ANÁLISE DE GENOTOXICIDADE: OTIMIZAÇÃO DE MÉTODO LABORATORIAL E AVALIAÇÃO EM RECÉM-NASCIDOS DE MÃES COM RESTRIÇÃO DE CRESCIMENTO INTRAUTERINO EXERCITADAS DURANTE A PRENHEZ ALINE DE OLIVEIRA NETTO Botucatu 2013 ALINE DE OLIVEIRA NETTO ANÁLISE DE GENOTOXICIDADE: OTIMIZAÇÃO DE MÉTODO LABORATORIAL E AVALIAÇÃO EM RECÉM-NASCIDOS DE MÃES COM RESTRIÇÃO DE CRESCIMENTO INTRAUTERINO EXERCITADAS DURANTE A PRENHEZ Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina de Botucatu – Unesp, Programa de Pós-Graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia. Área de concentração: Tocoginecologia, para obtenção do título de Mestre. Orientadora: Profa. Dra. Débora Cristina Damasceno Botucatu 2013 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSANGELA APARECIDA LOBO Netto, Aline de Oliveira. Análise de genotoxicidade: otimização de método laboratorial e avaliação em recém-nascidos de mães com restrição de crescimento intrauterino exercitadas durante a prenhez. / Aline de Oliveira Netto. – Botucatu : [s.n.], 2013 Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Débora Cristina Damasceno Capes: 40101150 1. Toxicologia genética. 2. Útero - Crescimento. 3. Natação. 4. Rato como animal de laboratório. Palavras-chave: Exercício (natação), Genotoxicidade, Rata, Restrição de crescimento intrauterino. “A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.” (Arthur Schopenhauer) Dedicatória A Deus pelo dom da vida. Por estar comigo em todos os momentos e não me deixar desistir quando já achava que não conseguiria. Por estar ao meu lado, me dar força para superar as dificuldades, e me permitir a graça de poder estudar. “Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não temerei mal algum porque tu estás comigo, a tua vara e o teu cajado me consolam” (Salmos 23:4) http://www.webfrases.com/ver_frase.php?id_frase=eae1fac4 http://www.webfrases.com/ver_frase.php?id_frase=eae1fac4 Aos meus pais, Antônio Roberto Netto e Magali Ap. de Oliveira Netto. Sou eternamente grata por toda a dedicação, por todo esforço realizado para minha educação, pelas lições de vida, coragem, dignidade, honestidade e fé. Sempre ao meu lado, me apoiando e dando forças para não desistir. Agradeço a Deus por me permitir mais um dia de vida ao lado de vocês. Amo vocês! “Enquanto houver você do outro lado, aqui do outro eu consigo me orientar....Só enquanto eu respirar, vou me lembrar de você, só enquanto eu respirar” (Fernando Anitelli) A minha irmã querida Talita de Oliveira Netto por tudo que vivemos juntas, o carinho, a cumplicidade e o amor partilhado. Aprendemos muito juntas e que Deus permita nossa união sempre. Obrigada por existir na minha vida, minha jóia rara. Amo você! “Entender o verdadeiro sentido das coisas, é querer saber demais, querer saber demais...” (O Teatro Mágico) Agradecimentos A Profa. Dra. Débora Cristina Damasceno, que não tenho palavras para expressar o quanto sou grata por todos seus ensinamentos e toda sua dedicação. Tenho como orientadora e amiga, agradeço a Deus por ter colocado em minha vida uma pessoa tão maravilhosa, que ás vezes parece que não existe. Exemplo de professora, mãe e esposa, se eu for metade do que você é, serei muito feliz. Sem você eu não conseguiria, obrigada pelas lições de vida, no campo profissional e pessoal, sempre disposta e encantando na arte de ensinar. Muito Obrigada! “Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina” (Cora Carolina) Ao meu namorado Wilson Roberto Alves por estar ao meu lado em todos os momentos, me apoiando e não me deixando desanimar. Meu amor, amigo e companheiro, que Deus continue abençoando nosso relacionamento, sou profundamente grata por existir na minha vida! Amo você! “Queria saber voar Pra lá do alto poder ver você Te ver sorrir, te ver sonhar Coisas lindas quero te dizer se um anjo encontrar Eu vou pedir pra ele te proteger Ó estrela que me faz enxergar Que a vida é linda de viver” (Chimarruts) Aos amigos do Laboratório de Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetricia: Aline Bueno, Bruna Dallaqua, Edlaine Cristina de Lego, Daniele Pereira dos Santos, Felipe Hiroshi Saito, Fernanda Piculo, Franciane Quintanilha Gallego, Gabriela Marini, Glilciane Morceli, Gustavo Tadeu Volpato, Isabela L. Iessi, Joice Monaliza Vernini, Kleber Eduardo Campos, Mikaela da Silva Correa, Rafael Gelaleti, Rebeca Germano Serrano, Thais Tiemi Sato e Yuri Karen Sinzato, pela alegre convivência e ajuda durante os dois anos de mestrado que foram essenciais para o desenvolvimento deste trabalho. Muito obrigada! À Silvana Barroso Corvino, primeiramente pela linda amizade, momentos inesquecíveis, companhia para todas as horas. Exemplo de mulher guerreira e que tenho muito orgulho de ser amiga. Obrigada por me permitir entrar em sua vida e dividi-la comigo, por me ouvir, me apoiar e não me deixar desanimar. À Bruna Dallaqua pela amizade e ensinamentos, que sempre soube me ouvir, me incentivando e ajudando a persistir até o final também pelo maravilhoso convívio durante essa jornada. À Isabela L. Iessi pela amizade e divisão de conhecimentos, pela ajuda nos procedimentos práticos no decorrer do trabalho e pela amável convivência nesses anos. À Franciane Quintanilha Gallego por toda força nesse caminho do mestrado e amizade que ultrapassa o local de trabalho. Sempre disposta a me ouvir e apoiar. À Lígia Maria Kfouri amiga de todas as horas, me apoiando nessa jornada e mesmo com distância física unidas em pensamento. Aos professores Dr. Kleber Eduardo de Campos e Dr. Gustavo Tadeu Volpato, pela ajuda e contribuição nas discussões durante esses anos. À Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, em especial ao Programa de Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia e Departamento de Ginecologia e Obstetrícia pela acolhida e concessão das dependências e ao Laboratório de Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetrícia (LAPGO) em função do espaço físico e utilização de aparelhos durante a realização deste trabalho. Aos funcionários do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Aparecida Benedita Vasques, César Eduardo Guimarães, Regina Célia Gamito e, em especial à Ana Cláudia Garcia Mira (secretária do programa de Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia) pela dedicação e auxílios prestados. Aos funcionários da Seção de Pós-graduação Janete Aparecida Nunes Silva, Márcia F. Quadros, Regina C. Spadin, Lilian Cristina Nunes e Andréia Longo Devide pela dedicação e serviços prestados. Aos funcionários da Biblioteca da Unesp de Botucatu pela atenção durante o período do mestrado, pelo auxílio na pesquisa bibliográfica e elaboração da ficha catalográfica. Ao Grupo de Apoio à Pesquisa (GAP) da Faculdade de Medicina de Botucatu e, em especial ao bioestatístico José Eduardo Corrente, pela assistência nas análises estatísticas e por toda contribuição prestada. À Talísia Collachiti Moreto, técnica responsável pelo Laboratório de Pesquisa Experimental em Ginecologia e Obstetrícia, pela colaboração nas rotinas laboratoriais e manutenção dos animais. À Capes pela bolsa que permitiu que eu me dedicasse integralmente à minha pesquisa ao longo de todo o mestrado. Aos animais que doaram suas vidas em prol da ciência. Índice CAPÍTULO 1 - Efeito do diabete na gestação sobre os danos no DNA: atualização de literatura Artigo de atualização............................................................................ 