RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 15/08/2021. i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA -UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL Localização subcelular de proteínas de Xanthomonas citri subsp. citri utilizando proteína repórter Michelle Mendonça Pena Bióloga 2019 i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA -UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL Localização subcelular de proteínas de Xanthomonas citri subsp. citri utilizando proteína repórter Michelle Mendonça Pena Orientadora: Profa. Dra. Maria Inês Tiraboschi Ferro Coorientador: Prof. Dr. Jesus Aparecido Ferro Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Microbiologia Agropecuária 2019 ii Pena, Michelle Mendonça P397I Localização subcelular de proteínas de Xanthomonas citri subsp. citri utilizando proteína repórter / Michelle Mendonça Pena. – – Jaboticabal, 2019 86 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015 Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro Coorientador: Jesus Aparecido Ferro 1. Microscopia de Fluorescência. 2. Localização subcelular de proteínas. 3. Genetica de Bactérias. 4. Interação Planta-Patógeno. 5. Cancro cítrico. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Jaboticabal. Dados fornecidos pela autora. iii iv DADOS CURRICULARES DA AUTORA MICHELLE MENDONÇA PENA, nascida em 16 de maio de 1986 na cidade de Monte Carmelo, Minas Gerais. Filha de José Carlos de Araújo Pena e Maria Inês Luiz de Mendonça. Em 2005 iniciou o curso de Ciências Biológicas pelo Centro Universitário do Cerrado – Patrocínio (UNICERP), em Patrocínio, Minas Gerais, obtendo o título de Bióloga em 2008. Em março de 2013 ingressou no curso de mestrado pelo Programa de Pós-graduação em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – FCAV/UNESP, em Jaboticabal, São Paulo. Recebeu auxílio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), desenvolvendo pesquisas voltadas para identificação de genes candidatos a Barcode em plantas carnívoras, sob a orientação do Prof. Dr. Vitor Fernandes Oliveira de Miranda e coorientação do Prof. Dr. Alessandro de Mello Varani. Obteve o título de mestre em Agronomia (Genética e Melhoramento de Plantas) em julho de 2015. Em agosto do mesmo ano, ingressou no curso de doutorado pelo Programa Pós-graduação em Microbiologia Agropecuária, também da FCAV/UNESP, com auxílio financeiro da CAPES, sob orientação da Profa. Dra. Maria Inês Tiraboschi Ferro e coorientação do Prof. Dr. Jesus Aparecido Ferro. Em 2018, foi contemplada com uma bolsa de Doutorado Sanduíche no Exterior, através do Programas Estratégicos (PE) da CAPES, para realizar estágio no Laboratório de Patologia e Bacteriologia de Citros, do Professor Nian Wang, no Citrus Research and Education Center (CREC), da Universidade da Flórida, em Lake Alfred, Flórida, Estados Unidos. Até o presente momento, a autora dedicou sua pesquisa acadêmica às áreas de Biologia Molecular, Genética de Bactérias, Fitopatologia e Biotecnologia voltada para estudos de plantas e microrganismos. v AGRADECIMENTOS Agradeço pela vida maravilhosa que me foi concedida por Deus e pela oportunidade de aprendizado e evolução nesse plano terrestre. Cada momento que vivi durante todo o período de pós-graduação foi importante para meu crescimento pessoal e me ajudou a entender quais são meus objetivos na vida. A todos da minha família, que sempre me apoiaram e não mediram esforços para que eu pudesse finalizar mais uma etapa da minha formação. Por entenderem que para encontrar meu caminho eu precisei ficar longe de vocês e por sempre me acolherem quando precisei de colo. To my boyfriend Gant, you are an inspiration and an example of persistence, dedication and hard work. Thank you for always being there for me, for having the best words, advices and for supporting me through difficult times. Aos meus orientadores, Profa. Dra. Maria Inês Tiraboschi Ferro e Prof. Dr. Jesus Aparecido Ferro por acreditarem na minha capacidade e por me permitirem desenvolver meu trabalho da melhor maneira possível, sem medir esforços. Obrigada por sempre estarem disponíveis quando eu precisei, por entenderem quando passei por momentos difíceis e por lutarem comigo. Com vocês aprendi lições que mudaram minha vida profissional e pessoal. Ao prof. Dr. Henrique Ferreira, por todo apoio, atenção, e disponibilidade em me ajudar, responder dúvidas, por sempre abrir as portas do seu laboratório para que eu pudesse realizar parte da minha pesquisa. Aos alunos do Laboratório de Genética de Bactérias (LGB) pela ajuda com os experimentos em Rio Claro. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Aos professores e funcionários da FCAV, em especial aos que trabalham no Departamento de Tecnologia e Seção Técnica de pós-graduação. À Universidade Estadual Paulista – Unesp, Campus de Jaboticabal, pela oportunidade de realização do doutorado e Ao Conselho do Programa de Pós- graduação em Microbiologia Agropecuária do qual fiz parte por dois anos. vi Aos membros do LBM e CREBIO por todo apoio e ajuda durante a realização dos experimentos e por toda experiência compartilhada ao longo desses 4 anos. To Dr. Nian Wang, from University of Florida, for opening his laboratory and allowing me to do a great work. It was a great opportunity for me and I’m thankful for that. To my friends/co-workers from CREC and Wang’s lab, you guys have made my time there amazing and I will remember this experience forever. Aos amigos que fiz em Jaboticabal e Rio Claro, que foram minha segunda família, meu alívio em momentos difíceis e que de diversas maneiras, todos contribuíram para que eu chegasse ao final dessa etapa. Dificilmente uma pessoa vence uma batalha sozinha, eu com certeza tive o apoio de diversas pessoas ao longo do caminho, pessoas que se tornaram grandes amigos, pessoas com as quais aprendi grandes lições, pessoas que foram exemplos de solidariedade, compaixão e amor ao próximo. Espero um dia poder retribuir o que fizeram por mim... Muito obrigada! i SUMÁRIO RESUMO.................................................................................................................... iii ABSTRACT ................................................................................................................ iv CAPÍTULO 1 – Considerações gerais ......................................................................... 1 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 4 2.1 Citricultura: origem, importância econômica e contexto atual......................................... 4 2.2 Cancro cítrico: características e implicações na citricultura ............................................ 6 2.3 Genoma de X. citri e proteínas sem função conhecida (hipotéticas) .............................. 13 2.4 Uso de microscopia de fluorescência como ferramenta para localização subcelular de proteínas ............................................................................................................................... 17 3. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 21 CAPÍTULO 2 – mCherry fusions enable the subcellular localization and pattern differentiation of periplasmic and cytoplasmic proteins in Xanthomonas sp. ............. 30 Abstract ..................................................................................................................... 30 Introduction................................................................................................................ 31 Material and methods ................................................................................................ 32 Bacterial strains, plasmids and culture conditions ............................................................... 32 Details of plasmid construction and genes cloning .............................................................. 33 Fluorescence microscopy ..................................................................................................... 35 Growth curve and pathogenicity assays ............................................................................... 35 Western Blotting, Coomassie Blue and qRT-PCR ............................................................... 36 Results ...................................................................................................................... 37 The integrative mCherry vector for X. citri .......................................................................... 37 Stable integration of pMAJIIc into X. citri chromosome ..................................................... 37 Subcellular localization of cytoplasmic and periplasmic proteins in X. citri ....................... 38 ii Integration into X. citri chromosome does not affect bacteria pathogenicity and viability.. 41 Effect of arabinose on the expression of mCherry under control of araBAD promoter ...... 43 Discussion ................................................................................................................. 45 Acknowledgments ..................................................................................................... 