ADHARA SMITH NÓBREGA Biocompatibilidade de pigmentos e a influência de diferentes métodos de incorporação em propriedades físicas e mecânicas de silicones para próteses bucomaxilofaciais Araçatuba – SP 2017 ADHARA SMITH NÓBREGA Biocompatibilidade de pigmentos e a influência de diferentes métodos de incorporação em propriedades físicas e mecânicas de silicones para próteses bucomaxilofaciais Tese apresentada à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- UNESP, para obtenção do Título de DOUTORADO EM ODONTOLOGIA (Área de concentração em Prótese Dentária). Orientador: Prof. Titular. Marcelo Coelho Goiato Araçatuba – SP 2017 Catalogação na Publicação (CIP) Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação – FOA / UNESP Nobrega, Adhara Smith. N754i Biocompatibilidade de pigmentos e a influência de diferen- tes métodos de incorporação em propriedades físicas e mecâ- nicas de silicones para próteses bucomaxilofaciais / Adhara Smith Nobrega. - Araçatuba, 2017 151 f. : il. ; tab. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientador: Prof. Marcelo Coelho Goiato 1. Prótese maxilofacial 2. Elastômeros de silicone 3. Cor 4. Corantes 5. Citotoxicidade imunológica I. T. Black D3 CDD 617.69 Dados Curriculares Adhara Smith Nóbrega Nascimento 11/11/1987 – São Paulo – SP/Brasil Filiação Nilva Marisa Andrade Smith Rogério Nobrega 2008/2011 Graduação em Odontologia Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista - Júlio de Mesquita Filho 2012/2014 Curso de especialização em Prótese Dentária na Faculdade de Odontologia de Araçatuba – Universidade Estadual Paulista - Júlio de Mesquita Filho 2012/2014 Curso de Pós - Graduação em Odontologia, área de Prótese Dentária, em nível de Mestrado na Faculdade de Odontologia de Araçatuba- UNESP Dedicatória Àquela que eu desejei e esperei chegar por treze anos. Àquela que é meu motivo de orgulho e admiração. E que agora pretende seguir os meus passos na reconstrução de sorrisos... ...Bárbara Teodoro Nóbrega. Agradecimentos Especiais A Deus Nada seria possível nessa vida, se Ele não permitisse! Obrigada meu Deus, por Se mostrar presente em todos os momentos da minha vida, principalmente aqueles de maior desespero. As provações foram muitas, mas graças à Sua força, eu consegui! Cheguei até aqui! Obrigada por colocar em meu caminho verdadeiros anjos ao longo da vida, amigos que sempre me ajudaram a lembrar da Sua existência e me deram o suporte necessário. Pai Amado, Sua luz guia meus passos pelos caminhos escuros e Sua benção recai sobre mim. A minha gratidão e o meu amor são imensuráveis... Aos Meus Pais Para começar, a minha vida não seria possível sem vocês. Obrigada por me amarem de forma tão linda! Mesmo estando à distância, o amor de vocês me acalentava. Obrigada pelo suporte emocional e psicológico. O colo de vocês e as orações é que me protegeram todos os dias, criando uma barreira contra toda energia negativa. Obrigada também pelo suporte financeiro, por permitir que eu continuasse meus estudos, atingindo o nível de doutorado. Eu sei que não foi fácil, e um dia, espero que em breve, recompensarei vocês por cada gota de suor e esforço realizado. Tuca e Rogério, obrigada por serem os melhores pais desse mundo. Amo vocês! Obrigada mãe, por me dar um segundo pai, que há 17 anos participa da minha educação, criação e compartilha do mesmo amor e carinho. Obrigada pai, por me dar mais uma mãe, exemplo de força e de puro amor, que faz de tudo para ser presente todos os dias e ter uma família unida. Wilson e Roberta obrigada por todo amor, tempo e atenção dedicados a mim. Obrigada também por aumentarem nossa família, e me darem os irmãos mais maravilhosos do mundo: Amanda, Rodrigo, Vitória, Carol, Cris e Caio. À Minha Família Agradeço aos meus avós Vô Plácido (Plácido Nóbrega) (in memorian), Vô Mith (Nitton Schmith) (in memorian), Vó Mirinha (Zulmira Andrade Schmith) (in memorian) e Vó Sônia (Sônia Pipino Nóbrega) (in memorian) por proporcionarem a família mais linda desse mundo. Através dos filhos mais unidos e mais amigos, que fazem todos os dias o amor e os valores ensinados por vocês se perpetuarem. Sei que daí de cima vocês continuam orientando nossos passos e tendo orgulho dessa linda família. Aos meus tios que sempre se fizeram presentes, do amor e carinho até as broncas, influenciando as minhas escolhas, sempre fazendo parte da minha vida e da minha história... Tio Hil (Newton Hilson Andrade Smith) (in memorian), Tia Lu (Lúcia Oki Smith), Tia Nil (Nilza Maria Andrade Smith), Tio Arno (Arno Witte), Tia Có (Nilce Neide Andrade Smith), Tio Flávio (Flávio Medeiros), Tia Rê (Regina Nobrega Gomes de Araújo), Tio Mário(Mário Rubens Gomes de Araújo), Tia Gu (Regiane Nobrega França) e Tio Bibi (Luiz Augusto França), sem a colaboração de vocês, seja me ensinando matemática nos tempos de escola ou me proporcionando um lugar pra morar durante o cursinho, proporcionarem auxílio financeiro para minha educação, ou, ainda, simplesmente se preocupando comigo, eu não teria chegado até aqui! É muito amor em uma família! Amo vocês! Obrigada também aos meus primos, que são como irmãos! A ligação presente entre os irmãos, nossos pais e tios, se projeta para nós. Amo vocês, Carol (Carolina Oki Smith), Mari (Mariana Oki Smith), Nay (Nayara Nóbrega de Araujó), Silvio (Silvio Louro), Raks (Rafael Nóbrega de Araújo), Bubu (André Luiz Nóbrega França), Digo (Rodrigo Araújo Louro) e Gu (Gustavo Araújo Louro). Ao Meu Orientador Agradeço ao meu professor e orientador há 8 anos, Professor Titular Marcelo Coelho Goiato por me ajudar a descobrir o meu amor pela disciplina de prótese já no início da graduação e me apresentar a prótese bucomaxilofacial. Obrigada também por me apresentar a vida acadêmica, nunca antes imaginada, hoje motivação no meu dia-a-dia. Obrigada pela paciência, pelos ensinamentos, inclusive quando vieram seguidos de puxões de orelha, essa é uma das funções de um pai, mesmo que acadêmico. Professor, que o senhor continue sempre executando esse lindo trabalho com as próteses bucomaxilofaciais, que traz o seu reconhecimento a nível internacional. Levarei com orgulho o seu nome como orientador ao longo de toda a minha vida. Aproveito para estender os agradecimentos à Professora Adjunta Daniela Micheline dos Santos, braço direito do meu orientador, que muito auxilia na coorientação, harmonia e progresso do grupo, exemplo de dedicação e ascensão na vida acadêmica. À Minha Inspiração Na vida, todos temos exemplos bons e ruins, os quais devemos selecionar criteriosamente para decidir quais devemos seguir. Entre os anjos que Deus colocou no meu caminho, existe uma professora da qual me aproximei há 5 anos durante o período de especialização. Ela se tornou um exemplo a ser seguido, dos melhores, diga-se de passagem. Exemplo de profissional. É ótima professora, ministra aula lindas e de altíssima qualidade, além de possuir técnica e conhecimentos clínicos invejáveis. Espero um dia poder ser uma professora admirada, competente e querida como você! Exemplo de bondade e educação, de saber respeitar ao próximo, de tratar o ser humano de forma realmente humana. Com você venho aprendendo a lidar com alunos, pacientes e pessoas em todas as esferas da vida profissional e pessoal. A minha aproximação e admiração por você se fortaleceram durante o tratamento da mais importante paciente para mim, minha mãe. Obrigada pelo carinho e atenção a ela dedicados. Exemplo de fé inabalável. Crê no nosso Pai maior de maneira admirável. Sei que orou e ora por mim diariamente. Inúmeras vezes quando a distância impedia de receber o acalento dos meus pais, foram as suas palavras amigas e seus abraços que cumpriram esse papel. A você, minha amiga e Professora Assistente Doutora Adriana Cristina Zavanelli, muito obrigada pela amizade e dedicação. Você me inspira diariamente a ser uma pessoa melhor! À minha “Braço Direito” Àquela que participou ativamente de todas as partes dessa tese, confeccionando amostras e ajudando a realizar os ensaios, às vezes acordando 3 horas da manhã. Àquela que durante esse período compartilhou comigo momentos de muita alegria e tristeza, de empolgação e também desânimo, inclusive na vida pessoal, mas que não deixava, assim como eu, de acreditar em um final feliz. Àquela que se tornou além de parceira de laboratório, minha parceira de cerveja, de japa e de crossfit. Muito mais do que uma aluna de Iniciação Científica, uma verdadeira amiga!! A você minha amiga Estefânia Marrega Malavazi, meu muito obrigada por estar ao meu lado nessa caminhada. Agradecimentos À Minha Faculdade À Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, na pessoa do diretor Professor Titular Wilson Roberto Poi pela oportunidade de realização dos cursos de Graduação, Especialização, Mestrado e Doutorado, pelos seus funcionários e corpo docente. Agradeço também Professor, pela sua amizade e exemplo de ser humano! Seus ensinamentos nas aulas do mestrado se concretizam no meu dia-a-dia. Fico feliz de ter tido um mestre como o senhor de referência em minha vida. Ao Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Professor Adjunto André Luiz Fraga Briso, pela competência e afinco na condução da nossa pós-graduação, fazendo com que nosso programa se torne a cada dia melhor. Obrigada também por disponibilizar seus equipamentos quando me foi necessário realizar alguns dos testes que compõem essa tese, bem como à sua orientada Marjory Gallinari pela sua disponibilidade e boa vontade. Estendo os meus sinceros agradecimentos ao vice-coordenador, o Professor Adjunto Celso Koogi Sonoda, bem como às funcionárias Valéria de Queiroz M. Zagatto, Cristiane Regina Lui Matos e Lilian Sayuri Mada pela disposição e boa vontade em nos ajudar ao longo desses 6 anos de pós graduação. Vocês foram essenciais para que eu chegasse até aqui. Às Agências de Fomento À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da Bolsa de Doutorado durante os primeiros meses do curso. Meus sinceros agradecimentos. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), que me concedeu durante os anos de trabalho acadêmico sob a orientação do Professor Marcelo, as bolsas de Iniciação Científica (Processo 2010/11765-0), de Mestrado (Processo 2012/05270-3) e de Doutorado (Processo 2014/11765-0). Agradeço mais uma vez pela confiança em mais um projeto, que me permitiu investir ainda mais na minha carreira profissional. Aproveito esse espaço para agradecer a Indústria Orbital Colors, responsável pelo desenvolvimento do novo pigmento, que abraçou a ideia desse projeto. O nosso muito obrigada. À Banca Examinadora Sobre não existir uma banca melhor do que essa para enriquecer essa pesquisa. Ao Professor Titular Humberto Gennari Filho, para mim é uma honra ter o senhor compondo a mesa nesse tão importante momento. Não tive a oportunidade de obter seus aprendizados durante a graduação, mas essa ausência foi compensada durante os meus 5 anos de pós-graduação. O Senhor é exemplo de competência e dedicação! Seu carisma e sua boa vontade fazem com que estar em sua presença nos sintamos muito bem amparados. Aprendi e ainda aprendo diariamente com o senhor. As suas considerações serão de grande valia para mim. Saiba que sou sua fã. À Professora Adriana Cristina Zavanelli por atender tão prontamente e me dar suporte em mais esse momento, e permitir que seus conhecimentos venham a acrescentar esse trabalho. À Professora Simone Cecilio Hallak Regalo por se mostrar tão querida, atenciosa e disponível. Seu conhecimento é ímpar, e com toda a certeza irá acrescentar muito para esses artigos. A sua bondade é reconhecida prontamente por todos que a cercam. Tenho certeza de que o mundo acadêmico seria de mais fácil convivência se as pessoas que fazem parte dele fossem como a Senhora. À grande amiga e Professora Marcela Filié Haddad, que ajudou o nosso orientador durante a minha tutela na Iniciação