RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/03/2024. UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Anahi de Paula Melo Propriedades físico-químicas e atividade antimicrobiana de cimentos biocerâmicos associados ao Thyme Essencial Oil Araraquara 2022 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Anahi de Paula Melo Propriedades físico-químicas e atividade antimicrobiana de cimentos biocerâmicos associados ao Thyme Essencial Oil Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara para obtenção do título de Mestre em Odontologia, na Área de Endodontia. Orientadora: Profa. Dra. Juliane Maria Guerreiro-Tanomaru Araraquara 2022 Anahi de Paula Melo Propriedades físico-químicas e atividade antimicrobiana de cimentos biocerâmicos associados ao Thyme Essencial Oil Comissão Julgadora Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Odontologia Presidente e orientadora: Profa. Dra. Juliane Maria Guerreiro-Tanomaru 2° Examinadora: Profa. Dra. Roberta Bosso Martelo 3° Examinador: Prof. Dr. Rogério de Castilho Jacinto Araraquara, 28 de março de 2022. //DADOS CURRICULARES Anahi de Paula Melo NASCIMENTO 16/06/1993 – Uberlândia – Minas Gerais FILIAÇÃO Helton de Paula Melo Liliane Conceição de Melo 2015-2019 Graduação em Odontologia Universidade Federal de Uberlândia - UFU 2020-2022 Mestrado em Odontologia – Área de Endodontia Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP 2021-2023 Especialização em Endodontia Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP A Deus, Por minha vida, pela família, amigos e pessoas que colocou em meu caminho para me guiar e acompanhar. Por ter sempre me colocado nos lugares certos na hora certa, mostrando que seus planos são muito melhores do que eu poderia imaginar. Por me abençoar sempre, me dando forças para seguir e realizar minhas conquistas. A minha mãe, Por quem eu tenho profunda admiração. É para mim um exemplo de vida e de ser humano, que com todas as dificuldades que a vida lhe ofereceu fez o possível e o impossível para que eu estivesse aqui hoje. Eu não conheço palavras capazes de expressar a minha gratidão por tudo que fez e faz por mim, por sempre sonhar os meus sonhos comigo e fazer de tudo para que se tornem realidade. Este trabalho com toda certeza do mundo também é seu! Te amo sem medida. Ao Alaor, Por estar sempre ao meu lado me incentivando e aplaudindo as minhas vitórias. Por me fazer sentir amada como filha e não medir esforços para me auxiliar em tudo que é preciso sempre. Só tenho a agradecer por ser muito mais que meu pai de coração. Aos meu irmãos, Por todo amor dedicado a mim. Por entenderem meus momentos de ausência e vibrarem junto comigo em todas as etapas vencidas da vida. Por deixarem os meus dias mais leves quando nos reunimos, sempre me dando apoio e forças para seguir em frente. Ao Paulo, Meu parceiro de todos os momentos. Pelo incentivo e apoio incondicional, por me acalmar nos momentos mais difíceis e me fazer acreditar que sou capaz. Por enfrentar junto comigo todo esse ciclo que se encerra. Por me ensinar todos os dias sobre o amor por cuidar do próximo. Eu amo você! AGRADECIMENTOS A minha orientadora Professora Dra Juline Maria Guerreiro-Tanomaru, e ao Professor Dr. Mario Tanomaru-Filho, por esses anos de trabalho juntos, pela confiança depositada em mim, pela convivência harmoniosa e pelo conhecimento compartilhado. Ao meu amigo Danilo, que me acompanha desde a graduação, com quem eu venho dividindo diversos momentos da minha vida a 7 anos. Só tenho a agradecer pela convivência harmoniosa durante a nossa estadia em Araraquara. Pelo suporte diário, que com certeza foi extremamante importante para que eu suportasse a distância de casa. Aos amigos que o mestrado me deu, Larissa e Lucas, só tenho a agradecer por todos os momentos que vivemos juntos. Vocês deixaram meus dias mais leves e felizes durante a minha passagem por Araraquara. Com toda certeza vocês foram muito importantes para que eu conseguisse