de nitrogênio piridínico do anel pirazólico, formando um anel metalociclo estável de 5 membros. A capacidade dessa classe de ligantes em formar produtos N,S-quelatos de Pd(II) vem sendo explorada por muitos grupos de pesquisa objetivando sintetizar novos complexos com potencial farmacológico. 28 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 9 – Fórmula estrutural geral das tiossemicarbazonas e tiocarbamoilpirazóis Fonte: autor Figura 10 – Modos de coordenação de ligantes 1-(N-substituído)tiocarbamoilpirazóis Fonte: autor Barik et al.42,43 mostraram a síntese e estrutura de dois compostos de Co(III) contendo ligantes 3,5-dimetil-1-(N-metil/etil)tiocarbamoilpirazol de fórmula [CoL3]. A coordenação ao metal se deu de maneira N,N-aniônica (Figura 11, lado esquerdo), via nitrogênio do grupo tiocarbamoil e nitrogênio piridínico. Alem deste, foi relatada a síntese e estrutura de o modo de coordenação N,S-aniônico (Figura 11, lado direito) de um complexo de Ni(II) do tipo [NiL2], evidenciando a capacidade de coordenação do grupo dependente da polarizabilidade do íon metálico utilizado43. 29 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 11 – Compostos [CoL3] e [NiL2], sendo L = 3,5-dimetil-1-(N-etil)tiocarbamoilpirazol Fonte: Adaptado de BARIK, A. K. et al. 42,43 Além disso, a incorporação do núcleo pirazólico na estrutura molecular desses ligantes N,S-doadores representa uma estratégia interessante no design de novos candidatos a fármacos, uma vez que os pirazóis são conhecidos por apresentarem atividade antipirética44, anti- inflamatória45, antiviral46,47 e antitumoral47, enquanto que as pirazolinas (4,5-diidropirazois) conhecidos por suas atividades antitumorais48, anti-inflamatória49, antimicrobiana50 e analgésicas48. Os pesquisadores Lv et al.51 relataram que o composto 3-(3,4-dimetilfenil)-5-(4- metóxifenil)-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carbotioamida apresentou uma atividade inibitória potente frente ao receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em uma concentração de IC50 = 0,07 M, comparável ao controle positivo erlotinibe. As EGFR quinases desempenham uma função importante em cânceres uma vez que receptores proteína tirosina quinases tem um papel vital na sinalização que regulam a divisão celular e a diferenciação51. O composto pirazólico mencionado também foi citotóxico frente a células de tumor MCF-7 (IC50 = 0,08 M). Nesse contexto, Budakoti et al.52 relatam a síntese, caracterização e a investigação in vitro da atividade anti-amoébica de complexos de paládio(II) com ligantes 1-N-substituido- tiocarbamoil-3,5-difenil-2-pirazolina (Figura 12). Os complexos apresentaram valores de concentrações inibitórias de 50 % bem promissores frente ao protozoário Entamoeba histolytica, causador da amebíase, superando em muitos casos o valor encontrado para o fármaco padrão metronidazol (IC50 = 1,82 µM). 30 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 12 – Fórmula estrutural geral dos compostos de Pd(II) contendo o ligante 1-N- substituido tiocarbamoil-3,5-difenil-2-pirazolina Fonte: Adaptado de BUDAKOTI et al.52 Casas et al.53 descreveram a síntese, caracterização e a avaliação da atividade antitumoral de novos complexos bis-quelatos de Pd(II) e Pt(II) com ligantes pirazólicos N,S- quelantes (Figura 13). Estes compostos foram testados em linhagens de células cancerígenas humana de ovário A2780, sensível ao cisplatina e A2780cisR, resistente ao cisplatina. Os complexos de paládio(II) se mostraram mais citotóxicos frente a estas células do que seus análogos de platina(II). Em relação à citotoxicidade frente a linhagem A2780, o composto [Pd(L1)2] demonstrou resultado similar à cisplatina. Já em relação à linhagem resistente A2780cisR, ambos os compostos demonstraram ser consideravelmente mais ativos que o cisplatina, com valores de IC50 < 1,3 M. Figura 13 – Fórmulas estruturais dos complexos [Pd(L1)2] (L1 = 5-fenil-3-oxo-2-tiocarbamoil- pirazolonato); [Pd(L2)2] (L2 = 4-etil-5-metil-3-oxo-2-tiocarbamoilpirazolonato) Fonte: Adaptado de CASAS, J. S. et al. 53 31 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Quatro complexos mononucleares do tipo [PdX2(tmdmPz)] {X = Cl- (1a), Br (2a); I (3a); SCN (4a); tmdmPz = N-metil-3,5-dimetil-1-tiocarbamoilpirazol} foram sintetizados e caracterizados espectroscopicamente54 por nosso grupo de pesquisa. O composto 1a foi formado a partir da substituição da acetonitrila do complexo [PdCl2(MeCN)2] pelo 3,5-dimetil- 1-tiocarbamoilpirazol. Os demais compostos foram obtidos através da substituição dos íons cloro por brometo (2a), iodeto (3a) e tiocianato (4a), conforme é ilustrado na Figura 14. Figura 14 – Síntese dos complexos [PdX2(tmdmPz)] {X = Cl (1a), Br (2a); I (3a); SCN (4a); tmdmPz = N-metil-3,5-dimetil-1-tiocarbamoilpirazol}54 Fonte: Adaptado de BARRA, C. V. et al. 54 Os compostos 1a-4a e o ligante tmdmPz tiveram sua atividade antitumoral testada frente a células de tumores de mama (LM3) e pulmão (LP07), ambas murinas. A cisplatina foi usada nos testes como fármaco de referência. Os valores de IC50 encontrados estão representados na Tabela 2. Tabela 2 – Valores de IC50 (molL–1) para compostos 1a-4a frente LM3 e LP07 Composto LM3 LP07 1a 3,29 ± 0,20 2,56 ± 0,14 2a 3,40 ± 0,44 1,84 ± 0,14 3a 2,53 ± 0,06 1,65 ± 0,44 4a 3,17 ± 0,48 1,66 ± 0,10 tmdmPz >140 >140 CISPLATINA 30,26 ±3,72 4,3 ± 0,4 Fonte: Adaptado de BARRA, C. V. et al. 54 De acordo com os testes realizados, o ligante tmdmPz apresentou IC50 > 140 μM frente as duas linhagens testadas, sendo considerado, portanto, inativo. No entanto, os complexos apresentaram excelentes resultados de atividade citotóxica, indicando que nesse caso, a coordenação ao centro metálico potencializa o efeito biológico. Os resultados obtidos com os ensaios frente as linhagem LM3 e LP07 mostraram que todos os compostos foram mais ativos 32 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO que a cisplatina. Considerando-se que o DNA mostrou-se ser o alvo celular de alguns complexos de Pd(II) contendo tiossemicarbazonas, estudos de interação com a guanosina e o plasmídeo pNFkB-luc foram realizados para verificar se a citotoxicidade observada pode estar relacionada à interação dos complexos 1a-4a com o DNA. Em função da baixa solubilidade dos complexos em água e da dificuldade em se obter os aqua-complexos, as reações foram realizadas em dmf. Os complexos 1a e 2a reagiram diretamente com a guanosina, entretanto o mesmo não foi observado para os complexos 3a e 4a, provavelmente em função da menor