UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE REPRODUÇÃO ANIMAL E RADIOLOGIA VETERINÁRIA VIABILIDADE PÓS CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES DE NOVILHAS NELORE SUPLEMENTADAS COM GORDURA PROTEGIDA RUMINAL MONIQUE MENDES GUARDIEIRO Botucatu-SP Março, 2009 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE REPRODUÇÃO ANIMAL E RADIOLOGIA VETERINÁRIA VIABILIDADE PÓS CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES DE NOVILHAS NELORE SUPLEMENTADAS COM GORDURA PROTEGIDA RUMINAL MONIQUE MENDES GUARDIEIRO Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual “Júlio Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária, Área de Reprodução Animal. Orientador: Dr. Roberto Sartori Filho Botucatu-SP Março, 2009 ii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus Guardieiro, Monique Mendes. Viabilidade pós criopreservação de embriões de novilhas Nelore suplementadas com gordura protegida ruminal / Monique Mendes Guardieiro. – Botucatu : [s.n.], 2009 Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2009. Orientador: Roberto Sartori Filho Assunto CAPES: 50504002 1. Bovino (Nelore) - Reprodução 2. Criopreservação 3. Embrião CDD 636.208924 Palavras-chave: Ácidos graxos; Bovino; Criotolerância; Embrião; Superovu- lação iii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE REPRODUÇÃO ANIMAL E RADIOLOGIA VETERINÁRIA VIABILIDADE PÓS CRIOPRESERVAÇÃO DE EMBRIÕES DE NOVILHAS NELORE SUPLEMENTADAS COM GORDURA PROTEGIDA RUMINAL MONIQUE MENDES GUARDIEIRO Aprovada por: ROBERTO SARTORI FILHO, Ph.D Orientador Departamento de Zootecnia Universidade de São Paulo / Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” JOSÉ LUIZ MORAES VASCONCELOS, DOUTOR Examinador interno Departamento de Produção Animal Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Unesp - Botucatu GUILHERME DE PAULA NOGUEIRA, DOUTOR Examinador externo Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal – Unesp - Araçatuba Data da defesa: 20 de março de 2009 Botucatu-SP Março, 2009 iv Dedico este trabalho: Ao meu tio, Gabriel de Godoy, que infelizmente não está entre nós, mas sei que estaria feliz por esta conquista. E aos meus pais, Leida Márcia Mendes Guardieiro e Marlus Guardieiro, que não mediram esforços, acreditando em meu potencial. v AGRADECIMENTOS Ao curso de Pós-graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootécnica (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Botucatu – SP, ao Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária (RARV) e especialmente à Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF pela oportunidade de aprimoramento técnico- científico e acadêmico. Aos pesquisadores da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília- DF, pela disposição a ensinar e pelas contribuições intelectuais: Dr. Maurício Machaim Franco, Dra. Margot Alves Nunes Dode, Dr. Rodolfo Rumpf, Dr. Alexandre Floriani Ramos, Dr. Eduardo de Oliveira Melo e ao médico veterinário, Ivo Pivato pelo exemplo profissional. Aos meus amigos da equipe de trabalho da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF, cuja ajuda no projeto de pesquisa foi imprescindível para sua realização: Michele Ricieri Bastos, Grazieli Marinheiro Machado, Emivaldo Siqueira, Heitor Castro Alves Teixeira, Thiago Diesel, Ligiane Leme, José Carvalho, Nádia Simarro, Lígia Lima, Marcos Rollemberg Mollo e Leonardo Mello. Aos amigos que também torceram para o sucesso do experimento: Ester Caixeta, Allice Rodrigues, Valquíria Michalczechen, Marcelo Tigre Moura, Jefferson Badaraco, Andrei Fidelis, Ana Cláudia Valeriano, Regivaldo Sousa, Mirian Souza, Juliana Cassiano, Patrícia Massuda, Suziane Silva, Breno Moscheta e Christina Ramires. A vocês, meu muito obrigada! A todos os funcionários da fazenda Sucupira, por atenderem meus pedidos e ajudarem no manejo dos animais e na organização dos materiais de laboratório, em especial: Japão, Weber, Chicão, Zidane, Adolfo, Zezão, Arlindo, Tinho, Normandes, Urias, Milton, D. Zefa, Expedito, Pelezinho, D. Lia e Nita. Aos estagiários que acompanharam o desenvolvimento do experimento e contribuíram para sua realização: Bruno (Uniplac, Brasília-DF), Vagner (Uniube, Uberaba-MG), Gustavo (Faculdade Jaguariúna), Amanda (Unesp, Botucatu-SP), Cristina (Unesp, Botucatu-SP), Letícia (UFF, Rio de Janeiro-RJ), Markis Suel (MS), Carlos Thiago (UFG, Goiânia-GO) e Pedro Ivo (UnB, Brasília-DF). Ao médico veterinário Luiz Henrique Carrijo da Integral Nutrição Animal, pela disposição em nos ajudar na elaboração dos suplementos fornecidos no experimento e pelo apoio à pesquisa. Ao professor Gerson Barreto Mourão pela disposição e colaboração nas análises estatísticas. Ao Dr. Roberto Sartori Filho, pela oportunidade concedida para orientação durante o mestrado e pela confiança em meu trabalho. Hoje entendo o significado da palavra orientação: participação, compreensão, confiança e companheirismo. Obrigada por permitir meu crescimento profissional. vi Aos funcionários da seção de Pós-Graduação e do Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ-UNESP-Botucatu-SP:José Roberto Lalla Junior, Maria Aparecida Dias, Edilson, Cristina Paganini, que gentilmente atenderam nossas solicitações. À bibliotecária Meire pela simpatia e auxílio na correção das citações e referências bibliográficas. Aos amigos de Botucatu-SP: Hení Falcão, Maria Clara Mattos, Jeanne Siqueira, Rogério Fonseca, Fernanda Saules, Ana Carolina Oliveira, Dani Monteschiesi, Cláudia Monteiro, Anthony Castilho, Diego Marcondes, Mariana Fernandes, Mateus Sudano, Vicente Turino, Rosiara Maziero, Ian Martin, Wangles, Thiago Matos, Rodolfo Cardoso e Catarina Lopes. Aos meus pais, Leida Márcia Mendes Guardieiro e Marlus Guardieiro, à minha irmã Natália Mendes Guardieiro e aos familiares, por compreenderem minha ausência e sempre apoiarem minhas decisões profissionais. Amo vocês!!! Ao Heitor Castro Alves Teixeira por ser meu porto-seguro e me proporcionar alegria. Você e sua família (Glória, Flávio, Ludmila, Flavinho, Luciana, José Bonifácio, Socorro, Luiz, Thiago, Luize, Lorenna, Pedrinho, Nazaré e Anália) amenizaram a dor da saudade por estar fora de casa. Obrigada pelo carinho, vocês estão guardados em meu coração!!! Ao professor Ricardo Chebel e à Tatiana Araújo bem como às empresas Pfizer, Arm & Harmer e Integral Nutrição Animal que auxiliaram na execução do projeto através da doação de produtos e incentivaram a pesquisa científica. Aos professores doutores componentes da banca examinadora pela disponibilidade e colaboração em minha dissertação. À Fapesp pela bolsa de estudo oferecida. A todos agradeço pelo apoio à pesquisa! vii LISTA DE TABELAS TABELA 1. Porcentagem dos principais ácidos graxos encontrados na gordura protegida, Megalac-E......................................................... 45 TABELA 2. Porcentagem relativa aos ingredientes utilizados na composição dos suplementos experimentais com gordura protegida ruminal (G) e controle (C)............................................................................. 46 TABELA 3. Níveis de garantia dos suplementos com gordura protegida ruminal (G) e controle (C) previamente e posteriormente à adição de milho moído................................................................................ 47 TABELA 4. Ingestão diária estimada de nutrientes dos concentrados com gordura protegida ruminal (G) e controle (C) por animal previamente e posteriormente à adição de milho moído................ 48 TABELA 5. Descrição dos kits utilizados e coeficientes de variação (CV) intra-ensaio, valores extremos das curvas padrão e sensibilidade do ensaio, obtidos nas dosagens hormonais realizadas................. 58 TABELA 6. Consumos desejados e observados médios, nutrientes digestíveis totais (NDT) e proteína bruta (PB) dos concentrados experimentais (G e C), previamente e posteriormente à adição de milho moído..................................................................................... 60 TABELA 7. Resultados (média dos quadrados mínimos ± EP) da população folicular, corpos lúteos e embriões colhidos em novilhas suplementadas com gordura protegida (G) ou sem a adição de gordura protegida (C)...................................................................... 64 TABELA 8. Estágio de desenvolvimento embrionário e diâmetro (média dos quadrados mínimos ± EP) dos embriões viáveis produzidos por animais que receberam suplemento com gordura protegida (G) ou controle (C) 48 e 72 h após o início do cultivo in vitro................ 66 TABELA 9. Estágio de desenvolvimento embrionário e diâmetro (média dos quadrados mínimos ± EP) dos embriões viáveis após a descongelação ou desvitrificação avaliados 48 e 72 h após o início do cultivo in vitro.................................................................... 68 viii LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Esquema do delineamento experimental, mostrando o período de fornecimento das dietas experimentais (G = Gordura protegida ruminal e C = Controle), os protocolos hormonais para sincronização da ovulação e superestimulação, bem como as avaliações ultra-sonográficas. BE = Benzoato de estradiol (2 mg; Estrogin®); FSH (total de 70 mg; Folltropin®); GnRH = Lecirelina (50 µg; Gestran Plus®); PGF = Prostaglandina F2 (25 mg; Lutalyse®); P4 = dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®); US = avaliação ultra-sonográfica; M = manhã; T = tarde; ↑ = inserção; ↓ = retirada........................................................................ 50 FIGURA 2. Peso corporal (média ± EP) dos animais que receberam suplementos com gordura protegida ruminal (G, n = 20) ou controle (C, n = 20), na primeira repetição. Não houve diferença (P > 0,10) no peso corporal médio entre os grupos experimentais.................................................................................... 61 FIGURA 3. Peso corporal (média ± EP) dos animais que receberam suplementos com gordura protegida ruminal (G, n = 20) ou controle (C, n = 20), na segunda repetição. Não houve diferença (P > 0,10) no peso corporal médio entre os grupos experimentais.................................................................................... 61 FIGURA 4. Escore de condição corporal (ECC; escala de 1 a 5; média ± EP) de animais que receberam suplementos com gordura protegida ruminal (G, n = 20) ou controle (C, n = 20), na primeira repetição. Não houve diferença (P > 0,10) no ECC médio entre os grupos experimentais.................................................................................... 62 FIGURA 5. Escore de condição corporal (ECC; escala de 1 a 5; média ± EP) de animais que receberam suplementos com gordura protegida ruminal (G, n = 20) ou controle (C, n = 20), na segunda repetição. Não houve diferença (P > 0,10) no ECC médio entre os grupos experimentais.................................................................................... 62 ix FIGURA 6 Taxa de eclosão (média dos quadrados mínimos ± EP) dos embriões após a descongelação ou desvitrificação avaliada 48 e 72 h após o início do cultivo in vitro, comparando embriões produzidos por animais que receberam suplemento com gordura protegida (G) ou controle (C). A taxa de eclosão foi maior para os embriões provenientes do grupo C em relação à dos embriões produzidos pelo grupo G (a,bGrupos diferem entre si dentro de cada momento de avaliação; P < 0,05)............................................ 65 FIGURA 7. Taxa de eclosão (média dos quadrados mínimos ± EP) dos embriões submetidos à vitrificação/desvitrificação ou congelação/descongelação avaliada 48 e 72 h após o início do cultivo in vitro. A taxa de eclosão foi similar para os embriões vitrificados e congelados, independentemente do momento da avaliação do cultivo in vitro (P > 0,10).............................................. 