47 References ................................................................................................................ 47 Supplementary material ............................................................................................ 52 CAPÍTULO 3 – Subcellular localization of EnvC homologue and its role in cell separation and virulence of Xanthomonas citri subsp. citri ........................................ 53 Abstract ..................................................................................................................... 53 Introduction................................................................................................................ 54 Material and methods ................................................................................................ 55 Bacterial strains, plasmids and culture condition ................................................................. 55 Mutant construction and complementation .......................................................................... 56 Microscopy ........................................................................................................................... 57 Pathogenicity assay and bacterial strains viability ............................................................... 58 Protein Modeling ....................................................................................................... 58 Results ...................................................................................................................... 59 X. citri encodes an EnvC-like protein that is conserved in many bacteria ........................... 59 Deletion of envC affects X. citri virulence ........................................................................... 61 .............................................................................................................................................. 62 Periplasmic protein EnvC is required for X. citri daughter cell separation .......................... 63 Discussion ................................................................................................................. 66 Acknowledgments ..................................................................................................... 68 References ................................................................................................................ 68 Supplementary material ............................................................................................ 72 iii LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR DE PROTEÍNAS DE Xanthomonas citri subsp. citri UTILIZANDO PROTEÍNA REPÓRTER RESUMO – Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) é uma bactéria fitopatogênica, conhecida por causar Cancro Cítrico Asiático (CCA) na maioria das espécies economicamente importantes de citros. A bactéria possui em seu genoma inúmeros genes que codificam para proteínas sem função descrita. A elucidação da localização subcelular e da função dessas proteínas são uma importante estratégia para o entendimento dos mecanismos e vias envolvidos na interação planta-patógeno. Assim, um vetor integrativo (pMAJIIc) contendo a proteína vermelha fluorescente mCherry foi construído com o objetivo de possibilitar a expressão e localização intracelular de proteínas de X. citri fusionadas a mCherry. O vetor pMAJIIc se integra no gene da α-amilase de X. citri, mas a interrupção do gene α-amilase não afetou a patogenicidade e a virulência da bactéria e a integração do vetor ao cromossomo bacteriano se manteve estável ao longo de diversas gerações. Com este vetor foi possível demonstrar em X. citri um padrão de emissão de fluorescência para proteínas citoplasmáticas e periplasmáticas. A proteína VrpA fusionada a mCherry foi visualizada circundando a membrana externa bacteriana, enquanto a proteína GyrB fusionada a mCherry foi visualizada difusa pelo citoplasma, com alguns pontos de acumulação localizados próximos aos polos da célula. O vetor também foi utilizado para a caracterização e localização subcelular da proteína hipotética XAC0024 de X. citri, agora anotada como EnvC. O mutante para o gene envC (ΔenvC) apresentou virulência reduzida e atraso no desenvolvimento das lesões típicas de cancro cítrico quando inoculado em folhas de limão cravo (Citrus limonia Osbeck). Além disso, o mutante ΔenvC apresentou células morfologicamente alteradas, com formato filamentoso e formação de minicélulas, indicando que essa proteína é um dos fatores responsáveis pela correta