UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO VANESSA ROSSETTO MARCELINO DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E VARIAÇÃO MORFOLÓGICA EM POPULAÇÕES DO ANURO HYPSIBOAS BISCHOFFI (ANURA: HYLIDAE) Rio Claro 2009 CIÊNCIAS BIOLÓGICAS VANESSA ROSSETTO MARCELINO DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA E VARIAÇÃO MORFOLÓGICA EM POPULAÇÕES DO ANURO HYPSIBOAS BISCHOFFI (ANURA: HYLIDAE) Orientador: JOÃO MIGUEL DE BARROS ALEXANDRINO Co-orientador: CÉLIO FERNANDO BAPTISTA HADDAD Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Campus de Rio Claro, para obtenção dos graus de Bacharel e Licenciado. Rio Claro 2009 Marcelino, Vanessa Rossetto Distribuição geográfica e variação morfológica em populações do anuro Hypsiboas bischoffi (Anura: Hylidae) / Vanessa Rossetto Marcelino. - Rio Claro, SP : [s.n.], 2009 32 f. : il., figs., gráfs., tabs. Trabalho de conclusão de curso (Licenciatura e Bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: João Miguel de Barros Alexandrino Co-Orientador: Célio Fernando Baptista Haddad 1. Anuro. 2. Biogeografia. 3. Morfometria. 4. Diversidade morfológica. I. Título. 597.8 M314d Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP AGRADECIMENTOS Quero agradecer às pessoas que, muito além de ajudarem diretamente nesse trabalho, me ajudaram a compreender a ciência como ela é. Primeiramente, quero agradecer ao João Alexandrino, pela honra de ser orientada por alguém que admiro e estimo, tanto como pesquisador quanto como ser humano. Agradeço pela confiança, paciência, atenção e incentivo em todos os momentos. Agradeço por me ensinar o que é ciência, e por me mostrar que ciência também é arte. Ao Célio Haddad, por abrir as portas do laboratório desde meu primeiro ano de faculdade, e por toda a atenção e preocupação com o trabalho. Á Olívia Araújo e ao João Gabriel, pela convivência e pelo apoio, e por sempre me darem os conselhos certos na hora certa. Á Maria Tereza Thomé, Juliana Zina, Julián Faivovich, Daniel Loebmann, Luis Giasson, Cynthia Prado, Maria Guimarães, Tuliana Brunes, Augusto Abe, Victor Dill, Felipe Toledo, enfim, a todos do Laboratório de Herpetologia, pela convivência e cooperação. Um agradecimento especial à cafeteira do Laboratório, que me deu ânimo para trabalhar sempre um pouquinho mais. Á minha família e amigos, que me lembram sempre de que há vida além da universidade. 3 SUMÁRIO Página 1. RESUMO ........................................................................................................................... 4 2. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 5 3. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................................. 7 3.1. Amostragem ........................................................................................................ 7 3.2 . Análises do Padrão de Coloração ....................................................................... 8 3.3. Análises Populacionais Morfométricas ............................................................... 9 4. RESULTADOS ................................................................................................................ 12 5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 14 6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 18 7. ANEXO I .......................................................................................................................... 21 4 RESUMO O anuro Hypsiboas bischoffi é endêmico do sul e sudeste do Brasil, ocorrendo em áreas de montanha e submontanha da Mata Atlântica. Este trabalho estuda a variação geográfica de traços morfológicos em Hypsiboas bischoffi, através da análise da distribuição de duas formas distintas de padrão de coloração (forma listrada e não listrada), a fim de examinar a hipótese de que o padrão de coloração é polimórfico dentro das populações. Adicionalmente, nós descrevemos a variação em diversos traços morfométricos e examinamos sua associação com o padrão de coloração e com gradientes ambientais em toda a distribuição da espécie. Nossos resultados revelam que as duas formas de padrão de coloração são parapátricas, com as formas listradas e não listradas ocorrendo ao norte e ao sul da distribuição da espécie, respectivamente. As duas formas não foram observadas em coocorrência, mas indivíduos não listrados apresentaram padrões um tanto intermediários em localidades próximas à suposta zona de contato entre as duas formas. Análises multivariadas de variação morfométrica mostraram que a variação no tamanho do corpo explica a maior parte da variação observada, mas nem o tamanho do corpo, nem variações morfométricas adicionais estariam associadas com o padrão de coloração ou distância geográfica entre populações. No entanto, o tamanho do corpo parece estar associado com níveis locais de precipitação no verão. O padrão de diferenciação geográfica em H. bischoffi é concordante com padrões observados em alguns poucos organismos estudados, codistribuídos na Mata Atlântica. 