labilidade dos ligantes iodeto e tiocianato. Por essa razão, os grupos I e SCN dos compostos 3a e 4a foram removidos com AgNO3 em dmf para produzir solvento/nitrato-complexos in situ os quais reagiram prontamente com a guanosina, indicando que a ligação Pd-haleto/pseudo-haleto influencia na reatividade do complexo. O DNA incubado com os complexos 1a-4a (nas concentrações 10 μM e 100 μM) é representado nas linhas 4-11 (Figura 15). Verifica-se a influência da concentração dos compostos na interação com o DNA, sendo os compostos 2a e 4a capazes de clivar o DNA a 10 μM, porém, quando considerada a concentração de 100 μM, todos eles apresentaram essa capacidade. Figura 15 – Ação dos complexos 1a-4a no DNA plasmideal pNFkB–Luc Fonte: Adaptado de BARRA, C. V. et al. 54 A partir dos resultados obtidos, ainda não foi possível fazer uma relação direta entre os dados obtidos nesse ensaio e no ensaio de citotoxicidade. O experimento de eletroforese indicou que apenas os compostos 2a e 4a são capazes de interagir com o DNA a baixas concentrações (10 μM). Portanto, seria de se esperar que estes fossem os compostos mais ativos. No entanto, os resultados de citotoxicidade de 1a-4a frente as linhagens LM3 e LP07 (IC50 = 1,6-3,4 μM) 33 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO indicaram que todos os compostos são ativos em baixas concentrações. Neste ponto, cabe lembrar que a célula é uma entidade muito mais complexa que o DNA plasmideal e, portanto, fatores como mecanismos de influxo e efluxo não podem ser descartados. Além disso, outros alvos biológicos, além do DNA, podem estar envolvidos nos mecanismos citotóxicos destes complexos. Vale destacar que outros complexos de Pd(II) contendo pirazóis/pirazolinas como ligantes N,S-quelantes foram sintetizados e estudados por nosso grupo de pesquisa, sobretudo variando-se o substituinte ligado ao nitrogênio (Figura 16). Dentre estes complexos sintetizados nota-se um incremento da atividade citotóxica frente à linhagem LM3 em que há a presença de grupos lipofílicos - compostos contendo ligantes tmdmPz e tfdmOH, substituídos por metil e fenil, respectivamente - ao grupo tioamida destes ligantes se comparado aos compostos do tipo [PdX2(tdmPz)]. Destaca-se os complexos [PdX2(tmdmPz)] (X = Cl-, Br-, I-, SCN-, 1a-4a) por possuir valores de IC50 de até 10 vezes menor que a cisplatina para a linhagem LM3. Figura 16 – Índices de citotoxicidade (IC50) de complexos de fórmula [PdX2(tdmPz)], [PdX2(tmdmPz)] e [PdX2(tfdmOH)], sintetizados pelo grupo, frente a linhagem de adenocarcinoma mamário murino LM354-56 Fonte: autor 1.5 Ligantes fosfínicos As fosfinas são ligantes neutros e volumosos que se caracterizam por estabilizar diferentes classes de complexos metálicos57, tanto metais de altos quanto baixos estados de oxidação. A ligação das fosfinas com um metal envolve uma componente σ-doadora de um par de elétrons do átomo de fósforo para o metal e uma π-receptora via transferência de um par de elétrons do orbital d preenchidos do metal para os orbitais d vazios do átomo de fósforo, como 34 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO representado na Figura 17. No contexto do planejamento de novos candidatos a metalo- fármacos de Pd(II), a utilização de ligantes fosfínicos volumosos em complexos de paládio consiste em uma estratégia muito interessante para a obtenção de complexos cineticamente mais estáveis. Considerando que o mecanismo de substituição de ligantes que predomina em complexos de Pd(II) é o associativo (Figura 18)58, é bem estabelecido que a presença de ligantes volumosos no poliedro de coordenação dificulta a formação do intermediário pentacoordenado e, consequentemente, retarda a substituição de ligantes através deste mecanismo. A inserção de trifenilfosfina entre outras fosfinas terciárias na estrutura molecular do complexo também promove um aumento da lipofilicidade, podendo auxiliar a sua permeabilidade através da membrana celular57, além de possuir citotoxicidade frente a alguns tumores59. Figura 17 – Representação da retrodoação do metal para o átomo de fósforo Fonte: Autor Figura 18 – Mecanismo associativo para substituição de ligantes em complexos d8. Fonte: Autor Apesar de apresentarem uma atividade citotóxica promissora frente a duas linhagens de tumores murinos, a baixa solubilidade dos complexos de Pd(II) contendo tiocarbamoilpirazóis/pirazolinas (Figura 16, página 33) em solventes hidrofílicos nos impulsionou a realizar algumas mudanças nos seus respectivos arcabouços moleculares. Além disso, a trifenilfosfina tem um volume molecular adequado para ocupar bolsões hidrofóbicos nos sítios de várias enzimas, o que favorece a estabilização do complexo composto de paládio- 35 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO enzima. Dentre estes fatores, foram sintetizados e estudados complexos de Pd(II) contendo N,S- doadores e trifenilfosfina em sua esfera de coordenação (Figura 19 e 20). Vale destacar que a substituição do grupo X- pela trifenilfosfina pode conduzir à formação de um complexo catiônico, como foi verificado para o complexo 3b por difratometria de raios X de monocristal (Figura 21)60,61, acarretando possivelmente em uma maior solubilidade em solventes hidrofílicos que se comparado a complexos neutros análogos. Figura 19 – Design de uma nova família de complexos [PdX(T)(PPh3)]X {X = Cl- (1b), Br- (2b); I- (3b); SCN- (4b); T = tiossemicarbazidas} a partir dos protótipos [PdX2(tmdmPz)] Fonte: Autor Figura 20 – Síntese do complexo 1b, [PdCl(4-PhT)(PPh3)]Cl {4-PhT = N-fenil-tiossemicarbazida} Fonte: Autor 36 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 21 – Estrutura do complexo [PdI(PPh3)(4-PhT)]I (3b) Fonte: ROCHA, F. V.60,61 A substituição de um ligante tiocarbamoilpirazol por uma tiossemicarbazida objetiva manter a presença de um ligante N,S-quelante. Além disso, a substituição do anel aromático pirazólico por grupos polares (-NH- e –NH2) visa intensificar as ligações de hidrogênio entre o complexo e o receptor, maximizando assim a estabilização da supramolécula receptor- complexo de Pd(II). Ensaios de citotoxicidade (método do MTT) envolvendo os complexos 1b- 4b e a cisplatina foram realizados in vitro frente às linhagens tumorais murinas, adenocarcinoma mamário (LM3) e adenocarcinoma pulmonar (LP07)60,61. Os valores de IC50 estão apresentados na Tabela 3. Tabela 3 – Valores de IC50 dos compostos [PdX(4-PhT)(PPh3)]X {X = Cl- (1b), Br- (2b); I- (3b); SCN- (4b)} e da cisplatina contra as células tumorais murinas LM3 e LP07 após 