superar a saudade de casa. Eu levarei vocês para toda a minha vida. Aos meus outros colegas de pós, só tenho a agradecer pela convivência e pela nossa união. Embora tenhamos passado por um momento atípico de pandemia pudemos nos aproximar e estávamos sempre nos auxiliamos no que podíamos. Aos colegas do pós-doutorado e doutorado que estiveram me auxiliando durante todo o meu mestrado (Giselle, Fernanda, Jáder, Karina e Airton) só tenho agradecer por todo conhecimento compartilhado, todas as discussões sobre o trabalho e amparo durante todas as etapas. À CAPES: O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001. Melo AP. Propriedades físico-químicas e atividade antimicrobiana de cimentos biocerâmicos associados ao Thyme Essencial Oil [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2022. RESUMO Cimentos biocerâmicos reparadores e endodônticos com atividade antimicrobiana podem contribuir para o controle da infecção. O óleo essencial de tomilho, ou Thyme Essential Oil (TEO), é um extrato natural com propriedades antimicrobianas e anti- inflamatórias. Objetivo: Avaliar cimentos biocerâmicos reparadores e endodônticos associados ou não ao TEO. Publicação 1: Visa avaliar propriedades físico-químicas e antimicrobianas dos cimentos biocerâmicos reparadores pronto para uso Bio-C Repair (BCR, Angelus, Brasil) e pó/líquido NeoMTA 2 (NMTA2, Nusmile, EUA) e das suas associações ao TEO. Publicação 2: Visa avaliar propriedades físico-químicas e antimicrobianas dos cimentos endodônticos biocerâmicos pronto para uso Bio-C Sealer (BCS) e pó/líquido BioRoot RCS (BR) e das suas associações ao TEO. Metodologia: Tempo de presa foi avaliado de acordo com a ISO 6876:2012. O pH foi avaliado após imersão dos materiais em água destilada nos períodos de 1, 3, 7, 14 e 21 dias. Alteração volumétrica foi avaliada utilizando microtomografia computadorizada (micro-CT). A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo teste de contato direto modificado (TCDM) sobre biofilmes de E. faecalis formados sobre discos de hidroxiapatita. Os resultados foram submetidos a testes de normalidade seguido de ANOVA e Tukey (p < 0.05). Publicação 1 – Resultados: TEO não interferiu no tempo de presa, pH e alteração volumétrica dos cimentos (p > 0,05). Todos os materiais mostraram capacidade de alcalinização em relação ao controle (p < 0.05). BCR/TEO e NMTA2/TEO apresentaram melhor atividade antimicrobiana que BCR e NMTA2 contra E. faecalis (p < 0.05). Conclusão: A adição de Thyme Essential Oil melhorou significativamente a atividade antimicrobiana dos cimentos potencializando a atividade antimicrobiana sem modificar propriedades físico- químicas. Publicação 2 – Resultados: TEO não alterou o tempo de presa dos cimentos (p > 0,05). Todos os materiais mostraram capacidade de alcalinização nos períodos avaliados em relação ao controle (p < 0.05). BR/TEO mostrou menor alteração volumétrica que BR (p < 0.05). BCS/TEO e BR/TEO foram mais efetivos que BCS e BR sober biofilme de E. faecalis. Conclusão: A associação de Thyme Essential Oil aos materiais aumentou a efetividade dos materiais sobre biofilme de E. faecalis, representando uma alternativa para aumentar o potencial antimicrobiano. Palavras chave: Materiais Restauradores do Canal Radicular. Microtomografia por Raio-X. Calcarea Silicata. Óleos Voláteis. Anti-infecciosos. Melo AP. Physicochemical properties and antimicrobial activity of bioceramic cements associated with Thyme Essential Oil [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2022. ABSTRACT Restorative and endodontic bioceramic cements with antimicrobial activity can contribute to infection control. Thyme essential oil, or Thyme Essential Oil (TEO), is a natural extract with antimicrobial and anti-inflammatory properties. Objective: To evaluate repairing and endodontic bioceramic cements associated or not with TEO. Publication 1: Aims to evaluate physicochemical and antimicrobial properties of Bio- C Repair (BCR) and