UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL POLIMORFISMO CROMOSSÔMICO INTRAESPECÍFICO EM Mazama nana (HENSEL, 1872) Valdir Nogueira Neto Médico Veterinário 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL POLIMORFISMO CROMOSSÔMICO INTRAESPECÍFICO EM Mazama nana (HENSEL, 1872) Discente: M.V. Valdir Nogueira Neto Orientador: Prof. Dr. José Maurício Barbanti Duarte 2023 Dissertação de mestrado apresentada à Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. Dados curriculares do Autor Valdir Nogueira Neto – Nascido em 09 de setembro de 1997, na cidade Passos – MG, Brasil. Iniciou a graduação em Medicina Veterinária em fevereiro de 2015 no Centro Universitário da Fundação de Ensino Octávio Bastos em São João da Boa Vista – SP, Brasil, obtendo o título de Médico Veterinário em dezembro de 2019. Foi bolsista de Treinamento Técnico - 2 da Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (Fapesp) de agosto de 2019 a Julho de 2021 no Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos (Nupecce) na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Jaboticabal – SP. Ingressou no mestrado em agosto de 2021 no Programa de Pós- graduação em Ciência Animal da FCAV – Unesp, Jaboticabal – SP. Durante a elaboração desta dissertação foi agraciado parcialmente com a bolsa de estudos da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) sob número de processo 001, e parcialmente pela bolsa proveniente do CNPq. Agradecimentos Agradeço à Deus, por todas as oportunidades que me deu na vida e nunca me deixou faltar nada. Ao meu orientador, Prof. José Maurício Barbanti Duarte, pela oportunidade de estudar estes animais incríveis neste laboratório e pelos ensinamentos sobre os cervídeos. À Capes e CNPq pela bolsa de pesquisa e agradeço à Faculdade de Ciências Agrarias e Veterinárias – UNESP “Júlio de Mesquita Filho”, pela estrutura utilizada. Aos meus pais, José Rui e Higínia, por todos ensinamentos e apoio, às minhas irmãs Ana Laura e Allana, pelas risadas e conversas descontraídas nos encontros de família, aos meus sobrinhos Roberto Miguel e Pedro Gabriel por serem tão carinhosos e aos meus cunhados, Filipe e Leandro por toda ajuda durante esses anos. E à minha pequena cadela, Lolla. À cada pessoa do NUPECCE, pelo apoio nos bolos com café na cozinha e no RU, a ida e volta de bicicleta para o laboratório, de tantos que passaram, cito: Maria Helena, Liss, Lola, Jeferson, Eduard, Raquel, Laís e Bianca que sempre estiveram me apoiando, e também aos meninos da ecologia, Pedro, Marcio, Chico e Rullian. Agradecimento especial à Agda pelo ensinamento de técnicas e aulas, apoio, correções, caronas, inúmeras ajudas, companheirismo e paciência. Com certeza seria tudo mais difícil sem o seu apoio, muito obrigado! Agradeço também à Eluzai, pelo apoio no laboratório, paciência, disposição para me ajudar nos mais variados assuntos, compreensão e conselhos que levarei para a vida. Ao técnico João Airton Bôer, pelas conversas e ensinamentos das técnicas laboratoriais, além do apoio durante a execução do projeto. À todos os moradores da Republica Kilomb.O, por me acolherem e estarem disponíveis para momentos de descontração e conversas, e especialmente ao Mao- mé por sempre me socorrer nos momentos de desespero e pelas horas e horas de conversa. À Bruna Momesso por todos os anos de amizade e apoio emocional durante tanto tempo, que dure muito mais. À Patrícia Perin e Flávia Medeiros, pelos bons momentos e convivência em casa, e as duas “crianças” de 4 patas, Órion (In memorian) e Margot. À todos que passaram por minha vida nos últimos anos, um enorme, Obrigado por tudo! O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. V Sumário Páginas RESUMO ......................................................................................................... VII ABSTRACT ..................................................................................................... VIII ÍNDICE DE FIGURAS ....................................................................................... IX ÍNDICE DE TABELAS ....................................................................................... XI 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................... 3 2.1. Família Cervidae .................................................................................... 3 2.2. A diversidade cariotípica dos Cervídeos ................................................ 6 2.3. Citogenética molecular em Cervidae ..................................................... 10 2.4. A espécie Mazama nana ........................................................................ 12 3. OBJETIVOS ..................................................................................................17 4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 18 4.1. Amostras ............................................................................................... 18 4.2. Preparo das Lâminas ............................................................................. 19 4.2.1. Cultivo de Pele ........................................................................... 19 4.2.2. Repique ...................................................................................... 20 4.2.3. Colheita de células ..................................................................... 20 4.3. Obtenção e preparo de sondas ............................................................. 21 4.3.1. Clones de BAC ........................................................................... 21 4.3.2. Amplificação e Marcação das Sondas ....................................... 21 4.4. Hibridização in situ fluorescente ............................................................ 21 4.5. Análise de lâminas ................................................................................ 22 5. RESULTADOS ............................................................................................. 24 5.1. Variantes cariotípicas de Mazama nana ............................................. 25 6. DISCUSSÃO ................................................................................................. 30 7. CONCLUSÃO ............................................................................................... 37 8. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 38 VI VII Polimorfismo cromossômico intraespecífico em Mazama nana (Hensel, 1872) RESUMO – A espécie Mazama nana, é o menor cervídeo do Brasil. A espécie possui uma ampla distribuição que se estende pelo sul do Brasil, sudeste do Paraguai e nordeste da Argentina e atualmente, é classificada como “vulnerável” pela IUCN. Essa espécie possui o maior polimorfismo cromossômico intraespecífico, dentro dos cervídeos neotropicais. Dessa maneira o presente estudo objetivou investigar os polimorfismos cariotípicos intraespecíficos em amostras obtidas de animais com origem conhecida da espécie M. nana, utilizando sondas BAC de Bos taurus, pela técnica de hibridização in situ fluorescente. Os resultados revelaram a presença de oito variantes cariotípicas, com intervalo de 2n = 36 a 39, NF constante e igual a 58, e 0 a 5 cromossomos B em 11 indivíduos de diferentes localidades. Essas variações ocorreram nos pares cromossômicos 1, 3, 12 e 17. Os pares 1 e 3, foram cromossomos de dois braços, ou em heterozigose para a fusão cêntrica, enquanto os pares acrocêntricos 12 e 17 apresentaram fusão cêntrica Rb(12;17) em heterozigose ou homozigose. Uma variante, denominada V08, foi identificada pela primeira vez, destacando-se por acumular duas fusões cêntricas e uma fusão em tandem distinta das demais variantes. A partir dos rearranjos encontrados, foi elaborado um cariótipo ancestral hipotético para M. nana, que permitiu a inferência de uma rede de variantes cariotípicas. A rede resultou em duas linhagens cromossômicas a partir do cariótipo ancestral. Dessa maneira, a reprodução entre parentais com rearranjos cromossômicos distintos pode resultar em um indivíduo com aptidão reprodutiva reduzida, pelas divergências cromossômicas intrínsecas das variantes. Portanto, os polimorfismo cariotípico descrito para a espécie Mazama nana deve ser considerado para fins de conservação, enfatizando a importância de estratégias que levem em conta a complexa dinâmica das variantes cromossômicas dentro das populações. Palavras-chave: cariótipos, cervídeos, FISH, polimorfismo intraespecífico, rearranjos cromossômicos. VIII Intraspecific chromosomal polymorphism in Mazama nana (Hensel, 1872) ABSTRACT – The species Mazama nana is the smallest forest cervid in Brazil. The species has a wide distribution that extends through southern Brazil, southeastern Paraguay, and northeastern Argentina, and is currently classified as "vulnerable" by the IUCN. This species exhibits the highest intraspecific chromosomal polymorphism among neotropical cervids. Thus, the present study aimed to investigate intraspecific karyotypic polymorphisms in samples obtained from animals with a known origin of the species M. nana, using Bos taurus BAC probes through the fluorescent in situ hybridization technique. The results revealed the presence of eight karyotypic variants, with a range of 2n = 36 to 39, a constant NF equal to 58, and 0 to 5 B chromosomes in 11 individuals from different locations. These variations occurred in chromosomal pairs 1, 3, 12, and 17. Chromosomal pairs 1 and 3 exhibited themselves as two-armed chromosomes or in heterozygosity for centromeric fusion, while the acrocentric pairs 12 and 17 showed different rearrangements, including fused by the centromere in homozygosity, and the centric fusion Rb(12;17) in heterozygosity. A variant, named V08, was identified for the first time, standing out for accumulating two centric fusions and a tandem fusion distinct from other variants. From the rearrangements found, a hypothetical ancestral karyotype for M. nana was elaborated, allowing the inference of a network of karyotypic variants. The network resulted in two chromosomal lineages from the ancestral karyotype. Thus, reproduction between parents with different chromosomal rearrangements may result in an individual with reduced reproductive fitness due to intrinsic chromosomal divergences of the variants. Therefore, the karyotypic polymorphisms described for the species Mazama nana should be considered for conservation purposes, emphasizing the importance of strategies that take into account the complex dynamics of chromosomal variants within populations. Keywords: karyotypes, cervids, FISH, intraspecific polymorphism, chromosomal rearrangements. IX Índice de Figuras Figura 1: Árvore filogenética dos cervídeos neotropicais através do gene mitocondrial parcial Citocromo B (934 pb). Marcações na árvore: Gray clade (Clado cinza, homólogo a subtribo Blastocerina), Red clade (clado vermelho, homólogo a subtribo Odocoileina). O suporte dos clados é apresentando através de valores de bootstrap e probabilidade posterior. Fonte: Duarte, González e Maldonado, 2008. ...................... 