UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DE BOTUCATU CAMPUS DE BOTUCATU PREVALÊNCIA DA MUTAÇÃO E321G NO GENE MYH1, ASSOCIADA A MIOSITE IMUNO- MEDIADA, EM CAVALOS QUARTO DE MILHA NO BRASIL ANA LUÍSA HOLANDA DE ALBUQUERQUE Botucatu - SP Julho de 2020 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DE BOTUCATU CAMPUS DE BOTUCATU PREVALÊNCIA DA MUTAÇÃO E321G NO GENE MYH1, ASSOCIADA A MIOSITE IMUNO- MEDIADA, EM CAVALOS QUARTO DE MILHA NO BRASIL ANA LUÍSA HOLANDA DE ALBUQUERQUE Dissertação apresentada junto ao Progra- ma de Pós-graduação em Medicina Vete- rinária para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. José Paes de Oliveira Filho Co-orientador: Prof. Dr. Diego José Zanza- rini Delfiol Botucatu, SP Julho de 2020 Palavras-chave: Doenças genéticas; Doenças musculares; Miosite; Mutação; Quarto de milha. Albuquerque, Ana Luisa Holanda. Prevalência da mutação E321G no gene MYH1, associada a miosite imunomediada, em cavalos Quarto de Milha no Brasil / Ana Luisa Holanda Albuquerque. - Botucatu, 2020 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: José Paes de Oliveira Filho Coorientador: Diego José Zanzarini Delfiol Capes: 50501062 1. Cavalos - Raças. 2. Miosite. 3. Músculos - Doenças. 4. Genética. 5. Mutação (Biologia). DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. Nome do autor: Ana Luísa Holanda de Albuquerque Título: PREVALÊNCIA DA MUTAÇÃO E321G NO GENE MYH1, ASSOCIADA A MIOSITE IMUNOMEDIADA, EM CAVALOS QUARTO DE MILHA NO BRASIL COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. José Paes de Oliveira Filho Presidente e Membro Departamento de Clínica Veterinária FMVZ - UNESP - Botucatu, SP Prof. Dr. Alexandre Secorun Borges Membro Departamento de Clínica Veterinária FMVZ - UNESP - Botucatu, SP Dr. Cesar Erineudo Tavares de Araújo Membro Departamento de Medicina Veterinária Centro Universitário Leão Sampaio Data da defesa: 23 de julho de 2020. Dedico à minha família, Mariana, Ana Teresa e Valdery Albuquerque. AGRADECIMENTOS Aos meus pais, Valdery e Ana Teresa Albuquerque, pelo apoio incondi- cional, por me ensinarem a buscar meus sonhos sempre seguindo nossos valo- res, sendo inspiração e exemplos de pessoas, muito admirados por mim. À minha irmã Mariana, minha melhor amiga e meu grande amor. Às minhas amigas Ana Meguerditchian, Giovana Rodrigues, Thaís Nogales, Thaís Riether e Aline Lionço. Aos meus avós João, Dilce e Natália, mas especialmente para Waldemar por despertar em nós o amor pelo campo e animais. Ao meu orientador, professor Dr. José Paes de Oliveira Filho, pelos en- sinamentos desde a residência, pelo apoio, oportunidade, paciência e por ser exemplo de profissional que admiro e respeito. Obrigada pela oportunidade e por contribuir no meu crescimento profissional e pessoal. Ao meu co-orientador, professor Dr. Diego José Zanzarini Delfiol, pela imensa ajuda e considerações na redação deste trabalho. Ao professor Dr. Alexandre Secorun Borges, pela contribuição no meu crescimento profissional e pessoal durante a residência e mestrado, obrigada por todas as oportunidades de aprendizado. À professora Dra. Luciana Sonne, pela imensa colaboração na área de patologia clínica deste trabalho. Aos parceiros de pesquisa, Danilo Andrade e Lukas Albertino, pela grande colaboração neste estudo e manuscrito, nosso trabalho em equipe sempre trouxe excelentes resultados. Aos amigos de pós-graduação: Anelize Trecenti, Mariana Carvalho, Da- nilo Andrade, Larissa Andrade, Raíssa Leite, Rebeca Abibe, Campo Amor Cu- nha, César Erineudo, Lukas Albertino, Luiza Zakia, Pedro Negri, Emanuel Apo- lônio, Igor Vellano e Gustavo Rosa pelas conversas, trabalho e momentos compartilhados. Ao Roberto Yamawaki, por sempre me apoiar e acreditar em mim. Aos meus fiéis companheiros, Musashi, Odin e Heimdall. Aos professores e funcionários do curso de pós-graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP - Botucatu, pelas disciplinas mi- nistradas e pelo auxílio prestado durante este período. A todas as pessoas que diretamente ou indiretamente contribuíram para que este trabalho pudesse ser realizado. À CAPES, pela concessão da bolsa de estudo, sem a qual a realização deste trabalho seria muito mais difícil. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação De Aper- feiçoamento De Pessoal De Nível Superior – Brasil (CAPES) – código de finan- ciamento 001. Lista de Tabelas Tabela 1 Classificação de miopatias em equinos. VALBERG, S.J. Skeletal Muscle and Lameness. In: ROSS, M. W. & DYSON, J. S. Diagnosis and Lameness in the Horse. Saunders, 2011. Chap. 83, p. 821. 14 Tabela 2 Table 1. Genotype prevalence and allele frequency (esti- mated value ± SE) of the E321G MYH1 variant in Brazilian quarter horses. 35 Lista de Figuras Figura 1 Aleman, M. A review of equine neuromuscular disorders. Neu- romuscular disorders. v.18. p. 277–287. 2008. Miosite imuno- mediada (A) Cavalo doente com perda muscular profunda. Músculo glúteo médio deste cavalo a 40X (B e C). (B) Colora- ção H&E recém-congelada mostrando infiltração histiocítica e linfocítica endomisial, perimisial e perivascular. (C) Reação fosfatase ácida para destacar a infiltração histiocítica. (D) colo- ração de CD4 + destacando linfócitos T CD4. 11 Figura 2 Fig 1. A and B, moderate diffuse inflammatory infiltrate and myocyte necrosis in the semimembranosus muscle of foal 1 (H&E, C. bar=200 µm; D. bar=50 µm). C, partial chromatogram showing capillary sequencing results for homozygous (top) and heterozygous (bottom) alleles of the E321G MYH1 variant in mare and foal 1, respectively. Wild-type allele adenine (A, green arrow) and the respective amino acid glutamic acid (E) and double peaks (adenine/guanine) are observed (red arrow); in addition, note the amino acid glutamic acid (E) in heterozy- gous horses. Images were obtained using Geneious® 10.0 software. D, pedigree of IMM-affected foals 1 and 2. Horses 1 to 6 were genotyped for the E321G MYH1 variant in the pre- sent study, and the other genotype information was obtained in the AQHA stud book. The lines do not represent generations. Circles = females, squares = males. Black shape = My/My genotype. Black/White shape = N/My genotype. White shape = N/N genotype. Grey shape = unknown genotype. 37 Figura 2 Fig S1. Pedigree analysis of the 30 MYH1 heterozygous (N/My) quarter horses (green shape) obtained in Pedigraph (Garbe & Ya 2008). All affected horses could be traced back to a common sire, A281 (red arrow), within four to nine genera- tions. Circles = females, squares =males. SUMÁRIO CAPÍTULO I RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO ..........................................................................................................4 2. REVISÃO DE LITERATURA .....................................................................................5 2.1 Miosite Inflamatória Imunomediada .........................................................................5 2.1.1 Etiologia.................................................................................................................. 6 2.1.2 Epidemiologia ......................................................................................................7 2.1.3 Patogênese ..........................................................................................................8 2.1.4 Sinais Clínicos......................................................................................................... 9 2.1.5 Patologia Clínica e Histopatológico...................................................................... 10 2.1.6 Diagnóstico ......................................................................................................... 11 2.1.7 Diagnósticos Diferenciais… ................................................................................. 12 2.1.8 Tratamento ......................................................................................................... 15 2.1.9 Prognóstico…………………………………………………………………………......... 16 2.2 Miosite Inflamatória Imunomediada em outras espécies. ........................................ 16 2.3 Objetivos.....................………………………………………………………………..........18 3.0 Referências Bibliográficas Capítulo 1 .................................................................... 18 CAPÍTULO 2 4.0 Trabalho científico redigido para a revista “The Veterinary Journal” ........................ 24 4.1 Material e Métodos....................................................................................... ...............26 4.2 Seleção das Amostras….. ...................................................................................... 26 4.3 Padronização da PCR.........…………………………………………………………….....27 4.4 Análise dos Resultados...............................................................................................27 5.0 Resultados.. ................................................................................................................27 6.0 Discussão e Conclusão.. ........................................................................................ 29 7.0 Referências Bibliográficas Capítulo 2 ..................................................................... 33 8.0 Considerações Finais.................................................................................................39 9.0 Normas para a submissão da revista “The Veterinary Journal” ........ ........................40 ALBUQUERQUE, A. L. H. PREVALÊ NCIA DA M UT AÇÃO E321G NO GENE MYH1 , ASSOCIADA A M IOSIT E IM UNOM EDIADA, EM CAV A- LOS QUART O DE M ILHA NO BRASIL . Botucatu, 2020. 61 p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO A miosite imunomediada (IMM) causa atrofia muscular aguda e infiltração linfo- cítica de miofibras. Em cavalos Quarto-de-milha (QM), uma mutação missense E321G em gene MYH1 está altamente associada à suscetibilidade ao desen- volvimento de IMM. O objetivo deste estudo foi investigar a frequência alélica da variante E321G em gene MYH1 em QMs no Brasil. Dos 299 QMs genotipa- dos, 44 animais (14,7%) foram identificados como heterozigotos (N/My) para a variante E321G em gene MYH1 e 255 (85,3%) foram homozigotos para o alelo wild type (N/N); portanto, a frequência do alelo foi de 0,074. Cavalos da linha- gem de rédeas mostraram uma frequência de heterozigotos significativamente maior do que outras linhagens. Não houve associação entre miopatia de arma- zenamento de polissacarídeos tipo 1 ou hipertermia maligna e a variante E321G em gene MYH1 nos animais avaliados. Além disso, aqui, descrevemos aqui pela primeira vez no Brasil dois potros (N/My) com sinais clínicos de IMM. Este estudo destaca a importância de medidas de controle para evitar um au- mento na incidência de IMM associado ao E321G em gene MYH1 em QMs no Brasil, principalmente em cavalos de rédeas. Palavras-chave: miosite, doença muscular, doença genética, mutação, Quarto de Milha. ALBUQUERQUE, A. L. H. PREVALENCE OF THE E321G MYH1 VARIANT, ASSOCIATED WITH IMMUNE-MEDIATED MYOSITIS IN QUARTER HORSES IN BRAZIL. BOTUCATU – SP, 2020. 