Científica. Com você aprendi a pesquisar nas bases de dados e as estruturas de um trabalho de pesquisa. Hoje meus slides, tão elogiados em sala de aula, ainda apresentam as características e os refinamentos estéticos por você ensinados. Você é contribuinte em uma grande parte da profissional que hoje eu sou. O seu conhecimento por ter estado nessa mesma linha de pesquisa será de grande valia e importância nesses capítulos. À Professora Adjunta Sandra Helena Penha de Oliveira por ter contribuído diretamente na realização do Capítulo 1 desta tese. Através do seu grupo me foi possível conhecer uma nova metodologia de trabalho, totalmente diferente de tudo que até então eu havia executado. O seu vigor e sua animação são dignos de admiração. Obrigada pela oportunidade e pela amizade. Aproveito esse espaço para agradecer a todos os seus orientados, em especial à querida e competente amiga Doutora Aline Satie Takamyia, sem a qual eu não teria executado os ensaios aqui realizados. Ela esteve ao meu lado em todos os momentos. Obrigada pela paciência e por ter me ensinado tanto. O seu futuro como docente de extrema competência e sucesso, é garantido. Ao grande amigo e Professor Joel Ferreira Santiago Júnior, muito obrigada por todo o apoio, dedicação e amizade dedicados durante os anos de pós-graduação que tive o prazer de dividir com você. Suas palavras amigas e paciência aliadas à educação sempre fizeram de você um ser humano fantástico. Seus conselhos e seus conhecimentos, sempre foram de grande valia para mim. Você transforma indivíduos em pessoas melhores. Obrigada por fazer parte desse momento tão importante. Ao Professor Valentim Adelino Barão pelos momentos que pude conviver durante a pós e por ser esse ser humano determinado e de grande exemplo acadêmico. A sua inteligência e dedicação te colocam em um nível altíssimo de profissionalismo e conhecimento. É uma honra ter a oportunidade de você avaliar este trabalho. A todos vocês, profissionais do mais alto gabarito, meu muito obrigada por atender a esse convite. Ao Departamento de Materiais Odontológicos e Prótese Aos professores do Departamento de Materiais Odontológicos e Prótese, por sempre se mostrarem prestativos e com vontade de ensinar. Agradeço também pela acolhida e pelos funcionários do departamento pela hospitalidade, e oportunidade de fazer parte dessa equipe, em especial à secretária Magda Requena Caciatore, por ser o ponto de apoio e grande amiga. Aos Mestres Agradeço a todos os meus professores de graduação e pós-graduação, que me inspiraram a tomar amor por esse curso. Agradeço em especial ao Professor Assistente Doutor José Vitor Quinelli Mazaro, por ser o melhor cirurgião que eu tive oportunidade de conhecer. Um exemplo de carisma, dedicação e amor pela odontologia. Obrigada pela oportunidade de aprender e me apaixonar pela periodontia e me orientar a aperfeiçoar meus planejamentos reabilitadores. Obrigada também por ter executado um atendimento impecável à minha mais cara paciente, minha mãe. Agradeço também ao Professor Doutor Rodrigo Sversut de Alexandre por complementar os ensinamentos do Professor José Vitor. Ter a oportunidade de conviver com a equipe de trabalho de vocês me abriu novos campos de visão e desejo de aperfeiçoamento na clínica odontológica. À maravilhosa e querida Professora Assistente Doutora Aimée Maria Guiotti, por ter sanado tantas dúvidas sobre as metodologias empregadas nesse trabalho, por ter cedido os pigmentos, e por toda atenção sempre dedicada. Inicio a minha carreira de docente onde você deu iniciou a sua, onde é um modelo e referência até os dias de hoje. Aos Anjos Eu agradeci à Deus pelos anjos que ele colocou ao longo dos anos em minha vida em forma de grandes amigos. Amigos esses que mesmo à distância sempre se fizeram presentes, dividindo todos os momentos da minha vida. Agradeço aos meus lacinhos, amizades mais puras da minha infância e que se perpetuam na vida adulta. Vocês sempre estiveram presentes nas minhas lágrimas, independentemente de serem de alegrias ou de tristeza. Com vocês a vida é intensa, feliz e admirável! A tatuagem na pele leva para sempre o nosso amor... “Nó aperta, laço enfeita!” Ao meu primeiro amigo em Araçatuba e até hoje um dos melhores que eu tenho, Yugo Honda, vulgo Coxinha. Obrigada pelos conselhos dados, principalmente os que eu não segui. Espero que você entenda os meus puxões de orelha ao longo desses anos com relação ao seu estudo e obrigada por estar ao meu lado em momentos de extrema importância, mesmo que apenas compartilhando do meu silêncio. Amigos leais como você, são uma espécie rara. À Dra. Agda Marobo Andreotti, uma das minhas primeiras amizades da faculdade, a qual tive a felicidade de ter presente ao meu lado durante a vida de graduação e pós-graduação. Tivemos a oportunidade de todos os dias dividir nossas angústias, o que facilitou o nosso caminho nessa jornada. Mas tivemos oportunidade também de dividir a cerveja, a música, a família e o amor que nutrimos uma pela outra. Não é à toa que encerramos esse ciclo também juntas. Tem gente que é para sempre, não importa o que aconteça. Ao Ms. Régis Alexandre de Mello que eu tive a oportunidade de me aproximar durante o seu curso de mestrado e de repente nos tornamos indispensáveis um na vida do outro. Mesmo a milhares de quilômetros de distância você se fez presente em todos os momentos pessoais e profissionais da minha vida. Obrigada pelas palavras, mesmo as mais duras quando foram necessárias. À Ms. Hiskell Francine Fernandes e Oliveira, vulgo pinguim. Obrigada pela sua amizade que chegou em hora tão propícia, pelas risadas compartilhadas, pelos abraços que me foram necessários, por essa amizade tão linda que compartilhamos. Você está fazendo falta no meu dia-a-dia, afinal era meu “anjo” mais próximo, apenas 3 andares nos separavam. Mas o que importa é o lado de dentro, e mesmo estando alguns quilômetros mais longe sei que nada mudará. Obrigada por ter apresentado à pessoa mais engraçada e alto astral da vida, que se tornou uma amiga essencial, nesta jornada, Jéssica Quereza, obrigada por ser tão ativa, companheira, engraçada. Sua presença ilumina o ambiente, é uma felicidade desfrutar de sua companhia! Aos Amigos Á minha Turma 54, por todos os momentos compartilhados na graduação, pelo exemplo de união e determinação, pelas grandes amizades que com vocês nasceram e até hoje permanecem. “A melhor sala é nossa”... E para sempre será! Aos colegas de pós-graduação que tive a oportunidade de conviver ao longo desses anos, Professor Assistente Doutor Aldiéris Alves Pesqueira, Professora Doutora Amália Moreno, Professor Doutor Daniel Almeida, Caroline Cantieri de Mello, Jéssica Gomes, Aljomar José Vecchiato, Liliane Bonatto, Mariana Vilela, Sandro Bittencourt, Emily Viviane Silva, Rodrigo Antônio de Medeiros, Fernando Isquierdo e tantos outros. Obrigada por todo o aprendizado, não apenas acadêmico, obtido no convívio com vocês. Às bixetes mais queridas que eu poderia ter Priscila Vedoato, Carolayne Cunha e Yara Matsu. À família CT Interact, por ser tão unida e me proporcionar amizades maravilhosas, em especial Luciane Naranjo, Jéssica Franco, Jean Scanfela, Laís Matsuoka, Ricardo Serapião, Ketheleen Myiaji, Rogério Minagoranci, Mirella Rodrigues e o Coach Marcus Freitas. Com vocês o condicionamento foi além do físico, atingiu o nível psicológico e emocional. Obrigada por essa amizade sincera. À Universidade Brasil Encerro meus agradecimentos, agradecendo a instituição onde dou início à uma nova jornada de vida, onde inicio a minha carreira como Professora Universitária. Agradeço primeiramente à Universidade Brasil, na pessoa do diretor Professor Amauri Piratininga Silva, pela oportunidade. Essa é uma universidade ainda muito nova, mas que tem um potencial de crescimento gigantesco e que com certeza, em pouco tempo será notada pela sua qualidade. É com muito orgulho que visto essa camisa, e contribuirei em tudo que me for possível pela excelência dessa faculdade. Agradeço ao amigo, colega de trabalho nas disciplinas de prótese e coordenador do curso de Odontologia da Universidade Brasil, Professor Doutor Nagib Pezzati Boer. Chefe, obrigada pela confiança, pelo ombro amigo, pela compreensão e por toda a ajuda proporcionada. Você acompanhou a minha jornada nessa reta final, torcendo pela conquista desse título. Seu suporte junto com os colegas foi essencial para a conclusão desse ciclo. Agradeço em especial ao amigo no período de Pós-Graduação e Professor Doutor André Luís da Silva Fabris, que me indicou para essa instituição, confiando no meu conhecimento e profissionalismo. Agradeço aos grandes amigos que tenho a honra de estar ao lado ministrando as aulas de Prótese, além do Professor Nagib, o Professor Doutor Mitsuro Ogata e o Professor Mestre Farid Jamil Arruda. Tenho aprendido diariamente a aprimorar o dom, possuído por vocês, de ensinar. A amizade compartilhada entre nós, dentro e fora das salas de aula é de importância imensurável. Vocês são exemplos a serem seguidos. Meu muito obrigada por esses momentos. Agradeço também pela forte empatia e amizade que criei com a Professora Doutora Elisa Mattias Sartori, Professor Doutor Ovídio Martin e Professor Doutor Paulo Henrique Bortoluzo, aqueles que compartilham comigo diariamente seus conhecimentos, materiais didáticos e também a risada acompanhada da boa cerveja. E também à Professora Mestre Taís Marques, exemplo de educação, bom humor e alto astral. Vocês me fizeram enxergar um novo caminho em minha vida. Obrigada por essa amizade. Obrigada também à grande amiga, Professora Mestre Karina Camara Fernandes, por cada palavra de apoio, preocupação e oração direcionadas a mim! Cada gesto seu me ajudou na conclusão desse ciclo! Sua bondade, seu carisma, são inspiradores e fazem eu desejar a sua amizade para além dessa vida. Obrigada também a Professora Doutora Luciana Simonato, por ser um exemplo de educação. E por ter me emprestado por tantas vezes a fonte do seu computador para poder terminar os meus trabalhos! Sem você, definitivamente eu não sei o que eu faria em situações de tanta emergência. E agradecer imensamente pelo convívio diário, compartilhando além do corpo docente da disciplina de Anatomia Dental, o convívio debaixo do mesmo teto, à grande amiga, Professora Mestre Martha Suemi Sakashita. São 5 meses, dos quais o último se tornou uma convivência diária! Sua presença e sua preocupação e toda atenção dedicados a mim, fazem me sentir amparada. São dois gênios muito fortes que resolveram abaixar o topete e dar início a uma linda amizade. Marthita, obrigada por todos os dias me ajudar a perceber que eu tomei as escolhas certas. Você se tornou de fundamental importância na minha vida em pouco tempo. Obrigada por aceitar essa “provação”. Obrigada a todos os outros professores não citados aqui, mas que colaboram para o ambiente agradável que é o do nosso trabalho. Posso afirmar com toda certeza que sou muito feliz aqui, e isso acontece porque vocês colaboram diretamente para isso. Agradeço por último, mas de forma alguma menos importante, aos meus alunos. Os elogios e a vontade que vocês apresentam diariamente me motivam a ser uma professora cada vez melhor. Obrigada pelo apoio e pelo carinho que vocês mostram por mim. Sem vocês, a docência não teria o menor sentido. Epígrafe “Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu. É sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu!” Ana Vilela Resumo Nobrega AS. Biocompatibilidade de pigmentos e a influência de diferentes métodos de incorporação em propriedades físicas de silicones para próteses bucomaxilofaciais [tese]. Araçatuba: Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista; 2017 RESUMO Uma prótese ideal deve reproduzir as estruturas perdidas nos mínimos detalhes e ser imperceptível em público. Entretanto a natureza do defeito, as habilidades do protesista e os materiais de escolha limitam a beleza da prótese e, consequentemente o seu uso, já que a sua principal função é a recuperação da estética. Sendo assim, cor, forma e textura, são características primordiais que irão determinar o sucesso ou falha da prótese bucomaxilofacial, bem como a sua durabilidade. O presente estudo tem como objetivo analisar a biocompatibilidade de um novo pigmento para coloração de próteses bucomaxilofaciais, bem como a influência dos métodos de incorporação de três pigmentos na estabilidade cromática, absorção e solubilidade, estabilidade dimensional e reprodução de detalhes dos silicones A2 A-2186 e Silastic MDX4-4210. Para a confecção das amostras, foram utilizados dois silicones faciais, três tipos de pigmentos, sendo dois deles específicos para caracterização de próteses bucomaxilofaciais nas cores bronze e preto, e um novo pigmento na cor rosa médio. Para se verificar a biocompatibilidade através dos testes in vitro de citotoxicidade com ensaios de MTT, Alamar Blue e Neutral Red com cultura de células foram confeccionadas 40 amostras, dividas em 8 grupos (n=5), de acordo com o silicone e pigmentos. Já para os testes físicos, foram confeccionadas 200 amostras para cada ensaio, divididas em 20 grupos (n=10), distribuídos de acordo com o tipo de silicone, pigmento adicionado e método de incorporação utilizado (industrial, laboratorial mecânica ou convencional). As leituras dos testes de estabilidade cromática, absorção e solubilidade, reprodução de detalhes e estabilidade dimensional foram realizadas no período inicial e ao término de cada ciclo de envelhecimento de 252, 504 e 1008 horas. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística, utilizando-se os testes de ANOVA (p<.05) e teste de Bonferroni para a biocompatibilidade e de Tukey para os ensaios físicos. Verificou-se, por meio dos resultados que o método de incorporação, pigmento, silicone e período avaliado influenciou as propriedades estudadas. Pode-se concluir que todos os materiais utilizados são biocompatíveis, o melhor método de Incorporação de pigmentos para estabilidade cromática é o industrial e o melhor pigmento o Rosa, todos os grupos apresentaram alterações cromáticas dentro do limite clínico considerado aceitável, os valores de absorção e solubilidade foram baixos para todos os grupos, a alteração dimensional resultou em contração das amostras, todos os grupos apresentaram uma ótima reprodução de detalhes (Escore 2). Palavras-chave: Prótese Maxilofacial. Elastômeros de Silicone. Corantes. Cor. Citotoxicidade Imunológica. Abstract Nobrega AS. Biocompatibility of pigments and the influence of different incorporation methods on physical properties of silicones for bucomaxillofacial prostheses [thesis]. Araçatuba: UNESP- São Paulo State University; 2017 ABSTRACT An ideal prosthesis should reproduce the structures lost to the smallest details and be imperceptible in public. However, the nature of the defect, the skills of the prosthodontist and the materials of choice limit the beauty of the prosthesis and consequently its use, since its main function is the recovery of aesthetics. Thus, color, shape and texture are prime characteristics that will determine the success or failure of the bucomaxillofacial prosthesis as well as its durability. The present study aims to analyze the influence of the incorporation of three pigments on the color stability, absorption and solubility, dimensional stability and detail reproduction of the silicones A2 A-2186 and Silastic MDX4-4210, as well as the biocompatibility of a new pigment for staining of buccomaxillofacial prostheses. For the preparation of the samples, two facial silicones, three types of pigments were used, two of them specific for the characterization of bucomaxillofacial prostheses in bronze and black, and a new pigment in the medium pink color. In order to verify biocompatibility through in vitro cytotoxicity tests MTT, Alamar Blue and Neutral Red assays with cell culture, and 40 samples were prepared, divided into 8 groups (n=5), according to the silicon and pigments. For the physical tests, 200 samples were prepared for each test, divided into 20 groups (n=10), distributed according to the type of silicone, pigment added and method of incorporation used (industrial, mechanical or conventional laboratory). The chromatic stability, absorption and solubility, detail reproduction and dimensional stability readings were performed at baseline and at the end of each aging cycle of 252, 504 and 1008 hours. The data were submitted to statistical analysis, using ANOVA (p <.05) and Bonferroni test for biocompatibility and Tukey for physical tests. It was verified, through the results that the method of incorporation, pigment, silicone and period evaluated influenced the properties studied. It can be concluded that all the materials used are biocompatible, the best method of incorporation of pigments for chromatic stability is the industrial and pink is the best pigment, all groups presented chromatic alterations within the clinical limit considered acceptable, the absorption values and solubility were low for all groups, the dimensional change resulted in contraction of the samples, all groups presented a good reproduction of details (Score 2). Key-words: Maxillofacial Prosthesis. Silicone Elastomers. Coloring Agents Color. Cytotoxicity, Immunologic Listas e Sumário Lista de Figuras Capítulo 1 Figura 2.1. Fluxograma de confecção das amostras.............................................................. 53 Figura 2.2. Porcentual de proliferação celular para cada silicone e pigmento após os períodos de formação de extrato de 24, 48 e 72 horas segundo o ensaio de MTT .................. 60 Figura 2.3. Porcentual de proliferação celular para cada silicone e pigmento após os períodos de formação de extrato de 24, 48 e 72 horas segundo o ensaio de Alamar Blue....... 61 Figura 2.4. Porcentual de proliferação celular para cada silicone e pigmento após os períodos de formação de extrato de 24, 48 e 72 horas segundo o ensaio de Neutral Red......................................................................................................................................... 62 Capítulo 2 Figura 3.1. Fluxograma de confecção das amostras.............................................................. 80 Capítulo 3 Figura 4.1. Fluxograma de confecção das amostras.............................................................. 105 Lista de Tabelas Capítulo 2 Pág. Tabela 3.1. Valores médios (desvio padrão) de alteração de cor (ΔE) dos silicones utilizados de acordo com o método de incorporação, pigmento e marca do silicone.............................................................................................................................................. 84 Tabela 3.2. Valores médios (desvio padrão) de alteração de cor (ΔE) dos silicones utilizados de acordo com o método de incorporação e o pigmento, independente da marca do silicone............................................................................................................................................... 85 Tabela 3.3. Valores médios (desvio padrão) de alteração de cor (ΔE) dos diferentes silicones de acordo com o método de incorporação, independente do pigmento utilizado.................................... 86 Tabela 3.4. Valores médios (desvio padrão) de alteração de cor (ΔE) dos diferentes silicones utilizados de acordo com o pigmento, independentemente do método de incorporação.................... 86 Tabela 3.5. Valores médios (desvio padrão) de alteração de cor (ΔE) dos silicones que receberam incorporação industrial dos pigmentos, de acordo com o pigmento, marca do silicone e diferentes períodos de análise............................................................................................................................. 87 Capítulo 3 Tabela 4.1. Valores médios (desvio padrão) de absorção (%) dos silicones utilizados de acordo com o método de incorporação, pigmento e marca do silicone........................................................... 111 Tabela 4.2. Valores médios (desvio padrão) de absorção (%) dos silicones utilizados de acordo com o método de incorporação e o pigmento, independente da marca do silicone........................... 112 Tabela 4.3. Valores médios (desvio padrão) de absorção (%) dos diferentes silicones utilizados de acordo com o método de incorporação, independente do pigmento............................................... 113 Tabela 4.4. Valores médios (desvio padrão) de absorção (%) dos diferentes silicones utilizados de acordo com o pigmento, independentemente do método de incorporação...................................................................................................... ................................. 114 Tabela 4.5. Valores médios (desvio padrão) de absorção (%) dos silicones que receberam incorporação industrial dos pigmentos, de acordo com o pigmento, marca do silicone e diferentes períodos de análise............................................................................................................................ . 115 Tabela 4.6. Valores médios (desvio padrão) de solubilidade (%) dos silicones utilizados de acordo com o método de incorporação, pigmento e marca do silicone............................. 116 Tabela 4.7. Valores médios (desvio padrão) de solubilidade (%) dos diferentes silicones utilizados de acordo com o método de incorporação, independente do pigmento............................................... 117 Tabela 4.8. Valores médios (desvio padrão) de solubilidade (%) dos silicones que receberam incorporação industrial dos pigmentos, de acordo com o pigmento, marca do silicone e diferentes períodos de análise...................................................................................................................... 118 Tabela 4.9. Valores percentuais médios (desvio padrão) de solubilidade dos diferentes silicones utilizados que receberam incorporação industrial dos pigmentos, independente do período e do pigmento.............................................................................................................................. ................ 118 Tabela 4.10. Valores médios (desvio padrão) de estabilidade dimensional (%) dos diferentes silicones utilizados de acordo com o pigmento, método de incorporação e período de análise............ 119 Tabela 4.11. Valores médios (desvio padrão) de estabilidade dimensional (%) dos silicones utilizados de acordo com o pigmento, método de incorporação e período de análise, independente da marca do silicone........................................................................................................................... 120 Tabela 4.12. Valores médios (desvio padrão) de estabilidade dimensional (%) dos silicones que receberam incorporação industrial dos pigmentos, de acordo com o pigmento, marca do silicone e diferentes períodos de análise.............................................................................................................. 121 Tabela 4.13. Valores percentuais médios (desvio padrão) de estabilidade dimensional (%) dos diferentes silicones utilizados que receberam incorporação industrial dos pigmentos, independente da marca do silicone............................................................................................................................ 122 Lista de Abreviaturas e Siglas pág. = Página % = Porcento et al. = E colaboradores Ltda. = Limitada nº = Número mm = Milímetro min = Minuto º C= Graus Celsius SP = São Paulo UV = ultravioleta DP = Desvio Padrão kgf= Quilograma força Sumário Pág. 1. Introdução Geral........................................................................................................... 