UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO GUILHERME DOS SANTOS LIMA DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO EM FÍGADO DE LOBO MARINHO SUL- AMERICANO (Arctocephalus australis) Rio Claro 2019 CIÊNCIAS BIOLÓGICAS GUILHERME DOS SANTOS LIMA DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO EM FÍGADO DE LOBO MARINHO SUL- AMERICANO (Arctocephalus australis) Orientador: Prof. Dr. AMAURI ANTONIO MENEGÁRIO Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharel em Ciências Biológicas. Rio Claro 2019 L732d Lima, Guilherme dos Santos Determinação de Mercúrio em fígado de Lobo marinho Sul-americano (Arctocephalus australis) / Guilherme dos Santos Lima. -- Rio Claro, 2019 22 p. : il., tabs., mapas Trabalho de conclusão de curso (Bacharelado - Ciências Biológicas) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientador: Amauri Antonio Menegário 1. Mércurio. 2. Arctocephalus australis. 3. Bioacumulação. 4. Bioindicador. 5. CVAFS. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. RESUMO O mercúrio possui alta mobilidade, elevado potencial de bioacumulação e pode provocar sérios riscos toxicológicos. Assim sendo, a determinação e monitoramento de suas concentrações em tecidos biológicos são de extrema importância para identificar os seus efeitos contaminantes nos ecossistemas. Foi determinado a concentração de Mercúrio (Hg) em fígado de 19 espécimes de lobo marinho sul-americano (A. australis), encontrados encalhados na costa brasileira (provenientes do Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de Santos - PMP-BS), utilizando a técnica espectrometria de fluorescência atômica associada à geração de vapor frio (CVAFS). A média da concentração de Hg encontrada nos espécimes foi de 6,26 mg/Kg, sendo a concentração mínima encontrada igual a 0,09 mg/Kg e a maior concentração igual a 15,66 mg/Kg. Não foi verificado existência de correlação entre as variáveis biológicas (sexo, comprimento total e peso) e a concentração de Hg em fígado de A. australis. Palavras-chave: Arctocephalus australis. Hg. Bioindicador. Bioacumulação. SUMÁRIO 1- INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 4 2- OBJETIVOS .......................................................................................................................... 7 3- MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 7 3.1- Coleta de amostras .............................................................................................................. 7 3.2- Materiais e descontaminação .............................................................................................. 8 3.3- Aparelhos e Instrumentação ................................................................................................ 9 3.4- Reagentes, Solução padrão e Materiais de referência ......................................................... 9 3.5- Preparação da amostra (Procedimento) ............................................................................. 10 3.6- Determinação de Mercúrio ................................................................................................ 11 3.7- Análise estatística .............................................................................................................. 11 4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 11 4.1- Distribuição dos espécimes ............................................................................................... 13 4.2- Correlações ........................................................................................................................ 