24 h de exposição Complexo Linhagens Celulares LM3 LP07 Cisplatina 30,3 (±3,7) 4,3 (±0,4) 1b 8,57 (±1,21) 7,11 (±0,64) 2b 8,84 (±2,8) 3,58 (±0,16) 3b 2,79 (±0,58) 3,72 (±0,71) 4b 4,61 (±1,69) 3,56 (±0,31) Fonte: ROCHA, F. V.60,61 Para a linhagem LP07, todos os complexos apresentaram uma boa citotoxicidade, especialmente 2b-4b, os quais possuem atividade similar ao cisplatina. Observando os resultados para a linhagem LM3, a atividade de todos os complexos foi consideravelmente maior do que a do cisplatina. Valendo a pena destacar os compostos 3b e 4b, com valores de 37 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO citotoxicidades 11 e 6,5 vezes maior do que o medicamento de referência, respectivamente. Estes resultados sugerem que a presença de diferentes contra íons afetam significativamente a citotoxicidade dos complexos, indicando que a força da ligação Pd-X possui um papel importante na atividade dos compostos. A substituição do cloro por bromo, iodo ou tiocianato, átomos ou grupos, mais volumosos e macios, diminuiu o valor de IC50, mostrando que, neste caso, uma ligação mais forte entre o metal e o haleto ou pseudo-haleto confere em uma maior atividade. Estudos de interação entre os complexos 1b-4b e a guanosina mostraram que os compostos reagem com a nucleobase somente após a remoção do grupo X- mediante precipitação com AgNO3 em dmf (Figura 22). Figura 22 – Reação entre os complexos 1b-4b e a guanosina Fonte: ROCHA, F. V.60,61 Medidas de eletroforese em gel dos complexos 1b-4b (Figura 23) mostram que somente os complexos 1b, 2b e 4b interagiram com o DNA em altas concentrações (100 µM). Já o complexo [PdI(PPh3)(4-PhT)]I (3b) se mostrou incapaz de reduzir a mobilidade eletroforética do DNA, bem como em danificar a sua estrutura. 38 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 23 – Incubação do plasmídeo com os complexos 1b-4b e cisplatina por 24 h. Linha 1: plasmídeo em água. Linha 2: plasmídeo em água/dmf (2.5%). Linha 3: cisplatina (20 μM). Linha 4: 1b (10 μM). Linha 5: 1b (100 μM). Linha 6: 2b (10 μM). Linha 7: 2b (100 μM). Linha 8: 3b (10 μM). Linha 9: 3b (100 μM)/ Linha 10: 4b (10 μM). Linha 11: 4b (100 μM) Fonte: ROCHA, F. V.60,61 Diante destes dados pode-se concluir que a maioria dos compostos interage diretamente com o DNA, mas apenas em concentrações altas, o que vai de encontro com os resultados obtidos na avaliação da citotoxicidade destas moléculas, uma vez que o IC50 varia entre 2,79- 8,84 μM e 7,11-3,56 μM frente as células tumorais LM3 e LP07, respectivamente. Desta maneira, a atividade citotóxica deve ser originada a partir da interação desses complexos de Pd(II) frente a outros alvos farmacológicos diferentes do DNA. É bem estabelecido na literatura que células tumorais de uma maneira geral, principalmente de mama e pulmão, possuem uma elevada expressão das enzimas DNA-topoisomerases, sendo o alvo de alguns fármacos no tratamento de diversos tipos de câncer62. Uma vez que os complexos de Pd(II) apresentaram alta citotoxicidade frente a linhagens tumorais de mama e de pulmão, decidimos investigar a capacidade desses complexos em inibir enzimas DNA-topoisomerases. Os complexos de 1b-4b tiveram sua habilidade de inibição contra a topo I humana avaliada na concentração de 50 μM. Os complexos foram incubados por 40 minutos juntamente com o DNA superenovelado e a enzima. Controle positivo (DNA + topo I), e controle negativo (DNA), foram feitos para fins comparativos. Os resultados obtidos mostraram que os complexos não foram capazes de inibir a ação da topoisomerase I na concentração testada. Por outro lado, os ensaios de inibição da enzima topo IIα mostraram que, com exceção do composto 1, todos os outros complexos foram capazes de interromper a ação da enzima topoisomerase II sobre a estrutura superenovelada do DNA em concentrações entre 5-25 μM (Figura 24). 39 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO Figura 24 – Incubação do plasmídeo com os complexos 1b e 2b e a topo II por 40 min em diferentes concentrações, C-, controle negativo e C+, controle positivo Fonte: ROCHA, F. V.60,61 1.6 Princípios norteadores usados no planejamento de novos compostos de coordenação Motivado pelos resultados obtidos54-56,61, foram discutidos nesta dissertação a síntese e caracterização de compostos de coordenação contendo um tiocarbamoilpirazol como ligante N,S-doador, utilizando-se o etil como grupo lipofílico no átomo de nitrogênio da tioamida; avaliação da atividade com introdução de bases mais polarizáveis que o cloreto (ex. Br, I, SCN); introdução do ligante trifenilfosfina a fim de proporcionar maior estabilidade ao complexo. Figura 25 – Estratégia relacionando-se estrutura-atividade para os tiocarbamoil pirazóis monoquelatos Fonte: Autor Os compostos quelatos de Pd(II) contendo ligantes 1-tiocarbamoilpirazólicos e trifenilfosfina (Figura 26) representam portanto uma alternativa promissora no design de novos agentes antitumorais, visto o número significativo de relatos na literatura sobre suas citotoxicidades frente as células tumorais e microorganismos patógenos. Neste contexto, os 1 2 40 ___________________________________________________________________ INTRODUÇÃO resultados provenientes da pesquisa que propomos sobre complexos quelatos de Pd(II) podem resultar no desenvolvimento de novos compostos de potencial farmacológico que sejam mais seletivos, menos tóxico e mais ativos que os fármacos tradicionais utilizados no tratamento do câncer (ex. cisplatina). Figura 26 – A estrutura, a priori pretendida, dos quelatos de Pd(II) sintetizados e estudados neste trabalho Fonte: Autor 41 ___________________________________________________________________ PARTE EXPERIMENTAL 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral: Planejamento de novos complexos de Pd(II) contendo ligante bidentado N,S-doador com a presença do ligante fosfínico terciário e investigação de sua atividade citotóxica frente as células tumorais. 2.2 Objetivos Específicos: I. Síntese e caracterização do composto orgânico N-etil-3,5-dimetil-1- tiocarbamoilpirazol via metodologia empregada pelo grupo; II. Síntese e caracterização dos compostos monoquelatos de Pd(II), utilizando os ligantes: cloreto; brometo; iodeto; tiocianato; N-etil-3,5-dimetil-1- tiocarbamoilpirazol e trifenilfosfina; III. A investigação do índice de citotoxicidade (IC50) dos complexos preparados frente à linhagem de adenocarcinoma mamário humano MCF-7; IV. Ensaios envolvendo a reação dos complexos sintetizados com a guanosina. 