Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte dos requisitos para obtenção ao título de Mestre UNIVERSIDADE ESTAUDAL PAULISTA Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Campus de Botucatu Polímero de óleo de soja como potencial veículo termoprotetor para a Fitase em dietas para a Tilápia-do-Nilo EDGAR JUNIO DAMASCENO RODRIGUES BOTUCATU – SP Outubro – 2019 2 VI Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Zootecnia como parte dos requisitos para obtenção ao título de Mestre UNIVERSIDADE ESTAUDAL PAULISTA Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Campus de Botucatu Polímero de óleo de soja como potencial veículo termoprotetor para a Fitase em dietas para a Tilápia-do-Nilo EDGAR JUNIO DAMASCENO RODRIGUES Zootecnista ORIENTADOR: Prof. Dr. Luiz Edivaldo Pezzato COORIENTADOR: Prof. Adj. Dr. Pedro de Magalhães Padilha BOTUCATU – SP Outubro – 2019 V Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. R696p Rodrigues, Edgar Junio Damasceno Polímero de óleo de soja como potencial veículo termoprotetor para a Fitase em dietas para a Tilápia-do-Nilo / Edgar Junio Damasceno Rodrigues. -- Botucatu, 2020 69 p. : il., tabs. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu Orientador: Luiz Edivaldo Pezzato Coorientador: Pedro de Magalhães Padilha 1. Oreochromis niloticus. 2. Digestibilidade. 3. Antinutricionais. 4. Minerais. 5. Polímero. I. Título. V BIOGRAFIA Nascido em Formiga-MG em 1991, filho de Lúcia e Edgar, teve criação humilde junto a seu irmão e avós. Sua mãe, professora, sempre muito exigente quanto à educação de seus filhos, os estimulava a serem esforçados e nunca cessarem os estudos. Ingressou no curso de Zootecnia na Universidade Federal de Lavras (UFLA) em julho de 2010. Estimulado por seu padrinho, Mozar Brito, professor do Departamento de Administração na UFLA, pleiteou uma vaga no programa de Iniciação Científica (IC) para o setor de aquicultura da UFLA em seu primeiro semestre de graduação, obteve êxito sendo contemplado com outras bolsas de IC até o final de sua graduação no mesmo setor. Em 2013, foi aprovado no processo seletivo para o programa de intercâmbio acadêmico “Ciência Sem Fronteiras”, passando 18 meses em estudos intensos de Língua Inglesa e Animal Science na The University of Queensland em Brisbane QLD, Austrália. Retorna em 2015 para retomar os estudos no Brasil, e em 2018 gradua-se Zootecnista e inicia o curso de mestrado na Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Botucatu, onde atualmente aspira realizar seu Doutorado. VI Agradeço a Olorum pela oportunidade, força e saúde concedida. Aos meus pais Lucia Brito e Edgar Rodrigues pelo amor e apoio. Ao meu irmão Euler Rodrigues, pelo apoio incondicional e incentivo. À minha esposa, Gabriela pelo companheirismo e amor. Às minhas filhas, Helena e Sofia, que torcem pelo seu pai mesmo lá de cima. Muito obrigado. Dedico. VII AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a Olorum que em nenhum momento me abandonou e me concedeu saúde e força para seguir nessa caminhada. À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” pela oportunidade de realizar este curso. Aos meus pais, em especial à minha mãe, pelo amor incondicional, pelos anos de luta e trabalho árduo necessários para a minha criação, pelo apoio e compreensão. Ao meu irmão Euler Rodrigues, que esteve ao meu lado nessa jornada, me apoiando, motivando e que sempre se fez presente para o que fosse preciso. Seremos sempre nós dois contra o mundo. À minha esposa, Gabriela Maria dos Santos, pelos anos juntos, me apoiando, motivando e fazendo a caminhada mais leve. Ao meu padrinho Mozar José de Brito, que me incentivou desde o ensino médio a ingressar em uma universidade, me deu todo o suporte necessário para a conclusão de minha graduação, sempre disposto a auxiliar e compartilhar os mais diversos ensinamentos e que me apresentou ao mundo acadêmico. Aos meus familiares, que mesmo distantes se fizeram presentes através de ligações, cartas, mensagens. Em especial a minha avó Maria de Lourdes que nunca duvidou do meu potencial e sempre me confortou com seu amor. Ao meu orientador Prof. Dr. Luiz Edivaldo Pezzato que me concedeu o privilégio de ser orientado pela maior referência em digestibilidade de alimentos para peixes do Brasil. Que me acolheu em sua equipe e pacientemente compartilhou tanto conhecimento e experiências de vida, além de fundamentalmente contribuir para a minha formação, acreditar em meu potencial e ser um exemplo em quem se espelhar. VIII À Prof. Dra. Margarida Maria Barros, pelos ensinamentos compartilhados, acolhimento e exemplo de dedicação e profissionalismo. Ao Prof. Dr. Pedro de Magalhães Padilha por abrir as portas de seu laboratório e prontificar-se a auxiliar nas diferentes análises necessárias para a execução deste trabalho e também pelos ensinamentos. A todos os professores desta instituição que contribuíram para a minha formação. À toda equipe do laboratório AQUANUTRI, Igor Simões Tiágua Vicente, Matheus Gardim Guimarães, Pedro Luiz Pucci Figueiredo de Carvalho, William dos Santos Xavier, Jaqueline de Oliveira Fonseca e demais estagiários pelo acolhimento, companheirismo, confiança, dedicação aos trabalhos e desafios que encaramos juntos e pela amizade construída ao longo dos anos. À minha orientadora de iniciação científica, Priscila Vieira Rosa e equipe de pesquisa, que durante a minha graduação, lapidaram e moldaram meu perfil acadêmico, acreditaram no meu potencial, forneceram apoio e compartilharam conhecimentos importantes para minha vida profissional e pessoal. Aos meus irmãos de fé, orixás e guias, que me apresentaram e acolheram em uma religião tão linda, repleta de fé e axé, como a Umbanda. O apoio, ensinamentos e amizade de todos foi fundamental durante meu mestrado e os levarei para a vida toda. Todos vocês foram de suma importância para a conclusão desta etapa de minha carreira, a todos minha gratidão. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo: 2018/19293- 1), pela bolsa concedida. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (Processo: 134366/2018-2), pela bolsa concedida. IX RESUMO GERAL A enzima fitase é utilizada em dietas de animais monogástricos objetivando minimizar o efeito antinutricional do fitato presente nos alimentos de origem vegetal. A elevação da temperatura durante o processamento das rações próprias à piscicultura diminui significativamente a ação dessa enzima e, portanto, este estudo objetivou avaliar o polímero do óleo de soja, obtido pelos princípios da química verde, como veículo termoprotetor para a fitase durante o processamento de dietas para tilápia-do-Nilo. Foram utilizados 192 juvenis de tilápia- do-Nilo (peso médio de 140g), dispostos em 12 aquários de alimentação (250 litros). O experimento foi delineado em esquema fatorial (3x2) que consiste em três métodos de inclusão da enzima (revestida ao pellet pós processamento -CPP, associada ao polímero -PAE e sem enzima -NE) x dois tipos de processamento da dieta (extrusão ou peletização). Foi adicionada a mesma quantidade de polímero (43,1 g/kg/ração) com o mesmo nível de fitase (1500 unidades de fitase/kg/ração) seguindo as formas de inclusão e processamento descritas no esquema fatorial. Os peixes foram alimentados quatro vezes ao dia, até a saciedade aparente, e suas excretas coletadas uma vez ao dia, intercalando a repetição de cada tratamento. Para a determinação da eficácia do produto teste, os coeficientes de digestibilidade aparente dos nutrientes das dietas foram determinados. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância (two-way ANOVA), com 5% de significância, e teste Tukey para comparação das médias. Houve interação significativa para os valores de coeficientes de digestibilidade aparente (CDA) para fósforo (P), cálcio (Ca), matéria mineral (MM) e extrato etéreo (EE) (p<0.05). O método CPP determinou os maiores valores de CDA para P, Ca, MM, seguido pelo método PEA em dietas extrudadas (p<0.05). Para as dietas peletizadas, PEA promoveu os maiores valores de CDA para P e Ca, seguido pelo método CPP (p<0.05). Estes resultados sugerem que o polímero de óleo de soja pode ser utilizado com veículo para a fitase. Palavras chave: Oreochromis niloticus, digestibilidade, antinutricionais, minerais, polímero. X ABSTRACT Phytase is supplemented in non-ruminant diets in order to reduce the antinutritional effects of the phytate content of vegetable ingredients. Aquafeed processing can reach elevated temperatures, which could impair phytase activity. In this sense, this study aimed to evaluate a heat and acidic pH resistant soybean oil polymer, produced following the principles of “green chemistry” as a vehicle to protect phytase during fish feed processing. Juvenile Nile tilapia (140 ± 4.3 g) were randomly distributed and kept in 12 feeding aquaria (250 L). The experimental design was factorial (3x2) with three phytase supplementation methods (coating post processing - CPP, polymer associated to enzyme - PAE, and no enzyme - NE) and two feed processing methods (extrusion or pelletizing) with one enzyme level: 1500 phytase units kg-1 (FTU kg-1) and the same amount of polymer 43.1 g /kg-1, accordingly to the methods described previously. Fish were fed the experimental diets four times a day until apparent satiation and feces samples were collected once a day. The efficacy of the polymer as a thermoresistant vehicle to phytase during feed processing was evaluated by assessing the apparent digestibility coefficient (ADC) of nutrients in the diets. The data obtained were subject to a two-way ANOVA at 5% of significance and Tukey’s test. There was a positive interaction for ADC values of phosphorus (P), calcium (Ca), mineral matter (MM) and crude fat (CF) (p<0.05). Coating determined higher ADC values for P, Ca and MM, followed by PEA in extruded diets (p<0.05). For pelletized diets, PEA determined higher ADC values for P and Ca, followed by coating (p<0.05). These results suggest that the polymer may be a potential protective carrier for phytase and other thermo labile additives. Keywords: Oreochromis niloticus, digestibility, sustainability, aquafeed, edible polymer XI LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO I CAPÍTULO II Figura 1. Suplementação de fitase em dietas baseadas em ingredientes vegetais para Truta Arco-Íris sobre a emissão sólida ou dissolvida de Nitrogênio (N) e Fósforo (P) ................................. 6 Figura 2. Estrutura química do Ácido fítico .......................................................................................... 8 Figura 3. Fitato complexado a nutrientes, complexo binário (*), complexo ternário (**)........ 13 Figura 4. Mecanismo de ação da fitase em peixes ................................................................... 17 Figure S1. TG/DTG-DTA curves for phytase (a), polymer (b), and polymer-associated phytase (c) …………………………………………………………………………. 62 XII XIII LISTA DE TABELAS CAPÍTULO I Tabela 1. Concentração de fósforo total e fítico em ingredientes vegetais ......................... 9 Tabela 2. Disponibilidade de fósforo em ingredientes vegetais para tilápia-do-Nilo .......... 10 Tabela 3. Características de algumas fitases comerciais .......................................... 19 Tabela 4. Os doze princípios da “Química Verde” ................................................... 30 CAPÍTULO II Table 1. Ingredient composition and proximate analysis of the diets...……………………………… 59 Table 2. Apparent digestibility coefficient (ADC) values of phosphorus and calcium for Nile tilapia fed phytase-supplemented diets subjected to different processing and incorporation methods…………………………………………………………… 60 Table 3. Apparent digestibility coefficient (ADC) values of CP, CE, CF, DM, MM for Nile tilapia fed phytase-supplemented diets subjected to different processing and incorporation methods…………………………………………………………… 61 XIV XV LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ADC Apparent digestibility coefficient Ca Calcium CP Crude protein CDA Coeficiente de digestibilidade aparente CF Crude fat CPP Coating post processing DM Dry matter FAPESP The São Paulo Research Foundation FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia FTU Unidades de fitase GE Gross energy MM Mineral matter NRC National Research Council NE No enzyme inclusion P Phosphorus PAE Polymer associated to enzyme UNESP Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho’’ XVI XVII SUMÁRIO CAPÍTULO 1......................................................................................................... 1 Considerações iniciais................................................................................... 2 1. Revisão da Literatura.................................................................................... 3 1.1. Expansão aquícola e seus impactos ambientais............................................ 3 1.2. Fitato na alimentação de peixes.................................................................... 7 1.3. Alternativas para inativar o fitato................................................................. 14 1.4. Fitase............................................................................................................ 16 1.5. Fitase na nutrição de peixes.......................................................................... 22 1.6. A digestibilidade dos alimentos................................................................... 25 1.7. Polímeros de óleos vegetais e aplicações...................................................... 27 Referências Bibliográficas............................................................................ 31 CAPÍTULO 2. “A plant-based polymer as a potential thermoresistant carrier to phytase in Nile tilapia diets”……………………… 47 Abstract .................................................................................................................... 48 1. Introduction ............................................................................................... 48 2. Material and Methods ................................................................................ 50 2.1. Experimental diets and phytase incorporation. ..................................... 50 2.2. Digestibility Assessment ...................................................................... 52 2.3. Chemical Analysis ................................................................................ 52 2.4. Statistical Analysis ............................................................................... 53 2.5. Simultaneous Thermogravimetry-Differential Thermal Analysis (TG- DTA…………………………………………………………………… 53 2.6. Ethics statement……………………………………………………… 53 3. Results and Discussion ............................................................................... 53 4. Conclusion ................................................................................................. 57 Acknowledgements.................................................................................... 58 Conflict of interest statement..................................................................... 58 References ................................................................................................. 63 CAPÍTULO III 67 Implicações ............................................................................................... 68 XVIII 1 Capítulo I 2 Considerações Iniciais O Capítulo I discorre sobre alguns dos impactos no ambiente aquático promovidos pelo desenvolvimento do setor aquícola assim como estratégias que visam minimizar tais efeitos. Dentre as diferentes consequências, a eutrofização de corpos d’agua tem sido amplamente discutida. Este fenômeno ocorre naturalmente ao longo dos anos; entretanto, pode ser acelerado pelo aumento na concentração de nutrientes limitantes para o ecossistema aquático, como fósforo e nitrogênio, inviabilizando o consumo de água e a produção de organismos aquáticos nas áreas afetadas. Sistemas de produção de peixes não sustentáveis podem exacerbar este problema, sendo responsáveis pelo aumento significativo dos nutrientes lançados no ambiente aquático, na forma de ração não consumida ou excretas. Apesar disso, existem soluções para reduzir os efeitos negativos promovidos pela expansão da aquicultura. Uma das estratégias que podem ser adotadas é a suplementação de fitase. Essa enzima aumenta a disponibilidade de alguns nutrientes contidos em dietas à base de ingredientes vegetais para os animais, além de reduzir a necessidade de suplementação de fósforo. Embora a fitase possa contribuir com a sustentabilidade da aquicultura, a sua incorporação em dietas para peixes ainda é um desafio. Tal enzima tem sua atividade reduzida ao ser exposta às altas temperaturas, necessárias durante o processamento de dietas para peixes. Dessa forma, o desenvolvimento de veículos para aumentar a estabilidade térmica desta enzima, como polímeros vegetais, pode ser uma importante ferramenta para viabilizar o seu uso em dietas comerciais para peixes. Considerando tais informações redigiu-se o Capítulo II, com o intuito de testar o polímero de óleo de soja como veículo termoprotetor para a enzima fitase em dietas para juvenis de tilápia-do-Nilo. Este capítulo é entitulado: A plant-based polymer as a potential thermoresistant carrier to phytase in Nile Tilapia diets, o qual foi escrito seguindo as normas do periódico Food Chemistry (fator de impacto 5.399). 