61 p. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Pau- lista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu. ABSTRACT In Quarter horses (QHs), myosin heavy chain myopathy (MYHM), characterized by nonexertional rhabdomyolysis or immune-mediated myositis (IMM) with acute mus-cle atrophy, is highly associated with a missense E321G MYH1 mu- tation. We identified two related QH foals in Brazil with the E321G MYH1 muta- tion that had clinical signs of MYHM, with the histological confirmation of IMM in one foal. This prompted an investigation into the allele frequency of the E321G MYH1 variant across performance QHs using a DNA archive in Brazil. Of 299 genotyped QHs, 44 animals (14.7%) were identified as heterozygous (My/N) for the E321G MYH1 variant, and 255 (85.3%) were homozygous for the wild-type allele (N/N), with an allele frequency of 0.074. Reining horses showed a signifi- cantly higher prevalence of heterozygosity than those in other disciplines (P=0.008). The prevalence of type 1 polysaccharide storage myopathy was 0.032, with only two E321G MYH1 heterozygotes possessing the GYS1 muta- tion. This study highlights the existence of MYHM and the high prevalence of the MYH1 mutation in QHs in Brazil, especially in reining QHs, underlining the importance of control measures to prevent an increase in the incidence of MYHM in QHs in Brazil. Keywords: muscle disorders; mutation; MYH1 gene; myositis. 4 1. INTRODUÇÃO Após a substituição do uso de cavalos para trabalho e transporte por máquinas e automóveis, os equinos começaram a ser utilizados para lazer e se tornaram grandes representantes deste segmento. Estima-se a existência de 1,1 milhões de equinos neste segmento no Brasil desde 2015, gerando movimen- tação econômica de 5,84 bilhões de reais no mesmo ano. A partir de 2004, o Quarto de Milha começou a liderar o ranking de comercialização no Brasil (CORRÊA & MOTA, 2007). Durante os últimos 20 anos, algumas bases genéticas de doenças que afetam cavalos da raça Quarto de Milha foram identificadas (TRYON et al., 2009). Estas são: paralisia periódica hypercalêmica (HYPP) (RUDOLPH et al., 1992), deficiência de enzima de ramificação do glicogênio (GBED) (WARD et al., 2004), astenia cutânea hereditária equina (HERDA) (TRYON et al., 2007), hi- pertermia maligna (MH) (ALEMAN et al., 2008), miopatia por acúmulo do polis- sacarídeo tipo 1 (PSSM1) (MCCUE et al., 2008) e Trombastenia de Glanzmann (CHRISTOPHERSON et al., 2007) e miosite inflamatória imunomedia- da/Immune-Mediated Myositis (IMM) (FINNO et al., 2018; GIANINO et al., 2019; VALBERG et al., 2018). Com exceção da última, todas estas doenças já tiveram a prevalência determinada em cavalos Quarto de Milha no Brasil (BA- DIAL et al., 2014; DELFIOL et al., 2015; ARAÚJO et al., 2018; DELFIOL et al., 2018; LEITE et al.,2019). Atualmente, o painel de doenças genéticas que devem ser obrigatoria- mente testadas afim de registrar garanhões na American Quarter- Horse Asso- ciation (AQHA) é composto por HYPP, GBED, HERDA, PSSM e MH. O teste genético para diagnóstico de HYPP também é obrigatório para registro na As- sociação Brasileira de Criadores de Quarto de Milha (ABQM) para descenden- tes do garanhão Impressive. A IMM equina é uma enfermidade muscular associada a uma mutação genética pontual, ainda não descrita no Brasil, denominada miosite inflamatória imunomediada (IMM) (FINNO et al., 2018; GIANINO et al., 2019; VALBERG et al., 2018). Clinicamente é caracterizada por intensa atrofia muscular, principalmen- te por episódios agudos e recorrentes, de musculatura epaxial e glútea, fraque- za muscular, apatia e infiltração de linfócitos CD 4+, CD 8+ e CD 20+ ao redor devasos sanguíneos e infiltrados de miofibras sem evidência de vacúolos orbi- tais (FINNO et al., 2018; VALBERG et al., 2018). A etiologia de várias doenças 5 autoimunes não é completamente compreendida, porém sabe-se que estímulo do ambiente e predisposição genética são fatores relevantes (FINNO et al., 2018). Não se sabe ao certo quais fatores ambientais contribuem com o de- senvolvimento da doença em cavalos, porém 39% dos casos de IMM em equi- nos têm histórico de infecção por Streptococcus spp. ou vacinação para Strep- tococcus equi subsp. equi ou herpes vírus, quatro a três semanas antes do quadro clínico (FINNO et al., 2018). Porém, os fatores desencadeantes perma- necem desconhecidos em mais de 40% dos casos (VALBERG et al., 2018). A IMM, assim como demais doenças genéticas, foi correlacionada de acordo com a linhagem de trabalho, havendo maior prevalência em linhagens de rédeas (FINNO et al., 2018). A seleção de equinos, em especial da raça Quarto de Milha, é realizada baseada no desempenho atlético, o que levou a acentuada estratificação da população (BETTLEY et al., 2012). Atualmente, já há a disponibilidade de teste genético para IMM nos EUA, possibilitando o diagnóstico precoce e evitando a reprodução indiscriminada possibilitando o nascimento de animais afetados, porém, ainda não há a identi- ficação da mutação responsável pela IMM ou a disponibilidade de teste genéti- co no Brasil. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Miosite Inflamatória Imunomediada Miopatias inflamatórias são alterações inflamatórias ou imunomediadas caracterizadas pela presença de linfócitos na musculatura esquelética (FINNO et al., 2018). Miosite Imunomediada é uma enfermidade conhecida que leva a atrofia muscular em cavalos Quarto de Milha e raças relacionadas, por vezes associada a fatores ambientais como vacinação e histórico de doença respira- tória (VALBERG et al., 2018). A susceptibilidade da IMM é atribuída a uma 6 mutação missense no gene miosina de cadeia pesada 1 (MYH1) codificador da cadeia pesada da proteína miosina de fibras musculares tipo 2X (GIANINO et al., 2019). 2.1.1 Etiologia Miosite inflamatória pode ocorrer devido à infecção prévia, pré-neoplásica ou causas imunomediadas. Causas de miosite infecciosa em cavalos incluem clostriodioses, estreptococose e sarcocistose, caracterizadas por mionecrose e infiltrados polimorfonucleares em tecido muscular (LEWIS et al., 2007). A etio- logia de algumas doenças imunomediadas não são totalmente conhecidas, po- rém estímulo ambiental associado a predisposição genética é a causa mais pro- vável para a IMM (FINNO et al., 2018). Doenças de caráter autoimune são ca- racterizadas como decorrentes de uma síndrome consequente da ativação de células T e/ou B. Atualmente, acredita-se que a ocorrência de doenças autoi- mune dependa de um ou mais mecanismos como susceptibilidade genética, características ambientais que podem levar ao desenvolvimento da doença, desencadeando auto-reatividade de linfócitos, alterações no processo patológico ao longo da progressão da doença, e múltiplos mecanismos de lesão tecidual (MACKAY & ROSEN, 2001). Não estão totalmente esclarecidos quais são os fatores ambientais asso- ciados à IMM, porém 39% dos animais que manifestam a doença apresentavam histórico de infecção poucas semanas antes dos primeiros sinais clínicos, prin- cipalmente por Streptococcus spp., ou vacinação para influenza, rinotraqueíte equina ou Streptococcus equi subsp. equi (LEWIS et al., 2007; HUNYADI et al., 2017). A infecção por S. equi subesp. equi pode levar à complicações como púrpura hemorrágica, empiema de bolsa gutural, obstrução de via respiratória superior, garrotilho bastardo, pneumonia, pleurite, agalactia, abcessos periorbi- tais e rabdomiólise (VALBERG, 2006b) A rabdomiólise grave e aguda é uma complicação rara e fatal por infecção de vias aéreas superiores por Streptococ- cus em equinos. Sugere-se que ocorra por presença de exotoxinas ou protea- ses na musculatura, devido a bacteremia, além de hipotensão e hipoperfusão, acidose lática, superantígenos estreptocócicos e ação de células T (SPON- SELLER et al., 2005). Ainda não é esclarecido porque a musculatura superficial é particularmente mais afetada (LEWIS et al., 2007). 7 A IMM foi recentemente associada à mutação E321G no gene MYH1, conferindo susceptibilidade à doença, potencialmente dependente da presença de outros fatores desencadeadores de doenças imunomediadas (FINNO et al., 2018). A mutação missense identificada no gene MYH1 está localizada em uma região altamente conservada da cabeça globular da proteína miosina em sub- fragmento-1 entre a região hélice loop-hélice de Hélice J e Hélice K. Os laços helicoidais entre desempenham um papel importante ara ligação do ATP. A mutação MYH1 E321G substitui um ácido glutâmico (E) carregado negativa- mente por uma glicina não polar (G) que necessita de cadeias laterais necessá- rias para a formação de ligações de hidrogênio, resultando em instabilidade da proteína moisina 2 X devido a maior redução de contato entre os domínios SWITCH1 e hélice 1 da cabeça globular da miosina 2X (FINNO et al., 2018). 2.1.2 Epidemiologia Na IMM, a população de risco está relacionada a fatores ambientais que desencadeiam a doença, associada a linhagens, pedigree e frequência alélica. Altas frequências de determinadas doenças genéticas ocorrem em linhagens específicas de maneira desproporcional (GIANINO et al., 2019). Nos EUA, por exemplo, as frequências alélicas de HERDA e GBED são mais elevadas em equinos da linhagem de apartação (respectivamente, 0,142 e 0,068) e western pleasure (respectivamente, 0,064 e 0,132). Em subgrupos de linhagem de Con- formação há maior frequência alélica para HYPP (0,299) e PSSM (0,155) e alta prevalência da Síndrome Letal do Oveiro Branco em linhagens da raça Paint Horses (TRYON et al., 2009). A IMM ocorre predominantemente em linhagens de cavalos da raça Quarto de Milha (LEWIS et al., 2007). Nos EUA frequência alélica de IMM foi encontrada em maior proporção em linhagens de rédeas (0,135), representando 24,3% dos cavalos Quarto de Milha desta linhagem, se- guido por working cow (0,085) e conformação (0,08). Encontrada também, em linhagens de apartação (0,044) e western pleasure (0,021), não encontrada em linhagens de tambor e corrida (GIANINO et al., 2019). Esta enfermidade tem distribuição bimodal de idade, tanto em humanos quanto equinos, afetando jo- vens (cavalos abaixo de 8 anos) e idosos (cavalos acima de 17 anos) (LEWIS et al., 2007). 