42 ___________________________________________________________________ PARTE EXPERIMENTAL 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1 Procedência de solventes e reagentes Foram utilizados solventes e reagentes de padrão analítico, sem purificação prévia e armazenados em frascos de vidro escuro, sendo o pentano e clorofórmio-d1 mantidos em geladeira. A Tabela 4 apresenta a procedência dos solventes e reagentes empregados neste trabalho. Tabela 4. Procedência de solventes e reagentes. “SL”: utilizado na etapa de síntese do ligante; “SC”: utilizado na etapa de síntese do complexo; “RMN”: utilizado como solvente na técnica de ressonância magnética nuclear; “E”: utilizado para ensaios e/ou dados de solubilidade dos produtos. 3.2 Metodologia de síntese A metodologia utilizada para a síntese do composto orgânico consiste na reação entre os compostos 2,4-pentadiona e 4-etil-3-tiossemicarbazida em meio aquoso levemente ácido (pH entre 2 e 3)54. O precursor de paládio foi obtido a partir da adição de cloreto de paládio ao solvente acetonitrila a quente: [PdCl2(MeCN)2] MeCN PdCl2 Reagentes Procedência Função Solventes Procedência Função Ácido Clorídrico Merck SL Álcool metílico Merck SC Álcool etílico Merck SL Brometo de Potássio Carlos Erba SC Éter etílico Synth SL Cloreto de paládio Vetec SC 4-Etil-3-tiossemicarbazida Sigma-Aldrich SL Iodeto de Potássio Merck SC 2,4-Pentadiona Merck SL Tiocianato de Potássio Merck SC Pentano Synth SL/SC Clorofórmio-d1 Sigma-Aldrich RMN Acetonitrila Mall.Chem. SC dmf Synth E Guanosina Sigma-Aldrich E dmso-d6 Deutero RMN dmso Synth E Clorofórmio Merck SC 43 ___________________________________________________________________ PARTE EXPERIMENTAL Os complexos contendo trifenilfosfina foram obtidos a partir da substituição dos ligantes MeCN e um dos cloretos da esfera de coordenação pela adição do ligante quelante tedmPz e trifenilfosfina, sendo substituído o cloreto por outros haletos e pseudo-haletos pela adição de sais de potássio: [PdCl2(MeCN) 2] + TedmPz [PdCl(PPh3)(TedmPz)] [PdBr(PPh3)(TedmPz)][PdCl(PPh3)(TedmPz)] KBr+ [PdI(PPh3)(TedmPz)][PdCl(PPh3)(TedmPz)] KI+ [Pd(SCN)(PPh 3)(TedmPz)][PdCl(PPh3)(TedmPz)] KSCN+ + P(C6H5)3 CHCl3 CHCl3 CHCl3 CHCl3 3.3 Síntese dos compostos [PdCl2(MeCN)2]: Em um erlenmeyer de 125 mL de capacidade contendo 40 mL de acetonitrila a 60° C foram adicionados lentamente 1,00 g (5,64 mmols) de cloreto de paládio anidro (PdCl2). A suspensão foi mantida sob intensa agitação magnética por 3 horas. Após este período o sistema fora resfriado lentamente, obtendo-se um precipitado amarelo cristalino. O sólido foi isolado a partir de uma filtração em funil de buchner. Massa do produto: 1,02 g. Rendimento(%): 71. Ligante tedmPz: Em um erlenmeyer de 125 mL de capacidade contendo 340,6mg (2,858 mmol) de 4-etil-3-tiossemicarbazida (C3N3H9S) dissolvido em uma mistura de 40,0 mL de água destilada e aproximadamente 0,02 mL de HCl concentrado foi adicionado um volume de 3,00 mL (2,906 mmol) de solução de volume 1:9 de 2,4-pentadiona e álcool etílico (9,688 mmol/mL). A adição do reagente conduziu à formação de uma solução leitosa, que desapareceu em poucos minutos dando lugar a uma fase oleosa. A agitação magnética foi mantida por 20 horas, obtendo-se uma fase oleosa amarelo esverdeada pouco viscosa, sendo esta purificada via extração fracionada em uma solução de pentano e água seguida de sucessivas lavagens. O produto foi seco em dessecador por 4 horas sob vácuo. Massa do produto: 362,0 mg. Rendimento(%): 76,5. 44 ___________________________________________________________________ PARTE EXPERIMENTAL [PdCl(tedmPz’)(PPh3)],(1) (composto 1): Em um erlenmeyer de 25 mL de capacidade contendo 100,0 mg do precursor [PdCl2(MeCN)2] (0,3854 mmol) solubilizado em volume de 7,0 mL de clorofórmio, foram adicionados 70,6 mg de tedmPz (0,3852 mmol) e 101,1 mg de PPh3 (0,3854 mmol) solubilizados em solução de clorofórmio e metanol (1:2), obtendo-se após 1 hora de agitação solução amarelo alaranjada contendo pouca quantidade de precipitado. A solução foi filtrada, lavada com água e seu solvente quase totalmente evaporado em capela, obtendo-se um sólido amorfo após adição de pentano ao sistema. O sólido foi filtrado em funil de buchner e seco em dessecador por 4 horas. Massa do produto: 186,4. Rendimento(%): 82,5. [PdBr(tedmPz’)(PPh3)] (composto 2): Fez-se a mesma metodologia de adição de reagentes para a síntese do composto 1 (partindo-se de 60,6 mg, ou 0,2330 mmol, de [PdCl2(MeCN)2]), adicionando in situ, após 30 minutos do início da reação, 44,8 mg de KBr (0,376 mmol, aproximadamente 1,6:1 composto 1) sob agitação intensa, sendo o sistema mantido por 12 horas, obtendo-se uma solução alaranjada com pouco precipitado, sendo esta lavada, precipitada e seca sob mesma metodologia descrita para o composto 1. Massa do produto: 118,6 mg. Rendimento(%): 80,6. [PdI(tedmPz’)(PPh3)] (composto 3): Fez-se a mesma metodologia de adição de reagentes para a síntese do composto 1 (partindo-se de 51,5 mg, ou 0,1981 mmol, de [PdCl2(MeCN)2]), adicionando in situ, após 1h do início da reação, 39,3 mg de KI (0,2367 mmol, aproximadamente 1,2:1 Pd) sob agitação intensa, sendo o sistema mantido por 2 horas, obtendo-se uma solução avermelhada com presença de precipitado. Verificou-se que sólido não possuía o ligante quelato, sendo este descartado. O sobrenadante lavado com água e evaporado até volume aproximado de 1 mL, obtendo-se precipitado após a adição de 10 mL de etanol. O precipitado (3) foi filtrado em funil de buchner e seco em dessecador. Aspecto do sólido: cristalino, cor vermelha. Massa do produto: 46,5 mg. Rendimento(%): 34,6. [Pd(SCN) (tedmPz’)(PPh3)] (composto 4): Fez-se a mesma metodologia de adição de reagentes para a síntese do composto 1 (partindo-se de 46,9 mg de [PdCl2(MeCN)2], 0,1801 mmol), adicionando in situ, após 1 h do início da reação, 35,0 mg de KSCN (0,360 mmol, aproximadamente 2:1 TePd(PPh)Cl) sob agitação intensa, obtendo-se uma solução alaranjada com pouco precipitado, sendo esta lavada, precipitada e seca sob mesma metodologia descrita (1) Diferencia-se tedmPz’ de tedmPz pela desprotonação do ligante no complexo, formando-se um iminotiolato. 45 ___________________________________________________________________ PARTE EXPERIMENTAL para o composto TePd(PPh)Cl, obtendo-se sólido amorfo amarelo. Massa do produto: 91,7 mg. Rendimento(%): 83,6. 