separação de células filhas bacterianas. A localização subcelular da proteína EnvC fusionada a mCherry apresentou o padrão descrito para proteínas periplasmáticas, sendo visualizada circundando a membrana externa bacteriana. Assim, pela primeira vez demonstramos que fusões com mCherry para localização subcelular de proteínas em X. citri utilizando vetor integrativo permite a identificação de um padrão de emissão de fluorescência específico para proteínas citoplasmáticas e periplasmáticas, o que tornou possível a caracterização de uma proteína até então sem função conhecida em X. citri. Palavras-chave: mCherry, vrpA, gyrB, envC, microscopia de fluorescência, virulência iv PROTEIN SUBCELLULAR LOCALIZATION of Xanthomonas citri subsp. citri USING REPORTER PROTEIN ABSTRACT – Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) is a phytopathogenic bacterium well known for causing Asiatic Citrus Canker (CCA) in the most economically important citrus species. The bacterium has in its genome sevral genes that code for proteins with no described function. The elucidation of the subcellular localization and function of these proteins is an important strategy for understanding the mechanisms and pathways involved in plant-pathogen interaction. Thus, an integrative vector (pMAJIIc) containing the red fluorescent protein mCherry was constructed to enable the expression and intracellular localization of mCherry fused proteins in X. citri. The pMAJIIc vector integrates into X. citri’s α-amylase gene, but disruption of the α-amylase gene did not affect the pathogenicity and virulence of the bacterium, and the integration of the vector into the bacterial chromosome remained stable over several generations. Using this vector, it was possible to demonstrate a fluorescence emission pattern for cytoplasmic and periplasmic proteins in X. citri. The mCherry fused VrpA protein was visualized surrounding the bacterial outer membrane, while the mCherry fused GyrB protein was visualized diffused by the cytoplasm, with some accumulation points located near the cell poles. The vector was also used for the characterization and subcellular localization of X. citri’s hypothetical protein XAC0024, now named EnvC. The mutant for envC gene (ΔenvC) showed reduced virulence and delayed development of the typical lesions of citrus canker when inoculated in leaves of Rangpur lime (Citrus limonia Osbeck). In addition, the ΔenvC mutant showed morphologically altered cells with filamentous shape and formation of minicells, indicating that this protein is one of the factors responsible for the correct separation of bacterial daughter cells. The subcellular localization of the mCherry-fused EnvC protein showed the pattern described for periplasmic proteins, being visualized surrounding the bacterial outer membrane. Thus, for the first time we demonstrated that the mCherry fusions for subcellular localization of protein in X. citri using the integrative vector allows the identification of a specific fluorescence emission pattern for cytoplasmic and periplasmic proteins, which allowed the characterization of a protein with no known function in X. citri. Keywords: mCherry, vrpA, gyrB, envC, fluorescence microscopy, virulence 1 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais 1. INTRODUÇÃO O gênero Citrus pertence à família Rutaceae, assim como Fortunella e Poncirus, e é originário das regiões tropicais e subtropicais do continente asiático e do arquipélago malaio (ALVES; MELO, 2003). No Brasil, os citros foram introduzidos durante o período de colonização, expandindo-se então por todo o território nacional e ganhando destaque em produção por meados de 1980, com o desenvolvimento industrial do país (NEVES et al., 2010). A produção brasileira de citros é voltada principalmente para o cultivo de laranjas doces e destina-se principalmente ao processamento industrial para o preparo de suco de laranja concentrado e congelado (“Frozen Concentrated Orange Juice” - FCOJ). O país é o maior produtor mundial de laranja, e a estimativa de produção para a safra 2018/2019 é de 17,7 milhões de toneladas (USDA, 2019), sendo São Paulo o Estado com maior produção, responsável por 62,69% (10,97 milhões de toneladas) desse montante (FUNDECITRUS, 2019). Dentre os diversos problemas fitossanitários que acometem a citricultura brasileira, o cancro cítrico é uma das doenças mais devastadoras (BELASQUE JÚNIOR et al., 2005; OLIVEIRA et al., 2008), pois acomete a maioria das espécies e cultivares comercialmente importantes e reduz diretamente