8 2.1.3 Patogênese A musculatura consiste de um conjunto de fibras com diferentes estruturas moleculares, contráteis, com propriedades metabólicas, que contribuem para várias habilidades funcionais (MORENO-SANCHÉZ et al., 2010). A função da musculatura é determinada por sua estrutura e tipo de fibra muscular que a compõe (WANG et al., 2017). A existência de múltiplas isoformas de proteínas miofibrilares é o principal fator que leva a diversidade de tipos de fibra, e sua composição principal responsável por caracterizar a contração. A classificação de fibras mais aceita é tipo 1, de lenta contração e tipos 2A e 2X, de rápida contração (ENNION et al., 2005). A miosina de cadeia pesada (MyHC) é a molécula motora do músculo e forma estrutura de filamentos sarcômeros. Se houver mutação nesta molécula, há diferentes expressões fenotípicas, dependendo de qual é o isoforma mutada, seu tipo e localização da mutação. Em equinos, o gene MYH1 codifica miosina de cadeia pesada, encontrada em fibras musculares de contração rápida tipo 2X (VALBERG et al., 2018). A miosina é um motor molecular que converte energia química em força mecânica. A miosina classe II convencional é uma proteína hexamérica composta por duas subunidades de miosina de cadeia pesada (MyHC), que por sua vez, apresenta dois domínios funcionais formados por dois domínios: cabeça globular amino-terminal, na qual se ligam as correntes de luz exercendo função motora e o terminal alfa-hélix que apresenta propriedade de formação de filamentos (VALBERG et al., 2018). A susceptibilidade a IMM é atribuída a mutação genética missense E321G em região altamente conservada do gene MYH1 do cromossomo 11 (GIANINO et al., 2019). O gene MYH1 mutado apresenta composição de ami- noácidos alterada da região da cabeça globular, potencialmente impactando na estabilidade proteica uma vez que a mutação E321G na proteína substitui um ácido glutâmico (E) negativamente carregado, por uma glicina (G) não polar, que por sua vez, não possui ligação com hidrogênio, havendo redução de con- tato entre áreas de domínio da cabeça globular da fibra 2X (FINNO et al., 2018). Em cavalos portadores do alelo mutado, a exposição de nova isoforma de miosina ao ambiente extracelular parece iniciar infiltração linfocítica e des- truição de miofibras, predominantemente do tipo 2X (GIANINO et al., 2019). 9 Quando ocorre IMM e intensa atrofia muscular, há menos fibras musculares 2X e presença de infiltrado linfocítico em miofibras tipo 2X. Miopatias hereditárias associadas a miosina têm formado um importante grupo de doenças que variam em sintomatologia clínica e relação a autoimune humoral (LEWIS et al., 2007). A IMM equina é caracterizada por intensa atrofia muscular e infiltração de linfócitos CD4+, CD8+ e CD20+ ao redor de vasos sanguíneos e infiltrados de miofibras sem evidência de vacúolos orbitais (FINNO et al., 2018; VALBERG et al., 2018). O infiltrado linfocítico encontrado em amostras de musculatura de equinos com IMM consiste principalmente de célu- las CD4+, células plasmáticas e CD8+ encontradas em áreas de intensa infla- mação (VALBERG et al., 2018). No caso de IMM decorrente de infecção estreptocócica, a proteína M li- berada da superfície bacteriana forma complexos junto ao fibrinogênio que in- duz à liberação de proteína de ligação à heparina, elevando intensamente a permeabilidade vascular. A proteína de ligação à heparina e neutrófilos primar i- amente polimorfonucleares é mediada por CD11/CD18, integrina que também é expressa em monócitos e ativada por linfócitos. Essa ligação ao CD11/CD18 leva a indução de várias quinases intracelulares como tirosina- quinases, que resulta em mobilização de cálcio intracelular (PAHLMAN et al., 2006). A proteí- na M também é potente ativador de monócitos, sua interação com TLR2 em mo- nócitos resulta em produção de citocinas, especialmente IL-6 (PAHLMAN et al., 2006). Além disso, Finno (2019) mostrou similaridades entre regiões de ali- nhamento proteico entre as proteínas M do Streptococcus equi e a sequênca de aminoácidos MyHC 2 X, e sugere-se por este motivo a resposta imune adaptativa poderia ser acionada por epítopos compartilhados entre bactérias (como a proteína M de Streptococcus sp.) e a miosina. 2.1.4 Sinais Clínicos Miopatias imunomediadas em equinos podem levar a sintomatologia aguda, edema generalizado, infarto ou atrofia muscular (VALBERG, 2006a). Sinais clínicos de IMM incluem rápida atrofia, particularmente de musculatura epaxial e gluteal, depressão e aumento do tônus muscular (LEWIS et al., 2007). Porém, não se encontra na literatura a justificativa do porque estes grupos musculares são os mais afetados. Sinais clínicos mais comuns descritos por Hunyadi et al (2017) foram rápida, simétrica, difusa e progressiva atrofia mus- cular (80% dos casos), aumento do tônus muscular/enrijecimento do andar 10 (74%) e febre (44%). Quadro clínico de miosite imunomediada associada a re- cente infecção de Streptococcus equi. subsp. equi foi descrito como agudo, grave, com intenso infarto muscular e necrose fibronoide de vasos sanguíneos, edema subcutâneo, e sinais clínicos de abdômen agudo (BEECH, 2000). Em quatro casos, descritos por Valberg e colaboradores (1996) após exposição a S. equi sem sintomatologia de garrotilho, observou-se atrofia rápida e progressiva de musculatura epaxial e glútea. Beech (2000) descreve sintomatologia seme- lhante em um equino não exposto a Streptococcus equi, porém desenvolveu atrofia muscular multifocal. Barrot et al. (2004), relataram um caso de suspeita de IMM em um pônei de 16 anos que apresentava atrofia bilateral de muscula- tura do pescoço, o diagnóstico foi realizado por achados histológicos da muscu- latura, exclusão de outras enfermidades e melhora ao tratamento com dexame- tasona. O caso foi descrito como atrofia muscular progressiva e indolor, limita- da à musculatura de região medial do pescoço, bilateral e acompanhada de fraqueza. 2.1.5 Patologia Clínica e Histopatológico Como demais rabdomiólises, espera-se valores séricos de creatinina ki- nase (CK) iguais ou acima de 5.000 U/L (VALBERG et al., 2018). Equinos com IMM apresentam, em média, valores séricos de CK e AST (aspartato amino- transferase) de 9.746 (Referência de 119 – 187 U/L) e 2.880 (Referência 138 a 409 U/L), respectivamente (LEWIS et al., 2007). Além disso, leucocitose (60%) e hiperfibrinogenemia (51%) são comumente observadas em casos de IMM (HUNYADI et al., 2017). Achados histopatológicos em miopatias imunomediadas são descritos por vasculite leucoclástica com pouco infiltrado de células mononucleares, prova- velmente decorrente de deposição de imunocomplexo microvasculares (LEWIS et al., 2007). Suspeitou-se de causa imunomediada para a degeneração muscu- lar causada pela miosite em equinos a partir de infiltrados linfocíticos em amos- tras de equinos com rabdomiólise, havendo predominacia de CD4+ seguido de CD8+, de maneira semelhante a outras miosites imunomediadas como miosite mastigatória do cão, dermatomiosite em humanos (ambos com predominância de CD4+), e polimiosite em cães (predominância de CD8+) (DURWARD- AKHURST et al., 2016). O achado diagnóstico clássico de IMM é infiltrado lin- focítico em miócitos em variados graus, na maioria dos casos ao redor de va- sos sanguíneos (DURWARD-AKHURST & VALBERG, 2018). A IMM equina é 11 caracterizada por infiltrados linfocíticos CD4+, CD8+ e CD20+ ao redor de vasos sanguíneos e infiltrados de miofibras sem evidencia de vacúolos (FINNO et al., 2018). A causa imunomediada para miosite em equinos foi melhor compreendida a partir de achados de biópsia (infiltrado linfocítico) e expressão sarcolemal de MHC I e MCH II em proporção de miofibras. A expressão de MHC ocorreu em algumas miofibras específicas em equinos afetados com PSSM, na ausência de infiltrados linfocíticos (DURWARD-AKHURST et al., 2016). A figura 1 ilustra a atrofia de musculatura glútea, assim como região bio- psiada e histopatológico. Figura 1. Aleman, M. A review of equine neuromuscular disorders. Neuromuscular disor- ders. v.18. p. 277–287. 2008. Miosite imunomediada (A) Cavalo doente com perda muscu- lar profunda. Músculo glúteo médio deste cavalo a 40X (B e C). (B) Coloração H&E recém- congelada mostrando infiltração histiocítica e linfocítica endomisial, perimisial e perivascu- lar. (C) Reação fosfatase ácida para destacar a infiltração histiocítica. (D) coloração de CD4 + destacando linfócitos T CD4. 2.1.6 Diagnóstico O diagnóstico de doenças musculares em cavalos é composto pelo his- tórico, exame físico e alguns exames laboratoriais e perfil de bioquímica sérica 12 (CK, AST, LDH, mioglobina, concentração de vitamina E e selênio), urinálise e fração de excreção renal de eletrólitos. Com base nos achados laboratoriais pode-se determinar se os sinais musculares são primários ou secundários, se primários podem ser lesão muscular focal, rabdomiólise, fraqueza e intolerância muscular sem rabdomiólise, contração muscular anormal ou atrofia muscular (VALBERG, 2009). Exames complementares de ultrassonografia, eletromiogra- fia, termografia, cintilografia nuclear, biópsia muscular para análise histopatoló- gica, testes genéticos e teste de resposta ao exercício (em suspeita de rabdo- miólise associada ao exercício assintomática, o exame é positivo havendo ele- vação de três a quatro vezes na concentração basal de CK a exercício de 15 minutos ao trote) (VALBERG, 2006b; VALBERG, 2009). O diagnóstico de IMM em equinos é realizado a partir da sintomatologia clínica na ocorrência de rabdomiólise, seguido de teste genético e, se necessá- rio, biópsia muscular para histopatológico (VALBERG et al., 2018). A biopsia transcutânea de músculos afetados é um dos testes mais úteis para diagnosti- car equinos com IMM ativa. Amostras de Trucut fixadas em formalina ou em agulhas Bergstrom frescas-congeladas de musculatura epaxial/abaxial são ge- ralmente suficientes para diagnóstico (DURWARD-AKHURST & VALBERG, 2018). As demais miopatias de origem genética (PSSM, HYPP e MH) têm teste diagnóstico biomolecular disponíveis. Da mesma maneira, o teste genético para a variante E321G permite o diagnóstico de IMM e rabdomiólise não associada ao exercício em equinos, permitindo a seleção de animais para a reprodução, evitando a produção de potros afetados (GIANINO et al., 2019). Apesar da mu- tação ser descrita em E321 pela literatura (FINNO et al., 2018; GIANINO et al., 2019; VALBERG et al., 2018), ela está identificada em E320 de acordo com o National Center for Biotechnology Information (NCBI). 