powder/liquid NeoMTA 2 (NMTA2) ready-to-use bioceramic repair cements and their associations with TEO. Publication 2: Aims to evaluate physicochemical and antimicrobial properties of Bio-C Sealer ready-to-use endodontic cements (BCS) and BioRoot RCS powder/liquid (BRT) and their associations with TEO. Methodology: Setting time was evaluated according to ISO 6876:2012. The pH was evaluated after immersion of the materials in distilled water in the periods of 1, 3, 7, 14 and 21 days. Volumetric change was assessed using micro-computed tomography (micro-CT). Antimicrobial activity was evaluated by the modified direct contact test (MDCT) on E. faecalis biofilms formed on hydroxyapatite discs. The results were submitted to normality tests followed by ANOVA and Tukey (P<0.05). Publication 1 – Results: TEO did not affect the setting time, pH and volumetric change of the cements (P>0.05). All materials showed alkalization capacity in relation to the control (P<0.05). BCR/TEO and NMTA2/TEO showed better antimicrobial activity than BCR and NMTA2 against E. faecalis (P< .05). Conclusion: The addition of Thyme Essential Oil significantly improved the antimicrobial activity of cements, enhancing the antimicrobial activity without modifying physicochemical properties. Publication 2 – Results: of TEO did not change the setting time of the cements (P>0.05). All materials showed alkalization capacity in the periods evaluated in relation to the control (P<0.05). BR/TEO showed less volumetric change than BR (P<0.05). BCS/TEO and BR/TEO were more effective than BCS and BR on E. faecalis biofilm. Conclusion: The association of Thyme Essential Oil to the materials increased the effectiveness of materials on E. faecalis biofilms, representing an alternative to increase the antimicrobial potential. Keywords: Root Canal Filling Materials. X-Ray Microtomography. Calcarea Silicata. Oils, Volatile. Anti-Infective Agents. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... ..8 2 PROPOSIÇÃO ............................................................................................ 11 2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 11 2.2 Objetivos Específicos ................................................................................ 11 3 PUBLICAÇÃO ........................................................................................... 12 3.1 Publicação 1 .............................................................................................. 12 3.2 Publicação 2 .............................................................................................. 27 4 DISCUSSAO ................................................................................................ 42 5 CONCLUSÃO .............................................................................................. 45 REFERÊNCIAS ........................................................................................... 46 APÊNDICE A ............................................................................................... 52 ANEXO A ..................................................................................................... 61 8 1 INTRODUÇÃO Biomateriais de silicatos de cálcio apresentam potencial bioativo1, promovendo reparação por tecido mineralizado após tratamento reparador ou tratamento endodôntico2. O Agregado Trióxido Mineral (MTA) foi o primeiro cimento reparador com silicatos de cálcio demonstrando potencial bioativo3. É composto por silicato tricálcico, silicato dicálcico, aluminato tricálcico entre outros óxidos minerais4. MTA demonstrou capacidade de estimular reparação do tecido pulpar e induzir a formação de dentina reparadora5,6, além de apresentar alguma atividade antimicrobiana pela liberação de íons cálcio e hidroxila7. Porém, a capacidade de alcalinização é limitada após seu processo de hidratação quando ocorre diminuição de seu potencial antimicrobiano8. Além disso, apresenta desvantagens como elevado tempo de