UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PERFIL LIPÍDICO DA MEMBRANA PLASMÁTICA E ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS DE ESPERMATOZOIDES DE GARANHÕES RESISTENTES E SENSÍVEIS À CRIOPRESERVAÇÃO Carlos Ramires Neto Botucatu - SP Junho / 2015 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DEPARTAMENTO DE REPRODUÇÃO ANIMAL E RADIOLOGIA VETERINÁRIA PERFIL LIPÍDICO DA MEMBRANA PLASMÁTICA E ALTERAÇÕES MORFOFUNCIONAIS DE ESPERMATOZOIDES DE GARANHÕES RESISTENTES E SENSÍVEIS À CRIOPRESERVAÇÃO Carlos Ramires Neto Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Animal para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga Co-orientadora: Dra. Katia Roberta A. Belaz Botucatu Junho / 2015   ii   FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 Ramires Neto, Carlos. Perfil lipídico da membrana plasmática e alterações morfofuncionais de espermatozoides de garanhões resistentes e sensíveis à criopreservação / Carlos Ramires Neto. - Botucatu, 2015 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Marco Antonio Alvarenga Coorientador: Katia Roberta A. Belaz Capes: 50504002 1. Equino - Reprodução. 2. Criopreservação. 3. Sêmen. 4. Preservação do sêmen. 5. Citometria de fluxo. 6. Biotecnologia animal. Palavras-chave: Citometria de fluxo; Criopreservação; Criotolerância; MALDI-MS; Sêmen.   iii   Nome do autor: Carlos Ramires Neto Título: Perfil lipídico da membrana plasmática e alterações morfofuncionais de espermatozoides de garanhões resistentes e sensíveis à criopreservação COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga Presidente e Orientador Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, FMVZ-UNESP- Botucatu Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, FMVZ-UNESP- Botucatu Prof. Dr. Mateus José Sudano Membro Curso de Medina veterinária, Universidade Federal do Pampa Data da Defesa: 25 de junho de 2015   iv   Dedicatória ... Dedico este trabalho às pessoas mais importantes em minha vida, meus pais minha irmã, meus avós e minha namorada. Sem vocês nada disso seria possível. Amo vocês.   v   Agradecimentos ... À Deus, por todas as bençãos e proteção. Muito obrigado pela minha vida, pela minha família, pelas pessoas especias que sempre colocou em meu caminho e pelas minhas realizações. Minha eterna gratidão e fé. Aos meu pais, Vitória e Beto, por tudo que sou e conquistei. Muito obrigado por nunca pouparem esforços e nem sacrifícios para que meus sonhos se tornassem realidade. Agradeço por todo o amor, carinho, dedicação, educação e pelo apoio incondicional em tudo que fiz ou desejei fazer. Hoje a conquista deste título de mestre é de vocês também. À minha irmã Thais, pela amizade, amor e companheirismo durante toda a minha vida. Além de minha irmã, você é minha melhor amiga. Independente das dificuldades, sempre pude contar com você. Te desejo toda a felicidade sempre. À minha avó Edy, por ter sido a maior referência da minha vida. Muito obrigado por toda amizade, amor e dedicação. A senhora não imagina a falta que faz, queria muito a tua presença neste dia especial. Aos meus avós Dalila e Carlos, que são meus exemplos. Muito obrigado pelo carinho, amor e carinho. Devo a vocês grande parte do que sou. À minha namorada Vanessa, por todo amor e companherismo. A cada dia você se torna uma pessoa mais especial em minha vida. Me desculpe muitas vezes a falta da minha presença e o meu estresse por causa do trabalho. Te agradecerei sempre por me compreender, me ajudar e me apoiar. Te amo! Às minhas cachorras, Mortadela e Prenda, por serem minhas companheiras fiéis durante tantos anos e por alegrarem sempre os meus dias.   vi   À todos os meus amigos de Botucatu, especialmente Bianca, Bojuda, Barriguera, Carlos Renato, Corneta, Carol Destro, Creison, Diego, Fábio, Hélène, Giovane, Guta, Ian, Japonês, Lexotan, Leandro, Mandril, Maria Manoela, Mariana, Priscilla, Patricia, Pedro, Rosiara e Yamê, por tornarem tão divertidos e especiais os 7 anos vividos nesta cidade. Você foram a minha família “Botucuda”. Muito obrigado pela amizade de e o apoio de sempre. À minha amiga Fúlvia, pela amizade, apoio e ajuda de sempre. Você foi uma pessoa muito marcante durante meus anos de graduação e espero que esteja sempre presente em minha vida. À minha amiga Yamê, por ser a minha amiga e maior companheira de trabalho. Você foi fundamental para o desenvolvimento desta dissertação, além disso, sempre foi uma amiga muito especial. Muito obrigado pela ajuda, ensinamentos, apoio e amizade. Aos Professor Marco Antonio Alvarenga, meu orientador, pela amizade, ensinamentos e todas as oportunidades oferecidas. Devo ao senhor grande parte de meu crescimento pessoal e profissional. Muito obrigado por propiciar a execução de tantos trabalhos e pelo apoio incondicional dado. Muito mais que um professor e orientador, o senhor se tornou um grande amigo. Serei eternamente grato. Ao professor Frederico Ozanam Papa, por todos os ensinamentos e amizade ao longo destes anos. Muito obrigado por abrir as portas do seu laboratório e me ensinar tantas coisas. Sempre me considerei como seu orientado também. À Dra. Camila de Paula Freitas Dell`aqua, pela amizade e apoio de sempre. Muito obrigado pela imensa colaboração neste trabalho e pelas análises de citometria de fluxo. Aos amigos Maria Manoela e Lorenzo pela amizade e ajuda prestada durante este trabalho.   vii   À todos do laboratório Thomson da UNICAMP, especialmente Professor Marcos Eberlin, Dra. Alessandra, Dra. Dávila e Dra. Katia Roberta, por todas análise de MALDI-MS. Muito obrigado por serem tão atenciosos e solícitos e por nos darem a oportunidade de executar este trabalho. À Dra. Karia Roberta A. Belaz, minha coorientadora, pela atenção, ensinamentos e dedicação. Te agradeço por ser sempre tão prestativa e colaborar tanto com esta pesquisa. Para mim, é uma grande prazer ser seu primeiro orientado. Ao Dr. Mateus Sudano, por ter aceitado participar de minha banca de defesa e pela execussão das análises estatísticas. Muito obrigado pela atenção, por ser sempre tão solícito e pela imensa contribuição neste trabalho. À Dra. Fabiana Ferreia de Souza, pela participação nas minhas bancas de qualificação e defesa. Muito obrigado pela sua importante colaboração, pelas sugestões e correções que melhoram muito esta dissertação. Te agradeço também pela ajuda e esclarecimentos que sempre prestou em minhas pesquisas. À todos os proprietários e veterinários dos cavalos utilizados neste estudo, especialmente o Dr. Marcelo Pessoa. Muito obrigado por me acolherem em suas propriedades, pela disponibilização do material biológico de seus cavalos e pela confiança. Sem vocês não seria possível a execução deste trabalho. À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP, Campus de Botucatu, por minha formação pessoal e profissional. Tenho grande orgulho de ter sido parte dissente de sua graduação e pós-graduação.   viii   Aos departamento de Reprodução animal da FMVZ-UNESP, todos seu professores e funcionários pelo acolhimento, carinho e amizade durante estes anos. À Botupharma, por disponibilizar parte dos produtos utilizados nesta e em outras pesquisas que realizei. À todos os integrantes da Turma de Veterinária XLV da FMVZ-UNESP, por fazerem tão especiais os anos da minha graduação. Muito obrigado pela amizade. À todos pós-graduandos da FMVZ-UNESP-Botucatu, pelo convivência agradável e troca de conhecimentos. À Fundação de aparo à pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP) pela conseção da bolsa (FAPESP 2012/24843-4) e auxílio (FAPESP 2013/12838-9) para o desenvolvimento desta pesquisa. À todos que de alguma maneira ajudaram no desenvolvimento e elaboração deste trabalho. Muito Obrigado!   ix   Lista de abreviações ANE V : Células íntegras com translocação de fosfatidilserina; Bad Cooler: Garanhões sensíveis ao processo de refrigeração de sêmen; Bad Freezer: Garanhões sensíveis ao processo de congelação de sêmen; CASA: análise computadorizada do movimento espermático; CFDA: Diacetato de carboxifluoresceína; DNA: Ácido Desoxiribonucléico; FMVZ: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia; Good Cooler: Garanhões resistentes ao processo de refrigeração de sêmen; Good Freezer: Garanhões resistentes ao processo de congelação de sêmen; IMP: integridade de membrana plasmática; IP: Iodeto de propídio; M0: Momento do sêmen fresco; M1: Momento após a descongelação; M24: Momento após a refrigeração à 5oC; MALDI-MS: matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry; mL: mililitro; MM: Mangalarga Marchador; MP: motilidade progressiva; MT: motilidade total; PERO: Índice de peroxidação lipídica; QM: Quarto de Milha; RAP: espermatozoides rápidos; ROS: Espécies Reativas de Oxigênio; ROS T: Espécies Reativas de Oxigênio em todas as células; ROS CI: Espécies Reativas de Oxigênio em células íntegras; UNESP: Universidade Estadual Paulista; VAP: velocidade média de trajeto; VSL: velocidade linear progressiva; v/v: volume por volume; µL: microlitro; µm/s: micrômetro por segundo; ºC: graus Celsius.   x   Lista de tabelas Artigo 1 Tabela 1 – Configuração do equipamento de CASA utilizado nas análises. 37 Tabela 2 - Valores médios e desvios padrão MT, MP, VAP, VSL, RAP e IMP do sêmen garanhões das raças QM e MM do sêmen fresco (M0), após a congelação (M1) e após 24 horas de refrigeração (M24). 41 41 41 Tabela 3 - Valores médios e desvios padrão ANE V, PERO, ROS em células totais (ROS T) e ROS em células íntegras (ROS CI) do sêmen congelado de garanhões das raças QM e MM. 41 Tabela 4 – Relação massa-carga (m/z), espécies lipídicas (fosfolipídios), referência bibliográfica de identificação do íon (referência) dos principais íons identificados. 42 Artigo 2 Tabela 1 – Configuração do equipamento de CASA utilizado nas análises 60 Tabela 2 - Valores médios e desvios padrão de MT, MP, VAP, RAP e IMP do sêmen do sêmen fresco (M0) e após a congelação (M1) dos Bad freezer e Good freezer de ambas raças. 64 Tabela 3 - Valores médios e desvios padrão de ANE V, PERO, ROS em células totais (ROS T) e ROS em células íntegras (ROS CI) do sêmen congelado dos garanhões classificados Bad freezer e Good freezer de ambas raças. 64 Tabela 4 – Relação massa-carga (m/z), espécie lipídica (fosfolipídios) e refêrencia bibliográfica identificação do íon (Referência) dos principais íons identificados pela análise de fold change. 65   xi   Tabela 5 - Valores médios e desvios padrão de MT, MP, VAP, RAP e IMP do sêmen do sêmen fresco (M0) e após a congelação (M1) dos Bad freezer e Good freezer das raças QM e MM. 69 Tabela 6 - Valores médios e desvios padrão de ANE V, PERO, ROS em células totais (ROS T) e ROS em células íntegras (ROS CI) do sêmen congelado dos garanhões classificados Bad freezer e Good freezer das raças QM e MM. 70 Artigo 3 Tabela 1 – Configuração do equipamento de CASA utilizado nas análises. 85 Tabela 2 - Valores médios e desvios padrão de MT, MP, VAP, RAP e IMP dos garanhões Bad cooles e Good Coolers. 88 Tabela 3 – Relação massa-carga (m/z), espécie lipídica (fosfolipídios), refêrencia bibliográfica identificação do íon (Referência) dos principais íons lipídicos encontrados noes espectros de MALDI-MS. 89 Artigo 4 Tabela 1 – Configuração do equipamento de CASA utilizado nas análises. 106 Tabela 2 - Valores médios e desvios padrão MT, MP, VAP, RAP e IMP do sêmen do sêmen fresco (M0), após a congelação (M1) e após 24 horas de refrigeração (M24) de garanhões Bad e Good Cooler. 109 Tabela 3 - Valores médios e desvios padrão MT, MP, VAP, RAP e IMP do sêmen do sêmen fresco (M0), após a congelação (M1) e após 24 horas de refrigeração (M24) de garanhões Bad e Good Freezer. 