14 5- CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 19 6- REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 19 4 1- INTRODUÇÃO Os elementos-traços são componentes naturais do sistema biogeoquímico da terra (LUOMA, 1983). Podem ser classificados em dois diferentes grupos: essenciais do ponto de vista biológico e não essenciais, com funções biológicas não conhecidas (UNDERWOOD, 1977; KEHRIG, 2009). Embora alguns elementos-traços sejam essenciais para a vida, todos podem sob condições específicas, se tornar contaminantes ou poluentes de solo e água, causando impactos negativos aos ecossistemas (LUOMA, 1983; GUILHERME et al., 2005). Os processos que ocorrem nos sistemas biogeoquímicos desempenham um grande papel na regulação da introdução de elementos-traços em ambientes aquáticos (PARAQUETTI et al., 2004). Grandes quantidades são expelidos para os sistemas aquáticos por meio de efluentes, por conseguinte, as atividades antrópicas têm assim alterado o ciclo biogeoquímico dos elementos-traços na zona costeira (PARAQUETTI et al., 2004). Segundo Luoma (1983), a introdução e redistribuição física e geoquímica de elementos-traços em ambientes aquáticos por atividades antrópicas tem grande potencial para perturbar os ecossistemas aquáticos. Estas atividades têm resultado na emissão de uma elevada quantidade de elementos-traços potencialmente tóxicos nos ecossistemas, ocasionando em concentrações acima dos níveis ambientais normais (WALDICHUK,1989; TANABE,1994; DE MORENO et al., 1997). Devido a isso, é necessário que os efeitos dessas atividades provindas da demanda do antropocentrismo estejam sendo monitorados, para que um ecossistema saudável possa ser mantido, visando assim um mínimo impacto ambiental dessas atividades. O mercúrio está entre os elementos-traços presentes nos efluentes industriais e agrícolas, dos quais provocam grande interesse ambiental (KEHRIG, 2011). O mercúrio (Hg) é um elemento onipresente com maior risco ambiental e que também afeta a saúde humana, sendo liberado no ambiente tanto por fontes antropogênicas quanto fontes naturais (GAO, 2012; BISINOTI 2004; PARAQUETTI, 2004). A emissão de Hg no solo, águas e atmosfera tem sido significantemente elevada no Antropoceno, devido ao crescimento populacional e urbanização (GAO, 2012; SELIN, 2009). Estima-se que dois terços do Hg biodisponível, são de origem antropogênica e apenas um terço é proveniente de fontes naturais (MOREL, 1998). O Hg natural surge da gaseificação da crosta terrestre por meio dos vulcões e provavelmente da volatilização dos mesmos nos oceanos (BOENING, 2000). Os sedimentos bentônicos, fontes hidrotermais e deposição atmosférica direta, também são outras fontes naturais (MASON, 2012). A amalgamação na 5 purificação do ouro, mineração, queima de combustíveis fósseis, baterias, tintas, agricultura, lixiviação de aterro etc., são as principais atividades antrópicas consumidoras de Hg (VIEIRA et al., 2000; BOENING, 2000; PARAQUETTI, 2004). Foi após a “Doença de Minamata (Japão)”, ocorrida em 1953, quando um grupo de pessoas morreram ao se alimentarem de peixes contaminados com Hg, que alertou ao mundo os perigos de poluição ambiental com o elemento (FLORENCE, 1983; BISINOTI, 2004). O Hg no ambiente possui diversas vias em que o elemento pode seguir no ciclo biogeoquímico (BISINOTI, 2004; BOENING, 2000). Dentre elas, ocorre a liberação de Hg do solo e da água para atmosfera, seguida da deposição atmosférica, bioconversão em formas voláteis ou solúveis (metilação/ desmetilação), e bioacumulação na cadeia alimentar (BISINOTI, 2004). Para se compreender a toxicidade dos compostos de Hg no ambiente é necessário que se estude o ciclo biogeoquímico do Hg (BISINOTI, 2004). De acordo Boening (2000), o Hg é um elemento-traço líquido a temperatura e pressão ambiente. Porém, este elemento pode estar presente em distintas formas químicas dissolvidas no ambiente, assim como adsorvido nos sedimentos de fundos de ambientes aquáticos (PARAQUETTI, 2004). Estes compostos, se solúveis em água, passam a ser biodisponíveis e potencialmente tóxicos (BOENING, 2000). A principal toxicidade do elemento para os seres humanos e para o ambiente está relacionada ao metilmercúrio (MeHg) (PARAQUETTI, 2004; SELIN, 2009). Sabe-se que a contaminação por MeHg em humanos, ocorre principalmente através da ingestão de peixes contaminados (BISINOTI, 2004). Desse modo, os efeitos adversos provocados por níveis elevados de elementos-traços, no solo, água, sedimento, e em tecidos biológicos tem tido uma preocupação crescente (PEIJNENBURG, 2003). O Hg é um elemento penetrante que bioacumula nos organismos e é altamente tóxico, assim é provavelmente o mais estudado de todos os elementos-traços não essenciais no ambiente (MOREL, 1998). A exposição