15 CAPÍTULO 2 - Diferentes metodologias de descongelamento das amostras de sangue total de ratos para análise de genotoxicidade Resumo................................................................................................. 30 Introdução............................................................................................ 31 Materiais e Método............................................................................. 32 Resultados............................................................................................ 36 Discussão.............................................................................................. 36 Conclusão.............................................................................................. 39 Referências........................................................................................... 39 Anexos.................................................................................................. 42 CAPÍTULO 3 - Avaliação da genotoxicidade nos descendentes de ratas que nasceram com restrição de crescimento intrauterino exercitadas durante a prenhez Resumo................................................................................................. 45 Introdução............................................................................................ 46 Materiais e Método............................................................................. 48 Resultados............................................................................................ 55 Discussão.............................................................................................. 60 Conclusão.............................................................................................. 61 Referências........................................................................................... 62 Anexos.................................................................................................. 66 Capítulo 1 EFEITO DO DIABETE NA GESTAÇÃO SOBRE OS DANOS NO DNA: ATUALIZAÇÃO DE LITERATURA EFFECT OF THE DIABETES DURING PREGNANCY ON DNA DAMAGE (GENOTOXICITY): LITERATURE UPDATE EFECTO DEL DIABETES EN EMBARAZO SOBRE LOS DAÑOS DE DNA: ACTUALIZACIÓN DE LA LITERATURA ARTIGO DE REVISÃO ALINE OLIVEIRA NETTO 1 - SILVANA BARROSO CORVINO 2 - DÉBORA CRISTINA DAMASCENO 3 * 1. Programa de Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia (Nível: Mestrado) da Faculdade de Medicina de Botucatu_Unesp 2. Programa de Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia (Nível: Doutorado) da Faculdade de Medicina de Botucatu_Unesp 3. Professora Assistente Doutora do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Botucatu_Unesp *Profa. Dra. Débora Cristina Damasceno - Laboratório de Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetrícia, Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Botucatu, Univ Estadual Paulista- Unesp, Distrito de Rubião Jr, s/n, CEP: 18603.970, Botucatu, Brasil.Telefone: (14) 38801631. alineonetto@gmail.com; bc.silvana@gmail.com; damascenofmb@gmail.com Título abreviado: Gravidez e danos no DNA mailto:alineonetto@gmail.com mailto:bc.silvana@gmail.com mailto:damascenofmb@gmail.com RESUMO Para ampliar os conhecimentos dos efeitos do diabete na gestação e danos no DNA, foi realizada uma revisão de literatura utilizando dois conjuntos de palavras-chave: 1) diabetes, DNA damage, pregnancy e 2) rat, diabetes, DNA damage, pregnancy, no site da base de dados do National Center of Biotechnology Information (NCBI-PUBMED). No primeiro conjunto, foram encontrados 28 artigos e, no segundo, 13 artigos. Destes, 11 eram iguais aos do primeiro conjunto e dois não tinham coerência com as palavras- chave. Dos 28 artigos analisados, 28,58% foram considerados adequados para a redação da revisão e 71,42% inadequados, pois tinham títulos e resumos fora de contexto. Dos adequados, 37,5% eram relacionados à pesquisa em humanos, 50% em animais de experimentação e 12,5% em humanos e animais. De forma geral, os artigos demonstraram que o diabete aumenta espécies reativas de oxigênio gerando danos em ácidos nucleicos e isto exarceba o estresse oxidativo materno, embrionário e fetal. Palavras-chave: diabete, danos no DNA, gestação, prenhez ABSTRACT To contribute the knowledge of the diabetes effects during pregnancy in the DNA damage, we performed a literature review using two groups of keywords: 1) diabetes, DNA damage, pregnancy and 2) rat, diabetes, DNA damage, pregnancy, in site of the database of the National Center for Biotechnology Information (NCBI-PUBMED). In the first group of keywords were found 28 articles. In the second group, there were 13 articles, which 11 were equal to the first group. Then, 28 articles were analyzed. Of these articles, 28,28% were considered adequate for writing the review, while 71,42% were considered inappropriate because they presented no coherent titles and abstracts. Of these articles, 37.5% were related to human research, 50% in experimental animals and 12.5% in humans and animals. Thus, in general, the articles showed that diabetes increases the reactive oxygen species that causes nucleic acid damage and this exacerbates maternal, embryonic and fetal oxidative stress. Keywords: diabetes, DNA damage, pregnancy RESUMÉN Para aumentar el conocimiento de los efectos de la diabetes durante el embarazo en los daños de ADN, fué desarrollada uma revisión de la literatura con dos grupos de palabras-clave: 1) diabetes, daño de ADN, embarazo y 2) rata, diabetes, daño de ADN, embarazo, en la base de datos de Centro Nacional de Información de la Biotecnología (NCBI - PUBMED). Para el primer grupo de palabras-clave, se encontraron 28 estudios. Para el segundo grupo, se encontraron 13, dos quales 11 eran los mismos al del primero. De los 28 articulos, 28,58% fueron considerados aptos para la revisión, mientras que 71,42% fueron considerados inadecuados porque había malos títulos y resúmenes. De ellos, 37,5% estaban relacionadas con la investigación en humanos, 50% en animales de experimentación y 12,5% en ambos. De manera general, esa revisión demostró que la diabetes aumenta las especies reactivas de oxígeno e eso genera los daños en los ácidos nucléicos. Descriptores: diabetes, daño en ADN, embarazo DIABETE NA GESTAÇÃO SOBRE OS DANOS NO DNA: ATUALIZAÇÃO DE LITERATURA DM é um grupo de doenças metabólicas, resultante de defeitos na secreção e/ou ação da insulina levando à hiperglicemia (1). Há evidências que, na gestação diabética, a formação aumentada de espécies reativas de oxigênio (ERO) ou a ineficiência do sistema de defesa antioxidante induz peroxidação lipídica nas estruturas celulares (2, 3). ERO incluem radicais do ânion superóxido (O2 -), peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO). Estes são formados em células vivas como consequência de reações de um metabolismo normal. Em condições fisiológicas, há o balanço entre oxidantes e antioxidantes. Entretanto, quando há excesso da geração de oxidantes ou diminuição de antioxidantes, ocorre um desbalanço chamado estresse oxidativo, o qual gera danos oxidativos em ácidos nucléicos, proteínas e lípides (4). Em condições normais, as moléculas de “limpeza” conhecidas como antioxidantes convertem ERO em água para evitar superprodução dos agentes oxidantes. Existem dois tipos de antioxidantes no corpo humano: antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos (5). Os antioxidantes enzimáticos são conhecidos como antioxidantes naturais, neutralizam as ERO excessivas e evitam que elas danifiquem as estruturas celulares. Alguns exemplos são: superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GSH-Px) e glutationa redutase (GSH-Rd), que provocam a redução de peróxido de hidrogênio (H2O2) à água (H2O) e álcool. Os antioxidantes não enzimáticos também são conhecidos como antioxidantes sintéticos ou suplementos dietéticos (6), caracterizados pelas vitaminas e minerais (vitamina C, vitamina E, selênio, zinco, taurina, glutationa e beta- caroteno) (5,7). A literatura evidencia que a exposição aos radicais livres a partir de uma variedade de fontes leva o organismo a desenvolver uma série de mecanismos de defesa (8). Esses mecanismos envolvem: 1) mecanismos de prevenção, 2) mecanismos de reparo e 3) aumento de defesas antioxidantes (9). A oxidação do DNA é conhecida por ser um dos tipos mais comuns de danos no DNA (10). Modificações permanentes no material genético resultantes desses danos oxidativos representam o primeiro passo envolvido na mutagênese, carcinogênese e envelhecimento humano. A discussão sobre a melhor metodologia para avaliar a oxidação do DNA ainda é polêmica. O método tradicional é a determinação de 8-oxo-7, 8-dihidro-2-desoxiguanosina (8-oxodGuo) (ou a base de 8 oxoGua). Em meados de 1990, foi descoberto que o DNA é propenso à oxidação durante o preparo de amostras, assim foi desenvolvida uma abordagem alternativa com outros procedimentos (10). Para estudos de toxicogenética, foi proposto o teste do cometa em função de suas peculiaridades e vantagens quando comparado a outros testes para detecção de substâncias genotóxicas. O teste não é utilizado para detectar mutações, mas sim lesões genômicas que, após serem processadas, podem resultar em mutação. Diferente das mutações, as lesões detectadas pelo teste do cometa são passíveis de correção. Assim, o teste do cometa também pode ser utilizado para estudos de reparo de DNA, trazendo informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão reparada, embora não possibilite inferir a fidedignidade do processo de reparo. É um método rápido e sensível, pode ser utilizado para detectar bases oxidadas no DNA com emprego de endonucleases de reparo como endonuclease III (Endo III) e formamidopirimidina DNA glicosilase (Fpg). A detecção por Fpg e Endo III revela bases de purina e pirimidina oxidadas (12, 13). A relação entre diabete e estresse oxidativo está fortemente evidenciada na literatura. As repercussões do estresse oxidativo, advindo ou não do quadro diabético, gera danos no DNA. Desta forma, há interesse em se estudar a associação entre diabete na gestação e a presença de danos no DNA. Este estudo tem como objetivo apresentar uma atualização de literatura para ampliar os conhecimentos do efeito do diabete na gestação em relação ao metabolismo oxidativo e danos no DNA. Foi realizada uma revisão de literatura utilizando dois conjuntos de palavras- chave: 1) diabetes and DNA damage and pregnancy e 2) rat and diabetes and DNA damage and pregnancy. A pesquisa foi investigada no banco de dados do National Center of Biotechnology Information (NCBI – PUBMED) considerando um período de 40 anos (1982 a 2012). Foram incluídos os artigos considerados adequados com relação às palavras-chave nos títulos e/ou resumos. Caso contrário, os artigos eram excluídos da análise. Para o primeiro conjunto de palavras-chave, foram encontrados 28 artigos, sendo o primeiro artigo publicado em 1988. Para o segundo conjunto, 13 artigos foram encontrados, sendo o primeiro publicado em 1997. Dos 13 artigos do segundo conjunto de palavras-chave, 11 deles eram os mesmos aos do primeiro conjunto e dois não tinham coerência com as palavras-chave. Desta forma, um total de 28 artigos foram analisados/lidos. No primeiro conjunto de palavras-chave, 11 artigos não tinham coerência com as palavras-chave, oito tinham títulos e resumos bons, dois tinham títulos inadequados e resumos bons, três tinham títulos bons e resumos inadequados, três tinham títulos e resumos inadequados, um tinha título bom e sem resumo. Dos artigos considerados adequados, isto é, possuíam títulos e resumos bons para a redação da revisão, três eram relacionados à pesquisa em humanos, quatro em animais de experimentação e um em ambos. De acordo com os artigos analisados, foi observado que no estágio inicial da gestação diabética o controle metabólico inadequado pode estar associado ao aumento nas taxas de abortos e de malformações fetais (14, 15). A administração de antioxidantes, como a vitamina E, diminui a frequencia de malformações e de mortes embrionárias, denominadas como reabsorções em animais de experimentação (16, 17, 18, 19). O impacto teratogênico frente ao ambiente intrauterino hiperglicêmico depende do excesso de ERO nos embriões, os quais podem induzir quebras nos cromossomos (20). ERO também pode reagir com as bases do DNA e alterar sua estrutura (21, 22), levando a mutações (21, 22, 23). Lee et al. (24) também demonstraram aumento na taxa de mutações em embriões de ratas diabéticas, que contribuíram para o aparecimento de malformações. Viana et al. (25) observaram que ratas prenhes diabéticas que receberam vitamina E apresentaram diminuição na taxa de embriões malformados e de reabsorções. O mecanismo pelo qual a vitamina E diminuiu essas repercussões pode estar relacionado à redução de bases de DNA alteradas e as concentrações de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS – marcador de lipoperoxidação) no fígado materno. Este fato demonstra a relação entre a oxidação de lipídios e os danos no DNA como dois mecanismos associados à teratogênese causada pelos radicais livres induzidos pelo diabete (25). Os estudos indicam que os radicais livres podem ser produzidos como resultado de longos períodos de exposição à hiperglicemia, a qual é conhecida por causar glicação não enzimática de proteínas (26, 27, 28) e auto-oxidação da glicose (29). Há evidência que 8-OHdG é produzida pela oxidação do nucleosídeo desoxiguanosina e, subsequentemente, é excretada diretamente pela urina. 8-OHdG tem sido identificada como marcador de dano oxidativo no DNA (30, 31). Algumas pesquisas mostram aumento nas concentrações de 8-OHdG em indivíduos diabéticos com glicemia malcontrolada (32, 33) e outros autores afirmam que há associação positiva entre 8- OHdG na urina e hiperglicemia, intolerância à glicose e Diabetes mellitus tipo 2 em homens e mulheres (34, 32, 35, 33, 36). Qiu et al. (37) demostraram que a concentração de 8-OHdG na urina materna também parece estar relacionada com o risco aumentado para o surgimento do Diabetes mellitus gestacional (DMG). Além disso, este trabalho mostrou que a houve maior relação entre a concentração de 8-OHdG em mulheres que desenvolveram DMG. Com relação aos estudos com animais de experimentação, ratas com diabete grave (glicemia superior a 300 mg/dL) que foram expostas à fumaça de cigarro antes e durante toda a prenhez apresentaram ativação do sistema antioxidante como uma tentativa de diminuir alta lipoperoxidação, caracterizada pela produção exacerbada de TBARS (38). O mesmo grupo de pesquisa verificou que os níveis de danos no DNA foram elevados em ratas diabéticas expostas à fumaça de cigarro antes da prenhez e naquelas expostas antes e durante a prenhez em relação ao nível de danos de ratas não diabéticas e expostas ao ar filtrado. Além disso, o teste do cometa indicou que as ratas diabéticas expostas à fumaça de cigarro somente antes da prenhez apresentaram maior genotoxicidade comparada à de ratas expostas à fumaça antes e durante a prenhez. O mesmo artigo demonstrou que os fetos de ratas