5 Figura 2: Diferenças cromossômicas encontradas no complexo de espécies crípticas Mazama americana. Citótipos Juina 2n = 44/45 e Rondônia: 2n = 42/43, correspondem a linhagem de baixo número diploide. Os citótipos Santarém: 2n = 50/51; Jari: 2n = 48/49; Paraná: 2n = 52/53; Carajás: 2n = 50/51 e o M. americana sensu stricto: 2n = 45, correspondem a linhagem de alto número diplóide. Fonte: Cifuentes-Rincón et al., 2021. ..................................................................................... 8 Figura 3: Exemplo de aplicações das diferentes técnicas de FISH em cervídeos neotropicais. A: FISH utilizando a pintura cromossômica no estudo comparativo entre as espécies Mazama rufa (MRU) e M. americana (MAM). B: Técnica de BAC derivadas de Bos taurus, no mapeamento cariotípico da espécie S. gouazoubira. Fonte: Adaptados de A: Peres et al., 2021. B: Bernegossi et al., 2022. ................... 11 Figura 4: Foto lateral do corpo de um indivíduo adulto da espécie Mazama nana em cativeiro no Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos. Fonte: Acervo do NUPECCE. ................................................................................................................ 13 Figura 5: Cariótipos de um indivíduo da espécie Mazama nana V01 (2n = 36), a partir de diferentes bandamentos e colorações. A: coloração de Giemsa. B: Bandamento C. (bandas escuras correspondentes às regiões de heterocromatina constitutiva) C: Bandamento Ag-NOR, (regiões organizadoras de nucléolo dos pares 2 e 6). D: Bandamento G (padrão de bandas claras e escuras de todos os cromossomos do lote). Fonte: Abril e Duarte, 2008. ............................................................................. 14 Figura 6: Bandamento G das variantes cariotípicas de Mazama nana a partir da técnica do bandamento G. A: cariótipo de V03 (2n = 37 NF = 58. Par de cromossomos sexuais (XX) e heterozigose do par 7. B: V04 (2n = 38 NF = 58; par sexual (XY) e pares 8 e 9 em heterozigose). C: V05 (2n = 38 NF = 58; cromossomos sexuais (XX) e elementos acrocêntricos não fusionados do par 7). D: V07 (2n = 39, NF = 58, par de cromossomos sexuais (XY), fusão cêntrica do par 3 em heterozigose e elementos acrocêntricos não fusionados do par 7. Fonte: Abril e Duarte, 2008. ........................ 15 Figura 7: Modelagem da distribuição da espécie Mazama nana. Retirado de: Oliveira, Couto e Duarte, 2019. ............................................................................................... 16 Figura 8: Mapa indicando as localidades amostradas, sob a distribuição atual da espécie Mazama nana, segundo a IUCN. Em vermelho estão evidenciados os limites dos estados brasileiros. ............................................................................................. 19 Figura 9: Cariótipos representativos de cada variante da espécie Mazama nana, em DAPI invertida. .......................................................................................................... 24 Figura 10: Resultados da FISH de diferentes amostras de Mazama nana. A. I - Par cromossômico 1 em homozigose, mostrado pela sonda 214M18 (braço p) e 121P7 (braço q). II - Par cromossômico 1 em heterozigose, a sonda 173B8 (verde) marca o file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309453 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309453 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309453 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309453 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309453 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309454 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309454 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309454 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309455 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309455 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309455 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309455 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309455 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309455 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309456 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309456 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309456 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309456 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309456 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309456 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309456 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309457 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309457 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309458 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309458 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309458 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309459 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309459 X braço p de um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico, a sonda 79A23 (rosa) marca o braço q e um acrocêntrico. B. Par 1 homozigoto a sonda 437C7 (verde) no braço p e a sonda 42D15 no braço q. II - Par 3 em heterozigose a sonda 437C7 marca o braço p de um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico, a sonda 42D15 marca o braço q do mesmo cromossomo de dois braços e um acrocêntrico. C. I -Pares 12 e 17 em homozigose não fusionados, Par 12 em rosa (sonda 223P21) e par 17 em verde (sonda 106N15). II - Par 12 e 17 fusionados em homozigose 12 em rosa (sonda 223P21) e par 17 em verde (sonda 106N15). III - Pares 12 e 17 fusionados em heterozigose, par 12 em rosa (sonda 223P21) e par 17 em verde (sonda 106N15). A linha amarela traçada corresponde a posição do centrômero. .................................. 26 Figura 11: Figura comparativa entre as diferenças cromossômicas apresentadas pela V01 e a V08 de Mazama nana sob a análise de FISH. A. Par 1 da V01 fusionado em homozigose com a sonda em verde (214M18) no braço p e sonda rosa (121P7) no braço q, comparado a ao par 1 em heterozigose da V08 onde a sonda verde (173B8) marca o braço p de um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico, e a sonda rosa (79A23) marca o braço q do cromossomo de dois braços e um acrocêntrico. B. Par 2 da V01 em comparação ao par 5 da V08, a região proximal do braço q do par 2 da V01 se manteve na mesma posição no par 5 da V08 (sondas 59F16 - V01 e 411D6 - V08), enquanto a porção distal do par 2 da V01, corresponde ao par 10 da V08 (sondas 283F4 – V01 e 124O11 – V08). C. O braço q do cromossomo 4 da V01 (sonda 47G11), corresponde ao braço q do par 2 da V08 (sonda 205E12), enquanto o braço p do cromossomo 4 da V01 (sonda 463C19) corresponde a porção distal do braço q do par 5 da V08 (Figura 11.C – sonda 91N11). D. O braço p do cromossomo 6 da V01 corresponde ao braço p do cromossomo 6 da V08, e o braço q do mesmo cromossomo corresponde ao par 12 da V01, por sua vez o braço q do cromossomo 6 da V01, corresponde ao braço p do cromossomo 2 da V08 (Figura 11C – Sonda 215P21). A linha amarela traçada corresponde a posição do centrômero. .................................. 29 Figura 12: O esquema apresenta: à esquerda a variante 01 e à direita a V08. As cores correspondem às homologias cromossômicas. A disposição dos cromossomos foi reestruturada para a V08. ......................................................................................... 30 Figura 13: Comparação entre o par cromossômico 2 da V01 e os pares 5 e 10 da V08. Ao lado direito de cada par se encontra seu esquema de homologias baseado na V01. A linha azul indica a posição da banda heterocromática no par 2 da V01 e no par 10 da V08. O par 5 da V08 não apresentou a marcação da banda heterocromática. A seta vermelha indica a região heteromórfica de um dos cromossomos do par 10 da V08. ........................................................................................................................... 30 Figura 14: A) Cariótipo Hipotético Ancestral de Mazama nana, elaborado a partir dos resultados obtidos pela hibridização de sondas BAC’s. B) Rede de evolução das variantes cariotípicas de Mazama nana, por meio de fusões cêntricas e em tandem a partir do cariótipo ancestral hipotético. Quadros da Figura B: 1) Representação esquemática dos pares 2, 4, 6 e 12, comuns da V01 a V07. 2) Esquema representativo dos pares 2, 5, 6 e 10, rearranjos cromossômicos observados exclusivamente na V08. .................................................................................................................................. 30 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309462 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309462 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309462 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309463 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309463 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309463 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309463 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309463 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309463 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309464 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309464 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309464 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309464 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309464 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309464 file:///C:/Users/Valdir/Desktop/Dissertação%20M%20nana%20-%20Correções%2002.docx%23_Toc158309464 XI Índice de Tabelas Tabela 1: Identificação, sexo e origem das amostras de Mazama nana utilizadas para a descrição e análise cariotípica. .............................................................................. 18 Tabela 2: Mistura de hibridização para volume final de 10 μl: .................................. 22 Tabela 3: Sondas BAC’s utilizadas para a descrição dos polimorfismos. Na primeira coluna são mostrados os cromossomos de Bos taurus (BTA), seguindo pela região sinalizada; identificação do Clone BAC e posição correspondente na biblioteca genômica CHORI-240. Cada linha corresponde ao cromossomo bovino da primeira coluna e cada região corresponde a uma sonda diferente (Centromérica, Medial, Distal ou Telomérica). ......................................................................................................... 