ambiental ao Hg (especialmente na forma de MeHg) via cadeia alimentar é significantemente maior em animais de topo de cadeia, uma vez que este elemento apresenta alta toxicidade e capacidade de sofrer biomagnificação (KEHRIG et al., 2002; KEHRIG, 2011; GAO, 2012). O processo de biomagnificação ocorre através da transferência de elementos contaminantes de um nível trófico a outro, exibindo concentrações crescentes à medida que passam para os níveis superiores (LOPES, 2012). Diferentes processos ambientais e biológicos podem influenciar a acessibilidade de elementos-traços a organismos, afetando assim a biodisponibilidade dos mesmos no ambiente 6 (LUOMA, 1983; PEIJNENBURG, 2003). As características da interface entre o meio ambiente e um organismo influenciam diretamente na forma como o elemento-traço é bioacumulado (LUOMA, 1983). Deste modo a bioacumulação de elementos-traço nos organismos aquáticos é de interesse para a ciência ambiental, e ciência da saúde, devido à crescente preocupação com os destinos e os efeitos dos contaminantes na cadeia alimentar (REINFELDER, 1998). Organismos aquáticos em todos os níveis tróficos acumulam Hg nos tecidos, seja de origem orgânica ou inorgânica (BOENING, 2000; BISINOTI, 2004). Os mamíferos marinhos predadores de topo tem grande potencial para absorver e acumular Hg associados a águas costeiras, em concentrações de várias ordens de grandeza acima das concentrações na coluna d'água e em sedimentos, podendo assim indicar a dinâmica destes contaminantes no ambiente (TANABE et al., 1994; DE MORENO et al., 1997; KEHRIG et al., 2009). Assim, mesmo em níveis de baixas concentrações no ambiente, o Hg pode bioacumular e se elevar quanto maior o nível trófico do animal. Portanto, animais de níveis tróficos superiores têm maior relevância em estudos aplicados a biomagnificação, uma vez que, se um elemento é biomagnificado a cada etapa trófica, então os organismos de topo de cadeia podem ser afetados em maior grau pela contaminação presente no ambiente (REINFELDER, 1998). Além disso, espécies que forrageiam em áreas costeiras urbanizadas podem ser mais suscetíveis a acumular elementos- traços potencialmente tóxicos provindos de insumos naturais e antropogênicos (MCHURON et al. 2014). O Arctocephalus australis (A. australis, ZIMMERMANN, 1783), referenciado popularmente de Lobo-marinho-sul-americano (MACHADO, 2009), é o pinípede predador de topo com mais ampla distribuição no hemisfério sul, com ocorrência entre sul do Brasil, até centro do Peru (MAJLUF; TRILLMICH, 1981; RIEDMAN, 1990; NAYA et al., 2002; DEMÉRÉ et al., 2003). São poucos os estudos envolvendo a determinação de potenciais contaminantes (e, principalmente, Hg) em A. australis. Gerpe et al. (1990) estudaram a presença de Hg em rim, fígado e músculo de indivíduos adultos de A. australis, por meio da espectrometria de absorção atômica. Fossi et al. (1997) determinaram a concentração de Hg (peso seco) em indivíduos de A. australis no sudoeste do atlântico. Gerpe et al. (2009) estudaram o aumento da concentração de Hg em filhotes de A. australis do Uruguai e norte da Argentina após o período de lactação. Gerpe et al., (1990), Baraj et al., (2009) relataram em seus estudos sobre A. australis que o tecido de fígado apresentou maiores níveis de 7 concentrações de Hg em comparação aos outros tecidos, como rim e músculo. Boening, (2000), relatou em seu estudo que o fígado é o principal local de biotransformação de MeHg em animais. No entanto em todos os trabalhos citados acima, o n amostral de espécimes de A. australis foi extremamente baixo (n< 8), exceto Gerpe et al. (2009), e apresentando concentrações de apenas um estágio de crescimento. Tornando impossível avaliar as concentrações de Hg e correlacionar com os parâmetros biológicos por meio de análise estatística. Assim sendo, a determinação e quantificação da concentração dos elementos-traços acumulados em organismos, podem indicar informações da quantidade de elementos biodisponíveis em um determinado habitat. Neste trabalho, os resultados obtidos da concentração de Hg em amostras biológicas de A. australis foram caracterizados quanto a influência do sexo, estágio de desenvolvimento, comprimento total e peso. Esses dados podem ajudar a estabelecer níveis de referência de concentração de Hg em fígado de A. australis, podendo vir a ser utilizados posteriormente em estudos comparativos sobre acúmulo de Hg entre espécies de topo de cadeia, deste modo, servindo como bioindicadores da qualidade do ambiente. 