presa e potencial de descoloração dentária8,9, levando ao desenvolvimento de novos materiais. Os cimentos à base de silicatos de cálcio demonstram propriedades biológicas adequadas10,11. São biocompatíveis, bioativos e não citotóxicos10, promovendo a formação de hidrato de silicato de cálcio e hidróxido de cálcio em contato com água12, propiciando selamento em ambientes úmidos ou contaminado com sangue13. Selamento de perfurações radiculares, capeamento pulpar, pulpotomias, apexificação, apicigênese e obturação retrógrada são algumas de suas indicações clínicas14. Bio-C Repair (Angelus, Paraná, Brasil) e NeoMTA 2 (Avalon Biomed, Houston, Estados Unidos) é um cimento biocerâmico reparador. É composto por silicatos de cálcio, aluminato de cálcio, óxido de cálcio e óxido de zircônio. Bio-C Repair apresenta bioatividade e potencial de mineralização15, além da capacidade de liberar íons hidroxila e cálcio16. Entretanto, ainda não há estudos que avaliaram a atividade antimicrobiana deste material. NeoMTA2 é um cimento à base de silicatos de cálcio, e um gel à base de água. Segundo o fabricante o NeoMTA2 apresenta partículas menores e maior radiopacidade. Este material é o sucessor do NeoMTA Plus, que apresenta formulação similar. NeoMTA Plus apresenta propriedades físico- químicas e biológicas adequadas17,18. Entretanto, não demonstra ação antimicrobiana efetiva contra biofilme de E. faecalis e C. albicans18. 9 NMTA2 demonstra ser citocompatível, bioativo e apresenta potencial de mineralização19. Ainda não existem estudos que avaliem as propriedades físico- químicas e antimicrobianas do NeoMTA 2. Além de propriedades físico-químicas adequadas, os cimentos obturadores de canal radicular devem apresentar atividade antimicrobiana20. BioRoot RCS (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, França) e Bio-C Sealer (Angelus, Paraná, Brasil) são cimentos obturadores à base de silicato tricálcico. BioRoot RCS é um cimento endodôntico pó-líquido composto por silicato tricálcico e óxido de zircônio. BioRoot RCS apresenta pH, tempo de presa, solubilidade e porosidade adequados, é capaz de promover a alcalinização do meio21. Também demonstra propriedades antimicrobianas22,23 e não induz citocinas pró-inflamatórias, além de apresentar citocompatibilidade24. Bio-C Sealer é um cimento pronto para uso a base de silicatos de cálcio, aluminato de cálcio, óxido de cálcio e óxido de zircônio, além do agente dispersante. Bio-C Sealer apresenta adequados valores de pH, tempo de presa, escoamento, radiopacidade e alteração volumétrica25. É um material biocompatível, apresenta potencial bioativo e favorece o reparo26. Além disso, apresenta atividade antimicrobiana contra E. faecalis devido ao seu potencial de alcalinização26. Cimentos à base de silicatos de cálcio apresentam propriedades antimicrobianas com efeito limitado, e menor ação sobre infecções persistentes20. A presença de microrganismos isolados ou em biofilme é a principal causa do insucesso do tratamento endodôntico27,28. Enterococcus faecalis é o microrganismo prevalente em infecções persistentes de canais radiculares tratados endodonticamente29,30. Mesmo diante da disponibilidade limitada de nutrientes, algumas bactérias podem permanecer no canal radicular após o preparo biomecânico31,32. Desta forma, a atividade antimicrobiana de materiais reparadores e cimentos endodônticos pode contribuir no controle destes microrganismos residuais33,34. A associação de agentes antimicrobianos aos materiais endodônticos pode melhorar seu efeito contra os microrganismos remanescentes. Algumas estratégias são utilizadas para melhorar a atividade antimicrobiana dos cimentos35-37. Dentre elas, a adição de clorexidina demonstrou melhora na atividade anitmicrobiana, em contrapartida, prejudicou a presa dos cimentos e aumentou citotoxicidade38-40. 