67 x LISTA DE ABREVIAÇÕES AGC = ácido graxo conjugado AGP = ácido graxo poliinsaturado BE = benzoato de estradiol BSA = Bovine Serum Albumin C = controle CC = embriões congelados provenientes de novilhas do grupo C CCO = complexo cúmulus ovócito CG = células da granulosa CL = corpo lúteo CV = coeficiente de variação CV= embriões vitrificados provenientes de novilhas do grupo C DHA = ácido graxo docosahexaenóico DMSO = dimetilsulfóxido DPBS = Dulbeco phosfhate buffered saline ECC = escore de condição corporal EG = etilenoglicol EP = erro padrão EPA = ácido eicosapentaenóico FIV = fecundação in vitro FSH = hormônio folículo estimulante g = giros G = gordura protegida ruminal GH = hormônio do crescimento GnRH = hormônio liberador de gonadotrofinas GC = embriões congelados provenientes de novilhas do grupo G GV = embriões vitrificados provenientes de novilhas do grupo G h = hora ha = hectare HM = solução de manutenção IA = inseminação artificial IATF = inseminação artificial em tempo fixo IGF = fator de crescimento semelhante à insulina xi i.m. = intramuscular LH = hormônio luteinizante min = minuto mL = mililitros mm = milímetros n-3 = ômega 3 n-6 = ômega 6 NDT = nutrientes digestíveis totais NNP = nitrogênio não protéico OPS = open pulled straw OPU = ovum pick up P4 = dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR); PB = proteína bruta PGF2α = prostaglandina F2α PGFM = metabólito da PGF2α PGHS = prostaglandina endoperóxido sintetase PIV = produção in vitro de embriões PM = peso molecular PPAR = gene ativador de receptores de peroxissomo PVP = polivinilpirrolidona SD = solução de desvitrificação s = segundo SFB = soro fetal bovino SM = solução de sucrose SOF = meio de fluido de oviduto sintético SOV = superovulação SV = solução de vitrificação TALP = meio de calcium-free Tyrode’s albumin lactate pyruvate TE = transferência de embriões UI = unidades internacionais US = avaliação ultra-sonográfica vs = versus μL = microlitros μm = micrômetro xii SUMÁRIO Página RESUMO........................................................................................................ 1 ABSTRACT.................................................................................................... 2 1. INTRODUÇÃO........................................................................................... 3 2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................... 4 2.1 Produção in vivo de embriões bovinos.................................................. 4 2.2 Criopreservação de embriões bovinos.................................................. 6 2.2.1 Congelação lenta.......................................................................... 10 2.2.2 Vitrificação..................................................................................... 10 2.2.3 Vitrificação versus congelação lenta de embriões........................ 13 2.3 Ácidos graxos........................................................................................ 16 2.4 Gordura protegida ruminal.................................................................... 17 2.5 Efeito dos ácidos graxos....................................................................... 18 2.5.1 Puberdade, estação de monta e pré-parto.................................... 18 2.5.2 Prenhez......................................................................................... 19 2.5.3 Concentração sanguínea de hormônios e outras substâncias..... 22 2.5.4 Folículos ovarianos....................................................................... 28 2.5.5 Ovócitos........................................................................................ 29 2.5.6 Resposta superovulatória e qualidade embrionária................... 31 2.5.7 Criopreservação de embriões....................................................... 37 3. OBJETIVO.................................................................................................. 41 4. HIPÓTESES............................................................................................... 42 5. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 43 5.1 Local...................................................................................................... 43 5.2 Animais.................................................................................................. 43 5.3 Dietas experimentais............................................................................. 44 5.4 Manejo dos pastos................................................................................ 49 5.5 Avaliações de escore de condição corporal e pesagem.................... 49 5.6 Superovulação...................................................................................... 49 5.7 Colheita embrionária............................................................................. 50 5.8 Avaliações ultra-sonográficas relacionadas à SOV............................. 51 5.9 Técnicas de criopreservação................................................................ 52 5.9.1 Congelação................................................................................... 52 5.9.2 Vitrificação..................................................................................... 53 xiii 5.10 Produção in vitro de embriões............................................................. 54 5.11 Cultivo in vitro dos embriões............................................................... 55 5.12 Colheita e análise do sangue.............................................................. 57 5.13 Análise estatística............................................................................... 58 6. RESULTADOS........................................................................................... 59 6.1 Consumo das dietas.............................................................................. 59 6.2 Peso e escore de condição corporal................................................... 60 6.3 Resposta superovulatória e produção embrionária............................ 63 6.4 Desenvolvimento in vitro dos embriões após desvitrificação ou descongelação............................................................................................... 64 6.5 Concentrações circulantes de IGF-I e insulina.................................... 68 7. DISCUSSÃO.............................................................................................. 69 7.1 Consumo dos suplementos experimentais.......................................... 69 7.2 Resposta superovulatória, produção e desenvolvimento in vitro de embriões......................................................................................................... 69 7.3 Técnica de criopreservação.................................................................. 78 7.4 Concentrações circulantes de IGF-I e insulina.................................... 81 8. CONCLUSÕES.......................................................................................... 84 9. CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................... 85 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 86 11. TRABALHO CIENTÍFICO......................................................................... 101 Anexo....................................................................................................... 118 GUARDIEIRO, M.M. Viabilidade pós criopreservação de embriões de novilhas Nelore suplementadas com gordura protegida ruminal. Botucatu, 2009. 100p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO O objetivo do presente trabalho foi avaliar a resposta superovulatória, a produção embrionária e a resistência à criopreservação através de congelação ou vitrificação de embriões de novilhas Nelore suplementadas com gordura protegida ruminal (Megalac-E®). Foram utilizadas 40 novilhas da raça Nelore mantidas a pasto, divididas em dois grupos experimentais de acordo com o tipo de suplementação fornecido (G = concentrado com gordura protegida ruminal e C = suplementação controle, sem adição de gordura). Os suplementos foram formulados para serem isoenergéticos e isoprotéicos. O delineamento foi do tipo cross-over com 67 (primeira repetição) e 70 d (segunda repetição) de duração. Após 50 d de suplementação dietética, foi realizada a sincronização da emergência da onda para iniciar o protocolo de superovulação. Os embriões colhidos foram congelados ou vitrificados e avaliação de desenvolvimento embrionário in vitro foi realizada posteriormente. Não houve diferença (P > 0,10) entre os Grupos G e C em relação à resposta superestimulatória, ao número total de estruturas, embriões congeláveis, degenerados e ovócitos não fecundados colhidos. Apesar do grupo C ter mostrado maior reposta superovulatória que o G (15,7 ± 1,2 vs 18,0 ± 1,3 CL; P = 0,06), os embriões do Grupo C apresentaram maior taxa de eclosão, independentemente do método de criopreservação, às 48 h (33,1 ± 4,0%; n = 148 vs 17,3 ± 3,3%; n = 137; P = 0,009) e às 72 h (44,3 ± 4,2%; n = 148 vs 30,9 ± 4,0%; n = 137; P = 0,04) de cultivo do que os do grupo G. Além disso, os embriões vitrificados e congelados apresentaram taxas similares de eclosão (P > 0,10). Nas condições do presente estudo, o suplemento composto com gordura protegida não afetou a resposta superestimulatória e a produção de embriões, e os embriões do Grupo Controle foram mais tolerantes à criopreservação. Palavras-chave: Bovino, ácidos graxos, superovulação, embrião, criotolerância. GUARDIEIRO, M.M. Post cryopreservation viability of embryos from Nellore heifers supplemented with rumen-protected fat. Botucatu, 2009. 100p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT The aim of the current study was to evaluate the superovulatory response and embryo production, as well as embryo resistance to cryopreservation through freezing or vitrification of embryos from Nellore heifers supplemented with rumen-protected fat, Megalac-E®. Forty heifers kept in pasture were randomly divided into two experimental groups according to supplement source (G = supplement with rumen-protected fat and C = Control, without fat supplementation). The supplements were formulated to be isocaloric and isoproteic. Each female underwent both treatments in a cross-over design with approximately 67 d (first replicate) and 70 d (second replicate). After 50 d of feeding, the emergence of the wave was synchronized with the aid of hormones to iniciate the superovulation protocol. The embryos recovered were frozen or vitrified and subsequently in vitro embryo development evaluation was accomplished. There was no difference between G and C groups (P > 0.10) regarding superstimulatory response, number of total embryos/ova, viable embryos, degenerate embryos, or unfertilized oocytes recovered. However, group C had a greater superovulatory response than G (15.7 ± 1.2 vs 18.0 ± 1.3 CL; P = 0.06). Group C embryos presented greater hatching rate, independently of the cryopreservation method, at 48 h (33.1 ± 4.0%; n = 148 vs 17.3 ± 3.3%; n = 137; P = 0.009) and at 72 h (44.3 ± 4.2%; n = 148 vs 30.9 ± 4.0%; n = 137; P = 0.04) of in vitro culture. Moreover, vitrified and frozen embryos had similar hatching rate (P > 0.10). Under the conditions of the present study, supplementation with protected fat did not affect superstimulatory response, quantity or quality of embryos. However embryos from the Control group were more tolerant to cryopreservation. Keywords: Bovine, fatty acids, superovulation, embryo, cryotolerance. 