diabéticas, expostas ou não à fumaça de cigarro, apresentaram aumento na freqüência de anomalias esqueléticas e viscerais. Esses descendentes também apresentaram sítios incompletos de ossificação, sugerindo restrição de crescimento intrauterino (RCIU) (39), o que confirma que os fatores ambientais e genéticos são importantes contribuidores no aparecimento de embriopatias diabéticas (40). De maneira similar ao diabete, estudos em humanos e em animais têm demonstrado que os mecanismos fisiopatológicos envolvidos com relação à exposição à fumaça de cigarro é aumento na formação de ERO, aumentando assim o estresse oxidativo embrionário e fetal (41). Vários fatores etiológicos têm sido propostos para explicar os graves danos embrionários relacionados ao diabete, especialmente nos estágios iniciais da organogênese. As investigações confirmam cada vez mais que ERO causa prejuízos no desenvolvimento embrionário e fetal, pois as alterações metabólicas podem ser inicializadas desde o ambiente intrauterino, i.e., por condições maternas graves, tais como a hiperglicemia (42, 43). ERO pode atacar todos os tipos de macromoléculas, incluindo proteínas, lipídios e DNA (44). O estresse oxidativo está envolvido no rompimento de membranas, peroxidação lipídica e no processo de mutagênese e carcinogênese (45). Streptozotocin (STZ) é usado para induzir diabete em modelos experimentais porque causa efeitos tóxicos nas células beta pancreáticas (46, 47). Mossman et al. (48) demonstraram que o STZ induz quebra de fitas simples no DNA em uma linhagem específica de roedores (RINr 38) e que essas lesões podem ser reparadas em função do tempo, com reparo de danos dentro de 24 horas depois da exposição ao STZ. Usando a mesma linhagem celular, Pettepher et al. (49) demonstraram que o STZ induz quebra em sítios álcali- lábeis de forma dose dependente no DNA mitocondrial e que essas lesões podem ser reparadas. Esses autores encontraram que 8 horas depois da exposição ao STZ, 55% das lesões induzidas no DNA mitocondrial são reparadas e os níveis de reparo aumentam para 70% em 24 horas. Desta forma, fica evidente que o STZ por si só não é responsável pelo aumento nos níveis de danos no DNA nos leucócitos de mães e de seus descendentes, mas o fator indutor é a hiperglicemia, a qual leva a complicações a longo prazo não somente por gerar mais ERO mas também por atenuar os mecanismos antioxidantes através da glicação de enzimas antioxidantes (50). Lima et al. (51) avaliaram os danos oxidativos em amostras de linfócitos de ratas prenhes com diabete grave (DG) ou diabete moderado (DM) (glicemia entre 120 a 300 mg/dL) e nas amostras de sangue total de seus respectivos recém-nascidos. Estas amostras de sangue foram preparadas e analisadas pelo teste do cometa aplicando enzimas de reparo (Endo III e Fpg). Os autores demonstraram que as ratas com DM e seus filhotes apresentaram mais sítios sensíveis à Fpg, o qual refletiu os danos resultantes da hiperglicemia. As ratas com DG e sua prole mostraram mais danos oxidativos no DNA detectado tanto pela enzima Fpg quanto pela enzima Endo III, mostrando repercussões gerais relacionadas ao diabete. O tratamento enzimático para danos no DNA evidencia que as repercussões maternas do diabete estão associadas com lesões oxidativas no DNA materno e fetal, os quais não são observados em outro tipo de análise sem utilização de enzimas (65). Desta forma, os artigos analisados demonstraram que o diabete aumenta a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), as quais geram danos em ácidos nucleicos, proteínas e lipídeos, exarcebando o estresse oxidativo materno, embrionário e fetal. REFERÊNCIAS (1) American Diabetes Association (ADA). Summary of Revisions for the 2010 Clinical Practice Recommendations. Diabetes Care. 2010;33(1)S3. (2) Myatt L, Cui X. Oxidative stress in the placenta. Histochem Cell Biol. 2004; 122(4):369-82. (3) Griesmacher A, Kindhauser M, Andert SE, et al. 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Programa de Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia (Nível: Iniciação Científica) da Faculdade de Medicina de Botucatu_Unesp 7. Professora Assistente Doutora do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Botucatu_Unesp * Laboratório de Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetrícia, Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Botucatu, Univ Estadual Paulista- Unesp, Distrito de Rubião Jr, s/n, CEP: 18603.970, Botucatu, Brasil. Telefone: 55 14 38801631 alineonetto@gmail.com; rafaelgelaleti@hotmail; rebecagserrano@gmail.com; damascenofmb@gmail.com # Autor correspondente: damascenofmb@gmail.com; Este capítulo foi redigido e será submetido à revista Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis mailto:alineonetto@gmail.com mailto:rebecagserrano@gmail.com mailto:damascenofmb@gmail.com mailto:damascenofmb@gmail.com RESUMO O teste do cometa é um método sensível para detectar danos no DNA, é muito utilizado em linfócitos isolados de humanos. Porém, envolve experimentos longos e as amostras devem ser processadas logo após a coleta. Para otimizar o tempo de experimento e visando utilizar as amostras posteriormente, Hininger et al. (2004) congelaram amostras de sangue total humano e descongelaram após alguns meses para análise dos efeitos do congelamento nos danos do DNA. Seguindo este estudo, o objetivo foi utilizar o protocolo de Hininger et al. (2004) em animais de laboratório e testar outra técnica de descongelamento para verificar a influência nos danos de DNA (genotoxicidade). Após a colheita de sangue de ratos, as amostras foram submetidas a quatro experimentos diferentes: Experimento 1: de acordo com o protocolo de Lima et al. (2008) utilizando linfócitos a frescos, considerado padrão ouro na literatura para análise de genotoxicidade. Experimento 2: segundo protocolo padronizado por Hininger et al. (2004). Experimento 3: congelamento similar a Hininger et al. (2004), mas com modificações na técnica de descongelamento. Experimento 4: protocolo para processamento de sangue total a fresco como controle. As lâminas foram montadas com uma mistura de amostra e agarose de baixo ponto de fusão (LMP). A lamínula foi colocada e levada para a geladeira para solidificação da agarose. Após retirada da lamínula, as lâminas contendo as amostras foram colocadas em solução de lise overnight. A corrida da eletroforese foi conduzida e, depois, as lâminas foram neutralizadas. As amostras foram coradas com brometo de etídio e analisadas em microscópio de fluorescência. Os resultados mostraram que os testes 1, 2, 3 e 4 não apresentaram diferenças estatisticamente significativas (p>0,05) entre si, quando analisados pelo teste do cometa por score visual ou pela análise em software (tail intensity). Portanto, foi concluído que os testes realizados com sangue total congelado foram viáveis, reduzindo a quantidade de sangue e do tempo de trabalho. Além disso, foi demonstrada maior eficiência e redução de custos nas práticas de laboratório. Este estudo apresenta uma nova abordagem aos trabalhos experimentais, visto que a literatura aborda tal assunto em humanos. Palavras-chave: Teste do cometa, sangue total, ratos, congelamento, descongelamento e danos no DNA. 1. INTRODUÇÃO Fatores externos podem influenciar a integridade do material genético (DNA) existente no núcleo das células. Quando um organismo é exposto a fatores químicos, físicos ou biológicos, a possibilidade de aparecimento de lesões nesse material genético pode aumentar. Diversos fatores