110 Tabela 4 - Massa carga (m/z), espécie lipídica (fosfolipídios) e refêrencia bibliográfica identificação do íon (Referência) dos principais íons identificados   xii   pela análise de fold change. 111   xiii   Lista de figuras Artigo 1 Figura 1 – Espectros de massas representativos dos perfis de fosfolipídios obtidos por MALDI-MS dos animais das raças QM (A) e MM (B). 42 Figura 2 – Representação gráfica da diferença do perfil de fosfolipídios, analisado por PLS–DA, entre os grupos MM (Vermelho, n=21) e QM (Verde, n=22). 44 Figura 3 – Ions, identificados pelo teste Volcano plot, que se diferenciam entre as raças QM (n=22) e MM (n=21). 44 Figura 4 – Representação gráfica de heatmap dos identificando os principais íons diferenciais entre os perfis lipídicos de cada animal. As caixas coloridas à direita indicam as abundâncias relativas dos íons dos grupos estudados. 45 Figura 5 – Representação gráfica da diferença da abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 entre as raças QM (n=22) e MM (n=21), com os valores de p e fold change (FC). 45 Artigo 2 Figura 1 – Espectros de massas representativos dos perfis de fosfolipídios obtidos por MALDI-MS dos animais Good Freezer (A) e Bad Freezer (B), respectivamente. 65 Figura 2 – Representação gráfica da diferença do perfil de fosfolipídios, analisado por PLS –DA, entre os grupos Bad Freezer (Vermelho) e Good Freezer (Verde). 67 Figura 3 – Ions, identificados pelo teste Volcano plot, que se diferenciam entre os grupos Bad Freezer e Good Freezer. 67   xiv   Figura 4 - Pontuação VIP diferenciando a abundância dos íons entre os grupos Bad Freezer e Good Freezer. As caixas coloridas à direita indicam as concentrações relativas do ions em cada grupo estudado. 68 Figura 5 – Representação gráfica da diferença relativa na abundância dos ions m/z 703,5; 728,6; 781,5; 808,5 e 836,6 entre os grupos Bad Freezer (n=19) e Good Freezer (n=20), com valores de p e fold change (FC). 69 Figura 6 – Representação gráfica da diferença do perfil de fosfolipídios, analisado por PLS –DA, entre os grupos Mangalarga Marchador Bad freezer (Vermelho), Mangalarga Marchador Good freezer (Verde), Quarto de Milha Bad freezer (Azul escuro) e Quarto de Milha Good freezer (Azul claro). 71 Figura 7 – Ions, identificados pelo teste ANOVA, que se diferenciam entre os grupos Bad Cooler e Good Cooler nas duas raças. 71 Figura 8 – Representação gráfica de heatmap da abundância dos principais íons entre de cada animal. As caixas coloridas à direita indicam as concentrações relativas do ions em cada grupo estudado. 72 Figura 9 – Representação gráfica da diferença relativa na abundância dos ions m/z 703,5; 781,5; 792,5 810,6 e 838,6 nos grupos Mangalarga Marchador Bad freezer (n=14), Mangalarga Marchador Good freezer (n=6), Quarto de Milha Bad freezer (n=5) e Quarto de Milha Good freezer (n=14), com valores de p. 72 Artigo 3 Figura 1 – Espectros dos perfis de fosfolipídios analisados por MALDI-MS dos animais dos grupos Bad Cooler (A) e Good Cooler (B). 89 Figura 2 – Representação gráfica da diferença do perfil de fosfolipídios entre os grupos Bad Cooler (Vermelho) e Good Cooler (Verde) avaliado por MALDI- MS e analisado estatisticamente por PLS–DA. 92   xv   Figura 3 – Íons lipidicos, analisados por MALDI-MS e identificados pela análise estatítica de Volcano plot, que possuem abundância diferente entre os grupos Bad Cooler e Good Cooler. 92 Figura 4 - Pontuação VIP identificando os principais íons diferenciais entre os perfis lipídicos por MALDI-MS dos grupos Bad Cooler e Good Cooler. As caixas coloridas à direita indicam as abundâncias relativas relativas dos íons em cada grupo um dos grupos estudados. 93 Figura 5 – Representação gráfica da diferença na abundância relativa dos íons lipídicos (m/z 772,5 e m/z 774,6) que se diferem entre os grupos Bad Cooler (n=8) e Good Cooler (n=12). 93 Artigo 4 Figura 1 – Espectros dos perfis de fosfolipídios analisados por MALDI-MS dos animais dos grupos Bad Cooler (A), Good Coolers (B), Bad Freezer (C) e Good Freezer (D). 110 Figura 2 – Representação gráfica da diferença do perfil de fosfolipídios, avaliados pela análise estatística de PLS –DA, entre os grupos Bad Cooler (Vermelho) e Good Cooler (Verde). 113 Figura 3 – Íons, identificados na análise estatística det, que se diferenciam em termos de abundância relativa entre os grupos Bad Cooler e Good Cooler. 113 Figura 4 - Pontuação VIP identificando os principais íons lipídicos diferentes em termos de abundância relativa entre os os grupos Bad Cooler e Good Cooler. As caixas coloridas à direita indicam as abundâncias relativas do íons em cada grupo um dos grupos estudados. 114 Figura 5 – Representação gráfica da diferença de abundância relativa dos íons (m/z 772,5 e m/z 774,6) entre os grupos Bad Cooler (n=12) e Good Cooler (n=8), com valores de p e de fold change (FC). 114   xvi   Figura 6 – Representação gráfica da diferença do perfil de fosfolipídios, avaliado pela análise estatística de PLS –DA, entre os grupos Bad Freezer (Vermelho) e Good Freezer (Verde). 115 Figura 7 – Íons, identificados pela análise estatística T teste, que se diferenciam entre os grupos Bad Freezer e Good Freezer. 116 Figura 8 - Pontuação VIP identificando os principais íons que se diferem em termos de abundância entre os grupos Bad Freezer e Good Freezer. As caixas coloridas à direita indicam as abundâncias relativas do íons em cada grupo um dos grupos estudados. 116 Figura 9 – Representação gráfica da diferença em abundância relativa do íon m/z 768,6 entre os grupos Bad Freezer (n=14) e Good Freezer (n=6), com valores de p. 117   xvii   Sumário Introdução 1 Revisão de Literatura 4 Congelação de sêmen equinos 5 Mudança nos parâmetros espermáticos pela congelação 7 Refrigeração de sêmen equino 9 Lipídios da membrana espermática 11 Espectometria de massas 14 Referências 16 Objetivos 30 Capítulo 1 32 Capítulo 2 55 Capítulo 3 81 Capítulo 4 101 Conclusões gerais 125 Anexos 127   xviii   Ramires Neto, C. Perfil Lipídico Da Membrana Plasmática E Alterações Morfofuncionais De Espermatozoides De Garanhões Resistentes E Sensíveis À Criopreservação. Botucatu, 2015. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, São Paulo. Resumo A congelação e refrigeração são biotecnologias muito utilizadas na reprodução equina, entretanto um significativo número de garanhões possuem baixa qualidade seminal após a criopreservação. Diversos autores descreveram a importância da composição e lipídica das membranas espermáticas sobre a resistência à criopreservação. Desta forma, este estudo teve como objetivo analisar a relação do perfil lipídico das membranas espermáticas com a raça e a resistência espermática à congelação e refrigeração. No experimento 1 foram verificadas as diferenças do perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas de garanhões das raças Mangalarga Marchador e Quarto de Milhaa e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 nos Mangalarga Marchador. No experimento 2 foram avaliados os fosfolipídios das membranas espermáticas entre garanhões com espermatozoides sensíveis ou resistentes à danos decorrentes da congelação e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 703,5; 728,6; 781,5; 808,5 e 836,6 nos animais sensíveis à congelação. No experimento 3 comparou-se os fosfolipídios das membranas espermáticas dos garanhões com a resistencia à refrigeração e observou-se maior abundância relativa dos íons m/z 772,5 e 774,6 nos animais resistentes à refrigeração. No experimento 4 observou-se não serem os mesmo lipídios que conferem resistência espermática à congelação e à refrigeração. Como os resultados do presente estudo, pode-se concluir que existe diferença no perfil lipídico das membranas espermáticas entre animais Quarto de Milha e Mangalarga Marchado, entre animais sensíveis e resistentes à congelação, entre animais sensíveis e resistentes à refrigeração. Além disso não há relação do perfil lipídicos que confere resistência espermática à congelação e à refrigeração. Palavras-chave: Sêmen, Criopreservação, Criotolerância, MALDI-MS, Fosfolipídios, Citometria de fluxo   xix   Abstract The freezing and refrigeration are biotechnology very used in equine reprodution, although a significant number of stallion have low seminal quality after cryopreservation. Many authors described the importance of lipid composition of spermatic membrane in crypreservation resistance.The aim of this study is to analisy the lipid profile with MALDI-MS of plasmatic membrane of stallion sperm, checking its relation with breed and with spermatic resistance to freezing and refrigeration. Four experiments were done. The experiment 1 verified the diference of phospholipid spermatic membrane in stallions of Mangalarga Marchador and Quarter horse breeds, which was observed bigger relative abundance of ions m/z 728,6; 741,5 e 744,5 in Mangalarga Marchador. The experiment 2 evaluated the spermatic phospholipid membrane between stallions with weak and resistant to the damage of freezing and was observed bigger relative abundance of ions m/z 703,5; 728,6; 782,5; 808,5 and 836, 6 in the animals weaks to freezing. The experiment 3 compared the phospholipids of stallions spermatic membranes with sperm weaks or resistant to the damage of refrigeration and was observed bigger relative abundance of ions m/z 772,5 e 774,6 in animals resistants to refrigeration. The experiment 4 showed that not the same lipids offer spermatic resistance to freezing and refrigeration.The results of this study demonstrate tha there is a diference in lipid profile of spermatic membrane between Quarter Horse and Mangalarga Marchador breeds, between animals weak and resistant to freezing and between animals weak and resistant to refrigeration. Besides there is no relation of lipid profile that offer spermatic resistance to freezing and refrigeration. Key-words: Semen, Cryopreservation, Cryotolerance, MALDI-MS, Phospholipids, Flow cytometry     1     INTRODUÇÃO   2   1. Introdução A congelação e refrigeração do sêmen são biotecnologias de destaque na reprodução equina, pois possibilitam a preservação do material genético do animal por um tempo ilimitado, a minimização da propagação de doenças e eliminação de barreiras geográficas (MOORE et al., 2005; HOFFMANN et al., 2011). Entretanto, os processos de criopreservação causam uma diminuição da viabilidade espermática (GRAHAM, 1996; AURICH, 2008), que é refletida na redução de fertilidade (SAMPER & MORRIS, 1998). Um dos principais danos ocasionados pelo processo de criopreservação são as rupturas de suas membranas espermáticas (WHITE, 1993). A manutenção da integridade da membrana dos espermatozoides está diretamente relacionada aos lipídios e proteínas que a compõem (PARKS & EHRENWALD, 1990). Assim, o entendimento da composição e fisiologia das membranas dos espermatozoides auxilia no desenvolvimento e aprimoramento das técnicas de congelação e refrigeração de sêmen, contribuindo para melhorar a taxa de fertilidade. Quando se expõe os espermatozoides a temperaturas não fisiológicas ocorrem mudanças na organização bidimensional dos lipídios que compõem a membrana plasmática espermática, levando a alterações na fluidez e perda lipídica (HOLT, 2000; GRAHAM, 2010). Sabe-se que a composição dos ácidos graxos e a proporção dos lipídios que compõem a membrana plasmática dos espermatozoides estão diretamente relacionadas à sua resistência à criopreservação (PARKS & LYNCH, 1992; LESSIG et al., 2004; GARCIA et al., 2011a). Estudo realizado por Cerolini et al. (1997) observou que espermatozoides mais resistentes à criopreservação possuem maiores quantidades de triglicérides, lipídios e fosfolipídios em sua membrana plasmática. Estas caracteristicas de composição de membrana espermática pode ser transmitida geneticamente em equinos, assim como foi observado para suínos em estudo realizado por THURSON et al, (2002). O fator racial também interfere na resistência espermática à criopreservação. Alvarenga et al. (1996) analisaram garanhões de diferentes raças e observaram que os garanhões das raças de Hipismo e Quarto de Milhas possuem os melhores parâmetros espermáticos após a congelação do que os Mangalarga Marchadores. Fárras et al. (2014) observaram que os   3   garanhões da raça Mangalarga Marchador possuem menor resistência espermática à refrigeração que os Quarto de Milha. Desta maneira, o presente estudo tem o objetivo de comparar o perfil lipídico das membranas espermáticas de garanhões de duas raças, de garanhões sensiveis e resistêntes à congelação de sêmen e de garanhões sensívies e resistentes à refrigeração de sêmen. Além disso, objetiva-se comparar o perfil lipídico das membranas espermática que confere resistência à congelação e à refrigeração.   