23 Tabela 4: Identificação, número diplóide e número de cromossomos B's em cada amostra de Mazama nana. ........................................................................................ 25 1 1. INTRODUÇÃO A espécie Mazama nana, também conhecida como veado-da-mão-curta e veado-cambuta, habita a região sul do Brasil e países vizinhos, estando restrita à Mata Atlântica (OLIVEIRA; COUTO; DUARTE, 2019). Esta espécie enfrenta desafios como a perda de hábitat, caça ilegal, predação por cães errantes e infecções virais transmitidas por ruminantes domésticos (OLIVEIRA; COUTO; DUARTE, 2019). Essas ameaças, em conjunto, atribuem à espécie o status de vulnerável na lista vermelha da IUCN (sigla de Internacional Union for Conservation of Nature, ou União Internacional para a Conservação da Natureza, em português) (DUARTE et al., 2015). A fragmentação do habitat resulta na concentração das populações em áreas cada vez menores, o que, por sua vez, perturba a dinâmica das populações (SHCHIPANOV; PAVLOVA, 2019). Além das pressões ambientais mencionadas, Abril e Duarte (2008), descreveram sete variantes cariotípicas para M. nana, com números cromossômicos (2n) variando de 36 a 39 e portando de 0 a 6 cromossomos B's. Estas variantes apresentaram distintas translocações Robertsonianas em heterozigose. A complexa reorganização estrutural descrita é sugestiva de uma potencial fragilidade cromossômica característica de cervídeos neotropicais florestais (VARGAS-MUNAR; SARRIA-PEREA; DUARTE, 2010). A descrição minuciosa dos polimorfismos cariotípicos é fundamental para uma compreensão mais ampla sobre a espécie. Isso porque estudos relatam drásticas reduções nos parâmetros reprodutivos de híbridos resultantes de cruzamentos entre diferentes linhagens cromossômicas de Mazama americana (GALINDO et al., 2021a). As linhagens cromossômicas de M. americana carreavam diferentes números e reorganizações cariotípicas, semelhante ao observado para a espécie M. nana (ABRIL e DUARTE, 2008; CURSINO et al., 2014; GALINDO et al., 2021a) Para explorar minuciosamente os polimorfismos cromossômicos intraespecíficos é essencial o uso de metodologias acuradas, como a hibridização in situ fluorescente (FISH). A FISH é uma técnica altamente sensível que possibilita a detecção precisa de homologias cromossômicas (LIEHR, 2017). Nesse método, é feito a hibridização de uma sequência de DNA ou RNA conhecida, à sua exata localização complementar no material genético de uma célula-alvo (LIEHR, 2017). Para a visualização da região hibridizada, a sequência conhecida é marcada com uma 2 molécula fluorescente que emite um sinal de fácil identificação (PINTO, 2013). A precisa detecção de homologias permite a identificação de translocações, fissões cromossômicas, e propicia comparações diretas entre cariótipos (FROHLICH et al., 2017). Desse modo, o estudo teve como finalidade, analisar os cromossomos envolvidos no polimorfismo cromossômico da espécie Mazama nana, e relacionar ao possível impacto que essas divergências podem causar nas populações da espécie. Essa abordagem visa, em última instância, discutir as implicações desse polimorfismo na conservação da espécie M. nana. 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Família Cervidae A família Cervidae é a segunda mais diversa entre os ruminantes, compreendendo 56 espécies divididas em 21 gêneros (HECKEBERG et al., 2016; ZURANO et al., 2019). Uma característica intrínseca dessa família são os chifres, que os difere dos demais mamíferos. Os chifres são estruturas ósseas decíduas que crescem a partir de um pedículo localizado na fronte, sendo um prolongamento do osso frontal (HECKEBERG, 2017). Essa estrutura, presente nos machos da família, também está presente nas fêmeas de Renas (Rangifer tarandus), sendo a única espécie que apresenta chifres nos dois sexos (HOLAND et al., 2004). Outras exceções estão nas espécies Hidropotes inermis e Moschus moschiferus, que se destacam pela ausência de chifres nos machos, os quais, no entanto, exibem um par de caninos que se alongam para além da cavidade oral (PRIKHOD’KO, 2015; SEO et al., 2017). Os cervídeos possuem uma ampla distribuição pelos continentes europeu, asiático e americano, em que as espécies da família se adaptaram a diferentes ambientes como as savanas, florestas, tundras e até ao Ártico (GROVES; GRUBB, 2011). Como resultado a essa adaptação, há uma extensa diferenciação morfológica, com espécies de grande tamanho corporal como Alces alces, de aproximadamente 600kg e dois metros de altura da cernelha, contrastando com espécies de estatura pequena como Pudu puda, espécie florestal de cerca 7kg e 40 centímetros de altura da cernelha (GROVES; GRUBB, 2011). A dispersão histórica da família Cervidae ainda possui lacunas, porém, acredita-se que os primeiros cervídeos viveram nas florestas da Eurásia há cerca de 13 milhões de anos (Ma) (ZURANO et al., 2019). Há aproximadamente 5 Ma, durante a transição do Mio-Plioceno, os cervídeos atravessaram o Estreito de Bering e chegaram a América do Norte. Por volta de 2,5 Ma atrás, já existiam pelo menos duas linhagens da tribo Odocoileini (subtribos Blastocerina e Odocoileina) de acordo com registros fósseis (HECKEBERG et al., 2016). Neste mesmo período, com a formação geológica do Istmo do Panamá, houve a migração dos cervídeos da América do Norte em direção à América do Sul, no evento conhecido como Grande Intercâmbio Biótico Americano (WEBB, 1976). Após esse evento singular, a dispersão pela América do 4 Sul foi rápida e favorecida pela ausência de competidores ruminantes e também, até então, pela escassez de predadores (HASSANIN et al., 2012). Atualmente, a região neotropical conta com oito gêneros separados em duas subtribos. A subtribo Blastocerina compreende os gêneros Blastocerus, Hippocamelus, Ozotoceros, Passalites, Pudu e Subulo, e, a subtribo Odocoileina, contém os gêneros Mazama e Odocoileus. Esses gêneros se distribuem geograficamente do sul do México ao sudoeste do Chile (HECKEBERG, 2020; ZURANO et al., 2019). Embora alocados em subtribos diferentes, algumas espécies compartilham características fenotípicas muito similares, que foram associadas a uma convergência adaptativa ou retenção de padrões morfológicos (MERINO; ROSSI, 2010). Por exemplo, as espécies dos gêneros Mazama, Passalites e Subulo apresentam tamanho corporal reduzido e chifres simples em forma de espeto (DUARTE; GONZÁLEZ; MALDONADO, 2008; HECKEBERG, 2017). Por consequência, indivíduos com esse morfotipo foram alocados no passado dentro de um único gênero por diversas revisões taxonômicas (ROSSI, 2000). Com o advento das técnicas genéticas, foi demonstrado que a morfologia sozinha não era suficiente para reconstruir a história filogenética do grupo, sendo propostas novas revisões integrando dados morfológicos, citogenéticos e moleculares (GILBERT; ROPIQUET; HASSANIN, 2006). Os estudos de genética molecular foram a base para a sugestão e revalidação dos nomes genéricos Passalites (Gloger, 1841) e Subulo Smith, 1827 para alocar as espécies antigamente nomeadas Mazama nemorivaga (Cuvier, 1817) e Mazama gouazoubira (Fischer, 1814), respectivamente, que eram agrupadas dentro de Mazama devido às similaridades morfológicas (BERNEGOSSI et al., 2022a; DUARTE; GONZÁLEZ; MALDONADO, 2008; GILBERT; ROPIQUET; HASSANIN, 2006; HASSANIN et al., 2012; MORALES-DONOSO et al., 2023). Entretanto, a filogenia mitocondrial evidenciou que os táxons previamente mencionados divergiam em duas linhagens diferentes, sem ancestral comum recente entre si, nem com o grupo relacionado à espécie tipo do gênero Mazama (GUTIÉRREZ et al., 2017; HECKEBERG et al., 2016). Também, mostraram os gêneros Pudu, Hippocamelus e Odocoileus como polifiléticos (Figura 1) (DUARTE; GONZÁLEZ; MALDONADO, 2008; GUTIÉRREZ et al., 2017; HASSANIN et al., 2012). Isso tudo, revelou a necessidade de revisões mais robustas partindo de abordagens integrativas e multi-locus para 5 esclarecer a complexa taxonomia dos cervídeos neotropicais (HECKEBERG, 2020; PERES et al., 2021) Figura 1: Árvore filogenética dos cervídeos neotropicais através do gene mitocondrial parcial Citocromo B (934 pb). Marcações na árvore: Gray clade (Clado cinza, homólogo a subtribo Blastocerina), Red clade (clado vermelho, homólogo a subtribo Odocoileina). O suporte dos clados é apresentando através de valores de bootstrap e probabilidade posterior. Fonte: Duarte, González e Maldonado, 2008. 6 Em virtude da reclassificação das espécies da tribo Blastocerina, atualmente seis espécies são consideradas válidas para o gênero Mazama, são elas: M. americana Erxleben 1777, M. rufa (Illiger 1815), M. temama (Kerr 1792), M. rufina (Pucheran 1851), M. jucunda Thomas 1913, e M. nana (Hensel 1872) (GUTIÉRREZ et al., 2017; HECKEBERG, 2020; PERES et al., 2021). Apesar de todas as mudanças de nomenclatura e classificação taxonômica, ainda é necessário ampliar o conhecimento das relações evolutivas dos cervídeos neotropicais e compreender a ampla variação cariotípica intra e interespecífica que caracteriza o gênero Mazama. 2.2. A diversidade cariotípica dos cervídeos A alta taxa de evolução cromossômica é notável dentro da família Cervidae, sendo maior que grande parte das famílias da ordem Artiodactyla (FONTANA; RUBINI, 1990). Devido a isso, é observada uma grande variedade de números diploides (2n), onde a espécie Muntiacus vaginalis possui o menor número cromossômico da família com 2n= 6-7, e as espécies Hidropotes inermis e Subulo gouazoubira possuem o maior número cariotípico de 2n = 70. Essas últimas duas espécies foram consideradas retentoras do cariótipo hipotético ancestral, o qual consiste em 68 pares de cromossomos autossomos acrocêntricos, o X acrocêntrico e maior do lote, e o Y um submetacêntrico e menor do lote (DEMENTYEVA ET AL., 2010; FONTANA & RUBINI, 1990; PROSKURYAKOVA ET AL., 2017). Presume-se que os cervídeos evoluíram, de maneira geral, por fusões cromossômicas em tandem e cêntricas (NEITZEL, 1987). Nesse sentido, cada tribo é reconhecida por apresentar padrões particulares de evolução cromossômica a partir do cariótipo basal (BONNET-GARNIER et al., 2003; CHI et al., 2005; FONTANA; RUBINI, 1990; YANG et al., 1997). As fusões em tandem, por exemplo, são fortemente associadas à rápida evolução da tribo Muntiacini, enquanto as fusões cêntricas são mais associadas aos rearranjos cromossômicos da tribo Odocoileini (FONTANA; RUBINI, 1990; HUANG et al., 2006). Nessa tribo, correspondente aos cervídeos neotropicais, ainda é possível observar um padrão de evolução cromossômica diferente entre suas subtribos. As espécies da subtribo Blastocerina possuem uma variação pequena no número cromossômico, com 