2.1.7 Diagnósticos Diferenciais Doenças que causam lesões e sintomatologia de grupos musculares em equinos são diversas e comuns. A maior parte das vezes são causadas por ra- bdomiólise induzida por esforço. Doença muscular da ‘segunda-feira de ma- nhã’, azoturia, sídrome do tying-up e rabdomiólise associada ao exercício usu- almente são ditas como sinônimos, apesar de haver algumas variações entre os termos. Azotúria é o termo para denotar grave lesão muscular, enquanto tying up geralmente é resultado de leve lesão muscular. Outros estudos sugerem que tying up ocorre após exercício físico intenso e prolongado, e que rabdomiólise 13 associada ao exercício é resultado de depleção de energia muscular e somente associado a exercícios aeróbicos. Porém, apesar da falta de consenso, o termo rabdomiólise associada ao exercício é o mais aceito e os demais não devem mais ser utilizados (FREESTONE & CARLSON, 1991). Outras doenças de origem muscular que são diferenciais para IMM são atrofia por desuso, miosite por agentes infecciosos como: sarcocystis, Strepto- coccus equi, influenza, Clostridium sordelli (FREESTONE & CARLSON, 1991), Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Infantum (QUIST et al., 2011) ou Acinetobacter calcoaceticus (DICKIE & REGNIER, 1978); além de, miodegene- ração nutricional por deficiência de vitamina E e selênio, miopatia imumo- mediada devido a púrpura hemorrágica, miopatia mitocondrial e rabdomiólise induzida por demais etiologias (BARROT et al., 2004; ALEMAN, 2008). As doenças musculares que levam ao quadro clínico de rabdomiólises podem ainda ser classificadas em rabdomiólises associadas ao exercício ou rabdomólises não associadas ao exercício (Tabela 1). De acordo com a tabela 1, a IMM é uma rabdomiólise não associada ao exercício, classificada como miopatatia inflamatória e imuno-mediada. Mas também, como ocorre em curso mais avançado da doença, relacionada a atrofia muscular. 14 Tabela 1. Classificação de miopatias em equinos. VALBERG, S.J. Skeletal Muscle and Lameness. In: ROSS, M. W. & DYSON, J. S. Diagnosis and Lame- ness in the Horse. Saunders, 2011. Chap. 83, p. 821. Rabdomiólise não associada ao exercício Rabdomiólise associada ao exer- cício 1. Miopatias Inflamatórias 1.Lesão muscular focal 1.1 Imuno-mediadas 1.1 Tying up esporádico 1.1a Púrpura hemorrágica 1.1a Nutricional (deficiên- cias/desequilíbrios) vitamínicos, mi- nerais, eletrolíticos. 1.1b Miosite Imunomediada 1.1b Excesso de exercício físico 2. Infecciosas 1.1c Síndrome da exaustão 2.a Miosite por Clostridiose 1.2 Tying up crônico 2.b Miosite por Streptococcus equi 1.2a Polysaccharide storage myopa- thy (PSSM) tipo 1 2.c Miosite por Anaplasma 1.2b Polysaccharide storage myopa- thy (PSSM) tipo 2 2.d Miosite viral 1.2c Hipertermia Maligna 2.e Miosite por Sarcocystis 1.2d Rabdomiólise associada ao exercício recorrente 3. Miopatias Nutricionais 1.2e Rabdomiólise associada ao exercício crônica idiopática 3.a Deficiência de Vitamina E e Se- lênio Miopatia associada ao exercício (sem alteração de CK) 4. Miopatias por intoxicação 1. Miopatia Mitocondrial 4.1 Intoxicação por ionóforo Atrofia Muscular 4.2 Miopatias de pastagem 1.1 Atrofia Miogênica 4.2a Rayless goldenrod/white snake- root 1.1a Por disuso 4.2b Cassia occidentalis 1.1b Por caquexia 4.2c Mioglobinúria atípica 1.1c Por Cushing’s disease 5. Miopatia traumática 1.1d Por Miosite Imunomediada (atrofia rápida) 15 5.1 Miopatia Anestésica Compres- siva 1.1e Por Polysaccharide storage myopathy (PSSM) tipo 2 5.2 Trauma 1.1f Rabdomióse grave 6. Miopatia Metabólica 1.2 Atrofia neurogênica 6.1 Glycogen branching enzyme de- ficiency(GBED) em Quarto de Milha 1.2.a Mielite protozoária equina 7. Polysaccharide storage myopathy (PSSM) tipos 1 e 2 1.2.b Trauma neural local 8. Hipertermia Maligna 1.2c Doença do neurônio motor . Doenças de origem neurológica também são diagnósticos diferenciais para atrofia muscular, como EPM, polineurite equina, mielite verminótica, doen- ça do neurônio motor inferior e atrofia neurogênica (BARROT et al., 2004). Per- da de massa muscular devido a atrofia neurogênica pode ser descartada por biópsia, assim como a grande maioria dos diferenciais (BARROT et al., 2004). Outros diagnósticos diferenciais descritos são Intoxicações por ionóforo, canta- ridina e snakeroot branco (QUIST et al., 2011). Por fim, alterações musculares também podem ser de resultado de mu- tações genéticas, como é o caso de doenças já descritas em cavalos Quarto de Milha no Brasil, são elas HYPP, PSSM1 e MH (DELFIOL et al., 2015; DELFIOL et al., 2018), além de GBED (ALEMAN, 2008; ARAUJO et al., 2018). Equinos com PSSM apresentam rabdomiólise sem haver infiltrado inflamatório acentuado por linfócicos. Também não possuem expressão de MHC classes I ou II em sarcolema como equinos com IMM, exceto em amostras de PSSM as- sociado a ausência de infiltrados linfocíticos ou características de regeneração (como núcleo deslocado centralmente ou citoplasma basofílico), provavelmente devido a inflamação por citocinas causada pela presença de polissacarídeo anormal (DURWARD-AKHURST et al., 2016). 2.1.8 Tratamento Tratamento instituído em pônei com suspeita de IMM foi 0,1 mg/kg de dexametasona reduzindo 0,04mg/kg a cada quatro dias. O curso inicial cont i- nuou por oito semanas, após este período não havia mais perda de massa muscular visível, porém o tratamento se prolongou por mais 12 semanas, com acompanhamento histopatológico de biópsias musculares e ultrassonografias da musculatura afetada (BARROT et al., 2004). Tratamento realizado por Lewis et 16 al. (2007) em suspeita de IMM foi dexametasona (0,07 a 0,1 mg/kg) ou predni- sona/prednisolona (1 mg/kg) e antibioticoterapia caso houvesse infecção em progresso e acompanhamento dos casos com biópsias musculares. No caso de miopatia secundária à infecção estreptocócica, alta mortal i- dade foi reportada em cavalos que receberam penicilina intravenosa durante tratamento para garrotilho ou miopatia, mesmo havendo alta suscetibilidade de espécies estreptocócicas à antibióticos beta-lactâmicos. Porém, a associação de penicilina à rifampicina (antimicrobiano que inibe síntese proteica) aumenta a taxa de sobrevivência em rabdomiólise estreptocócica. Nesses casos, antiin- flamatórios não esteroidais ou altas doses de corticoides de ação curta podem diminuir resposta inflamatória. Infusão continua de lidocaína, detomidina ou ce- tamina podem diminuir ansiedade e dor. Caso haja decúbito decorrente da mi- opatia, os cavalos devem permanecer em baia com cama alta e alterado o de- cúbito a cada quatro horas ou erguidos em sling, caso consigam manter-se de pé sob os membros pélvicos (VALBERG, 2006b). 2.1.9 Prognóstico Hunyadi et al. (2017) relataram 87% de proporção de sobrevivência em cavalos acometidos com IMM. Fatores como raça (animal não ser Quarto de Milha) e época do ano (inverno) parecem influenciar negativamente na taxa de sobrevivência. Assim como, animais com febre ou doença concomitante apre- sentam prognóstico desfavorável em relação à vida. Porém, tratamento imedia- to está associado a prognóstico favorável. Apesar de elevado aumento em ati- vidade de enzimas musculares, a AST e CK não foram uteis como indicadores de prognóstico (HUNYADI et al., 2017). 2.2 Miosite Inflamatória Imunomediada em outras espécies A miosina é uma proteína ubíqua e altamente conservada, encontrada em todas as células eucarióticas, onde fornece a função motora para diversos movimentos, como citocinese, fagocitose e contração muscular. Todas as mio- sinas contêm um domínio motor/terminal amino-terminal e um domínio cauda terminal-carboxi. Devido ao grande número de moléculas diferentes identifica- das até o momento, as miosinas foram divididas em sete classes distintas com base nas propriedades do domínio da cabeça. Uma dessas classes, miosinas de classe II, consiste nas miosinas de duas cabeças convencionais que formam filamentos e são compostas por duas subunidades de cadeia pesada de mios i- 17 na (MYH) e quatro subunidades de cadeia leve de miosina. A subunidade MYH contém a atividade ATPase, fornecendo energia que é a força motriz dos pro- cessos contráteis mencionados acima, e existem numerosas isoformas MYH nos vertebrados para desempenhar essa função (WEISS &, LEINWAND, 1996). Desta maneira, é descrita a mutação em miosinas também em outras espécies, como humanos e cães. Em humanos, mutações dominantes em ge- nes isoformes de MyHC (MYH3 e MYH8) são associados a síndromes de ar- trogripose distal. Mutações dominantes ou recessivas afetando MyHC tipo IIA (MYH2) são associadas a episódio precoce de miopatias com fraqueza muscu- lar variável em intensidade e oftalmoplegia (TAJSHARGHI & OLDFORS, 2013). Miopatia congênita relacionadas às mutações misssense do gene MYH2 em humanos é uma rara doença neuromuscular, também causando oftalmopare- sia/oftalmoplegia e disfagia, dispneia ao nascer (D’AMICO et al., 2013). Tam- bém, miopatias de acúmulo de miosina e miopatia distal de Laing são, em ge- ral, enfermidades resultantes de mutação dominante no MYH7 (TAJSHARGHI & OLDFORS, 2013). O tipo e distribuição de células inflamatórias mononuclea- res em histopatológicos diferem dentre miopatias (LEWIS et al., 2007). Um grupo heterogêneo de doenças musculares imunomediadas é des- crito em cães e humanos e pertencem à duas categorias: polimiosites e derma- tomiosites (LEWIS et al., 2007). Shelton (2007) descreve ainda uma terceira ca- tegoria: miosite por corpos de inclusão. São ligadas a atributos inespecíficos como envolvimento difuso e simétrico da musculatura, fraqueza generalizada, responsividade a corticoides e desconhecimento de causa primária. Doenças virais e infecciosas podem levar a IMM em cães e humanos, doença de Lyme já foi reportada como causa de IMM em humanos. Em cães, a IMM pode levar a miosite de musculatura mastigatória (LEWIS et al., 2007). A IMM em humanos é caracterizada por fraqueza muscular, lesões de pele, doença pulmonar intersti- cial e neoplasia (ROTHWELL et al., 2013). Em humanos, polimiosite também já foi relatada em associação com doenças sistemicas, como lúpus eritematoso, esclerose progressiva sistêmica e periarterite nodosa (MEDSGER et al., 1970) e doenças imunomediadas de articulações (BENNET & KELLY, 1987). 