a qualidade do fruto. São conhecidos diversos tipos de cancro cítrico, causados por diferentes agentes patogênicos, os quais apresentam diferenças em sua patogenicidade e sintomatologia (ROSA, 2010). O cancro cítrico asiático ou cancrose A, é o tipo economicamente mais importante da doença (GOTTWALD et al., 2002), e é causado pela estirpe A da bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). A X. citri é uma bactéria Gram-negativa, estritamente aeróbica, dotada de um único flagelo polar e que apresenta células do tipo bastonete (BRUNINGS; GABRIEL, 2003). Essa bactéria está adaptada ao ambiente das plantas cítricas, com crescimento endofítico, sendo raramente encontrada livre no solo (WELLS, 1987; SWINGS; CIVEROLO, 1993). A disseminação da doença é feita de forma direta e a bactéria pode chegar a um pomar por meio da chuva com vento (aerossol), do material de colheita, do trânsito de pessoas, veículos e máquinas agrícolas, de mudas 2 contaminadas, além de poder disseminar-se por contaminação nos frutos, no ar, no solo e pela presença de insetos (PALAZZO et al., 1984; BRUNINGS; GABRIEL, 2003). No cancro cítrico, como em muitas outras doenças bacterianas, o patógeno entra nos tecidos da planta hospedeira através dos estômatos ou feridas e os sintomas podem aparecer nas folhas, frutos e ramos como lesões circulares, corticosas e eruptivas, de coloração marrom, circundadas por um halo amarelo (MOREIRA et al., 2004). O gênero Citrus apresenta uma ampla variação nos níveis de tolerância ao cancro cítrico, porém não existem variedades ou espécies de uso comercial que sejam completamente resistentes à doença (FUNDECITROS, 2019). As estratégias de combate empregadas até o momento não são eficazes e o método mais seguro de erradicar a doença dos pomares é por meio da eliminação das plantas contaminadas, processo que traz significativas perdas econômicas (SCHUBERT et al. 2001). Outro método utilizado é borrifar as plantas com caldas de cobre metálico, o que pode levar ao surgimento de cepas resistentes e à contaminação do ambiente. Assim, diversos estudos relacionados ao agente etiológico do cancro cítrico têm sido desenvolvidos com vistas à obtenção de estratégias menos onerosas e que causem menos danos ao meio ambiente. Com a publicação do genoma completo da X. citri estirpe 306 (DA SILVA et al., 2002), a utilização de abordagens de genômica funcional no estudo dos genes envolvidos na patogenicidade e virulência desta bactéria têm proporcionado grandes avanços para o entendimento do patossistema citros - X. citri; porém, o arsenal utilizado pelo patógeno na colonização e ataque ao hospedeiro ainda não foi totalmente caracterizado e compreendido em suas particularidades individuais e inter- relacionais (JALAN et al., 2014). Desta forma, o conhecimento da biologia, dos mecanismos moleculares a níveis fisiológico, bioquímico, e também com relação às proteínas é crucial para o entendimento das interações planta-patógeno e desenvolvimento de novos métodos para o controle do cancro cítrico (WOOD, 1987; PASCHOLATI, 2008). Dentre os genes abordados no presente trabalho, o gene XAC0024 codifica para uma proteína hipotética que apresenta no N-terminal um peptídeo sinal composto por 20 aminoácidos, como predito pelo programa SignalP 4.1 Server (PETERSEN et al., 2011), e possui também um domínio catalítico peptidase M23, domínio este que 3 abrange uma superfamília de proteínas responsáveis pelo processo de proteólise, além de outros domínios relacionados com a divisão celular. O mutante do gene XAC0024 (XAC0024), quando inoculado em folhas de Limão Cravo (Citrus limonia Osbeck), apresentou diminuição das lesões típicas de cancro cítrico quando comparadas com as lesões causadas pela estirpe selvagem (MARTINS, 2016). No entanto ainda não se sabe a função e local de atuação da proteína codificada por esse gene, sendo sua elucidação de grande importância para a compreensão dos mecanismos moleculares de virulência da bactéria, podendo possivelmente contribuir para a elaboração de novas estratégias de erradicação do cancro cítrico. Embora existam inúmeras maneiras de se caracterizar a função de genes e proteínas, novas ferramentas precisam ser desenvolvidas e aprimoradas para tornar essa caracterização mais eficaz. A função de proteínas pode ser elucidada em parte pela fusão com proteínas fluorescentes e pela determinação de seu sinal de marcação e acumulação subcelular (GOODIN et al., 2002). mCherry é uma proteína que apresenta fluorescência vermelha, possuindo um comprimento de onda