2n de 66 a 70, com a descrição de polimorfismos intraespecíficos para S. gouazoubira (2n = 68 - 70 + 0-3 B e NF = 70) e P. nemorivagus (2n = 67-69 + 2-7 B e NF = 69-72) (FIORILLO et al., 2013; VALERI; 7 TOMAZELLA; DUARTE, 2018). Por sua vez, na subtribo Odocoileina, a diversidade cariotípica é maior, com números cromossômicos variando de 2n = 32 a 70, sendo que o gênero Mazama detêm o maior intervalo de 2n = 32 a 53 e espécies com notáveis descrições de polimorfismo cromossômicos intraespecíficos (ABRIL; DUARTE, 2008; ABRIL et al., 2010). Os polimorfismos intraespecíficos do gênero Mazama são descritos em cinco das seis espécies: Mazama jucunda (2n = 32-34 + 4-5 B NF= 45), Mazama nana (2n = 36-39 + 0-6 B e NF = 58), Mazama temama ( 2n = 44-47 + 0-5 B e NF = 70), Mazama rufa (2n = 52-53 + 2-3 B e NF = 56) e, o caso mais expressivo presente em Mazama americana sensu lato (2n = 42-51 + 0-6 B e NF = 46-56) (ABRIL et al., 2010b; ABRIL; DUARTE, 2008; DUARTE; JORGE, 2003; PERES et al., 2021; SANDOVAL et al., 2022). Nessa última espécie, a ampla variação cariotípica em indivíduos indistinguíveis morfologicamente levou à descrição de um complexo de espécies crípticas, o que foi suportado por uma polifilia da espécie em filogenias de genes mitocondriais (ABRIL et al., 2010b; DUARTE; GONZÁLEZ; MALDONADO, 2008). Para este complexo de espécies, são descritas duas linhagens cromossômicas: uma de alto e uma de baixo número diploide. As descrições cariotípicas estiveram de acordo com a origem da amostra, sendo observada uma forte congruência geográfica, dessa forma, a descrição de indivíduos carreando os mesmos rearranjos cariotípicos, foram chamados de citótipos (ABRIL et al., 2010b). Por sua vez, os citótipos com semelhanças cromossômicas são agrupados em uma mesma linhagem (Figura 2) (ABRIL et al., 2010b). Considerando que o cruzamento de indivíduos com cariótipos diferentes pode gerar descendentes subférteis ou inférteis por erros meióticos (DOBIGNY; BRITTON- DAVIDIAN; ROBINSON, 2015) estudos avaliaram os parâmetros reprodutivos de machos e fêmeas de M. americana, puros e híbridos entre citótipos, buscando compreender o impacto das diferenças cromossômicas na fertilidade (CURSINO et al., 2014; SALVIANO et al., 2017). Como resultado, os híbridos que os parentais tinham apenas uma fusão de diferença foram subférteis, por sua vez, indivíduos cujo parentais possuíam mais de uma fusão de diferença geraram indivíduos inférteis (CURSINO et al., 2014; SALVIANO et al., 2017). Animais puros não apresentaram qualquer variação na fertilidade (CURSINO et al., 2014; SALVIANO et al., 2017). Nesse caso, foi demonstrado que as discrepâncias cromossômicas dos progenitores 8 levaram a consequências significativas nos parâmetros reprodutivos dos híbridos (CURSINO et al., 2014; SALVIANO et al., 2017). Figura 2: Diferenças cromossômicas encontradas no complexo de espécies crípticas Mazama americana. Citótipos Juina 2n = 44/45 e Rondônia: 2n = 42/43, correspondem a linhagem de baixo número diploide. Os citótipos Santarém: 2n = 50/51; Jari: 2n = 48/49; Paraná: 2n = 52/53; Carajás: 2n = 50/51 e o M. americana sensu stricto: 2n = 45, correspondem a linhagem de alto número diplóide. Fonte: Cifuentes-Rincón et al., 2021. Para melhor compreensão dos efeitos da hibridação entre os citótipos de M. americana, Galindo et al. (2021a) avaliaram as consequências de apenas uma fusão em tandem (FT) ou translocação Robertsoniana (TR) em heterozigose sobre o desbalanço cromossômico nas células espermáticas dos portadores. Neste estudo, constataram que uma TR em heterozigose apresenta baixo efeito na aptidão reprodutiva, entretanto, os indivíduos heterozigotos para uma FT possuem taxas significativas de espermatozoides desbalanceados (GALINDO et al., 2021b). Os 9 autores concluíram, então, que a FT em heterozigose causa a severa redução na fertilidade, atuando como uma eficiente uma barreira reprodutiva (GALINDO et al., 2021a). A baixa aptidão reprodutiva dos híbridos entre as diferentes linhagens cromossômicas suscita questionamentos interessantes (SALVIANO et al., 2017). Nesse contexto, surge a reflexão sobre o isolamento geográfico das populações e se isso terá sido a principal causa da evolução independente dos seus cariótipos, desempenhando um papel crucial como barreira reprodutiva (UNCKLESS; ORR, 2009). Além disso, outra perspectiva instigante é a possibilidade de mutações cromossômicas ocasionais terem desempenhado um papel preponderante na condução do processo de isolamento reprodutivo (PAYSEUR; RIESEBERG, 2016) Entretanto, acredita-se que a barreira reprodutiva secundária, mediada por mutações cromossômicas, pode ser a explicação mais plausível (ABRIL, 2005). Isso se deve à hipótese de que certas espécies de cervídeos neotropicais podem ser mais suscetíveis a fragilidades cromossômicas, resultando em quebras e rearranjos cariotípicos (GLOVER; STEIN, 1988). Diante disso, a hipótese da fragilidade cromossômica foi testada in vitro em quatro espécies de cervídeos com o fármaco Doxorubicina. O fármaco agiu como agente indutor de mutagenicidade aumentando a ocorrência de quebras e aberrações cromossômicas, resultando em gaps cromossômicos, quebras de cromátides ou cromossomos (ambas cromátides). As espécies mais afetadas foram, respectivamente, S. gouazoubira, seguido por M. americana e M. nana, e a espécie menos afetada foi Blastocerus dichotomus (VARGAS-MUNAR; SARRIA-PEREA; DUARTE, 2010). Esse estudo possui coerência, visto que B. dichotomus é relatado como uma espécie estável cromossomicamente, e as duas espécies do gênero Mazama avaliadas, são as que mais possuem descrições de polimorfismos cromossômicos (ABRIL; DUARTE, 2008; ABRIL, 2009). Diante do contexto de fragilidade cromossômica, as técnicas citogenéticas clássicas desempenham um papel fundamental no diagnóstico de polimorfismos. No entanto, torna-se evidente que essas técnicas têm limitações quando se trata de variações sutis nos padrões cromossômicos, que podem conter informações cruciais sobre a evolução das espécies, como observado em espécies de cervídeos 10 neotropicais (ABRIL et al., 2010b). Dessa forma, os polimorfismos cariotípicos denotam a necessidade de abordagens mais precisas e detalhadas para o estudo dessas variações. É nesse contexto que as técnicas citogenéticas em nível de DNA surgem como uma solução promissora para superar essas limitações e obter uma compreensão mais profunda das variações intrínsecas às espécies. 2.3. Citogenética molecular em Cervidae As técnicas citogenéticas clássicas são amplamente usadas para fins comparativos entre cariótipos e diagnósticos de polimorfismos cromossômicos (STEINER et al., 2015). Especificamente, o uso de colorações como a Giemsa, e os bandamentos G, C e Ag-NOR são práticas comuns para a citogenética de cervídeos, auxiliando a taxonomia e identificação de espécies (ABRIL; DUARTE, 2008; ABRIL et al., 2010; FIORILLO et al., 2013). No entanto, a comparação de polimorfismos intraespecíficos pode ser complexa, pois discretas mudanças nos padrões de bandas, podem corresponder a informações evolutivas importantes (TOMAZELLA; ABRIL; DUARTE, 2017). Com o avanço das tecnologias, houve um refinamento e aumento da precisão das metodologias empregadas. Surgiram as abordagens de citogenética molecular, que se mostraram mais acuradas na identificação de rearranjos cromossômicos (LIEHR, 2017). Entre essas abordagens, destaca-se a técnica de hibridização in situ fluorescente (FISH, do termo em inglês Fluorescence in situ hybridization) (LIEHR, 2017). A FISH é uma técnica sensível na detecção de homologias cromossômicas em que sua metodologia envolve a hibridização de sequências complementares, ligadas a fluorocromos (LIEHR, 2017). Nesse caso, os fluorocromos servem como sinalizadores, emitindo fluorescência quando o DNA se anela à região alvo (LIEHR, 2017). A utilização da FISH representou um marco significativo nos estudos citogenéticos, possibilitando novas abordagens para o mapeamento cromossômico de espécies selvagens (YANG et al., 1995). Uma técnica amplamente utilizada é a pintura cromossômica. Nesta modalidade, a sequência de um cromossomo inteiro é utilizada a fim de detectar sua sequência complementar em uma metáfase (SVARTMAN et al., 2004; KULEMZINA et al., 2011). Essa técnica já foi amplamente utilizada em cervídeos, com o uso de sequências cromossômicas de humanos, dromedários, bovinos, entre outros (KULEMZINA et al., 2009; DEMENTYEVA et al., 2010; RUBES 11 et al., 2012; FROHLICH et al., 2017). Contudo, a técnica de pintura cromossômica possui limitantes, uma delas é a dificuldade de detecção de rearranjos intracromossômicos, como inversões e shifts centroméricos que possuem papel importante no processo de especiação dos mamíferos (FERGUSON-SMITH; TRIFONOV, 2007; DOBIGNY; BRITTON-DAVIDIAN; ROBINSON, 2015). Portanto, uma maneira de explorar os rearranjos intracromossômicos é aplicando sondas derivadas de DNA clonado, como os cromossomos artificiais de bactérias (BAC’s, Bacterial Artificial Chromosome). Estas sondas se hibridizam pontualmente em suas sequências complementares e permitem a identificação das reorganizações mais discretas do genoma (LIEHR, 2017). O uso das aplicações da FISH com sondas derivadas de BAC tem tido protagonismo na citotaxonomia em que o mapeamento permite a identificação de rearranjos importantes que ajudam a corroborar a revalidação de espécies crípticas (Figura 3) (BERNEGOSSI et al., 2022a, 2022b; GALINDO et al., 2021a, 2021b; MORALES-DONOSO et al., 2023; PERES et al., 2021) Como referência, existem bibliotecas genômicas de diferentes espécies disponíveis em bancos de dados como no NCBI (National Center for Biotechnology Information, ou Centro Nacional de Informação Biotecnológica em português). Essas bibliotecas possuem sequências precisas e úteis para a produção de DNA clonado. Uma das bibliotecas comumente utilizada para a FISH em cervídeos é da espécie doméstica Bos taurus. De forma ampla, as sondas de bovinos têm sido utilizadas para descrição de rearranjos e mapeamentos cromossômicos, com resultados eficientes na detecção de homologias (BERNEGOSSI et al., 2022b; GALINDO et al., 2021a, 2021b; PROSKURYAKOVA et al., 2022, 2023) Figura 3: Exemplo de aplicações das diferentes técnicas de FISH em cervídeos neotropicais. A: FISH utilizando a pintura cromossômica no estudo comparativo entre as espécies Mazama rufa (MRU) e M. americana (MAM). B: Técnica de BAC derivadas de Bos taurus, no mapeamento cariotípico da espécie S. gouazoubira. Fonte: Adaptados de A: Peres et al., 2021. B: Bernegossi et al., 2022. file:///C:/Users/Diri/Desktop/Correção%20-%20Dissertação/DissertaçãoValdir_v3%20-%20ultima%20versão.docx%23_Toc145755169 