5 INTRODUÇÃO Descobrir os padrões geográficos de variação fenotípica é um caminho para examinar a diversificação de espécies ou populações. Estudos de variação geográfica podem gerar hipóteses sobre adaptação a diferentes habitats, separação histórica e isolamento ecológico (e.g., BENÍTEZ-DIAZ, 1993; PUORTO et al., 2001; ALEXANDRINO et al., 2005; ARNTZEN et al., 2007). Tais estudos são incomuns nos Neotrópicos, onde o número de trabalhos sobre a descrição de novos taxa e suas relações filogenéticas superam grandemente os estudos sobre padrões intraespecíficos de variação geográfica, que podem ajudar a elucidar os processos microevolucionários que promovem a diversificação biológica. O anuro Hypsiboas bischoffi (BOULENGER, 1887) é endêmico da Mata Atlântica, onde habita áreas de montanha e submontanha, em floresta chuvosa e semidecídua. Sua distribuição geográfica conhecida estende-se do estado de São Paulo até o Rio Grande do Sul, no Sudeste e Sul brasileiros. A classificação taxonômica deste anfíbio tem originado alguma controvérsia, devido à variação do padrão de coloração dorsal. Indivíduos das localidades ao norte (Hypsiboas bischoffi multilineata, LUTZ, 1973), no estado de São Paulo, possuem múltiplas linhas longitudinais que estão ausentes nos indivíduos das localidades ao sul (Hypsiboas bischoffi bischoffi, LUTZ, 1973), nos estados do Paraná até o Rio Grande do Sul (Fig. 1). Essa variação tem sido interpretada tanto como uma variação em uma espécie monotípica (Hyla bischoffi, HADDAD E SAZIMA, 1992), como uma variação entre duas subespécies distintas (Hyla bischoffi bischoffi e Hyla bischoffi multilineata, LUTZ, 1973) ou entre duas espécies distintas (Hyla multilineata e Hyla bischoffi, LUTZ E LUTZ, 1939; HEYER et al., 1990). Infelizmente, a amostragem populacional e geográfica insuficiente (e.g. quatro e uma localidades foram amostradas por Lutz, 1973, e por Heyer et al., 1990, respectivamente), impediu o estudo adequado das hipóteses alternativas de polimorfismo dentro de populações coespecíficas versus grupos geográficos discretos de populações com padrões de coloração dorsal distintos. Aqui, nós examinamos tais hipóteses através da descrição geográfica e populacional das formas listrada e não listrada de H. bischoffi, por toda sua extensão geográfica. Adicionalmente, nós procuramos por paralelos na variação geográfica de uma 6 variedade de caracteres relativos à forma e ao tamanho do corpo da espécie. Nós explicitamente testamos a relação entre a variação morfológica, padrões de coloração dorsal, distância geográfica entre populações e gradientes ambientais no sul da Mata Atlântica brasileira. Figura 1. Indivíduos de Hypiboas bischffi representando os padrões de coloração dorsal listrado e não listrado: A) indivíduo com padrão de coloração listrado, coletado na localidade 12 (Guapiara-SP); B) indivíduo com padrão de coloração não listrado, coletado na localidade 30 (Anitápolis- SC). Para códigos das localidades, veja tabela 1. Fo to : J. A le xa nd ri no Fo to : J. A le xa nd ri no Fo to : L. G ia ss on Fo to : L. G ia ss on A) B) 7 MATERIAIS E MÉTODOS Amostragem: Indivíduos machos adultos foram obtidos da coleção de anfíbios CFBH, no departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Rio Claro, SP, e coletas de campo adicionais. Foram examinados 286 espécimes de 34 localidades distintas, abrangendo toda a distribuição da espécie (Fig. 2, Tab. 1). Os indivíduos foram coletados durante a estação reprodutiva, entre fevereiro de 2005 e fevereiro de 2007. Os animais coletados foram fixados em uma solução de formol a 10% por uma semana, preservados em uma solução de álcool etílico 70% e depositados na coleção CFBH. A maior parte dos indivíduos disponíveis eram machos (269 de 286), que foram coletados durante o canto de anúncio em seu comportamento reprodutivo. Figura 2. Distribuição geográfica de Hypsiboas bischoffi no sul da Mata Atlântica. As localidades amostradas encontram-se numeradas de 1- 34, de acordo com um eixo norte-sul. Pontos brancos e pretos representam localidades com indivíduos listrados e não listrados, respectivamente. Localidades com amostragem < 5 estão marcadas com uma cruz. Ao lado direito encontram-se imagens representando padrões de coloração distintos: (A–B) indivíduos com o padrão listrado das localidades 10 e 15, no estado de São Paulo; (C–D) indivíduos não listrados coletados na localidade 20, no Paraná; (E–F) indivíduos não listrados coletados nas localidades 26 e 28, em Santa Catarina. Brasil AA BB CC DD EE FF 0 400 Kilometros 8 Tabela 1. Coordenadas de GPS das 34 localidades amostradas para o anuro H bischoffi (numeradas em um eixo norte-sul). Localidades com tamanho amostral > 5 estão destacadas em negrito. Localidades Código Longitude Latitude Jundiaí 1 -46.94395 -23.24967 Natividade da Serra, SP 2 -45.44190 -23.37560 Mairiporã, SP 3 -46.60860 -23.39860 Serra da Cantareira, SP 4 -46.65786 -23.42245 