2- OBJETIVOS O objetivo do presente estudo foi avaliar a concentração de Hg em amostras de fígado de lobo marinho sul-americano (A. australis), encontrados encalhados na costa brasileira. 3- MATERIAIS E MÉTODOS 3.1- Coleta de amostras As amostras de tecidos de fígado foram oriundas de 19 indivíduos A. australis, encontrados encalhados na costa Brasileira, provenientes do Projeto de Monitoramento de Praias da Bacia de Santos (PMP-BS) no período de 2015 a 2018 (Figura 1). As coletas foram realizadas em projeto de monitoramento ambiental exigido pelo IBAMA no licenciamento ambiental das atividades de produção e escoamento de petróleo e gás natural no pré-sal. Foram coletadas apenas amostras biológicas de indivíduos que vieram a óbito em um curto período após o atendimento veterinário ou que morreram durante o transporte. Os animais que 8 morreram em tratamento não foram selecionados para o teste de elementos traços, pois as concentrações encontradas poderiam ser provenientes da etapa de tratamento veterinário, não correspondendo às concentrações normais de um animal selvagem. Os parâmetros biológicos, localização e data de coleta foram registrados para cada espécime (Tabela 1). A entrega das amostras no Centro de estudos ambientais da UNESP – CEA (local do presente estudo) foi realizada pela UNIVALI e CTA, instituições responsáveis respectivamente pelo PMP-BS Fase 1 e Fase 2. Após o recebimento, as amostras foram armazenadas em ultra freezer (- 80 °C). 3.2- Materiais e descontaminação Todos os materiais e acessórios (espátulas, tubos Falcon, gral, pistilo etc.) utilizados foram previamente descontaminados com o seguinte procedimento: Imersão em um banho de HNO3 10% (v/v) durante no mínimo 4h e posteriormente lavagem com água ultrapura tipo 1(AUT1) [5 vezes]. Após esse procedimento, todo o material foi seco em capela de fluxo laminar. Os frascos de digestão foram descontaminados respectivamente com o seguinte Figura 1. Localização por coordenadas geográficas dos espécimes de Arctocephalus australis (círculos preenchidos) encontrados encalhados. O mapa apresenta divisão territorial por mesorregiões com colorações distintas na área de extensão do PMP-BS. 9 procedimento: rodada de digestão com 15 mL de HNO3 concentrado, lavagem com AUT1 (5 vezes), rodada de digestão com 15 mL de AUT1 e por fim lavagem com AUT1 (5 vezes). Todos os equipamentos, acessórios e reagentes que foram utilizados no presente estudo estão disponíveis no CEA/ UNESP, onde o projeto foi desenvolvido. 3.3- Aparelhos e Instrumentação Um espectrômetro de fluorescência atômica (AFS) (PS Analytical modelo Millennium Merlin - Kent - Reino Unido), foi utilizado para a determinação de Hg. O instrumento está equipado com amostrador automático; bomba peristáltica; válvula solenoide de comutação controlada via software; controladores de fluxo de massa, e separador líquido-gás. O instrumento está inserido em sala pressurizada e temperatura controlada com classificação ISO 7 (Classe 10.000) e procede em condições operacionais e químicas para determinar concentrações de Hg, descrito em mais detalhes em outros trabalhos (JONES 1995, RAHMAN 2000). A digestão das amostras foi realizada por via úmida em sistema fechado assistida por radiação micro-ondas. Foi utilizado o modelo de forno de micro-ondas Ethos UP (Milestone MLS, Sorisole, Itália) equipado com um rotor de média pressão com 44 recipientes TFM (MAXI-44) com um volume de 100 ml. O rotor é totalmente controlado por sensor infravermelho sem contato para controlar a temperatura e a pressão de cada tubo. Para a digestão foi utilizado um programa com dois passos: Rampa 1 - Elevar temperatura até 170º em 20 minutos, manter a 170º por 5 minutos, em potência 1600 MW; Rampa 2 - Elevar de 170º até 200º em 10 minutos e manter 200º por 20 min, potência 1600 MW e depois resfriar. 