3 1. INTRODUÇÃO A pecuária brasileira possui uma demanda crescente de animais de elevado mérito genético, o que tem impulsionado o uso de técnicas avançadas de biotecnologia, notadamente aquelas associadas à reprodução animal, tais como a superovulação (SOV) e transferência de embriões (TE). Atualmente, o Brasil é um dos países que mais geram produtos utilizando esta biotecnologia, porém com resultados muito variáveis e aquém do ideal. A nutrição está entre os fatores que mais afetam a desempenho reprodutivo de fêmeas bovinas. Por isso, animais de elevado mérito genético que são utilizados como doadoras de embriões devem estar sob um manejo nutricional adequado. A suplementação de gordura é uma prática comum para aumentar a densidade energética da dieta. Além de fornecer calorias, a gordura possui efeito direto na reprodução através do tipo de ácido graxo presente (FUNSTON, 2004; RAES et al., 2004). A suplementação de energia é bastante utilizada em gado de leite, principalmente pelo seu papel no aumento da densidade energética da dieta. Porém, devido às diferenças na ingestão de matéria seca e no nível de produção de leite, os resultados das pesquisas com gado de leite não são necessariamente aplicáveis aos animais para produção de carne (ARM & HAMMER, s. d.; FUNSTON, 2004; RAES et al., 2004). Os componentes das membranas celulares como os ácidos graxos poliinsaturados podem ser manipulados através da nutrição das doadoras de embriões (SEIDEL, 2006). Neste sentido, a inclusão de gordura protegida na dieta pode ser uma possiblidade para melhorar a tolerância a baixas temperaturas de embriões produzidos in vivo. Além disso, devem-se procurar alternativas para incrementar os resultados dos processos de criopreservação de embriões de fêmeas zebuínas com conseqüente incremento de opções para disseminação do material genético de doadoras de embriões de interesse comercial. 4 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Produção in vivo de embriões bovinos Dados mundiais demonstram que cerca de 800.000 embriões bovinos são produzidos por ano, sendo que o Brasil representa do total da produção mundial, 17,6% e 48,5% de embriões produzidos in vivo e in vitro, respectivamente (dados de 2005, MAPLETOFT, 2006; VIANA & CAMARGO, 2007). O uso de biotecnologias como a TE tem sido disseminado no Brasil, especialmente na raça Nelore, cujos exemplares excedem 90 milhões, devido à resistência ao estresse calórico e a parasitas (MONTEIRO et al., 2009). Deste modo, a técnica de múltiplas ovulações e a transferência de embriões são ferramentas utilizadas com o intuito de melhorar e multiplicar a genética de fêmeas Bos indicus (BARROS & NOGUEIRA, 2001; BARUSELLI et al., 2001). As raças zebuínas são consideradas mais sensíveis aos tratamentos com gonadotrofinas, inclusive por possuírem maior número de folículos recrutados do que fêmeas Bos taurus taurus (BARUSELLI et al., 2001). Através da adequação de protocolos superestimulatórios, como o controle da emergência da onda folicular, indução da ovulação e doses de FSH adequadas para os zebuínos, facilitou-se o manejo destes animais e aumentou a eficiência dos programas de transferência de embriões (BARUSELLI et al., 2001; BÓ et al., 2008). A produção in vivo de embriões através da SOV é uma biotécnica reprodutiva comumente denominada TE e consiste na estimulação hormonal dos ovários (superovulação ou indução de ovulações múltiplas) de uma fêmea, doadora, para induzir o desenvolvimento e a maturação de vários folículos simultaneamente (SARTORI et al., 2009). Após detecção de estro ou indução de ovulação através da aplicação exógena de hormônio, a vaca ou novilha recebe monta natural ou inseminação artificial (IA) e, seis a oito dias após, os embriões são colhidos através de lavagem uterina e imediatamente criopreservados ou transferidos para receptoras (SARTORI et al., 2009). Portanto, o objetivo dos protocolos de superestimulação é obter o número máximo de embriões transferíveis com alta probabilidade de produzirem prenhezes (MAPLETOFT, 2006). 5 O aumento do número de bezerros obtidos de doadoras com alto valor genético proporcionado pelo uso desta técnica permite a disseminação mundial de genética (BARUSELLI et al., 2001), podendo obter rápida expansão de determinados genes. Na pesquisa científica, esta técnica também possui sua aplicação, sendo usada para responder questões de fisiologia básica e para melhorar os protocolos de TE (MAPLETOFT, 2006). Na SOV, se busca a estimulação e a ovulação de um maior número possível de folículos de uma mesma onda de crescimento folicular, através da aplicação de hormônios (MAPLETOFT, 2006). O número de ovulações e a eficiência da colheita de embriões são dependentes da quantidade de FSH utilizada. Com a elevação das doses deste hormônio, a ovulação também aumenta até que o platô seja alcançado. Entretanto, o uso de altas doses de FSH deprime as taxas de colheita, através da inibição do pico de LH (hormônio luteinizane) e ovulação (SCHERZER et al., 2008). A dose de FSH exógeno utilizado varia conforme o produto (laboratório), a categoria, o estado fisiológico, o escore de condição corporal (ECC), a raça e a individualidade da doadora, sendo que para as raças zebuínas se utiliza uma dose menor (aproximadamente 50% a menos) do que para as taurinas e as novilhas necessitam de doses menores do que as vacas (BARUSELLI et al., 2006; SARTORI et al., 2009). A variação no número de folículos ovulados está associada ao número de folículos com diâmetro > 2 mm no início da superestimulação ovariana, predizendo a resposta superestimulatória. Animais que possuem baixa resposta em determinada colheita embrionária continuam apresentando-a nos próximos tratamentos hormonais (MAPLETOFT, 2006; SCHERZER et al., 2008). Em geral, a taxa de colheita, ou seja, o número de embriões colhidos em relação ao número de corpos lúteos (CLs) é de 60 a 70% (SARTORI et al., 2009), mas depende do procedimento de colheita, do meio utilizado e da habilidade do técnico. Os resultados de SOV ainda variam muito entre as doadoras, o que está relacionado ao hormônio utilizado, à sua dose e pureza, à raça, à nutrição e, notoriamente, à variação individual dos animais (SCHERZER et al., 2008; SARTORI et al., 2009). Cerca de 25% das fêmeas escolhidas como doadoras não produzem nenhum embrião transferível em resposta à SOV, 25% 6 respondem muito bem (≥ 10 embriões viáveis) e as demais, 50% respondem de maneira intermediária. Uma boa parcela do grupo de doadoras que não respondem, pode produzir embriões se adequando os protocolos conforme a individualidade da cada doadora (SARTORI et al., 2009). Os fatores de variabilidade de resposta à SOV mais importantes são ligados ao animal e ambiente, principalmente, ao estado nutricional, histórico reprodutivo, idade, época do ano, raça e estado ovariano no momento do tratamento hormonal (MAPLETOFT, 2006). Repostas superovulatórias inconsistentes têm sido associadas à assincronia entre a maturação folicular e ovocitária, ocasionando falhas na fecundação. Adicionalmente, o perfil esteirodogênico nos folículos durante o período pré-ovulatório resulta em ovulações prematuras durante o tratamento com FSH; podendo originar CLs prematuros que secretam baixos níveis de progesterona no momento do estro, inibindo o pico de LH e as ovulações (BARROS & NOGUEIRA, 2001). Entretanto isto pode ser evitado através do uso de dispositivos de progesterona no protocolo superovulatório. Além disso, há indícios de comprometimento do transporte espermático e captura dos ovócitos pelas fímbrias da tuba uterina ao se utilizar protocolos hormonais. Apesar dos avanços no conhecimento da fisiologia reprodutiva e na purificação dos hormônios utilizados atualmente na SOV, em termos gerais, os resultados de produção embrionária não diferem muito daqueles obtidos 20 anos atrás (HASLER, 2006). Esta realidade é o reflexo de baixos resultados obtidos com embriões criopreservados, diminuindo a chance de disseminar o material genético de animais de alto valor. Neste sentido há necessidade da otimização de técnicas de criopreservação que venham atender a demanda da produção de embriões in vivo. 2.2 Criopreservação de embriões bovinos Da totalidade dos embriões obtidos pela transferência convencional no Brasil (81.114 embriões), 12% são criopreservados pelo método de congelação lenta (dados de 2006, VIANA & CAMARGO, 2007). Entretanto, dados de embriões vitrificados são escassos, pelo fato do baixo número de embriões 7 vitrificados transferidos a campo e por não se relatar a transferência destes embriões, pelos técnicos. O cenário mundial apresenta predomínio de transferências realizadas a fresco, sendo porcentagens maiores que 80% para embriões produzidos in vivo e acima de 95% para embriões oriundos da produção in vitro. Tal fato se deve principalmente aos resultados insatisfatórios obtidos de embriões zebuínos congelados convencionalmente, diferindo de embriões taurinos (VIANA & CAMARGO, 2007). Embriões de Nelore apresentam alterações significativas durante o processo de criopreservação. Visintin et al. (2002) relataram a presença de sinais de degeneração e morte de células embrionárias em embriões vitrificados ou congelados, ao serem comparados com embriões frescos. Além disso, durante a rápida congelação e vitrificação, os embriões provenientes de vacas holandesas exibiram melhores características morfológicas do que embriões de Nelore (VISINTIN et al., 2002). Estes resultados concordam com Zanenga (1993) que mostrou comportamento homogêneo durante o processo de congelação para embriões Bos taurus. Por outro lado, embriões Bos indicus variaram sua qualidade após descongelação, resultando em menores taxas de prenhez. Apesar disso, Lopatarova et al. (2002) comentam que a criopreservação de embriões tem sido um método utilizado na transferência comercial, principalmente pelo fato das taxas de sobrevivência serem próximas às dos embriões frescos. Há, inclusive, relatos de taxas de prenhez de 40 a 55% para embriões transferidos pós-vitrificação (LAZAR et al., 2000; MASSIP, 2001), entretanto estes trabalhos utilizaram um número baixo de animais. A criopreservação simplifica o transporte e comercialização de material genético; reduz os custos com o processo de aquisição de animais, diminui os riscos de doenças; evita a perda de animais durante o transporte (GUIGNOT et al., 2006); alivia o problema da disponibilização de receptoras, através da criopreservação dos embriões colhidos excedentes ao número de receptoras e facilita a formação de bancos de germoplasma para preservar determinadas espécies ou raças (SILVA & METELO, 2005). O método de criopreservação de embriões de mamíferos foi desenvolvido durante a década de 70 para camundongos e bovinos. Desde então, testes são realizados para criopreservar embriões de diversas espécies 8 e raças, bem como de diferentes estágios de desenvolvimento e para aqueles considerados mais sensíveis como os produzidos in vitro, clonados ou biopsiados (MASSIP, 2001). As baixas temperaturas utilizadas na preservação de embriões têm a finalidade de manter o metabolismo celular em estado de quiescência, conseqüentemente, a atividade enzimática intracelular envolvida no metabolismo e respiração celular é estagnada, permitindo a conservação de células e tecidos por tempo indeterminado (GREEN, 2007). O princípio fundamental da criopreservação se baseia na necessidade de remoção máxima de água das células antes da congelação, evitando a formação de grandes cristais de gelo que resultam em diversos danos intracelulares. O crioprotetor permeável (baixo peso molecular) promove esta desidratação das células embrionárias através da diminuição do ponto de solidificação e a formação de gelo extracelular se inicia entre -5ºC e -15ºC, porém as células continuam descongeladas e super resfriadas. O gelo extracelular formado provoca aumento da concentração de solutos fora do embrião. Deste modo, as células se desidratam até que as concentrações totais de solutos dentro e fora estejam em equilíbrio, o qual é atingido quando o embrião retorna ao seu volume anterior em meio isotônico (PALASZ & MAPLETOFT, 1996; GREEN, 2007). Os crioprotetores permitem que o ponto de congelação do meio seja abaixado do ponto de congelação da água. Deste modo, em temperaturas menores que -20ºC, as soluções podem sofrer um super-resfriamento, sem a formação de gelo, impedindo a desidratação celular adequada. Com isso, grandes cristais de gelo podem se formar intra e