Santo André, SP 5 -46.53830 -23.66390 Itapecerica da Serra, SP 6 -46.84920 -23.71690 São Paulo, SP 7 -46.65242 -23.80865 Cubatão, SP 8 -46.39872 -23.84546 Pilar do Sul, SP 9 -47.69357 -23.89886 Curucutu, São Paulo, SP 10 -46.77446 -23.98822 Itanhaém, SP 11 -46.81837 -24.06059 Guapiara, SP 12 -48.44835 -24.23914 Ribeirão Branco, SP 13 -48.73861 -24.34500 Piraí do Sul, PR 14 -49.95739 -24.53918 Iporanga, SP 15 -48.62787 -24.57792 Barra do Turvo, SP 16 -48.50470 -24.75640 Morretes, PR 17 -48.87606 -25.36338 Piraquara, PR 18 -49.06330 -25.44170 São José dos Pinhais, PR 19 -49.14684 -25.72964 Tijucas do Sul, PR 20 -49.14826 -25.87041 Mafra, SC 21 -49.83327 -26.16793 São Bento do Sul, SC 22 -49.37860 -26.25030 Corupá, SC 23 -49.33680 -26.36455 Santa Cecília, SC 24 -50.35041 -26.99386 Botuverá, SC 25 -49.11480 -27.16404 Campos Novos, SC 26 -51.45786 -27.54602 Angelina, SC 27 -49.05056 -27.61675 Rancho Queimado, SC 28 -49.12464 -27.69843 Lages, SC 29 -50.34335 -27.80837 Anitápolis, SC. 30 -49.12169 -27.90849 Treviso, SC 31 -49.46888 -28.46893 São Francisco de Paula, RS 32 -50.38338 -29.39069 São Francisco Paula II, RS 33 -50.23799 -29.46392 Itatí, RS 34 -50.10908 -29.51208 Análises do Padrão de Coloração: O padrão de coloração dorsal de cada um dos 286 indivíduos foi classificado como pertencente a um dos dois grupos distintos: listrados, com linhas longitudinais predominantemente contínuas (veja Fig. 2A–B); e não listrados, incluindo padrões com linhas desorganizadas, com linhas escassas e interrompidas, até indivíduos com o dorso completamente cinza e, algumas vezes, manchado (veja Fig. 2C–F). 9 Análises Populacionais Morfométricas: Apenas indivíduos machos adultos foram utilizados nas análises, devido ao baixo número de fêmeas disponíveis (N=17). Dezessete medidas morfométricas foram tiradas de cada macho adulto (Fig. 3): As medidas foram realizadas com um paquímetro digital (Mitutoyo® , precisão de 0,01mm), por um dos autores (VRM). Localidades com tamanho amostral ≥ 5 foram incluídas nas análises populacionais multivariadas (N = 235 indivíduos, de 19 localidades, Fig. 2, Tab. 1) Os dados morfométricos foram logaritmizados para reduzir desvios de normalidade e efeitos de distorção causados por relações alométricas. As médias populacionais foram comparadas por Análise de Variância Multivariada (MANOVA). Todas as medidas apresentaram diferenças significantes entre populações (Wilk´s lambda = 0,098, P < 0,001; todos os resultados univariados com P < 0,001). Figura 3. Dezessete medidas morfométricas realizadas em indivíduos de H. bischoffi: Comprimento Rostro-Cloacal (CRC); Comprimento da cabeça (CC); Largura da cabeça (LC); Comprimento do focinho (CF); Distância Inter-nasal (DIN); Distância Inter-orbital (DIO); Diâmetro do olho (DO); Distância narina-olho (DNO); Diâmetro do tímpano (DT); Comprimento do braço (CB); Comprimento do antebraço (CAM); Comprimento do 3º dedo da mão (CDM3); Distância axila-virilha (DAV); Comprimento da coxa (COXA); Comprimento da tíbia (TIBIA); Comprimento do pé (CP); Comprimento do 4º dedo do pé (CDP4). COXA DO CRC CC LC DT CP TIBIA CAM DAV CB CDM3 DNO CF DIN CDP4 10 As análises morfométricas subseqüentes foram realizadas por Análises de Componentes Principais (PCA), com o software Statistica v. 4.5 (STATSOFT, 1993). Após confirmação de que o tamanho explicava a maior parte da variação observada (primeiro eixo explicava 68% da variância, com todas as variáveis correlacionadas negativamente com o eixo na faixa de -0,58 a -0,96), foram usados os resíduos da regressão do log pelo logCRC (Comprimento Rostro-Cloacal), daqui em diante diferenciados pelo símbolo # ligado ao nome da variável. Tabela 2. Coeficientes do primeiro e segundo Componentes Principais (PC) para as dezessete medidas morfométricas de 19 populações de Hypsiboas bischoffi. Variáveis PC1 PC2 Comprimento rostro-cloacal (CRC) -0.954 0.030 Comprimento da cabeça (CC) -0.875 -0.271 Largura da cabeça (LC) -0.899 -0.003 Comprimento do focinho (CF) -0.861 0.164 Distância Internasal (DIN) -0.579 -0.649 Distancia Interorbital (DIO) -0.871 0.074 Diâmetro do olho (DO) -0.731 -0.461 Distância narina-olho (DNO) -0.742 0.328 Diâmetro do tímpano (DT) -0.579 -0.327 Comprimento do braço (CB) -0.708 0.231 Comprimento do antebraço (CAM) -0.945 -0.057 Comprimento do 3º dedo da mão (CDM3) -0.861 0.255 Distância axila-virilha (DAV) -0.744 0.147 Comprimento da coxa (COXA) -0.937 -0.005 Comprimento da tíbia (TIBIA) -0.857 -0.061 Comprimento do pé (CP) -0.964 -0.010 Comprimento do 4º dedo do pé (CDP4) -0.823 0.356 Variância explicada (%) 68.526 7.240 Variância cumulativa (%) 68.526 75.766 As diferenças morfológicas, expressadas por distâncias euclidianas par-a-par entre as médias populacionais (ambas com a média da PCA com os dados brutos e ajustados – #PCA) foram comparadas com a distância geográfica (medidas em mapas 1:100.000), distância ambiental e padrão de coloração, através de testes de Mantel parcial (RT 2.0; MANLY, 