3.4 – Reagentes, Solução padrão e Materiais de referência Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. Água ultrapura tipo 1(AUT1), obtida de um Sistema de Purificação de Água (Milli-Q® Direct) foi utilizada em todas as soluções, reagentes e amostras preparadas. Ácido nítrico - HNO3 concentrado (bidestilado abaixo do ponto de ebulição) e ácido clorídrico - HCl concentrado (bidestilado abaixo do ponto de ebulição), foram utilizados para digestão do tecido. Solução contendo Brometo de potássio - KBr (1,19% m/V) / Bromato de potássio - KBrO3 (0,28% m/V) foi utilizado como digestor de MeHg a Hg2+; e solução de cloridrato de hidroxilamina - NH2OH (5% m/V) foi utilizada para neutralizar o excesso da solução KBr/KBrO3. 10 Foi preparado 5 soluções-padrão (com concentrações de 0 μg kg-1; 0,1 μg kg-1; 0,25 μg kg-1; 0,5 μg kg-1; 1,0 μg kg-1) obtidas a partir de diluições sucessivas de uma solução- padrão estoque certificada para calibração do equipamento. Adicionou-se nas soluções-padrão de Hg a mesma quantidade das soluções de KBr/KBrO3, HCl e NH2OH adicionada nas amostras digeridas. Utilizou-se uma solução de cloreto de estanho - SnCl2 2% (m/V) adicionado on-line e dissolvido em HCl (10% V/V), como agente redutor de Hg2+ a Hgº. Duas amostras biológicas de referência (uma certificada): TORT-3 (hepatopâncreas de lagosta, National Research Council - CANADÁ) e MR (Tecido animal - fígado bovino in natura enriquecida de Hg), com concentração conhecida de Hg foram utilizadas para avaliar a exatidão das análises. 3.5 – Preparação da amostra (Procedimento) O procedimento adotado na preparação das amostras seguiu como base os protocolos EPA 245.7 e 7474. Adicionou-se aproximadamente 0,5 g de amostra úmida (in natura), macerados anteriormente com gral e pistilo, nos frascos de digestão previamente descontaminados. Anotado o valor acrescentado, transferiu-se ao frasco 2 mL HNO3 concentrado (bidestilado), 6 mL HCl concentrado (bidestilado) e foram fechados os frascos para pré-digestão em temperatura ambiente durante uma noite (overnight). Esses valores foram também adicionados em um frasco sem amostra (branco), para certificar a eficiência do procedimento de descontaminação dos frascos. Após essa fase, os frascos foram submetidos ao processo de aquecimento no forno de micro-ondas. Após a digestão, o extrato digerido da amostra foi transferido quantitativamente para tubos Falcon, lavando o frasco com AUT1 e transferindo para os tubos, até o volume final para aproximadamente 15 mL, obtendo-se o valor de extrato concentrado. Por fim, a massa do extrato concentrado foi pesada utilizando balança analítica, obtendo-se o primeiro fator de diluição. Posteriormente ao processo de digestão, o extrato concentrado foi dividido em pseudo- réplicas (digeridos diluídos) para ser analisados em triplicatas, transferindo-se os seguintes valores para tubos Falcon de 15 ml: 0,6 mL do digerido; 1,2 mL KBr / KBrO3; 0,75 mL de HCl e depois avolumado com AUT1 até aproximadamente 15 mL. Após esse procedimento manteve-se as pseudo-replicas por 30 minutos em reação/ repouso. Ao fim do repouso foi adicionado 0,2 mL de NH2OH nas pseudo-replicas e pesado os tubos em balança analítica para se obter o segundo fator de diluição. Por fim, as triplicatas foram analisadas por meio da 11 técnica analítica de espectrometria de fluorescência atômica com geração de vapor frio (CVAFS) para determinação da concentração de Hg. 3.6- Determinação de Mercúrio Após os ajustes instrumentais do equipamento, as amostras foram quantificadas utilizando as soluções-padrão. Os controles de qualidade (soluções padrões, materiais de referência e brancos) foram analisados em triplicata antes das amostras para avaliar a exatidão das análises. O padrão de recuperação da curva durante as determinações foi mantido entre 90 – 110%. Por fim, as concentrações de Hg nas amostras foram expressas em mg kg-1 de amostra (peso úmido), por meio do resultado do equipamento subtraído do resultado da média do branco, e multiplicado pelos fatores de diluição. 3.7- Análise estatística A elaboração de mapas e gráficos foram realizadas respectivamente nos seguintes softwares: Qgis e Tableau Desktop. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software de domínio livre BIOSTAT. Os dados da concentração de Hg foram testados para verificar a distribuição normal por meio do teste de Shapiro-Wilk. Como os dados não mostraram distribuição normal, não se testou a homogeneidade das variâncias. Devido a estes resultados foi aplicado o teste não paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney, assumindo um nível de significância de 5%. Optou-se por este teste, uma vez que os dados apresentaram distribuição independente, não normal e com tamanho amostral de n<50. 4- RESULTADOS E DISCUSSÃO O Limite de Detecção (LD) obtido foi de 0,007 mg/Kg e o Limite de Quantificação (LQ) foi de 0,02 mg/Kg utilizando as normas para Hg do Instituto Nacional de Metrologia Normalização e Qualidade Industrial (INMETRO, 2010). Os parâmetros biológicos dos espécimes de A. australis apresentados na tabela 1, indicam três classes de estágio de desenvolvimento – filhotes, juvenis e adultos, com um conjunto representando indivíduos majoritariamente juvenis (n=15), enquanto adultos (n=2), filhote (n=1), e um espécime com estágio não informado. Em relação ao sexo, apresentam fêmea (n=7) e macho (n=12). As 12 concentrações determinadas no fígado para cada espécime são mostradas por meio do boxplot na figura 2. A média de concentração de Hg encontrada nos espécimes foi de 6,26 mg/Kg, sendo a concentração mínima encontrada no espécime 5, igual a 0,09 mg/Kg e a maior concentração no espécime 15, igual a 15,66 mg/Kg. O desvio padrão dos dados foi 4,97 mg/Kg. Por ser um elemento não essencial já se esperava que fosse encontrado variação nas concentrações de Hg determinada nos espécimes, uma vez que o elemento não possui função biológica conhecida (CÁCERES-SAEZ et al., 2013). Essa variação nas concentrações de Hg determinadas, podem ser devido as diferenças nos hábitos alimentares entre os espécimes e/ou devido a exposição a níveis ambientais em determinadas regiões (KEHRIG et al., 2009; CÁCERES-SAEZ et al., 2013). Naya et al. (2002) relataram em seu estudo que a dieta de A. australis é composta principalmente por peixes teleósteos e cefalópodes, e varia fortemente entre os anos, isto provavelmente causado pela variação na disponibilidade de presas. 13 Figura 2. Relação entre as concentrações de Hg (mg/Kg) em fígado de exemplares de A. australis de acordo com cada espécime amostrado. (Q1=1,90; Mediana= 5,17; Q3=11,03; Mínimo= 0,09; e Máximo= 15,66). 4.1 Distribuição dos espécimes Figura 3. Mapa de densidade de Kernel 14 Aproximadamente 90% dos espécimes encontrados estavam localizados no estado de Santa Catarina (Figura 3). Os municípios do estado de SC com maior amostragem foram em Laguna, onde foram coletados 5 espécimes e em Imbituba, com 4 espécimes coletados. A maior concentração de Hg determinados em espécimes coletados no estado foi 15,66 mg/Kg, no município de Imbituba e a menor é igual a 0,09 mg/Kg no município de Itajaí. Foi coletado também um espécime no estado do Paraná, no município de Pontal do Paraná com concentração de 10,8 mg/Kg e outro no estado do Rio de Janeiro, no município de Marica, com 4,92 mg/Kg. O estado de São Paulo foi o único estado da extensão do PMP-BS sem representantes amostrados. Assim sendo, não foi possível fazer uma correlação entre a concentração de Hg e a localidade dos espécimes por estados, uma vez que os estados de RJ, PR e SP apresentam um n =1 ou n =0, limitando a análise estatística. A maioria dos registros dos pinípedes foram no sul do brasil e são poucos nas demais regiões (MAYORGA et al. 2016). Apesar de A. australis apresentar ocorrência nos estados do sul e sudeste brasileiro, não existem colônias reprodutivas da espécie na costa brasileira, portanto, provavelmente estes são indivíduos das colônias reprodutivas do Uruguai (ABREU, 2011; AMORIM, 2014; CRESPO et al, 2015; MAYORGA, et al. 2016). Logo, essa maior densidade de coletas no estado de SC, pode ser justificada pela maior distribuição da espécie na região sul. 4.2 Correlações Foi realizada a análise do efeito do sexo dos espécimes sobre a concentração de Hg determinada (Figura 4). Em seu estudo Gerpe., et al (1990) relatou uma diferença de concentração