39 2. Capítulo 1 Análise in vitro da proliferação de células HaCaT estimuladas por extratos de pigmentos para silicones de próteses bucomaxilofaciais............................................. 45 2.1 Resumo..................................................................................................................... 46 2.2 Abstract..................................................................................................................... 48 2.3 Introdução............................................................................................................. .... 50 2.4 Materiais e Métodos................................................................................................. 52 2.5 Resultados................................................................................................................. 60 2.6 Discussão..................................................................................... ............................. 63 2.7 Conclusão................................................................................................................ 66 2.8 Referências............................................................................................................... 67 3 Capítulo 2 Influência de diferentes métodos de incorporação de pigmentos na estabilidade cromática de silicones para próteses bucomaxilofaciais .................... 71 3.1 Resumo..................................................................................................................... 72 3.2 Abstract..................................................................................................................... 74 3.3 Introdução............................................................................................................. .... 76 3.4 Materiais e Métodos................................................................................................. 79 3.5 Resultados................................................................................................................ 84 3.6 Discussão.................................................................................................................. 88 3.7 Conclusão................................................................................................................ 91 3.8 Referências............................................................................................................... 92 4 Capítulo 3 Influência de diferentes métodos de incorporação de pigmentos em propriedades físicas de silicones para próteses bucomaxilofaciais......................... 97 4.1 Resumo..................................................................................................................... 98 4.2 Abstract..................................................................................................................... 100 4.3 Introdução............................................................................................................. ..... 102 4.4 Materiais e Métodos.................................................................................................. 104 4.5 Resultados.................................................................................................................. 111 4.6 Discussão................................................................................................................... 124 4.7 Conclusão................................................................................................................. 127 4.8 Referências................................................................................................................ 128 ANEXOS............................................................................................................................... ...... 133 1. Introdução Geral Introdução Geral 42 1. INTRODUÇÃO GERAL A emoção resultante da percepção do belo é um fator importante na vida de um indivíduo, visto que interfere diretamente nas suas relações sociais e interpessoais. Desta forma, mutilações, principalmente faciais, causadas por alterações genéticas, traumas e/ou ressecções cirúrgicas podem causar graves alterações psicológicas. Assim a reabilitação desses pacientes é imprescindível. Em circunstâncias propícias, a cirurgia plástica, realizada em tecido vivo, é a mais indicada. Entretanto, apesar dos avanços das técnicas cirúrgicas, essa modalidade terapêutica frequentemente apresenta limitações, desde a impossibilidade de sua realização até possíveis deformidades. Frequentemente nesses casos, as próteses bucomaxilofaciais são utilizadas escondendo defeitos, de forma a proporcionar uma aparência mais agradável e, algumas vezes inclusive, melhora da função. O que permite ao paciente mutilado retomar sua rotina social, resultando em melhora da autoestima e, consequentemente, da qualidade de vida. Uma prótese ideal deve reproduzir as estruturas perdidas nos mínimos detalhes e ser imperceptível em público. Entretanto a natureza do defeito, as habilidades do protesista e os materiais de escolha limitam a beleza da prótese e, consequentemente o seu uso, já que a sua principal função é a recuperação da estética. Sendo assim, cor, forma e textura, são características primordiais que irão determinar o sucesso ou falha da prótese bucomaxilofacial, bem como a sua durabilidade. Desde a década de 60 os elastômeros de silicone têm sido utilizados para confecção de próteses bucomaxilofaciais, visto que é um material com textura semelhante à da pele humana, biocompatível, que apresenta boa resistência e durabilidade, além de fácil manipulação. Introdução Geral 43 Desta forma, um dos maiores problemas enfrentados pelos protesistas é a descoloração sofrida pela prótese, às vezes em menos de um ano de uso, seja essa pigmentação realizada de forma intrínseca ou extrínseca. A literatura atribui essa alteração de cor à exposição aos raios ultravioletas e à manipulação diária da prótese pelo paciente, ao utilizar cosméticos e solventes para limpeza, além de atos insensatos, tais como o uso de tabaco. Já é consagrado o uso da câmara de envelhecimento acelerado para avaliar a degradação de materiais poliméricos. Apesar de esse ensaio realizar condições extremas de umidade e de exposição aos raios UVB, ele é considerado um método viável, capaz de simular as mesmas condições e deteriorações do envelhecimento natural. Contudo, deve-se levar em consideração que a estabilidade cromática do pigmento, bem como, a dificuldade de pigmentação do material de escolha para confecção da prótese, podem ser os responsáveis por essa descoloração. O desbotamento de um pigmento ou corante não é uma supressão ou desaparecimento da substância, trata-se na realidade de uma alteração química, que pode ser influenciada por diversos fatores, desde a sua composição até a maneira que esse pigmento é incorporado. A pureza química de um pigmento é variável. Alguns compostos simples são praticamente puros, enquanto outros pigmentos, apesar de apresentarem alto grau de pureza, contêm outros elementos adicionados durante a fabricação, como para a alteração da cor. Os pigmentos podem ser classificados quanto à sua origem, sendo esta de acordo com o seu componente principal. Pigmentos orgânicos são aqueles de origem animal, vegetal ou sintética. Já os pigmentos inorgânicos não são formados por carbono e hidrogênio, eles contêm átomos de metal, são, portanto, de origem mineral. Existem relatos que os pigmentos orgânicos apresentam menor solidez à luz e, consequentemente, são mais susceptíveis a deterioração, apresentando assim, uma vida útil mais limitada. Introdução Geral 44 Solidez à luz é uma propriedade física que determina a capacidade de um material resistir à alteração de cor quando exposto a luz, podendo variar de I a V a sua classificação, sendo I a menor alteração cromática e V a maior. Assim, poderia ser determinado como solução para a descoloração de próteses bucomaxilofaciais a utilização de pigmentos com alta solidez. Entretanto há relatos na literatura, inclusive com a utilização de anti-UVs, antioxidantes e opacificadores, em que o material alterou a sua cor em curto prazo. Surge um questionamento então, se a maneira que esse pigmento é incorporado não poderia estar diretamente relacionada à dispersão e homogeneização do mesmo no material, afetando então as suas propriedades no que se relaciona principalmente à estabilidade cromática. É ainda importante ressaltar a dificuldade de se realizar uma prótese com a coloração exata da pele e que, apesar de existirem tentativas de confecção de escalas de cor, nenhuma ainda se consagrou, seja na literatura ou na rotina clínica. Não há ainda na literatura um consenso sobre qual seria o melhor método de incorporação de pigmentos, intrínseco ou extrínseco, e se eles interferem na estabilidade cromática de silicones faciais. Por isso a execução desse trabalho se justificou pela necessidade de avaliar três diferentes métodos de incorporação de pigmentos e a sua influência ao longo do tempo. No método de incorporação laboratorial convencional, o pigmento foi misturado ao silicone sobre uma placa de vidro com o auxílio de uma espátula de aço inoxidável, até a obtenção de uma massa homogênea. Já para a incorporação laboratorial mecânica, o silicone foi misturado ao pigmento manualmente durante 15 segundos, seguida pela espatulação a vácuo (20 psi) por 30 segundoss com 425 RPM, em espatuladora mecânica. A incorporação industrial do pigmento ao silicone foi realizada na indústria Orbital Colors®, o pigmento foi adicionado à base do silicone por meio de uma máquina de moagem, que consistiu de três etapas. Introdução Geral 45 Inicialmente o pigmento foi adicionado ao silicone por meio de um dispersor em hélice, em seguida passou por um moinho tricilindro e posteriormente por um teste de controle de qualidade, segundo norma DIN. O catalisador foi adicionado à base pigmentada a nível laboratorial, conforme especificações do fabricante. O trabalho analisou, além de pigmentos já existentes no mercado específicos para próteses bucomaxilofaciais, um novo pigmento sugerido pelos autores deste trabalho. Por se tratar de um pigmento nunca antes utilizado para esse fim, foi necessário avaliar a sua biocompatibilidade com os tecidos humanos, comparando-a com a dos demais pigmentos já existentes. Esse pigmento será utilizado futuramente para formar uma escala de cor a ser patenteada para uso clínico. Sendo o principal diferencial dessa escala, o próprio pigmento, visto que a sua composição se dá a partir de pastas em cores primárias (amarelo, vermelho) associadas a cores de matização (branco) e sombreamento (preto), tornando possível abranger todo o espectro de coloração da pele humana. Assim, com o auxílio de um colorímetro portátil, o clínico facilmente conseguirá saber a proporção de cores para poder mimetizar a pele do seu paciente. Além disso, é importante que a utilização de pigmentos não interfira negativamente na capacidade do material de absorver e solubilizar substâncias, nem na estabilidade dimensional e na reprodução de detalhes do mesmo, visto que poderia resultar em uma desadaptação da prótese, portanto essas propriedades também devem ser avaliadas. Como já explicitado anteriormente, materiais poliméricos sofrem degradação ao longo do tempo, o que pode resultar em alteração das suas propriedades. Dessa forma se faz necessário a análise da influência desses pigmentos não só no momento da confecção das próteses, mas também ao longo do tempo, para verificar o seu comportamento durante o uso clínico pelo paciente. Introdução Geral 46 O presente estudo tem como objetivo analisar a influência dos métodos de incorporação de três pigmentos na estabilidade cromática, absorção e solubilidade, estabilidade dimensional e reprodução de detalhes dos silicones A2 A-2186 e Silastic MDX4-4210, bem como a biocompatibilidade de um novo pigmento para coloração de próteses bucomaxilofaciais. . 