1996), com 10.000 randomizações. A distância ambiental entre localidades foi expressa por distâncias euclidianas par-a-par, tanto para as variáveis separadamente, como para as médias ao longo dos eixos sintéticos da PCA, para as seguintes variáveis não-correlacionadas (Pearson r < 0,70) que descrevem a altitude e o clima da Mata Atlântica (obtidas através da 11 base de dados bioclimáticos Worldclim, na resolução espacial de 30 arc-sec; Hijimans et al., 2005): Altitude (Alt), Média da Temperatura Anual (TempAnnRge), Precipitação Anual (AnnPrec), e Precipitação do Trimeste Mais Quente (PrecWarmQt). Nós aplicamos a correção de Bonferroni nos testes com os dados de PCA e #PCA, uma vez que a hipótese nula global de não associação entre a variação morfológica e as variáveis independentes estavam sendo examinadas por múltiplos testes (P-level de 0,05/6 ≈ 0,01). A correção de Bonferroni não foi usada ao se testar hipóteses específicas aninhadas dentro da hipótese nula global (i.e., variáveis dependentes como CRC). Para validar a classificação posterior dos indivíduos em cada população para cada grupo listrado ou não listrado, foi realizada uma Análise Discriminante (DA) com o software Statistica v. 4.5 (STATSOFT, 1993). Tabela 3. Coeficientes dos quatro primeiros Componentes Principais para dezesseis medidas morfométricas ajustadas (#PC), realizadas em 19 populações de Hypsiboas bischoffi. Variáveis PC#1 PC#2 PC#3 PC#4 Comprimento da cabeça (CC) -0.545 -0.513 -0.231 0.138 Largura da cabeça (LC) -0.531 -0.008 -0.200 0.317 Comprimento do focinho (CF) -0.545 0.399 -0.470 0.093 Distância Internasal (DIN) -0.391 -0.643 -0.097 0.059 Distancia Interorbital (DIO) -0.597 0.247 -0.458 0.017 Diâmetro do olho (DO) -0.215 -0.639 -0.2119 -0.317 Distância narina-olho (DNO) -0.379 0.568 -0.470 -0.055 Diâmetro do tímpano (DT) -0.245 -0.256 -0.271 -0.710 Comprimento do braço (CB) -0.197 0.237 0.462 -0.411 Comprimento do antebraço (CAM) -0.728 -0.183 0.315 -0.081 Comprimento do 3º dedo da mão (CDM3) -0.548 0.483 0.102 -0.261 Distância axila-virilha (DAV) 0.274 0.132 0.457 -0.062 Comprimento da coxa (COXA) -0.665 -0.079 0.373 0.029 Comprimento da tíbia (TIBIA) -0.528 -0.197 0.385 0.312 Comprimento do pé (CP) -0.819 -0.076 0.351 0.023 Comprimento do 4º dedo do pé (CDP4) -0.394 0.590 0.257 -0.003 Variância explicada (%) 25.786 15.215 11.760 6.791 Variânica cumulativa (%) 25.786 41.000 52.761 59.552 12 RESULTADOS O padrão listrado de Hypsiboas bischoffi (Fig. 1A e Fig. 2A–B) foi encontrado exclusivamente nas localidades 1–16, nos estados de São Paulo e norte do Paraná, enquanto o padrão não listrado (Fig. 1B e Fig. 2C–F) foi observado nas populações ao sul do estado de São Paulo (localidades 17-34, Fig. 2). A coocorrência de indivíduos listrados e não listrados na mesma população não foi observada em nenhuma localidade. A PCA com os dados brutos resultou em dois eixos principais que explicam aproximadamente 68% e 7% da variação total, respectivamente (Tab. 2). As médias dos fatores de pontuação das 19 populações estão representadas ao longo do primeiro e do segundo eixo da PCA (Fig. 4A). A PCA com os dados ajustados produziu um eixo que explica aproximadamente 26% da variação total. Os primeiros quatro eixos explicam 59% da variação total (Tab. 3). As médias dos fatores de pontuação das 19 populações estão representadas ao longo do primeiro e segundo eixos da PCA com os dados ajustados (Fig. 4B). Os fatores de pontuação individuais da PCA com os dados brutos e ajustados estão representados na figura 4. Figura 4. Média dos fatores de pontuação (centróides) para 19 populações analisadas de Hypsiboas bischoffi, nos primeiros dois eixos principais da PCA com dados brutos (A) e da #PCA com dados ajustados (B). As populações estão representadas por números, segundo um eixo norte-sul. Pontos abertos e sólidos representam populações com indivíduos listrados e não listrados, respectivamente. 1 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 33 34 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 PC1 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 PC2 A) 1 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 33 34 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 PC#1 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 PC#2 B) 13 A PCA morfométrica baseada nas distâncias entre populações não estão associadas com o grupo morfológico, distância geográfica, Altitude, Média da Temperatura Anual, Precipitação Anual e Precipitação do Trimestre Mais Quente (i.e. no verão), com exceção do PC1 (≈CRC) e CRC que estavam significativamente associados com a Precipitação no Trimestre Mais Quente (P < 0,0001; Tab. 4, Fig. 6). A classificação correta dos indivíduos nos respectivos grupos de padrão de coloração, segundo DA com dados brutos e ajustados foi 79,5% e 75,0%, respectivamente (Fig. 7) Figura 5. Fatores de pontuação para os indivíduos de 34 populações de H. bischoffi, no primeiro e segundo eixo