de Hg entre machos e fêmeas de A. australis, relatando os valores da média de concentração para Hg (peso úmido), em fêmea igual a 39,90 mg/Kg e em macho 25,00 mg/Kg. Justificando, que essa menor concentração de Hg em macho deve-se a um fator comportamental que ocasiona em uma alteração na sua dieta, diminuindo assim a proporção de peixes na sua dieta e aumento no consumo de lulas (GERPE., et al. 1990). Os valores (dados em [mg/Kg]) obtidos no presente estudo da média para fêmea (n=7) foram iguais a 6,70 e para macho (n=12) iguais a 6,0. A média de concentração de Hg determinada no fígado de A. australis no presente estudo se encontra abaixo da observada por Gerpe em espécimes do Uruguai, há aproximadamente três décadas atrás. Aplicado o teste de Wilcoxon-Mann- Whitney, não foi constatado diferença significativa entre o grupo de machos e fêmea, 15 comprovando que os níveis de concentração de Hg não dependem do sexo dos espécimes. A inconsistência ocorre provavelmente porque, no presente estudo, o n amostral foi majoritariamente de indivíduos juvenis, ou seja, a maioria dos indivíduos não apresentam maturação sexual completa. Os valores obtidos do teste foram de U= 37, Z(U) = 0,42, p-valor (unilateral) = 0,33, p-valor (bilateral) = 0,67, sendo atribuído valor estatístico de p= 0,05. Embora, a correlação entre concentração de Hg e sexo não ocorra estatisticamente, a média encontrada de Hg nas fêmeas foi levemente superior ao apresentado nos machos, o que poderia ser justificado pela alteração na dieta em machos. Segundo Naya et al. (2002), as fêmeas de A. australis em seu período de lactação são restritas a uma faixa de forrageamento, pela necessidade de retornar aos filhotes frequentemente. Causando uma redução na seletividade de presas durante período de lactação, e após esse período é possível observar um aumento na diversidade de sua dieta (NAYA., et al. 2002). Portanto, a maior concentração de Hg em fêmeas (mesmo que pequena), pode ser devido a uma menor diversidade de presas em sua dieta. Figura 4. Relação entre as concentrações de Hg [mg/Kg] em fígado de espécimes de A. australis de acordo com o sexo dos indivíduos. Fêmea (n=7) e macho (n=12). 16 A Figura 5 apresenta a relação dos valores das concentrações de Hg com o estágio de desenvolvimento do espécime. O valor mínimo e máximo determinados em espécimes adultos (n = 2) foram respectivamente; 0,09 e 1,47 mg/Kg. Em filhotes (n = 1) a concentração determinada foi 4,92 mg/Kg. A classe de juvenis foi a mais representativa com n = 15, com média de concentração de Hg igual a 6,74 mg/Kg, e valores mínimo e máximo respectivamente iguais a 0,17 e 15,66 mg/Kg. Determinou-se também a concentração de um espécime com o sexo não informado, com valor igual a 11,37 mg/Kg. Não foi possível realizar testes estatísticos de tendência central para esta correlação, uma vez que não existia um valor de n amostral significativo nas classes de adulto e filhote. No entanto, não foi constatado nenhum aumento de concentração de Hg relacionado ao estágio de desenvolvimento, pois, os espécimes adultos amostrados apresentaram concentrações de Hg inferiores em relação as classes de juvenis e filhotes. Provavelmente este fato deve-se a maior diversidade na dieta, e na maior área de forrageamento dos espécimes que estão no clímax do desenvolvimento. Gerpe et al. (1990) demonstrou em seu estudo em espécimes de A.australis que as concentrações de elementos-traços aumentam linearmente com o estágio de crescimento dos indivíduos, concluindo no estudo, uma dependência do teor de elementos-traços com a idade dos organismos. Contudo, em seu trabalho foram amostrados apenas indivíduos adultos (n=8), sendo 5 fêmeas e 3 machos. Sabe-se que a concentração inicial de Hg em filhotes de A. australis pode ser proveniente de transferência materna (placenta e/ou leite), porém, é o Figura 5. Relação entre as concentrações de Hg [mg/Kg] em fígado de espécimes de A. australis de acordo com o estágio de desenvolvimento. a Ni= não informado 17 consumo de peixe o principal contribuinte para acúmulo de Hg em A. australis (GERPE et al. 2009). Gerpe et al. (2009) observou em seus estudos que filhotes em período