file:///C:/Users/Diri/Desktop/Correção%20-%20Dissertação/DissertaçãoValdir_v3%20-%20ultima%20versão.docx%23_Toc145755169 file:///C:/Users/Diri/Desktop/Correção%20-%20Dissertação/DissertaçãoValdir_v3%20-%20ultima%20versão.docx%23_Toc145755169 file:///C:/Users/Diri/Desktop/Correção%20-%20Dissertação/DissertaçãoValdir_v3%20-%20ultima%20versão.docx%23_Toc145755169 12 2.4. A espécie Mazama nana A espécie Mazama nana, conhecido também como veado-da-mão-curta, cambuta ou bororó, é o menor cervídeo brasileiro (Figura 4) com cerca de 45 cm na altura da cernelha e 15kg em um indivíduo adulto (ABRIL et al., 2010a). Sua distribuição abrange a região sul do Brasil, nordeste da Argentina e sudeste do Paraguai (DUARTE et al., 2015). Essa é uma das espécies de cervídeos nacionais que se encontra sob o status “vulnerável” pela lista vermelha da IUCN (DUARTE et al., 2015). Diante dos diversos fatores que coloca este táxon como vulnerável, podem ser destacados a perda de hábitat, a caça ilegal, ataque por cães errantes e enfermidades virais (DUARTE et al., 2015; BALDINI et al., 2018; DE OLIVEIRA; DO COUTO; DUARTE, 2019). Outro fator que deve ser levado em consideração para a conservação, mas que permanece pouco explorado é o fato dessa espécie apresentar um elevado número de polimorfismos cromossômicos intraespecíficos (ABRIL; DUARTE, 2008). Os primeiros polimorfismos cariotípicos conhecidos para Mazama nana foram descritos por Duarte (1992). Nesse estudo, a análise de três animais da região de Foz do Iguaçu, Paraná, Brasil, permitiu a identificação de variações de 2n = 36 a 39 e NF = 58, além da presença variável de 4 a 5 cromossomos supranumerários (DUARTE, 1992). Após uma amostragem maior a partir de 28 indivíduos de cativeiro, o intervalo mostrou-se ainda maior, variando de 2n = 36 a 40, NF = 56 a 60 e de 1 a 7 cromossomos B (DUARTE, 1998). A principal diferença apontada foram os cromossomos acrocêntricos grandes, que variou em número de 1 a 5 nos indivíduos analisados (DUARTE, 1998). A descrição mais detalhada até o momento utilizando os bandamentos cromossômicos para comparação cariotípica foi realizada por Abril e Duarte (2008), através da análise de 24 indivíduos de M. nana provenientes de distintos cativeiros, dos quais 13 eram machos e 11 eram fêmeas. Nesse estudo, os autores observaram variações de 2n = 36 a 39, NF = 58 e 1-7 B’s, cujos polimorfismos foram classificados em sete variantes diferentes: a variante V01, com 2n = 36, a mais comum, presente em sete dos 24 indivíduos (Figura 5 a-d), as variantes V03 (Figura 6a) e V05 (Figura 6c) , encontradas em quatro indivíduos cada, a variante V07 (Figura 6d) encontrada em três indivíduos, a V06 em dois indivíduos, enquanto as variantes V02 e V04 (Figura 13 6b) estavam presentes em apenas um indivíduo cada (ABRIL; DUARTE, 2008). O estudo descreve a presença de rearranjos cromossômicos em heterozigose envolvendo os pares 1, 3, 7, 8 e 9. A variante V04 foi a única apresentar dois pares cromossômicos heterozigotos, enquanto outras variantes com heterozigoses apresentaram apenas um par heterozigoto (ABRIL; DUARTE, 2008). Também, o par 7 em heterozigose descrito para a variante V03, se apresentou como dois pares acrocêntricos não fusionados em três variantes, e em outras três foi observada como cromossomos metacêntricos em homozigose (ABRIL; DUARTE, 2008). A descrição das variantes cromossômicas em M. nana permitiu a discussão sobre uma potencial vantagem adaptativa que os polimorfismos cromossômicos possam proporcionar frente às mudanças ambientais recorrentes (ABRIL; DUARTE, 2008). Assim, é necessário aumentar a amostragem a fim de aprofundar o entendimento sobre a dinâmica dos polimorfismos nessa espécie e as consequências para a conservação das suas populações. Os estudos supracitados foram conduzidos a partir de amostras de cativeiro. A reprodução não-aleatória como consequência do cativeiro pode ter influenciado a frequência de polimorfismo observados (MARTIN-WINTLE et al., 2017). Isso ocorre uma vez que o pareamento de indivíduos cativos em uma população pequena Figura 4: Foto lateral do corpo de um indivíduo adulto da espécie Mazama nana em cativeiro no Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos. Fonte: Acervo do NUPECCE. 14 superestima os polimorfismos cariotípicos dos parentais nas gerações seguintes (STEINER et al., 2015). Sendo assim, a diversidade cariotípica de populações naturais pode ser diferente daquela observada em cativeiro (STEINER et al., 2015). Isso reforça que a origem conhecida de indivíduos oriundos da natureza é um fator importante, para discussões em relação ao endemismo de variantes cromossômicas ao longo da distribuição da espécie. Figura 5: Cariótipos de um indivíduo da espécie Mazama nana V01 (2n = 36), a partir de diferentes bandamentos e colorações. A: coloração de Giemsa. B: Bandamento C. (bandas escuras correspondentes às regiões de heterocromatina constitutiva) C: Bandamento Ag-NOR, (regiões organizadoras de nucléolo dos pares 2 e 6). D: Bandamento G (padrão de bandas claras e escuras de todos os cromossomos do lote). Fonte: Abril e Duarte, 2008. 15 Entretanto, a ocorrência de registros de M. nana em vida livre é limitada devido ao comportamento elusivo, noturno e solitário da espécie, além de sua presença em áreas de difícil acesso (OLIVEIRA; COUTO; DUARTE, 2019). No Brasil, a distribuição da espécie por amostragem não-invasiva, obteve a confirmação de M. nana em sete áreas protegidas (parques ecológicos e reservas ambientais), pertencentes aos estados do Paraná (três), Santa Catarina (três), e Rio Grande do Sul (uma) (Figura 7). Como analisado, a espécie esteve presente nas fitofisionomias ombrófila mista e densa, e, floresta estacional decídua e semidecídua, da Mata Atlântica. A modelagem do mesmo estudo, indicou estas áreas como prioritárias para favorecer a proteção da espécie (OLIVEIRA; COUTO; DUARTE, 2019). Contudo, é importante notar que essa metodologia não forneceu informações sobre possíveis isolamentos geográficos ou fatores ecológicos que possam ser relacionados aos padrões citogenéticos observados. Figura 6: Bandamento G das variantes cariotípicas de Mazama nana a partir da técnica do bandamento G. A: cariótipo de V03 (2n = 37 NF = 58. Par de cromossomos sexuais (XX) e heterozigose do par 7. B: V04 (2n = 38 NF = 58; par sexual (XY) e pares 8 e 9 em heterozigose). C: V05 (2n = 38 NF = 58; cromossomos sexuais (XX) e elementos acrocêntricos não fusionados do par 7). D: V07 (2n = 39, NF = 58, par de cromossomos sexuais (XY), fusão cêntrica do par 3 em heterozigose e elementos acrocêntricos não fusionados do par 7. Fonte: Abril e Duarte, 2008. 16 Em resumo, a espécie Mazama nana apresenta importantes questões ainda não respondidas relacionadas aos polimorfismos cromossômicos descritos. Sendo assim, a análise citogenética de populações naturais e a identificação dos cromossomos envolvidos em variações cromossômicas nessa espécie são de grande relevância, uma vez que pode haver implicações reprodutivas (GALINDO et al., 2021a). Adicionalmente, é de grande valor avaliar se existe padrões geográficos para as mudanças cromossômicas ao longo da distribuição da espécie. Dada a importância anteriormente discutida, este estudo busca caracterizar por técnicas de citogenética molecular os indivíduos com origem conhecida na natureza da espécie M. nana. Essa caracterização é o ponto de partida para o entendimento do polimorfismo cromossômico em populações naturais da espécie, consequentemente, fornecendo informações importantes para planos de conservação e manejo dessa espécie emblemática. A utilização da FISH com sondas BAC para a detecção dos cromossomos envolvidos nos polimorfismos cariotípicos é um Figura 7: Modelagem da distribuição da espécie Mazama nana. Retirado de: Oliveira, Couto e Duarte, 2019. 17 diferencial para M. nana, permitindo a confirmação dos rearranjos ocorridos nessa espécie e sugerindo seu potencial efeito como barreira reprodutiva. 3. OBJETIVOS O presente estudo buscou caracterizar os polimorfismos cromossômicos encontrados na espécie M. nana utilizando amostras de animais mantidos em cativeiro com origem conhecida, mantidos no banco criogênico do Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos – FCAV/UNESP. Para isso, foi utilizada a técnica de FISH com o uso de sondas BAC derivadas de B. taurus. Sendo assim, os objetivos específicos propostos foram: • Analisar os rearranjos cromossômicos encontrados na espécie M. nana pela técnica de FISH; • Descrever quais cromossomos estão envolvidos nos polimorfismos intraespecíficos; • Discutir quais são as possíveis implicações que os polimorfismos podem causar para a conservação dessa espécie. 18 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Amostras Foram utilizadas amostras de pele da espécie M. nana armazenadas em nitrogênio líquido (-196ºC) no banco criogênico do Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos – NUPECCE, UNESP - FCAV, Campus Jaboticabal, São Paulo. Essas amostras foram obtidas previamente a partir de animais ingressantes no plantel devido a apreensões ou para cuidados veterinários, cuja origem na vida selvagem era conhecida. As amostras são provenientes dos estados brasileiros do Paraná (5), Santa Catarina (1), Rio Grande do Sul (3) e, Canendeyú (2) no Paraguai, conforme indicado na Figura 8. Tabela 1: Identificação, sexo e origem das amostras de Mazama nana utilizadas para a descrição e análise cariotípica. Tese Sexo Origem 105 F Colonia Itambey - Canendeyú - Paraguai 107 M Corpus Christi - Canendeyú - Paraguai 185 M Céu Azul – Paraná - Brasil 186 F Cascavel - Paraná - Brasil 187 M Cascavel - Paraná - Brasil 188 F Humaitá - Rio Grande do Sul - Brasil 189 F Humaitá - Rio Grande do Sul - Brasil 221 M Cascavel - Paraná - Brasil 304 M Guaporé - Rio Grande do Sul - Brasil 353 F Pitanga - Paraná - Brasil 443 F Concórdia – Santa Catarina - Brasil 19 4.2. Preparo das lâminas 4.2.1. Cultivo de Pele As amostras de pele foram descongeladas em banho-maria (37°C) até que o meio com as células congeladas voltasse ao seu estado líquido. Em fluxo laminar, o fragmento foi lavado duas vezes em 2,0 mL de PBS (10g NaCl/L + 0,25g KCl/L + 1,44g Na2HPO4.12H2O/L + 0,25g KH2PO4/L) em placas de Petri descartáveis. O material foi divulsionado com lâmina de bisturi em placa de Petri contendo 2,0 mL de meio de cultivo DMEM (Meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbeco Cultilab™/L + 3,7 g de bicarbonato/L + 1,0 mL de sulfato de gentamicina/L + 2,0 mL de anfotericina B/L, pH 6,8-7,1) e 1,0 de soro fetal bovino (Cultilab ®). Os diversos fragmentos foram transferidos para frascos de cultivo T25 (TPPTM) com 2,0 mL de meio DMEM e 500 µL de soro fetal bovino (SFB) Cultilab TM. Os frascos foram mantidos em estufa a 5% CO2 e 37°C por 48 horas sem qualquer movimento (Verma e Babu, 1995). A cultura foi monitorada diariamente e o meio trocado a cada 48 horas. Após a aderência dos fragmentos de pele, foi mantida a quantidade de 2,5 mL de DMEM com 20% de SFB até a formação de uma monocamada de células no fundo do frasco. Figura 8: Mapa indicando as localidades amostradas, sob a distribuição atual da espécie Mazama nana, segundo a IUCN. Em vermelho estão evidenciados os limites dos estados brasileiros. 