4   REVISÃO DE LITERATURA   5   2. Revisão de literatura 2.1. Congelação do sêmen equino Pesquisas visando aprimorar os protocolos de criopreservação de sêmen têm sido amplamente exploradas nas últimas décadas. Muitos desses estudos se propõem caracterizar os fluxos hidráulicos a que os espermatozoides são submetidos durante o processo de congelação e descongelação. Para isso, a permeabilidade da membrana dos espermatozoides, utilizando parâmetros bioquímicos, foi estudada com o objetivo de estabelecer protocolos de resfriamento que fossem minimamente nocivos aos espermatozoides (HOLT, 2000). Durante a congelação, o sêmen deve ser primeiramente resfriado até a temperatura ambiente (20oC), fase que se realizada com o meio diluente adequado, não causa danos aos espermatozoides. Entretanto, na continuidade do processo de refrigeração, a temperatura atingida pelo sêmen na faixa entre 19 e 8oC pode causar grandes danos à célula espermática (MORAN, 1992). Nesta faixa de temperatura, os lipídios da membrana plasmática passam por uma fase de transição do estado líquido-cristalino para o estado de gel (GRAHAM, 1996) e se o espermatozoide não for resfriado apropriadamente, ocorrem danos que poderão resultar em perda da motilidade e fertilidade, sendo este fenômeno denominado de choque-frio (WATSON, 1995). Os danos causados pelo choque-frio causam lesão na membrana plasmática, redução do metabolismo de carboidratos e perda de componentes intracelulares, lipídios e enzimas dos espermatozoides (DROBNIS et al., 1993). O acrossomo pode ser afetado, apresentando ingurgitamento, enrugamento e destacamento da zona equatorial. Além disso, pode ocorrer criocapacitação, diminuindo a sobrevida pós-descongelamento. Entretanto, todos estes danos podem ser minimizados com uma curva de resfriamento apropriada e o uso de meio diluente específico (WATSON, 1995). A faixa de temperatura entre -15 e -50oC pode também causar danos aos espermatozoides, porém após este intervalo de temperatura, a atividade metabólica e as reações cessam e as células permanecem inativas (MAZUR, 1984). A congelação da água pura e a formação de cristais de gelo ocorre a 0oC, entretanto o ponto de congelamento das outras soluções é determinado   6   pela concentração de solutos contidos nela (MAZUR, 1984). Os cristais de gelo intracelulares são compostos exclusivamente por água, e os sais da solução permanecem nas porções fluidas do meio (AMMAN & PICKETT, 1987). Com a formação dos cristais de gelo, a concentração dos outros soluto nas frações fluidas do meio aumenta (MAZUR, 1977). Esta formação de cristais de gelo intracelulares é uma das principais lesões causadas aos espermatozoides durante os processos de congelação e descongelação. Estas lesões afetam a estrutura da célula e a concentração dos outros solutos. A alta concentração de sais no meio durante o congelamento pode desidratar os espermatozoides, levando a deformações celulares, danos estruturais na membrana, deslocamento e desnaturação de proteínas de membrana e desarranjo das estruturas do citoesqueleto (Graham, 1996). Dessa forma, torna-se imprescindível utilizar curvas de congelação apropriadas para evitar a formação de cristais de água (MAZUR,1984). Em curvas de resfriamento lenta (-25 a -40oC/min), a água se difunde para o exterior da célula para atingir o equilíbrio devido à alta concentração de solutos no meio extracelular, dessa maneira, os espermatozoides se tornam desidratados e não há formação de grandes cristais de gelo intracelulares (AMMAN & PICKETT, 1987). Entretanto, esta desidratação pode resultar em altas concentrações intracelulares de soluto, provocando o chamado efeito de solução, que é prejudicial às células (Watson, 1981). Por outro lado, nas curvas de resfriamento muito rápidas (>-60oC/ min), não há tempo hábil para saída da água, causado danos devido à formação de cristais gelo intracelulares (MAZUR, 1984). Holt (2000) afirmou que a magnitude do fluxo de água é altamente dependente da curva de resfriamento e então os valores ótimos para os fluxos de água poderiam ser estimados pelo cálculo de curvas ótimas de congelamento. O cálculo dos fluxos de água depende da derivação de parâmetros específicos da membrana, da condutibilidade hidráulica e da energia de ativação, porém como o espermatozoide é uma célula muito complexa, estes parâmetros podem variar em diversos locais da membrana ao longo da superfície do espermatozoide. Além disso, sabe-se que alterações nos lipídios da membrana podem induzir variações dependentes da temperatura e que os crioprotetores, em especial o glicerol, interagem com   7   estes lipídios e podem afetar os parâmetros espermáticos. Hinkovska- Galcheva et al. (1989) observaram mudanças na composição lipídica da membrana de espermatozoides ovinos decorrentes da criopreservação, entretanto neste estudo não foi observada diferença na quantidade total de fosfolipídios antes e após a criopreservação. Os animais de uma raça originalmente Brasileira, o Mangalarga Marchador, tem baixa resistência à congelação de sêmen (ALVARENGA et al., 1996), entretanto estudo realizado com a associação entre dimetilformamida ao glicerol no meio extensor de congelação de sêmen equino melhorou os parametros de cinética espermática após a descongelação (ALVARENGA et al., 2005). 2.2. Alerações dos parâmetros espermáticos decorrentes da congelação A viabilidade celular está correlacionada com fatores físicos, morfológicos, bioquímicos e metabólicos da célula espermática. Para o funcionamento celular normal é necessário que todos os seus componentes e funções estejam preservados (GRAHAM et al., 1980). Um dos testes mais utilizados para análise da viabilidade espermática é a porcentagem de espermatozoides móveis (CONTRI et al., 2010). A estimativa do percentual de espermatozoides móveis, a motilidade espermática, é um teste funcional que demonstra o status energético do espermatozoide. A motilidade é necessária para a penetração na junção útero- tubárica, durante a fecundação (QUINTERO-MORENO et al., 2004). Estudo realizado por Ferreira (2000) demonstrou que os parâmetros de motilidade são representantes fidedignos da qualidade espermática em amostras seminais congeladas. A avaliação da cinética espermática pode ser comprometida se as mitocôndrias estiverem afuncionais, a membrana plasmática estiver lesada ou se os espermatozoides sofrerem choque-frio (KIRK, 2001). Durante a congelação pode ocorrer o choque frio, que resulta em perda da motilidade e consequentemente fertilidade (WATSON, 1995). Oehninger et al. (2000) observaram que o decréscimo da motilidade progressiva é um dos principais indicadores de danos causados pela criopreservação e pode consequentemente causar queda de fertilidade. Além disso, Blottner et al. (2001) demonstraram que a criopreservação resulta em uma mudança na   8   linearidade e hiperatividade dos espermatozoides. A avaliação da integridade da membrana plasmática é outro indicativo da viabilidade espermática, uma vez que as membranas são suscetíveis à danos externos (PARKS & GRAHAM, 1992; HARRISON, 1997; HOLT & MEDRANO, 1997). Uma das maneiras de se avaliar a integridade espermática é a utilização corantes fluorescentes supravitais (ALTHOUSE & HOPKINS, 1995; GRAVANCE et al., 2001). A reação acrossomal é um passo essencial para a fertilização, assim a avaliação do acrossomo também é um parâmetro importante para caracterizar a viabilidade espermática e prever a fertilidade (BLOTTNER et al., 1990; FENICHEL, 1995). Blottner et al. (2001) observaram que as alterações de acrosssomo são os principais defeitos espermáticos no sêmen criopreservado de garanhões. A fragmentação do DNA espermático é um dos marcadores de apoptose (DONNELLY et al., 2000). Esta alteração pode alterar a capacidade fecundante dos espermatozoides ou ocasionar alterações no desenvolvimento embrionário (HENKEL et al., 2004; SAKKAS & ALVAREZ, 2010). Na espécie equina é conhecida a correlação entre o nível de fragmentação de DNA e fertilidade (KENNEY et al., 1994). Estudo realizado por Blottner et al. (2001) concluiu haver baixa alteração nos níveis de fragmentação de DNA decorrente da criopreservação nos espermatozoides equinos. O estresse oxidativo está relacionado à diminuição da fertilidade durante o processamento do sêmen (TRINCHERO et al., 1990; SIKKA, 1996; O`FLAHERTY et al., 1997; ORTEGA et al., 2003). Estes danos oxidativos prejudicam as funções espermáticas (WATSON, 2000). Entretanto a formação destas espécies oxidativas é necessária para o processo de fertilização (O'FLAHERTY et al, 1997). Os espermatozoides bovinos e o sêmen fresco são mais resistentes a danos oxidativos em relação aos espermatozoides humanos, equinos, caprinos e o sêmen congelado (TRINCHERO et al., 1990). Estudos demonstraram que a criopreservação ocasiona estresse oxidativo aos espermatozoides (CHATTERJEE et al., 2001). Os processos de congelação de sêmen causa injúrias à célula espermática, sendo a produção anormal de espécies reativas de oxigênio ocasionada pela peroxidação lipídica da membrana espermática, um dos principais responsáveis por tais injúrias   9   (MAXWELL & WATSON, 1996). Estudos demonstraram que em condições hipotérmicas de estocagem, além da perda da motilidade espermática, ocorre a indução de apoptoses, devido à peroxidação lipídica e a oxidação dos aminoácidos aromáticos nos espermatozoides (MAXWELL & WATSON, 1996; BUCAK et al., 2010). Os espermatozoides criopreservados apresentam comportamento semelhante aos espermatozoides capacitados, uma vez que possuem mudanças na membrana acrossomal, induzidas pela criopreservação (GREEN & WATSON, 2001). A capacitação, assim como a criopreservação ocasiona aumento do influxo de cálcio para a célula espermática (BAILEY et al., 2000), o que pode comprometer a capacitação normal e consequentemente fertilidade do sêmen congelado (SION et al., 2004). A capacitação precoce e a criopreservação são causadoras de redução da viabilidade espermática (BAILEY et al., 2000; WATSON, 2000). Estudo realizado por Thomas et al. (2006) observou que a criopreservação aumenta as alterações de lipídios da membrana espermática em equinos. Entretanto, nesta espécie as alterações da membrana plasmática e a fosforilação da proteína tirosina, ocasionadas pela criopreservação, diferem das ocasionadas pela capacitação espermática in vitro. 