de lactação apresentam baixas concentrações de Hg e após o período de lactação e ingresso na alimentação dependente de sólidos (peixes e lulas), as concentrações são maiores. Para testar a relação da concentração de Hg com o comprimento total dos espécimes (Figura 6), foi necessário excluir os espécimes 1 e 14, os quais não foram obtidos os valores de comprimento. Esta análise foi realizada por meio da correlação do coeficiente de Spearman. Os valores obtidos para n = 17 do teste foram: Coeficiente de Spearman (rs)= 0,07; t = 0,30; (p) = 0,76. Não sendo observado correlação entre as duas variáveis. O espécime 6, com 155 cm de comprimento total, apresentou concentração de Hg igual a 1,47 mg/Kg. Enquanto o espécime 2 com 71cm de comprimento total, apresentou concentração de Hg igual a 1,09 mg/Kg. Com isto, o presente estudo não corrobora com o pressuposto de dependência da concentração de elementos-traços com o estágio de crescimento dos organismos para o Hg. Figura 6. Concentração de Hg (mg/Kg) com relação ao comprimento total (cm) em fígado de espécimes A. australis. a Ni= não informado 18 A análise da relação de concentração de Hg em relação ao peso também foi realizada por meio do coeficiente de Spearman (Figura 7). Assim como o comprimento total, o peso dos espécimes não apresentou correlação significativa com a concentração de Hg. O teste apresentou coeficiente de Spearman (rs)= 0,02, t = 0,10, (p)= 0,91 com valor amostral de n =19. Assim sendo constata-se que a concentração de Hg não depende dos parâmetros biológicos analisados no presente estudo como sexo, comprimento total e peso. Figura 7. Concentração de Hg [mg/Kg] com relação ao Peso (kg) em fígado de espécimes A. australis. Os dados obtidos no presente estudo também foram comparados com o estudo realizado por Baraj et al. (2009). Os valores determinados por Baraj para concentração de Hg (peso úmido) em A. australis (N=8) variam de 0,319 a 54,22 mg/Kg. Comparando com os valores obtidos no presente estudo, observa-se que nenhum indivíduo apresentou concentração superior ao relatado por Baraj, sendo a maior concentração igual a 15,66 mg/Kg, três vezes menor do que a maior concentração relatada em seu estudo. Os mamíferos marinhos apresentam alguns mecanismos de defesa que podem proteger contra os efeitos negativos do Hg (MCHURON et al. 2014). Alguns trabalhos relatam que por meio do efeito antagonista, o Selênio é capaz de realizar o processo de desmetilação de Hg 19 (KOEMAN et al., 1975; LAILSON-BRITO et al., 2012; PELLETIER, 1986; WAGEMANN et al., 1998). Por assim dizer, entende-se no presente estudo que para avaliar a suscetibilidade da concentração de Hg em organismos marinhos de topo de cadeia, é necessário determinar também a concentração de elementos-traços que possam atuar na desmetilação do Hg, estudando assim os possíveis mecanismos de defesa, reguladores de concentrações de elementos-traços não essenciais (especialmente Hg) em organismos de topo de cadeia. 5- CONCLUSÃO O elevado potencial de biomagnificação, flexibilidade e a alta mobilidade do Hg no ecossistema marinho ressaltam a importância de estudos de levantamento e monitoramento dessas concentrações em tecidos biológicos. Não foi verificado existência de correlação entre as variáveis biológicas (sexo, comprimento total e peso) e a concentração de Hg em fígado de A. australis. A variação nas concentrações de Hg em espécimes de A. australis ocorre provavelmente, devido a diferenças regionais na biodisponibilidade de mercúrio no ambiente, e/ou devido a diferenças nos hábitos alimentares dos espécimes. Pois a presença de Hg em mamíferos marinhos pode ser reflexo da bioacumulação no alimento e essa bioacumulação é influenciada pelo nível de biodisponibilidade do elemento no ambiente, seja ele de fonte natural ou antropogênica. 6- REFERÊNCIAS ABREU, A. R., Diversidade genética e estrutura populacional do lobo-marinho sul- americano (Arctocephalus australis, mammalia, carnivora, otariide) ao longo da costa atlântica da América do Sul. 2011. 42 f Dissertação de Mestrado - Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2011. AMORIM, D. 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