18 2.3 OBJETIVOS O objetivo deste trabalho é verificar a frequência alélica da mutação E321G no gene MYH1 no Brasil, e nas linhagens de criação (rédeas, tam- bor/baliza, conformação, apartação e corrida) em cavalos Quarto de Milha no Brasil. Além de descrever caso clínico de IMM em potro Quarto de Milha hetero- zigoto para a mutação E321G em gene MYH1. 3.0 REFERÊNCIAS ALEMAN, M. A review of equine muscle disorders. Neuromuscular disorders, v.18, n.4, p. 277-287, 2008. ARAUJO, C. E., DELFIOL, D. J., BADIAL, P. R., OLIVEIRA-FILHO, J. P., ARAUJO- JUNIOR, J. P., BORGES, A. S. 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Oliveira-Filhoa,* 10 11 a São Paulo State University (Unesp), School of Veterinary Medicine and Animal 12 Science, Department of Veterinary Clinical Science,18618-681 Botucatu, Brazil 13 b School of Veterinary Medicine, Universidade Federal de Uberlândia, 38405-320 14 Uberlândia, Brazil 15 c Sector of Veterinary Pathology, Veterinary Faculty, Federal University of Rio Grande 16 Sul, Av Bento Gonçalves, 9090, Pr 42505, Porto Alegre, RS, Brazil 17 d Michigan State University, Department of Large Animal Clinical Sciences, College of 18 Veterinary Medicine, East Lansing, MI, 19 e University of California-Davis, Department of Population Health and Reproduction, 20 School of Veterinary Medicine, Davis, CA 21 22 *Corresponding author. Tel.: +55 14 3880 2083. 23 E-mail address: jose.oliveira-filho@unesp.br (J.P. Oliveira-Filho). 24 25 mailto:jose.oliveira-filho@unesp.br 26 Abstract 26 In Quarter horses (QHs), myosin heavy chain myopathy (MYHM), characterized 27 by nonexertional rhabdomyolysis or immune-mediated myositis (IMM) with acute mus-28 cle atrophy, is highly associated with a missense E321G MYH1 mutation. We identified 29 two related QH foals in Brazil with the E321G MYH1 mutation that had clinical signs of 30 MYHM, with the histological confirmation of IMM in one foal. This prompted an in-31 vestigation into the allele frequency of the E321G MYH1 variant across performance 32 QHs using a DNA archive in Brazil. Of 299 genotyped QHs, 44 animals (14.7%) were 33 identified as heterozygous (My/N) for the E321G MYH1 variant, and 255 (85.3%) were 34 homozygous for the wild-type allele (N/N), with an allele frequency of 0.074. Reining 35 horses showed a significantly higher prevalence of heterozygosity than those in other 36 disciplines (P=0.008). The prevalence of type 1 polysaccharide storage myopathy was 37 0.032, with only two E321G MYH1 heterozygotes possessing the GYS1 mutation. This 38 study highlights the existence of MYHM and the high prevalence of the MYH1 mutation 39 in QHs in Brazil, especially in reining QHs, underlining the importance of control 40 measures to prevent an increase in the incidence of MYHM in QHs in Brazil. 41 42 Keywords: muscle disorders; mutation; MYH1 gene; myositis. 43 27 Introduction 44 The equestrian industry is a strong segment of Brazilian agribusiness, and sporting 45 breeds certainly play a fundamental role in the industry. Quarter horses (QHs) stand out 46 as one of the main breeds of sport horses in Brazil, with horses specializing in specific 47 disciplines. Muscle disorders are among the major health concerns that affect the per-48 formance of athletic horses (Valberg, 2018). Genetic muscle disorders in this breed in-49 clude hyperkalaemic periodic paralysis (HYPP), glycogen branching enzyme deficiency 50 (GBED), type 1 polysaccharide storage myopathy (PSSM1) and malignant hyperther-51 mia (MH), all of which are included in the American Quarter Horse Association 52 (AQHA) breed panel test (Valberg, 2020). The R309G GYS1 mutation causing PSSM1 53 is the most prevalent in QHs, with an allele frequency of 0.055 in the United States 54 (USA) (Tryon et al., 2009). 55 Recently, a codominant E321G mutation in the MYH1 gene encoding fast-twitch 56 type 2X myosin heavy chain has been identified in QHs; this mutation causes myosin 57 heavy chain myopathy (MYHM) (Finno et al., 2018; Valberg et al., 2018). Horses with 58 MYHM can present with nonexertional rhabdomyolysis or immune-mediated myositis 59 (IMM) characterized by acute muscle atrophy and lymphocytic infiltration into the my-60 ofibres (Lewis et al., 2007; Durward-Akhurst et al, 2016; Finno et al., 2018; Valberg et 61 al., 2018). The allele frequency of the E321G MYH1 mutation in the general QH popu-62 lation in the United States (US) is 0.034; however, frequencies vary among performance 63 horse disciplines, and the frequency is much higher in reining horses (Tryon et al., 64 2009). 65 To date, clinical cases of MYHM have not yet been reported in QHs in Brazil, although 66 reining is a very popular discipline. The purpose of the present study was to report the 67 presence of MYHM in two QH foals in Brazil and to evaluate the allele frequency of 68 28 E321G MYH1 in Brazilian QHs used in various disciplines (reining, barrel racing, hal-69 ter, cutting and racing). 70 71 Materials and Methods 72 This study was approved on July 10, 2019, by the Institutional Animal Care and 73 Use Committee (approval number 110/2019-CEUA-UNESP). 74 75 Clinical Cases: Two potential cases of MYHM on a stud farm in Brazil were investi-76 gated. Medical records, clinical signs, blood work and muscle histopathology were re-77 viewed when available. The foals (foals 1 and 2) and their healthy parents (horses 3 to 78 6) were genotyped for MYHM, PSSM1 and MH, as described previously or detailed 79 below (Delfiol et al., 2018). Histopathological analysis of skeletal and cardiac muscle 80 (foal 1) was performed with formalin-fixed paraffin-embedded tissue stained with hae-81 matoxylin and eosin, periodic acid Schiff (PAS), and amylase-PAS. 82 83 MYH1 Allele Frequencies: To estimate the allele frequency of the E321G MYH1 vari-84 ant in Brazilian QHs, DNA samples from a total of 299 elite performance QHs were 85 obtained from the Laboratory of Molecular Biology of the Veterinary Clinic (LBMCV) 86 of the São Paulo State University (UNESP), School of Veterinary Medicine and Animal 87 Science Botucatu/Brazil database. All horses were registered with the Brazilian Associ-88 ation of Quarter Horse Breeders (ABQM), and at the time of collection, they were com-89 peting or had already competed in official ABQM events. The blood samples, which 90 were collected from 2010 to 2014, were from 299 horses located at 30 stud farms or 91 equine training centres (10 specializing in reining; 6 specializing in halter; 5 specializ-92 ing in barrel racing; 5 specializing in cutting farms; and 4 specializing in racing). 93 29 94 Genotyping: PCR was performed with specific primers (JPOF_MYH1F1, 5’-95 CCAGCTAAAGGCGGAAAGAA-3’, and JPOF_MYH1R1, 5’-96 GGGCAGAGTAGGAGTGAGTAA-3’) that amplified the E321G mutation region in 97 the MYH1 gene (Finno et al. 2018). The PCR products (713 bp) were purified and sub-98 jected to Sanger sequencing. For validation, genotypes for 10 DNA samples from 99 MYH1 heterozygotes and 20 from wild-type horses were genotyped at the Veterinary 100 Genetics Laboratory at the University of California Davis (VGL-UC Davis). The geno-101 types for PSSM1 and RYR1 had previously been analysed and were collated for this 102 performance horse subset (Delfiol et al., 2018). 103 Pedigrees from horses with the MYH1 variant were obtained from ABQM data 104 and analysed using Pedigraph (Garbe and Da, 2008). Seven generations of ancestors of 105 the affected animals were considered during the construction and analysis of the pedi-106 grees. 107 108 Statistical analysis: The allele frequency and standard error for each competitive disci-109 pline were estimated as previously described (Delfiol et al., 2018). Chi-square tests 110 were performed using GraphPad Prism 7 software to compare the prevalence of the 111 E321G MYH1 mutation stratified by sex and performance discipline. Significance was 112 set at P<0.05. 113 114 Results 115 Clinical cases: Two QH foals with potential cases of MYHM were reported within a 116 14-month period on the same stud farm. 117 30 Foal 1 was a 9-month-old colt that developed acute onset stiffness, excessive sweating, 118 muscle tremors, reluctance to move, well-defined contracted musculature, a fever of 119 40.5°C, acute severe atrophy of the gluteal and epaxial muscles, severe muscle stiffness 120 and limb spasticity, decubitus and difficulty standing up. The colt’s serum creatine k i-121 nase (CK) activity was increased at 8,000 U/L (reference range reference 119–287 U/L) 122 (Kaneko et al., 2008). Neither myoglobinuria nor signs of concurrent respiratory disease 123 were observed. The foal was treated with dexamethasone (0.1 mg/kg bodyweight), a 124 muscle relaxant (thiocolchicoside, 0.04 mg/kg bodyweight), selenium-vitamin E, and 125 fluid therapy. Despite treatment, foal 1 clinically deteriorated (8th day), developing se-126 vere atrophy of the gluteal and epaxial muscles, severe muscle stiffness and limb spas-127 ticity, and difficulty standing up, which progressed to decubitus and, ultimately, death. 128 Foal 2 was a 11-month-old filly that had clinical signs compatible with nonexertional 129 rhabdomyolysis, characterized by the acute onset of limb spasticity, muscle tremors, 130 reluctance to move, and a fever of 40.5°C. The CK level was 6,500 U/L, with myoglo-131 binuria. Signs of concurrent respiratory disease were not observed. The foal improved 132 clinically after being treated in the same way as foal 1, and on day 40, the foal appeared 133 to be clinically normal. 