RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 24/07/2021. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO E IN VIVO DO PEPTÍDEO LL-37 CONTRA Streptococcus agalactiae EM TILÁPIA-DO-NILO Elielma Lima de Sousa Bióloga 2020 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO E IN VIVO DO PEPTÍDEO LL-37 CONTRA Streptococcus agalactiae EM TILÁPIA-DO-NILO Discente: Elielma Lima de Sousa Orientadora: Profa. Dra. Fabiana Pilarski Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia Agropecuária. 2020 3 4 5 DADOS CURRICULARES DO AUTOR Elielma Lima de Sousa – nascida em São Luis, Estado do Maranhão, em 05 de agosto de 1992. Ingressou no Curso de Ciências Biológicas (Licenciatura e Bacharelado) em 2011 na Universidade Estadual do Maranhão– Câmpus Paulo VI em São Luis, obtendo o título de bióloga em 2017. Durante a Graduação, realizou graduação sanduiche de um ano e quatro meses (2013-2014) na Universidade de Alberta, Canadá. Ainda como estudante de graduação, realizou outro intercâmbio, desta vez na Argentina. A carreira cientifica como pesquisadora teve início no segundo ano de graduação (2012), quando desenvolveu o primeiro trabalho de Iniciação cientifica (2012-2013) Após a realização deste trabalho, tornou-se bolsista de Incitação cientifica por mais dois anos (2015-2017). Os trabalhos de pesquisa desenvolvidos resultaram em artigos e resumos apresentados e publicados em anais de eventos científicos locais e internacionais. Realizou três estágios extracurriculares. Ingressou no curso de mestrado em março de 2018, no programa de Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária, na Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – FCAV – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (Câmpus Jaboticabal). 6 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pela minha existência, por tudo que sou e tenho. À minha família, especialmente aos meus queridos pais Maria Nivia e Pedro pelo apoio, amor e confiança. Agradeço a Profa. Dra. Fabiana Pilarski pelo aceite no grupo de pesquisa, por ter acreditado e confiado no meu trabalho. Obrigada pela orientação, paciência e por ajudar na minha formação profissional. Agradeço ao Prof. Dr. Norival Santos-Filho pelo suporte e disponibilidade de tempo, de muito bom grado em todos os momentos que necessitei. Aos professores membros da banca examinadora pelo seu tempo e contribuição. Aos colegas do Laboratório de Microbiologia e Parasitologia de Organismos Aquáticos (LAPOA) por toda ajuda, em especial, ao Inácio e Raphael pelo apoio e conhecimento técnico para que este trabalho fosse desenvolvido; Ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária e a Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV/Unesp. Aos peixes, que cederam suas vidas para esse projeto. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. E todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a conclusão deste trabalho. Obrigada a todos! i SUMÁRIO LISTA DE TABELAS .......................................................................................... iv LISTA DE FIGURAS ....................................................................................... ...v Resumo .............................................................................................................. vi Abstract ............................................................................................................. vii CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ..................................................... 1 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1 2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................... 3 2.1 Piscicultura no Brasil ................................................................................. 3 2.2 Estreptococose: um desafio para tilapicultura mundial ............................. 4 2.3 Tratamento da estreptococose na piscicultura .......................................... 6 2.4 Uso de peptídeos como antimicrobiano .................................................... 7 2.5 Peptídeos Antimicrobianos na Aquicultura ................................................ 8 2.6 Peptídeo LL-37 .......................................................................................... 9 2.7 Parâmetros hematológicos e imunológicos em peixes teleósteos .......... 11 3 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 13 CAPITULO 2: Haematological, biochemical and immunological biomarkers, antibacterial activity, and survival in Nile tilapia Oreochromis niloticus after treatment using antimicrobial peptide LL-37 against Streptococcus agalactiae….. ................................................................................................... 23 Abstract ............................................................................................................ 24 1 Introduction .................................................................................................... 25 2. Material and methods ................................................................................... 27 2.1. Antimicrobials ......................................................................................... 27 2.2.Cytotoxicity studies by haemolytic activity ............................................... 