3 Revisão da Literatura 1.1. Expansão aquícola e seus impactos ambientais A aquicultura pode ser definida como a produção de diferentes organismos aquáticos, peixes, anfíbios, alguns répteis, moluscos, crustáceos e plantas aquáticas, por exemplo (FAO, 2019). Dentre as atividades de produção de alimento, a aquicultura é o setor que mais cresce mundialmente, sendo o pescado a proteína de origem animal mais consumida no mundo (FAO, 2018). A produção aquícola pode ser dividida em dois seguimentos principais: sistemas de cultivo e captura extrativista. Historicamente o total produzido por meio da captura é superior à produção em sistemas de cultivo; entretanto, a pesca extrativista permanece com seu crescimento estagnado desde a década de 80, enquanto o cultivo de organismos aquáticos segue crescendo consideravelmente com projeções para ultrapassar a produção extrativista nos próximos anos (FAO, 2018). O Brasil está entre os países de maior potencial hídrico para o desenvolvimento da aquicultura. Este possui cerca de 10 milhões de hectares de água doce, distribuídos entre rios, represas e lagos (RORIZ et al., 2017) que possivelmente podem ser utilizados para a expansão sustentável desta atividade. De fato a aquicultura tem se expandido no Brasil, segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (2019) a produção piscícola nacional cresceu cerca de 10% nos últimos dois anos, sendo a tilápia-do-Nilo (Oreochromis niloticus) a espécie de água doce mais produzida, principalmente em tanques-rede, correspondendo a 52.6% do total. Sistemas de produção em tanques-rede tem sido considerado um recurso importante para impulsionar o desenvolvimento da piscicultura no Brasil e aumentar a sua competitividade. O uso deste tipo de sistema produtivo tem crescido em diversos países, como Indonésia, China e Brasil, que possui alta taxa de crescimento para produção de tilápia, sendo considerado principal concorrente da China para a posição de maior produtor de tilápia-do-Nilo (FITZSIMMONS, 2006; SAMPAIO et al., 2013). Considerando o alto potencial produtivo 4 desta atividade, a demanda por dietas adequadamente balanceadas, assim como outras medidas que promovam a expansão sustentável da aquicultura no Brasil é expressiva. Um dos principais entraves para a expansão aquícola é o custo de produção e este é representado em sua maior parte por despesas para a produção ou compra de ração para os animais. Segundo o National Research Council (NRC) (2011) a dieta dos peixes cultivados em sistemas de produção intensivos representa cerca de 70% dos custos totais de produção, sendo a fonte proteica, de fósforo e óleo os ingredientes proporcionalmente mais onerosos. Assim, a ração deve ter ótimo valor biológico para aperfeiçoar o processo produtivo e minimizar a eutrofização do ambiente aquático, sendo esta causada primariamente por nutrientes não digeridos, resíduos do metabolismo e a dissolução de ração não consumida na água (KAWASAKI et al., 2016; GONZÁLEZ et al., 2008). Da mesma maneira que outros setores de produção de alimentos, a aquicultura é também responsável pela descarga de nutrientes em corpos d’água. A produção mundial de peixes e crustáceos em 2008 resultou na emissão de 1.7 e 0.46 milhões de toneladas de nitrogênio e fósforo, respectivamente (VERDEGEM, 2013). Já em 2010 o teor de nitrogênio e fósforo nos efluentes oriundos de sistemas de produção de peixes de água doce aumentou para 5 e 0.9 milhões de toneladas respectivamente (BOUWMAN et al., 2013). A adição controlada destes e outros nutrientes poderia beneficiar de certa maneira o ecossistema aquático. Entretanto, este tipo de sistema possui capacidade limitada para assimilar e reciclar nutrientes, que quando excedida gera eutrofização (WHITE; PHILLIPS; BEVERIDGE, 2013). A água com grande concentração de nitrogênio e fósforo, que são nutrientes limitantes, promove o aumento da população de bactérias, algas e outros organismos que diminuem o teor de oxigênio dissolvido, liberam toxinas e podem causar a morte massiva dos peixes (DIAZ; ROSENBERG, 2008; EDWARDS, 2015; PAERL, 1997). Adicionalmente, a eutrofização pode inviabilizar o uso de corpos d’água tanto para a atividade aquícola quanto 5 para o consumo humano e mesmo para atividades de recreação (CHISLOCK; DOSTER; ZITOMER; WILSON, 2013). Por utilizar águas públicas de quaisquer origens, é eminente a necessidade de se adotar medidas visando a redução dos impactos ambientais causados pela implementação de sistemas de produção de peixe. No sentido de se diminuir o grau de eutrofização da água dos tanques destinados à piscicultura, recomenda-se a adoção de boas práticas de alimentação para reduzir o volume de fezes e de resíduos de alimentos no meio (SCHULZ; GELBRECHT; RENNERT, 2003). Dentre as boas práticas de alimentação, o uso de ingredientes com alto valor biológico e formulações com níveis adequados de alguns nutrientes também têm sido recomendadas, a fim de reduzir os impactos ambientais da aquicultura. De acordo com Bueno et al. (2012), a redução de 0.4% nos níveis de fósforo em dietas para tilápia-do-Nilo pode diminuir o teor deste nutriente em até 55% nos efluentes do tanque sem prejudicar o desempenho dos peixes. A utilização de menores níveis de fósforo na dieta pode, ainda, reduzir os custos com a formulação da ração sem prejudicar a qualidade final do produto (OSTI et al., 2018). Adicionalmente, pode- se recomendar o uso de tanques de decantação para os sedimentos, o recolhimento de sobras após o arraçoamento, e tratamento biológico e/ou químico dos efluentes (DUMAS et al., 1998; HUSSENOT; LEFEBVRE; BROSSARD, 1998; NAYLOR et al., 2003). Entretanto, a demanda de alto investimento inicial e sua inviabilidade de uso em sistemas de tanque-rede, limita a adoção destas práticas. Uma das formas mais adequadas para amenizar esse problema seria a adoção de arraçoamento racional assim como rações contendo fitase e outras enzimas como carboidrases e proteases, que possam aumentar a disponibilidade de minerais e outros nutrientes aos animais (BUREAU; HUA, 2010). Lemos e Tacon (2017) compilaram em uma revisão diferentes trabalhos que comprovam os benefícios da adição da enzima fitase na nutrição de peixes, promovendo melhorias na utilização de nutrientes e energia, e podendo reduzir o teor de 6 nutrientes nos efluentes do sistema produtivo. De fato, essa enzima pode reduzir os níveis de nutrientes excretados pelos peixes na água. Morales et al. (2016) comprovaram que a suplementação de 4000 unidades de fitase (FTU) kg-1 para Oncorhynchus mykiss reduziu em aproximadamente 50% e 13% a emissão de fósforo e nitrogênio respectivamente (Figura 1). Outros trabalhos demonstraram que a inclusão de 1500 FTU kg-1 em dietas para tilápia-do-Nilo, além de melhorar a utilização do fósforo fítico e outros nutrientes da dieta, determinou redução de 43% da emissão de fósforo para o ambiente aquático, minimizando os impactos gerados por este nutriente no ambiente de produção e entorno (BOCK et al., 2006; BOCK et al., 2007; GODA, 2007). Figura 1: Suplementação de fitase em dietas baseadas em ingredientes vegetais para Trutra Arco-Íris sobre a emissão sólida ou dissolvida de Nitrogênio (N) e Fósforo (P) Assim, a adição de fitase pode ser considerada uma ferramenta para aumentar a sustentabilidade ecológica da aquicultura, por ser capaz de aumentar a utilização de alguns Fonte: Adaptado de Morales et al. (2016) 7 nutrientes e reduzir a emissão de possíveis poluentes na água (CAO et al., 2007). Entretanto, existem desafios para a sua incorporação em rações próprias para a piscicultura, uma vez que o processo de extrusão, por elevar a temperatura da ração a valores de até 150°C, pode diminuir a efetividade da fitase suplementada na dieta (AUTIN, 1997). 1.2. Fitato na alimentação de peixes A rápida expansão da aquicultura elevou o custo das principais fontes proteicas de algumas rações, como a farinha de peixe. Dessa forma, ingredientes alternativos, como farelos vegetais, passaram a ser incluídos nas formulações de dietas para aumentar a economicidade da produção. A crescente utilização de fontes proteicas de origem vegetal em dietas para peixes foi impulsionada pelo aumento excessivo no preço da farinha de peixe, acarretando alguns desafios para a indústria aquícola (GATLIN et al., 2007). Apesar de serem alternativas economicamente viáveis, farelos de origem vegetal podem conter diferentes substâncias antinutricionais, que reduzem a disponibilidade, a digestibilidade e o valor nutritivo de uma dieta (JOBLING, 2016). Para viabilizar o uso destes ingredientes, estratégias têm sido desenvolvidas objetivando a redução dos impactos causados pela presença de fatores antinutricionais em dietas que contenham alimentos vegetais. Dentre tais substâncias pode-se citar o ácido fítico e seus sais, compostos encontrados em alimentos de origem vegetal, como milho, soja e trigo, comumente utilizados para produzir rações de peixes. O ácido fítico (C6H18O24P6; figura 2) ou mio-inositol 1,2,3,4,5,6 dihidrogênio hexafostato e seus sais mistos; conhecidos como fitato (Ip6) e fitina, são as principais formas de reserva de cátions, grupos fosforilados altamente energéticos e de fósforo encontrados na maioria das sementes e tecidos vegetais (KUMAR et al., 2012). 