podem danificar o DNA, como a luz solar, poluentes ambientais, estresse, exposição à fumaça de cigarro, espécies reativas ao oxigênio (ERO), exposição a raios X e hiperglicemia. Vários mecanismos envolvidos nos danos no DNA são especulados, mas o mecanismo preciso não está totalmente esclarecido. No entanto, os autores concluem que uma das repercussões é o aparecimento de câncer [1,2,3]. Para analisar as consequências da genotoxicidade são utilizados marcadores citogenéticos, como ensaio de aberração cromossômica, ensaio de troca entre cromátides- irmãs, teste de micronúcleo [4] e o teste do cometa [5]. Uma grande variedade de ensaios citogenéticos são usados com sucesso no monitoramento de populações expostas a agentes mutagênicos e aberrações cromossômicas, porque avaliam a possibilidade de ocorrência de câncer na população [6]. O teste do cometa é um ensaio proposto para medir danos no DNA. É um método rápido, simples, sensível, confiável, razoavelmente barato [7] e é viável para detectar a influcência de substâncias genotóxicas. O termo “genotóxico” está relacionado aos agentes que mudam a sequência do DNA e são considerados “tóxicos” para o gene. O teste do cometa não é utilizado para detectar mutações e sim lesões genômicas [8]. Esse método permite a detecção de várias classes de alterações no DNA como, quebra de fita simples e dupla, sítios álcali lábeis, sítios incompletos de reparo e ligações cruzadas [9]. Estudos com seres humanos mostram que o ensaio do cometa é amplamente utilizado em linfócitos isolados [10], pois linfócitos proporcionam uma fonte conveniente e prontamente disponível de material humano. Além disso, são utilizados experimentalmente para avaliar os potenciais efeitos tóxicos e citoprotetores nos danos no DNA e reparo. Embora o teste do cometa utilize linfócitos isolados de humanos, cabe enfatizar que esse teste envolve experimentos longos e as amostras devem ser processadas imediatamente após a colheita do material biológico. Para otimizar o tempo de processamento e visando utilizar as amostras para análises de genotoxicidade posteriormente, Hininger et al. [11] congelaram amostras de sangue total humano, descongelaram após alguns meses e verificaram que o método era adequado para análise dos danos do DNA. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi utilizar o protocolo de Hininger et al. [11] em animais de laboratório e testar outras técnicas de descongelamento para verificar a influência nos danos de DNA (genotoxicidade), visando ajustar o experimento mais apropriado para o armazenamento das amostras de sangue total para processamento e análises posteriores. 2. MATERIAIS E MÉTODO 2.1 Animais Foram utilizados ratos Wistar, na idade de três meses, pesando em torno de 250g. Os animais foram adquiridos do Centro de Investigação Biológica (CEMIB – Unicamp, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil). Esses animais foram mantidos sob condições controladas em nosso biotério. Todos os procedimentos utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu_Unesp (Protocolo No. 952/2012_ANEXO 1). 2.2 Seqüência Experimental Ratos machos adultos foram anestesiados com tiopental sódico (Thiopentax - 50 mg/kg) para dessangramento e colheita de amostras de sangue total em tubos a vácuo com anticoagulante (EDTA - ácido etilenodiamina tetraacético). As amostras de sangue foram processadas aleatoriamente utilizando quatro diferentes testes experimentais (n=4 animais/teste) (FIGURA 1): Figura 1. Diferentes testes de descongelamento das amostras Experimento 1: O teste com o uso de amostras de linfócitos foi realizado pelo fato de ser considerado como padrão ouro no teste do cometa. Este experimento seguiu o protocolo de Lima et al. [12] para isolamento de linfócitos a fresco de ratos. Os linfócitos foram isolados com ficoll e submetidos à centrifugação com PBS (tampão salina fosfato). 20l da amostra foram misturados a 120l de agarose LMP (Low Melting Point) e colocados em uma lâmina contendo agarose NMP (Normal Melting Point) previamente preparada. As lamínulas foram colocadas sobre as lâminas e levadas para geladeira (4oC) para que a agarose se solidificasse. O procedimento foi feito em duplicata para cada amostra. Na etapa seguinte, as lâminas foram mergulhadas em solução de lise contendo NaCl a 2,5 M, EDTA (100 mM), Tris (10mM), Triton X-100 (1ml), DMSO (10 mL), N-Lauroil-sarcosinato (1%) e levadas à geladeira para obtenção de nucleóides. Em seguida, as lâminas foram retiradas da solução de lise e lavadas com PBS gelado por 5 minutos. As lâminas seguiram para corrida de eletroforese, foram neutralizadas e coradas com brometo de etídio para análise dos nucleóides com relação à presença de danos no DNA. Experimento 2: Foi realizado de acordo com o protocolo modificado de Hininger et al. [11]. O sangue foi colhido em tubos a vácuo com EDTA. Foram coletados 500L da amostra de sangue total e armazenados em um eppendorf contendo 400L de meio de cultura RPMI 1640 e 100L de dimetilsulfóxido (DMSO). A etapa de congelamento deste estudo difere do protocolo de Hininger et al. [11], que armazenaram as amostras de sangue humanas em caixas de criopreservação com decaimento de temperatura até as mesmas serem transferidas para freezer a -80º C. No entanto, em nosso estudo, nossas amostras foram armazenadas em freezer a -20°C por 24 horas e, em seguida, foram transferidas para freezer a -80°C onde permaneceram no máximo até quatro meses. Para o procedimento de descongelamento, as amostras foram descongeladas em banho-Maria a 37°. Nos eppendorfs, foram visualizados pellets, os quais foram lavados com PBS. Similarmente ao experimento 1, as lâminas contendo a amostra foram montadas em duplicata (20l de amostra foram misturados com 120l agarose LMP). As amostras presentes nas lâminas foram colocadas em solução de lise, seguiram para eletroforese, neutralização e coloração para avaliação de danos no DNA. Experimento 3: O procedimento de congelamento foi semelhante ao experimento 2, mas a etapa de descongelamento das amostras diferiu pelo fato das amostras terem sido retiradas do freezer a -80°C, levadas para freezer a -20°C e permanecerem por 24 horas. Após este tempo, as amostras foram levadas para geladeira onde permaneceram por no máximo 30 minutos. A seguir, todos os outros procedimentos para montagem das lâminas contendo as amostras foram similares aos adotados para os experimentos 1 e 2. Experimento 4: O teste foi realizado com amostras de sangue total a fresco e este foi considerado como controle dos experimentos. O sangue foi coletado em tubo a vácuo com EDTA, foram coletados 500L de sangue total e preparadas as lâminas com o sangue total a fresco. Todos os outros procedimentos de montagem das lâminas com as amostras foram similares aos experimentos 1, 2 e 3. 2.3 Teste do Cometa 2.3.1 Reagentes e soluções Foram utilizados os seguintes materiais: agarose com ponto de fusão normal (Normal Melting Point - NMP) e agarose com baixo ponto de fusão (Low Melting Point - LMP) (Collins et al., 1998), cloreto de sódio (NaCL), brometo de etídio, dimetilsulfóxido (DMSO), etil- diaminotetracetato de sódio (EDTA), ácido clorídrico (HCl), hidróxido de sódio (NaOH), N- Lauroil-sarcosinato, tampão salina fosfato (PBS) livre de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+), Tris e Triton X-100. 2.3.2 Tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) Foi utilizada solução de H2O2 (400μM) para obtenção do controle positivo. Em seguida, as amostras de sangue total e linfócitos foram incubadas por 5 minutos no gelo seguindo protocolo descrito por Blasiak et al. [13] com algumas modificações com relação à molaridade da solução de H2O2 (10μM). 