extracelularmente. Neste sentido, a indução de cristalização (“seeding”) é necessária e realizada entre - 5ºC e -7ºC para evitar a formação de gelo pré-congelação (PALASZ & MAPLETOFT, 1996; GREEN, 2007). Os agentes crioprotetores podem ser classificados em: de baixo peso molecular (PM) e permeáveis; de baixo PM e não permeáveis e de alto PM e não permeáveis. Os permeáveis de baixo PM são solutos orgânicos capazes de atravessar a membrana plasmática, conferindo proteção das organelas, durante o resfriamento e descongelação (BEGIN et al., 2003). Além disso, por substituírem osmoticamente a água intracelular nas células embrionárias, antes 9 da congelação, reduzem as alterações de volume e formação de cristais de gelo intracelulares. Esta habilidade de atingir o meio intracelular está ligada ao baixo PM do crioprotetor. Os mais comumente utilizados são metanol (PM: 32,0), etilenoglicol (EG, PM: 62,1), 1,2 propanadiol (PM: 76,1), dimetilsulfóxido (DMSO, PM: 78,1), 2,3 butanadiol (PM: 90,1), glicerol (PM: 92,1) e outros alcoóis (PALASZ & MAPLETOFT, 1996). Os crioprotetores extracelulares, sejam os de baixo (galactose, PM: 180,2; glicose, PM: 181,1; sucrose, PM: 342,3; trealose, PM: 378,3 e outros açúcares) ou de alto PM (> 50000 dáltons, como polivinilpirrolidona, PVP; álcool polivinil, dentre outros polímeros) são macromoléculas e açúcares não permeáveis cujas funções são reduzir a formação de gelo, facilitar a desidratação das células antes da congelação, proteger a integridade da membrana celular e auxilar na reidratação celular (PALASZ & MAPLETOFT, 1996; MASSIP, 2001). A concentração e a composição do crioprotetor, e o procedimento de descongelação são fatores que influenciam na sobrevivência dos embriões (SILVA & METELO, 2005). Além disso, a eficiência da proteção celular pode ser aumentada, durante a congelação/vitrificação, através da combinação de crioprotetores de baixo PM permeáveis e não permeáveis, pelo fato deste último reduzir a concentração dos crioprotetores intracelulares, diminuindo a toxicidade celular (PALASZ & MAPLETOFT, 1996; MASSIP, 2001). Entretanto, os crioprotetores podem levar a toxidade química e osmótica das células, provocando alterações em macromoléculas. Os embriões, quando em contato com EG, sofrem rápida contração e expansão, como resultado das mudanças na osmolaridade do meio com crioprotetor. Este choque osmótico é responsável por parte das lesões embrionárias (SILVA & METELO, 2005). Alterações ultra-estruturais também são relatadas em embriões criopreservados, tais como defeitos nas microvilosidades da membrana plasmática, edema de mitocôndria, acúmulo de debris celulares e redução nas junções de contato entre as células do trofoblasto (FAIR et al., 2001). 10 2.2.1 Congelação lenta A congelação lenta consiste em um processo físico em que as células embrionárias são desidratadas progressivamente através da ação de soluções crioprotetoras, provocando decréscimo no ponto de congelação da célula, limitando assim a formação de cristais de gelo intracelular (MASSIP, 2001). As taxas de prenhez com embriões produzidos in vivo congelados podem alcançar 60 a 70% (SOMMERFELD & NIEMANN, 1999). Primeiramente, a técnica foi desenvolvida para embriões de camundongos por Wittingham, em 1971. Posteriormente, em 1973, foi aplicada a embriões bovinos produzidos in vivo (revisado por MASSIP, 2001), sendo que, atualmente, a maioria dos embriões de mamíferos é criopreservada por este método. São utilizados crioprotetores de permeabilidade lenta e em baixas concentrações, induzindo a cristalização, controlando a taxa de resfriamento lenta (0,2ºC a 2,0ºC/min) até -30ºC a -70ºC e imergindo em nitrogênio líquido (- 196ºC). A descongelação é de forma controlada (250ºC/min) também (MASSIP, 2001). Esta técnica expõe os embriões a várias fases de congelação, sofrendo interferência de fatores físicos, químicos e biológicos. Tais efeitos podem resultar em lesões na zona pelúcida, membranas celulares, citoesqueleto e distúrbios metabólicos, ocasionando perda do controle celular e eventualmente apoptose ou necrose. Estas alterações estão ligadas à formação de cristais intracelulares que ocorrem sob condições específicas de congelação e descongelação (FAIR et al., 2001). 2.2.2 Vitrificação A vitrificação, por longo tempo, tem sido uma alternativa aos métodos convencionais de criopreservação, cujo primeiro uso para embriões de mamíferos foi em 1985, feito por Rall e Fahy e posteriormente, 1986 e 1989 por Massip e colaboradores. Este procedimento envolve o uso de crioprotetores mais concentrados com a finalidade de aumentar a viscosidade dos meios intra e extracelulares e uma taxa de resfriamento de 20000 a 25000ºC/min ou mais. Desta forma, permite a passagem do conteúdo embrionário do estado líquido 11 ao estado vítreo (gel amorfo) sem a formação de cristais de gelo intra e extracelularmente (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al., 1995; DOBRINSKY, 2002; LOPATAROVA et al., 2002; SILVA & METELO, 2005). Devido às altas concentrações dos crioprotetores utilizadas nesta técnica, pode-se observar efeito de toxicidade ao embrião. Entretanto, tal fato pode ser minimizado pela exposição rápida aos crioprotetores e às altas taxas de resfriamento, proporcionando passagem direta pela zona perigosa de resfriamento entre +15ºC e -5ºC (VAJTA et al., 1998; VISINTIN et al., 2002). As soluções de diluição comumente utilizadas na vitrificação possuem alta osmolaridade para prevenir a rápida reidratação que leva ao edema e lesões celulares, devido ao influxo de água ser mais rápido do que o efluxo do crioprotetor (VAJTA et al., 1998). A reidratação e a perda do crioprotetor ocorrem simultaneamente enquanto os embriões são expostos a soluções com concentrações decrescentes até que as condições isosmóticas sejam restabelecidas (EL-GAYAR et al., 2008). Deste modo, na vitrificação, os efeitos osmóticos e tóxicos ao aquecimento dos embriões criopreservados são minimizados pela imersão da palheta contendo o embrião na solução de desvitrificação (LOPATAROVA et al., 2002). Existem diversas técnicas de vitrificação, tais como: grades de microscopia eletrônica, capilares de vidro, palhetas abertas (open pulled straw, OPS), “cryoloops” (alça de “nylon” com fina camada de solução de vitrificação), superfície sólida (vitrificação dos ovócitos/embriões em contato direto com uma superfície sólida resfriada a -150ºC a -180ºC) e “cryotop” (vitrificação realizada na superfície de uma haste de plástico). Estas metodologias são usadas para reduzir o volume da solução de vitrificação onde os ovócitos ou embriões ficam contidos (BEGIN et al., 2003). A vitrificação em OPS foi originalmente desenvolvida por Vajta et al. (1997) para embriões bovinos e é amplamente utilizada. Baseia-se na redução do diâmetro e da espessura da parede para aproximadamente a metade do tamanho original das palhetas de 0,25 mL. Desta forma há o aumento da relação área de superfície e volume, obtendo-se pequena quantidade de meio envolvendo o embrião (cerca de 1 a 2 μL), e uma aceleração na taxa de resfriamento para mais de 10 vezes (acima de 20000ºC/min), comparada à da palheta regular (2500ºC/min), quando se faz a imersão das palhetas em 12 nitrogênio líquido, e menores danos tóxicos e osmóticos são observados (VAJTA et al., 1998; DOBRINSKY, 2002). Através do uso da OPS, há o risco de contaminação do embrião pelo contato direto com o nitrogênio líquido. Entretanto, isto pode ser eliminado pela filtragem do nitrogênio em filtros com poros de 0,2 µm de tamanho; realização da vitrificação em vapor de nitrogênio concentrado (-170ºC); fechamento das extremidades da palheta, ou mesmo, a lavagem repetitiva dos embriões desvitrificados em meio de cultivo reduzindo a chance de contaminação (KONG et al., 2000; LOPATAROVA et al., 2002). A vitrificação é empregada principalmente para embriões produzidos in vitro, pois estes são mais sensíveis a diminuição de temperaturas do que os produzidos in vivo (SOMMERFELD & NIEMANN, 1999). Apesar de pouco difundida a campo, alguns estudos demonstraram que esta técnica de criopreservação pode ser utilizada com sucesso para embriões bovinos sem redução significativa nas taxas de prenhez (DOBRINSKY, 2002). Dattena et al. (2000) compararam a sobrevivência pós-transferência de embriões derivados de ovelhas superovuladas e de blastocistos produzidos in vitro vitrificados com glicerol e EG, em palhetas de 0,25 mL e embriões frescos. Não encontraram diferenças nas taxas de prenhez entre os embriões vitrificados e frescos. Da mesma forma, Ptak et al. (1999) não observaram diferença na taxa de prenhez quando compararam embriões de ovelhas produzidos in vitro frescos ou vitrificados, apesar da menor taxa de nascimento encontrada para embriões vitrificados. Por outro lado, a vitrificação em OPS resultou em diminuição da taxa de prenhez para embriões ovinos vitrificados quando comparados com embriões não criopreservados transferidos, sendo tal efeito mais pronunciado em embriões produzidos in vitro (5%, 2/40 vs 54,3%, 19/35) do que nos desenvolvidos in vivo (50%, 5/10 vs 90%, 9/10; PAPADOPOULOS et al., 2002). Os resultados inferiores encontrados para embriões vitrificados podem ser explicados pelos seguintes achados: riscos de toxicidade atribuída a altas concentrações dos crioprotetores utilizados (SOMMERFELD & NIEMANN, 1999); maiores alterações na ultra-estrutura pós desvitrificação, com sinais de danos osmóticos nas células embrionárias (DARVELID et al., 1994); redução drástica do número de células da massa interna celular, sem alterar as células 13 do trofectoderma em relação àquelas dos embriões frescos, sendo que os embriões vitrificados que levam a gestação a termo são aqueles que contêm quantidade suficiente de células na massa interna celular (GÓMEZ et al., 2009); rompimento da zona pelúcida que é um fenômeno comum quando os embriões são rapidamente resfriados ou descongelados nas palhetas. Entretanto, Vajta et al. (1998) afirmam que com a vitrificação em OPS este tipo de defeito é raro de ocorrer, apesar do aumento nas taxas de resfriamento e desvitrificação. A otimização de técnicas de transferência direta de embriões bovinos vitrificados para receptoras é de fundamental importância por trazer uma maior praticidade, simplicidade e disseminar seu uso a campo e comercialmente, uma vez que reduz o tempo requerido para manipulação de embriões para transferência, elimina a necessidade de equipamento e treinamento técnico. Taxas de prenhez de embriões vitrificados transferidos diretamente são próximas ao método de remoção do crioprotetor previamente à transferência dos embriões em bovinos e ovelhas, respectivamente (LEWIS et al., 1999; GREEN et al., 2008a). Guignot et al. (2006) utilizando o método de transferência direta para embriões caprinos vitrificados em glicerol e EG observaram a mesma proporção de receptoras prenhes/transferidas em relação aos embriões submetidos à diluição antes da transferência, além disso, a taxa de nascimento foi maior para o grupo de embriões transferidos diretamente. 