134 Samples of the semimembranosus and semitendinosus muscle of foal 1 were obtained 135 after death. There was marked myocyte necrosis characterized by the loss of cross stria-136 tions and hypereosinophilia, in addition to some fibres showing flocculant cytoplasm 137 and some mineralization (Fig. 1A and B). Both muscle samples contained diffuse mod-138 erate-to-severe inflammatory infiltrates composed of lymphocytes and macrophages, in 139 addition to rare neutrophils and multinucleated giant cells. (Fig. 1A and B). There was 140 mild regeneration of the muscle fibres. PAS and amylase-PAS stains showed normal 141 glycogen. Microscopic lesions were not observed in the heart. 142 31 Neither the foals nor their parents possessed the GYS1 mutation for PSSM1 nor the 143 RYR1 mutation for MH, however, both foals and their sires (horses 3 and 6) were heter-144 ozygous for the E321G MYH1 variant, while their dams (horses 4 and 5) were homozy-145 gous wild-type (Fig. 1C). Pedigree analysis determined that the two foals were related: 146 the sire of foal 1 was the grandsire of foal 2 (Fig. 1D). 147 148 MYH1 allele frequency. A total of 299 elite performance QH DNA samples obtained 149 between 2010 and 2014 were used in the present study. At the time of sampling, the 150 horses (197 females and 102 males) were healthy, with a mean age of 8.8 ± 5.7 (SD) 151 years. In total, 14.7% (44/299) were E321G MYH1 heterozygotes (My/N), 0% (0/299) 152 were homozygotes (My/My), and 85.3% (255/299) were wild-type homozygotes (N/N). 153 The overall allele frequency of the E321G MYH1 was 0.074 (Table 1). The allele fre-154 quency and prevalence of the E321G MYH1 was the highest in the horses involved in 155 reining (21.9%, 34/155), followed by those in the barrel racing (10%, 4/40), cutting 156 (6.1%, 2/33), racing (5.7%, 2/35), and halter (5.6%, 2/36) disciplines (Table 1). The 157 allele frequency of MYH1 heterozygotes was significantly higher in reining QHs than 158 QHs in other disciplines (P=0.008). There was no significant difference in the distribu-159 tion of the E321G MYH1 mutation between males (17.6%, 18/102) and females (13.2%, 160 26/197), (P=0.3875). The results of the genotyping validation performed at the VGL – 161 UC Davis confirmed the genotypes obtained by LBMCV. 162 The prevalence of the PSSM1 mutation was 3.9% in reining QHs (6/155) and 36% in 163 halter QHs (13/36), with a total allele frequency of 0.032 (19/299). Out of 44 E321G 164 MYH1 heterozygous QHs, two were heterozygous for the PSSM1 mutation, and none 165 possessed a MH mutant allele (Delfiol et al., 2018). 166 167 32 Pedigree analysis: All E321G MYH1 heterozygous QHs with an available pedigree 168 (30/44) could be traced back to a common sire within four to nine generations (Fig. S1). 169 Two stallions were present in the pedigrees of 27 of the 30 QHs and another stallion 170 was present in the pedigrees of 26 of the 30 QHs. The average inbreeding coefficient 171 was generated after the construction and analysis of the 30 affected horses’ pedigrees, 172 and it was found to be 0.006 (smallest non-zero: 0.0001; maximum: 0.31) in the QH 173 population. 174 175 Discussion 176 In the present study, the prevalence and allele frequency of the E321G MYH1 variant 177 was investigated in a group of 299 elite performance QHs in Brazil using DNA from the 178 LBMCV stock. The allele frequency of the E321G MYH1 variant in QHs in Brazil was 179 estimated to be 0.074, which was twice as high as the frequency observed in 146 ran-180 domly selected QHs in the USA and Canada (0.034) but similar to that observed in elite 181 performance QHs in the USA (0.049) (Gianino et al., 2018). As observed for MYH1, the 182 frequencies of alleles involved in other genetic diseases, i.e., hereditary equine regional 183 dermal asthenia (HERDA), hyperkalaemic periodic paralysis (HYPP), glycogen-184 branching enzyme deficiency (GBED), and PSSM1, in Brazilian QHs (Badial et al., 185 2014; Delfiol et al., 2015; Araujo et al., 2018; Delfiol et al., 2018) are also close to 186 those found in American QHs (Tryon et al. 2009). The similarity in the allele frequen-187 cies of these mutations may be due to the fact that Brazilian QHs are often closely relat-188 ed to American QHs (Leite et al., 2019). 189 In the present study, the highest allele frequency was observed in reining QHs (0.110, 190 n=155), which was similar to the result reported in the USA (reining QHs 0.135, n=37) 191 (Gianino et al., 2018). In the Brazilian QHs, the MYH1 mutation was also observed in 192 33 other QHs in other disciplines, i.e., barrel racing (0.050, n=40), cutting (0.030, n=33), 193 racing (0.029, n=35), and halter (0.028, n=63); however, the frequencies in the QHs in 194 those disciplines were significantly lower than that in reining QHs (P=0.008). Among 195 the elite performance QHs assessed in the USA, the E321G MYH1 variant was also ob-196 served in halter and cutting QHs but was not observed in elite barrel racing and racing 197 QH stallions (Gianino et al., 2018). 198 Gianino et al. (2018) compared the frequency of the E321G MYH1 variant in the gen-199 eral QH population (0.034) with the frequencies of alleles involved in important genetic 200 diseases in QHs and found that the frequency of the E321G MYH1 variant in the general 201 QH population was slightly higher than the reported whole-breed estimates of allele 202 frequencies for HyPP (0.008) and HERDA (0.021) but lower than those for PSSM1 203 (0.055) and GBED (0.054) (Tryon et al., 2009). However, in the Brazilian QHs, the 204 frequency of the E321G MYH1 (0.074) variant was higher than the frequencies of al-205 leles involved in other genetic diseases, i.e., HERDA (0.029) (Badial et al., 2014), and 206 HyPP (0.021) (Delfiol et al., 2015), GBED (0.054) (Araujo et al., 2018), and PSSM1 207 (0.034) (Delfiol et al., 2018). 208 It is important to note that the sample population in Brazil was not random and that 209 more reining QHs were evaluated in the present study than in other studies. This may 210 have contributed to the higher prevalence of the MYH1 mutation. The most likely ex-211 planation for the higher allele frequency of E321G MYH1 in Brazilian reining QHs than 212 in QHs in other disciplines is that there is substantial consanguinity in Brazilian QHs. 213 The use of popular sires within performance groups can result in the inadvertent con-214 centration of deleterious genetic traits or the hitch-hiking of deleterious traits with per-215 formance-enhancing traits. All heterozygous animals with available pedigrees (n=30) in 216 the present study could be traced back to a common sire. Three other stallions were 217 34 overrepresented in the pedigrees, with two stallions present in the pedigrees of 27 of the 218 30 horses and one stallion present in the pedigrees of 26 of the 30 QHs. 219 In the present study, we definitively identified IMM in one Brazilian foal through histo-220 pathology and genetic testing, and the likelihood of the second foal on the same stud 221 farm having the same diagnosis was high, according to the clinical signs, relatedness 222 and genetic testing. These appear to be the first two cases of MYHM associated with the 223 E321G MYH1 variant reported in QHs in Brazil. Despite the high allele frequency of 224 MYH1, the disease may not yet be recognized and properly diagnosed in Brazil. 225 The percentage of horses with the MYH1 mutation that go on to develop nonexertional 226 rhabdomyolysis or muscle atrophy is unknown at this time. The samples used in our 227 study were previously collected from healthy horses by our research group to assess the 228 prevalence of other genetic mutations (Badial et al., 2014; Delfiol et al., 2015; Araujo et 229 al., 2018; Delfiol et al., 2018; Leite et al., 2019). We were, therefore, unable to associate 230 the presence of the mutated MYH1 allele with the occurrence of MYHM. Clinical signs 231 of MYHM appear to be dependent upon both a genetic predisposition and environmen-232 tal stimuli. In 39% of IMM cases, the affected horses had a history of infection with 233 Streptococcus spp. or vaccination against Streptococcus equi subsp. equi (Lewis et al., 234 2007; Finno et al., 2018). Another study implicated Corynebacterium pseudotuberculo-235 sis, Anaplasma phagocytophilum, equine herpes virus 1 [EHV1], and equine influenza 236 virus and other antigens contained in influenza and EHV1 vaccines as potential trigger-237 ing factors (Hunyadi et al., 2017). In the present study, we were unable to accurately 238 identify the trigger of rhabdomyolysis in the two foals, and in these two cases, rhabdo-239 myolysis was not associated with exercise. 240 In conclusion, there is a high prevalence of the E321G MYH1 mutation in Brazilian 241 QHs, especially in those used for reining, and clinical cases of MYHM have now been 242 35 documented in Brazil. Breeders and owners in Brazil need to be aware of the clinical 243 signs of MYHM, including severe nonexertional rhabdomyolysis and acute muscle at-244 rophy, and use genetic testing not only to achieve a diagnosis but also to inform appro-245 priate breeding strategies. 246 247 Conflict of interest statement 248 None of the authors of this paper has a financial or personal relationship with 249 other people or organisations that could inappropriately influence or bias the content of 250 the paper. 251 252 Acknowledgements 253 This study was carried out at the São Paulo State University (UNESP), in part as 254 fulfilment of the Master of Science thesis of ALHA at São Paulo State University 255 (UNESP), Brazil. 256 257 References 258 Araujo, C.E., Delfiol, D.J., Badial, P.R., Oliveira-Filho, J.P., Araujo-Junior, J.P., 259 Borges, A.S., 2018. Prevalence of the glycogen branching enzyme deficiency 260 mutation in Quarter Horses in Brazil. 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Veterinary Clinics of North 310 America: Equine Practice 36, 353-378. 311 38 312 39 Figure Legends 313 314 Fig. 1. A Moderate diffuse inflammatory infiltrates and myocyte necrosis in the semi-315 membranosus muscle of foal 1 (H&E bar=200 µm). B.; Infiltrates of lymphocytes and 316 macrophages surrounding and within myocytes (H&E bar=50 µm). C, partial chroma-317 togram showing capillary sequencing results for homozygous (top) and heterozygous 318 (bottom) alleles of the E321G MYH1 variant in mare and foal 1, respectively. Wild-type 319 allele adenine (A, green arrow) and the respective amino acid glutamic acid (E) and 320 double peaks (adenine/guanine) are observed (red arrow); in addition, note the amino 321 acid glutamic acid (E) in heterozygous horses. Images were obtained using Geneious® 322 10.0 software. D, pedigree of MYHM-affected foals 1 and 2. Horses 1 to 6 were geno-323 typed for the E321G MYH1 variant in the present study, and the other genotype infor-324 mation was obtained from the AQHA stud book. Circles = females, squares = males. 