8 Figura 2. Estrutura química do Ácido fítico Apesar de ser empregada de uma maneira geral, a palavra fitato refere-se ao sal de ácido fítico com um único tipo de mineral, fitato de sódio ou de potássio por exemplo; já o termo fitina se refere ao sal misto de ácido fítico com magnésio, potássio e cálcio (DERSJANT-LI et al., 2015; SELLE; RAVINDRAN, 2007). Nas plantas o ácido fítico ocorre primariamente na forma de sal com cátions mono e bivalentes, como potássio-magnésio no arroz e cálcio- magnésio-potássio na soja, por exemplo (MORALES et al., 2016; ZHAO et al., 2014). Como diferentes formas do ácido fítico e seus sais podem ser identificadas em vegetais simultaneamente, muitos pesquisadores não fazem distinção entre eles (REDDY; SATHE, 2001); assim, o termo fitato será utilizado como referência para estes compostos. A formação do fitato ocorre gradativamente durante o desenvolvimento de sementes de cerais e leguminosas, acumulando-se principalmente como IP6 (90 – 95%) e em pequenas parcelas de outros ésteres como IP5 e IP4 e IP3 (KUMAR et al., 2010; PONTOPPIDAN; PETTERSSON; SANDBERG, 2007). A síntese deste composto (IP6) acontece por meio da fosforilação sequencial do mio-inositol, de monofosfato (IP1) para difosfato (IP2), até o seu último passo, chegando a hexafosfato (IP6) (LOEWUS, 2001). Fonte: KUMAR et al., 2010 9 A quantidade de fitato encontrado em produtos de origem vegetal pode variar significativamente, sendo influenciada por diferentes variáveis externas ou características intrínsecas do vegetal. Fatores genéticos, condições climáticas e suas variações, tipo de solo, grau de maturação da semente ou vegetal e uso de suplementos, como o P2O5, podem modular a quantidade e o tipo de fitato presente no vegetal (OATWAY; VASANTHAN; HELM, 2001; REDDY et al., 1989). Tal variação pode ser observada na tabela 1, em que o teor de fósforo total (P total) e fósforo fítico (P fítico) foram dispostos com base em matéria seca de diferentes ingredientes vegetais comumente utilizados na formulação de dietas para animais. Tabela 1. Concentração de fósforo total e fítico em ingredientes vegetais Fonte: Adaptado por Pontes (2019) 10 A digestibilidade do fósforo proveniente de ingredientes vegetais para peixes é limitada. De fato, a biodisponibilidade média do fósforo de origem vegetal para estes animais é de aproximadamente 30%, dependo da espécie e do ingrediente vegetal incluído na dieta (BORBA; SÁ; ABREU, 2016). Na tabela 2 pode-se observar a porcentagem, em matéria seca, de fósforo total (%Pt) e fósforo disponível (%Pdis) em alguns ingredientes proteicos e energéticos de origem vegetal para juvenis de tilápia-do-Nilo. Estes ingredientes têm sido utilizados na formulação de dietas de algumas espécies de peixe, como a supracitada. Tabela 2. Disponibilidade de fósforo em ingredientes vegetais para tilápia-do-Nilo Fonte: Adaptado de Gonçalves et al. (2007) Como observado nas tabelas anteriores, em alguns vegetais, como a soja e outras leguminosas, cerca de 50 a 80% do fósforo total não é disponível para não ruminantes por estar na forma de fitato (RAVINDRAN, 2000). O fósforo fítico é indisponível ou parcialmente Ingrediente %Pt %Pdis Energéticos Milho 0,10 11,44 Milho extrudado 0,10 13,15 Farelo de trigo 0,74 53,11 Sorgo baixo tanino 0,17 24,09 Farelo de arroz 1,78 17,29 Proteicos Farelo de soja 0,40 22,31 Farelo de soja extrudado 0,58 26,27 Glúten de milho 0,40 22,17 Farelo de algodão 0,72 52,88 Farelo de girassol 0,59 26,42 11 utilizado pela maioria dos animais monogástricos, como os peixes, devido à ausência ou baixa produção de fitase endógena, enzima necessária para hidrolisar o fitato e tornar o fósforo disponível para ser absorvido no sistema gastrintestinal (KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019). Este fator contribui para o aumento dos níveis de fósforo e outros nutrientes lançados ao ambiente aquático, principalmente em dietas com alta inclusão de ingredientes de origem vegetal. Isto ocorre pois microrganismos presentes no ambiente aquático degradam o fitato, tornando o fósforo fítico disponível, contribuindo para o aumento da poluição, proliferação de algas em rios, lagos e geralmente resultando em eutrofização (DEBNATH et al., 2005). O que caracteriza o fitato como um fator antinutricional é a sua capacidade quelante, que pode ser medida pelo número de cargas iônicas de seus grupos fosfatos, que torna-o capaz de se complexar e indisponibilizar outros nutrientes (ROMANO; KUMAR, 2018). O fitato pode possuir o total de 12 cargas negativas, visto que em cada um dos seus 6 grupos fosfatos podem se localizar 2 cargas (QUIRRENBACH et al., 2009). Portanto, o grau de fosforilação do IP6 é diretamente proporcional ao número de cargas e a sua eficiência como agente quelante. Aliado ao grau de fosforilação, o pH do meio também influencia na quantidade de cargas negativas da molécula de IP6. De fato, o IP6 pode se manter com todas as cargas negativas em diferentes faixas de pH observadas no trato gastrintestinal animal (MITTAL et al., 2013) ou ainda ser protonado total ou parcialmente dependendo do pH do meio. O fitato carregado negativamente tem afinidade por minerais de valência 2 e 3, como o cálcio, zinco, manganês, ferro e cobre, e ao ligar-se a eles forma complexos fíticos que dificultam ou até mesmo inviabilizam a sua absorção (CAO et al., 2007), podendo influenciar negativamente o desempenho de peixes. A maioria dos complexos fitato-minerais, como o cálcio, ocorrem em regiões de pH intermediário a alcalino nas quais o fitato apresenta o maior número de cargas negativas, consequentemente, mais sítios disponíveis para se ligar a estes elementos (SIENER; HEYNCK; HESSE, 2001; WINDISCH, 2002). Adicionalmente, a 12 interação entre fitato e minerais também pode ser influenciada pelo conteúdo destes elementos na dieta. Por exemplo, dietas com quantidades elevadas de cálcio podem favorecer a formação do complexo cálcio-fitato, que possui alta afinidade ao zinco e, portanto, pode formar um coprecipitado com este mineral, reduzindo a sua disponibilidade de maneira indireta (KUMAR et al., 2010). Apesar de ter uma influência menor que os teores de cálcio, a quantidade de Mg2+ também pode aumentar a precipitação de zinco por um mecanismo semelhante (WISE, 1983). Além de indisponibilizar minerais, a molécula de fitato pode se ligar a cadeias laterais de algumas proteínas formando complexos insolúveis, dependendo do pH do meio. A ligação entre fitato e proteínas é dependente principalmente do pH do meio e pode acontecer de formas diferentes (JONGE; TESTERINK; JONGBLOED, 1997; KIES et al., 2006). As duas principais formas de interação entre o IP6 e proteínas dietéticas ocorre com a formação de complexos binários (proteína-fitato) ou ternários (proteína-mineral-fitato) (KIES et al., 2006), como observado na figura 3. O complexo binário é formado em regiões de pH ácido, como o estômago da tilápia-do-Nilo (pH 1-2). Nestes locais o fitato é parcialmente protonado, permanecendo com a metade de seus grupos fosfatados negativamente carregados, o que favorece a sua ligação a grupos laterais positivamente carregados, como guanidina, imidazol e amino, dos aminoácidos arginina, histidina e lisina, respectivamente (KUMAR et al., 2012). Em locais com pH intermediário (pH 5,0) a alcalino, como o intestino da tilápia-do-Nilo (pH 8,5 –8,8), o fitato e algumas proteínas com ponto isoelétrico menor que os valores de pH intestinais estão negativamente carregados; assim, a formação do complexo ternário é favorecido (RICHE et al., 2001). A formação deste complexo ocorre por meio de uma ponte feita entre o fitato e a proteína por um cátion divalente, geralmente Ca2+ que está presente em grandes concentrações na digesta de peixes (MORALES et al., 2016). Os dois complexos, binários ou ternários, tendem a formar aglomerados moleculares, se tornando resistentes à ação de proteases digestivas de peixes (RICHE; GARLING, 2004). Adicionalmente, o fitato pode interferir na digestibilidade 13 de proteínas contidas na dieta mesmo sem se complexar a elas. Isso acontece porque o IP6 é capaz de reduzir a atividade de algumas proteases endógenas, como a pepsina e a tripsina (LIENER, 1994). Figura 3. Fitato complexado a nutrientes, complexo binário (*), complexo ternário (**) Além de reduzir a disponibilidade de minerais e proteínas, o fitato diminui a digestibilidade de carboidratos e outras fontes de energia, como os lipídeos. A redução da digestibilidade de carboidratos pode acontecer de maneiras distintas: complexação direta fitato-carboidrato, indireta por meio de proteínas de acoplamento (fitato-proteína-carboidrato) ou por inativação de carboidrases como a alfa-amilase e pela complexação com o Ca2+ cofator da referida enzima (KUMAR et al., 2010; RAVINDRAN, 2000). Ao se complexar com o cálcio, a molécula de Fonte: Adaptado de Romano; Kumar (2018). 