principal da PCA com dados brutos (A) e da #PCA com dados ajustados (B). Pontos abertos e polígonos tracejados representam indivíduos listrados, enquanto pontos sólidos e polígonos com linhas contínuas representam indivíduos não listrados. -3 -2 -1 0 1 2 3 4 PC1 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 PC2 A) -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 PC#1 -3 -2 -1 0 1 2 PC#2 B) 14 DISCUSSÃO Análises morfológicas de populações de H. bischoffi em toda a área de distribuição da espécie mostraram a existência de duas formas geográficas: a forma listrada, que se distribui no estado de São Paulo e norte do Paraná; e a forma não listrada, distribuída ao sul, nos estados do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Fig. 2). Apesar da transição entre as formas parecer pontual (i.e., padrões listrados e não listrados não foram observados sintopicamente), indivíduos não listrados de localidades próximas à fronteira de transição são um tanto quanto intermediários (padrões na Fig. 2C–D, das localidades 17 e 20), sugerindo a existência de uma zona de introgressão entre as duas formas (padrões na Fig. 2A–B, E–F). Tabela 4. Resultados do Testes de Mantel Parcial para associação entre diferenciação morfológica em populações de H. bischoffi versus relação ao grupo de coloração, distância geográfica e quatro variáveis de distância ambiental. As variáveis dependentes são os dois primeiros eixos da PCA, os quatro primeiros eixos da #PCA com dados ajustados e o Comprimento Rostro-Cloacal. A correção de Bonferroni foi aplicada a seis testes co os dados da PCA (resultados significantes se p < 0,01), mas não ao teste com o CRC. Valores de correlação parcial estão dados onde estes são significantes (* = p<0,0001; ns = não significante) Variável Dependente Variáveis explicativas Relação ao grupo Distância geográfica Altitude TempAnnRge AnnPrec PrecWarmQt PC1 ns ns ns ns ns 0.30* PC2 ns ns ns ns ns ns PC#1 ns ns ns ns ns ns PC#2 ns ns ns ns ns ns PC#3 ns ns ns ns ns ns PC#4 ns ns ns ns ns ns CRC ns ns ns ns ns 0.32* A variação geográfica discreta entre duas formas de padrão de coloração não foi acompanhada por um padrão similar de variação morfométrica em H. bischoffi (Tab. 4). Apesar de serem observadas diferenças morfométricas entre populações, especialmente tamanho do corpo, a existência de um padrão de variação morfométrica não é aparente (Figs. 4, 5 e 7). Os maiores e menores indivíduos de H. bischoffi tendem a ser listrados e não listrados, respectivamente (uma tendência previamente notada por Lutz, 1973), mas a 15 distribuição dos valores de tamanho individual parecem se sobrepor amplamente entre os dois grupos de padrão de coloração. Adicionalmente, indivíduos não listrados das localidades mais ao sul (locs. 32–34) eram, em média, os maiores entre os não listrados (Fig. 4), explicando a alta proporção desses indivíduos classificados pela DA como pertencentes ao grupo listrado (Fig. 7), refutando a hipótese da existência de um gradiente geográfico para o tamanho do corpo. Em vez disso, a variação do tamanho do corpo parece seguir um gradiente ambiental de precipitação no verão (Fig. 6). Este padrão de variação do tamanho do corpo é diferente do reportado no único estudo comparável de anuros realizado na Mata Atlântica, em que uma série geográfica de cinco espécies do grupo Rhinella crucifer mostraram uma tendência de diminuição do tamanho do corpo nas populações ao sul (BALDISSERA et al., 2004). Figura 6. Associação entre Comprimento Rostro-Cloacal e precipitação no verão em 19 populações de H. bischoffi. Cores mais escuras representam maiores índices de precipitação. 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 Precipitação no Verão (polegadas) + Tam anho do corpo (PC 1) 1 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 3334 - 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 Precipitação no Verão (polegadas) + Tam anho do corpo (PC 1) 1 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 3334 1 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 3334 - 16 Figura 7. Probabilidade posterior da classificação de cada indivíduo ao grupo de padrão de coloração, a partir da Análise Discriminante dos dados morfométricos brutos (A) e ajustados (B), em 19 populações de H. bischoffi. Pontos abertos e sólidos representam indivíduos listrados e não listrados, respectivamente. Locality 1 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 33 340.0 0.5 1.0 PStriped A) DA P listrado Localidade Locality 1 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 26 27 28 29 31 32 33 340.0 0.5 1.0 B) DA# PStriped Localidade P listrado 17 A confirmação de que duas formas geográficas existem para H. bischoffi não é suficiente para inferir que os dois grupos representam linhagens evolutivas distintas e, talvez, espécies distintas. Informações filogeográficas serão necessárias para examinar essa questão, especificamente testando se os dois grupos fenotípicos são