2.2.3 Vitrificação versus congelação lenta de embriões Ao se comparar as duas técnicas de criopreservação, a vitrificação é considerada um procedimento simples, apesar de necessitar de um treinamento técnico mais aperfeiçoado. Além disso, menor tempo é requerido para equilíbrio das soluções de vitrificação e o embrião, perfazendo todo o procedimento menos de 25 min, sem necessitar de equipamento (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al., 1995; LOPATAROVA et al., 2002). Por outro lado, a congelação clássica possui duração de aproximadamente 60 a 90 min e requer equipamento específico (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al., 1995; LOPATAROVA et al., 2002). A utilização de pequenos volumes da 14 solução de vitrificação juntamente com a imersão direta da palheta no nitrogênio líquido proporciona um resfriamento extremamente mais rápido em relação à congelação, conseqüentemente espera-se a redução de fraturas celulares (BEGIN et al., 2003). Devido à diversidade de técnicas utilizadas para vitrificação e conseqüentemente a dificuldade na padronização destas, os resultados encontrados quando se compara à técnica de congelação convencional tornam-se difíceis de serem aplicados. Neste sentido, há relatos variáveis de taxa de prenhez e desenvolvimento embrionário in vitro para estas técnicas de criopreservação, além de encontrar escassa literatura comparando tais técnicas em embriões produzidos in vivo. No estudo de Lopatarova et al. (2002) foi demonstrada a mesma taxa de eclosão, avaliada pelo cultivo in vitro por 72 h, para embriões bovinos produzidos in vivo vitrificados em OPS ou congelados convencionalmente, independente do grau de qualidade. Entretanto, embriões expandidos apresentaram resultados melhores na vitrificação. Como Lopatarova et al. (2002) testaram o desenvolvimento de embriões provenientes de vacas superovuladas pós vitrificação em OPS e congelação, somente em condições in vitro; em 2006, Lopatarova e colaboradores avaliaram a taxa de sobrevivência destes embriões em receptoras. Entretanto, um baixo número de receptoras por grupo foi utilizado. As taxas de prenhez para embriões vitrificados ou congelados de diferentes estágios (mórula, blastocisto inicial e blastocisto expandido) bem como os de grau 1 e 2 vitrificados não diferiram. Da mesma forma, Guignot et al. (2006) compararam a taxa de sobrevivência de embriões provenientes de cabras superovuladas, os quais foram submetidos à vitrificação em glicerol e EG ou à congelação lenta. Estes autores não observaram diferença entre as técnicas de criopreservação após a transferência para receptoras: 69% (18/26) vs 48% (14/29) para proporção de receptoras prenhes/transferidas e na taxa de nascimento, 45% vs 35% para embriões congelados e vitrificados, respectivamente. A viabilidade de embriões ovinos produzidos in vivo criopreservados pelo método de vitrificação em OPS ou congelação tradicional, comparando dois métodos (direto e indireto) de transferência dos embriões pós- 15 aquecimento foi avaliada (GREEN et al., 2008a). A taxa de prenhez em receptoras inovuladas com embriões a fresco foi de 50%, sendo similar às taxas encontradas para embriões congelados (38,6%) e vitrificados (55,8%). No entanto, embriões vitrificados e inovulados pela técnica direta (57,1%) resultaram em maior taxa de gestação que os embriões congelados (34,8%, P = 0,07; GREEN et al., 2008a). Os embriões produzidos em cabras foram vitrificados em OPS e avaliados antes da transferência e não apresentaram defeito morfológico, enquanto que, os embriões congelados convencionalmente não alcançaram a completa re-expansão. As taxas de prenhez aos 40 dias e sobrevivência embrionária foram diferentes para embriões congelados (58%, 7/12 e 42%, 10/24), respectivamente e para embriões vitrificados (100%, 14/14 e 64%, 18/28; EL-GAYAR & HOLTZ, 2001). Dinnyés et al. (1996) avaliando a criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro relataram que a taxa de sobrevivência em 24 h de cultivo foi superada por blastocistos expandidos vitrificados (92%) em relação aos congelados (65%), apesar de que a taxa total de sobrevivência dos embriões criopreservados foi significativamente menor do que os embriões controle. Após 72 h de cultivo in vitro, a taxa de sobrevivência do grupo vitrificado foi numericamente maior, entretanto não houve diferença estatística quando comparado ao grupo congelado. Houve similaridade também para a taxa de eclosão dos grupos criopreservados. Estes autores observaram que a adesão dos embriões eclodidos dos grupos vitrificado e controle ao tapete celular foi menor que a adesão do grupo de embriões congelados, entretanto a proliferação da massa celular interna para os embriões presos à camada celular do meio de cultivo pode ser relacionada com sobrevivência embrionária. Por outro lado, embriões de ovelhas desenvolvidos in vitro foram vitrificados (propilenoglicol e glicerol) ou congelados (glicerol e sucrose) e posteriormente o desenvolvimento in vitro foi avaliado. Mórulas e blastocistos congelados (31% e 67%) mostraram maiores taxas de desenvolvimento do que os vitrificados (12% e 19%; De PAZ et al., 1994). Silva & Metelo (2005) relacionaram alterações físicas na zona pelúcida com a viabilidade de embriões bovinos produzidos in vitro submetidos à congelação lenta ou à vitrificação (utilizando EG, ficol e sucrose). Maior 16 viabilidade foi obtida para embriões provenientes do grupo de embriões frescos, seguida dos congelados e por último, dos embriões vitrificados. O número total de poros observados na zona pelúcida foi maior para embriões controle do que os do grupo dos congelados e vitrificados, apesar de que, os poros dos embriões vitrificados foram de tamanho menor. Isto foi associado com o comprometimento da viabilidade embrionária causado pela falha da barreira em proteger o embrião contra patógenos e pela menor interação entre células epiteliais maternas e embrionárias. 2.3 Ácidos graxos Os ácidos graxos poliinsaturados (AGP) possuem mais de uma ligação dupla na molécula e são classificados em três grupos com base na estrutura química: ômega-3 (n-3), ômega-6 (n-6) e ômega-9, sendo que a primeira ponte dupla está localizada nos carbonos 3, 6 e 9 , respectivamente. Os animais não sintetizam n-3 e n-6, por não terem as enzimas dessaturases apropriadas para inserir as duplas ligações na posição correta (STAPLES et al., 1998; WATHES et al., 2007). As principais famílias de ácidos graxos que afetam a fertilidade são n-3 e n-6. O ácido linoléico dietético, abundante nos óleos vegetais, é um dos representantes da família n-6 (WATHES et al., 2007), o qual é convertido em ácido aracdônico, precursor das prostaglandinas dienóicas, como a PGF2α. As mesmas enzimas, elongase e dessaturase, que atuam na conversão do ácido linoléico em aracdônico, também convertem o principal ácido graxo n-3, o ácido linolênico a ácido eicosapentaenóico (EPA), precursor das prostaglandinas trienóicas, como PGF3α. Há uma competição entre precursores n-3 e n-6 para dessaturação e elongação e pelo sítio da enzima prostaglandina endoperóxido sintetase (PGHS), assim o aumento de ácidos graxos n-3, na dieta diminuirá a produção de prostaglandina dienóica (PETIT et al., 2002; WATHES et al., 2007). Por outro lado a produção de PGF2α pode ser aumentada ao se produzir mais ácido aracdônico (STAPLES et al., 1998). O ácido linoléico também inibe a síntese de PGF2α por um mecanismo de competição com ácido aracdônico em se ligar à enzima PGHS, a qual é requerida para a conversão de ácido aracdônico à PGF2α. Além disso, o ácido 17 linoléico pode ser convertido em EPA quando há excesso de ácido linoléico, provocando redução na síntese de prostaglandinas das séries 1 e 2 (STAPLES et al., 1998; THATCHER & JENKINS, 2002; RAES et al., 2004; WATHES et al., 2007). A este efeito negativo do ácido linoléico na síntese de PGF2α, associam-se também reduções nas concentrações de estradiol intrafolicular e plasmática, refletindo nas concentrações de prostaglandinas (RAES et al., 2004). 2.4 Gordura protegida ruminal O fluxo de ácidos graxos é menor do que a ingestão, devido à porcentagem de hidrogenação ruminal, ou seja, saturação dos ácidos graxos insaturados da dieta, que representa cerca de 80% para o ácido linoléico e 92% para o linolênico (DOREAU & CHILLIARD, 1997; RAES et al., 2004). Através deste processo, os microrganismos incorporam os ácidos graxos em sua composição lipídica (STAPLES et al., 1998). Numerosas tentativas foram feitas para limitar os efeitos da hidrogenação de lipídios no rúmen e seus distúrbios na digestão dos carboidratos, através de diferentes técnicas de proteção da gordura, tais como, métodos de proteção natural (óleo de sementes); tratamentos químicos por formaldeído e sais de cálcio (saponificação) para encapsulação da gordura e tratamento físico através do aumento do ponto de fusão ou diminuição da granulometria da gordura. Uma dessas técnicas, elaborada em 1984, foi a associação de cálcio e ácidos graxos, comumente chamada de sais, como exemplo, o Megalac® (DOREAU & CHILLIARD, 1997). Este produto é uma gordura granular composta de sais de cálcio de óleo de palma ou de soja e contém ácidos graxos saturados, tais como ácidos graxos palmítico (óleo de palma), esteárico e poliinsaturados de cadeia longa, como o linoléico e linolênico (ARM & HAMMER, s. d.; FUNSTON, 2004). Esta gordura protegida é obtida a partir de ácidos graxos de cadeia longa que ficam livres no processo de cisão dos triglicérides de óleos vegetais. Estes ácidos graxos reagem com sais de cálcio, formando um sal, popularmente conhecido como sabão de cálcio (ARM & HAMMER, s. d.). Este tipo de gordura, por ser um produto altamente estável em água e alta temperatura, somente é digerido 18 no animal, em meio ácido. No rúmen, o meio é ligeiramente ácido (pH = 6,2), o que faz com que ele permaneça inalterado. Ao chegar ao abomaso, cujo meio é extremamente ácido (pH = 2 e 3), ocorre o desdobramento do Megalac® com a liberação dos ácidos graxos e íons de cálcio para o intestino, que serão absorvidos e levados pela corrente sangüínea (ARM & HAMMER, s. d.). A suplementação da dieta com gorduras protegidas ajuda a repor os ácidos graxos essenciais (linoléico e linolênico) perdidos, importantes no desempenho reprodutivo por terem diversas ações tais como: são precursores das prostaglandinas (ARM & HAMMER, s. d.; PETIT et al., 2002) e agem no corpo lúteo, ovócitos e embriões e na secreção de LH e de hormônios esteróides (STAPLES et al., 1998; MATTOS et al., 2004; WATHES et al., 2007). 2.5 Efeito dos Ácidos Graxos 2.5.1 Puberdade, estação de monta e pré-parto Em alguns estudos relatados por Raes et al. (2004) foi observado um maior número de novilhas entrando em puberdade no começo da estação de monta, quando receberam dietas isoenergéticas e ricas em ácidos graxos. Talvez pelo fato dos ácidos graxos circulantes no sangue estimularem os neurônios que sensibilizam aqueles produtores de GnRH (SENGER, 1999). Bagley (1993) mencionou também que novilhas alimentadas com baixa energia na dieta tiveram maior idade à puberdade e menores níveis de progesterona do que aquelas que receberam dieta com alta quantidade de energia. Block et al. (2003) alimentaram bezerras holandesas de 3 a 5 meses de idade com ração suplementada com sais de cálcio de gordura de palma ou ácido linoléico conjugado e o tipo de gordura não teve efeito na idade à puberdade. Há poucos estudos com suplementação com ácidos graxos para novilhas, pois em geral, as novilhas dos experimentos estão num plano nutricional adequado e desenvolvem ótimo peso. Apesar disso, geralmente possuem uma boa reposta à suplementação. Em relação à suplementação de ácidos graxos em dietas isoenergéticas, antes da estação de monta foi observado o aumento do número de vacas 19 ciclando no começo deste período (RAES et al., 2004). A gordura fornecida na dieta de vacas prenhes também influenciou na composição de ácidos graxos do líquido amniótico e na membrana lípídica do intestino do feto, em ratos (CLANDININ et al., 1991). Dietas lipídicas fornecidas no pré-parto melhoraram a sobrevivência de bezerros no parto. Isto ocorre devido ao aumento na atividade do tecido adiposo marrom que é essencial à regulação da temperatura dos recém-nascidos (LAMMOGLIA et al., 1999). 