20 4.2.2. Repique Após o crescimento adequado da monocamada de células, foi realizado o repique dos cultivos. O método consistiu em desprezar o meio presente nas garrafas, e lavá-las 3 vezes com 2,0 mL de PBS. Para soltura das células aderidas a monocamada, as garrafas foram tripsinizadas com 1,0 mL de tripsina (8,0g NaCl/L + 0,4g KCl/L + 0,58 g NaHCO3/L + 1 g glucose/L + 0,005 g vermelho fenol/L + 0,2 g EDTA/L + 0,5 g tripsina/L, pH 7,2-7,4). A cultura foi monitorada em microscópio invertido para verificar se as células soltaram do fundo do frasco e então, imediatamente, a tripsina foi inativada com 200 μL de SFB e 800 μL de DMEM. O material foi dividido da garrafa mãe entre novos frascos, as quais foram monitoradas e tratadas como descrito anteriormente (subitem 4.2.1) até obter um número suficiente de cultivos secundários. 4.2.3. Colheita de células Um dia antes da colheita, foi realizada a pré-tripsinização das garrafas. Após 24 horas da pré-tripsinização e 45 minutos antes da colheita, foram adicionados 60 μL de colchicina (0,016%) CultilabTM em cada frasco, incubados a 37°C e 5% de CO2. Depois, foi realizada a tripsinização para que as células se desprendam dos frascos. O conteúdo dos frascos foi transferido para tubos cônicos e então, centrifugados por cinco minutos a 1600 rpm e os sobrenadantes descartados. Após o descarte dos sobrenadantes, os sedimentos foram ressuspendidos em 8 mL de solução hipotônica KCl 0,067M e incubados no banho-maria a 37°C por vinte minutos. Posteriormente, a pré-fixação foi realizada adicionando 3 gotas de solução fixadora (ácido acético e metanol, proporção 3:1) e o material foi centrifugado novamente. Os sedimentos foram ressuspendidos em três ocasiões (6,0, 4,0 e 3,0 mL) com solução fixadora. As preparações cromossômicas obtidas a partir dos cultivos de fibroblastos foram gotejadas em lâminas para posterior uso na técnica de hibridização in situ fluorescente. 21 4.3. Obtenção e Preparo das sondas 4.3.1. Clones de BAC Os clones utilizados no preparo de sondas foram adquiridos da biblioteca bovina CHORI-240 com base no NCBI ARS-UCD1.2 Assembly data e obtidos do BACPAC Genomics, Emeryville, CA, USA. As 53 sondas utilizadas foram escolhidas com base no mapeamento de Subulo gouazoubira utilizando 109 clones de BAC da espécie Bos taurus (Bernegossi et al., 2022b) e a partir do prévio mapeamento de um espécime de M. nana utilizando a mesma metodologia (dados não publicados). 4.3.2. Amplificação e Marcação das sondas Para a extração do DNA, foi utilizado o protocolo adaptado do método incluído no Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification Systems. A marcação dos clones BAC, para produção de sondas, foi realizada com Green-DdUTP (Abbott, IL, USA), biotina 16-dUTP e digoxigenina-11-dUTP (Roche, Mannheim, Alemanha) utilizando protocolo incluído no kit BioPrime® Array CGH Genomic Labeling System (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). 4.4. Hibridização in situ fluorescente As lâminas com preparações cromossômicas foram incubadas em solução de 2xSSC a 70 °C em banho-maria por 30 minutos e, após esse período, foram deixadas para esfriar em temperatura ambiente por 20 minutos. Subsequentemente, foram lavadas em 0,1xSSC por 1 minuto e desnaturadas em solução de 0,07M NaOH por 50 segundos. Após desnaturação, as lâminas foram incubadas em solução 0,1xSSC e 2xSSC, a 4ºC por 1 minuto cada e, finalmente, em série alcoólica (70%, 90%, 100%) em temperatura ambiente, 1 minuto cada novamente. Concomitantemente, foi preparado o mix de hibridização conforme apresentado na tabela 2. Para isso, foram utilizados DNA Cot bovino (HyblocTM Competitor DNA, Applied Genetics Laboratories Inc. Melbourne, USA) e DNA de esperma de salmão (UltrapureTM Salmon Sperm DNA Solution, Invitrogen®) como DNA supressores a fim de se inibir a hibridização de sequências repetitivas. 22 Tabela 2: Mistura de hibridização para volume final de 10 μl. A mistura de hibridização foi aquecida a 92 °C por 10 minutos e incubada a 37ºC por 30 minutos. Posteriormente, foi adicionada às lâminas que foram cobertas por lamínula e incubadas em câmara úmida a 37 °C por 40 horas. Para a lavagem pós-hibridização, as lâminas foram incubadas em solução 2xSSC por 2 minutos a temperatura ambiente, depois colocadas em solução de 0,7xSSC por 2 minutos a 70°C e novamente em 2xSSC por 2 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, foram incubadas em câmara úmida a 37ºC com 100 μL de solução bloqueio (0,1g de solução bloqueio Sigma- Aldrich®, dissolvido em 9 ml H2O + 1 ml solução TN) por 10 minutos. A detecção foi realizada com Streptavidine-FITC (Invitrogen/Molecular Probes) Camarillo, CA, USA), para as sondas marcadas com biotina-16-dUT, e com antidigoxigenina-rodamina (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) para as sondas marcadas com digoxigenina-11-dUTP. Para isso, 0,25 μl de cada anticorpo diluído em 100 μl de solução bloqueio foram adicionados a cada lâmina, as quais foram incubadas em câmara úmida por 45 minutos. Após a detecção, as lâminas foram lavadas em solução 1xTNT três vezes por 5 minutos cada. Posteriormente, os cromossomos foram contrastados com DAPI (VOZDOVA et al., 2019). 4.5. Análise das lâminas As preparações submetidas à FISH foram analisadas na microscopia de fluorescência. Todas as preparações cromossômicas foram fotografadas com uma câmera Zeiss AxioCam MRm acoplada ao microscópio Olympus BX60 (objetiva de 100x), com auxílio do programa Axio Vision Release 4.8.2. As imagens foram editadas com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS6 Portable. A Tabela 3, resume todas as sondas testadas para a caracterização dos rearranjos cromossômicos em M. nana. Para cada conjunto de sondas hibridizada com sucesso, 10 metáfases foram fotografadas. Reagente Volume Master Mix* (*5ml formamida + 1g Sulfato de dextrano + 1 ml 20xSSC) 7 μl DNA Cot bovino 1 μl DNA de esperma de Salmão 0.6 μl Sonda 0,7 μl -1,4 μl por sonda 23 Tabela 3: Sondas BAC’s utilizadas para a descrição dos polimorfismos. Na primeira coluna são mostrados os cromossomos de Bos taurus (BTA), seguindo pela região sinalizada; identificação do Clone BAC e posição correspondente na biblioteca genômica CHORI-240. Cada linha corresponde ao cromossomo bovino da primeira coluna e cada região corresponde a uma sonda diferente (Centromérica, Medial, Distal ou Telomérica). 24 5. RESULTADOS A hibridização in situ fluorescente nas metáfases de 11 indivíduos de M. nana provenientes de vida livre revelou a existência de oito variantes cariotípicas apresentadas na Figura 9 (V01 a V08) e na Tabela 4. Os números cromossômicos variaram de 36 a 39 e o número fundamental foi constante e igual a 58. Os cromossomos X e Y foram submetacêntricos, sendo o X similar ao tamanho de um autossomo intermediário, enquanto o Y é o menor do lote. As diferenças entre as variantes são descritas em detalhe nos itens subsequentes. Figura 9: Cariótipos representativos de cada variante da espécie Mazama nana, em DAPI invertida. V01 (2n = 38 e NF = 58). V02 (2n=36 e NF = 58) fusão cêntrica (12;17) em homozigose. V03 (2n=37 e NF = 58), fusão cêntrica (12;17) em heterozigose. V04 (2n=37 e NF = 58), fusão cêntrica do par 1 em heterozigose e fusão cêntrica 12;17 em homozigose. V05 – 2n=38, par 1 e fusão cêntrica (12;17) em heterozigoses.V06 (2n=39 e NF = 58), fusão cêntrica do par 3 em heterozigose. V07 – 2n=37, fusão cêntrica do par 3 em heterozigose e fusão cêntrica (12;17) em homozigose. V08 (2n=39 e NF = 58), fusão cêntrica do par 1 em heterozigose. 25 Tabela 4: Identificação, número diplóide e número de cromossomos B's em cada amostra de Mazama nana. Identificação 2n Variante Cariotípica B's Fig. 9 T105 38 V01 0 a 4 A T107 38 V01 0 a 5 A T443 38 V01 0 a 4 A T187 36 V02 0 a 3 B T221 36 V02 0 a 2 B T189 37 V03 0 a 4 C T185 37 V04 0 a 3 D T188 38 V05 0 a 3 E T304 39 V06 0 a 3 F T186 37 V07 0 a 4 G T353 39 V08 0 a 2 H 5.1. Variantes cariotípicas de Mazama nana Variante 01 A V01 foi observada em três indivíduos (T105 ♀, T107 ♂ e T443♀) sendo representado na Figura 9-V01. A V01 correspondeu a um cariótipo 2n=38 e NF=58, sendo nove pares de autossomos de dois braços (metacêntricos e submetacêntricos), nove pares de um braço (acrocêntricos), e um par de cromossomos sexuais (XX ou XY). A contagem de cromossomos B por metáfase, revelou uma variação de 0 a 4 para os indivíduos T105 e T443, e de 0 a 5 para T107. Por ser o cariótipo mais frequente nos indivíduos, esse cariótipo foi utilizado como padrão para comparação com as demais variantes. A Figura 10 apresenta os resultados da hibridização por FISH dos pares cromossômicos 1, 3, 12 e 17 (Figuras A-1, B-1, C-1, respectivamente) da variante atual, uma vez que esses pares foram identificados como polimórficos durante a análise comparativa nas variantes V02 a V07. Variante 02 A V02 foi observada em duas amostras correspondendo aos indivíduos T187 e T221. A variante 02 (V02) apresentou 2n=36 e NF=58, dos quais dez pares de autossomos possuíram dois braços, sete pares foram acrocêntricos (Figura 9-V02) e um par de cromossomos sexuais (XY). Os indivíduos portadores da V02 apresentaram a variação de 0-3 cromossomos B para o indivíduo T187 e 0-2 para o T221, por metáfase. Essa variante possui os pares todos os pares em homozigose (Figura 10.A- I e B-I), incluindo a translocação Robertsoniana (Rb) dos cromossomos 12 e 17 em homozigose, exemplificado na Figura10 C-II, os pares 12 e 17 fusionados. 