3.4 Métodos instrumentais Análise Elementar As análises quantitativas dos elementos carbono, hidrogênio e nitrogênio foram efetuadas no analisador automático da Perkin-Elmer, modelo 240, pertencente à Central Analítica do Instituto de Química da USP - São Paulo. Espectroscopia Vibracional na região do Infravermelho Os espectros vibracionais na região do infravermelho foram obtidos no espectrofotômetro Nicolet IS5 Thermo Scientific, atuando na região de 4000-400 cm-1, utilizando-se de pastilhas de KBr. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear Os espectros de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C foram registrados nos Espectrômetros multinuclear Bruker, modelos Fourier 300 (7.0 T, Sonda: Easy Probe Dul 300MHz S1 5mm z Gradient) e Avance III 600 HD (14,1 T, Sonda: Triple Inverse TCI Cryo- probehead), localizados no IQ-UNESP de Araraquara. Utilizou-se clorofórmio-d1 e dmso-d6 para dissolução das amostras. Os deslocamentos químicos obtidos foram referenciados pelos solventes. Software para aquisição: TopSpin v.3.2. Medidas de Condutividade As medidas de condutividade foram realizadas pelo condutivímetro DM 31 Digimed. Utilizou-se soluções de dmf em concentração do composto de 1,0 x 10-3 mol/L. Medidas de Ponto de Fusão As medidas de ponto de fusão foram realizadas no aparelho MQAPF-302, de temperatura máxima de 350°C. Utilizou-se o valor de taxa de aquecimento de 3,0 °C/min. Espectrometria de Massas Para espectrometria de massas foi utilizado o espectrômetro modelo 3200 QTRAP LC/MS/MS contendo analisador híbrido triplo quadrupolo/armadilha de íons linear (LIT), 46 ___________________________________________________________________ PARTE EXPERIMENTAL localizado no IQ-UNESP de Araraquara. A análise foi realizada por infusão direta MS/MS utilizando-se metanol padrão LC-MS como solvente no modo positivo de ionização por electrospray. Parâmetros: IonSpray (IS): 5000 V, DP: 20V, EP: 10V. Experimentos: varredura de íons (200 – 1000) e enhanced resolution (ER). As amostras foram preparadas dissolvendo- se 1mg de analito em metanol padrão HPLC-MS e posteriormente diluído a concentrações adequadas para o experimento. Difração de raios X de monocristais A determinação estrutural por difração de raios X de monocristal foram realizadas em um difratômetro BRUKER APEX II Duo, equipado com duas micro fontes, de cobre e molibdênio, e sistema OXFORD de baixa temperatura. As estruturas foram determinadas em colaboração com o Prof. Dr. Victor Marcelo Deflon. 3.5 Testes biológicos com células tumorais Medidas de Atividade Biológica Os experimentos biológicos foram realizados no Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP, em colaboração com a Profª. Drª. Iracilda Z. Carlos e a doutoranda Francine A. Manente. Foi avaliado o índice de citotoxicidade dos complexos 1-4 e do composto orgânico tedmPz frente as células tumorais MFC-7. Determinação da viabilidade celular Foram adicionados 200 µL das células tumorais ajustadas a uma concentração de 5x105 células mL-1 em cada poço de placas 96 poços. Após 24 h de incubação, período necessário para as células aderirem à placa, foram colocados 200 µL de soluções de concentrações conhecidas dos compostos sintetizados em cada poço. Após incubação por mais 24 h, as células foram expostas ao MTT por 3 h. O conteúdo da placa foi então vertido e adicionadas a cada poço 100 µL de álcool isopropílico visando solubilizar os cristais de formazana formados. A leitura da absorbância foi realizada em fotocolorímetro UV/Visível (Multiskan Ascent, Labsystems), em comprimento de onda de 540 nm e filtro de referência 620 nm. Foram realizados dois experimentos independentes em triplicada para cada concentração. Os valores correspondentes à concentração que reduz em 50% a viabilidade celular (IC50) dos compostos foram quantificados através da regressão não linear de uma curva dose-resposta de cada gráfico obtido por Concentração x Viabilidade Celular, obtidos utilizando-se o programa OriginPro 8. 47 ___________________________________________________________________ PARTE EXPERIMENTAL Preparo das soluções As soluções-mãe dos compostos foram preparadas dissolvendo-se 5,0 µmol de cada composto em 1,0 mL de dmso (5,0 mmol L-1) e posterior diluição com meio de cultura DMEM momentos antes da aplicação das amostras nos testes de citotoxicidade, atingindo concentração máxima de dmso de 2,0% v/v. As concentrações obtidas para o ensaio foram 100; 50,0; 25,0; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56 µmol L-1. Reação com o nucleosídeo guanosina Foram solubilizados em 5 mL de metanol 6,00 mg de guanosina (21,2 mmol) e adicionadas quantidades estequiométricas dos complexos 1-4 sob agitação, deixando o sistema deste modo por 24 h. O solvente foi removido via evaporação em capela, seco em dessecador a vácuo por 4 horas e finalmente realizado o experimento em dmso-d6. A ocorrência da reação fora verificada via espectroscopia de RMN dos complexos e a guanosina livre. 48 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Síntese e caracterização espectroscópica do composto tedmPz (3,5-dimetil-1-(N- etil)tiocarbamoilpirazol): A espectroscopia vibracional na região do infravermelho e de RMN é de grande importância na elucidação de estruturas de diversas classes de compostos orgânicos ou de coordenação, sobretudo na identificação de grupos funcionais envolvidos e o modo de coordenação dos ligantes. Os principais modos vibracionais discutidos serão os que indicam a ocorrência da síntese do ligante (perda dos grupos C=O e formação do anel pirazólico) e referentes à formação do complexo, observados pelas variações nos modos vibracionais dos grupos funcionais pirazol, tioamida, fosfina e tiocianato, além da variação dos sinais dos núcleos de 1H e 13C para regiões de maior ou menor blindagem no espectro, importantes na identificação do modo de coordenação no quelato. O mecanismo de reação envolvido na síntese de pirazóis a partir da acetilacetona (Hacac) é bem estabelecido na literatura, sendo no intervalo de pH de 1,5-3,0 constatada a condensação catalisada por ácido63. A reação em questão envolve a formação de intermediários diidróxipirazolidínicos (A) (Figura 27)63. Não há evidencias de formação de hidrazonas como intermediários, de modo que o produto da adição da hidrazina com uma das carbonilas do acac é seguido de uma ciclização imediata. O intermediário diol (A) então sofre duas eliminações sucessivas para gerar o produto (B). Figura 27 – Mecanismo de reação entre acetilacetona e hidrazinas Fonte: Adaptado de KATRITZKY, A. R.63 A síntese do composto orgânico 3,5-dimetil-1-(N-etil)tiocarbamoilpirazol foi obtida através da metodologia utilizada