2.5.2 Prenhez Vários estudos relatados por Thatcher & Jenkins (2002) mostraram que vacas lactantes suplementadas com Megalac® em dietas isoenergéticas obtiveram maiores taxas de concepção do que aquelas que não foram suplementadas. Da mesma forma, Ferguson et al. (1990), Sklan et al. (1991), Scott et al. (1995) e Garcia-Bojalil et al. (1998) relataram que vacas de leite suplementadas com Megalac® (8% de ácido linoléico) na lactação apresentaram melhorias na concepção. Outros pesquisadores (RAES et al., 2004) trabalhando com suplementação de gordura para vacas no pós-parto observaram menor tempo para reinício da ciclicidade e melhores taxas de concepção. Petit et al. (2002) estudaram os efeitos dos tipos de gorduras ricas em ácidos graxos n-3 (Megalac®; linhaça tratada com formaldeído; uma mistura de óleo de peixe e linhaça tratada com formaldeído e um grupo alimentado com concentrado sem gordura, mas receberam 500 g por dia de óleo de linhaça infundida no duodeno) na secreção de prostaglandina em vacas lactantes. Observaram que o aumento da proporção de ácidos n-3 em relação aos n-6 diminuiu a síntese de PGF2α. Os efeitos positivos das gorduras na função reprodutiva ocorrem devido ao aumento no balanço energético, aumento nas concentrações de colesterol e progesterona plasmáticos, mudanças na dinâmica folicular e alterações na secreção de prostaglandina. Neste experimento, as vacas tiveram ingestão de matéria seca, produção de leite e peso corporal similares, sugerindo que o balanço energético não foi o responsável pelos efeitos. A concentração do metabólito da PGF2α, PGFM, quando se aplicou ocitocina, foi menor para vacas submetidas às dietas com 20 ácido linolênico, o que pode ter contribuído para maiores taxas de gestação, através da redução da luteólise e aumento do diâmetro do corpo lúteo de vacas que receberam quantidade moderadas de ácidos graxos n-3. As taxas de concepção 24 dias pós-IA foram maiores para vacas de leite suplementadas com ácido linolênico do que linoléico, mostrando uma alta taxa de sobrevivência embrionária inicial e menor perda de prenhez para vacas alimentadas com linhaça (AMBROSE et al., 2006). Lopes et al. (2007) em um experimento realizado no Brasil, avaliaram os efeitos da adição de gordura protegida ruminal, Megalac-E® (sal de cálcio de ácidos graxos de cadeia longa, com 40% de ácido linoléico) à suplementação mineral protéica na resposta reprodutiva de primíparas Nelores a pasto por 31 dias, após a Inseminação Artificial em Tempo Fixo (IATF). Para isto, distribuíram os animais em dois grupos: um recebendo suplementação mineral protéica e Megalac-E® (n = 200) e um grupo controle recebendo suplementação mineral protéica sem Megalac-E® (n = 211), porém as dietas não foram isoenergéticas. As vacas foram submetidas ao protocolo de IATF e os bezerros foram removidos por 48 h e retornaram após IATF. O índice de concepção das primíparas suplementadas com Megalac-E® foi superior (56,5%) ao grupo não suplementado (45,6%). Os autores acreditam que este resultado foi devido ao papel do ácido linoléico em suprimir a síntese de PGF2α no útero e conseqüentemente prevenir a morte embrionária. Durante o experimento, os bezerros tiveram acesso ao cocho com a suplementação mineral protéica, e foi observado aumento numérico no ganho de peso dos bezerros das primíparas suplementadas com Megalac-E® (27,4 Kg contra 16,9 Kg dos bezerros que não tiveram acesso à suplementação com Megalac-E®). Estes dados sugerem que há necessidade de experimento para se avaliar o efeito da suplementação com Megalac-E® na produção de leite em vacas de corte e no ganho de peso dos bezerros. Posteriormente, foi realizado outro experimento para avaliar o efeito de duas dietas isoenergéticas contendo dois tipos de gorduras protegidas (Megalac-E®, predominância de ácido graxo linoléico ou Megalac®, ácido graxo saturado) na taxa de prenhez em vacas Nelores (n = 583), as quais receberam tais dietas do dia da IA até o diagnóstico de gestação (28 dias pós IA). Para os animais alimentados com Megalac-E® observou-se maior aumento na taxa de 21 prenhez (48,2%, 81/168) do que os suplementados com Megalac (33,9%, 58/177; P < 0,05) e mineral protéico (26,4%, 63/238; P < 0,01); tal resultado pode ser explicado pela diferença no perfil de ácidos graxos entre os tratamentos (LOPES et al., 2008). Dieta com semente de girassol foi fornecida a vacas Nelores pós-parto (n = 133) do momento da IA até 22 dias após o protocolo e observou-se aumento de 20,4% na taxa de concepção e redução na mortalidade embrionária para vacas que receberam esta dieta. Provavelmente, a semente de girassol por ser rica em ácido linoléico, limitou a síntese de PGF2α (PERES et al., 2008). Adicionando Megalac-E® à suplementação mineral protéica de receptoras mestiças (n = 288) do início do protocolo de sincronização até o 52º dia após a transferência de embriões, houve acréscimo na taxa de concepção de 12% (48,7% vs 36,7%) em relação ao grupo controle (n = 207; RODRIGUES JUNIOR, 2008). O incremento encontrado nas taxas de concepção e prenhez pode estar ligado a alterações causadas pelos AGP que influenciam a dinâmica ovariana, bem como a viabilidade ovocitária, proporcionada pela ovulação de um folículo maior ou mesmo à atenuação da secreção de PGF2α, durante o período de reconhecimento materno-fetal ou envolvimento direto dos ácidos graxos em mecanismos embriotróficos (AMBROSE et al., 2006). Staples et al. (1998) apresentaram alguns efeitos negativos da alimentação com gordura inerte na atividade ovariana, como maior incidência de vacas no anestro, cisto e a não manifestação de estro. Entretanto, estes achados foram relatados em um número pequeno de trabalhos e podem estar associados à alta produção de leite. Por outro lado, a infusão de ácido graxo linoléico em novilhas pós-parto não influenciou retorno à ciclicidade, taxa de prenhez ou intervalo de partos, apesar de resultar em concentrações de ácido linoléico mais altas e em aumento da capacidade de produção de PGF2α (FILLEY et al., 1999). Spicer et al. (1993) também observaram que dietas controle ou com gordura não afetaram o intervalo de ovulações ou estros, no pós-parto. A taxa de prenhez aos 28 ou 45 dias pós IA não diferiu para vacas de leite que receberam dietas 22 ricas em ácidos graxos n-9 cis (18:1c, oléico), n-9 trans (18:1t), n-6 (18:2, linoléico, Megalac-R) ou n-3 (18:3, linolênico; BILBY et al., 2006a). A maioria dos estudos apresentados por Staples et al. (1998) relata efeito positivo da suplementação de gordura nas taxas de concepção e prenhez. Entretanto, a suplementação com sementes de linhaça (rica em ácido graxo linolênico), girassol (composta de ácido graxo linoléico) ou controle por 25 dias antes do início do programa de sincronização até 50 dias após não influenciou na taxa de prenhez. Talvez, pelo não processamento das sementes oleaginosas, ocasionando absorção insuficiente de ácidos graxos para provocar efeito na reprodução (COLAZO et al., 2004). A grande variedade de resultados na taxa de concepção encontrada na suplementação de AGP pode ser explicada por falha de delineamento experimental, principalmente no que diz respeito ao número insuficiente de animais utilizados (WATHES et al., 2007). 2.5.3 Concentração sanguínea de hormônios e outras substâncias Em revisão realizada por Raes et al. (2004) foi documentado o efeito dos suplementos lipídicos nas concentrações dos hormônios metabólicos. Alguns autores observaram que o consumo de óleos poliinsaturados de plantas aumenta as concentrações de insulina, GH, glicose, ácidos graxos não esterificados e IGF-1 (fator de crescimento semelhante à insulina), em vacas e novilhas de corte e leite. Entretanto, há autores que não encontraram diferenças nas concentrações destes hormônios em vacas e novilhas suplementadas com lipídios. Thomas et al. (1997) avaliaram a influência de dietas isoenergéticas com composições diferentes de ácidos graxos na concentração de insulina e GH, em vacas de corte. A dieta suplementada com AGP provocou aumento nas concentrações de insulina entre a segunda e sétima semanas de suplementação, em relação à dieta controle. Já as outras dietas, suplementadas com ácidos graxos saturados e altamente poliinsaturados aumentaram as contrações de insulina somente depois da sexta ou sétima semana de alimentação. Todas as dietas lipídicas elevaram a concentração de GH, colesterol e IGF-1 intrafolicular nos folículos grandes. Os autores 23 concluíram que o consumo de AGP estimula o crescimento folicular, devido ao aumento nas concentrações de substâncias envolvidas na foliculogênese. Childs et al. (2008a) em um estudo comparando diferentes níveis de AGP linolênico em dietas isoprotéicas e isoenergéticas fornecidas por 14 dias antes da sincronização do ciclo estral, em novilhas de corte, constataram aumento nas concentrações plasmáticas de IGF-1. Para todas as dietas, independente do nível de ácido linolênico, houve aumento da concentração do EPA e diminuição do linoléico no endométrio e no fluido folicular, mostrando que existe uma correlação forte e positiva entre as concentrações plasmática, folicular e endometrial de AGP. Valores de IGF-1 foram maiores para vacas alimentadas com dieta composta de ácido graxo linoléico, em comparação às concentrações de dietas controle e rica em linolênico. Porém, as concentrações de insulina não foram afetadas pela dieta (ROBINSON et al., 2002). Em outros trabalhos, entretanto, as concentrações de IGF-1 e GH não apresentaram diferenças para os grupos de vacas que foram submetidos à ovum pick up (OPU; aspiração folicular guiada por ultra-som) e receberam dietas ricas em ácidos graxos n-9 cis (18:1c, oléico), n-9 trans (18:1t), n-6 (18:2, linoléico, Megalac-R) ou n-3 (18:3, linolênico; BILBY et al., 2006a). Em estudo recente, Childs et al. (2008b) compararam dietas com ácido saturado ou AGP n-3, isoenergéticas e isoprotéicas, fornecidas por 50 dias antes do protocolo de superestimulação para novilhas de corte e não observaram diferenças nas concentrações de insulina e IGF-1 para ambos tratamentos. Da mesma forma, Thangavelu et al. (2007) não encontraram diferença nas concentrações de insulina, em vacas que receberam dieta rica em ácido linoléico, linolênico ou saturado. Ponter et al. (2006a) também não observaram efeito nas concentrações de insulina e IGF-1 para novilhas de leite suplementadas a base de soja (rica em ácido linoléico) ou linhaça (rica em ácido linolênico). E, em outro trabalho, a concentração de IGF-1 foi similar para vacas alimentadas com dietas controle ou com gordura (SPICER et al., 1993). Dieta lipídica rica em AGP dada a ovelhas anteriormente à concepção (4 semanas) também não interferiu nas concentrações plasmáticas de insulina e IGF-1 (GREEN et al., 2008b). Da mesma forma, vacas que receberam dieta rica em gordura 14 dias antes da OPU não apresentaram diferenças nas 24 concentrações de GH, insulina, IGF-1 e leptina (FOULADI-NASHTA et al., 2007). A concentração de PGFM produzida em resposta à aplicação de ocitocina no dia 15 do ciclo estral foi maior para novilhas de corte que receberam dieta com AGP n-6 comparada a de animais alimentados com dieta de AGP n-3 (CHILDS et al., 2008c). Para animais submetidos à dieta com ácido linolênico também foi observado este aumento em relação àqueles suplementados com dieta sem gordura protegida (CHILDS et al., 2008a). Além da suplementação lipídica com ácido linoléico afetar as concentrações de PGFM no plasma, Scholljegerdes et al. (2007) observaram que os AGP alteram a composição de ácidos graxos no hipotálamo, tecido uterino e oviduto, sendo que este último demonstrou ser o mais sensível à dieta com ácido linoléico, podendo ter potencial para influenciar na fertilidade. A suplementação lipídica pode aumentar as concentrações plasmáticas de esteróides em bovinos, através da ação direta dos AGP no aumento da pulsatilidade de LH, no tamanho do folículo pré-ovulatório, no metabolismo hepático, nas concentrações plasmáticas de colesterol e IGF-1, no conteúdo lipídico das células luteais e na modulação da síntese de prostaglandina (HIGHTSHOE et al.,1991; RYAN et al., 1992; HAWKINS et al.,1995; THOMAS et al., 1997; STAPLES et al., 1998; PETIT et al., 2002; ROBINSON et al., 2002; RAES et al., 2004; CHILDS et al., 2008a.) Suplementação de gordura provoca aumento de colesterol e da lipoproteína que o carreia. Isso se