2.3. Refrigeração do sêmen equino O processo de refrigeração possibilita o transporte e armazenamento do sêmen equino, uma vez que reduz a atividade metabólica dos espermatozoides, aumentando assim o seu tempo de viabilidade (SQUIRES et. al., 1999). Com isso, se torna possível acasalar animais distantes geograficamente sem a necessidade de transportá-los (BRINSKO & VARNER, 1992; PAPA et al., 2005). Entretanto quando se utiliza esta técnica, é necessário realizar a diluição do sêmen e utilizar uma curva de refrigeração adequada, para reduzir as alterações no padrão de movimento espermático, perda rápida de motilidade, danos ao acrossomo e à membrana plasmática e com consequente redução na fertilidade deste sêmen (WATSON et. al., 1987; AMANN & GRAHAM, 1993; JASKO, 1994). Os meios diluidores utilizados para refrigeração de sêmen de garanhão tem como base em sua formulação o leite integral, leite desnatado aquecido,   10   creme ou leite desnatado em pó reconstituído (JASKO, 1994). Estes diluentes tem como função fornecer os nutrientes necessários para o metabolismo espermático, tampões para manter o pH adequado, controlar a osmolaridade e também proteger a membrana plasmática contra o choque causado pelo frio. Além disso, devido à presença de antibióticos, estes meios desempenham importante papel de prevenção do crescimento bacteriano durante a estocagem e transporte no útero (JASKO, 1994; GRIGGLER et al., 2001), pois o pênis e prepúcio possuem como sua microflora natural uma grande quantidade de bactérias, que são transmitidas ao sêmen no momento da ejaculação (BAUMBER-SKAIFE, 2012; TISCHNER & KOSINIAK, 1986). Apesar da refrigeração de sêmen ser uma biotecnologia largamente difundida e utilizada, alguns garanhões possuem baixa resistência espermática neste processo, sendo necessário nestes casos a aplicação de técnicas como a remoção do plasma seminal (BRINSKO et al., 2000; RAMIRES NETO et al., 2013a) ou a seleção de espermatozoides (MACPHERSON et al., 2003; LANDIM-ALVARENGA et al., 2004) para aumentar a qualidade e tempo de viabilidade do sêmen refrigerado. O plasma seminal consiste em um fluído produzido pela rede testis, epidídimo e glândulas acessórias. Este fluido é expelido em frações durante a ejaculação e tem a função de transportar e fornecer substratos metabólicos para os espermatozoides, além de participar do processo de maturação espermática (TROEDSSON et al., 2001; MILLER et al., 2000). É composto por substâncias protetoras e estimuladoras das células espermáticas (SQUIRES et. al., 1999), contudo devido a sua composição variável entre os reprodutores (ALMEIDA, 2006), o plasma seminal pode ser benéfico ou deletério à qualidade espermática (JASKO et al., 1992). Há na literatura diversos trabalhos que verificaram o efeito da remoção prévia do plasma seminal sobre a qualidade e tempo de viabilidade do sêmen refrigerado de garanhões, alguns demonstraram que a composição do plasma seminal de garanhões pode ser deletéria aos espermatozoides (JASKO et al., 1992; ALMEIDA, 2006), sendo necessária a remoção deste plasma seminal para aumentar a qualidade e longevidade do sêmen refrigerado (BRINSKO et. al., 2000; KARESKOSKI & KATILA, 2008; RAMIRES NETO et al., 2013a). Contudo alguns autores observaram que as técnicas utilizadas para remover o plasma seminal também   11   podem interferir negativamente sobre a integridade da célula espermática (SIEME et al., 2003; ALVARENGA et al., 2010). A técnica normalmente utilizada para remover plasma seminal do ejaculado de garanhões é a centrifugação, entretanto a força e tempo de centrifugação podem interferir negativa sobre a motilidade, integridade e taxa de recuperação espermática (SIEME et al.,2003). Dell`aqua et al.(2000) analisando a força e tempo de centrifugação observaram em 600xg durante 10 minutos a intersecção entre a menor perda espermática e maior qualidade e integridade dos espermatozoides. Outra técnica alternativa para remover plasma seminal do ejaculado é a centrifugação com cushing. Este método visa maximizar a recuperação de espermatozoides de sêmen centrifugado de garanhões (ECOT et al, 2005; KNOP et al, 2005; SIEME et al., 2005) e evitar empacotamento do espermatozoides, minimizando assim as lesões à célula espermática causada pela centrifugação (ALVAREZ et al., 1993; MACPHERSON et al. 2001). Visando também reduzir estes danos aos espermatozoides , Ramires Neto et al. (2013b) propuseram um método para remover plasma seminal do ejaculado através da filtração. Esta técnica utiliza filtro composto por membrana hidrofílica sintética (Sperm Filter®) que retêm os espermatozoides e possibilita a passagem do plasma seminal. Trabalho realizado por Ramires Neto et al. (2013a) demostrou que a filtração foi tão eficiente quanto a centrifugação para remover plasma seminal do sêmen antes da refrigeração e assim aumentar a sua viabilidade, nos animais classificados com sensíveis a danos espermáticos decorrentes da criopreservação. Outra técnica que vem sendo empregada para aumentar a qualidade e o tempo de viabilidade do sêmen de garanhões é a seleção espermática, onde realiza-se a separação dos espermatozoides com motilidade progressiva, sem defeitos morfológicos do restante do ejaculado (MACPHERSON et al., 2003) e para isso utiliza-se a centrifugação em gradientes de densidade. Estudo realizado por Ramires Neto et al. (2012) observou que a utilização da seleção espermática com diferentes gradientes de densidade em garanhões propicia um aumento da qualidade e longevidade do sêmen após a refrigeração. 2.4. Lipídios da membrana espermática   12   A membrana plasmática é uma estrutura fina, flexível, seletivamente permeável aos solutos polares (GUYTON e HALL, 1997) e composta por uma bicamada lipídica, sendo uma interface entre fosfolipídio e água e pelo glicocálice. Esta estrutura celular tem como uma de suas funções principais ser uma barreira física de proteção dos espermatozoides durante a passagem do trato genial masculino para o feminino (AMANN & GRAHAM, 2010). A bicamada lipídica é composta por fosfolipídios e colesterol, entremeados por proteínas. Assim como nas outros mamíferos, os garanhões possuem como classes principais de fosfolipídios da membrana plasmática dos espermatozoides a colina, etanolamina, e esfingomielina (AMANN & GRAHAM, 2010). Estudo realizado por Garcia et al. (2011a) demonstrou em garanhões que há uma variação individual na proporção de lipídios na membrana plasmática do espermatozoides. A maioria dos mamíferos contém ácido docosa-hexanóico como principal ácido graxo constituinte da membrana plasmática dos espermatozoides, entretanto os equinos, assim como os pássaros e ovinos têm o ácido docosa-pentanóico como principal constituinte de sua membrana espermática (PARKS & LYNCH, 1992; GARCIA et al., 2011b). Alguns fosfolipídios, como a fosfatidilserina, estão localizados principalmente no folheto interno da membrana plasmática e quando há danos à esta estrutura, como choque frio ou dano grave de resfriamento, estes são translocados para o folheto externo (GRAHAM, 2010). A distribuição do colesterol entre as membranas de uma mesma célula não é uniforme, uma vez que o colesterol ocorre em maiores concentrações nas membranas extracelulares em relação às intracelulares. Existe uma maior concentração de fosfolipídios em relação aos colesterois na membrana plasmática dos espermatozoides equinos, sendo esta proporção de colesterol:fosfolipídios nesta espécie de 0,36 (CROSS, 1998). Wales & White (1959) descreveram que as espécies de mamíferos com espermatozoides menos resistentes ao choque-frio apresentam menor teor de colesterol na membrana espermática. Além disso, Quinn & White (1967) indicaram uma relação entre a perda de fosfolipídios durante o trânsito do epidídimo de espermatozoides de carneiros e sua baixa resistência ao choque-frio. A membrana é fluída à temperatura corpórea, sendo este estado de   13   fluidez determinado pela proporção entre fosfolipídios e colesterol e pela natureza dos fosfolipídios (AMANN & GRAHAM, 2010). A fluidez da membrana plasmática possui grande importância, uma vez que Giraud et al. (2000) observaram que membranas mais fluidas antes da congelação possuem maior resistência a criopreservação. Estudo realizado sobre os efeitos do colesterol nas propriedades dos fosfolipídios demonstrou que o colesterol causa o desaparecimento da fase de transição da esfingomielina, criando um estado fluido intermediário da membrana e fazendo com que lipídios possam permanecer num estado líquido-cristalino ao invés de gel. Sabe-se ainda que o colesterol causa decréscimo na permeabilidade da membrana, sendo este mais pronunciado com relação à permeabilidade aos cátions, além de influenciar a mobilidade dos componentes e a atividade das enzimas ligadas à membrana (GO & WOLF, 1983; YEAGLE, 1985). As lesões celulares causadas pela criopreservação podem ser induzidas por alteração ou ruptura das estruturas celulares ou por alterações nas funções celulares. O resfriamento rápido dos espermatozoides de garanhões de 20 ◦C a 5 ◦C induz danos irreversíveis para a membrana celular, a qual é caracterizada por uma perda de lipídios da membrana para o meio extracelular e a subsequente perda de íons e moléculas intracelulares. O que leva a uma redução do metabolismo celular e perda rápida de motilidade. Este dano significativo é chamado de "choque- frio" e resulta em perda rápida de viabilidade dos espermatozoides (GRAHAM, 2010). Um indicativo da proteção proporciona pelos fosfolipídios à criopreservação espermática é que a gema de ovo é um dos principais componentes dos meios extensores para congelação sêmen e o seu componente que confere proteção à criopreservação é o fosfolipídiolecitina, que é um fosfolipídio (MEDEIROS et al. 2002). Pettitt & Buhr (1998) observaram que os componentes lipídicos da membrana espermática estão correlacionados aos danos desta membrana durante a refrigeração. Vários estudos demonstraram que a peroxidação dos lipídios é um dos principais responsáveis pela alteração da motilidade espermática de garanhões após a descongelação (FERRULOSA et al., 2009; ALVAREZ & STOREY, 2008, ANDRADE et al., 2012). Garcia et al. (2011a) relataram que maiores quantidades de fosfolipídios na membrana plasmática reduzem a peroxidação dos lipídios após a descongelação. Outro trabalho também realizado por   14   Garcia et al. (2012b) demonstraram que a composição e a proporção de lipídios na membrana espermática de espermatozoides equinos interferem diretamente na peroxidação dos lipídios da membrana plasmática, alterando assim a capacidade destes espermatozoides de resistirem à criopreservação. Estudo realizado com espermatozoides humanos, demonstrou alta presença dos ácido palmítico, esteárico, oleico , linoleico, docosa-hexanóico e araquidónico em espermatozoides defeituosos (KHOSROWBEYGI & ZARGHAMI, 2007). Darin-Bennett & White (1977) analisando espermatozoides de coelhos, humanos, bovinos e ovinos observaram que espermatozoides de espécies mais resistentes ao choque térmico apresentaram taxas molares colesterol:fosfolipídios maiores que espécies susceptíveis. A incorporação de colesterol à membrana plasmática de espermatozoides equinos, pelo complexo de inclusão com ciclodextrina, melhora da cinética espermática e integridade de membrana (COMBES et al., 2000; HARTWING et al., 2014). 