2.3.3 Eletroforese O teste do cometa foi realizado segundo o protocolo descrito por Tice et al. [14] com algumas modificações [12]. As lâminas com as amostras-testes foram colocadas na cuba de eletroforese horizontal onde foram incubadas em solução tampão de eletroforese (pH=13), composta por NaOH e EDTA, por 20 minutos a 4oC. Em seguida, foi realizada a corrida de eletroforese (25 volts, 30 minutos e 300 mA). Após eletroforese, as amostras das lâminas foram neutralizadas em Tris (pH=7,5) durante 15 minutos, fixadas em etanol a 100% e secas à temperatura ambiente. 2.3.4 Coloração Após secagem, as amostras das lâminas foram coradas com solução de brometo de etídio (20g/mL). Cada lâmina foi coberta por lamínula e o material foi analisado em microscópio imediatamente. 2.3.5 Análise das lâminas As amostras das lâminas foram analisadas usando sistema de score visual, sendo consideradas cinco diferentes classes (de 0 - sem cauda a 4 – pontuação máxima de danos no DNA) (ANEXO 2). Um total de 100 nucleóides por amostra foram analisados. Para cada nucleóide analisado foi atribuído o valor de 0 a 4 de acordo com sua característica para cada lâmina contento as amostras [15]. Além da análise por score, as lâminas foram avaliadas em microscópio de fluorescência num aumento de 400x. Foram observados 100 nucleóides por amostra (50/lâmina), por sistema de análise de imagem automática (Comet Assay IV, Perceptive Instruments, UK). Tail intensity (definido como os valores de intensidade na região da cauda menos a região da cabeça, em %) foi selecionado como indicador de dano no DNA [16]. 3. Análise estatística A comparação dos valores do score visual, obtidos nos diferentes testes empregados utilizando o teste do cometa, foi realizada pelo Teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis seguido do teste de comparações múltiplas de Dunn. Para a comparação dos níveis de danos no DNA nos testes 1, 2, 3 e 4, analisada pelo software (tail intensity), foi empregada a Distribuição Gama. p<0,05 foi considerado como limite de significância estatístico. 4. RESULTADOS O tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2) foi ineficaz nos testes com sangue total congelado e a fresco. A tabela 1 mostra que os níveis de danos no DNA entre os diferentes testes de descongelamento, por score visual e tail intensity, não apresentaram diferenças estatisticamente significativas. TABELA 1. Níveis de danos no DNA por score e por análise em software (tail intensity) de amostras de sangue total e de linfócitos de ratos Wistar adultos. Teste 1 Teste 2 Teste 3 Teste 4 Danos no DNA (score visual) 1,12 ± 0,93 1,16 ± 0,58 1,22 ± 0,56 1,20 ± 0,40 Danos no DNA (tail intensity) 33,32 ± 16,46 33,65 ± 16,20 36,78 ± 18,82 34,54 ± 17,15 Dados apresentados como média ± desvio-padrão p > 0,05 – sem diferença estatisticamente significativa 5. DISCUSSÃO Nossos resultados mostraram que os níveis de danos no DNA, pela análise de score visual ou pela análise em software (tail intensity), não diferiram entre as amostras de linfócitos a fresco de ratos comparados aos outros testes empregados com a utilização de amostras de sangue total, a fresco ou congelado. Da mesma forma, Braz & Salvadori [17] compararam sangue total fresco com linfócitos isolados frescos, obtidos de amostras humanas, e não observaram diferenças nos níveis de danos no DNA. Muitos protocolos já foram desenvolvidos para extrair linfócitos a partir de amostras de sangue total congelado. Stevens et al. [18] corroboram com nossos resultados porque desenvolveram e testaram um protocolo de criopreservação de amostras de sangue total sem a utilização de equipamentos especializados. Estes autores observaram que as variações de temperatura, utilizando apenas gelo e freezer, não comprometeram a coleta e a criopreservação dessas amostras de sangue. O uso de sangue total no teste do cometa para medir danos no DNA presente nos leucócitos é mais simples e envolve menos manipulação das células, ao contrário do que ocorre quando se realiza o isolamento dos linfócitos [19]. Outros autores argumentam que os linfócitos (humanos) podem ser utilizados frescos ou criopreservados a -196°C para futuras análises [20]. Duthie et al. [21] concluíram que os linfócitos humanos isolados a fresco ou congelados não apresentam aumento de danos no DNA e podem ser criopreservados com sucesso. Diferentemente dos linfócitos, poucos estudos relatam sobre o uso de amostras de sangue total como meio para otimizar o tempo nos experimentos. Hininger et al. [11] utilizaram amostras de sangue total humano a fresco e congelado de indivíduos fumantes e não fumantes. Após a colheita de amostras de sangue total, foi adicionado meio de cultura RPMI 1640 e DMSO. As amostras foram congeladas progressivamente e armazenadas em freezer a -80°C até quatro meses. O descongelamento foi feito em banho-Maria a 37°C e as amostras foram lavadas com PBS (tampão salina fosfato). Não foi observada diferença nos níveis de danos no DNA entre as amostras de sangue total a fresco e congelado utilizando o teste do cometa. Os autores concluíram que o sangue total congelado pode ser utilizado em associação com o teste do cometa em estudos epidemiológicos para biomonitoramento de danos genéticos em populações de risco, sendo o congelamento estável até quatro meses. Al Salmani et al. [22] compararam amostras de sangue total humano fresco e congelado, com ou sem DMSO, e observaram que não houve diferenças nos resultados dos danos no DNA em amostras sem adição de DMSO. No entanto, esses resultados são controversos porque DMSO é utilizado como um crioprotetor. Há necessidade de se discutir o fator tempo e os custos gerados nos ensaios de bancada para a análise de genotoxicidade visando minimizar este tempo para processamento das amostras. De acordo com nossos resultados, os testes 1, 2, 3 e 4 não mostraram diferenças com relação aos níveis de danos no DNA entre si, mostrando que as amostras de sangue total congelado não sofreram interferência do congelamento e/ou descongelamento. Além disso, cabe ressaltar que as análises de genotoxicidade, por score visual ou empregando o software Comet Assay IV para obtenção dos dados de tail intensity, não diferiram entre ambos. Existe ampla discussão na literatura de que, pelo fato das células sanguíneas vermelhas e plaquetas não terem núcleos, estas células não contribuem para análise de danos no DNA pelo teste do cometa. Narayanan et al. [20] verificaram influência das células sanguíneas vermelhas nas amostras de sangue total in vitro quanto à quebra de fitas simples de DNA em linfócitos humanos. Os danos no DNA aumentaram quando o linfócito foi analisado na presença de células vermelhas comparados aos de linfócitos isolados. Os candidatos presentes no sangue total que poderiam ser capazes de causar o dano observado seriam os neutrófilos e a lise de células sanguíneas vermelhas. Segundo Chuang & Hu [23], as células vermelhas não interferem nos valores de danos utilizando o teste do cometa. Estes autores justificam que as células vermelhas são lisadas em dois passos do teste, no momento da incubação na solução de lise e na eletroforese. Durante incubação com a lise, as membranas celulares são rompidas e, consequentemente, as células vermelhas sanguíneas são lisadas. Na eletroforese, o DNA é desenrolado e as células que sobram são