linhagens genéticas distintas. Como os traços morfológicos são produtos tanto da genética quanto do ambiente, é relevante, de uma perspectiva evolutiva, determinar se a variação morfológica reflete isolamento histórico ou adaptação com fluxo gênico recorrente (e.g. ALEXANDRINO et al., 2005). Diferenciação decorrente de isolamento histórico de populações provavelmente resulta em padrões paralelos em caracteres de diferentes naturezas (e.g. genéticos e morfológicos), enquanto adaptação a gradientes de seleção não vai necessariamente gerar o mesmo padrão (veja também BELLIDO et al. 2002). Nossos resultados também mostram que há um efeito ambiental no tamanho do corpo que não é associado geograficamente à existência de dois grupos fenotípicos em H. bischoffi. Se os dois grupos de padrão de coloração forem linhagens evolutivas, a associação positiva entre tamanho do corpo com precipitação no verão nesse anuro poderia sugerir que a disponibilidade de água estaria tanto dirigindo a seleção sobre o tamanho ou atuando indiretamente, afetando a disponibilidade de recursos (e.g. alimento) e metabolismo em populações locais de H. bischoffi. A zona de transição entre as formas listradas e não listradas, localizadas entre São Paulo e Paraná, é coincidente com transições entre espécies morfológicas nos complexos de espécies de anuros Phyllomedusa burmeisteri (POMBAL E HADDAD, 1992) e Rhinella crucifer (BALDISSERA et al., 2004; nome genérico usado após Chaparro et al., 2007) e com uma quebra filogeográfica antiga entre linhagens mitocondriais distintas da cobra Bothrops jararaca (GRAZZIOTIN et al., 2006). Tais padrões concordantes sugerem uma origem comum para os padrões de diferenciação geográfica em grupos de organismos distintos, que podem estar associadas com barreiras históricas (e.g., rios, montanhas) ou flutuações demográficas associadas com os ciclos de alterações climáticas do Terciário e Quaternário. Informações genéticas e morfológicas, em uma variedade de organismos, será necessária para esclarecer tais hipóteses, continuando a desvendar as origens da extraordinária diversidade biológica da Mata Atlântica. 18 REFERÊNCIAS ALEXANDRINO, J., N. FERRAND, AND J. W. ARNTZEN. Morphological variation in two genetically distinct groups of the golden-striped salamander, Chioglossa lusitanica (Amphibia: Urodela). Contributions to Zoology, v. 74, n. 3/4, p. 213–222. 2005. ARNTZEN, J. W., D. S. J. GROENENBERG, J. ALEXANDRINO, N. FERRAND, AND F. SEQUEIRA. 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Here, we focus on geographic variation in morphological traits of H. bischoffi by analyzing the distribution of two distinct color pattern forms (striped and nonstriped) to examine the hypothesis that color pattern is polymorphic within populations throughout its range. We additionally describe variation in several morphometric traits and examine their association with either color pattern or environmental gradients across the range. Our results show that the two color pattern forms are parapatric, with the striped and nonstriped forms occurring in the northern and southern parts of the species range, respectively. The two forms were not observed to co-occur, but nonstriped individuals appeared to present somewhat intermediate color patterns near the putative contact zone between the two forms. Multivariate analysis of morphometric variation showed that variation in body size explains most of the observed variation, but neither body size nor further morphometric variation was associated with color pattern or geographic distance between populations. Body size appeared instead to be associated with local levels of summer precipitation. The geographic differentiation pattern in H. bischoffi is apparently concordant with those observed for a few other codistributed organisms in the Brazilian Atlantic Forest. Uncovering geographic patterns of phenotypic variation is one approach to examining population or species diversification. Studies of geographic variation can generate hypotheses about adaptation to different habitats, historical separation, and ecolog- ical isolation (e.g., Benı́tez-Diaz, 1993; Puorto et al., 2001; Alexandrino et al., 2005; Arntzen et al., 2007). Such studies are uncommon in the Neotropics where describing new taxa and their phylogenetic relation- ships largely surpasses unveiling patterns of within- species geographic variation to understand the mi- croevolutionary processes that promote diversifica- tion. The treefrog Hypsiboas bischoffi (Boulenger, 1887) is endemic to the Brazilian Atlantic Forest, strictly inhabiting submontane to montane rain forest and semideciduous forest areas, with their known range extending from Rio Grande do Sul to northern São Paulo, in southern and southeastern Brazil. The taxonomy of H. bischoffi has been under review because of dorsal color pattern variation across its range. Individuals from northern localities (Hypsiboas bischoffi multilineata, Lutz, 