pelo grupo para o composto 3,5-dimetil-1-(N-metil)- tiocarbamoilpirazol54, e sua caracterização foi realizada acompanhando os espectros no IV e 49 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO RMN do composto análogo64. No espectro vibracional no IV do produto (Figura 28) nota-se a formação do anel pirazólico pelo desaparecimento de duas das bandas νNH (entre 3100 e 3400 cm-1) e ausência de bandas intensas referentes ao C=O (aproximadamente 1700 cm-1), além da formação da banda de νC=N (1577 cm-1) referente ao anel pirazólico. O espectro em questão será fundamental a posteriori para compreensão da coordenação dos complexos sintetizados. Figura 28 – Espectros vibracionais no comprimento de onda do infravermelho para o reagente (4-etil- 3-tiossemicarbazida) e composto orgânico tedmPz Fonte: autor A espectroscopia de RMN-1H e 13C foi de grande auxilio na identificação do produto gerado. Analisando o espectro de ressonância magnética nuclear de 1H do produto (Figura 29), nota-se um conjunto de seis sinais referentes aos hidrogênios da molécula. Observa-se um sinal alargado em 9,15 ppm atribuído a ressonância de núcleos de H ligados a átomos de nitrogênio 65, um simpleto em 5,93 ppm característico ao hidrogênio ligado a carbono sp2 e um par de quardrupletos em 3,68 ppm (3JNH = 5,5 Hz; 3JCH3 = 7,2 Hz) Em região de campo alto, verificam- se os sinais característicos dos grupos metílicos em 2,71, 2,15 e 1,27 ppm referentes às metilas do pirazol e do grupo etil respectivamente. 50 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 29 – Espectro de RMN-1H do composto tedmPz realizado em clorofórmio-d1 Fonte: autor Os hidrogênios da metila da posição 5 encontram-se mais desprotegidos quando comparados aos hidrogênios da metila 3 devido a sua proximidade ao grupo tiocarbamoil64. A integração dos sinais revelou a seguinte proporção dos átomos de H na molécula (Tabela 5): Tabela 5. Proporção de hidrogênios obtida pelo espectro de RMN do ligante  9,15 s 5,93 s 3,68 dq (7,2 e 5,5 Hz) 2,71 s 2,16 s 1,27 t (J = 7,2 Hz) integração [1H] [1H] [2H] [3H] [3H] [3H] Fonte: autor O sinal referente aos hidrogênios ligados a carbonos α-tioamídicos encontra-se duplicado, possivelmente por dois fenômenos: I) efeitos de ressonância, uma vez que a ligação π encontra-se delocalizada, gerando isômeros conformacionais (Figura 30) capazes de serem distinguidos via experimento de RMN66 , uma vez que os hidrogênios se encontram em diferentes ambientes químicos em cada uma dos isômeros; II) o acoplamento com o hidrogênio ligado ao nitrogênio, subdividindo os sinais referentes aos hidrogênios dos carbonos α. Esse tipo de acoplamento é incomum para a maioria das aminas, porem pode acontecer para alguns tipos de amidas primárias e secundárias65. 51 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 30 – Formas possíveis para o ligante tedmPz Fonte: autor A segunda hipótese é coerente ao espectro de RMN-13C (Figura 31), uma vez que é verificado somente um sinal referente ao carbono tiocarbonílico (176,01 ppm) onde seriam esperados um conjunto de picos referente a este carbono66. Figura 31 – Espectro de RMN-13C do composto tedmPz obtido em clorofórmio-d1 Fonte: autor Outro indicativo é encontrado na absorção em 9,15 no RMN de 1H para o desdobramento pelo 15N em 1J (Figura 32). O isótopo 14N possui abundância natural muito superior aos outros isótopos de nitrogênio, spin nuclear igual a 1 (e portanto momento elétrico de quadrupolo), resultando na absorção devida ao acoplamento de 1H ao núcleo 14N intensa e larga67. Contudo, para espectros em boa resolução de amostras muito concentradas contendo pouca água é possível verificar os desdobramentos (dublete) pelos hidrogênios de carbonos α- amídicos referente ao isotopômero contendo 15N (em N7), isótopo de baixa abundância e spin nuclear igual a 1/2. Estes desdobramentos variam dependendo da hibridização do nitrogênio na 52 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO molécula, variando de 89-96 Hz para pirróis e imidazóis68. Verifica-se no espectro de RMN-1H do ligante um dublete (J = 90 Hz) referente ao acoplamento 1H-15N a uma ligação, sendo possível observar através deste os desdobramentos pelos hidrogênios do carbono α, cuja constante de acoplamento condiz com a absorção referente ao C8 (J = 5,5 Hz)65. Figura 32 – Ampliação do espectro de RMN-1H do composto tedmPz realizado em clorofórmio-d1, destacando os sinais referentes aos hidrogênios H7 e H8 Fonte: autor Nota-se no espectro de RMN - 13C a incongruência entre número de picos e carbonos presentes na molécula, o que consiste na presença de equivalência de deslocamento químico para dois dos carbonos. A equivalência é verificada nos carbonos das metilas (C9, C10 e C11), uma vez que estes possuem deslocamentos químicos semelhantes - são carbonos primários ligados a outro carbono secundário ou quaternário, sendo as absorções em 13,18 e 17,28 ppm os possíveis sinais em que há a equivalência de deslocamento químico, sendo necessários experimentos de RMN que correlacionem os espectros de RMN-1H e 13C. Foram atribuídos também o deslocamento químico para C8 (39,31 ppm), C4 (111.45 ppm) e aos sinais menos intensos aos carbonos quaternários C5 (148,71 ppm), deslocado para campo mais baixo em relação ao C3 (145,03 ppm), uma vez que este se encontra próximo ao grupo tiocarbamoil64. 4.2 Caracterização dos complexos do tipo [PdX(PPh3)(tedmPz’)] {X = Cl; Br; I; SCN} Considerações iniciais O complexo 1 foi preparado a partir da reação entre o [PdCl2(MeCN)2] e os ligantes tedmPz e trifenilfosfina, na proporção molar de 1:1:1 em clorofórmio a temperatura ambiente, sendo os complexos restantes obtidos a partir do término da síntese do complexo de cloro pela adição in situ de seus respectivos haletos e pseudohaletos de potássio, em razões que variam dependendo do caráter polarizante do ânion. 