26 Figura 10: Resultados da análise de hibridização in situ fluorescente de diferentes amostras de Mazama nana. A. I - Par cromossômico 1 em homozigose, mostrado pela sonda 214M18 (braço p) e 121P7 (braço q) (T105; T107; T186; T187; T189; T221; T304; T443). II - Par cromossômico 1 em heterozigose, a sonda 173B8 (verde) marca o braço p de um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico, a sonda 79A23 (rosa) marca o braço q e um acrocêntrico (T185; T188; T353). B. I - Par 3 homozigoto, a sonda 437C7 (verde) no braço p e a sonda 42D15 (rosa) no braço q (T105; T107; T185; T187; T188; T189; T221; T353; T443). II - Par 3 em heterozigose a sonda 437C7 (verde) marca o braço p de um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico, a sonda 42D15 (rosa) marca o braço q do mesmo cromossomo de dois braços e um acrocêntrico (T186; T304). C. I - Pares 12 e 17 em homozigose não fusionados, par 12 marcado pela sonda 106N15 (verde) e par 17 pela sonda 223P21 (rosa) (T105; T107; T304; T353 T443). II - Par 12 e 17 fusionados em homozigose, par 12 pela sonda 106N15 (verde) e par 17 pela 223P21 (rosa) (T187; T185; T186; T221). III - Pares 12 e 17 fusionados em heterozigose, par 12 pela sonda 106N15 (verde) marca o braço q de um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico e par 17 pela 223P21 (rosa) que marca o braço p do cromossomo de dois braços e um acrocêntrico (T188; T189). A linha amarela traçada corresponde a posição do centrômero. Sondas BAC derivadas de Bos taurus (BTA) 27 Variante 03 A V03 foi identificada apenas em uma amostra (T189) e possuiu 2n=37 e NF=58, contendo 19 autossomos de dois braços, 16 acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (XX), (Figura 9-V03). Foi identificada a Rb (12;17) em heterozigose, resultando em um cromossomo submetacêntrico, e os braços homólogos em acrocêntricos. A figura 10 A-I e B-I mostra respectivamente os pares 1 e 3 em homozigose e a fusão em heterozigose dos pares 12 e 17, na figura 10 C-III. Também foi observada a presença de 0 a 4 cromossomos B por metáfase do indivíduo T189, único espécime a apresentar a V03. Variante 04 Apenas o indivíduo T185 apresentou essa variante. A V04 apresentou 2n=37 e NF=58, sendo 19 cromossomos autossomos de dois braços, 16 acrocêntricos e um par de cromossomos sexuais (XY) (FIGURA 9-V04). Essa variante possuiu uma fusão cêntrica em heterozigose correspondendo ao par 1 (Figura 10 A-II). Adicionalmente, foi observada a fusão do par 3 em homozigose (Figura 10 B-I) e a Rb (12;17) também em homozigose (Figura 10 CII). A V04 apresentou a variação de 0 a 4 supranumerários por metáfase. Variante 05 Esta é a única variante que apresentou duas fusões em heterozigose, foi observada apenas na fêmea T188. A variante 05 (V05), de 2n=38 e NF=58, apresentou 18 cromossomos de dois braços e 18 acrocêntricos autossômicos, além do par sexual (XX) (FIGURA 9-V05). Os cromossomos B variaram de 0 a 5 nas metáfases analisadas. Essa variante possui duas fusões cêntricas em heterozigose. A primeira correspondeu ao par 1 de V01 (Figura 10.A-II), e a segunda envolveu os cromossomos 12 e 17 (Figura 10.C-III). 28 Variante 06 Apenas o indivíduo T304 apresentou esse cariótipo. A V06 possui 2n=39 e NF=58, sendo 17 cromossomos autossomos de dois braços, 20 autossomos acrocêntricos, e um par de cromossomos sexuais (XY) (FIGURA 9-V06). Houve também a variação de 0 a 3 cromossomos B nas metáfases do indivíduo. Essa variante apresentou-se homozigota para a fusão do par 1 (Figura 10 A-I), e heterozigota para a fusão do par 3 de V01 (Figura 10.B-II), e os pares 12 e 17 não fusionados (Figura 10 C-I). Variante 07 A V07 esteve presente apenas na amostra do indivíduo T186. A V07, de 2n=37 e NF=58, apresentou 19 cromossomos de dois braços, 16 acrocêntricos autossômicos, além de um par de cromossomos sexuais (XX) (FIGURA 9-V07). Foram observados de 0 a 4 cromossomos supranumerários nas metáfases que correspondiam a essa variante. A V07 foi homozigota para a fusão do par 1 (Figura 10 A-I), e heterozigota para uma fusão do par 3 de V01 (Figura 10.B-II), além da fusão cêntrica entre os pares 12 e 17 em homozigose (Figura 10.C-II). Variante 08 A V08 apresentada pelo pela fêmea T353, possuiu 2n=39 e NF=58 sendo seu cariótipo formado por 17 cromossomos autossômicos de dois braços, 20 acrocêntricos, e um par de cromossomos sexuais (XX) (Figura 8-V08). A variação de 0 a 2 cromossomos B foram observadas nas metáfases analisadas. Apesar do 2n e NF similares às variantes anteriormente descritas, V08 divergiu das demais, por diversos rearranjos com organizações diferentes. A figura 11 resume os resultados de FISH das sondas que destacaram os rearranjos diferenciais entre as duas variantes. Em suma, em comparação ao cariótipo padrão (V01), cinco pares de cromossomos diferem quanto a sua conformação. Na V08, o par cromossômico 1 de V01 foi heterozigoto para a fusão cêntrica (Figura 11.A). Por sua vez, o braço mais longo (q) do cromossomo 2 correspondeu a região 4q do V01, enquanto o braço mais curto (p) correspondeu ao 6q, fusionados pelo centrômero em homozigose (FIGURA 11.B). Outra importante divergência dessa variante foi a presença de fusões em tandem entre os polimorfismos observados. O braço p e a região proximal do braço q, do par 5 foi correspondente a mesma região do par 2 na V01, adicionalmente, a parte 29 2q distal do V01 foi homólogo ao par 10 dessa variante (FIGURA 11.B). Na DAPI invertida da V08 também não foi possível identificar banda heterocromática intersticial no par cromossômico 5, que foi comum ao par 2 das demais variantes. A parte distal do braço 5q da V08 correspondeu ao braço 4p da V01 (Figura 11.D). Além disso, o par 6 foi formado por uma fusão cêntrica correspondente ao 6p e ao cromossomo 12 da V01 (Figura 11.E). Figura 11: Figura comparativa das diferenças cromossômicas apresentadas pela V01 e V08 de Mazama nana sob análise de hibridização in situ fluorescente, onde as linhas laranja e azul claro à esquerda de cada cromossomo indicam a região homóloga entre V01 e V08. A. Par 1 da V01 fusionado em homozigose comparado ao par 1 em heterozigose da V08 em que a sonda 173B8 (verde) marca o braço p de um cromossomo de dois braços e um acrocêntrico, e a sonda 79A23 (rosa) marca o braço q do cromossomo de dois braços e um acrocêntrico. B. Par 2 da V01 em comparação ao par 5 da V08, o braço p e a região proximal do braço q do par 2 da V01 (sonda 59F16, em rosa) se manteve na mesma posição no par 5 da V08 (sonda 411D6, em verde), enquanto a porção distal do par 2 da V01 (sonda 283F4, em verde), correspondeu ao par 10 da V08 (sonda 124O11, em rosa). C. O braço q do par cromossômico 4 da V01 (sonda 47G11, em rosa) correspondeu ao braço q do par 2 da V08 (sonda 205E12, em verde), enquanto o braço p do cromossomo 4 da V01 (sonda 463C19, em verde) correspondeu a porção distal do braço q do par 5 da V08 (sonda 91N11, em rosa). D. O braço p do cromossomo 6 da V01(sonda 121K12, em verde) correspondeu ao braço p do cromossomo 6 da V08 (sonda 399A11, verde), por sua vez o braço q do cromossomo 6 da V01 (sonda 215P21, em rosa), correspondeu ao braço p do cromossomo 2 da V08 (sonda 215P21, em rosa). E. Par cromossômico 12 da V01 em comparação ao braço cromossômico 6q - 30 da V08, as quais foram homólogas (sonda 106N15, em verde). A linha amarela traçada corresponde a posição do centrômero. Sondas BAC derivadas de Bos taurus (BTA): p- proximal, c- centromérica, m- medial, d- distal e t- telomérica. Finalmente, os cromossomos do par 10 foram polimórficos com presença de uma pequena região cromossômica pericentromérica extra em um dos cromossomos, visível em todas as metáfases analisadas. . O esquema da Figura 12 evidencia em cores as diferenças cromossômicas apresentadas pela V01 e V08 (Figura 11 A-D), em que as ortologias são apresentadas na mesma coloração. 6. DISCUSSÃO Esse estudo apresenta a primeira descrição de polimorfismos cariotípicos da espécie Mazama nana por meio de uma abordagem de citogenética molecular, fornecendo uma visão mais detalhada da diversidade cariotípica dentro desta espécie. Os resultados revelaram uma série de constatações intrigantes relacionadas à variação cromossômica em M. nana. O cariótipo mais observado em nosso estudo foi correspondente ao 2n = 38 e NF = 58 (3 de 11 amostras), sendo estabelecido como padrão para a população observada. Entretanto, Abril e Duarte (2008), pela análise cariotípica de uma população cativa, descreveu um cariótipo de 2n = 36 e NF = 58 como o mais prevalente (8 em 24 indivíduos), e, portanto, padrão para a população cativa. Essa divergência pode estar associada ao efeito da seleção dos cruzamentos em cativeiro, Figura 12: O esquema apresenta: à esquerda a variante 01 e à direita a V08. As cores correspondem às homologias cromossômicas. A disposição dos cromossomos foi reestruturada para a V08. Mazama nana 31 e como consequência ter aumentado a prevalência de determinado cariótipo (MARTIN-WINTLE et al., 2017). Na população amostrada, os indivíduos exibiram uma variação de 0 a 5 cromossomos supranumerários. As variações ocorreram entre indivíduos e entre as metáfases analisadas como mostrado na Tabela 4. Como relatado anteriormente, os cromossomos supranumerários são variáveis em número e entre células de um mesmo indivíduo em M. nana (DUARTE, 1992; DUARTE ,1998; ABRIL; DUARTE, 2008). A origem dos cromossomos supranumerários é multi-cromossômica, são sequências duplicadas derivadas de cromossomos autossomos e não são hereditários, além disso, a presença dessas variações não causam efeito fenotípico na maioria das espécies analisadas (SILVA; YONENAGA-YASSUDA, 2004; AHMAD; MARTINS, 2019). No presente estudo, foram identificadas as variações estruturais dos pares autossômicos 1, 3, 12 e 17. Os pares 1 e 3 foram descritos em homozigose ou em heterozigose para a fusão cêntrica, corroborado por Abril e Duarte (2008). Já os pares 12 e 17 se apresentaram em três diferentes organizações: fusionados pelo centrômero em homozigose, heterozigoto para a fusão cêntrica Rb(12;17) e também como elementos não fusionados. O estudo de Abril e Duarte (2008) apresentou resultados semelhantes para o par 7. As heterozigoses descritas para os pares 2, 8 e 9 de M. nana por Abril e Duarte (2008), não foram observadas nos indivíduos amostrados no presente estudo. Contudo, é preciso considerar as finalidades das técnicas utilizadas para cada estudo e a frequente ocorrência de diferentes rearranjos estruturais nessa espécie, fatores que podem estar relacionados descrições de variantes cariotípicas divergentes (ABRIL; DUARTE, 2008). Dentre o total de amostras, a V05 foi a única a acumular duas heterozigoses, sendo a fusão cêntrica do par 3 e a Rb (12;17). De maneira similar é discutido por Abril e Duarte (2008), uma variante possuindo duas fusões cêntricas em heterozigose, porém neste caso, se tratava dos pares 8 e 9. Contudo, é discutido que entre a quantidade de variantes apresentadas, apenas uma possuir dois polimorfismos é indicativo da atuação da seleção contra o acúmulo de heterozigoses (ABRIL, 2005). Em uma análise teórica da influência da estrutura do cromossomo em relação a adaptação local e evolução, foi observado que as fusões cêntricas em homozigose, 32 possuem uma vantagem adaptativa sobre as formas não fusionadas ou fusionadas