14 fitato torna-se capaz de interagir com lipídeos, reduzindo a sua utilização. Isso ocorre pois o complexo Ca/Mg-fitato pode interagir com lipídeos dando origem a “lipofitinas”, que podem formar sabões metálicos no lúmen intestinal (LEESON, 1993). A formação de sabões metálicos reduz a biodisponibilidade de lipídeos como fontes energéticas para aves e peixes (KUMAR et al., 2012; LEESON, 1993). Dessa forma, fica evidente a ação do fitato como um fator antinutricional para não ruminantes, impactando negativamente na disponibilidade de proteínas, minerais e energia para peixes e outros animais (CAO et al., 2008; LEMOS; TACON, 2017). 1.3. Alternativas para inativar o fitato Existem diferentes medidas para reduzir os efeitos negativos do fitato na produção animal. Técnicas de desfitinização, melhoramento genético para produção de cultivares com baixo nível de fitato e uso de grãos em diferentes estágios de maturação podem amenizar os efeitos prejudiciais e a quantidade de fitato presente em dietas de peixes (HAJRA et al., 2013; KUMAR et al., 2010; OLADOSU et al., 2016). A desfitinização pode ser definida como um conjunto de técnicas de processamento que visam reduzir o conteúdo de fitato de amostras vegetais (KUMAR, et al., 2012). Dentre tais técnicas, a trituração e a cocção de ingredientes vegetais foram testadas e apesar de reduzir o conteúdo de fitato, reduziram também, a quantidade de minerais e fibras (BOHN; MEYER; RASMUSSEN, 2008). A redução do conteúdo de IP6 pode ser atribuída às condições do cozimento que favorecem a atividade da fitase natural contida em alguns ingredientes vegetais (GREINER; KONIETZNY, 1999), e não pela exposição a temperaturas elevadas isoladamente. Outros autores não detectaram redução significativa nos níveis de fitato em ingredientes de origem vegetal termicamente tratados, o que sustenta a tese que o fitato é uma molécula termicamente estável (MITTAL et al., 2013; PONTOPPIDAN; PETTERSSON; SANDBERG, 2007). 15 Além da cocção e tratamento térmico, a malteação de grãos também foi avaliada como possível alternativa para a redução dos níveis de fitato. A malteação consiste na indução da germinação de uma semente e na sua interrupção, em determinado ponto, por meio de secagem ou torra. Entretanto, essa forma de processamento não foi capaz de reduzir os níveis de fitato em alguns cereais, sendo necessária a moagem e a reincubação dos grãos em condições favoráveis à atividade da fitase natural, para assim promover a inativação do fitato (LARSSON; SANDBERG, 1992). Outra alternativa para reduzir a quantidade de IP6 é a germinação de grãos de cereais e legumes, como a soja, que pode reduzir o seu conteúdo de fitato em até 50% (MARERO et al., 1991). Porém, assim como a malteação, a germinação visando a redução de IP6 em grãos também não é uma alternativa eficiente e economicamente viável para a indústria de produção de alimentos, devido ao longo período de tratamento (MITTAL et al., 2013) A desfitinização de ingredientes vegetais também pode ser feita com o uso de fitases exógenas (KUMAR et al., 2011). Essa técnica consiste no tratamento por incubação dos ingredientes moídos em solução aquosa contendo a enzima fitase à determinada temperatura e por um período de tempo estipulado. Após a incubação, os ingredientes tratados são secos em estufa, e em seguida incorporados aos demais ingredientes para a confecção da dieta. Os protocolos para este tipo de tratamento, níveis de enzima, tempo e temperatura de incubação, assim como seus efeitos podem variar (CAO et al., 2008; CARTER; SAJJADI, 2011; NWANNA et al., 2008; ROY et al., 2014; WANG et al., 2009; YANG et al., 2011). Apesar desta variação, os benefícios deste método geralmente estão relacionados ao aumento do ganho de peso, eficiência alimentar e digestibilidade de nutrientes como proteína, minerais e lipídeos (LEMOS; TACON, 2017). O mecanismo de hidrólise do fitato pela enzima fitase será descrito posteriormente. Adicionalmente às técnicas de desfitinização e à germinação, o desenvolvimento de cultivares que produzam grãos e sementes com níveis reduzidos de fitato também pode ser 16 considerado uma alternativa para reduzir os impactos negativos deste fator antinutricional. De fato, estudos com mutações genéticas de vegetais, como a soja, têm sido realizados para identificar cultivares que produzam grãos com menores níveis de fitato e resultados promissores foram obtidos (LANDAU-ELLIS; PANTALONE, 2009; SUNDARAMOORTHY et al., 2016; YUAN et al., 2007). Linhas de cultivares de trigo e cevada, com baixo teor de fitato, foram testadas para carpas e benefícios relacionas à digestibilidade de fósforo e deposição de gordura na carcaça foram observados (MALÝ et al., 2017). Apesar destes aspectos positivos, algumas mutações genéticas podem afetar negativamente a viabilidade e a quantidade de sementes produzidas por certas cultivares geneticamente modificadas (YUAN et al., 2007). Mesmo com os efeitos positivos das diferentes técnicas de desfitinização, melhoramento genético e outras alternativas, a suplementação de fitase em dietas de peixe tem sido considerada a forma mais viável para reduzir os efeitos negativos do fitato (CASTILLO; GATLIN, 2015; KUMAR et al., 2012; NRC, 2011). 1.4. Fitase A fitase é uma fosfatase que catalisa a hidrólise do ácido fítico e de seus sais mistos, resultando em inositol e fósforo inorgânico livre (MULLANEY, EDWARD; DALY; ULLAH, 2000). A hidrólise do fitato, promovida pela fitase, ocorre por meio de reações sequenciais de desfosforilação, a partir do hexafosfato até monofostato de mio-inositol (IP6 => IP5 => IP4 => IP3=> IP2=>IP1), gerando ésteres de fosfato de mio-inositol menores e mio-inositol livre (GREINER; KONIETZNY, 2010). Desta forma o fósforo presente no ácido fítico e seus sais tornam-se disponíveis para o animal, o que possibilita a redução nos níveis de inclusão deste mineral às dietas (CAO et al., 2007) ou pode dispensar a suplementação de fósforo na ração para as tilápias (PHROMKUNTHONG; GABAUDAN, 2006). A hidrólise desta molécula pode ser parcial e disponibilizar também outros nutrientes que estejam ligados ao fitato, como 17 minerais, aminoácidos, proteínas e outros (DERSJANT-LI et al., 2015). Um diagrama hipotético para o mecanismo geral de ação da fitase em dietas de peixes pode ser observado na figura 4. Figura 4. Mecanismo de ação da fitase em peixes. Fonte: Adaptado de Kumar; Sinha; Kajbaf (2019) 18 A enzima fitase pode ser encontrada em grãos, diferentes microrganismos (fungos ou bactérias) e no trato gastrintestinal de alguns animais, produzida pela mucosa intestinal ou microbiota associada (KUMAR et al., 2010). A primeira fitase comercial foi introduzida no mercado em 1991, sendo de origem fúngica (Aspergillus niger). Oito anos após este evento, a primeira fitase bacteriana (Escherichia coli) foi documentada e considerada mais eficiente que a fitase fúngica (RODRIGUEZ et al., 1999; RODRIGUEZ; HAN; LEI, 1999). Isso está relacionado à elevada resistência a proteases endógenas e à alta afinidade ao fitato na forma de IP6 e IP5 de fitases bacterianas, em comparação a fitases de origem fúngica (DERSJANT-LI et al., 2015; RODRIGUEZ et al., 1999). Estas características impulsionaram estudos com fitases de origem fúngica e bacteriana, sendo amplamente utilizadas como aditivos na alimentação animal atualmente (MITTAL et al., 2013). Além das diferentes fontes, existem distintas formas de classificação para a fitase relacionadas ao local de início da desfosforilação e às propriedades catalíticas e estruturais da enzima. Com base no local de início das reações de desfosforilação, o Comitê de Nomenclatura de Enzimas da União Internacional de Bioquímica classificou as fitases em dois grupos: 3-fitase (EC 3.1.3.8) e 6-fitase (EC 3.1.3.26) (SELLE; RAVINDRAN, 2007). Segundo estes autores, o primeiro grupo dá início às reações no carbono 1 ou 3 do anel de mio-inositol, enquanto o segundo inicia as reações em regiões próximas ao carbono 5. A União Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC) e a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (IUBMB) reconhecem uma terceira classificação para esta enzima, 5-fitase (EC 3.1.3.72), que inicia a desfosforilação do fitato no carbono de posição 5, existindo apenas uma fitase que pertence a este grupo (KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019). A maior parte das fitases microbianas são do tipo 3, com exceção para as tipo 6 produzidas pela bactéria E. coli, enquanto fitases de origem vegetal são do tipo 6, exceto a da soja (tipo 3) (KUMAR; SINHA, 2018). 