2. Capítulo 1 Capítulo 1 48 Análise in vitro da proliferação de células HaCaT estimuladas por extratos de pigmentos para silicones de próteses bucomaxilofaciais. 2.1 Resumo Apesar de propriedades físicas e mecânicas serem de extrema importância para a eficácia do tratamento protético, os materiais utilizados para a reabilitação facial devem ser biocompatíveis, visto que a prótese bucomaxilofacial fica em íntimo contato com a pele do paciente. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência de períodos de formação de extratos obtidos a partir de diferentes pigmentos utilizados para a confecção de próteses bucomaxilofaciais. Para a confecção das amostras, foram selecionados os silicones faciais A2 A-2186 e Silastic MDX4-4210,e três tipos de pigmentos, sendo dois deles específicos para caracterização de próteses bucomaxilofaciais já existentes no mercado nas cores bronze e preto, e um novo pigmento na cor rosa médio. Foram confeccionados 5 corpos de prova para cada um dos 8 grupos, distribuídos de acordo com o tipo de silicone e pigmento adicionado, para formação de extratos por 24, 48 e 72 horas de imersão em meio de cultura. Os ensaios in vitro de MTT, Alamar Blue e Neutral Red foram realizados para análise da citotoxicidade sobre queratinócitos humanos da linhagem HaCaT. Os dados obtidos nos ensaios foram submetidos à ANOVA, seguido pelo teste Bonferroni, com nível de significância de 5%. Os ensaios de MTT e Alamar Blue indicaram maior citotoxicidade para o período de formação de extrato de 24 horas. O Neutral Red por sua vez apresentou aumento da viabilidade celular, não exibindo toxicidade para nenhum dos silicones ou pigmentos. Para todos os períodos de formação dos extratos analisados não houve citotoxicidade dos silicones e pigmentos utilizados, visto que os valores permaneceram acima de 75% em todos os ensaios realizados. Apesar das limitações de Capítulo 1 49 um estudo in vitro¸ pode-se concluir que todos os materiais utilizados nesse estudo para a confecção de próteses bucomaxilofaciais são biocompatíveis. Palavras-chave: Teste de Materiais. Citotoxicidade imunológica. Queratinócitos. Prótese Maxilofacial. Corantes. Capítulo 1 50 In vitro analysis of Hacat cell proliferation stimulated by pigments for silicones used in maxillofacial prosthesis. 2.2 Abstract Although physical and mechanical properties are extremely important for the effectiveness of prosthetic treatment, the materials used for facial rehabilitation must be biocompatible, since the maxillofacial prosthesis is in close contact with the patient's skin. The objective of this study was to evaluate the influence of periods of eluates formation obtained from different pigments used for the manufacturing of maxillofacial prostheses. For the specimens manufacturing, the facial silicones A2 A-2186 and Silastic MDX4- 4210, and three types of pigments were selected, two of them specific for the characterization of maxillofcial prostheses, in bronze and black color, already placed on the market, and a new pigment in pink medium color. Five specimens were prepared for each of the 8 groups, distributed according to the type of silicon and pigment added, to form extracts for 24, 48 and 72 hours of immersion in culture medium. In vitro assays of MTT, Alamar Blue and Neutral Red were performed for cytotoxicity analysis on human keratinocytes of the HaCaT line. The data obtained in the tests were submitted to ANOVA, followed by the Bonferroni test, with a significance level of 5%. The MTT and Alamar Blue assays indicated higher cytotoxicity for the 24 hour eluate formation period. The Neutral Red showed increased in cell viability, exhibiting no toxicity for any of the silicones or pigments. For all the periods of formation of the analyzed eluates, there was no cytotoxicity of the silicones and pigments used, since the values remained above 75% in all performed assays. Despite the limitations of an in vitro study, it can be concluded that all materials used in this study for making maxillofacial prostheses are biocompatible. Capítulo 1 51 Key-Words: Materials Testing. Cytotoxicity, Immunologic. Keratinocytes. Maxillofacial Prosthesis. Coloring Agents. Capítulo 1 52 *Este artigo será formatado de acordo com as normas do periódico Journal of Prosthetic Dentistry 2.3 Introdução A emoção resultante da percepção do belo é um fator importante na vida de um indivíduo, visto que interfere diretamente nas suas relações sociais e interpessoais1. Desta forma, mutilações, principalmente faciais, causadas por alterações genéticas, traumas e/ou ressecções cirúrgicas2; 3; 4; 5; 6 podem causar graves alterações psicológicas7, assim a reabilitação desses pacientes é imprescindível1. Frequentemente4, as próteses bucomaxilofaciais são utilizadas escondendo defeitos, de forma a proporcionar uma aparência mais agradável e, algumas vezes inclusive, melhora da função3; 8., o que permite ao paciente mutilado retomar sua rotina social, resultando em melhora da autoestima e, consequentemente, da qualidade de vida4; 5; 6. Apesar de propriedades físicas e mecânicas serem de extrema importância para a eficácia do tratamento protético9, é ainda mais importante que os materiais utilizados para a reabilitação facial sejam biocompatíveis10; 11 visto que a prótese bucomaxilofacial fica em íntimo contato com a pele do paciente, não devendo gerar nenhum tipo de resposta inflamatória local ou sistêmica, nem ser carcinogênico12. Os testes de biocompatibilidade podem ser realizados in vivo ou in vitro. Testes in vivo de citotoxicidade sempre foram alvo de críticas crescentes por questões científicas, econômicas e éticas para a sua realização13. Os testes in vitro por sua vez, são capazes de demonstrar com segurança, de forma rápida, com baixo custo e com uma padronização bem definida a resposta celular frente ao material estudado ou extrato do mesmo12; 14. A literatura aponta diferentes testes in vitro para se determinar a citotoxicidade, tais como o teste MTT (sal metil tetrazolium)11; 14 e o teste Alamar Blue®15, os quais refletem o metabolismo celular por meio da atividade mitocondrial, e também o teste de Neutral Red13; 16, que determina a viabilidade celular por meio da atividade lisossômica. Capítulo 1 53 Com eles, pode-se observar, através do método de cultura de células, a proliferação ou a inibição do crescimento celular decorrente do contato com substâncias citotóxicas. De tal modo, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência de períodos de formação de extratos obtidos a partir de diferentes pigmentos utilizados para a confecção de próteses bucomaxilofaciais. Esta avaliação ocorreu através dos ensaios in vitro de MTT, Alamar Blue e Neutral Red para análise da citotoxicidade sobre queratinócitos humanos da linhagem HaCaT. A hipótese nula deste estudo é que diferentes períodos de formação dos extratos de pigmentos sobre culturas de células de queratinócitos humanos não produzem efeitos de citotoxicidade. Capítulo 1 54 2.4 Materiais e Métodos 2.4.1 Materiais Os materiais utilizados para a confecção das amostras estão listados abaixo (Quadro 2.1): Quadro 2.1 – Materiais utilizados para a confecção das amostras MARCA COMERCIAL FABRICANTE Silicone Silastic MDX4-4210 Dow Corning Corporation Medical Products, Midland, MI, EUA Silicone A2 A-2186 Factor II, Lakeside, AZ, EUA Pigmento FI- Functional Intrinsic II – Silicone Coloring System Bronze (Tan FI – 215) Factor II, Lakeside, AZ, EUA Pigmento FI- Functional Intrinsic II – Silicone Coloring System Preto (Black FI – 205) Factor II, Lakeside, AZ, EUA Pigmento Rosa Médio Orbital Orbital Colors, Birigui, SP 2.4.2 Métodos Confecção das amostras Para a confecção das amostras, foram selecionados os silicones faciais A2 A-2186 e Silastic MDX4-4210, três tipos de pigmentos, sendo dois deles específicos para caracterização de próteses bucomaxilofaciais já existentes no mercado nas cores bronze e preto, e um novo pigmento na cor rosa médio, idealizado pelos autores do presente Capítulo 1 55 estudo, obtido a partir de cores primárias - vermelho e amarelo- misturadas às cores de matização e sombreamento, branco e preto, respectivamente (Quadro 2.1) (Figura 2.1). Figura 2.1. Fluxograma de confecção das amostras Foram confeccionadas 5 amostras para cada grupo, distribuídos de acordo com o tipo de silicone, pigmento adicionado, sendo a divisão: Grupo 1: Silicone A2 A-2186 (SA), Grupo 2: SA + Pigmento Bronze (B) + Incorporação Laboratorial Convencional (C), Grupo 3: SA + Pigmento Preto (P) + C, Grupo 4: SA+ Pigmento Rosa Médio (R)+ C, Grupo 5: Silicone Silastic MDX4-4210 (SS), Grupo 6: SS + B + C, Grupo 7: SS + P + C, Grupo 8: SS+ R+ C. Para confecção das amostras, os silicones e os pigmentos foram pesados em balança analítica digital (Adventurer, Ohaus Corporation, NJ, EUA) sendo que os pigmentos bronze e preto foram adicionados a 0,2% do peso do silicone9 e para a coloração rosa médio foram adicionadas de acordo com a especificação do fabricante (Branco: 0,600%; Amarelo: 0,122%; Vermelho: 0,030%; Preto: 0,006%). Os pigmentos foram adicionados à base dos silicones através de manipulação industrial, na indústria Orbital Colors® (Orbital Ind. E Com. Ltda., Birigui, SP, Brasil), Capítulo 1 56 por meio de uma máquina de moagem, que consistiu de três etapas. Inicialmente o pigmento foi adicionado ao silicone por meio de um dispersor em hélice, em seguida passou por um moinho tricilindro e posteriormente por um teste de controle de qualidade padrões técnicos para a garantia da qualidade de produtos industriais e científicos na Alemanha, segundo norma DIN- Deutsches Institut für Normung. O catalisador foi adicionado à base pigmentada a nível laboratorial, conforme especificações do fabricante e, então, vertidos em matrizes de aço inoxidável. As matrizes foram então levadas à polimerizadora com pressão de 20 libras durante 20 minutos. Após este período, o silicone, contido na matriz, foi mantido com a superfície exposta ao meio ambiente por 72 horas até completa polimerização do material com a liberação do subproduto (formaldeído), conforme recomendação do fabricante. Após esse período cada amostra foi separada cuidadosamente da matriz metálica para evitar distorções. Análise de Viabilidade Celular A fim de utilizar uma concentração de soro fetal bovino que não superestimulasse o crescimento das células ou pudesse, de certa forma, interferir no seu crescimento padrão durante os períodos de desenvolvimento do projeto, foi realizado um estudo piloto para determinar a concentração de Soro Fetal Bovino (SFB) que seria utilizada na formação dos extratos. Foram avaliadas as concentrações de 5 e 10% e a partir dos resultados obtidos, optou-se pela utilização de meio com SFB na concentração de 10% para formação dos extratos. As amostras foram confeccionadas dentro de condições assépticas para evitar a contaminação do meio de cultura. Assim, um único operador, atuando sobre uma Capítulo 1 57 superfície de papel estéril, confeccionou as amostras utilizando instrumental esterilizado, roupas de proteção, luvas, óculos, gorro e máscara descartável. Para confecção das amostras foi utilizada uma matriz metálica em alumínio para cada um dos grupos, contendo em seu interior 6 compartimentos circulares com 10 mm de diâmetro e 1 mm de espessura17 Obtenção dos Extratos Para a análise do efeito citotóxico das substâncias liberadas pelas amostras, foram obtidos extratos das substâncias hidrossolúveis presentes nelas18; 19; 20. Foram colocadas 5 amostras de cada grupo em tubos Falcón contendo 9 ml de meio de cultura DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s) suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos, e incubados em estufa à 37º C por 24, 48 e 72 horas. Durante esse período de incubação, as