53 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Os compostos inéditos [PdX(PPh3)(tedmPz’)] (X = Cl-, Br-, I- e SCN-) são neutros, sólidos, de coloração entre amarelo (4) amarelo alaranjado (1 e 2) e laranja avermelhado (3), estáveis a condições ambientes, solúveis em clorofórmio, éter etílico, acetonitrila e acetona, pouco solúveis em metanol, etanol, dmf e dmso e insolúvel em água. Trifenilfosfina: Moléculas polifenílicas do tipo X(Ph3)n, como a trifenilfosfina, apresentam 30 modos vibracionais, dos quais 24 envolvem somente átomos de hidrogênio e carbono, enquanto que os modos q e t são vibrações que contêm também contribuições significativas de estiramento da ligação P-fenil. O espectro no IV do composto trifenilfosfina (PPh3) está ilustrado na Figura 33 e seus principais modos vibracionais estão inseridos na Tabela 669. Figura 33 – Espectro vibracional da trifenilfosfina na região do infravermelho Fonte: autor Tabela 6. Dados obtidos por espectroscopia vibracional no IV para trifenilfosfina e suas atribuições Bandas (cm-1) Atribuição 3057 (f) νC-H 1959-1813 (f) Harmônicos 1473(F), 1429(F), 1308(f) νanel 1178 (f) βC-H 1088 (F) Q 995 (m) νanel 744 (F) γC-H 692 (F) γanel 496 (F) Y 427 (F) T Intensidades: F = forte; m = média; f = fraca. Fonte: Adaptado de FREM, R. C. G.69 54 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Tiocianato: A espectroscopia vibracional na região do infravermelho é uma técnica interessante na investigação de complexos contendo pseudo-haletos em sua esfera de coordenação, principalmente pela presença de bandas características destes, sobretudo em seus diferentes modos de coordenação. Entre as bandas de absorção no IV destes compostos, a de maior importância é referente aos modos vibracionais de estiramento assimétrico, situando-se em uma região bastante limpa do espectro (2200-2000 cm-1). O íon tiocianato SCN- apresenta dois modos vibracionais ativos importantes no infravermelho, sendo estes o próprio νasCN, intenso em 2053 cm-1, e νCS pouco intenso em 748 cm-1. Ele pode coordenar-se a um único metal (coordenação terminal) ou a dois ou mais centros metálicos (coordenação em ponte). A formação da ligação Pd-NCS é caracterizada pelas presenças das bandas νasCN e νCS na região de 2090-2060 cm-1 e 854-830 cm-1, respectivamente. Quando coordenado pelo átomo de enxofre, a banda νasCN localiza-se em torno de 2100-2150 cm-1, enquanto a banda νCS encontra-se no intervalo de 696-711 cm-1. Atuando em ponte, a banda νasCN é encontrada em regiões do espectro acima de 2130 cm-1 70. De modo semelhante, utiliza-se também para o estudo do modo de coordenação do tiocianato a espectroscopia de RMN de 13C, onde são obtidos diferentes valores de deslocamento químico do carbono presente no íon tiocianato iônico, complexado via nitrogênio e via enxofre. De modo geral, verifica-se a ordem de deslocamento químico em referência ao TMS do carbono tiocianato como sendo S-ligante < iônico < N-ligante71. Ligante tedmPz: Sugere-se que a estrutura das tioamidas e seus análogos seja um híbrido de ressonância, com contribuição de estruturas altamente polares72 do tipo +H2N(CS-)R (Figura 34). Figura 34 – Estruturas de ressonância da tioamida Fonte: autor Compostos orgânicos portadores do grupo tioamida (HNCS) dão origem a quatro bandas características no espectro no IV73. A banda Tioamida I é localizada em 55 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO aproximadamente 1500 cm-1 e possui contribuições dos modos vibracionais NH e C=N. A banda Tioamida II aparece na região de 1300-1200 cm-1 e apresenta contribuições dos modos vibracionais C=N + NH + CH. Espera-se em 1000 cm-1 a presença da banda Tioamida III com significativa contribuição dos modos vibracionais C=N + C=S. A banda Tioamida IV, com forte contribuição do modo C=S, é encontrada no intervalo espectral de 850-700 cm-1. Se a coordenação ocorre via átomo de enxofre, as contribuições das estruturas altamente polares aumentam, devido à doação de um par de elétrons do enxofre ao metal, provocando um enfraquecimento da ligação C=S e produzindo um caráter parcial de ligação C=N ao nitrogênio da tioamida74. Verificou-se em trabalhos anteriores a desprotonação do grupo tioamida de complexos tetracoordenados catiônicos contendo tiocarbamoilpirazóis, resultando em ligante do tipo N,S-aniônico e carga do complexo neutra56. Espera-se que o átomo de enxofre esteja cis-direcionado ao ligante trifenilfosfina, uma vez que a situação inversa geraria uma competição entre os átomos de enxofre pela retroligação proveniente dos elétrons disponíveis na subcamada d do metal, enfraquecendo as duas ligações Pd-S e Pd-P75. Tal condição facilita a troca do íon cloreto restante por brometo, iodeto, e tiocianato. Esta substituição é facilitada também devido a outros fatores, como maior nucleofilicidade apresentada por estes ligantes em relação ao cloreto76 e os ligantes de entrada serem bases de Pearson mais moles que o Cl-, uma vez que o íon de Pd(II) é um ácido mole, possuindo portanto maior tendência em se ligar a bases moles77. 4.2.1 Espectroscopia vibracional na região do IV para os complexos A Figura 35 representa os espectros no IV dos complexos 1-4 em comparação aos ligantes PPh3 e tedmPz. As principais frequências vibracionais presentes nos espectros no IV dos compostos foram atribuídas e encontram-se listadas na Tabela 7. 56 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 35 – Espectros vibracionais no comprimento de onda do infravermelho para os compostos trifenilfosfina, tedmPz e os complexos sintetizados na região de 4000-400 cm-1. Fonte: autor Verifica-se o deslocamento das bandas de tioamidas características I (1516 cm-1), III (976 cm-1) e IV (801 cm-1) para os espectros dos complexos sintetizados provocada pela desprotonação, além perda da banda atribuída ao νNH (3322 cm-1), νSH (2584 cm-1) e deslocamento da banda Tioamida II (1245 (tedmPz), 1253 (1), 1252 (2), 1253 (3) e 1260 cm-1 (4)) no espectro dos complexos. Todas as mudanças supracitadas indicam a desprotonação e mudança estrutural provocada pelo fluxo de elétrons no grupo tioamida, sendo o deslocamento da banda Tioamida IV para menores valores de número de onda (801 cm-1 para tedmPz, 705- 702 cm-1 para os complexos), proveniente da dupla ligação em C-S, um forte indicativo da coordenação via átomo de enxofre. Também corroboram à estrutura pretendida os deslocamentos das bandas referentes aos complexos νCNanel (1577 (tedmPz), 1562 (1), 1561 (2), 1562 (3) e 1560 cm-1 (4)) indicando coordenação pelo N(sp2) do pirazol, em vista que a ligação Pd-Npirazol retira densidade eletrônica do nitrogênio. É possível evidenciar a coordenação do ligante trifenilfosfina devido à presença de suas bandas características na região de 1481 (δCC), 1095 (q) e 747 cm-1 (δCH)62. No espectro do complexo contendo tiocianato observa-se a banda de absorção de νas(SCN) em 2101 cm-1, sendo este valor ambíguo para a coordenação do tiocianato via átomo de enxofre (2150-2100 cm-1) e nitrogênio (2100-2080 cm-1) encontrados em complexos de coordenação na literatura70. As 57 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO frequências vibracionais presentes nos espectros no IV dos