19 As fitases podem ser classificadas como ácidas ou básicas de acordo com o seu pH ideal. As chamadas fitases ácidas tem pH ótimo entre 2.5 e 6.0 e as alcalinas 6.0 e 8.0 (VIJAYARAGHAVAN; PRIMIYA; PRAKASH VINCENT, 2013; YIN; ZHENG; KANG, 2007). Em relação às propriedades estruturais e catalíticas das fitases, essas enzimas ainda podem ser enquadradas em diferentes classes: fitase β-hélice (FBA), fosfatases ácidas de histidina (HFA), fosfatase ácido “purple” (FAP) e fosfatase proteína tirosina (KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019; MULLANEY; ULLAH, 2007). Essa classificação é feita de acordo com especificidade de substrato, conformação estrutural, faixas de pH, mecanismos de ação e outras propriedades bioquímicas de cada enzima (MULLANEY; ULLAH, 2007). Dentre as diferentes classes, fitases do grupo ácidas, HFA, de origem bacteriana ou fúngica (3 ou 6) são as mais estudadas e utilizadas na alimentação animal (KUMAR et al., 2012). Algumas das principais fitases comerciais podem ser observadas na tabela 3. Fitases ácidas possuem ampla especificidade de substrato, sendo capazes de disponibilizar entre 5 e 6 moléculas de fósforo fítico (GREINER; CARLSSON; ALMINGER, 2000; HAYAKAWA et al., 1990). Entretanto, fitases básicas possuem especificidade de substrato restrita, sendo incapazes de hidrolisar ésteres menores, como IP3, IP2 e IP1; portanto, disponibilizam menos fósforo fítico que as fitases HFA (GREINER et al., 2002; OH et al., 2004). Tabela 3. Características de algumas fitases comerciais Tipo Origem pH ótimo Temperatura ótima (∘C) Nome comercial 3 A. niger 2.5 – 5.5 65 Natuphos® 3 A. niger 6.0 – Allzyme® SSF 3 A. niger 2.5 – Finase® P/L 6 Escherichia coli 4.5 55 Phyzyme® XP 6 Escherichia coli 4.5 – Quantum® 6 Escherichia coli – – Quantum Blue® 6 Escherichia coli 3.4 – 5.0 58 OptiPhos® 6 Peniophora lycii 4.0 – 4.5 50–55 Ronozyme® 6 Citrobacter braakii – – Ronozyme Hiphos® 6 Buttiauxella spp. 3.5 – 4.5 60 Axtra® PHY Fonte: Adaptado de Dersjant-li et al. (2015) 20 A atividade da fitase pode ser expressa em diferentes unidades, (FU, U, FYT, PU, FTU), (KUMAR; SINHA, 2018), sendo FTU a forma mais comum. Conceitualmente, 1 unidade de fitase (FTU) é a quantidade de enzima que disponibiliza 1μmol de fosfato inorgânico, por minuto de reação, a partir de 0.0051 molL-1 do substrato fitato de sódio, a 37°C e pH 5.5 (ENGELEN et al., 1994). Como toda enzima, a fitase, pode ter a sua atividade afetada por diferentes fatores, relacionados à enzima ou ao animal. Entre os fatores inerentes à enzima pode-se citar: faixas ótimas de pH e temperatura, resistência à degradação de enzimas endógenas e desnaturação por calor (ROMANO; KUMAR, 2018). A maioria das fitases microbianas tem uma faixa de temperatura ótima que varia entre 40°C e 60°C, valores acima dos parâmetros fisiológicos normais da maioria dos animais (IGBASAN et al., 2000). A eficiência dessas enzimas pode ser afetada negativamente em alguns animais, como peixes, que têm sua temperatura corporal próxima a do seu ambiente, variando de 20° até 30°C ou de 5° a 20°C para peixes tropicais e de agua fria respectivamente, sendo necessária a suplementação de níveis mais elevados para peixes em comparação a outros animais (MORALES; MARQUEZ; et al., 2016). Como mencionado anteriormente, grande parte das fitases utilizadas na alimentação animal tem pH ótimo entre 3.5 e 8.0, compatível com valores observados ao longo do trato gastrintestinal de alguns animais. Entretanto, a solubilidade do fitato é dependente do pH do meio, sendo maior em regiões ácidas, e algumas espécies de peixes agástricas não conseguem acidificar a dieta para favorecer a atividade de fitases ácidas; portanto, o uso de fitases alcalinas é recomendado (LIU; SU; LUO, 2012). Mesmo com o uso de fitases alcalinas a sua eficácia pode ser comprometida devido à baixa solubilidade do fitato em regiões que o pH não seja suficientemente ácido, como o intestino de peixes agástricos (KUMAR; SINHA; KAJBAF, 2019). A resistência à digestão enzimática também é um fator que influencia consideravelmente a atividade da fitase. A atividade de enzimas endógenas como a tripsina e pepsina já foi 21 evidenciada em peixes, suínos e aves e estas podem degradar a fitase, reduzindo a sua atividade (DERSJANT-LI et al., 2015). Estudos mais recentes, in vitro e in vivo, compararam a resistência de fitases bacterianas e fúngicas, de diferentes espécies, e as enzimas provenientes de bactérias E. coli foram mais resistentes à degradação de enzimas endógenas de peixes, aves e suínos (AUGSPURGER et al., 2003; ELKHALIL et al., 2007; MORALES; MOYANO; MARQUEZ, 2011; ONYANGO; BEDFORD; ADEOLA, 2005). Além da digestão proteica, a exposição da fitase a temperaturas comuns ao processamento de ração para animais pode afetar a sua atividade. Temperaturas superiores a 70°C podem reduzir consideravelmente a atividade da maioria das fitases comercializadas (MRUDULA et al., 2019). Sabe-se que o processamento de dietas extrudadas pode atingir até 150°C e a peletização pode chegar até 95°C (AUTIN, 1997; MRUDULA et al., 2019; RASMUSSEN, 2010), comprometendo a atividade da fitase adicionada junto à mistura de ingredientes. Adicionalmente, o conteúdo da dieta e algumas características fisiológicas dos animais também podem afetar a atividade da fitase. Dentre os componentes da dieta, os níveis de cálcio e outros minerais podem alterar a eficácia da fitase. Isso acontece primariamente pela alta concentração de cálcio nas dietas, em relação aos outros minerais, assim como pela afinidade do fitato ao cálcio. Em dietas para não ruminantes os níveis de cálcio são mais elevados que outros minerais, por isso o fitato tende a se complexar com este mineral, formando precipitados em regiões de pH próximas à alcalinidade (CAO et al., 2007; GRYNSPAN; CHERYAN, 1983). O cálcio pode ainda aumentar o pH da digesta, atuar como um inibidor de fitase por competição de sítios de ligação e altas relações Ca:P podem influenciar negativamente na atividade desta enzima, sendo recomendadas relações entre 1:1 e 1:4 a fim de otimizar a atividade de fitase em peixes (CAO et al., 2007). A quantidade de outros minerais e os diferentes ingredientes vegetais contidos na ração também podem afetar a atividade da fitase. Esse tipo de influência é relacionada à interações mineral-fitato assim como pela quantidade e 22 tipo de fitato presente nos ingredientes que compõem a dieta do animal (DERSJANT-LI et al., 2015; GONÇALVES et al., 2007). 1.5. Fitase na nutrição de peixes A suplementação de enzimas para peixes, como a fitase, pode aumentar a disponibilidade de diferentes nutrientes, contribuindo para a sustentabilidade da aquicultura. De fato, estudos comprovaram que a suplementação desta enzima melhora principalmente a disponibilidade de minerais, como o fósforo, em dietas para peixes. Cao et al. (2008) verificaram, com a tilápia- do-Nilo, que a inclusão de 1000 FTU kg-1 aumentou a disponibilidade de fósforo e o coeficiente de digestibilidade aparente (CDA) da dieta. Estas constatações corroboram com a pesquisa de Bock et al. (2006), em que níveis de 1500 e 2000 FTU kg-1 de ração melhoraram o aproveitamento do fósforo das dietas possibilitando a redução da suplementação de fósforo proveniente de fontes não renováveis sem prejudicar o desempenho dos animais, aumentando, assim, a sustentabilidade da atividade aquícola. Outros trabalhos verificaram a correlação dose-resposta positiva para níveis de suplementação de fitase e biodisponibilidade de nutrientes e energia para tilápia-do-Nilo em diferentes fases. Com níveis de inclusão de 1000 FTU kg-1 em dietas formuladas exclusivamente com ingredientes de origem vegetal a enzima foi capaz de promover aumentos expressivos para ganho de peso (9%), biodisponibilidade de proteína (3%), extrato etéreo (26%), energia bruta (4%) e fósforo (27%) em relação às dietas sem suplementação de fitase (GODA, 2007; GONÇALVES et al., 2007). A inclusão de níveis mais elevados de fitase, entre 2000 e 3000 FTU kg-1, para a mesma espécie, determinaram um aumento de 8%, 3%, 41% e 16% no coeficiente de digestibilidade para energia e proteína bruta, fósforo e matéria mineral, respectivamente (NWANNA; BELLO, 2014; PONTES et al., 2019). Adicionalmente, estudos demonstram que a disponibilidade de micro minerais também é positivamente afetada pela 23 inclusão de diferentes níveis de fitase em dietas baseadas em alimentos de origem vegetal para espécies de água doce (GONÇALVES et al., 2005; VERLHAC-TRICHET et al., 2014). Apesar da identificação da atividade desta enzima em algumas espécies de peixes, a quantidade de fitase presente no trato gastrintestinal da maioria dos teleósteos não é suficiente para melhorar significativamente a hidrólise do ácido fítico (ELLESTAD et al., 2003). Logo, o uso de fitase exógena em dietas para peixes possui papel importante para aumentar a sustentabilidade da atividade e reduzir seus impactos ambientais, como descargas de fósforo e nitrogênio que podem induzir à proliferação de organismos que venham a diminuir o oxigênio dissolvido na água e poluir o ambiente (DEBNATH et al., 2005; KUMAR et al., 2012). Além dos benefícios relacionados à biodisponibilidade de nutrientes, energia e redução na emissão de poluentes provenientes da aquicultura, a fitase pode, ainda, reduzir o uso de fontes não renováveis de fósforo. Uma vez que essa enzima propicia a utilização do fósforo fítico contido nos farelos vegetais, a necessidade da suplementação de fósforo inorgânico vindo em sua maioria da rocha fosfatada, pode ser reduzida nas dietas baseadas em ingredientes de origem vegetal (MULLANEY; DALY; ULLAH, 2000). Mesmo com os benefícios ambientais e nutricionais promovidos pela inclusão de fitase em dietas para peixes, a sua incorporação pré-processamento de dietas, principalmente extrudadas, permanece um desafio. Isso se deve à instabilidade térmica da enzima. A maioria das fitases comerciais já produzidas tem a sua atividade consideravelmente reduzida ao serem expostas a temperaturas superiores a 70°C (MRUDULA et al., 2019). Uma vez que o processo de extrusão pode atingir temperaturas de até 150°C, a inclusão desta enzima pré-processamento torna-se inviável. Portanto, o uso comercial de fitase em dietas comerciais para peixes é limitado e significativamente menor quando comparado à adição em dietas para suínos e aves (MORALES; MARQUEZ; et al., 2016). 