completamente lisadas. Além disso, estes mesmos autores [23] verificaram que, após o isolamento de linfócitos e coleta de sangue total humano e de ratos, as amostras foram congeladas com meio de cultura RPMI e DMSO e armazenadas em freezer a -80°C para posterior realização do teste do cometa. Depois de 60 dias, as amostras foram descongeladas em banho-Maria a 37°C e foi realizado o teste do cometa imediatamente. Os nucleóides estavam intactos nas amostras de sangue total e nos linfócitos criopreservados com DMSO. Além disso, estes resultados foram similares aos do sangue total e de linfócitos isolados a fresco. Com relação à comparação dos níveis de danos no DNA entre as amostras de linfócitos e de sangue total humano e de ratos em função do tempo de armazenamento a 4°C, não foi verificada diferença, contradizendo Narayanan et al. [20], que observaram que o sangue total humano não pode ser armazenado por mais de 24 horas a 4°C. Berchieri-Ronchi et al. [24] extraíram linfócitos das amostras de sangue de suínos e congelaram com soro bovino fetal, RPMI e DMSO. Para o processo de descongelamento, foi utilizado banho-Maria a 37°C e foram adicionados RPMI e soro bovino fetal. No 30º dia de prenhez (fase inicial), foi observada diminuição de danos oxidativos, mas houve aumento de danos ao longo da prenhez e na lactação devido ao aumento da produção de espécies reativas ao oxigênio (ERO). Além disso, os autores demonstraram que o congelamento de linfócitos não aumentou a quebra de fitas simples no DNA quando analisado pelo teste do cometa. Além das análises de danos no DNA, também cabe ressaltar os custos em cada teste feito em nosso estudo. Foi demonstrado que o teste 2 (protocolo de Hininger et al. [11] – modificado) apresenta uma nova possibilidade de coleta e armazenamento de amostras visando análises futuras, pois exclui a etapa de isolamento de linfócitos. Isto reduz os custos com reagentes e outros materiais. O teste 3 também foi considerado viável para o estudo, pois as amostras foram descongeladas utilizando equipamentos similares aos utilizados para o congelamento. No entanto, a metodologia que utiliza sangue total a fresco e isolamento de linfócitos apresenta desvantagem do fato de serem preparados imediatamente após a coleta de sangue. Após extensa análise dos artigos que mencionam o uso de amostras de sangue total ou linfócitos, a fresco ou criopreservados, foi verificado que existem muitas diferenças nos resultados intra e interlaboratoriais quanto à análise de genotoxicidade via teste do cometa. Isto se deve a diversos fatores como, tempo de descanso no tampão de eletroforese, voltagem da cuba de eletroforese, tempo de corrida da eletroforese, concentração de agarose e quantidade de solução tampão de eletroforese, a qual pode interferir na corrente, pois a água é condutora de energia [25]. Portanto, de acordo com nossos resultados, os testes que foram realizados com sangue total congelado foram viáveis, pois reduziram a quantidade de sangue necessária quando comparada à quantidade de sangue utilizada para isolamento de linfócitos, não necessitou do processo de isolamento de linfócitos, dispensando muitas horas de técnica, o que mostrou maior eficiência e redução de custos nas práticas de laboratório. O estudo também apresenta uma nova abordagem nos trabalhos experimentais, visto que a maioria dos artigos que abordam tal assunto é realizada em humanos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. G.M. Halliday, J. Cadet. 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Influence of diet on oxidative DNA damage, uracil misincorporation and DNA repair capability. Mutagenesis. 25 (2010) 483-7. 17. M.G. Braz, D.M.F. Salvadori. Influence of endogenous and synthetic female sex hormones on human blood cells in vitro studied with comet assay, Toxicol. In Vitro. 21 (2007) 972-6. 18. V.L. Stevens, A.V. Patel, H.S. Feigelson , C. Rodriguez, M.J. Thun, E.E. Calle. Cryopreservation of whole blood samples collected in the field for a large epidemiologic study, Cance.r Epidemiol. Biomarkers. 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Capítulo 3 15 “Avaliação da genotoxicidade nos descendentes de ratas que nasceram com restrição de crescimento intrauterino exercitadas durante a prenhez” 16 RESUMO As condições de saúde no transcorrer da vida adulta resultam da combinação entre genótipo e fenótipo, que se inicia no período pré-natal, uma vez que o meio ambiente intrauterino influencia o desenvolvimento embriofetal, sendo permanentemente modificadas em relação à fisiologia e metabolismo. A gestação é um estado inflamatório que aumenta a susceptibilidade ao desequilíbrio entre espécies reativas de oxigênio e antioxidantes, levando a um aumento do quadro de estresse oxidativo e danos no DNA. Visando minimizar estas complicações, muitos especialistas recomendam a prática de exercício físico. Frente a isso, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência do exercício físico na prenhez de ratas Wistar que nasceram com restrição de crescimento intrauterino frente às possíveis alterações transgeracionais analisando níveis de danos no DNA maternos e dos recém- nascidos. Nossos resultados mostram que ratas que nasceram com peso adequado (AIP) e com peso pequeno (PIP) e foram submetidas ao exercício físico durante a prenhez ou não apresentaram ausência de alterações no teste oral de tolerância à glicose. Os níveis de danos no DNA de ratas AIP e PIP exercitadas foram menores, mas os das ratas PIP E foram maiores comparados aos das ratas AIP E. As ratas (AIP e PIP) exercitadas apresentaram porcentagem maior de recém-nascidos (RN) classificados como PIP em relação às não exercitadas. Quanto aos recém-nascidos, os níveis de danos no DNA não diferiram entre os sexos e os RN de ratas-mães PIP NE apresentaram maiores níveis de danos no DNA comparados aos de mães AIP NE. Já os RN de ratas-mães PIP E exibiram menores níveis de danos em relação aos de mães PIP NE. Portanto, nossos resultados mostraram que o exercício físico (natação) contribuiu para a estabilidade genética materna, demonstrada pela redução da genotoxicidade, mas causou comprometimento no peso dos recém-nascidos, evidenciado pela restrição de crescimento intrauterino. Também foi evidenciado que o exercício físico aplicado a ratas-mães com RCIU levou a efeito benéfico na redução dos níveis de danos no DNA de seus descendentes. Desta forma, as gestantes devem ser encorajadas a praticar exercício físico, mas devem ser supervisionadas por especialistas considerando suas limitações, o tipo e a intensidade do exercício e o momento apropriado na gestação. Palavras-chave: ratas, genotoxicidade, danos no DNA, exercício (natação) 17 INTRODUÇÃO Em mamíferos, o crescimento e o desenvolvimento fetal no meio intrauterino são fortemente dependentes dos nutrientes oferecidos pela mãe, aumentando nesse período as necessidades maternas de carboidratos, proteínas e lipídeos (Rudge et al., 2000; Aerts & Van Assche, 2006). Alimentação inapropriada ou comprometimento do fluxo de nutrientes materno-fetal causam alterações marcantes no metabolismo materno e modificam a nutrição fetal, determinando novas adaptações fetais durante seu desenvolvimento no meio intrauterino (Holemans et al., 2003; Caluwaerts et al., 2006). Na ausência dessas adaptações, o crescimento pós- natal é prejudicado. As condições de saúde no transcorrer da vida adulta resultam da combinação entre genótipo e fenótipo, que se inicia no período pré-natal, uma vez que o meio