28 2.3.Antimicrobial susceptibility testing (AST) ................................................. 29 2.3.1. Bacterial isolates ........................................................................... 29 2.3.2. Minimum inhibitory and bactericidal concentrations (MIC and MBC)... ............................................................................................................. 29 2.4. In vivo therapeutic effectiveness ............................................................ 30 2.4.1. Fish and study design ..................................................................... 30 2.4.2. Bacterial challenge ......................................................................... 32 ii 2.4.2.1. Inoculation of S. agalactiae KU60557.1 ....................................... 32 2.4.2.2. Antimicrobial administration ......................................................... 32 2.4.3. Effectivenes .................................................................................... 33 2.4.3.1. Histological analyses ................................................................... 33 2.5. Blood parameters ................................................................................... 34 2.5.1. Hematological analyses .................................................................. 34 2.5.2. Biochemical analyses ..................................................................... 35 2.5.3. Immunological analyses ................................................................. 35 2.5.4. Evaluation of micronuclei and nuclear abnormalities in erythrocytes… ........................................................................................... ……36 2.6. Statistical analysis .................................................................................. 36 3 Results .......................................................................................................... 36 3.1. Hemolytic activity of LL-37 against Nile tilapia red blood cells ................ 36 3.2. In vitro antimicrobial activity .................................................................... 37 3.3. In vivo therapeutic effectiveness ............................................................ 33 3.3.1. Histological analyses ...................................................................... 40 3.4. Hematological analyses .......................................................................... 43 3.5. Biochemical analyses ............................................................................. 45 3.6. Immunological analyses ......................................................................... 45 3.7. Erythrocytes abnormalities ..................................................................... 46 4 Discussion ..................................................................................................... 48 5 Acknowledgement ......................................................................................... 52 6 References .................................................................................................... 53 iii iv LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 2 ............................................................................................ Página Table 1. Histological changes according to the degree of intensity in Nile tilapia Oreochromis niloticus 20 days post-challenge with Streptococcus agalactiae and administration of LL-37 or florfenicol (FFC) ............................................... 42 Table 2. Intestinal morphometry of Nile tilapia treated with LL-37 or florfenicol (FFC), at 20th day after challenge with Streptococcus agalactiae..................... 43 Table 3. Haematological parameters of Nile tilapia Oreochromis niloticus 20 days post-challenge with Streptococcus agalactiae and administration of LL-37 or florfenicol (FFC) ........................................................................................... 44 Table 4. Serum biochemical parameters of Nile tilapia Oreochromis niloticus 20 days post-challenge with Streptococcus agalactiae, and administration of LL-37 or florfenicol (FFC) ........................................................................................... 45 Table 5. Comparison of micronuclei and other nuclear abnormalities in Nile tilapia 20 days post-challenge with Streptococcus agalactiae and administration of LL-37 or florfenicol (FFC) ............................................................................. 47 v LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 2 ............................................................................................ Página Figure 1. Hemolytic activity of the LL-37 to Nile tilapia red erythrocytes .......... 37 Figure 2. Cumulative survival (%) of Nile tilapia challenged with S. agalactiae and medicated with LL-37 or florfenicol (FFC).................................................. 38 Figure 3. Typical signs of streptoccosis in fish dying during the experimental period ............................................................................................................... 39 Figure 4. Changes in tissue section of Nile tilápia ........................................... 