1973), in the state of São Paulo, have multiple longitudinal stripes that are absent in frogs from southern localities (H. b. bischoffi, Lutz, 1973) from the state of Paraná to the state of Rio Grande do Sul. This variation has been interpreted either as variation in a monotypic species (Hyla bischoffi, Haddad and Sazima, 1992), between two distinct subspecies (Hyla bischoffi multilineata and H. b. bischoffi, Lutz, 1973) or between two distinct species (Hyla multilineata and Hyla bischoffi, Lutz and Lutz, 1939; Heyer et al., 1990). Unfortunately, insufficient geographic and popula- tion sampling (e.g., four and one localities were sampled by Lutz, 1973, and Heyer et al., 1990, respectively) has prevented adequate examination of the alternative hypotheses of polymorphism within conspecific populations versus discreteness of geo- graphic groups of populations with distinct dorsal patterns. Here, we examine these hypotheses by describing the population and geographic distribution of striped and nonstriped forms of H. bischoffi throughout its range. Additionally, we search for parallels in the geographic variation of a variety of characters describing the species’ size and shape. We explicitly test whether observed morphological vari- ation is associated with color pattern group, geo- graphic distance between populations and environ- mental gradients in the southern Atlantic Forest of Brazil. MATERIALS AND METHODS Sampling.—Individual adult frogs were obtained from the CFBH amphibian collection at Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP)–Rio Claro, SP, Brazil, and additional field collecting trips. A total of 286 specimens from 34 distinct localities throughout the species range was examined (localities numbered from north to south; Fig. 1, Table 1, Appendix 1). Individuals were collected during the breeding season, from February 2005 to February 2007. Speci- mens were fixed in a 10% formalin solution for a week and then preserved in 70% ethyl alcohol. They were deposited in the CFBH collection with accession numbers given in Appendix 2. Most of the available specimens (269 of 286) were males collected during their breeding call behavior.1 Corresponding Author. E-mail: jalex@rc.unesp.br Color Pattern Analysis.—The dorsal color pattern of each of the 286 H. bischoffi individuals was classified as belonging to one of two distinct categories: striped, with longitudinal stripes predominantly continuous (see Fig. 1A–B); and nonstriped, including disorga- nized striped patterns with few and interrupted stripes to completely solid light-grey, and sometimes blotched, dorsum (see Fig. 1C–F). Populational Morphometric Analyses.—Only adult breeding male individuals were used given that there were too few female specimens available for analysis (N 5 17). Seventeen morphometric measurements were taken from each adult male (Fig. 2): Measure- ments were taken to the nearest 0.01 mm with a digital calliper (MitutoyoH) by one of the authors (VRM). Localities with sample size $5 were included in the population multivariate analyses (N 5 235 individuals, from 19 localities; Fig. 1, Table 1). Mor- phometric data were log-transformed to reduce deviations from normality and distortion effects caused by allometric relationships. Population means were compared by multivariate analysis of variance (MANOVA). All measurements showed significant differences among populations (Wilks’ lambda 5 0.098, P , 0.001; univariate results all with P , 0.001). Subsequent morphometric analyses were per- formed by principal component analysis (PCA) with the software package Statistica v. 4.5 (StatSoft, 1993). Following confirmation that size explained most of the observed variability (first axis explained approximate- ly 68% of the variance, with all variables negatively correlated with the axis in the range of 20.58 to 20.96), the residuals of the regression of log,char- acter. against logSVL were used, hereafter denoted by the symbol # linked to the variable name. Morphological differentiation, expressed by pair- wise euclidean distances between population means (both of scores of raw data PCA and of size adjusted PCA#) was tested against geographic distance (mea- sured on 1:100,000 maps), environmental distance, and color pattern group membership (striped or nonstriped) by partial Mantel tests (RT 2.0; Manly, 1996), with 10,000 randomizations. Between-locality environmental distance was expressed by pairwise euclidean distances both for single variables and for scores along synthetic PCA axes for the following set of uncorrelated (Pearson r, 0.70) variables describing elevation and climate in the Brazilian Atlantic Forest (obtained from the bioclimatic database Worldclim, at a spatial resolution of 30 arc-sec; Hijmans et al., 2005): Altitude (Alt), Temperature Annual Range (Tem- pAnnRge), Annual Precipitation (AnnPrec), and Pre- cipitation of the Warmest Quarter (PrecWarmQt). We applied the Bonferroni