24 Devido às particularidades relacionadas à estabilidade térmica da fitase, diferentes estratégias têm sido desenvolvidas com o intuito de reduzir impactos em sua atividade durante o processamento de dietas extrudadas para peixes. Uma dessas estratégias é a desfitinização prévia dos ingredientes de origem vegetal com o uso de fitase. Nwanna et al. (2008) testaram diferentes métodos de suplementação de fitase em dietas peletizadas para carpa comum e concluíram que a desfitinização pré-processamento foi o método mais eficiente quando comparado com os outros métodos. Outros trabalhos foram conduzidos e comprovaram a eficácia da desfitinização de ingredientes vegetais, promovendo melhoras no conteúdo nutricional e na utilização de minerais (Zn, Ca, P, Mn, Fe, Cu), proteína e lipídeos para peixes; porém a variação no tempo de incubação e outras condições químicas do processo faz com que mais estudos sejam necessários para a utilização segura deste método (LEMOS; TACON, 2017). A adição de fitase em sua forma líquida, pós processamento da dieta, também foi uma alternativa considerada e testada em diferentes trabalhos. Este método de inclusão promove benefícios nutricionais para peixes e foi considerado o meio mais utilizado para evitar perda de atividade enzimática por exposição à temperaturas elevadas durante o processamento de dietas (VERLHAC; VIELMA; GABAUDAN, 2007), porém uma série de fatores podem inviabilizar a sua utilização em escala industrial. Apesar de evitar reduções na atividade da enzima promovidas pela exposição a altas temperaturas, o tempo despendido, maquinário específico para cada tamanho de pélete, a desuniformidade na distribuição da enzima e reduzido tempo de prateleira são fatores que podem reduzir o uso desta estratégia (MRUDULA et al., 2019). Outra técnica amplamente utilizada para a incorporação de fitase em dietas para animais é conhecida por revestimento. Essa tecnologia confere proteção térmica à enzima durante o processo de peletização e é a estratégia mais utilizada para a suplementação de fitase em dietas animais (GILBERT; COONEY, 2010; MRUDULA et al., 2019). Entretanto, alguns 25 componentes utilizados para promover o aumento da estabilidade térmica da fitase podem também reduzir a sua ação no trato gastrintestinal animal. Essa redução foi observada nos trabalhos de Vandenberg et al. (2011) que testaram a suplementação de fitase em microcápsulas de alginato-quitosano para a truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), e observaram menor disponibilização de fósforo quando compararam este método à inclusão de fitase nas dietas em sua forma livre. Outras formas de estabilização da fitase como revestimento com alofano sintético e óxido de ferro, nano partículas de ouro, nanofibras de casca de arroz e até mesmo o encapsulamento em leveduras foram desenvolvidas e aumentaram consideravelmente a resistência térmica e proteolítica da enzima, porém sua eficácia em organismos animais não foi comprovada (ISAKOVA et al., 2018; MENEZES-BLACKBURN et al., 2011; RATHNAYAKE et al., 2018; SHANKAR et al., 2015). A busca por microrganismos desconhecidos e técnicas de recombinação de proteínas para a produção de fitases com termorresistência elevada também têm sido tema de pesquisa. Estudos têm sido realizados com micro-organismos que vivem em diferentes temperaturas, como termófilos (22 a 75°C) e mesofilos (20 a 46°C), por meio de técnicas de recombinação genéticas avançadas ou de screening convencionais para identificar novas fontes de fitases naturalmente termoestáveis (USHASREE et al., 2017). Porém, a produção de enzimas termorresistentes à partir destes micro-organismos e das técnicas supracitadas ocorrem apenas para fins acadêmicos e novos trabalhos são necessários para viabilizar sua implementação em nível industrial (DREJER et al., 2018). 1.6. A digestibilidade dos alimentos O Coeficiente de Digestibilidade Aparente (CDA) informa o teor de nutrientes que o peixe digere e absorve, em relação à quantidade contida em determinado alimento ingerido (OGUNJI et al., 2009). Pesquisas com a tilápia-do-Nilo sobre esta temática são realizadas desde meados 26 dos anos 80, podendo-se destacar Hanley (1987) que determinou o CDA para a proteína e a energia bruta de diferentes alimentos para essa espécie e Pezzato et al. (2002) quando determinaram com a tilápia-do-Nilo os CDA da matéria seca e do extrato etéreo de 17 alimentos. Segundo o NRC (2011), a obtenção de uma ração balanceada, que atenda às reais exigências nutricionais para determinada espécie de peixe, somente é possível a partir do conhecimento do CDA dos alimentos a serem utilizados em sua formulação. Diferentes metodologias podem ser utilizadas para se determinar o CDA de alimentos e nutrientes das dietas dos peixes. Dentre elas pode-se observar o método de coleta por sucção anal (WINDEL; FOLZTZ; SAROKON, 1978), extrusão por pressão manual abdominal (HAJEN et. al., 1993), coleta em aquários com recipiente para concentração de fezes por decantação (CHO; SLINGER, 1979), dissecação intestinal (AUSTRENG, 1978) e contenção metabólica (SMITH et. al., 1971). Entretanto, o método indireto de coleta em aquários é mais confiável que outros métodos diretos, como a dissecação intestinal (PEZZATO et al., 2002). Os métodos diretos consistem na mensuração da quantidade total de alimento ingerido e de fezes excretadas pelo animal. Já na metodologia indireta, um marcador inerte é utilizado no sentido de conhecer quanto do nutriente ingerido foi realmente digerido. Este segundo método é o mais indicado, uma vez que o marcador permite que a determinação de um CDA seja realizado apenas com uma fração das fezes colhidas no ambiente aquático e não exige a quantificaçãodo alimento fornecido ao animal (CHOUBERT, 1999; MORALES et. al., 1999). Cada metodologia possui as suas particularidades e a escolha de um método de coleta de fezes para estudos de digestibilidade deve ser guiada por conhecimentos nutricionais e fisiológicos. O conteúdo da dieta, a frequência alimentar, o tempo e intervalo entre cada coleta, o formato das fezes, entre outros fatores podem influenciar diretamente na determinação de coeficientes de digestibilidade (ABIMORAD; CARNEIRO, 2004; BELAL, 2005; DIEMER et. al., 2011; PEZZATO et. al., 2002). 27 Para obtenção dos valores digestíveis de determinado nutriente recomenda-se cuidado especial objetivando minimizar a lixiviação dos nutrientes da ração e das fezes, tanto durante a alimentação, quanto no momento da coleta das excretas. Nestes estudos recomenda-se o emprego do sistema proposto por Cho (1987) e Cho, Cowey e Watanabe (1985) conhecido como “Sistema Guelph”. No Brasil utiliza-se o sistema apresentado por Cho (1987) com algumas adaptações. Este sistema é composto por um aquário com base inclinada onde as fezes se depositam por decantação para posterior coleta. O sistema adaptado por Pezzato et al. (2002) é composto por aquários de fibra de vidro com fundo cônico aliado a outro sistema, chamado de “aquários de alimentação” onde os animais ficam alojados em gaiolas. Neste sistema os peixes são alimentados durante o dia e transferidos à noite para o aquário de coleta evitando que a ração seja somada às fezes. 