em heterozigoses (GUERRERO; KIRKPATRICK, 2014). A vantagem se deve ao efeito de seleção sobre os loci em um cromossomo de dois braços ser menor, em comparação a pressão seletiva sobre os mesmos loci em cromossomos acrocêntricos (GUERRERO; KIRKPATRICK, 2014). Embora o número de variantes do presente estudo, esteja próximo às encontradas por Abril e Duarte (2008), a hibridização de sondas BAC revelaram um cenário diferente. A citogenética clássica, associava que as alterações estruturais e numéricas variavam exclusivamente por translocações Robertsonianas, como ocorre na maioria das variantes (ABRIL, 2005). Contudo o par 5 da V08, apresentou uma fusão em tandem inédita, não compartilhada com qualquer outra variante. Adicionalmente, todas as demais variantes apresentaram uma banda escura forte intersticial no cromossomo 2 quando visualizado pela DAPI invertida, o que pode ser associada a presença de heterocromatina constitutiva. Essa banda não está presente na V08 (Figura 13). De acordo com Yang et al. (1997), a perda de blocos de heterocromatina sugere fusões mais antigas durante a evolução do cariótipo, enquanto bandas mais visíveis são indicativas de fusões mais recentes. Também, o par 10 da V08, homólogo a região distal do par 2 da V01, apresentou uma heteromorfia exclusiva ainda não relatada em outros estudos. Figura 13: Comparação entre o par cromossômico 2 da V01 e os pares 5 e 10 da V08. Ao lado direito de cada par se encontra seu esquema de homologias baseado na V01. A linha azul indica a posição da banda heterocromática no par 2 da V01 e no par 10 da V08. O par 5 da V08 não apresentou a marcação da banda heterocromática. A seta vermelha indica a região heteromórfica de um dos cromossomos do par 10 da V08. 33 Devido aos polimorfismos cariotípicos observados na espécie M. nana, elaboramos um cariótipo ancestral hipotético, com o propósito de recriar o caminho evolutivo e supor os possíveis rearranjos cromossômicos que ocorreram. Para a elaboração do cariótipo ancestral, nos baseamos na suposição de Neitzel (1987), de que o cariótipo menos fusionado seja o mais próximo do cariótipo ancestral. Assim, tivemos como resultado um cariótipo de 2n=48 e NF=60, correspondendo a cinco pares autossômicos de dois braços, 18 pares acrocêntricos, e os cromossomos sexuais também com dois braços (Figura 14A). A elaboração de um cariótipo ancestral também foi feita por Abril (2005), o qual foi obtido o 2n=48 e NF=54, nesta formação haviam quatro pares cromossômicos de dois braços e 19 cromossomos acrocêntricos. Desta forma, as duas suposições se divergiram apenas no número fundamental, enquanto o número total de cromossomos permaneceu o mesmo. Após a análise das variantes apresentadas, a inferência de um cariótipo hipotético ancestral para M. nana permitiu a elaboração de uma rede cariotípica, em que foram exemplificados os passos que geraram as oito variantes cariotípicas observadas no presente estudo (Figura 14B). A partir do ancestral comum, se divergiram dois ramos, que correspondem aos rearranjos cromossômicos observados em cada linhagem cariotípica. O primeiro ramo, possui um cariótipo hipotético intermediário, que abrange as heterozigoses dos pares 1 e 3. Deste modo, o primeiro ramo foi denominado linhagem 1, e abrange de V01 a V07, pois possuem os cromossomos 2, 4 e 6 formados pelas mesmas fusões a partir do cariótipo ancestral. Em contrapartida, a linhagem 2 é representada unicamente pela V08, que se distingue das demais variantes, devido às fusões cêntricas dos pares 2 e 6, e pela fusão em tandem do par 5. 34 A divergência de duas linhagens a partir de um cariótipo ancestral hipotético permite a averiguação de informações complexas visto que, a espécie M. nana não possui histórico de populações isoladas geograficamente, que poderiam ter fixado os rearranjos encontrados nas diferentes linhagens. A fixação de rearranjos cariotípicos tem sido descrito para espécies em populações geograficamente isoladas por longos períodos de tempo e que possuem ciclos geracionais curtos, como os roedores (MILLS; SMOUSE, 1994). Figura 14: A) Cariótipo Hipotético Ancestral de Mazama nana, elaborado a partir dos resultados obtidos pela hibridização de sondas BAC’s. B) Rede de evolução das variantes cariotípicas de Mazama nana, por meio de fusões cêntricas e em tandem a partir do cariótipo ancestral hipotético. Quadros da Figura B: 1) Representação esquemática dos pares 2, 4, 6 e 12, comuns da V01 a V07. 2) Esquema representativo dos pares 2, 5, 6 e 10, rearranjos cromossômicos observados exclusivamente na V08. 35 Adicionalmente, M. nana exibiu ampla dispersão geográfica das variantes cromossômicas. V01 ocorreu em três amostras, duas no Paraguai e uma em Concórdia – SC. Isso pode indicar que as populações ainda não tiveram a fixação de rearranjos únicos, permitindo que ocorram diferentes combinações cromossômicas ao longo da distribuição da espécie. Em contraste, temos a presença das V02 (2n = 36), V04 (2n = 37) e V07 (2n = 37) em uma só localidade, a região de Cascavel – PR, enquanto V03 (2n = 37) e V05 (2n = 38) ocorreram em Humaitá – RS. Essa forma de distribuição das variantes cariotípicas de M. nana, também se difere da distribuição de variantes cariotípicas de roedores dos gêneros Ctenomys e Nannospalax (ARSLAN et al., 2016; GAVA; FREITAS, 2002; RORATTO; FERNANDES; FREITAS, 2015). Neles há uma distribuição em forma de clina cromossômica, na qual os extremos da distribuição geográfica da espécie possuem distintos rearranjos cariotípicos, contudo, a região intermediaria, possui cariótipos correspondentes ao cruzamento das variantes presentes nos extremos (GAVA; FREITAS, 2002) Tanto pelos resultados obtidos no presente estudo como na bibliografia (ABRIL; DUARTE, 2008; ABRIL, 2005) indica-se uma variação cariotípica intrapopulacional em M. nana, com diferentes cariótipos em localidades geograficamente próximas, sugerindo simpatria das variantes cariotípicas. Os encontros ocasionais entre indivíduos carreando diferentes rearranjos e de distintas linhagens, pode ser uma realidade para essa espécie. Na literatura são encontrados relatos de consequências reprodutivas em indivíduos nascidos do cruzamento de pais que carreiam diferentes rearranjos cromossômicos (GALINDO et al., 2021a). No caso de M. americana, são relatadas drásticas reduções na habilidade reprodutiva dos híbridos gerados a partir de diferentes citótipos. Na análise de machos e fêmeas, puros e híbridos entre linhagens cromossômicas, foi observado que os híbridos possuíam subfertilidade ou infertilidade, enquanto todos os puros foram férteis (CURSINO et al., 2014; SALVIANO et al., 2017). Destaca-se que híbridos em que os pais carreavam duas fusões cêntricas de diferença, já houve o comprometimento da aptidão reprodutiva (SALVIANO et al., 2017). De maneira similar, nos cangurus-das-rochas do gênero Petrogale, também há relatos do comprometimento da reprodução de híbridos, gerados a partir de 36 espécies que possuem uma fusão de diferença (ELDRIDGE et al., 1988; POTTER; DEAKIN, 2018). A infertilidade foi observada tanto para uma fusão em tandem (P. mareeba x P. sharmani), quanto para uma fusão cêntrica (P. assimilis x P. inornata), de diferença entre os parentais (POTTER et al., 2022). Mesmo que no caso de M. nana não haja comprovação por meio do cruzamento das linhagens, o sucesso reprodutivo do híbrido entre os cariótipos mais divergentes é teoricamente comprometido (AYARZA et al., 2022; GALINDO et al., 2021b; POTTER et al., 2022). A literatura que descreve as consequências para M. americana e nas espécies do gênero Petrogale ilustra que a presença de duas ou mais fusões cêntricas ou uma em tandem entre os parentais é, em geral, uma barreira pós-zigótica eficaz (GALINDO et al., 2021a, 2021b; POTTER et al., 2022). Desse modo, a presença de duas fusões cêntricas e uma em tandem entre as linhagens 1 e 2 de M. nana, pode ser uma barreira pós-zigótica efetiva. A literatura científica documentou casos significativos de hibridação entre variantes cariotípicas que resultaram em híbridos inférteis (COUGHLAN; MATUTE, 2020; FORNEL et al., 2010; GALINDO et al., 2021a; ROMANENKO et al., 2019). A evidência de subfertilidade na reprodução entre diferentes linhagens de M. nana se encaixa no conceito biológico de espécie de Mayr (FRANKHAM et al., 2012). De acordo com esse conceito, mesmo que esses indivíduos sejam semelhantes morfologicamente, a redução na capacidade reprodutiva ou até mesmo a infertilidade, nos indivíduos resultado do cruzamento das linhagens mais divergentes, pode ser indícios de táxons diferentes (DOBIGNY; BRITTON-DAVIDIAN; ROBINSON, 2015). Assim, de maneira mais conservadora, Frankham et al. (2011) sugerem que as linhagens com padrões cromossômicos distintos devem ser tratadas como grupos separados, cada um com suas características genéticas específicas. Portanto, a V08, devido às suas diferenças cromossômicas, deve ser manejada de maneira separada da linhagem 1 de M. nana, visto que a hibridização entre essas variantes pode ser prejudicial à população (ABBOTT et al., 2013; TODESCO et al., 2016) Essas informações citogenéticas aliadas aos aspectos reprodutivos, desempenham um papel crucial na orientação das decisões de conservação e na compreensão das implicações futuras para essa espécie (ARSLAN; ZIMA, 2014; ADÃO et al., 2020; VOLOBOUEV et al., 2001). Uma revisão detalhada de M. nana incorporando análise dos aspectos reprodutivos e ecológicos relevantes são 37 necessários, a fim de verificar diferenças substanciais para a separação das duas linhagens cromossômicas em espécies diferentes. É indiscutível que as informações apresentadas no presente estudo são inéditas para a espécie M. nana. Contudo, essas informações devem orientar as decisões de manejo para a espécie. Sendo assim, a cariotipagem, é uma fonte valiosa de informações e que pode contribuir significativamente para a conservação e preservação da genética das linhagens cariotípicas de Mazama nana. Para esclarecer ainda mais essas dinâmicas complexas, é necessário complementar as informações citogenéticas com estudos de genética molecular e novas abordagens, a fim de compreender os mecanismos que envolvem essas divergências. 7. CONCLUSÕES Foi encontrada para a espécie Mazama nana uma ampla variação caritotípica, além das já descritas na literatura. O grau de divergência entre as variantes sugere possibilidade desde uma variação intrapopulacional até espécies completamente isoladas e bem estabelecidas. 38 8. REFERÊNCIAS ABBOTT, R. et al. Hybridization and speciation. Journal of Evolutionary Biology, v. 26, n. 2, p. 229–246, fev. 2013. ABRIL, V. V. 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