compostos foram atribuídas e encontram-se na Tabela 7. Tabela 7 – Dados obtidos por espectroscopia no IV referente ao ligante tedmPz, seus complexos [PdX(PPh3)(tedmPz’)] (X = Cl-, Br-, I- e SCN-) e suas atribuições Número de onda (cm-1) Atribuições tedmPz 1 2 3 4 3325 - - - - νN-H - 3086 3086 3086 3073 νC-Hfenil - 3057 3056 3055 3056 νC-Hfenil 2975 2967 2966 2964 2966 νC-Hpirazol 2927 2928 2927 2923 2927 νC-Hmetila 2876 2867 2866 2866 2862 νC-Hmetila 2584 - - - - νS-H - - - - 2101 νas(SCN) - 1600 1599 1598 1610 vC=Ntioamida 1577 1562 1561 1562 1560 vC=Nanel 1516 - - - - Tioamida I - 1480 1480 1480 1481 νC-CPPh3 1454 1457 1456 1454 1458 δasCH3 1335 1335 1335 1334 1337 νC-Cpirazol 1245 1253 1252 1253 1260 Tioamida II - 1098 1098 1097 1101 qPPh3 1035 1046 1046 1043 1051 vNNanel + δrCH3 976 - - - - Tioamida III 961 955 956 956 958 δrCH3 801 705 704 702 705 Tioamida IV - 748 748 747 747 δCHPPh3 Fonte: autor 4.2.2 Espectroscopia de RMN-1H e 13C para os complexos: O espectro de RMN de 1H dos complexos estão representados pela Figura 36, sendo os valores de deslocamento químico, multiplicidades, constantes de acoplamento e valores de integral contidos na Tabela 8. 58 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 36 – Espectros de RMN-1H para os complexos obtidos em clorofórmio-d1 Fonte: autor 59 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Os espectros de RMN de 1H dos complexos são semelhantes ao do ligante livre, sendo o desaparecimento do pico referente ao hidrogênio do grupo tioamida (9,15 ppm) e deslocamento das metilas do anel pirazólico as principais mudanças. Verifica-se o deslocamento do sinal referente ao H11 para campo mais baixo após a complexação (2,16 ppm para o ligante e 2,69, 2,73, 2,77 e 2,54 ppm para os complexos contendo Cl-, Br-, I- e SCN- respectivamente), visto que com a formação da coordenação do Pd(II) ao nitrogênio do pirazol torna a metila próxima mais desprotegida64, enquanto que o H10 desloca-se para campo mais alto (2,71 ppm para o ligante e 2,52, 2,55, 2,50 e 2,52 ppm para os complexos contendo Cl-, Br- , I- e SCN- respectivamente), resultado da mudança dos grupos tioamida (desprotonação) próximos à metila. Verificam-se os sinais referentes aos hidrogênios do grupo trifenilfosfina deslocados para campo de maior desblindagem se comparado ao ligante livre (7,3 ppm), proveniente da formação da ligação de coordenação. Além disso, verifica-se efeito de anisotropia para os hidrogênios H11, sobretudo ao composto contendo tiocianato, uma vez que a proximidade das duplas ligações do ligante tiocianato é capaz de promover efeito proteção aos hidrogênios da metila do pirazol. Tabela 8 – Dados referentes aos espectros de RMN-1H para o ligante livre e complexos sintetizados Referência NH PPh3 PPh3 H4 H8 H10 H11 H9 tedmPz 9,15 (s) - - 5,93 (s) 3,68 (dq)* 2,71 (s) 2,16 (s) 1,27 (t)* 1 - 7,78 (m) 7,47 (m) 5,93 (s) 3,29 (q)* 2,52 (s) 2,69 (s) 1,16 (t)* 2 - 7,79 (m) 7,46 (m) 5,95 (s) 3,33 (q)* 2,55 (s) 2,73 (s) 1,17 (t)* 3 - 7,79 (m) 7,45 (m) 5,93 (s) 3,30 (q)* 2,50 (s) 2,77 (s) 1,15 (t)* 4 - 7,72 (m) 7,51 (m) 5,98 (s) 3,29 (q)* 2,52 (s) 2,54 (s) 1,17 (t)* ʃ [1H] [6H] [9H] [1H] [2H] [3H] [3H] [3H] * 3JCH2CH3 = 7,2Hz; JNHCH2 = 5,5Hz Fonte: autor As figuras a seguir (Figura 37-40) mostram os espectros de RMN de 13C dos complexos 1-4 obtidos em CDCl3. As atribuições dos sinais encontram-se na Tabela 9. 60 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 37 – Espectro de RMN de 13C do complexo [PdCl(PPh3)(tedmPz')] (1). Solvente: clorofórmio-d1 Fonte: autor Figura 38 – Espectro de RMN de 13C do complexo [PdBr(PPh3)(tedmPz')] (2). Solvente: clorofórmio-d1 Fonte: autor 61 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Figura 39 – Espectro de RMN de 13C do complexo [PdI(PPh3)(tedmPz')] (3). Solvente: clorofórmio-d1 Fonte: autor Figura 40 – Espectro de RMN - 13C do complexo [Pd(NCS)(PPh3)(tedmPz')] (4). Solvente: clorofórmio-d1 Fonte: autor 62 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Os espectros de RMN de 13C estão de acordo com as estruturas propostas. Neles são observados 6 sinais referentes ao grupo fenil presentes na trifenilfosfina e 8 sinais atribuídos ao ligante tiocarbamoilpirazol. Verifica-se o deslocamento mais pronunciado dentre os sinais da trifenilfosfina referente ao carbono ligado diretamente ao fósforo para campo mais desblindado (143,55-144 ppm) se comparado a valores da PPh3 livre (137,18 ppm)78, proveniente da coordenação do ligante ao Pd(II). A atribuição e interpretação dos sinais referentes ao ligante tedmPz nos complexos 1-4 fora realizada em comparação ao ligante livre, visto que não há na literatura o estudo deste ligante via espectroscopia de RMN – 13C seja do ligante livre ou em sua forma coordenada. Espera-se a variação dos deslocamentos químicos dos carbonos ligados diretamente ao grupo tiocarbamoil e de carbonos próximos ao N1 do grupo pirazol, levando-se em conta a formação do quelato de forma N,S-aniônica. No espectro de RMN de 13C (Figuras 37-40) foram observadas grandes variações de deslocamento químico, na faixa de 22 a 24 ppm para regiões de maior blindagem, referente ao carbono C6 de todos os complexos sintetizados se comparado ao ligante livre (tiocarbonílico, sinais entre 154,56-152,72 ppm para os complexos 1-4 e 176,01 ppm para o tedmPz livre), justificando a mudança estrutural provocada pela desprotonação do N3 e consequente mudança estrutural do grupo tiocarbamoil, neutro, para iminotiolato, aniônico. A formação do nitrogênio imínico é verificada também pelo deslocamento do carbono C8 para campo de menor blindagem no complexo (46,14-46,29 ppm para os complexos e 39,31 ppm no ligante livre), coerente aos valores de deslocamento químico de iminas encontrados na literatura, em 48,2 ppm79. Para o ligante pirazólico, são verificadas variações para os carbonos C3 e C5, para região de maior blindagem (127,45-130,92 ppm para C3 e 127,83-131,69 para C5), proveniente da capacidade π-aceptora da base de schiff. 63 ___________________________________________________________________ RESULTADOS E DISCUSSÃO Tabela 9 – Dados de RMN de 13C para os complexos 1-4 13C Composto 1 2 3 4 C9 15,06 15,10 15,09 14,78 C11 15,47 15,77 15,70 14,87 C10 15,76 17,26 20,40 15,74 C8 46,14 46,20 46,29 46,17 C4 110,44 110,11 109,48 110,18 C3 128,99 129,75 130,92 127,45 C5 129,37 130,13 131,69 127,83 C6 154,47 154,56 154,21 152,72 C NCS - - - 137,75 Cfenil 128,20 128,10 127,85 128,62 131,07 130,98 130,88 131,6 134,79 134,84 134,89 134,4 143,55 143,56 143,64 144,00 Fonte: autor