2.5. Espectrometria de Massas A técnica de espectrometria de massas possibilita a determinação da massa molecular e quantificação de biomoléculas, como proteínas, carboidratos, lipídios e oligonucleotídeos (FERREIRA et al., 2011). Para analisar um material pela espectrometria de massa, primeiramente é gerado íons com base em compostos (orgânicos ou inorgânicos) por meio de um método de ionização apropriado. Em seguida, estes íons são separados pela sua relação massa−carga (m/z) em um analisador de massas e detectados qualitativamente e ou quantitativamente por meio de um detector, que quantifica os íons. A magnitude do sinal elétrico em função da razão m/z é convertida por um processador de dados, o qual gera o espectro de massas correspondente (GROSS, 2004). A Ionização e dessorção a laser assistida por matriz (“matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry” - MALDI-MS) é uma técnica de espectrometria de massas originalmente desenvolvida para análise de proteínas, entretanto tem se mostrado eficiente, rápida e prática para qualificar lipídios (SCHILLER et al., 2007). Normalmente a análise de lipídios é realizada pela cromatografia líquida e de camada fina, entretanto esta técnica exige experiência e é de baixa resolução (PETERSON et al., 2006).   15   Schiller et al. (2000) verificaram que a espectrometria de massas MALDI-MS é eficiente para caracterizar os lipídios da membrana plasmática espermática de humanos e que este perfil está diretamente relacionado à capacidade de fertilização dos espermatozoides. Lessig et al. (2004) ao analisarem o perfil lipídico dos espermatozoides de humanos e ovinos pelo MALDI-MS espectrometria de massas observaram diferença significativa nos lipídios das duas espécies. A mesma observação foi relatada por Fuchs et al. (2009) ao compararem espermatozoides de ruminantes e felinos.   16   Referência   17   3. Referências - Almeida, J.L. Efeito de de diferentes concentrações de plasma seminal na criopreservação do sêmen eqüino. Dissertação (Mestrado em Ciências Agrárias). Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária. Universidade de Brasília, Brasília, 2006. - Althouse, G.C.; Hopkins, S.M. Assessment of boar sperm viability using a combination of two fluorophores. Theriogenology, v.43, p.595-03, 1995. - Alvarenga, M.A.; Papa, F.O.; Buratini Jr, J. The effect of breeds spermatic parameters over equine sêmen freezability. In: Symposium on Stallion Semen, Amersfoort. Proceedings p. 82, 1996. - Alvarenga, M.A; Papa, F.O; Landim-Alvarenga, F.C.; Medeiros, A.S.L. Amides as cryoprotectants for freezing stallion semen: A review. Ani Repro Sci, v.89, p.105-13, 2005. - Alvarenga, M.A.; Melo, C.M.; Magalhães, L.C.; Papa, F.O. A new method to concentrate equine sperm. Anim Reprod Sci, v.121S:186-87, 2010. - Alvarez, J.G.; Lasso, J.L.; Blasco, L.; Numez, R.C.; Heyner, S., Caballero, P.P.; Storey, B.T. Centrifugation of human spermatozoa induces sublethal damage; separation of human spermatozoa from seminal plasma by a dextran swim-up procedurewithout centrifugation extends their motile lifetime. Hum Reprod, v.8, p.1087- 92,1993. - Alvarez, J.G.; Storey B. Evidence for increased lipid peroxidative damage and loss of superoxide dismutase activity as a mode of sublethal cryodamage to human sperm during cryopreservation. J Androl, v.13, p.232–41, 2008. - Amann, R.P.; Pickett; B.W. Principals of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. J Equine Vet Sci, v.7, p.145-73, 1987.   18   - Amann, R.P.; Graham, J.K. Spermatozoal function. In: Mckinnon, A.O.; Voss, J.L. Equine reproduction, 1.ed. Philadelphia: Lea & Febiger, cap.80, p.715-45, 1993. - Amann, R.P.; Graham, J.K. Spermatozoal Function. In: Equine reproduction, p.1053, 2010. - Andrade, A.F.C; Zaffalona, F.G.; Celeghini, E.C.C.; Nascimento, J.; Bressan, F.F.; Martins, S.M.M.K.; Arruda, R.P. Post-thaw addition of seminal plasma reduces tyrosine phosphorylation on the surface of cryopreserved equine sperm, but does not reduce lipid peroxidation. Theriogenology, v.77, p.1866– 72, 2012. - Aurich, C. Recent advances in cooled-semen technology. Anim Reprod Sci, v.107, p.268-75, 2008. - Bailey, J.L.; Bilodeau, J.F.; Cormier, N. Semen cryopreservation in domestic animals: A damaging and capacitating phenomenon. J Androl, v.21, p.1-7, 2000. - Baumber-Skaife, J. Evaluation of Semen. In: Equine Reproduction, 2nd ed, Ed: McKinnon AO, Squires EL, Vaala WE, Varner DD, Chichester, p.1278-91, 2012. - Blottner, S.; Nehring, H.; Torner, H. Individual differences in capacitation of bull spermatozoa by heparin in vitro: relationship to fertility. Theriogenology, v.34, p.619–628, 1990. - Blottner, S.; Warnke, C.; Tuchscherer, A.; Heinena, V.; Torner.H. Morphological and functional changes of stallion spermatozoa after cryopreservation during breeding and non-breeding season. Ani Repro Sci, v.65, p.75–88, 2001. - Brinsko S.P.; Varner DD. Artificial insemination and preservation of semen.   19   Vet Clin N Amer, v.8, p. 205-18, 1992. - Brinsko, S.P.; Crockett, E.C.; Squires, E.L. Effect of centrifugation and partial removal of seminal plasma on equine spermatozoal motility after cooling and storage. Theriongenology, v.54, v.129-36, 2000. - Bucak, M.N.; Tuncer, P.B.; Sariözkan, S.; Baspinar, N.; Taspinar, M.; Çoyan, K.; Bilgili, A.; Akalin, P.P.; Büyükleblebici, S.; Aydos, S.; Ilgaz, S.; Sunguroglu, A.; Öztuna, D. Effects of antioxidants on post-thawed bovine sperm and oxidative stress parameters: Antioxidants protect DNA integrity against cryodamage. Cryobiology, v.61, p. 248-53, 2010. - Cerolini, S.; Kelso, K.A.; Noble, R.C.; Speake, B.K.; Pizzi, F.; Cavalchini, L.G. Relationship between spermatozoan lipid composition and fertility during aging of chickens. Biol Reprod, v.57, p.976–90, 1997. - Celeghini, E.C.C. Efeitos da criopreservação do sêmen bovino sobre as membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial e estrutura da cromatina dos espermatozoides utilizando sondas fluorescentes. 186f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2005. - Chatterjee, S.; Gagnon, C. Production of reactive oxygen species by spermatozoa undergoing cooling, freezing and thawing. Mol Reprod Dev, v.59, p.451-58, 2001. - Combes, G.B.; Varner, D.D; Schroeder, F.; Burghardt, R.C.; Blanchard, T.L. Effect of cholesterol on the motility and plasma membrane integrity of frozen equine spermatozoa after thawing. J Reprod Fert, Suppl, v.56, p.127-32, 2000. - Contri, A.; Valorz, C.; Faustini, M.; Wegher, L.; Carluccio, A. Effect of semen preparation on CASA motility results in cryopreserved bull spermatozoa. Theriogenology, v.74, p.424-35, 2010.   20   - Cross, N.L. Role of cholesterol in sperm capacitation. Biol Reprod, v.59, p.7- 11, 1998. - Darin-Bennett, A.; White, I.G. Influence of the cholesterol content of mammalian spermatozoa on susceptibility to cold-shock. Cryobiology, v.14, p.466-70, 1977. - Dell`Aqua, J.A.; Papa, F.O.; Alvarenga, M.A.; Zahn, F.S. Effect of centrifugation an packing system on sperm parameters of equine frozen semen. Anim Reprod Sci, v.68, p.324-25, 2001. - Donnelly, E.T.; O'connell, M.; Mcclure, N.; Lewis, S.E. Differences in nuclear DNA fragmentation and mitochondrial integrity of semen and prepared human spermatozoa. Hum Reprod, v.15, p.1552-61, 2000. - Drobnis, E.Z.; Crowe, L.M.; Berger, T.; Anchordoguy, T.J.; Overstreet, J.W.; Crowe, J.H. Cold shock damage is due to lipid phase transitions in cell membranes: a demonstration using sperm as a model. J Exp Zool, v.265, p.432-37, 1993. - Ecot, P.; Decuadro-Hansen, G.; Delhomme, G.; Vidament, M. Evaluation of a cushioned centrifugation technique for processing equine semen for freezing. Anim Reprod Sci, v.89, p.245-48, 2005. - Farrás, M.C; Fioratti, E.G.; Ramires Neto, C.; Carmo, M.T.; Oliveira, R.A.; Papa, F.O.; Puoli Filho, J.N.P.; Alvarenga, M.A. Comparação de diferentes temperaturas de armazenamento de sêmen refrigerado de garanhões da raça Mangalarga Marchador e Quarto de Milha. Vet Zootec, v.21, p.187-95, 2014. - Hinkovska-Galcheva, V.; Petkova, D.; Koumanov, K. Changes in the phospholipid composition and phospholipid asymmetry of ram sperm plasma membranes after cryopreservation. Cryobiology, v.26, p.70-75, 1989. - Hoffmann, N.; Oldenhof, H.; Morandini, C.; Rohn, K.; Sieme, H. Optimal   21   concentrations of cryoprotective agents for semen from stallions that are classified “good”ou “poor” for freezing. Ani Repro Sci, v.125, p.112-18, 2011. - Fenichel, P. Acrosomal function and sperm fertilizing ability. In: Fenichel, P.; Parinaud, J. (Eds.), Human Sperm Acrosome Reaction. Colloque INSERM, v.236, p. 277–285, 1995. - Ferreira, J.C.P. Avaliação subjetiva e computadorizada do movimento espermático pós-descongelação do sêmen eqüino. Botucatu: Universidade Estadual Paulista, 2000. 93p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) - Universidade Estadual Paulista, 2000. - Ferreira, C.R.; Saraiva, S.A.; Catharino, R.R.; Garcia, J.S.; Gozzo, F.C.; Sanvido, G.B.; Santos, L.F.A.; Lo Turco, E.G.; Pontes, J.H.F.; Basso, A.C.; Bertolla, R.P.; Sartori, R.; Guardieiro, M.M.; Perecin, F.; Meirelles,F.V.; Sangalli, J.R.; Eberlin, M.N. Single embryo and oocyte lipid fingerprinting by mass spectrometry. J Lip Res, v.51, p.1218-27, 2010. - Ferrusola, C.O.; Fernández, L.G.; García, B.M.; Salazar, C.S.; Morell, J.M., Martinez, H.R.; Tapia, J.A., Peña FJ. Lipid peroxidation, assessed with BODIPY-C11 increases after cryopreservation of stallion spermatozoa is stallion dependent and relates to “apoptosis like” changes. Reproduction, v.138, p.55–63, 2009. - Fuchs, B.; Jakop, U.; Göritz, F.; Hermes, R.; Hildebrandt, T.; Schiller, J.; Müller, K. MALDI-TOF "fingerprint" phospholipid mass spectra allow the differentiation between ruminantia and feloideae spermatozoa. Theriogenology, v.71, n.4, p.568-75, 2009. - Garcıa, B.M.; Fernandez, L.G.; Ferrusola, C.O.; Bolanos, J.M.G.; Martinez, H.R.; Tapia, J.A.; Morcuende, D.; Pena, F.J. Fatty acids and plasmalogens of the phospholipids of the sperm membranes and their relation with the post- thaw quality of stallion spermatozoa. Theriogenology, v.75, p.811–818, 2011a.   22   - Garcıa, B.M.; Fernandez, L.G.; Ferrusola, C.O.; Salazar-Sandoval, C.; Rodrıguez, A.M.; Martinez, H.R.; Tapia, J.A.; Morcuende, D.; Pena, F.J. Membrane Lipids of the Stallion Spermatozoon in Relation to Sperm Quality and Susceptibility to Lipid Peroxidation. Reprod Dom Anim, v.46, p.141–48, 2011b. - Giraud, M.N.; Motta, C.; Boucher, D.; Grizard, G. Membrane fluidity predicts the outcome of cryopreservation of human spermatozoa. Hum Reprod, v.15, p.2160-64, 2000. - Graham, E.F.; Schmehl, M.K.L.; Nelson, D.S. Problems with laboratory assays Proc 8th tech Conf AI and reprod NAAB, p.1-8, 1980. - Graham, J.K. Cryopreservation of stallion spermatozoa. Vet Clin North Am: Eq Prac, v. 12, p. 131-47, 1996. - Graham, J.K. Principles of Cooled Semen. In: Equine reproduction, p.1308, 2010. - Gravance, C.G.; Garner, D.L.; Miller, M.G.; Berger, T. Fluorescent probes and flow cytometry to assess rat sperm integrity and mitochondrial function. Reprod Toxicol, v.15, p.5–10, 2001. - Green, C.E.; Watson, P.F. Comparison of the capacitation-like state of cooled boar spermatozoa with true capacitation. Reproduction, v.122, p.889–98, 2001. - Griggers, S.; Paccamonti, D.L.; thompson, R.A.; Eilts, B.E..The effects of pH, osmolarity and uterine contamination on equine spermatozoa motility. Theriogenology, v.56, p.613-622, 2001. - Gross, J.H. Mass spectrometry: a textbook. Heidelberg, Germany: Springer Verlag, p.518, 2004.   