correction to tests with the PCA and the PCA# data because the global null hypothesis of no association between morphological variation and the independent variables was being examined with multiple tests (P-level of 0.05/6 < FIG. 1. Geographic distribution of Hypsiboas bischoffi in the southern Brazilian Atlantic Forest. Sampling localities are numbered from 1 to 34 along a north-south axis. White and black dots represent localities with striped and nonstriped individuals, respectively. Localities with sample size,5 are marked with a cross. On the right side are images representing distinct color patterns: (A–B) individuals with striped dorsal patterns from localities 10 and 15, in state of São Paulo (SP); (C–D) nonstriped individuals collected in locality 20, Paraná (PR), (E–F) nonstriped individuals collected in localities 26 and 28, Santa Catarina (SC). 352 SHORTER COMMUNICATIONS 0.01). The Bonferroni correction was not used when testing specific hypotheses nested within the global null hypothesis (i.e., dependent variables such as SVL). To evaluate the a posteriori classification of individuals in each population to either the striped or the nonstriped group, Discriminant Analysis (DA) was performed on both log-transformed and size- adjusted (#) morphological measurements with Sta- tistica/w 4.5 (StatSoft, 1993). RESULTS Striped color patterns of Hypsiboas bischoffi (Figs. 1A–B) were found exclusively at localities 1– 16, in São Paulo state (SP) and northern Paraná (PR), whereas nonstriped color patterns (Figs. 1C–F) were observed in populations to the south of São Paulo (localities 17–34; Fig. 1). Striped and nonstriped individuals were not observed to co-occur at any of the sampled localities. The PCA from raw data resulted in two main PCA axes that explained approximately 68% and 7% of the total variance, respectively (Table 2). The factor score means of 19 populations are represented along the first and second axes of PCA (Fig. 3A). PCA with the size-adjusted data yielded a first axis explaining TABLE 1. GPS coordinates for 34 sampled localities of Hypsiboas bischoffi (numbered along a north-south axis). Localities with sample size $ 5 are highlighted in bold. Localities Code Longitude Latitude Jundiaı́ 1 246.94395 223.24967 Natividade da Serra, SP 2 245.44190 223.37560 Mairiporã, SP 3 246.60860 223.39860 Serra da Cantareira, SP 4 246.65786 223.42245 Santo André, SP 5 246.53830 223.66390 Itapecerica da Serra, SP 6 246.84920 223.71690 São Paulo, SP 7 246.65242 223.80865 Cubatão, SP 8 246.39872 223.84546 Pilar do Sul, SP 9 247.69357 223.89886 Curucutu, São Paulo, SP 10 246.77446 223.98822 Itanhaém, SP 11 246.81837 224.06059 Guapiara, SP 12 248.44835 224.23914 Ribeirão Branco, SP 13 248.73861 224.34500 Piraı́ do Sul, PR 14 249.95739 224.53918 Iporanga, SP 15 248.62787 224.57792 Barra do Turvo, SP 16 248.50470 224.75640 Morretes, PR 17 248.87606 225.36338 Piraquara, PR 18 249.06330 225.44170 São José dos Pinhais, PR 19 249.14684 225.72964 Tijucas do Sul, PR 20 249.14826 225.87041 Mafra, SC 21 249.83327 226.16793 São Bento do Sul, SC 22 249.37860 226.25030 Corupá, SC 23 249.33680 226.36455 Santa Cecı́lia, SC 24 250.35041 226.99386 Botuverá, SC 25 249.11480 227.16404 Campos Novos, SC 26 251.45786 227.54602 Angelina, SC 27 249.05056 227.61675 Rancho Queimado, SC 28 249.12464 227.69843 Lages, SC 29 250.34335 227.80837 Anitápolis, SC. 30 249.12169 227.90849 Treviso, SC 31 249.46888 228.46893 São Francisco de Paula, RS 32 250.38338 229.39069 São Francisco de Paula II, RS 33 250.23799 229.46392 Itatı́, RS 34 250.10908 229.51208 TABLE 2. Factor loadings for the first and second Principal Components axes for 17 morphometric measurements in 19 populations of Hypsiboas bischoffi. Variables PC1 PC2 Snout–vent length (SVL) 20.954 0.030 Head length (HL) 20.875 20.271 Head width (HW) 20.899 20.003 Snout length (SL) 20.861 0.164 Internasal distance (ND) 20.579 20.649 Interobital distance (IOD) 20.871 0.074 Eye diameter (ED) 20.731 20.461 Snout–eye distance (SED) 20.742 0.328 Tympanum diameter (TD) 20.579 20.327 Forelimb length (FLL) 20.708 0.231 Forearm length (FAL) 20.945 20.057 Third finger length (TFL) 20.861 0.255 Axilla–groin length (AGL) 20.744 0.147 Thigh length (TL) 20.937 20.005 Shank length (SL) 20.857 20.061 Foot length (FL) 20.964 20.010 Fourth toe length (FTL) 20.823 0.356 Variance explained (%) 68.526 7.240 Cumulative variance (%) 68.526 75.766 SHORTER COMMUNICATIONS 353 approximately 26% of the total variance. The first four PCA axes explained 59% of the total variance (Table 3). The factor score means of 19 populations are represented along the first and second axes of PCA (Fig. 3B). The individual factor scores from PCA with raw and size-adjusted data are represented in Fig- ure 4. Morphometrical PCA based distances among pop- ulations were not associated with group membership, geographic distance, Altitude, AnnTempRge, AnnPrec and PrecWarmQt, with the exception of PC1 (