de excitação/emissão de 587/610nm, respectivamente. Essa proteína é um homólogo derivado de DsRed (“red fluorescent protein”), originalmente isolado de um cnidário, e tem sido amplamente aplicada em fusões para localização de proteínas em procariotos e eucariotos (RAMSON et al., 2015; DUELLMAN et al., 2015; ZHANG et al., 2015). Com base em suas características físico-químicas e principalmente pelo fato dessa proteína ser funcional no ambiente oxidativo do periplasma de bactérias, mCherry possibilita a localização subcelular de proteínas. Dentro deste contexto, o nosso trabalho de Tese teve como objetivos: 1) a construção de um vetor de expressão contendo a proteína repórter mCherry, que fosse capaz de revelar a localização subcelular de proteínas em X. citri a ela fusionadas e que não causasse nenhuma alteração do fenótipo da estirpe selvagem e 2) utilização deste vetor para a caracterização da proteína codificada pelo gene XAC0024 de X. citri, anotada como proteína hipotética, ou seja, sem função conhecida. 66 Discussion Gram-negative bacteria possess a tight peptidoglycan layer localized in its periplasmic space, between the outer and inner membranes (VOLLMER et al., 2008). This polymer is composed of glycan strands of β-1,4-glycosidic bond-linked N- acetylglucosamine and N-acetylmuramic acid disaccharide cross-linked by short peptides and plays an essential role in preservation and maintenance of cell shape and integrity (SILHAVY et al., 2010). Two main classes of peptidoglycan-lytic enzymes are responsible for assembly the peptidoglycan: the glycosidases that cleave the glycan backbone and the amidases (or peptidases) that cleave the peptide sidechain (FRIRDICH; GAYNOR, 2013). The Xanthomonas citri’s EnvC protein has a predicted M23 peptidase domain, which is part of a metallopeptidase’s superfamily characterized by the presence of zinc in its active enzyme site (WU et al., 1990). Included in this enzyme’s family is the Nlpd from E. coli, a LytM factor that is responsible, as well as EnvC, for activate the N- acetylmuramoyl-L-alanine amidases (AmiA, AmiB and AmiC). Those enzymes are necessary for daughter cell separation and inactivation of the genes encoding by them results in long cell chains formation (HEIDRICH et al., 2001; UEHARA et al., 2009; UEHARA et al., 2010). Here we showed that envC mutant of Xanthomonas citri strain displayed a defect in cell separation allied with differences in cell morphology. Bacteria cultures of ΔenvC exhibited elongated rods, filaments and minicells. Similar results were observed by Yang and coworkers (2018) in Xanthomonas campestris strains lacking NlpD, EnvC or AmiC1 which showed a severe defect in daughter cell separation. However, the physiological roles of peptidoglycan hydrolases factors are still unclear, since the loss of an individual enzyme has little effect on growth and division, suggesting that there is significant functional overlap between the innumerous hydrolases (VOLLMER et al., 2008). Despite of this information, a collection of E. coli mutants lacking individual LytM factors (EnvC, NlpD, YgeR and YebA) and all possible combination of them was generated by Uehara and coworkers (2009), and only the mutants with envC deletion 67 failed to separate normally, confirming that EnvC plays a critical role for proper cell separation in this bacteria. Xanthomonas citri mutant lacking EnvC showed a delay in citrus canker symptomatology compared with the wild-type and complemented strains. The bacteria’s virulence was affected by the gene inactivation which could be demonstrated by the inoculation of mutant strain into citrus plant and observation of the disease development. The ΔenvC (pMAJIIc-envC) complemented strain restored the virulence comparable with those of the wild-type, demonstrating that was not a polar mutation effect. Interestingly, Xanthomonas campestris strains lacking either NlpD or AmiC1 almost completely lost virulence, but the mutant lacking EnvC showed levels of virulence like the wild-type strain (YANG et al., 2018). According to the amino acid sequence analysis performed by SignalP 5.0 server (ARMENTEROS et al., 2019), EnvC from Xanthomonas citri has a signal peptide and its cleavage site is between the amino acids position 20 and 21 (Figure S2 A). The same analysis was performed for E. coli’s and Xanthomonas campestris’ EnvC and its sequences also presented a signal peptide with a cleavage site between the amino acids 42 and 43 for E. coli and between the amino acids 14 and 15 for Xanthomonas campestris (Figure S2 B and C). The signal peptide serves as a membrane anchor and for many pathogenic bacteria, proteins that carry a signal peptide are intended to be transported to the periplasm by the type II or III secretion system (BRUNINGS; GABRIEL, 2003; JHA; RAJESHWARI; SONTI, 2005; BUTTNER; ULLA BONAS, 2010; SOARES et al., 2010; RYAN et al., 2011; YAN; WANG, 2011; ZIMARO et al., 2014; ZHOU et al., 2015). The fluorescence microscopy of EnvC-mCherry fusion in Xanthomonas citri displayed a signal pattern observed for periplasmic protein localization (PENA et al., 2019). The red fluorescent emission was clearly localized surrounding the outer membrane of the bacteria, while the cytoplasm remained non-fluorescent. The same pattern was successfully demonstrated for EnvC-mCherry fusion in E. coli (UEHARA et al., 2009), reinforcing the efficiency of this red fluorescent protein for periplasmic subcellular localization once GFP (green fluorescent protein) is not fluorescent when secreted to the periplasm in an unfolded conformation via Sec system (FEILMEIER et al., 2000). 68 Taken together, these results, as well as similar results from many other bacterial system studies, support the notion that EnvC appears to be recruited to the division site during cell division (BERNHARDT; BOER, 2003; BERNHARDT; BOER, 2004; UEHARA et al., 2009). The subcellular localization of EnvC in Xanthomonas citri has not been previously reported, and we confirm by the mCherry fusion that it is a periplasmic protein. However, the precisely actuation of EnvC and how this protein interacts with the other hydrolases in daughter cell separation is still unclear. Furthers studies of septal peptidoglycan splitting in Xanthomonas could provide us with more information about the peptidoglycan hydrolases regulation and its lysis mechanisms in bacteria division process. Acknowledgments This work is part of the Ph.D. thesis of M. M. Pena and Master’s dissertation of T. Z. Martins and was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Finance Code 001. We thank Dr. Henrique Ferreira for the kindly assistance and support with the microscope, microplate device and helpful comments. The Citrus Research and Education Center for allowed to use their microscope facilities. We also thank Dr. Fernanda Nogales, Dr. Yosvani Acanda and Naiara Zancanari for the support with experimental assays and analyzes. References ARMENTEROS, J. J. A.; TSIRIGOS, K. D.; SONDERBY, C. K.; PETERSON, T. N.; WINTHER, O.; BRUNAK, S.; HEIJNE, G. V.; NIELSEN, H. 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C.; DO AMARAL, A. M.; BERTOLINI, M. C.; CAMARGO, L. E. A.; CAMAROTTE, G.; CANNAVAN, F.; CARDOZO, J.; CHAMBERGO, F.; CIAPINA, L. P.; CICARELLI, R. M. B.; COUTINHO, L. L.; CURSINO-SANTOS, J. R.; EL- DORRY, H.; FARIA, J. B.; FERREIRA, A. J. S.; FERREIRA, R. C. C.; FERRO, M. I. T.; FORMIGHIERI, E. F.; FRANCO, M. C.; GREGGIO, C. C.; GRUBER, A.; KATSUYAMA, A. M.; KISHI, L. T.; LEITE, R. P.; LEMOS, E. G. M.; LEMOS, M. V. F.; LOCALI, E. C.; MACHADO, M. A.; MADEIRA, A. M. B. N.; MARTINEZ-ROSSI, N. M.; MARTINS, E. C.; MEIDANIS, J.; MENCK, C. F. M.; MIYAKI, C. Y.; MOON, D. H.; MOREIRA, L. M.; NOVO, M. T. M.; OKURA, V. K.; OLIVEIRA, M. C.; OLIVEIRA, V. R.; PEREIRA, H. A.; ROSSI, A.; SENA, J. A. D.; SILVA, C.; DE SOUZA, R. F.; SPINOLA, L. A. F.; TAKITA, M. A.; TAMURA, R. E.; TEIXEIRA, E. C.; TEZZA, R. I. D.; TRINDADE DOS SANTOS, M.; TRUFFI, D.; TSAI, S. M.; WHITE, F. F.; SETUBAL, J. C.; KITAJIMA, J. P. Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specificities. 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Name Sequence A(F) CAGAGCCAGCGCGAGACCGAG B(R) ACGGTGGTGCAGCGGTGCATTGCGGCCCAC C(F) GCACCGCTGCACCACCGTGACTGCAGTGGC D(R) TCAGCGGCGTTGCAGCCAGCT 0024_500_IF_F AGATCCATGGCACTCGAGCGCCACTGATCTGGC 0024_500_IF_R GCTCACCATCTCGAGGTCGTCGATCGGCGCGATCA 0024_IF_F AGATCCATGGCACTCGAGATGTGGCTGGCGGTG 0024_IF_R GCTCACCATCTCGAGGCGGCGTTGCAGCCAGCTCGA 73 Figure S1: Protein sequence alignment between: A: XAC0024 from Xanthomonas citri and its homologue XCC0022 from Xanthomonas campestris; B: XAC0024 from Xanthomonas citri and EnvC from Escherichia coli. The alignments were performed using the NCBI - BLASTP (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). A B https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 74 Figure S2: Predicted signal peptide for: A: XAC0024 from Xanthomonas citri; B: EnvC from Escherichia coli; C: XCC0022 from Xanthomonas campestris. The analysis was performed using the SignalP 5.0 Server (ARMENTEROS et al., 2019). B A C