deve, provavelmente, à necessidade de se aumentar a absorção de ácidos graxos e conseqüente transporte destes. Além disso, alguns artigos sugerem que a concentração adicional de colesterol provocada pela alimentação com gordura pode aumentar a síntese de progesterona pelas células foliculares e luteias (STAPLES et al., 1998). Entretanto, alguns trabalhos não mostraram aumento da concentração sérica do colesterol coincidindo com maiores concentrações de progesterona (STAPLES et al., 1998). Como o colesterol é um precursor para síntese de progesterona, o aumento nas concentrações circulantes deste lipídio (RYAN et al., 1992; HAWKINS et al.,1995; THOMAS et al., 1997; ROBINSON et al., 2002) pode levar a um incremento na síntese de progesterona (RYAN et al., 1992; SPICER 25 et al., 1993; RAES et al., 2004; PETIT & TWAGIRAMUNGU, 2006; ADAMIAK et al., 2006; FOULADI-NASHTA et al., 2007), o que está associado a melhores taxas de concepção, em ruminantes. A suplementação com AGP n-3 ou n-6 aumentou a concentração de colesterol (CHILDS et al., 2008ac), porém o diâmetro do CL e as concentrações plasmáticas dos esteróides, em novilhas de corte suplementadas foram similares (CHILDS et al., 2008c). Por outro lado, Ambrose et al. (2006) não encontraram diferença no tamanho do CL e nas concentrações de colesterol e progesterona para grupos de animais que receberam dietas enriquecidas com ácido linoléico ou linolênico, apesar de que o folículo ovulatório foi maior para vacas submetidas à dieta com ácido linolênico. Novilhas de corte submetidas a dietas isoenergéticas e isoprotéicas ricas em lipídios (óleo de soja) não tiveram as concentrações de estradiol afetadas no fluido folicular em relação ao grupo que foi alimentado com dieta sem a adição de gordura, porém apresentaram maiores concentrações de progesterona e aumento da capacidade da granulosa em produzir progesterona (RYAN et al., 1992). Os suplementos lipídicos enriquecidos com ácidos graxos n-9 cis (18:1c, oléico), n-9 trans (18:1t), n-6 (18:2, linoléico, Megalac-R) ou n-3 (18:3, linolênico) não interferiram nas concentrações circulantes de progesterona no começo da sincronização ou durante as sessões de OPU, apesar das dietas tratamentos terem afetado os volumes dos CLs (BILBY et al., 2006a). A secreção de LH e desenvolvimento folicular são regulados pelo estado energético do animal. A energia fornecida pelos ácidos graxos aumenta a secreção de LH e de glicose e esta pode contribuir na liberação de LH. Ambos estimulam o crescimento do folículo pré-ovulatório e aumentam o tamanho deste, resultando na formação de um CL maior com capacidade esteroidogênica maior e, conseqüentemente produção de progesterona mais alta e melhores taxas de concepção (RAES et al., 2004). Hightshoe et al. (1991) encontraram maiores concentrações de colesterol e LH em vacas alimentadas com dietas suplementadas com gordura. Estes autores acreditam que os lipídios provocam diminuição de estradiol e 26 conseqüente diminuição no feedback negativo à adenohipófise e aumento da secreção de gonadotrofinas, como o LH. Vacas alimentadas com dietas ricas em linoléico ou linolênico possuíam maior folículo pré-ovulatório e subseqüente maior CL, entretanto a concentração de progesterona foi similar e não houve alteração na qualidade ovocitária e embrionária (BILBY et al., 2006a). No entanto, um tamanho aumentado do CL em fêmeas alimentadas com AGP não parece ser somente devido à ovulação de um folículo de maior tamanho. Pode estar associado a um efeito direto luteotrófico. Na avaliação de microscopia eletrônica, revelou-se maior conteúdo lipídico nas células luteais de novilhas alimentadas com sais de cálcio de óleo de palma (HAWKINS et al., 1995). Além disso, pela redução na síntese de prostaglandina no endométrio através da suplementação de AGP n- 3 há manutenção do CL e das concentrações de progesterona (WATHES et al., 2007; LEROY et al., 2008) ou mesmo através da produção de PGE, um agente luteotrófico (WATHES et al., 2007). O tamanho do CL foi menor para vacas alimentadas com ácido linoléico comparado àquelas dos grupos suplementados com linolênico ou com óleo de palma, o que pode explicar a menor taxa de prenhez para o grupo com menor CL (PETIT & TWAGIRAMUNGU, 2006). Ao contrário dos resultados normalmente observados, a concentração de progesterona plasmática, no início da fase luteal, foi significativamente menor para vacas de leite que receberam dietas ricas em ácidos graxos n-3 ou n-6 do que o controle (ROBINSON et al., 2002). Ovelhas alimentadas com dieta lipídica rica em AGP tiveram menores concentrações plasmáticas de progesterona e não apresentaram diferença significativa no número de CL em relação aos animais que receberam dieta sem suplementação lipídica (GREEN et al., 2008b). O aumento da progesterona plasmática em vacas alimentadas com dietas suplementadas com gordura pode ser devido ao incremento na síntese ou redução na taxa de metabolismo deste esteróide, no fígado (STAPLES et al., 1998). Para testar o mecanismo pelo qual a inclusão de gordura na dieta aumenta a concentração de progesterona circulante, Hawkins et al. (1995) forneceram sais de cálcio de ácidos graxos de cadeia longa, iniciando 100 dias 27 antes do parto. A concentração de progesterona foi maior para novilhas de corte mantidas nesta dieta, porém as concentrações luteais de progesterona foram similares entre os grupos, indicando que não houve diferença na taxa de secreção de progesterona. Por outro lado, o tempo requerido para desaparecimento da metade da progesterona, após a ovariectomia diferiu, sugerindo que houve redução no clearance hepático, sendo o fator principal que contribuiu para aumentar as concentrações de progesterona, em vacas alimentadas com dieta rica em lipídios. Entretanto, não foi realizado um estudo de maneira precisa para calcular o volume de sangue disponível ao fígado nestas condições. Piccinato et al. (2009) observaram in vitro que ácidos graxos com cadeias de carbono de diferentes comprimentos diminuíram o metabolismo de esteróides. Entretanto, não houve repetição deste resultado in vivo, através da infusão de óleo de linhaça no abomaso, concordando com os resultados de Sartori et al. (2004) que também não comprovaram o efeito dos ácidos graxos na diminuição do metabolismo dos hormônios esteróides. Recentes observações mostram que a insulina plasmática reduz a atividade das enzimas hepáticas envolvidas no metabolismo de esteróides (LEMLEY et al., 2008), e pelo fato da dieta com gordura aumentar as concentrações de insulina plasmática (THOMAS & WILLIAMS, 1996), pode ser uma explicação para o conseqüente aumento nas concentrações plasmáticas de progesterona (LEMLEY et al., 2008). Além disso, os AGPs podem agir competindo com os substratos de ligação a enzimas hepáticas, inibindo desta forma a atividade de catabolismo dos esteróides, no fígado (YAO et al., 2006). O ácido aracdônico pode promover aumento da expressão da proteína STAR, que está envolvida na esteroidogênese, ou mesmo AGP podem regular a esteroidogênese da adrenal e ativar os receptores nucleares PPARs (gene ativador de receptores de peroxissomo), fator de transcrição que também está envolvido na síntese de esteróides nas gônodas (ROBINSON et al., 2002; WATHES et al., 2007). 28 2.5.4 Folículos ovarianos A suplementação dietética com AGP influencia a foliculogênese, promovendo o aumento no número de folículos e no tamanho do folículo dominante ou pré-ovulatório (WATHES et al., 2007). Trabalhos de diversos grupos de pesquisa relataram a influencia positiva de dietas com AGP no número de folículos pequenos (3 a 5 mm; BILBY et al., 2006b; PONTER et al., 2006b); médios (6 a 9 mm; HIGHTSHOE et al., 1991; LUCY et al., 1991; WEHRMAN et al., 1991; RYAN et al., 1992; THOMAS & WILLIAMS, 1996; THOMAS et al., 1997; ROBINSON et al., 2002; BADER et al., 2005); e grandes (> 10 mm; HIGHTSHOE et al., 1991; STAPLES et al., 1998). O aumento no número de folículos ocorreu paralelamente ao aumento nas concentrações de insulina, GH e IGF-1 no fluido folicular (RYAN et al., 1992; THOMAS & WILLIAMS, 1996; BADER et al., 2005), os quais agem na foliculogênese. Estas diferenças no número de folículos foram observadas após 3 a 4 semanas de suplementação, sendo a máxima diferença após 6 e 7 semanas. Gorduras de origem animal (predominantemente ácidos graxos saturados) também aumentam as concentrações de GH, em novilhas de corte, e elevam as concentrações plasmáticas de insulina e o número de folículos de tamanho médio mais lentamente do que fêmeas alimentadas com óleo de plantas. Já o tamanho do folículo dominante à aspiração, o número de corpos lúteos e as concentrações de progesterona não tiveram diferença entre tratamentos (THOMAS & WILLIAMS, 1996). O diâmetro do primeiro folículo dominante foi maior para vacas que receberam dieta rica em ácido graxo linoléico, sendo que as vacas suplementadas com linolênico possuíram diâmetro intermediário, em relação ao controle (ROBINSON et al., 2002). Vacas que receberam infusão de gordura, no abomaso também apresentaram maior tamanho do folículo dominante, além deste ter tido crescimento mais acelerado (STAPLES et al., 1998). Da mesma forma, Staples et al. (2000) mostraram maior tamanho do folículo dominante para vacas de leite suplementadas com ácidos graxos poliinsaturados, em comparação às que receberam ácido oléico na dieta. O folículo pré-ovulatório foi maior para o grupo de animais que receberam ácidos graxos poliinsaturados (n-3 e n-6) na dieta do que o grupo controle (BILBY et 29 al., 2006a). O fornecimento de linhaça (ácido linolênico) também aumentou o tamanho do folículo ovulatório em relação aos animais suplementados com girassol (ácido linoléico; ROBINSON et al., 2002). Além disso, a concentração sanguínea pré-ovulatória de estradiol foi maior para as vacas que receberam dietas ricas em ácidos graxos n-3 do que aquelas alimentadas com dieta controle. Valores intermediários para vacas sob dieta rica em n-6, o que pode estar associada às concentrações de IGF-1 (ROBINSON et al., 2002) e às maiores concentrações de colesterol no fluido folicular e plasma (LEROY et al., 2008). Por outro lado, Ambrose et al. (2006) e Petit & Twagiramungu (2006) não observaram diferença na quantidade de folículos pequenos, médios e grandes; e no tamanho do folículo dominante em vacas de leite suplementadas com dieta rica em ácido linoléico, linolênico ou saturado. Da mesma forma, em vacas de leite alimentadas com sais de cálcio de ácidos graxos linoléico e trans apresentaram diâmetros similares do folículo pré-ovulatório e luteal, em comparação aos animais que receberam óleo de palma (CERRI et al., 2004). Não houve efeito da dieta com AGP n-3 ou n-6 no diâmetro e taxa de crescimento do folículo pré-ovulatório e no volume do CL mensurado no Dia 7 pós-estro, em novilhas de corte (CHILDS et al., 2008c); concordando com Ambrose et al. (2006) que também não observaram efeito da dieta lipídica na taxa de crescimento do folículo dominante não ovulatório, no tamanho do CL e na concentração plasmática de progesterona. 