325 Black shape = My/My genotype. Black/White shape = My/N genotype. White shape = 326 N/N genotype. Grey shape = unknown genotype. 327 328 Fig. S1. Pedigree analysis of the 30 MYH1 heterozygous (My/N) quarter horses (green 329 shape) obtained in Pedigraph (Garbe & Ya 2008). All affected horses could be traced 330 back to a common sire, A281 (red arrow), within four to nine generations. Circles = 331 females, squares =males. 332 333 40 Table 1. Genotype prevalence and allele frequency (estimated value ± SE) of the E321G MYH1 variant in Brazilian Quarter horses. Discipline Sample size Genotype Brazil allele fre- quency US allele frequen- cy¹ N/N My/N My/My Reining 155 121 34 0 0.110 ± 0.018 0.135 ± 0.040 Barrel racing 40 36 4 0 0.050 ± 0.024 0 Cutting 33 31 2 0 0.030 ± 0.021 0.044 ± 0.023 Racing 35 33 2 0 0.029 ± 0.020 0 Halter 36 34 2 0 0.028 ± 0.019 0.080 ± 0.027 Total 299 255 44 0 0.074 ± 0.011 0.050 ± 0.009 ¹ Data previously published by Gianino et al. 2018. 41 Fig. 1. 40 Fig S1. 41 Considerações Finais Foram identificados 44 animais heterozigotos, totalizando a frequência alélica de 0,074 ± 0,011, superior à encontrada nos Estados Unidos. Diante deste resultado, concluímos que a mutação está presente no Quarto de Milha do Brasil e IMM deve ser diagnóstico diferencial na ocorrência de rabdomiólise. A maior frequência da mutação foi encontrada na linhagem de rédeas, assim como nos EUA, de onde importamos muitos animais (ABQM). Tratando-se de mutação dominante, é ainda maior a importância de diagnóstico precoce afim de identificar animais heterozigotos da reprodução equina e evitar a reprodução indiscriminada (inbreeding) que pode levar a animais afetados. Por conseguin- te, diante das frequências alélica expostas, é interessante a disponibilidade de teste genético para IMM no Brasil. 42 Normas para a submissão da revista “The Veterinary Journal” Guide for Authors Download Guide for Authors in PDF Aims and scope INTRODUCTION • Types of paper • Model Article Examples • Reporting Standards • Submission checklist source • Copyright • Role of the funding • Open access PREPARATION • Peer review • Use of Word Processing • Artwork • Tables • References • Supplementary material • Research data BEFORE YOU BEGIN • Ethics in publishing • Animal welfare • Declaration of interest • Submission declaration and verification • Use of inclusive language • Changes to authorship Software • Article structure • Essential title page information • Highlights • Abstract • Highlights • Nomenclature and Units AFTER ACCEPTANCE • Online proof correction • Offprints AUTHOR INQUIRIES • Appendix The Veterinary Journal (established 1875) is an international journal of veterinary re- search that publishes original papers and reviews on all aspects of veterinary science. Contributions reporting investigative work in the scientific disciplines involving veter- inary species are particularly welcome where they make a significant contribution to the field. The Editors will be pleased to consider suggestions for Special Issues on sub- jects of topical importance. The journal also publishes Guest Editorials and occasional- ly Personal Views by invitation, but does not have a Letters section. Book Reviews are published on-line. Articles of purely regional significance and studies of non-domestic species are considered only if they clearly have broader scientific importance. Manu- scripts that report novel studies with substantial importance to the profession are pre- ferred, including analytical studies that are relevant to practising veterinarians. Types of paper Manuscripts may describe original work in a Full Paper (Original Article) or a Short Communication, or may form a Review of the existing state of knowledge on a particu- lar aspect of veterinary science. Reviews should, in general, be written in support of original investigations. Case Reports are not published. 43 Model Article Examples Model article formats in WORD are available (click to follow link below as appropriate):  Original Article  Short Communication  Review  Guest Editorial  Viewpoint  Book Review Reporting Standards The Editors and reviewers use several published guidelines for reporting standards (see Appendix below). Conforming to these reporting standards allows the Editors and re- viewers to assess the quality and originality of submissions and offers readers suffi- cient information to judge the relevance of the work in an appropriate context. Omission of requirements specified in the relevant guidelines for reporting standards may lead to rejection of a manuscript. For further information, please see The Veter- inary Journal (2010) 184, 249-250 (view article). Submission checklist You can use this list to carry out a final check of your submission before you send it to the journal for review. Please check the relevant section in this Guide for Authors for more details. Ensure that the following items are present: One author has been designated as the corresponding author with contact details: • E-mail address • Full postal address All necessary files have been uploaded: Manuscript: • Include keywords • All figures (include relevant captions) • All tables (including titles, description, footnotes) • Ensure all figure and table citations in the text match the files provided • Indicate clearly if color should be used for any figures in print Graphical Abstracts / Highlights files (where applicable) Sup- plemental files (where applicable) Further considerations • Manuscript has been 'spell checked' and 'grammar checked' • All references mentioned in the Reference List are cited in the text, and vice versa • Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources (including the Internet) • A competing interests statement is provided, even if the authors have no competing 44 interests to declare • Journal policies detailed in this guide have been reviewed • Referee suggestions and contact details provided, based on journal requirements For further information, visit our Support Center. Ethics in publishing Please see our information pages on Ethics in publishing and Ethical guidelines for journal publication. Animal welfare Where animals have been used in a study, the institutional ethical or animal welfare Authority under which the work was conducted must be stated, along with the specific authorisation reference number and the date of approval. Such studies must meet An- imals in Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) guidelines (view arti- cle). Studies published in The Veterinary Journal must adhere to the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) hu- mane endpoints in animal experimentation. Please see their website for further infor- mation: https://www.nc3rs.org.uk/humane-endpoints For manuscripts reporting experimental models that induce disease, please pro- vide full details of rescue protocols, welfare/pain/health monitoring protocols, and an- imal welfare end points set a priori for withdrawal from the study. Additionally, please provide evidence that these protocols were approved before the study com- menced. Also, provide full details of the fate of each animal in the study, including those that were withdrawn because they reached animal welfare endpoints set a priori. If you are unable to provide this information, including all specific details, your manu- script will be rejected. Declaration of interest All authors must disclose any financial and personal relationships with other people or organizations that could inappropriately influence (bias) their work. Examples of poten- tial competing interests include employment, consultancies, stock ownership, honoraria, paid expert testimony, patent applications/registrations, and grants or other funding. Au- thors must disclose any interests in two places: 1. A summary declaration of interest statement in the title page file (if double-blind) or the manuscript file (if single- blind). If there are no interests to declare then please state this: 'Declarations of interest: none'. This summary statement will be ultimately published if the article is accepted. 2. De- tailed disclosures as part of a separate Declaration of Interest form, which forms part of the journal's official records. It is important for potential interests to be declared in both places and that the information matches. More information. http://www.nc3rs.org.uk/humane-endpoints 45 Submission declaration and verification Submission of an article implies that the work described has not been published previ- ously (except in the form of an abstract, a published lecture or academic thesis, see 'Multiple, redundant or concurrent publication' for more information), that it is not un- der consideration for publication elsewhere, that its publication is approved by all au- thors and tacitly or explicitly by the responsible authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be published elsewhere in the same form, in Eng- lish or in any other language, including electronically without the written consent of the copyright-holder. To verify originality, your article may be checked by the originality detection service Crossref Similarity Check. If the work has been published previously (as a published lecture, academic thesis or electronic preprint), the authors must declare this information on initial submission. Preprints Please note that preprints can be shared anywhere at any time, in line with Elsevier's sharing policy. Sharing your preprints e.g. on a preprint server will not count as prior publication (see 'Multiple, redundant or concurrent publication' for more in- formation). Use of inclusive language Inclusive language acknowledges diversity, conveys respect to all people, is sensitive to differences, and promotes equal opportunities. Articles should make no assumptions about the beliefs or commitments of any reader, should contain nothing which might imply that one individual is superior to another on the grounds of race, sex, culture or any other characteristic, and should use inclusive language throughout. Authors should ensure that writing is free from bias, for instance by using 'he or she', 'his/her' instead of 'he' or 'his', and by making use of job titles that are free of stereotyping (e.g. 