10 Óleos essenciais (OEs) extraídos de plantas são estudados como agentes antimicrobianos, demonstrando efeito antimicrobiano, além de propriedades antifúngicas, anti-inflamatórias e antibacterianas41-44. O TEO é composto principalmente por Timol e Carvacrol. Apresenta controle efetivo em biofilme polimicrobiano composto por C. albicans com Staphylococcus aureus, E. faecalis, Streptococcus mutans ou Pseudomonas aeruginosa 42. A associação com substâncias pode alterar propriedades físico-químicas de materiais, o que torna necessário avaliar suas propriedades. A microtomografia computadorizada (micro-CT) é utilizada como ferramenta reprodutível e não destrutiva, fornecendo dados precisos para avaliação qualitativa e quantitativa. O micro-CT pode avaliar a alteração volumétrica de cimentos antes e após a imersão em fluído em diferentes intervalos de tempo45,46, proporcionando entendimento do comportamento tridimensional dos materiais em diferentes períodos de tempo47,48. Além da avaliação das propriedades físico-químicas, testes antimicrobianos são necessários para avaliar a atividade antimicrobiana dos cimentos. O teste de Contato Direto Modificado (TCDM) com biofilme apresenta grande relevância na avaliação desta propriedade49. É um método quantitativo e reprodutível que simula o contato direto dos microrganismos na forma de biofilme com cimentos endodônticos50,51. Os cimentos biocerâmicos TotalFill BC Sealer (FKG Dentaire SA, La Chaux-de-Fonds, Switzerland), Sealer Plus BC (MK Life, Porto Alegre, RS, Brasil) Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, França) e MTA Fillapex (Angelus, Paraná, Brasil) foram previamente avaliados pelo TCDM demonstrando boa atividade antimicrobiana51-53. A Endodontia busca maior potencial antimicrobiano dos cimentos reparadores e endodônticos. Há poucos relatos do uso de óleos essenciais associados aos cimentos endodônticos. Dessa forma, a associação do TEO a estes materiais pode ser uma alternativa, uma vez que já demonstrou atividade antimicrobiana contra microrganismos comumente encontrados nas infecções endodônticas. Também é necessária a avaliação das propriedades físico-químicas desta associação para possibilitar sua aplicação clínica adequada. 45 5 CONCLUSÃO Publicação 1 – A adição do Thyme Essential Oil não interfere no tempo de presa, pH e alteração volumétrica dos cimentos Bio-C Repair e NeoMTA2. Ainda, a associação ao Thyme Essential Oil promoveu maior atividade antimicrobiana contra E. faecalis. Publicação 2 – Considerando a metodologia utilizada, a adição de Thyme Essential Oil aos cimentos Bio-C Sealer e BioRoot RCS não interferiu no tempo de presa e pH, e reduziu a alteração volumétrica do BioRoot. A adição de Thyme Essential Oil aos cimentos aumentou a atividade antimicrobiana contra E. faecalis. 46 REFERÊNCIAS 1. Torabinejad M, Parirokh M, Dummer PMH. Mineral trioxide aggregate and other bioactive endodontic cements: an updated overview - part II: other clinical applications and complications. Int Endod J. 2018; 51(3): 284-317. 2. Parirokh M, Torabinejad M, Dummer PMH. 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The role of calcium ion release on biocompatibility and antimicrobial properties of hydraulic cements. Sci Rep. 2019; 9(1): 19019.  De acordo com o Guia de Trabalhos Acadêmicos da FOAr, adaptado das Normas Vancouver. Disponível no site da Biblioteca: http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao- atualizado.pdf. http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao-atualizado.pdf http://www.foar.unesp.br/Home/Biblioteca/guia-de-normalizacao-atualizado.pdf 47 13. Prati C, Gandolfi MG. Calcium silicate bioactive cements: biological perspectives and clinical applications. Dent Mater. 2015; 31(4): 351-70. 14. Parirokh M, Torabinejad M. Mineral trioxide aggregate: a comprehensive literature review-part III: clinical applications, drawbacks, and mechanism of action. J Endod. 2010; 36(3): 400-13. 15. Lopez-Garcia S, Lozano A, Garcia-Bernal D, Forner L, Llena C, Guerrero- Girones J et al. 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