substâncias foram difundidas para o meio de cultura, formando, assim, os extratos utilizados no teste de citotoxicidade. Adicionalmente foi realizada a análise de meios de cultura como controle. Depois de solubilizados, os extratos foram filtrados com filtros Millex (Millipore) de 0,22 μm para esterilização, tendo em vista a grande facilidade de contaminação do meio devido a sua riqueza em nutrientes. Cultura e Manutenção das Células O possível efeito citotóxico das substâncias liberadas pelos materiais testados foi avaliado pelo método de cultura de células. Dessa forma, queratinócitos (HaCaT) foram expandidos em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. O cultivo das células foi realizado em garrafas para culturas de células com tampa, contendo Capítulo 1 58 um filtro que permite a passagem de CO2. Essas garrafas foram incubadas com 5% de CO2, à temperatura de 37º C, em ambiente com umidade controlada. Para a manutenção da cultura, as células foram repicadas para novas garrafas até atingirem confluência para a realização dos ensaios. Com a finalidade de desgrudar e desagregar as células das garrafas e obter uma suspensão foi utilizada tripsina à 0,025% incubada por 2-5 minutos a 37 ºC10. Dessa suspensão de células, cada 1 ml foi colocado em nova garrafa sendo acrescidos 9 ml de meio de cultura suplementado. Cada garrafa foi, então, tampada e levada à estufa para a formação de nova confluência de células. Todos os procedimentos foram realizados em área asséptica dentro da capela de fluxo laminar previamente desinfetada com álcool 70° e luz ultravioleta. Além disso, os materiais utilizados, com exceção das células, foram esterilizados previamente em luz ultravioleta durante 30 minutos dentro da capela de fluxo laminar18; 21. Quantificação das Células e Teste de Citotoxicidade Para a realização dos testes de citotoxicidade, suspensões celulares de 1,0 x 105 células/ml de HaCaT foram preparadas. Para isso, as células foram descoladas do fundo das garrafas. Em seguida, essa suspensão foi colocada em um tubo de 15 ml e levada para centrifugação por 5 minutos a 1500 RPM, com o objetivo de precipitar as células no fundo do tubo. Posteriormente, dentro do fluxo laminar, o sobrenadante foi desprezado e 1ml de meio de cultura DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino, foi acrescentado e as células misturadas a ele. A partir daí, 10 μL foram removidos e, então, as células viáveis foram contadas por meio de uma câmara automatizada para contagem de células. Capítulo 1 59 Em seguida, as suspensões celulares foram ajustadas às concentrações desejadas de células/ml para a linhagem HaCaT10; 18; 21; 22 sendo 1 ml pipetado em cada poço de uma placa de 24 poços. Após 24 horas, o meio de cultura foi descartado e 500 μL contendo os diferentes extratos, foram adicionados em cada poço. No poço de controle positivo, 1 ml de DMEM foi adicionado com 10% de soro fetal bovino e, no controle negativo, foi adicionado 3μl de Tween diluído em 1 ml de DMEM com 10% de soro fetal bovino. Ambos foram submetidos às mesmas condições de incubação e temperatura utilizadas para a obtenção dos extratos. Ensaios MTT Após o período de 24 horas de tratamento, os meios de cultura com os extratos foram removidos e substituídos por 0,5 ml de meio DMEM sem a adição de soro fetal bovino contendo 0,5 mg/ml de MTT (3-[4,5-dimetilazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio), e incubados por 2 horas com 5% de CO2 à temperatura de 37º C. Após a incubação, os poços foram checados quanto à presença de cristais de formazan com microscópio óptico. O meio de cultura foi aspirado e 500 μL de álcool isopropílico foram adicionados a cada poço. Subsequentemente, foi feita a leitura das absorbâncias em comprimento de onda de 570 nm por meio do espectrofotômetro UV-Visível. As taxas de sobrevivência dos controles representam 100% de proliferação. Este ensaio foi realizado em triplicata. ALAMAR BLUE Capítulo 1 60 O ensaio de Alamar Blue, assim como o de MTT, é um ensaio de citotoxicidade que mede o metabolismo celular pela atividade mitocondrial, nesse caso através da redução da Resazurina a Resofurina na presença de NADH. O Alamar Blue ® é um teste simples e rápido, em que 10% da solução comercialmente disponível são adicionados ao meio celular e medidos por colorimetria ou fluorimetria. No entanto, maior sensibilidade é conseguida utilizando a propriedade fluorescente. O ensaio apresenta um indicador de crescimento fluorimétrico com base na detecção da atividade metabólica. Especificamente, o sistema incorpora um indicador de oxidação- redução (REDOX), que gera produto fluorescente e muda de cor em resposta à redução química. Além disso, o Alamar Blue ® não é tóxico para as células e não interfere na viabilidade celular, como ocorre com o Azul de Trypan e não se faz necessário descartar as células para obter medições subsequentes, como ocorre com o teste MTT. Após as 24 horas de incubação das células em contato com os extratos, para cada poço da placa foram adicionados 20 µL de Alamar Blue ® diluídos em 100 µL de meio de cultura (10% do volume total de meio – 200 µL). A placa foi, então, incubada na estufa contendo CO2 a 5% e à temperatura de 37ºC por mais 4 horas. Após esse período, o conteúdo de cada orifício da placa foi transferido para uma placa com 96 poços e a fluorescência das amostras foi medida duas vezes utilizando-se um espctrofotômetro com comprimento de onda de 570 nm e de 600 nm. Os valores foram calculados em uma fórmula para obtenção dos resultados. Este ensaio também foi realizado em triplicata. NEUTRAL RED O teste com Neutral Red (NR) se baseia no fato de que apenas as células vivas são capazes de captar o corante NR e acumulá-lo em seus lisossomos, podendo, assim, determinar a quantidade de células vivas em uma cultura O ensaio com Neutral Red foi Capítulo 1 61 adicionado ao projeto a fim de complementar os resultados encontrados pelo MTT e Alamar Blue. Para isso, após cada período de 24, 48 e 72 horas de tratamento, 500 μL do corante NR, na proporção de 1:80, sendo 1 de corante para 80 de meio de cultura sem soro fetal bovino, foi adicionado aos poços após aspirar o extrato. As placas foram incubadas por 2 horas a 37º C. A solução foi então removida dos poços e cada poço lavado duas vezes com 0,5 ml de solução de 1% de ácido fórmico (1%; 12 ml de H2O + 0,12 ml de ácido fórmico). Após lavagem, 1 ml de solução de extração a base de ácido acético (1%; 12 ml de H2O + 0,12 ml de ácido acético) foi adicionado a cada poço. Após extrair o corante das células, a viabilidade celular foi avaliada por densidade óptica da solução resultante a 550 nm utilizando espectrofotômetro. Análise dos dados Os resultados de biocompatibilidade foram avaliados utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0, no qual foi aplicado Análise de Variância (ANOVA) dois fatores, seguido do Teste de Bonferroni com nível de significância a 5%. Capítulo 1 62 2.5 Resultados Pode-se verificar, por meio dos resultados, que os pigmentos influenciaram os valores de viabilidade celular (Figuras 2.2 a 2.4). MTT A figura 2.2 mostra a viabilidade celular medida pelo ensaio de MTT. Verifica-se que para o período de formação de extrato de 24 horas, este apresentou, de forma geral, maior citotoxicidade quando comparado com demais períodos para todos os pigmentos, independentemente da marca de silicone utilizado. Entretanto não foi encontrada diferença estatisticamente significante para nenhum dos grupos. Citotoxicidade de pigmentos C O N T R O L E + M D X M D X R O S A M D X B E G E M D X P R E T O A F A C T O R A F A C T O R R O S A A F A C T O R B E G E A F A C T O R P R E T O C O N T R O L E - 0 50 100 24 48 72 Silicone e pigmentos C it o to x ic id a d e ( % ) Figura 2.2. Porcentual de citotoxicidade para cada silicone e pigmento após os períodos de formação de extrato de 24, 48 e 72 horas segundo o ensaio de MTT. 75% Capítulo 1 63 ALAMAR BLUE Na figura 2.3 observa-se a viabilidade celular medida pelo ensaio de Alamar Blue. Verifica-se que a maior citotoxicidade foi encontrada também para o período de formação de extrato de 24 horas, quando comparado com os demais períodos para todos os pigmentos, independentemente da marca de silicone utilizado, com diferença estatisticamente significante para o pigmento preto com o silicone MDX-4210e para o silicone Factor A2 A-2186. Citotoxicidade de pigmentos C O N T R O L E + M D X M D X R O S A M D X B E G E M D X P R E T O A F A C T O R A F A C T O R R O S A A F A C T O R B E G E A F A C T O R P R E T O C O N T R O L E - 0 50 100 24 48 72* * * * * Silicone e pigmentos C it o to x ic id a d e ( % ) Figura 2.3. Porcentual de citotoxicidade para cada silicone e pigmento após os períodos de formação de extrato de 24, 48 e 72 horas segundo o ensaio de Alamar Blue. 75% Capítulo 1 64 NEUTRAL RED A figura 2.4 exibe a viabilidade celular medida pelo ensaio de Neutral Red. Ao contrário dos demais ensaios, este apresentou um aumento da viabilidade celular, não exibindo toxicidade para nenhum dos silicones ou pigmentos. Citotoxicidade de pigmentos -NR C O N T R O L E + M D X M D X R O S A M D X B E G E M D X P R E T O A F A C T O R A F A C T O R R O S A A F A C T O R B E G E A F A C T O R P R E T O C O N T R O L E - 0 50 100 150 200 24 48 72* * * * * * * * * Silicone e pigmentos C it o to x ic id a d e ( % ) Figura 2.4. Porcentual de citotoxicidade para cada silicone e pigmento após os períodos de formação de extrato de 24, 48 e 72 horas segundo o ensaio de Neutral Red. 75% Capítulo 1 65 2.6 Discussão A hipótese nula desse estudo foi rejeitada uma vez que os pigmentos avaliados influenciaram a viabilidade celular. Este estudo analisou dois pigmentos, nas cores bronze e preto, já existentes no mercado para a pigmentação de próteses bucomaxilofaciais e, também, um novo pigmento proposto pelos autores, com alta solidez à luz, na tentativa de melhorar a estabilidade cromática exigida para o sucesso do tratamento reabilitador dessas próteses1; 3. Assim, além de enriquecer a literatura através de um trabalho nunca antes realizado com pigmentos para esse fim, esse estudo se faz necessário para verificar se a utilização desse novo pigmento é compatível com a linhagem de células humanas HaCaT. De acordo com a ISO-standard 10993-523, os métodos in vitro para a análise da citotoxicidade podem ser classificados como não citotóxicos, quando a viabilidade celular é maior que 75%, discreta citotoxicidade, quando a viabilidade está entre 50 e 75%, moderada citotoxicidade, para viabilidade entre 25 e 50% e alta citotoxicidade, menor que 25%. Portanto, para todos os períodos de formação dos extratos analisados não houve citotoxicidade dos silicones e pigmentos utilizados, visto que os valores permaneceram acima de 75% em todos os ensaios realizados. Inclusive no ensaio de Alamar Blue, que apresentou diferenças estatisticamente significantes. Os resultados do presente estudo corroboram a literatura, em que os ensaios de MTT (Figura 2.2) e Alamar Blue (Figura 2.3) apresentam uma correlação positiva. Em ambos ensaios foi verificada uma diminuição da viabilidade celular para os extratos de 24 horas. No entanto a viabilidade celular é maior para os extratos de 48 e 72 horas, quando em comparação ao de 24 horas. Aparentemente o extrato de 24 horas apresenta substâncias mais fortes, capazes de matar células mais sensíveis. Capítulo 1 66 Sabe-se que o silicone tem polimerização contínua e a maior liberação de formaldeído ocorre nas primeiras 72 horas, mas passado este período, a liberação de subproduto ainda continua9; 24, porém de forma decrescente. Apesar de as amostras desse estudo terem sido colocadas no meio para formação dos extratos após esse período crítico de 72 horas, devido à essa liberação contínua de formaldeído, uma inibição celular pode ter sido causada, justificando os