40 Figure 5. Mean of Leukocyte respiratory burst, Serum lysozyme concentration and Hemolytic activity of the alternative pathway of the complement system of surviving O. niloticus in 20th day post treatment with LL-37 peptide ............... 46 Figure 6. Photomicrographs of erythrocytes with normal nucleus, Micronuclei and nuclear abnormalities in peripheral blood cells of Nile tilapia .................... 47 vi ATIVIDADE ANTIMICROBIANA IN VITRO E IN VIVO DO PEPTÍDEO LL-37 CONTRA Streptococcus agalactiae EM TILÁPIA-DO-NILO RESUMO - A estreptococose é uma doença bacteriana que causa grandes perdas econômicas na produção de tilápia. O Streptococcus agalactiae é um dos principais patógenos causadores de infecção em tilápia, em várias regiões do mundo. Atualmente, no caso de infecções microbianas em peixes, existem apenas duas moléculas licenciadas para uso na aquicultura. Os peptídeos com potencial antimicrobiano são compostos promissores no desenvolvimento de uma nova classe de antimicrobianos. O peptídeo LL-37, uma catelicidina humana caracterizada como um antibiótico de amplo espectro possui propriedades quimiotáticas e imunomoduladoras, as quais inibem a colonização de patógenos. Desta forma, neste trabalho objetivou-se avaliar a atividade antimicrobiana do peptídeo LL-37 em tilápia- do-Nilo infectadas com S. agalactiae. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) do LL-37 para S. agalactiae. Adicionalmente, avaliou-se a atividade hemolítica desse peptídeo e sua eficácia no tratamento da estreptococose em tilápia-do-Nilo. Os resultados demonstrados neste estudo mostraram que a concentração inibitória mínima e a concentração bactericida mínima do LL-37 para S. agalactiae foi 31,25 µg/mL. Os parâmetros hematológicos, bioquímicos e imunológicos apresentaram valores sem diferenças significativas entre os grupos. Nossos resultados sugerem que o peptídeo LL-37 é um potente antimicrobiano contra S. agalactiae in vitro e não afeta a viabilidade celular dos peixes. Não foi possível, com a dose 15 mg/kg controlar a mortalidade da tilápias infectadas com a bactéria, contudo, foi possível eliminar o patógeno dos peixes sobreviventes, o que pode ser positivo no controle de estreptococose recorrente. Palavras-chave: peptídeo, ação antimicrobiana, tratamento vii ANTIMICROBIAL ACTIVITY IN VITRO AND IN VIVO OF LL-37 PEPTIDE AGAINST Streptococcus agalactiae IN NILE TILAPIA ABSTRACT - Streptococcosis is a bacterial disease. It causes elevate economic savings in tilapia production. Streptococcus agalactiae is a pathogen wich cause motality of red tilapia in many regions of the world. Currently, microbial infections in fish are treated only with two molecules which one are licensed for use in aquaculture. Peptides with antimicrobial potential are promising compounds in the development of a new class of antimicrobials. LL-37 peptide has broad spectrum bacterial activity. In the present study, we aimed to evaluate antimicrobial activity of peptide LL37 in Nile tilapia infected with S. agalactiae. The minimum inhibitory concentration (MIC) and the concentration bacterial resistance (CBR) from LL-37 to S. agalactiae were analyzed. Additionally, hemolytic activity of this peptide was tested. As well, we evaluated efficacy of LL-37 in the treatment of streptococcosis in Nile tilapia. As the results, the minimum inhibitory concentration and the minimum bacterial concentration of LL-37 for S. agalactiae were 31.25 µg/mL. LL-37 in the treatment of infectious diseases by S. agalactiae was not effective at the dose of 15 mg/kg. Hematological, biochemical and immunological parameters include values within the range for healthy fish. Changes in blood cells and tissue of brain, kidney, liver and splen were found. Our results suggest LL-37 is a potent antimicrobial against S. agalactia in vitro and it does not affect fish cell viability. We conclude, It was not possible to control the mortality of streptococcosis with the dose of 15 mg/kg of LL-37, however, it eliminated either pathogen in surviving fish. Keywords: peptide, antimicrobials, treatment 1 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais 1 INTRODUÇÃO A ausência de um manejo adequado nos viveiros e tanques-rede utilizados nos diferentes sistemas de produção pode levar a deterioração da qualidade da água, com consequências para todo o sistema aquático e também para a criação de organismos aquáticos (Meneghine, 2013). Assim, faz se necessário o monitoramento dessa atividade, sobretudo nos lugares onde há rápida expansão e concentrada densidade de organismos nestes sistemas de criação (Dias e Sipaúba-Tavares, 2012). Alterações físicas e químicas do meio aquático são críticas para desenvolvimento de doenças parasitárias e bacterianas em peixes. A combinação de um patógeno presente na água, um hospedeiro suscetível e um ambiente com baixa qualidade define a patogênese de muitas doenças infecciosas em peixes (Plumb e Hanson, 2011). Nos últimos anos, a criação de tilápia tem sido prejudicada economicamente por elevada taxa de mortalidade decorrente principalmente de doenças bacterianas, e dentre elas, destaca-se a estreptococose. De acordo com Figueiredo et al. (2006), infecções causadas por