2.5.5 Ovócitos A distribuição de lipídios nos ovócitos se comporta da seguinte forma: aproximadamente 50% de triglicerídios, 29% de fosfolipídios, 20% de colesterol e 10% de ácidos graxos livres. Os ácidos graxos mais abundantes em ovócitos de ruminantes são os ácidos palmítico (C16:0), oléico (C18:1), esteárico (C18:0), e linoléico (C18:2; McEVOY et al., 2000; KIM et al., 2001). Dos componentes dos fosfolipídios, os ácidos graxos saturados estão em maior quantidade do que os AGPs. Destes, a maioria é da série 6, representada principalmente pelo linoléico e aracdônico (McEVOY et al., 2000; LEROY et al., 30 2008). Porém, pouco se tem investigado sobre o efeito dos ácidos graxos dietéticos na qualidade dos ovócitos. A qualidade de ovócitos e embriões está relacionada à composição de ácidos graxos, principalmente a composição da fração fosfolipídica da membrana plasmática, pelo papel importante no desenvolvimento durante e após a fecundação (McEVOY et al., 2000; FOULADI-NASHTA et al., 2007; LEROY et al., 2008). Os ácidos graxos são usados como energia durante o processo de maturação (SORBERA et al., 2001) e competência ovocitária (KIM et al., 2001) e no período de desenvolvimento embrionário até implantação (WATHES et al., 2007), quando há intensa elongação e dessaturação dos ácidos graxos (YAO et al., 1980). Na maturação nuclear e citoplasmática do ovócito, AGPs são requeridos para estrutura, função e metabolismo celular (WATHES et al., 2007). Kim et al. (2001) encontraram menores quantidades de ácido linoléico e aracdônico em ovóctios maturados in vitro do que nos imaturos, provavelmente devido à utilização deste AGP para processo de desenvolvimento ovocitário, já que este ácido graxo não é sintetizado nas células animais. Além disso, sabe- se que o ácido linolênico (WATHES et al., 2007) e linoléico (HOMA & BROWN, 1992) agem no crescimento e diferenciação ovocitária, e na prevenção da quebra da vesícula germinativa e progressão da metáfase II. Por este motivo, ácido graxo 18:2 (linoléico) está em menor concentração em folículos maiores, mostrando que pode influenciar na maturação nuclear, ao contrário dos achados de Bilby et al. (2006a). Adamiak et al. (2006) estudaram a interação da suplementação de ácido graxo (0% vs 6% ácido graxo de sais de cálcio de óleo palmítico) no desenvolvimento de ovócitos pós-fecundação, colhidos de novilhas cruzadas com baixo e moderado ECC. Compararam também a composição de ácidos graxos plasmático, nas células da granulosa (CG) e no complexo cúmulus- ovócito (CCO) e relacionaram com o potencial de desenvolvimento dos ovócitos. Foi relatado que, altas concentrações de ácidos graxos na dieta reduziram o número de blastocistos em novilhas com escore de ECC baixo, mas não no moderado. As alterações induzidas pela dieta no conteúdo de ácidos graxos no plasma e nas CG foram menos aparentes do que nos CCOs. Foi observado também, que há uma captação seletiva de ácidos graxos 31 saturados pelos folículos. Assim, a concentração de ácidos graxos saturados dentro dos CCOs foi elevada, e aumentos posteriores nos teores de ácidos graxos podem ter comprometido o desenvolvimento pós-fecundação, provavelmente por comprometer a fluidez da membrana plasmática. Houve uma redução significativa no conteúdo de AGP n-6 (ácido linoléico e aracdônico) dentro das CCOs de novilhas com ECC moderado comparadas às de ECC baixo, justificando a menor taxa de clivagem de ovócitos para novilhas com moderada condição. Estes ácidos graxos são precursores para síntese de prostanóides e influenciam na ciclooxigenase-2, enzima que é expressa nas células do cúmulus e juntamente com a síntese de prostanóides, é requerida para expansão do cúmulus e maturação ovocitária. Novilhas que receberam gordura protegida aumentaram a quantidade de ácidos graxos total nos ovócitos aspirados, porém isso não houve interferência na qualidade dos embriões (ADAMIAK et al., 2004). Bilby et al. (2006a) avaliaram o efeito de suplementos lipídicos enriquecidos com ácidos graxos n-9 cis (18:1c, oléico), n-9 trans (18:1t), n-6 (18:2, linoléico, Megalac-R) ou n-3 (18:3, linolênico) na qualidade ovocitária e desenvolvimento folicular, entre 5 semanas antes do parto e 15 semanas após parição. Não observaram diferenças no número de folículos aspirados e grau de ovócitos, apesar do número de ovócitos ter se apresentado maior para as vacas alimentadas com ácido graxo oléico. Se neste experimento houvesse um grupo de animais alimentados sem a suplementação lipídica de ácidos graxos talvez tivessem encontrado diferença na qualidade ovocitária. Apesar disso, Zeron et al. (2002) relataram maiores números de ovócitos e melhor qualidade ovocitária em ovelhas suplementadas com sais de cálcio de óleo de peixe por 13 semanas em relação ao grupo controle. 2.5.6 Resposta superovulatória e qualidade embrionária Os embriões de bovinos e suínos possuem maiores quantidades de gotas de lipídios, ao contrário de humanos e roedores. Essas gotas de gordura fornecem energia durante a fecundação e desenvolvimento embrionário inicial. Além disso, causam influência na sensibilidade à criopreservação de embriões, por mudanças na membrana lipídica (KIKUCHI et al., 2002). 32 Kane et al. (1979) mostraram que os ácidos graxos de cadeia longa suportam o crescimento de um zigoto ao estágio de mórula em cultivo in vitro por fornecer energia para o crescimento, bem como por modificar a composição da membrana plasmática. Sendo que, a deficiência de ácidos graxos n-6 em embriões está associada ao retardo no crescimento embrionário (KUBOW & KOSKI, 1995). Embriões acima de quatro células possuem concentrações maiores de ácidos graxos insaturados, como ácidos linoléico e oléico, em relação aos saturados, pois os AGPs são componentes da membrana lipídica e aumentam rapidamente com a divisão celular embrionária. Adicionalmente, embriões de qualidade excelente e de desenvolvimento avançado também possuem maiores concentrações de ácido graxo linoléico e menores de ácidos graxos saturados (HAGGARTY et al., 2006). Deste modo, a suplementação lipídica para vacas de corte durante o período pós-parto pode influenciar o número e qualidade de embriões (RYAN et al., 1992; THOMAS & WILLIAMS, 1996). Outra função atribuída à utilização dos ácidos graxos é a geração de água para o fluido da blastocele pela oxidação mitocondrial. A compactação entre os blastômeros que precede a blastulação depende da composição de lipídios da membrana plasmática do embrião, que pode ser comprometida em condições que alteram o conteúdo lipídico artificialmente (McEVOY et al., 2000). Neste sentido, ovócitos bovinos sob ação de agente bloqueador da oxidação de ácidos graxos têm capacidade reduzida de formar blastocistos (WATHES et al., 2007). A composição de ácidos graxos de embriões bovinos de D7 a D14 pós IA foi relatada por Menezo et al. (1982), os quais observaram que a quantidade de ácidos graxos de embriões D7 a D10 se mantém estável. O ácido aracdônico, precursor da síntese de prostaglandina foi detectado no dia 14, provavelmente pela demanda no desenvolvimento embrionário. Nesse momento há elongação e dessaturação de ácidos graxos, afetando também as propriedades da membrana plasmática. Blastocistos colhidos 16 e 19 dias pós inseminação sintetizam prostaglandinas in vitro através do ácido aracdônico, podendo ter ação no aumento da permeabilidade vascular do endométrio antes da implantação e contribuir para o crescimento e desenvolvimento embrionário, durante o período de gestação inicial (LEWIS et al., 1982). 33 A inclusão de AGP na suplementação dietética tem efeito positivo no desenvolvimento embrionário (THANGAVELU et al., 2007). Além disso, pode reduzir a síntese ovariana e endometrial de PGF2α, auxiliar o embrião a produzir interferon tau, bem como alterar o ambiente da tuba uterina e do útero, contribuindo para o desenvolvimento embrionário, redução na morte embrionária e conseqüente estabelecimento da prenhez (MATTOS et al., 2004). De fato, a mortalidade embrionária foi menor para o grupo de vacas que recebeu ácido linolênico, quando comparado às vacas suplementadas com linoléico ou óleo de palma, o que está relacionado à concentração de progesterona. Entretanto as taxas de concepção e nascimento foram similares para todos os tratamentos (PETIT & TWAGIRAMUNGU, 2006). Há escassa literatura relatando o efeito da suplementação de ácidos graxos na produção e desenvolvimento embrionário de bovinos. Não se sabe se os ácidos graxos são mais importantes para o embrião em si ou para sua implantação (PETIT et al., 2008). Além disso, não há consenso dos efeitos favoráveis ou não nestes parâmetros, ao se fornecer AGP. Fouladi-Nashta et al. (2007) realizaram um experimento com vacas de alta produção leiteira para determinar o efeito de dietas compostas de ácidos graxos nos ovócitos, durante curto período de alimentação. Observaram que vacas alimentadas com dieta rica em gordura (800 g de Megalac/dia, predominantemente ácido graxo palmítico) no pós-parto apresentaram ovócitos com maiores taxas de clivagem (blastocistos/clivagem) e desenvolvimento (blastocistos/FIV, fecundação in vitro). Maiores porcentagens de embriões e de blastocistos com maior quantidade de blastômeros e células do trofectoderma foram encontradas para animais suplementados com 800 g de Megalac/dia (dieta com alta quantidade de gordura) em relação àqueles que receberam dieta com baixa quantidade de gordura. Isso pode ser explicado pela menor concentração plasmática de ácidos graxos não esterificados, pelo efeito positivo dos ácidos graxos na competência dos ovócitos e nas membranas celulares ou citoplasma, resultando em benefícios para qualidade e desenvolvimento embrionário. Vacas de leite alimentadas com sais de cálcio de ácidos graxos linoléico e trans apresentaram maiores porcentagens de embriões de alta qualidade (73,5% vs 51,5%, P = 0,06); de espermatozóides acessórios presos à zona 34 pelúcida/estrutura recuperada (34,3 vs 21,5, P < 0,001) e taxa de fecundação (87,2% vs 73,3%, P = 0,11) em relação aos animais que receberam óleo de palma. Entretanto, não houve diferença no número de estruturas (45 vs 41) e taxa de recuperação (embriões/número de CL; 51,9% vs 54,9%; CERRI et al., 2004). Em um estudo (THANGAVELU et al., 2007), vacas holandesas lactantes com 86 dias pós-parto, foram submetidas à dieta com gordura saturada (principalmente ácidos graxos palmítico e esteárico), linhaça (rica em ácido linolênico) ou semente de girassol (rica em ácido linoléico). Não foi encontrado efeito das dietas no número de folículos, CL, total de estruturas colhidas, embriões transferidos e taxa de fecundação. Por outro lado, a concentração de progesterona antes do início do protocolo de superestimulação e o número de blastômeros foram maiores para embriões produzidos em vacas alimentadas com ácidos graxos insaturados em relação ao grupo que recebeu gordura saturada, mostrando o efeito da dieta acelerando o desenvolvimento embrionário. Entretanto, neste experimento não foi incluída a dieta sem suplementação de ácidos graxos insaturados. Kojima et al. (1997) avaliaram o efeito de dietas com ácidos graxos insaturados, linoléico; uma mistura de γ-linolênico (metabólito do ácido linoléico), linoléico e oléico; ou linolênico, no desenvolvimento de embriões de fêmeas suínas, suplementadas por 70 dias. O número de CLs e embriões, bem como os embriões de melhor qualidade colhidos de animais que receberam a mistura de ácidos graxos foram maiores do que para os outros grupos, apesar de que não houve diferença no diâmetro de blastocistos expandidos. Entretanto, por se tratar de dietas com quantidade de proteínas, lipídios, vitaminas e aminoácidos diferentes entre si, pode ser que outros componentes produziram este efeito benéfico. Em estudo recente, Childs et al. (2008b) compararam dietas com ácido graxo saturado ou com AGP n-3, isoenergéticas e isoprotéicas, fornecidas por 50 dias antes do protocolo de superestimulação para novilhas de corte. Avaliaram o efeito da suplementação na produção e qualidade embrionária, baseando-se para isto, na morfologia e expressão gênica dos mesmos. Não houve efeito da suplementação de AGP n-3 no número de ovulações, no número total de ovócitos não fecundados e embriões colhidos, bem como no 35 número de embriões graus 1 e 2. Por outro lado, o número de embriões degenerados foi reduzido para as novilhas que receberam dieta de AGP n-3. Isto pode ter ocorrido, devido a um incremento na qualidade ovocitária e no transporte espermático, a alterações no ambiente do oviduto pela ativação de prostaglandinas da série 3, menos potentes para luteólise ou mesmo na expressão gênica uterina e sobrevivência embrionária. Bader et al. (2005) não observaram aumento na qualidade e quantidade de embriões colhidos de