resultados encontrados. Os resultados do Neutral Red (Figura 2.4) demonstram um aumento da viabilidade celular para todos os períodos de formação de extrato, silicones e pigmentos, quando comparados ao grupo controle positivo. O Neutral Red é utilizado como um corante vital, para tingir células vivas. As células vivas incorporam essa substância em seus lisossomos. À medida que as células começam a morrer, sua capacidade de incorporar vermelho neutro diminui. Assim, a perda de absorção de vermelho neutro corresponde à perda de viabilidade celular25. No entanto, lisossomos são organelas responsáveis pela degradação de partículas vindas do meio extracelular, e também pela reciclagem de outras organelas e componentes celulares envelhecidos26, eles estão equipados com a maquinaria para detectar a disponibilidade de nutrientes, o que determina a distribuição, o número, o tamanho e a atividade dos lisossomos para controlar a especificidade do fluxo de carga e do tempo (iniciação e término) da degradação27. Assim, esse aumento de viabilidade celular, pode significar na realidade um aumento no número de lisossomos no citoplasma celular, na tentativa de digerir o formaldeído residual liberado - substância que inibe a atividade celular-, também demonstrado no presente estudo, pelos ensaios de MTT e Alamar Blue. O estudo de Korting et al.13, verificou que as células primárias de queratinócitos apresentavam resultados mais próximos dos estudos in vivo para o ensaio de Neutral Red. Capítulo 1 67 Esses resultados sugerem que, especialmente quando se usa um teste de Neutral Red para demonstrar citotoxicidade, os queratinócitos primários mostram uma melhor relevância funcional do que as linhagens celulares16. À medida que as células primárias são consideravelmente mais sensíveis, é imaginável que o teste de citotoxicidade na linha celular de queratinócitos HaCaT subestime o potencial citotóxico das substâncias de teste para as células da pele humana devido às alterações que a linhagem celular já sofreu, o que justificaria os resultados apresentados no ensaio de Neutral Red do presente estudo. Estudos futuros analisando os mediadores inflamatórios e quantificando a expressão de genes, como por exemplo colágeno tipo IV, devem ser realizados como complemento deste estudo. No presente estudo, testes in vitro de análise da citotoxicidade foram realizados. Embora apresentem limitações, visto que os resultados não refletem completamente as propriedades citotóxicas do material na sua condição clínica, esses testes são essenciais para avaliar a biocompatibilidade na utilização dos materiais em seres humanos. A partir desses resultados, constatou-se que os materiais utilizados para a confecção de próteses bucomaxilofaciais, silicones e pigmentos, inclusive o novo pigmento proposto, são biocompatíveis para linhagem celular de queratinócitos Hacat. Capítulo 1 68 2.7 Conclusão Apesar das limitações de um estudo in vitro¸ pode-se concluir que todos os materiais utilizados não são citotóxicos, inclusive o novo pigmento proposto para a confecção de próteses bucomaxilofaciais. Capítulo 1 69 2.8 Referências 1 WEE, A. G. et al. Proposed shade guide for human facial skin and lip: a pilot study. J Prosthet Dent, v. 110, n. 2, p. 82-9, Aug 2013. ISSN 0022-3913. 2 KANTOLA, R. M. et al. Use of thermochromic pigment in maxillofacial silicone elastomer. J Prosthet Dent, v. 110, n. 4, p. 320-5, Oct 2013. ISSN 0022-3913. 3 KIAT-AMNUAY, S. et al. Influence of pigments and opacifiers on color stability of silicone maxillofacial elastomer. J Dent, v. 37 Suppl 1, p. e45-50, 2009. ISSN 0300- 5712. 4 DOS SANTOS, D. M. et al. Color stability of polymers for facial prosthesis. J Craniofac Surg, v. 21, n. 1, p. 54-8, Jan 2010. ISSN 1049-2275. 5 HUNGERFORD, E. et al. Coverage error of commercial skin pigments as compared to human facial skin tones. J Dent, v. 41, n. 11, p. 986-91, Nov 2013. ISSN 0300-5712. 6 AKASH, R. N.; GUTTAL, S. S. Effect of Incorporation of Nano-Oxides on Color Stability of Maxillofacial Silicone Elastomer Subjected to Outdoor Weathering. J Prosthodont, Jan 5 2015. ISSN 1059-941x. 7 DOS SANTOS, D. M. et al. Influence of pigments and opacifiers on color stability of an artificially aged facial silicone. J Prosthodont, v. 20, n. 3, p. 205-8, Apr 2011. ISSN 1059-941x. Capítulo 1 70 8 AL-HARBI, F. A. et al. Mechanical behavior and color change of facial prosthetic elastomers after outdoor weathering in a hot and humid climate. J Prosthet Dent, v. 113, n. 2, p. 146-51, Feb 2015. ISSN 0022-3913. 9 NOBREGA, A. S. et al. Influence of adding nanoparticles on the hardness, tear strength, and permanent deformation of facial silicone subjected to accelerated aging. J Prosthet Dent, May 5 2016. ISSN 0022-3913. 10 BAL, B. T. et al. In vitro cytotoxicity of maxillofacial silicone elastomers: effect of accelerated aging. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, v. 89, n. 1, p. 122-6, Apr 2009. ISSN 1552-4973. 11 BONATTO, L. D. R. et al. Biocompatibility of primers and an adhesive used for implant-retained maxillofacial prostheses: An in vitro analysis. J Prosthet Dent, v. 117, n. 6, p. 799-805, Jun 2017. ISSN 0022-3913. 12 AKAY, C. et al. In Vitro Cytotoxicity of Maxillofacial Silicone Elastomers: Effect of Nano-particles. J Prosthodont, Sep 06 2016. ISSN 1059-941x. 13 KORTING, H. C. et al. Discrimination of the irritancy potential of surfactants in vitro by two cytotoxicity assays using normal human keratinocytes, HaCaT cells and 3T3 mouse fibroblasts: correlation with in vivo data from a soap chamber assay. J Dermatol Sci, v. 7, n. 2, p. 119-29, Apr 1994. ISSN 0923-1811 (Print) 0923-1811. 14 DA SILVA, E. V. et al. Effect of different methods of polymerizing ocular prosthesis acrylic resin on a human conjunctival cell line. J Prosthet Dent, v. 116, n. 5, p. 818-823, Nov 2016. ISSN 0022-3913. Capítulo 1 71 15 MOHARAMZADEH, K. et al. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent Mater, v. 23, n. 1, p. 40-4, Jan 2007. ISSN 0109-5641 (Print) 0109-5641. 16 OLSCHLAGER, V.; SCHRADER, A.; HOCKERTZ, S. Comparison of primary human fibroblasts and keratinocytes with immortalized cell lines regarding their sensitivity to sodium dodecyl sulfate in a neutral red uptake cytotoxicity assay. Arzneimittelforschung, v. 59, n. 3, p. 146-52, 2009. ISSN 0004-4172 (Print) 0004-4172. 17 ATA, S. O.; YAVUZYILMAZ, H. In vitro comparison of the cytotoxicity of acetal resin, heat-polymerized resin, and auto-polymerized resin as denture base materials. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, v. 91, n. 2, p. 905-9, Nov 2009. ISSN 1552-4973. 18 JORGE, J. H. et al. Biocompatibility of denture base acrylic resins evaluated in culture of L929 cells. Effect of polymerisation cycle and post-polymerisation treatments. Gerodontology, v. 24, n. 1, p. 52-7, Mar 2007. ISSN 0734-0664 (Print) 0734-0664. 19 CIAPETTI, G. et al. False positive results in cytotoxicity testing due to unexpectedly volatile compounds. J Biomed Mater Res, v. 39, n. 2, p. 286-91, Feb 1998. ISSN 0021-9304 (Print) 0021-9304. 20 SCHUSTER, G. S. et al. Relationships between denture base resin cytotoxicity and cell lipid metabolism. Int J Prosthodont, v. 8, n. 6, p. 580-6, Nov-Dec 1995. ISSN 0893-2174 (Print) 0893-2174. 21 JORGE, J. H. et al. Cytotoxicity of denture base acrylic resins: a literature review. J Prosthet Dent, v. 90, n. 2, p. 190-3, Aug 2003. ISSN 0022-3913 (Print) 0022-3913. Capítulo 1 72 22 WALTER, M. N. et al. Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing: an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays. Exp Cell Res, v. 316, n. 7, p. 1271-81, Apr 15 2010. ISSN 0014-4827. 23 International Organization for Standardization. ISO 10993-5: biological evaluation of medical devices - Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Genebra: ISO; 2009. 24 FILIE HADDAD, M. et al. Color stability of maxillofacial silicone with nanoparticle pigment and opacifier submitted to disinfection and artificial aging. J Biomed Opt, v. 16, n. 9, p. 095004, Sep 2011. ISSN 1083-3668. 25 REPETTO, G.; DEL PESO, A.; ZURITA, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nat Protoc, v. 3, n. 7, p. 1125-31, 2008. ISSN 1750-2799. 26 SILVERTHORN, D. U. Human Physiology: An integrated approach. 5. Barueri: 2010. 27 XU, H.; REN, D. Lysosomal physiology. Annu Rev Physiol, v. 77, p. 57-80, 2015. ISSN 0066-4278. 3.Capítulo 2 Capítulo 2 74 Influência de diferentes métodos de incorporação de pigmentos na estabilidade cromática de silicones para próteses bucomaxilofaciais 3.1 Resumo Uma possível solução para a descoloração de próteses bucomaxilofaciais seria a utilização de pigmentos com alta solidez a luz. Entretanto há relatos na literatura, inclusive com a utilização de anti-UVs, antioxidantes e opacificadores, em que o material alterou a sua cor em curto prazo. Surge um questionamento, se a maneira que esse pigmento é incorporado não poderia estar diretamente relacionada à dispersão e homogeneização do mesmo no material, afetando sua estabilidade cromática. Assim o objetivo desse estudo foi analisar a influência dos métodos de incorporação de três pigmentos na estabilidade cromática de silicones utilizados para confecção de próteses bucomaxilofaciais. Para a confecção das amostras, foram selecionados os silicones faciais A2 A-2186 e Silastic MDX4-4210, e três tipos de pigmentos, sendo dois deles específicos para caracterização de próteses bucomaxilofaciais já existentes no mercado nas cores bronze e preto, e um novo pigmento proposto nesse estudo na cor rosa médio. Ao todo o trabalho possui 20 grupos (n=10), distribuídos de acordo com o tipo de silicone, pigmento adicionado e método de incorporação utilizado (laboratorial convencional, laboratorial mecânica e industrial). As amostras foram submetidas aos testes de estabilidade cromática no período inicial e ao término de cada ciclo de envelhecimento de 252, 504 e 1008 horas. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística, utilizando-se os testes de ANOVA e teste de Tukey com nível de significância de 5%. Pode-se verificar, por meio dos resultados que o método de incorporação, pigmento, silicone e período avaliado Capítulo 2 75 influenciaram a estabilidade cromática. Apesar das limitações de um estudo in vitro¸ pode-se concluir que o Método de Incorporação de pigmentos influenciou na estabilidade cromática, sendo o método mais favorável, a incorporação industrial. Com relação aos pigmentos estudados, o novo pigmento Rosa, proposto neste estudo, foi o que apresentou a melhor estabilidade cromática. Apesar desses achados, todas as alterações cromáticas constatadas se mantiveram dentro do limite clinicamente aceitável. Palavras-chave: Prótese Maxilofacial. Elastômeros de Silicone. Corantes. Cor. Capítulo 2 76 Influence of different pigment incorporation methods on the chromatic stability of silicone for bucomaxillofacial prostheses 3.2 Abstract A possible solution for the discoloration of maxillofacial prostheses would be the use of pigments with high light fastness. However, there are reports in the literature, including the use of anti-UVs, antioxidants and opacifiers, in which the material altered its color in the short term. A question is raised, if the way that this pigment is incorporated could not be directly related to the dispersion and homogenization of the same in the material, affecting its chromatic stability. Thus, the objective of this study was to analyze the influence of incorporation methods of three pigment on the chromatic stability of silicones used to make maxillofacial prostheses. For the specimens manufacturing, the facial silicones A2 A-2186 and Silastic MDX4-4210, and three types of pigments were selected, two of them specific for the characterization of maxillofacial prostheses, that already exists on the market, in bronze and black