'chairper- son' instead of 'chairman' and 'flight attendant' instead of 'stewardess'). Changes to authorship Authors are expected to consider carefully the list and order of authors before submitting their manuscript and provide the definitive list of authors at the time of the original submission. Any addition, deletion or rearrangement of author names in the authorship list should be made only before the manuscript has been ac- cepted and only if approved by the journal Editor. To request such a change, the Editor must receive the following from the corresponding author: (a) the reason for the change in author list and (b) written confirmation (e-mail, letter) from all authors that they agree with the addition, removal or rearrangement. In the case of addition or re- moval of authors, this includes confirmation from the author being added or removed. Only in exceptional circumstances will the Editor consider the addition, deletion or rear- rangement of authors after the manuscript has been accepted. While the Editor consid- ers the request, publication of the manuscript will be suspended. If the manuscript has already been published in an online issue, any requests approved by the Editor will re- sult in a corrigendum. 46 Article transfer service This journal is part of our Article Transfer Service. This means that if the Editor feels your article is more suitable in one of our other participating journals, then you may be asked to consider transferring the article to one of those. If you agree, your article will be transferred automatically on your behalf with no need to reformat. Please note that your article will be reviewed again by the new journal. More information. Copyright Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete a 'Journal Publishing Agreement' (see more information on this). An e-mail will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript together with a 'Journal Publishing Agreement' form or a link to the online version of this agreement. Subscribers may reproduce tables of contents or prepare lists of articles includ- ing abstracts for internal circulation within their institutions. Permission of the Pub- lisher is required for resale or distribution outside the institution and for all other de- rivative works, including compilations and translations. If excerpts from other copy- righted works are included, the author(s) must obtain written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article. Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases. For gold open access articles: Upon acceptance of an article, authors will be asked to complete an 'Exclusive License Agreement' (more information). Permitted third party reuse of gold open access articles is determined by the author's choice of user license. Author rights As an author you (or your employer or institution) have certain rights to reuse your work. More information. Elsevier supports responsible sharing Find out how you can share your research published in Elsevier journals. Role of the funding source You are requested to identify who provided financial support for the conduct of the re- search and/or preparation of the article and to briefly describe the role of the spon- sor(s), if any, in study design; in the collection, analysis and interpretation of data; in the writing of the report; and in the decision to submit the article for publication. If the funding source(s) had no such involvement then this should be stated. Open access Please visit our Open Access page from the Journal Homepage for more information. Elsevier Researcher Academy Researcher Academy is a free e-learning platform designed to support early and mid- career researchers throughout their research journey. The "Learn" environment at Re- searcher Academy offers several interactive modules, webinars, downloadable guides 47 and resources to guide you through the process of writing for research and going through peer review. Feel free to use these free resources to improve your submission and navigate the publication process with ease. Language (usage and editing services) Please write your text in good English (British usage is preferred, North American au- thors may use American English). Authors who feel their English language manuscript may require editing to eliminate possible grammatical or spelling errors and to conform to correct scientific English may wish to use the English Language Editing service available from Elsevier's WebShop. Please note that there are a number of commercial organisations that will assist non- English speaking Authors in preparing their manuscripts for publication in international peer-reviewed journals. Further advice is available from Elsevier at https://www.elsevier.com/locate/languagepolishing . Some such services only offer help to improve the use of English and it remains the Authors responsibility to ensure that TVJ's layout and formatting requirements are also met. Our online submission system guides you stepwise through the process of entering your article details and uploading your files. The system converts your article files to a single PDF file used in the peer-review process. Editable files (e.g. Word) are required to typeset your article for final publication. All correspondence, including notification of the Editor's decision and requests for revision, is sent by e-mail. Options will be given for Authors to select a set of classifications for their papers, as well as a category designation (Original Article, Review, Short Com- munication etc.), from a given list. Authors must submit articles in WORD format and not as PDF files. PDF proofs will be automatically generated from uploaded files and these are used for subsequent reviewing. For queries concerning the submission process or journal procedures please visit the Elsevier Support Center. The Corresponding Author, who is normally the Author submitting the paper, will be asked to confirm that the article is original and is not being considered for peer- reviewed publication elsewhere. Submission also implies that all of the Authors have approved the paper for release and are in agreement with its content. Upon acceptance of the article by The Veterinary Journal, the Author(s) will be asked to transfer the copyright of the article to the Publisher. This transfer will ensure the widest possible dissemination of information. The Corresponding Author will also be required to confirm that all Authors have made substantial contributions to (1) the conception and design of the study or acquisi- tion of data or analysis and interpretation of data, (2) drafting the article or revising it critically for important intellectual content, and (3) final approval of the version to be submitted. Contributors who do not meet these criteria for authorship should be listed in an Acknowledgements section. Examples of those who might be acknowledged include a person who provided purely technical help, writing assistance, or a Departmental Chair who gave general support. http://www.elsevier.com/locate/languagepolishing http://www.elsevier.com/locate/languagepolishing 48 Authors are free to recommend 3-5 potential reviewers (although there is no guarantee they will be used for peer review). Submit your article Please submit your article via ees.elsevier.com/ytvjl. Peer review This journal operates a single blind review process. All contributions will be initially assessed by the editor for suitability for the journal. Papers deemed suitable are then typically sent to a minimum of two independent expert reviewers to assess the scientific quality of the paper. The Editor is responsible for the final decision regarding ac- ceptance or rejection of articles. The Editor's decision is final. More information on types of peer review. If possible authors are asked to refrain from sending email chasers to the journal asking about the status of their paper under review. The Editors aim to review your paper as efficiently as possible and the enquiry is unlikely to speed up the process. Use of Word Processing Software It is important that the file be saved in the native format of the word processor used. The text should be in single-column format. Keep the layout of the text as simple as possi- ble. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the article. In particular, do not use the word processor's options to justify text or to hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc. When preparing tables, please use a table grid, (however use only one grid for each individual table and not a grid for each row). The electronic text should be prepared in a way very similar to that of conventional manuscripts (see also the Guide to Publishing with Elsevier: https://www.elsevier.com/guidepublication). Note that source files of figures, tables and text graphics will be required whether or not you embed your figures in the text. See also the section on Electronic artwork. To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the 'spell-check' and 'grammar-check' functions of your word processor. Article structure Authors submitting papers that are suitable for consideration but do not comply fully with this Guide will be asked to amend the text and re-submit. Model article formats in WORD are available (click to follow link below as appropriate):  Original Article  Short Communication  Review  Guest Editorial  Personal View  Book Review http://www.elsevier.com/guidepublication) http://www.elsevier.com/guidepublication) 49 Original Articles should be no longer than 3,000 words in length, excluding the Title page, Abstract, Acknowledgements, Tables, Figures and References. Reviews should be about 4,000 words in length and Short Communications up to 1,000 words. Articles Original Articles (word limit 3,000 words) should be arranged as follows: (1) Title page; (2) an Abstract of up to 250 words (with no sub-headings), which should emphasise objectives, the experimental procedure, results and conclusions; up to fi