1.7. Polímeros de óleos vegetais e aplicações O desenvolvimento de polímeros de óleos vegetais se deu pela necessidade de se criar materiais termoplásticos utilizados rotineiramente, mas que fossem originados de fontes renováveis para substituição dos materiais de origem fóssil (ALARCON et al., 2017). Desta forma, pesquisas relacionadas às técnicas de polimerização de óleos vegetais, como o óleo de soja, e sobre as características físicas dos polímeros têm se tornado cada vez mais frequentes. Os óleos naturais e a sua composição têm sido tema de pesquisas para a criação de polímeros, tintas, vernizes e resinas de revestimento à base de água, além de polímeros altamente ramificados, que não agridam o meio ambiente e que reduzam, ou não contenham, o uso de solventes orgânicos voláteis em sua produção (LLIGADAS et al., 2013; SHARMA; KUNDU, 2006). Adicionalmente às aplicações industriais, polímeros de origem vegetal têm sido amplamente utilizados na biomedicina. Selantes e colas cirúrgicas, adesivos farmacológicos e carreadores de fármacos, dentre outros produtos, são produzidos a partir de polímeros de óleos 28 vegetais (LLIGADAS et al., 2013). Além de agirem como carreadores, polímeros feitos com base em óleo de rícino (ácido sebácico e ricinoleico) também são utilizados para a administração lenta de fármacos a base de peptídeos e sulfato de gentamicina, contendo substâncias anestésicas locais (KRASKO et al., 2007; KRASKO; KUMAR; DOMB, 2006; SHIKANOV; DOMB; WEINIGER, 2007). Polímeros obtidos a partir de óleos vegetais podem ser metabolizados por animais, uma vez que o óleo vegetal é a matéria prima principal. Segundo Shit e Shah (2014), polímeros classificados como comestíveis podem ser facilmente digeridos por humanos e outras espécies animais, sem prejuízos à saúde. Pesquisadores do Departamento de Química da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Bauru-SP, desenvolveram um polímero de óleo de soja que se enquadra nessa classificação. Além de comestível, o referido polímero foi produzido seguindo os princípios da “Química Verde’’(DE ALMEIDA; ALARCON; BANNACH, 2016). A química verde surgiu à partir de especulações iniciadas em meados de 1960 sobre possíveis soluções para a redução e tratamento adequado de resíduos químicos industriais, para promover o desenvolvimento sustentável deste setor (LANCASTER, 2016; LENARDÃO; DABDOUB; BATISTA, 2003). A partir disso e de conferências internacionais, surgiu o conceito de química verde, que é o desenvolvimento e a aplicação de tecnologias para reduzir ou eliminar o uso e a produção de substâncias que agridam o ambiente e ameacem saúde humana (LANCASTER, M., 2002). Essa prática ganhou reconhecimento após a publicação de seus doze princípios básicos (tabela 4), que devem necessariamente ser seguidos, para a sua implementação em um processo produtivo ou outras atividades (ANASTAS; WARNER, 1998). Este conceito é relacionado à tecnologia limpa, reutilização de resíduos e tem sido implementado em indústrias e instituições de ensino e pesquisa, afim de promover o avanço sustentável de diferentes atividades (SHELDON, 2016). 29 Além de se tratar de produto metabolizável por animais e sustentável do ponto de vista ambiental, o polímero em questão possui outras características que podem favorecer o seu uso na alimentação animal. Por ser um material com maior porosidade que outros polímeros à base de óleo vegetal (DE ALMEIDA; ALARCON; BANNACH, 2016) e ter baixa condutibilidade de calor, pode funcionar como carreador de alguns componentes nutricionais, além de ser um potencial termoprotetor. Devido à sua porosidade, este polímero é capaz de adsorver diferentes materiais, como o verde de malaquita e corantes, entre outras substâncias testadas laboratorialmente. Recentemente, o polímero de soja foi submetido ao contato com uma solução de fitase no laboratório de análise térmica e polímeros (UNESP-Bauru), sendo capaz de adsorvê-la com um coeficiente de adsorção de 0,66% (34,8 FTU/g de polímero). Alguns polímeros à base de óleo vegetal, como o polímero utilizado neste estudo, apresentam baixa condutividade térmica. Isso pode ser observado devido à relação inversamente proporcional existente entre a resistência térmica do material e a sua capacidade de condução térmica (LEE et al., 2006). Como o polímero utilizado nesta pesquisa possui boa resistência térmica, com estabilidade física até 160°C (DE ALMEIDA; ALARCON; BANNACH, 2016), ele consequentemente apresenta baixa capacidade de condução térmica. Tais características evidenciam que este produto pode ser um veículo termoprotetor em potencial para a enzima fitase, que poderia ser submetida a altas temperaturas durante o processo de extrusão na confecção da ração. Aliado à sua resistência a temperaturas elevadas, o polímero ainda é consideravelmente resistente ao pH ácido, água e outros solventes. Sabendo- se que o pH estomacal da tilápia-do-Nilo varia de 1,4 a 1,9 (MORIARTY, 1973), o complexo “polímero-fitase” pode passar pelo estômago sem sofrer degradação. Assim, o polímero pode evitar que a fitase sofra redução em sua atividade por ação de enzimas digestivas e do pH estomacal, atingindo o intestino do animal com maior atividade. 30 Outra característica que favorece o uso do óleo polimerizado como protetor para a fitase é a faixa de pH em que o mesmo é hidrolisado. O polímero sofre hidrólise em contato com soluções alcalinas (DE ALMEIDA; ALARCON; BANNACH, 2016) liberando gradativamente a enzima durante o processo de degradação, como ocorre com outros polímeros de origem vegetal (ICKOWICZ et al., 2016). Considerando que o pH intestinal das tilápias tende a alcalinidade, variando de 5,5 a 8,5 (MORIARTY, 1973; PAYNE, 1978), parte-se do pressuposto que a liberação da enzima ocorrerá gradativamente promovida pela hidrólise lenta do complexo “polímero-enzima” ao atingir esta região. Portanto, além de termoprotetor, o material possui características que podem diminuir ou evitar a redução da atividade da enzima ao entrar em contato com os ácidos estomacais da tilápia, uma vez que a fitase possui pH padrão ótimo de ação no valor de 5,5 (AOAC, 2000). Adicionalmente, o polímero pode proteger a enzima contra a hidrólise promovida pela pepsina, protease encontrada no estômago da tilápia. Por se tratar de molécula proteica, a fitase pode ser hidrolisada por proteases endógenas do trato digestório dos animais não ruminantes (DERSJANT-LI et al., 2015). Assim, o polímero de óleo de soja tende a proteger a fitase da hidrólise proteica, podendo melhorar a eficiência enzimática da fitase na porção inicial do intestino de tilápias-do-Nilo. Tabela 4. Os doze princípios da Química verde. 1. Prevenção Evitar a produção do resíduo é melhor do que tratá-lo ou “limpá-lo” após sua geração. 2. Economia de Átomos Deve-se procurar desenhar metodologias sintéticas que possam maximizar a incorporação de todos os materiais de partida no produto final. 3. Síntese de Produtos Menos Perigosos Sempre que praticável, a síntese de um produto químico deve utilizar e gerar substâncias que possuam pouca ou nenhuma toxicidade à saúde humana e ao ambiente. 4. Desenho de Produtos Seguros Os produtos químicos devem ser desenhados de tal modo que realizem a função desejada e ao mesmo tempo não sejam tóxicos. 5. Solventes e Auxiliares mais seguros O uso de substâncias auxiliares (solventes, agentes de separação, secantes, etc.) precisa, sempre que possível, tornar-se desnecessário e, quando utilizadas, estas substâncias devem ser inócuas. 31 6. Busca pela Eficiência de Energia A utilização de energia pelos processos químicos precisa ser reconhecida pelos seus impactos ambientais e econômicos e deve ser minimizada. Se possível, os processos químicos devem ser conduzidos à temperatura e pressão ambientes. 7. Uso de Fontes Renováveis de Matéria-Prima Sempre que técnica- e economicamente viável, a utilização de matérias-primas renováveis deve ser escolhida em detrimento de fontes não renováveis. 8. Evitar a Formação de Derivados A derivatização desnecessária (uso de grupos bloqueadores, proteção/desproteção, modificação temporária por processos físicos e químicos) deve ser minimizada ou, se possível, evitada, porque estas etapas requerem reagentes adicionais e podem gerar resíduos. 9. Catálise Reagentes catalíticos (tão seletivos quanto possível) são melhores que reagentes estequiométricos. 10. Desenho para a Degradação Os produtos químicos precisam ser desenhados de tal modo que, ao final de sua função, se fragmentem em produtos de degradação inócuos e não persistam no ambiente. 11. Análise em Tempo Real para a Prevenção da Poluição Será necessário o desenvolvimento futuro de metodologias analíticas que viabilizem um monitoramento e controle dentro do processo, em tempo real, antes da formação de substâncias nocivas. 12. Química Intrinsecamente Segura para a Prevenção de Acidentes As substâncias, bem como a maneira pela qual uma substância é utilizada em um processo químico, devem ser escolhidas a fim de minimizar o potencial para acidentes químicos, incluindo vazamentos, explosões e incêndios. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABIMORAD, E.G.; CARNEIRO, D.J. 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