Streptococcus spp. aumentaram nos últimos anos por elevação na ocorrência de casos clínicos, principalmente, associados a Streptococcus agalactiae (S. agalactiae) com perdas na tilapicultura mundial. A bactéria S. agalactiae além das mortalidades que provoca, também apresenta potencial de infectar mamíferos, humanos e aves, constituindo-se em um risco para a saúde pública. Em neonatos humanos, o S. agalactiae é o principal agente etiológico de septicemia, com evolução para outros quadros clínicos graves (Domelier et al., 2008). Atualmente, no caso de infecções microbianas em peixes, existe apenas dois antimicrobianos licenciados para uso na aquicultura, o florfenicol (específico para o tratamento da estreptococose) e a oxitetraciclina. A ineficácia desses medicamentos 2 pode levar ao uso irregular de outros antimicrobianos e aplicação de elevadas doses favorecendo a resistência bacteriana, o que pode gerar impacto ambiental e acúmulo de resíduos no produto destinado ao consumo humano (Hölmstrom et al., 2003). A resistência de patógenos aos antimicrobianos licenciados tem se tornado um problema mundial de interesse na produção aquícola. Vários microrganismos multirresistentes vêm surgindo atualmente e, em sua grande parte, são bactérias causadoras de infecções em peixes (Costa et al., 2008; Amarante et al., 2018). A presença de bactérias resistentes aumenta tanto a mortalidade como também o custo do tratamento, a evolução do quadro infeccioso e a duração da doença (Fernandes et al., 2014). Para solucionar essa problemática, diversas estratégias vêm emergindo. Uma delas é através de estudos com peptídeos antimicrobianos (PAMs), os quais são componentes do sistema imune de vertebrados e invertebrados e a primeira linha de defesa contra a invasão de microrganismos (Brogden, 2005; Brown e Hancock, 2006). Os PAMs podem ser utilizados em combinação ou não com outros fármacos e são compostos promissores no desenvolvimento de uma nova classe de antimicrobianos, pois apresentam características como a capacidade de eliminar bactérias Gram positivas e negativas, e atividade contra patógenos já multirresistentes aos fármacos comerciais (Da Silva et al., 2013; Krelin et al., 2016; Santos-Filho et al., 2017). Os PAMs possuem atividade antimicrobiana já comprovada contra diversos patógenos (Kim et al., 2002; Rahnamaeian, 2011; Bahar e Ren, 2013 Santos-Filho et al., 2017; Kim et al., 2017; Liu et al., 2018). O tratamento com peptídeos se torna uma alternativa ao uso de antimicrobianos, representando uma possibilidade interessante no controle de surtos de doenças. Entre os peptídeos mais utilizados em estudos científicos destaca-se o peptídeo LL-37, um peptídeo catiônico pertecente a família das catelicinas e presente nos humanos, com amplo espectro de ação, predominantemente encontrado e secretado em vários tecidos e fluidos (De Smet e Contreras, 2005; Cederlund et al., 2011). E é um peptídeo com capacidade de neutralizar a parede das bactérias (LPS) e interromper o seu crescimento (Cederlund et al., 2011). 3 Por ser um peptídeo com atividade antimicrobiana promissora (Mookherjee e Hancock, 2007; Overhage et al., 2008; Molhoek et al., 2009; Hell et al., 2010, Kanthawong et al., 2010; Thennarasu et al., 2010; Kanthawong et al., 2012) o LL-37 foi selecionado para ser usado neste trabalho, uma vez que não foram encontradas informações na literatura sobre o seu uso no tratamento de infecções causadas por S. agalactiae em tilápia-do-nilo. Desta forma, neste estudo objetivo-se avaliar a atividade antimicrobiana in vitro e in vivo do peptídeo LL-37 em tilápia-do-Nilo infectadas com S. agalactiae; a atividade citotóxica do peptídeo nas células sanguíneas e alerações nos parâmetros hematológicos, imunológicos e bioquimicos de juvenis de tilápia. 53 In conclusion, this study indicates that LL-37 is a promising antimicrobial candidate in the fight against bacterial diseases in aquaculture, since it showed strong in vitro antimicrobial activity against the most important and devastating pathogens of Nile tilapia and no significant effects on the haematological, biochemical and immunological parameters of the host, following a single oral dose of 15 mg/kg. 5 Acknowledgement This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001. The authors thank the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) [grant numbers 88882.433649/2019-01, 88882.433845/2019-01] and students from the Laboratory of Microbiology and Parasitology of Aquatic Organisms (LAPOA) of Caunesp for technical support. 6 References Andersson, M., 2019. Staphylococcus epidermidis Persister Cell Elimination Using an Antimicrobial Peptide. J. Bacteriol. Mycol. 6, 2–7. https://doi.org/10.26420/jbacteriolmycol.2019.1093 Asencios, Y.O., Sánchez, F.B., Mendizábal, H.B., Pusari, K.H., Alfonso, H.O., Sayán, A.M., Figueiredo, M.A.P., Manrique, W.G., Belo, M.A. de A., Chaupe, N.S., 2016. First report of Streptococcus agalactiae isolated from Oreochromis niloticus in Piura, Peru: Molecular identification and histopathological lesions. Aquac. Reports 4, 74–79. 54 https://doi.org/10.1016/j.aqrep.2016.06.002 Assane, I.M., Gozi, K.S., Valladão, G.M.R., Pilarski, F., 2019. 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