colors, and a new pigment, in pink medium color. The work presents 20 groups (n=10), distributed according to the type of silicone, pigment added and method of incorporation used conventional, mechanical and industrial) . The samples were submitted to chromatic stability tests in the initial period and at the end of each aging cycle of 252, 504 and 1008 hours. The data were submitted to statistical analysis, using ANOVA and Tukey test with a significance level of 5%. It can be verified, through the results that the method of incorporation, pigment, silicone and period evaluated influenced the chromatic stability. Despite the limitations of an in vitro study, it can be concluded that the pigment incorporation method influenced the chromatic stability, being the most favorable method, the industrial incorporation. Regarding the pigments studied, the new pink pigment, proposed in this study, presented Capítulo 2 77 the best color stability. Despite these findings, all the chromatic alterations observed remained within the clinically acceptable limit. Key-words: Maxillofacial Prosthesis. Silicone Elastomers. Coloring Agents. Color. Capítulo 2 78 *Este artigo será formatado de acordo com as normas do periódico Journal of Prosthetic Dentistry 3.3 Introdução As próteses bucomaxilofaciais são utilizadas escondendo defeitos, de forma a proporcionar uma aparência mais agradável e, algumas vezes inclusive, melhora da função1; 2. O que permite ao paciente mutilado retomar sua rotina social, resultando em melhora da autoestima e, consequentemente, da qualidade de vida3; 4; 5. Uma prótese ideal deve reproduzir as estruturas perdidas nos mínimos detalhes e ser imperceptível em público. Entretanto a natureza do defeito, as habilidades do protesista e os materiais de escolha limitam a beleza da prótese6 e, consequentemente o seu uso, já que a sua principal função é a recuperação da estética. Sendo assim, cor, forma e textura, são características primordiais que irão determinar o sucesso ou falha da prótese bucomaxilofacial1; 7, bem como a sua durabilidade5; 6. Desta forma, um dos maiores problemas enfrentados pelos protesista é a descoloração sofrida pela prótese, às vezes em menos de um ano de uso8; 9; 10, seja essa pigmentação realizada de forma intrínseca ou extrínseca10. A literatura9; 10; 11; 12 atribui essa alteração de cor à exposição aos raios ultravioletas e à manipulação diária da prótese pelo paciente, ao utilizar cosméticos e solventes para limpeza, além de atos insensatos, tais como o uso de tabaco. Já é consagrado o uso da câmara de envelhecimento acelerado para avaliar a degradação de materiais poliméricos1; 11; 13; 14; 15. Apesar de esse ensaio realizar condições extremas de umidade e de exposição aos raios UVB, ele é considerado um método viável, capaz de simular as mesmas condições e deteriorações do envelhecimento natural16. Contudo, deve-se levar em consideração que a estabilidade cromática do pigmento, bem como, a dificuldade de pigmentação do material de escolha para Capítulo 2 79 confecção da prótese, podem ser os responsáveis por essa descoloração12. De acordo com Mayer17, o desbotamento de um pigmento ou corante não é uma supressão ou desaparecimento da substância, trata-se na realidade de uma alteração química, que pode ser influenciada por diversos fatores, desde a sua composição até a maneira que esse pigmento é incorporado. A pureza química de um pigmento é variável. Alguns compostos simples são praticamente puros, enquanto outros pigmentos, apesar de apresentarem alto grau de pureza, contêm outros elementos adicionados durante a fabricação, como para a alteração da cor12. Os pigmentos podem ser classificados quanto à sua origem, sendo esta de acordo com o seu componente principal. Pigmentos orgânicos são aqueles de origem animal, vegetal ou sintética. Já os pigmentos inorgânicos não são formados por carbono e hidrogênio, eles contêm átomos de metal, são, portanto, de origem mineral17; 18. Existem relatos que os pigmentos orgânicos apresentam menor solidez à luz e, consequentemente, são mais susceptíveis a deterioração, apresentando assim, uma vida útil mais limitada12. Solidez à luz é uma propriedade física que determina a capacidade de um material resistir à alteração de cor quando exposto a luz, podendo variar de I a V a sua classificação, sendo I a menor alteração cromática e V a maior19. Assim, poderia ser determinado como solução para a descoloração de próteses bucomaxilofaciais a utilização de pigmentos com alta solidez. Entretanto há relatos na literatura3; 8; 20, inclusive com a utilização de anti-UVs, antioxidantes e opacificadores, em que o material alterou a sua cor em curto prazo. Surge um questionamento então, se a maneira que esse pigmento é incorporado não poderia estar diretamente relacionada à dispersão e homogeneização do mesmo no material3, afetando então as suas propriedades no que se relaciona principalmente à estabilidade cromática. Capítulo 2 80 É ainda importante ressaltar a dificuldade de se realizar uma prótese com a coloração exata da pele e que, apesar de existirem tentativas de confecção de escalas de cor4; 7; 21; 22; 23, nenhuma ainda se consagrou, seja na literatura ou na rotina clínica. Não há ainda um consenso sobre qual seria o melhor método de incorporação de pigmentos e se eles interferem na estabilidade cromática de silicones faciais. Por isso a execução desse trabalho se justificou pela necessidade de avaliar qualitativamente três diferentes métodos de incorporação de pigmentos e a sua influência ao longo do tempo. O presente estudo tem como objetivo analisar a influência dos métodos de incorporação de três pigmentos na estabilidade cromática dos silicones A2 A-2186 e Silastic MDX4-4210. Este estudo apresenta como hipótese nula que a incorporação de pigmentos não irá influenciar os valores de estabilidade cromática dos silicones. Capítulo 2 81 3.4 Materiais e Métodos 3.4.1. Materiais Os materiais utilizados para a confecção das amostras estão listados abaixo (Quadro 3.1): Quadro 3.1 – Materiais utilizados para a confecção das amostras MARCA COMERCIAL FABRICANTE Silicone Silastic MDX4-4210 Dow Corning Corporation Medical Products, Midland, MI, EUA Silicone A2 A-2186 Factor II, Lakeside, AZ, EUA Pigmento FI- Functional Intrinsic II – Silicone Coloring System Bronze (Tan FI – 215) Factor II, Lakeside, AZ, EUA Pigmento FI- Functional Intrinsic II – Silicone Coloring System Preto (Black FI – 205) Factor II, Lakeside, AZ, EUA Pigmento Rosa Médio Orbital Orbital Colors, Birigui, SP 3.4.2. Métodos Para a confecção das amostras, foram selecionados os silicones faciais A2 A-2186 e Silastic MDX4-4210, três tipos de pigmentos, sendo dois deles específicos para caracterização de próteses bucomaxilofaciais já existentes no mercado nas cores bronze e preto, e um novo pigmento na cor rosa médio, obtido a partir de cores primárias, Capítulo 2 82 (vermelho e amarelo), e de matização (branco) e sombreamento (preto) (Figura 3.1) (Quadro 3.1). Figura 3.1. Fluxograma de confecção das amostras Ao todo o trabalho possui 20 grupos, distribuídos de acordo com o tipo de silicone, pigmento adicionado e método de incorporação utilizado, sendo a divisão: Grupo 1: Silicone A2 A-2186 (SA), Grupo 2: SA + Pigmento Bronze (B) + Incorporação Laboratorial Convencional (C), Grupo 3: SA+ B+ Incorporação Laboratorial Mecânica (M), Grupo 4: SA+ B+ Incorporação Industrial (I), Grupo 5: SA + Pigmento Preto (P) + C, Grupo 6: SA + P+ M, Grupo 7: SA+ P+ I, Grupo 8: SA+ Pigmento Rosa Médio (R)+ C, Grupo 9: SA+ R+M, Grupo 10: SA+ R+ I, Grupo 11: Silicone Silastic MDX4- 4210 (SS), Grupo 12: SS + B + C, Grupo 13: SS+ B+ M, Grupo 14: SS+ B+ I, Grupo 15: SS + P + C, Grupo 16: SS + P+ M, Grupo 17: SS+ P+ I, Grupo 18: SS+ R+ C, Grupo 19: SS+ R+M, Grupo 20: SS+ R+ I. As amostras foram submetidas às leituras iniciais dos testes de estabilidade cromática e envelhecidas por 252, 504 e 1008 horas de envelhecimento acelerado, sendo que novas leituras foram realizadas ao término de cada ciclo. Capítulo 2 83 Confecção das amostras Para avaliação da estabilidade cromática foram confeccionadas 10 amostras para cada um dos grupos (n=10), por meio de matrizes com dimensões de 30 mm de diâmetro e 2 mm de espessura13; 24. As leituras foram realizadas no período inicial e após 252, 504 e 1008 horas de envelhecimento acelerado. Os silicones e os pigmentos foram pesados em balança analítica digital (Adventurer, Ohaus Corporation, NJ, EUA) sendo que os pigmentos bronze e preto foram adicionados a 0,2% do peso do silicone e para a coloração rosa médio foram adicionadas de acordo com a especificação do fabricante (Branco: 0,600%; Amarelo: 0,122%; Vermelho: 0,030%; Preto: 0,006%). Os silicones foram manuseados de acordo com as especificações do seu respectivo fabricante e vertidos em matrizes de aço inoxidável. Dependendo do grupo, diferentes métodos de incorporação dos pigmentos aos silicones foram realizados. Métodos de incorporação Para incorporação laboratorial convencional, o pigmento foi misturado ao silicone sobre uma placa de vidro com o auxílio de uma espátula de aço inoxidável, até a obtenção de uma massa homogênea. Após o manuseio, o silicone foi inserido no interior da matriz e, com o auxílio de uma espátula de metal, foi feita a regularização da espessura. A matriz foi então levada à polimerizadora com pressão de 20 libras durante 20 minutos. Após este período, o silicone, contido na matriz, foi mantido com a superfície exposta ao meio ambiente por 72 horas até completa polimerização do material com a liberação do subproduto (formaldeído), conforme recomendação do fabricante. Após esse período cada amostra foi separada cuidadosamente da matriz metálica para evitar distorções. Para incorporação laboratorial mecânica, o silicone foi misturado ao pigmento manualmente durante 15 segundos, seguida pela espatulação mecânica e a vácuo (20 psi) Capítulo 2 84 por 30s com 425 RPM, em espatuladora mecânica (Modelo 1170/97, Polidental Ind. e Com. Ltda.). Após a espatulação, foram seguidos os mesmos passos da incorporação laboratorial convencional. A incorporação industrial do pigmento ao silicone foi realizada na indústria Orbital Colors® (Orbital Ind. E Com. Ltda., Birigui, SP, Brasil), o pigmento foi adicionado à base do silicone por meio de uma máquina de moagem, que consistiu de três etapas. Inicialmente o pigmento foi adicionado ao silicone por meio de um dispersor em hélice, em seguida passou por um moinho tricilindro e posteriormente por um teste de controle de qualidade padrões técnicos para a garantia da qualidade de produtos industriais e científicos na Alemanha, segundo norma DIN- Deutsches Institut für Normung. Foi adicionado à base pigmentada a nível laboratorial o catalisador, conforme especificações do fabricante e, então, inserido na matriz. Seguindo os passos descritos anteriormente nos outros métodos para a confecção das amostras. Estabilidade Cromática As leituras de estabilidade de cor das amostras foram realizadas por espectrofotometria de reflexão ultravioleta visível. As alterações de croma e luminosidade foram avaliadas com auxílio do espectrofotômetro de reflexão (Shimadzu Corp., Nakagyo-ku, Kyoto, Japão)25. As alterações de cor foram calculadas por meio do Sistema CIE Lab, conforme estabelecido pela Comission Internacionale de I’Eclairage - CIE (Comissão Internacional sobre Iluminação). O CIE Lab permite a especificação de percepções de cores em termos de espaço tridimensional, comparando-se a cor da superfície das amostras com a cor do grupo controle correspondente, através do comprimento de onda versus reflexão. A axial “L” é conhecida como luminosidade e se estende de 0 (preto) a 100 (branco perfeito). A coordenada “a” representa a quantidade de vermelho (valores positivos) e de verde Capítulo 2 85 (valores negativos), enquanto a coordenada “b” r