23   - Go, K.J.; Wolf, D.P. The role of sterols in sperm capacitation. Adv Lipid Res, v.20, p.317-30, 1983. - Guyton, A.C.; Hall, J.E. Textbook of Medical Physiology, 9th edn. Philadelphia: W.B. Saunders, 2000. - Jasko, D.J.; Hathaway, J.A.; Schaltenbrand, V.L.; Simper, W.D.; Squires, E.L. Effect of seminal plasma and egg yolk on motion characteristics of cooled stallion spermatozoa. Theriogenology, v.37, p.1241-52, 1992. - Jasko, D.J. Procedures for cooling and freezing of equine semen. ARS Vet, v.10, n.2, p.156-65, 1994. - Harrison, R.A.P.; Vickers, S.E. Use of fluorescent probes to assess membrane 275 integrity in mammalian spermatozoa. J Reprod Fertil, v.8, p.343–52, 1990. - Harrison, R.A.P. Sperm plasma membrane characteristics and boar semen fertility. J Reprod Fertil (Suppl), v.52, p.195-11, 1997. - Henkel, R.; Hajimohammad, M.; Stalf, T.; Hoogendik, C.; Mehnert, C.; Menkveld, R.; Gips, H.; Schill, W.B.; Kruger, T.F. Influence of deoxyribonucleic acid damage on fertilization and pregnancy. Fertil Steril, v.81, n.4, p.965-72, 2004. - Hinkovska-Galcheva, V.; Petkova, D.; Koumanov, K. Changes in the phospholipid composition and phospholipid asymmetry of ram sperm plasma membranes after cryopreservation. Cryobiology, v.26, p.70–75, 1989. - Holt, W.V.; Medrano, A. Assessment of boar sperm function in relation to freezing and storage. J Reprod Fertil (Suppl), v.52, p.213-22, 1997. - Holt, W.V. Fundamental aspects of sperm cryobiology: the importance of species and individual differences. Theriogenology, v.53, p. 47-58, 2000.   24   - Knop, K.; Hoffmann, N.; Rath, D.; Sieme, H. Effects of cushioned centrifugation technique on sperm recovery and sperm quality in stallions with good and poor semen freezability. Anim Reprod Sci, v.89, p.294-97, 2005. - Landim-Alvarenga, F.C.; Graham, J.K.; Alvarenga, M.A.; Boyazoglu, S.E.A.; Squires, D.E.L. Calcium influx into equine and bovine spermatozoa during in vitro capacitation. Anim Reprod, v.1, n.1, p.96-05, 2004. - Lessig, J.; Gey, C.; Süss, R.; Schiller, J.; Glander H.J.; Arnhold, J. Analysis of the lipid composition of human and boar spermatozoa by MALDI-TOF mass spectrometry, thin layer chromatography and 31P NMR spectroscopy. Comp Biochem Physiol B, v.137, p.265-77, 2004. - Kareskoski M.; Katila T. Components of stallion seminal plasma and the effects of seminal plasma on sperm longevity. Anim Reprod Sci, v.107, p.249– 56, 2008. - Kenney, R.M.; Evenson, D.; Garcia, M.C.; Love, C.C. Associations of sperm chromatin structure, motility and morphology of ejaculated sperm, and seasonal pregnancy rate. In: Proceedings of the VIth International Symposium on Equine Reproduction, Caxamby, Brasilia, p.161–62, 1994. - Khosrowbeygi, A.; Zarghami, N. Fatty acid composition of human spermatozoa and seminal plasma levels of oxidative stress biomarkers in subfertile males. Prost Leu E Fat A, v.77, p.117–21, 2007. - Kirk, E.S. Dissertação de Mestrado. Flow cytometric evaluation of stallion sperm. Colorado State University. Fort Collins, 131p, 2001. - Macpherson, M.L.; Shore, M.D.; Fernandez, M.H.; Miller, C.D.; Thompson, J.A.; Blanchard, T.L.; Varner, D.D. Processing factors which influence viability and fertility of cryopreserved equine spermatozoa. Have Found Mono Ser, v.6, p.27-29, 2001.   25   - Macpherson, M.; Blanchard, T.L.; Love, C.C.; Brinsko, S.P.; Thompson, J.A.; Varner, D.D. Use of a Silane-Coated Silica Particle Solution to Enhance Semen Quality of Stallions. In: 49TH Annual convention of the american association of equine practitioners, New Orleans, Louisiana, p.347-49, 2003. - Mazur, P. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates. Cryobiology, v.14, p.251-72, 1977. - Mazur, P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol, v.247, p.125-42, 1984. - Maxwell, W.M.C.; Watson, P.F. Recent progress in the preservation of ram semen. Anim Reprod Sci, v.42, p.55- 65, 1996. - Medeiros, C.M.; Forell, F.; Oliveira, A.T.; Rodrigues, J.L. Current status of sperm cryopreservation: why isn’t better. Theriogenology, v.57, p.327–44, 2002. - Moore, I.; Squires, E.L.; Graham, J.K. Effect of seminal plasma on cryopreservation of equine spermatozoa. Theriogenology, v.63, p.2372-81, 2005. - Moran, D.M. Effects of cooling rate and storage temperature on motion characteristics of stallion spermatozoa. Fort Collins: Colorado State University, 1992. - Oehninger, S.; Duru, N.K.; Srisombut, C. Assessment of sprm cryodamage e strategies to improve outcome. Mol Cel Endo, v.169, p.3-10, 2000. - O’flaherty, C.M.; Beorlegui, N.B.; Beconi, M.T. Effect of natural antioxidants, superoxide dismutase and hydrogen peroxide on capacitation of frozen-thawed bull spermatozoa. Andrology, v.29, p.269-75, 1997. - Ortega, A.M.; Izquierdo, A.C.; Gómez, J.J.H.; Corichi, I.M.O.; Torres, V.M.M.;   26   Méndez, J.J.V. Peroxidación lipídica y antioxidantes en la preservatión de semen: un a revisión. Interciencia, v.28, p.699-04, 2003. - Papa, F.O.; Melo, C.M.; Dell`Aqua, J.A.; Macedo, L.P.; et al. Inovações metodológicas na biotecnologia de refrigeração e congelação de sêmen eqüino. Act Sci Vet, v.33(Suppl 1), p.19-27, 2005. - Parks, J. E.; Ehrenwald, E. Cholesterol efflux from mammalian sperm and its potential role in capacitation. In 'Fertilization in Mammals'. (Eds B. D. Bavister, J. Cummins and E. R. S. Roldan.) p.155-67. (Serono Symposium: Norwell.), 1990. - Parks, J.E.; Graham, J.K. Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology, v.38, p.209-22, 1992. - Parks, J.E.; Lynch, D.V. Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar, bull, stallion and rooster sperm membranes. Cryobiology, v.29, p.255-66, 1992. - Peterson, B.L.; Cummings, B.S. A review of chromatographic methods for the assessment of phospholipids in biological samples. Biomed Chromatogr, v.20, p.227-43, 2006. - Pettitt, M.J.; Buhr, M.M. Extender components and surfactants affect boar sperm function and membrane behaviour during cryopreservation. J Androl, v.19, p.736–46, 1998. - Quinn, P. J.; White, I. G. Phospholipid and cholesterol content of epididymal and ejaculated ram spermatozoa and seminal plasma in relation to cold shock. J Biol Sci, v.20, p.1205-15, 1967. - Quintero-Moreno, A.; Rigau, T.; Rodríguez-Gil, J. Regression analyses and motile sperm subpopulation structure study as improving tools in boar semen quality analysis. Theriogenology, v.61, p.673–90, 2004.   27   - Ramires-Neto, C.; Monteiro, G.A.; Delfiol, D.J.Z.; Farras, M.C.; Maziero, R.R.D.; Hartwing, F.P.; F.O. Papa, M.A. Alvarenga. Effect of different methods for sperm selection on cooled stallion semen. J Equi Vet Sci, v.32, p.509, 2012. - Ramires Neto, C.; Monteiro, G.A.; Soares, R.F.; Pedrazzi, C.; Dell`aqua, J.A.; Papa, F.O.; Alvarenga, M.A. Effect of removing seminal plasma using a sperm filter on the viability of refrigerated stallion semen. J Equ Vet Sci, v.33, p.40-43, 2013a. - Ramires Neto, C.; Monteiro, G. A.; Soares, R.F.; Pedrazzi, C.; Dell'aqua, J.A.; Papa, F.O.; Castro- Chaves, M.M.B.; Alvarenga, M.A. New seminal plasma removal method for freezing stallion semen. Theriogenology, v.79, p.1120-23, 2013b. - Sakkas, D.; Alvarez, J.G. Sperm DNA fragmentation: mechanisms of origin, impact on reproductive outcome, and analysis. Fertil Steril, v.93, p.1027-36, 2010. - Samper, J.; Morris, C.A. Current methods for stallion semen cryopreservation: a survey. Theriogenology, v.49, p.85-03, 1998. - Schiller, J.; Arnold, K. Mass spectrometry in structural biology. In: Encyclopedia of Analytical Chemistry. Ed: Meyers R A, John Wiley & Sons Ltd., Chichester, 2000. - Schiller, J.; Suss, R.; Fuchs, B.; Muller, M.; Zschornig, O.; Arnold, K. MALDI- TOF MS in lipidomics. Fro Biosci, v.12, p.2568-79, 2007. - Sieme, H.; Martinsson, G.; Rauterberg, H.; Walter, K.; Aurich, C.; Petzold, R.; Klug, E. Application of techniques for sperm selection in fresh and frozen- thawed stallion semen. Reprod Domest Anim, v.38, p.134–40, 2003.   28   - Sieme, H.; Knop, K.; Rath, D. Effects of duration, force of centrifugation and cushioned centrifugation technique on sperm recovery and sperm quality in stallions with good and poor semen freezability. Hav Found Mono Ser, v.18, p.6-9, 2005. - Sikka SC. Oxidative stress and role of antioxidants in normal and abnormal sperm function. Front Biosci, v.1, p.78-86, 1996. - Sion, B.; Janny, L.; Boucher, D.; Grizard, G. Annexin V binding to plasma membrane predicts the quality of human cryopreserved spermatozoa. Int J Androl, v.27, p.108–14, 2004. - Squires, E.L.; Pickett, B.W.; Graham, J.K.; Vanderwall, D.K.; Mccue, P.M.; Bruemmer, J.E. Cooled and Frozen Stalion Semen. Fort Collins: Animal Reproduction and Biotechnology Laboratory, 1999. - Thomas, A.D.; Meyers, S.A.; Ball, B.A. Capacitation-like changes in equine spermatozoa following cryopreservation. Theriogenology, v.65, p.1531-50, 2006. - Thurston, L.M.; Siggins, K.; Mileham, A.J.; Watson, P.F.; Holt, W.V. Identification of amplified restriction fragment length polymorphism marker linked to genes controlling boar sperm viability following cryopreservation. Biol Reprod, v.66, p. 545-54, 2002. - Tischner, M; Kosiniak, K. Bacterial contamination of stallion semen collected by ‘open’ AV. VlaamsDiergeneeskundigTijdschrift, v.55; p.90–94, 1986. - Trinchero, G.D.; Affranchino, M.A.; Shang, L.M.; Beconi, M.T. Antioxidant effect of bovine spermatozoa on lipid peroxidation. Com Biol, v.8, p.339- 50, 1990. - Troedsson, M.H.; Loset, K.; Alghamdi, A.M.; Dahms, B.; Crabo, B.G. Inter- action between equine semen and the endometrium: the inflam- matory   29   response to semen. Anim Reprod Sci, v.68, p.273-78, 2001. - Wales, R.G.; White, I.G. The susceptibility of spermatozoa to temperature shock. J Endocri, v.19, p.210-20, 1959. - Watson P.E.; Plummer, J.M.; Allen, W.E. Quantitative assessment of membrane damage in cold-shocked spermatozoa of stallions. J Repro Fert, v.35 (suppl), p.651-53, 1987. - Watson, P.F. Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprod Fertil Dev, v.7, p. 871-91, 1995. - Watson, P.F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Ani Repro Sci, v. 60-61, p.481-92, 2000. - White, I.G. Lipids and calcium uptake of sperm in relation to cold-shock and preservation: a review. Reprod Fertil Dev, v.5, p.639-58, 1993. - Yeagle, P.L. Cholesterol and the cell membrane. Biochim Biophys Acta, v.822, p.267-87, 1985.   30   Objetivos   31   3. Objetivos Os objetivos do presente estudo foram: 1) Caracterizar o perfil lipídico das membranas espermáticas de equinos pela técnica de MALDI-MS 2) Comparar o perfil lipídico das membranas dos espermatozoides de garanhões das raças Quarto de Milha e Mangalarga Marchador. 3) Comparar o perfil lipídico das membranas dos espermatozoides de garanhões resistentes e sensíveis a injúrias decorrentes da congelação de sêmen. 4) Comparar o perfil lipídico das membranas dos espermatozoides de garanhões resistentes e sensíveis a injúrias decorrentes da refrigeração de sêmen. 5) Verificar a relação do perfil de lipídios das membranas espermáticas de garanhões que confere resistência à refrigeração e à congelação.   32   CAPÍTULO 1   33   Artigo que foi submetido para a revista Theriogenology Diferenças na qualidade do sêmen e no perfil lipídico das membranas espermáticas entre garanhões das raças Quarto de Milha e Mangalarga Marchador Carlos Ramires Neto1, Katia Roberta A. Belaz2, Yame Fabres Robaina Sancler da Silva1, Davila Zampieri2, Alessandra Tata2, Marcos Nogueira Eberlin2, Camila de Paula Freitas Dell`aqua1, Mateus José Sudano3, Patricia de Mello Papa1, Maria Manoela Barata Castro-Chaves1, Frederico Ozanam Papa1, Marco Antonio Alvarenga1 1 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Campus Botucatu 2 Laboratório ThoMSon de Espectometria de Massas, Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas 3 Curso de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Pampa email: carlosramiresneto@hotmail.com Resumo Muitos fatores podem interferir na resistência espermática à criopreservação, destacando-se os genéticos/raciais e os relacionados à composição da membrana plasmática dos espermatozoides e do plasma seminal. Desta maneira o objetivo do presente estudo foi avaliar e comparar o perfil lipídico das membranas espermáticas de garanhões da raça Quarto de Milha (QM), que é considerada com alta resistência aos processo de criopreservação, e da raça Mangalaraga Marchador (MM), referida com baixa resistência à criopreservação. Para isso, foram utilizados dois ejaculados de 43 garanhões, das raças MM (n=21) e QM (n=22), todos com boa qualidade e alta fertilidade do sêmen fresco. O sêmen foi dividido em 2 alíquotas que foram destinadas à congelação e refrigeração à 5oC. Realizou-se análise computadorizada de cinética espermática pelo método computadorizado CASA e avaliações da integridade de membrana por microscopia de epifluorescência, translocação de fosfatidilserina, peroxidação lipídica e formação de espécies reativas de   34   oxigênio em células íntegras e totais por citometria de fluxo. Adicionalmente, foi realizada análise do perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas do sêmen fresco por MALDI-MS. Os dados de cinética espermática, microscopia de epifluorescência e citometria de fluxo foram comparados pelo teste t e os dados de perfil lipídico das membranas espermáticas foram avaliados utilizando modelos uni e multivariados. Nas amostras de sêmen fresco, refrigerado e congelado foi observada superioridade (p<0,05) dos parâmetros de qualidade seminal dos animais QM em relação aos MM e o sêmen congelado dos garanhões da raça MM apresentou maior peroxidação lipídica e formação de espécies reativas de oxigênio nas células íntegras. Na análise de MALDI-MS, foi possível observar uma diferença no perfil lipídico do sêmen fresco entre as raças, com maior abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 nos MM. Conclui-se que os garanhões da raça MM possuem qualidade inferior do sêmen fresco e menor resistência à criopreservação do que os garanhões QM e além das diferenças no perfil de fosfolipídios das membranas espermáticas entre as raças. Palavras-chave: Sêmen, Criopreservação, MALDI-MS, Citometria de fluxo, Quarto de Milha, Mangalarga Marchador 1. Introdução As técnicas de refrigeração e congelação de sêmen equino, associadas à inseminação artificial, possibilitaram um maior aproveitamento genético dos garanhões, uma vez que facilitam o acasalamento de animais distantes geograficamente e viabilizam a utilização de sêmen de animais que já morreram [1,2]. Entretanto, como na espécie equina a seleção dos reprodutores não é realizada pela aptidão reprodutiva [3], existe grande número de animais sub férteis ou que apresentam baixa resistência espermática aos processos de criopreservação [4]. Acredita-se que muitos fatores podem interferir na resistência espermática à criopreservação, como os fatores genéticos e raciais [5-7]. Além desses, destacam-se os relacionados à composição da membrana plasmática espermática [8-10] e do plasma seminal [11,12]. A raça de equinos Mangalarga Marchador é de origem brasileira conhecidamente detentora de alta sensibilidade ao transporte, refrigeração e   35   congelação de sêmen [13]. Alvarenga et al. [14] analisaram o sêmen congelado de garanhões de diferentes raças e observaram que os garanhões das raças de hipismo e Quarto de milha possuem os melhores parâmetros espermáticos após a descongelação do sêmen, quando comparados aos Mangalarga Marchador. Fárras et al. [13] observaram que os garanhões da raça Mangalarga Marchador possuem maior sensibilidade espermática ao processo de refrigeração, em relação aos Quarto de Milha. A sensibilidade ao processo de criopreservação está relacionada à composição dos ácidos graxos e a proporção dos lipídios das membranas espermáticas [9,10,15]. Quando se expõem os espermatozoides a temperaturas não fisiológicas, ocorrem mudanças na organização bidimensional dos lipídios que compõem a membrana plasmática espermática, levando a alterações na fluidez e perda dos lipídios [16,17]. Espermatozoides com melhor qualidade após criopreservação possuem maiores quantidades de triglicérides, lipídios e fosfolipídios na membrana plasmática [18]. Vários estudos demonstraram que a peroxidação dos lipídios é um dos principais responsáveis pela alteração da motilidade espermática de garanhões após a descongelação [19-21] e que maiores quantidades de fosfolipídios na membrana plasmática reduzem a perioxidação do lipídios desta após a descongelação [15]. Além da importância já demonstrada da composição lipídica das membranas espermática na qualidade do sêmen e na sua resistência à criopreservação em várias espécies, é conhecida a existência de uma variação individual na proporção de lipídios na membrana plasmática do espermatozoides equinos [15]. Diante disto, o objetivo do presente estudo foi comparar o perfil lipídico das membranas espermáticas de uma raça conhecidamente com boa resistência aos processos de criopreservação (Quarto de Milha), com o de outra raça que apresente baixa resistência à criopreservação (Mangalarga Marchador). 2. Material e Métodos 2.1. Animais e grupos estudados Foram utilizados dois ejaculados de 43 garanhões, das raças Mangalarga Marchado (MM, n=21) e Quarto de Milha (QM, n=22), com idade   36   entre 7 e 15 anos, alojados em haras nos estados de São Paulo e de Minas Gerais. Os animais selecionados apresentaram qualidade espermática dentro dos padrões para a espécie (Motilidade total >60% e motilidade progressiva >20%) e histórico de alta fertilidade (>70%) do sêmen fresco. O experimento foi aprovado pelo Comite de ética da Faculdade de medina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus Botucatu (Protocolo 242/2013-CEUA). 2.2. Colheita, refrigeração e congelação do sêmen O sêmen foi colhido com vagina artificial modelo Botucatu (Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) e posteriormente filtrado em filtro de nylon (Minitub®, Alemanha) para remoção da fração gel. A seguir, uma fração do ejaculado foi diluída com meio diluente comercial à base de leite desnatado (Botu-sêmen®, Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) na proporção de 1:1 (v/v). Essa amostra foi dividida em duas alíquotas, sendo uma destinada à congelação e outra à refrigeração. Para a congelação, o sêmen foi centrifugado a 600 x g por 10 minutos [22]. O sobrenadante foi desprezado e o “pellet” ressuspendido em meio de congelação Botucrio (Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) na concentração de 200x106 espermatozoides/mL. Após o envase em palhetas de 0,5 mL, as mesmas foram levadas ao refrigerador de temperatura controlada (Minitub, Alemanha) e permaneceram à 5°C por 20 minutos. Posteriormente, foram acomodadas sobre uma plataforma metálica em caixa isotérmica com capacidade de 45 litros, preenchida com nitrogênio líquido (N2) até 3,5 cm de altura. As palhetas ficaram dispostas horizontalmente a 6,0 cm do nível do nitrogênio líquido por 20 minutos e posteriormente foram armazenadas em botijão de nitrogênio [23]. As palhetas descongeladas à 37oC por 20 segundo. Para a refrigeração, uma fração do ejaculado foi acrescida de diluente comercial à base de leite desnatado (Botu-sêmen®, Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) a uma concentração de 50 x 106 espermatozoides/mL. As amostras de sêmen foram mantidas em sistema comercial de refrigeração passivo ( Botu- Flex®, Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) pelo período de vinte e quatro horas à 5°C. 2.3. Análise do sêmen   37   2.3.1. Análise computadorizada da cinética espermática Foi realizada análise dos parâmetros de cinética espermática do sêmen fresco diluído e após a refrigeração e congelação pelo método computadorizado CASA, quanto a motilidade total (MT, %), motilidade progressiva (MP, %), velocidade de trajeto (VAP, µm/s), velocidade linear progressiva (VSL, µm/s) e espermatozoides rápidos (RAP, %). A configuração do equipamento de CASA está descrito na Tabela 1. Tabela 1 – Configuração do equipamento de CASA utilizado nas análises. CARACTERÍSTICAS AJUSTE Número de pontos examinados Contraste das células em relação ao campo Tamanho mínimo da célula Contraste para células imóveis Limite inferior para índice retilíneo Referência para velocidade média (VAP) Referência para velocidade lenta (VAP) Referência para velocidade lenta (VSL) Limite inferior de tamanho Limite superior de tamanho Limite inferior de intensidade Limite superior de intensidade Limite inferior de alongamento Limite superior de alongamento Lentos contados como móveis Magnificação 30 60 pixels 3 pixels 30 pixels 80 % <70 µm/s <30 µm/s <20 µm/s 0,62 pixels 2,98 pixels 0,24 1,19 0% 100% Não 1,95 2.3.2. Integridade de membrana por microscopia de epifluorescência A análise da integridade de membrana plasmática (IMP) do sêmen fresco diluído, refrigerado por 24 horas e descongelado, foi realizada pela técnica de microscopia de epifluorescência (Leica Microsystem – DMLB, Ernst- Leitz-Strabe, Wezlar Germany), utilizando-se a associação das sondas fluorescentes diacetato de carboxifluoresceina (CFDA) e iodeto de propideo   38   (IP) segundo metodologia de Harrison e Vickers [24]. Nessa análise 100 células foram contadas, sendo os espermatozoides corados integralmente em verdes considerados íntegros e os espermatozoides corados em vermelho ou em verde e vermelho, considerados lesados. 2.3.3. Citometria de fluxo As análises de citometria de fluxo (BD LSR Fortessa, Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA, com lasers: azul 488 nm, 100 mW, vermelho 640- nm, 40 mW e violeta 405 nm e 100 mW) foram realizadas no sêmen após a descongelação. Após a análise, os dados foram arquivados para posterior avaliação em software (FACSDivatm software V6,2). A translocação de fosfolipídios de membrana (ANE V) foi avaliada com um Kit comercial ( anexina V–FITC, 6710KK; Pharmingen) para avaliação da apoptose e IP de acordo com as recomendações do laboratório. Uma alíquotaa do sêmen foi diluída em solução tampão de anexina V (pH 7,4 ajustado com NaOH, 140 mM NaCl e 2,5 mM CaCl2) numa concentração de 2x106 espermatozoides/mL; um volume de 100 µL (concentração final de 2x105) desta diluição foram acrescidos de 5 µL de anexina V-FITC e 5 µL de IP (50 µg/mL) e 5 µL de Hoechst (100µg/mL). A amostra foi homogeneizada e incubada por 15 minutos na temperatura ambiente. Novamente foram adicionados 400 µL de solução tampão de anexina V para uma concentração final de 1x106 espermatozoides/mL. A Peroxidação Lipídica (PERO) foi analisada utilizando a probe C11- BODYPY (D-3861; Molecular Probes). Uma amostra de sêmen foi diluída em TALP a uma concentração de 5x106 espermatozoides/mL com um volume final de 499,5µL. As amostras foram coradas com 0,5µL do corante (1mg/mL) por 30 minutos à 37oC. Após aincubação, uma alíquota de 145 µL da solução foi transferida para outro microtubo e então acrescida de 5µL de Hoechst 33342 (100µg/mL; H1399 – Molecular probes) e 5µL de iodeto de propídio (50µg/mL; P4170, Sigma) e incubados por mais 10 minutos a 37oC. Após a incubação foram adicionados 150µL de TALP e o volume foi transferidos para tubos graduados de 15mL, com uma concentração final de células de 2,5x106 espermatozoides/mL. A Concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS) foi mensurada com a   39   sonda 5-(-6)-carboxi-2,7-diclorodihidro-fluoresceindiacetato (carboxi-H2DCFDA; Molecular Probes). A sonda DCFDA (concentração final de 20µM), iodeto de propídeo (1µg/mL; P4170, Sigma) e hoechst 33342 (100µg/mL;) foram adicionados a uma solução contendo espermatozoides na concentração de 5x106 espermatozoides/mL. Esta mistura foi incubada a 25ºC por 60 minutos ao abrigo da luz. 2.3.4. Lipídios da membrana plasmática espermática A análise do perfil lipídico foi realizada por espectrometria de massa MALDI-MS no sêmen fresco (sem a adição de diluente). Após a obtenção do sêmen, alíquotas contendo 50 x 106 espermatozoides foram adicionadas à criotubos e armazenadas à -196oC para extração dos lipídios. A extração dos lipídios foi realizada pelo protocolo estabelecido por Bligh & Dyer [25]. A alíquota contendo os espermatozoides foi descongelada em temperatura ambiente e diluída com 1 mL de solução de PBS sem cálcio e magnésio. A mesma foi homogeneizada durante 3 minutos e centrifugada à 12000xg por 1 minuto. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e novamente as células foram lavadas. O sobrenadante foi descartado e 0,5 mL de uma solução de clorofórmio/metanol (CHCl3/CH3OH, 1:2) foi adicionada e homogeneizada durante 5 minutos. Uma nova centrifugação à 5000xg por 3 minutos foi realizada e a fase inferior foi removida e criopreservada a -196oC até a análise por espectrometria de massa. As análises de espectrometria de massas foram realizadas no Laboratório Thomson de Espectrometria de Massas, na Universidade Estadual de Campinas. O volume de 1µL do extrato lipídico foi adicionado sobre a placa MALDI e após a cristalização adicionou-se 1 µL da solução de DHB (30 mg em 1 mL de metanol). Os espectros foram adquiridos em modo positivo utilizando MALDI-MS Autoflex III por tempo de vôo, equipado com tecnologia laser smartbeamTM (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha). Os dados de MS foram adquiridos na faixa de m/z entre 700 e 1000 em média 1.500 disparos consecutivos de laser com uma frequência de 200 Hz. FlexAnalysis Software 3.0 foi utilizado para visualizar e processar os espectros de massas.   40   As estruturas dos fosfolipídios foram atribuídas baseada na busca da literatura e a base de dados (http://lipidsearch.jp ou www.lipidmaps.org). 2.4. Análise estatística Para a análise estatística da comparação da cinética espermática, citometria de fluxo e microscopia de epifluorescência foi utilizado teste t, considerando significativo p≤0,05. Para o perfil lipídico foram utilizados modelos uni e multivariados. Os valores foram substituídos pela metade do valor mínimo positivo nos dados obtidos a partir do pré-processamento. Os valores de intensidade de cada pico nos espectros foram auto-dimensionado (média-centrada e dividido pelo desvio padrão de cada variável), a fim de dar a mesma importância para cada valor em m/z. As análises foram realizadas utilizando o MetaboAnalyst 2,0, a análise discriminante dos quadrados mínimos parciais (PLS-DA), mostrado a relação entre a variância nos dados e as diferenças entre as raças (Quarto de Milha e Mangalarga Marchador). As espécies de lípidos foram diferencialmente expressos identificados utilizando ANOVA seguido pelo teste de Tukey. Vulcano plot foi usado para comparar dois grupos de garanhões, usando os seguintes critérios: valores de p≤0,05 e fold-change (FC) ≥1,5. Agrupamento hierárquico da espécie lipídica diferencialmente expressos foi realizada usando distâncias euclidianas ligaçãoes Ward foram utilizados para mostrar relação entre as amostras e funcionalidades. 3. Resultados Os dados de cinética espermática e IMP do sêmen fresco, refrigerado e congelado estão descritos na Tabela 2. As análises de citometria de fluxo do sêmen congelado estão apresentadas na Tabela 3.   41   Tabela 2 - Valores médios e desvios padrão MT, MP, VAP, VSL, RAP e IMP do sêmen garanhões das raças QM e MM do sêmen fresco (M0), após a congelação (M1) e após 24 horas de refrigeração (M24). Grupos MT (%) MP (%) VAP (µm/s) VSL (µm/s) RAP (%) IMP (%) QM (M0) 73,6±7,9a 37,3±10,6a 117,9±12,3a 99,5±28,7a 65,8±10,2a 68,7±15,5a MM (M0) 67,9±6,4b 29,7±7,9b 115,5±12,2a 87,0±9,8b 57,6±8,3b 71,5±17,0a QM (M1) 50,7±10,8a 18,7±6,9a 90,3±21,8a 66,1±7,2a 31,7±11,6a 42,9±14,1a MM (M1) 39,5±15,4b 12,8±6,9b 78,6±7,8b 63,9±5,0a 25,7±17,2a 37,9±11,7a QM (M24) 64,3±15,0a 30,7±13,1a 115,5±19,5a 89,2±16,2a 54,6±16,7a 68,2±17,6a MM (M24) 38,9±21,0b 14,9±10,6b 93,2±19,1b 69,6±14,2b 29,8±19,1b 60,6±20,3a Letras minúsculas indicam diferença (p<0,05) entre as colunas em um grupo. QM n=22 e MM n=21. Tabela 3 - Valores médios e desvios padrão ANE V, PERO, ROS em células totais (ROS T) e ROS em células íntegras (ROS CI) do sêmen congelado de garanhões das raças QM e MM. Grupos ANE V (%) PERO (%) ROS T (%) ROS CI (%) QM 10,5±4,7a 40,9±17,3a 5,8±5,4a 9,2±11,4a MM 15,2±18,9a 53,9±20,7b 18,2±29,5a 25,8±30,6b Letras minúsculas indicam diferença (p<0,05) entre as colunas, QM n=22 e MM n=21. A Figura 1 representa os espectros dos fosfolipídios dos animais QM e MM obtidos por MALDI-MS. A relação dos principais íons identificados nos espectros está apresentada na Tabela 4.   42   Figura 1 – Espectros de massas representativos dos perfis de fosfolipídios obtidos por MALDI-MS dos animais das raças QM (A) e MM (B). Tabela 4 – Relação massa-carga (m/z), espécies lipídicas (fosfolipídios), referência bibliográfica de identificação do íon (referência) dos principais íons identificados. m/z Fosfolipídios (Carbono:Insaturação) Referência 700,6 [PC (30:3) + H]+ 26 703,5 [SM (16:0) + H]+ 26, 27, 28 706,6 [PC (30:0) + H]+ 26 727,0 Oligomerisation product of DHB matrix 29 725,5 [SM (16:0) + Na]+ 26, 27, 28, 30 728,6 [PC (32:3) + H]+, [PEp (36:2) + H]+, [PEe (36:3) + H]+ 26 732.6 [PC (32:1) + H]+, [PEp (36:0) + H]+, [PEe (36:1) + H]+ 26 734.6 [PC (32:0) + H]+ 26 741,5 [PA (16:0,20:4) + H + 2 Na]+ 31 744,6 [PE (36:2) + H]+ 31 749 Não identificado 748,6 [PCe (34:0) + H]+ 32 756,6 [PC (32:0) + Na]+, [PC (34:3) + H]+ 26, 27, 28, 31 772,5 [PCp (36:1) + H]+, [PCe (36:2) + H]+ 26 774,6 [PCp (36:0) + H]+, [PCe (36:1) + H]+ 26 782,6 [PC (36:4) + H]+, [PC (34:1) + Na]+ 26, 28, 30 816.6 830.6 794.6 841.6725.6 857.5 38  0:D11  MS  R aw 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 In te n s.  [a .u .] 816.3 794.4 830.2 841.2728.5 808.3706.6 43  0:D21  MS  R aw 0 2000 4000 6000 8000 In te n s.  [a .u .] 700 750 800 850 900 950 1000 m/z     A B   43   784,6 [PC (36:3) + H]+, [PC (34:0) + Na]+ 27 788,6 [PC (36:1) + H]+ 26, 27, 28, 30 794,6 [PE (40:5) + H]+, [PCp (38:4) + H]+, [PCe (38:5) + H]+ 26, 27 796,6 [PCp (38:3) + H]+,[PCe (38:4) + H]+ 26 806,6 [PC (38:6) + H]+, [PC(36:3)+ Na]+ 27 808,6 [PC (38:5) + H]+, [PC(36:2)+ Na]+ 26, 27, 28, 30, 31 810,6 [PC (38:4) + H]+, [PC(36:1)+ Na]+ 26, 27, 28, 30, 31 812,6 [PC (38:3) + H]+ 26 814,6 [PC (38:2) + H]+ 26,27 830,6 [PCp (40:0) + H]+, [PCe (40:1) + H]+, [PC (38:5) + H]+ 27 832,6 [PC (38:4) + Na]+ 28 834,6 [PC (40:6) + H]+ 28 841,5 seminolipid (1-O-palmityl-2-O-palmityl-3-β-(3’- sulfogalactosyl)-glicerol 27 939,6 TAG (56:1) 33 Identificação baseada na literatura. PC: fosfatidilcolina; SM: esfigomielina; PE: fosfatidiletanolamina; TAG: triacilglicerol; PC com e e/ou p refere-se as subspecies plasmanyl e plasmenyl respectivamente. A diferença do perfil de fosfolipídios, por PLS-DA, está representada na Figura 2. Foram identificados, pelo análise de Volcano Plot, três íons lipídicos (m/z 728,5, m/z 741,4 e m/z 744,5) diferentes (p<0,05) entre os grupos (Figura 2, Figura 3). Estes três principais ions foram encontrados em maior abundância relativa nos animais MM (Figura 4 e Figura 5).   44   Figura 2 – Representação gráfica da diferença do perfil de fosfolipídios, analisado por PLS–DA, entre os grupos MM (Vermelho, n=21) e QM (Verde, n=22). Figura 3 – Ions, identificados pelo teste Volcano plot, que se diferenciam entre as raças QM (n=22) e MM (n=21).   45   Figura 4 – Representação gráfica de heatmap dos identificando os principais íons diferenciais entre os perfis lipídicos de cada animal. As caixas coloridas à direita indicam as abundâncias relativas dos íons dos grupos estudados. Figura 5 – Representação gráfica da diferença da abundância relativa dos íons m/z 728,6; 741,5 e 744,5 entre as raças QM (n=22) e MM (n=21), com os valores de p e fold change (FC). 4. Discussão No presente estudo foram selecionados garanhões das raças QM e MM, com boa fertilidade do sêmen fresco (>70%) e qualidade seminal normal para a espécie (Motilidade total >60% e motilidade progressiva >20%). Entretanto, pode-se observar, no sêmen fresco, que os animais da raça QM já p=0,016 FC=1,59 p=0,018 FC=2,25 p=0,015 FC=2,00   46   apresentavam melhor qualidade seminal em relação aos MM. Além disso, os animais da raça MM demonstraram uma maior susceptibilidade à danos espermáticos decorrentes dos processos de refrigeração e congelação. Estes dados corroboram com Alvarenga et al. [14] e Alvarenga et al. [7], que observaram que os animais da raça MM possuem uma maior sensibilidade ao processo de congelação de sêmen. Neste estudo os autores observaram que somente 11,7% dos garanhões da raça Mangalarga Marchador apresentaram motilidade total superior a 40% após a congelação, enquanto 50% dos QM apresentaram esta porcentagem. Além disso, os achados do presente estudo concordam o trabalho realizado por Fárras et al. [13], no qual observou-se uma maior sensibilidade na cinética espermática e integridade de membrana plasmática do sêmen refrigerado dos animais da raças MM em relação aos QM. Espermatozoides da raça MM demosntraram maior abundância relativa de 3 fosfolipídios na membrana em relação aos espermatozoides da raça QM. A maior susceptibilidade de danos espermáticos decorrentes dos processos de criopreservação podem ser explicados pela diferença em três fosfolipídios (m/z 728,6; m/z 741,5 e m/z 744,5) das membranas espermáticas dos animais MM em relação aos QM, uma vez que é conhecida a relação da composição lipídica da membrana plasmática dos espermatozoides com a sua resistência à criopreservação em outras espécies [9, 10, 15]. Além disso, esta diferença lipídica da membrana espermática entre os animais MM e QM pode explicar a predisposição racial da resistência à criopreservação, uma vez que THURSON et al, [6] observaram que as características de membrana são geneticamente transmitidas em suínos e congelabilidade é geneticamente determinada, provavelmente por alterações que ocorrem durante a espermatogênese, fato similiar pode estar ocorrerendo nos garanhões do presente estudo, pois há uma diferença racial na composição lipídica da membrana espermática e na resistência espermática à criopreservação. Adicionalmente, durante a criopreservação espermática ocorrerem rupturas das membranas que ocasionam perda da viabilidade dos espermatozoides [34], sendo os fosfolipídos e colesterol, importantes para a manutenção de sua integridade estrutural e fluidez [35]. A diferença existente entre os fosfolipídios pode representar a instabilidade da membrana   47   espermática destes animais e/ou alterar a sua fluidez. A diferença na composição de fosfolipídios das membranas dos animais MM pode também ser responsável pela maior porcentagem de espécies reativas de oxigênio e maior peroxidação lipídica da membrana plasmática observados no sêmen congelado nesta raça em relação aos QM. Devido à remoção das enzimas antioxidantes durante o processo de congelação, ocorre uma produção natural ROS, Entretanto quando ocorre aumento de sua produção de ROS, há uma interação com os fosfolipídios da membrana espermática que promove a maior peroxidação lipídica, alterando a fluidez e a integridade da membrana, e consequentemente prejudicando à capacidade fecundante e a motilidade espermática [36]. A maior abundância relativa de alguns fosfolipídios nas membranas espermáticas dos garan