ambiente intrauterino influencia o desenvolvimento embriofetal, sendo permanentemente modificadas em relação à fisiologia e metabolismo. Este efeito é conhecido como “origem fetal das doenças adultas” (Barker, 1997; Kanaka-Gantenbein, 2010; Hanson & Gluckman, 2011). Assim, a natureza da programação fetal é de extrema importância e envolve muitas doenças que se mantém em sucessivas gerações (Fernandez-Twinn & Ozanne, 2006; Aerts & Van Assche, 2006; Zambrano, 2009). Sabe-se que o ambiente intrauterino balanceado é essencial para o desenvolvimento normal do concepto e que, se o ambiente uterino for modificado devido a alterações no metabolismo materno, os processos essenciais para a regulação homeostática do organismo ficarão comprometidos, predispondo ao aparecimento de malformações congênitas e a doenças na fase adulta (Holemans et al., 2003). A incidência de recém-nascidos com restrição de crescimento intrauterino (RCIU) é de aproximadamente 3% a 7% na população mundial (Romo et al., 2009). As conseqüências de RCIU incluem distúrbios metabólicos e hematológicos, alterações termoregulatórias, retinopatia de prematuridade, que contribuem para morbidade perinatal. Os distúrbios metabólicos estão relacionados ao metabolismo da glucose e de ácidos graxos. É bem conhecido que indivíduos que apresentam pobre crescimento in utero são mais susceptíveis a Diabetes mellitus tipo 2 (DM2), obesidade, hipertensão, dislipidemia e resistência à insulina (também chamados de Síndrome metabólica) (Longo et al., 2012). A gestação é um estado inflamatório que aumenta a susceptibilidade ao desequilíbrio entre espécies reativas de oxigênio e antioxidantes, levando a aumento do quadro de estresse oxidativo e danos no DNA. No entanto em uma gestação saudável, os danos no DNA são reparados de forma eficaz. Com o estilo de vida moderna, isto é, exposição a poluentes ambientais, dieta desequilibrada e falta de exercício físico, o estado inflamatório, estresse oxidativo e os danos no DNA aumentam, 18 contribuindo para o aparecimento de complicações na gestação (Furness et al., 2011). Visando minimizar estas complicações, muitos especialistas recomendam a prática de exercício físico. Nascimento et al. (2012) relatam que o exercício físico é benéfico para mulheres durante a gestação e no período pós parto e que não está associado a riscos nos recém-nascidos e pode levar a mudanças no estilo de vida causando benefícios a longo prazo. Um ambiente intrauterino desfavorável pode ser simulado por diversos modelos experimentais, dentre eles o uso de corticosteróides (Nyirenda et al., 1998), redução do fluxo de sangue uterino por ligamento bilateral das artérias uterinas (Jansson & Lambert, 1999; Simmons et al., 2001), hipertensão arterial crônica (Bassan et al,. 2005), desnutrição proteica (Dahri et al., 1991) e droga beta-citotóxica para indução do diabete (Volpato et. al., 2006, 2008, 2009). Estudos prévios em nosso laboratório mostraram que ratas adultas com diabete induzido por streptozotocin (STZ), um agente químico que causa necrose das células beta-pancreáticas apresentaram glicemia superior a 300 mg/dL (diabete grave) e seus descendentes nasceram com restrição de crescimento intrauterino (RCIU), i.e., pequenos para a idade de prenhez (PIP) (Damasceno et al., 2011, Volpato et. al., 2008; Volpato et al., 2009; de Souza et al., 2009). Além disso, as ratas com diabete grave e seus descendentes apresentaram aumento no nível de danos no DNA (genotoxicidade) (Lima et al., 2008). Há pouca informação se o exercício físico está relacionado ou não aos danos genéticos. Vários autores já confirmaram o efeito do exercício aumentando os danos no DNA em animais de laboratório (Pozzi et al., 2010; Wierzba et al., 2006) e em humanos (Mastaloudis et al., 2004). Considerando que a hiperglicemia materna, causada pelo quadro de diabete grave em animais de laboratório, aumenta a frequência de recém-nascidos RCIU e promove maior genotoxicidade, o que contribui para o aparecimento de complicações na vida adulta em função de um ambiente intrauterino desfavorável, pretende-se aplicar o exercício físico na fase adulta (prenhez) de ratas RCIU visando interferir na programação fetal para prevenir as doenças crônicas de seus descendentes. O objetivo deste estudo é avaliar a influência do exercício físico na prenhez de ratas Wistar que nasceram com restrição de crescimento intrauterino frente às possíveis alterações transgeracionais. Especificamente pretendem-se avaliar pesos corpóreos, glicemias e intolerância à glicose durante a prenhez; determinar os níveis de danos no DNA maternos e dos recém-nascidos e correlacionar os níveis de danos no DNA maternos com os dos recém-nascidos. 19 MATERIAIS E MÉTODO Animais Foram utilizadas ratas Wistar, em idade reprodutiva (três meses), pesando aproximadamente 220g, e ratos Wistar pesando em torno de 250g. Os animais foram adquiridos do Centro de Investigação Biológica (CEMIB – Unicamp, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil) e adaptados no Laboratório de Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética de nossa Instituição. Seqüência Experimental Geração F0 Período de Diabetogênese - Indução do diabete O diabete foi induzido por streptozotocin (STZ – SIGMA Chemical Company, St. Louis, Millstone, EUA). STZ foi dissolvido em tampão citrato (0,1M, pH 4,5) e administrado via intravenosa (veia da cauda) na dose de 40 mg/kg de peso corpóreo para constituir o grupo diabético (Geração F0). A glicemia foi avaliada no 7o dia pós-administração de STZ com uso de glicosímetro convencional (One-Touch Ultra Johnson & Johnson), que expressa o valor em miligramas por decilitro (mg/dL). Para critério de inclusão dos animais no grupo com diabete grave (DG), foi considerada uma glicemia foi superior a 300 mg/dL (Rudge et al., 2007; Volpato et al., 2008; de Souza et al., 2010) e, para as ratas não-diabéticas (controle), que receberam somente o veículo (tampão citrato), foi considerada glicemia inferior a 120 mg/dL. Período de Acasalamento Após o período de diabetogênese, as ratas controle e diabéticas iniciaram a fase de acasalamento com duração máxima de 15 dias, que envolve pelo menos três ciclos estrais. Cada conjunto de quatro ratas foi colocado em gaiolas de polietileno, com cama de maravalha, na presença de um rato macho não-diabético durante o período noturno. Este procedimento foi realizado até atingir o número de réplicas em cada grupo experimental. Na manhã subsequente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais das fêmeas foram colhidos pela introdução de Cotonete embebido em solução fisiológica a 0,9% para análise em microscópio de luz. O fator indicativo de prenhez foi a presença de espermatozóides, sendo considerado dia zero de prenhez (Damasceno et al., 2002; Damasceno et al., 2008). As ratas F0 que não acasalaram neste período foram consideradas inférteis (Damasceno et al., 2002) e foram mortas por anestesia com tiopental 20 sódico (Thiopentax - 50 mg/kg de peso corpóreo). Período de Prenhez Durante a prenhez e a lactação, as ratas (controle e diabéticas) F0 foram mantidas em gaiolas individuais e, nestes períodos, foram colhidas amostras de sangue por punção da parte distal da cauda para determinação da glicemia materna por glicosímetro convencional para confirmação do diabete grave e normoglicemia das ratas controle. Após o período de amamentação da prole, as ratas da geração F0 foram mortas por anestesia com tiopental sódico (Thiopentax - 50 mg/kg) porque o objetivo foi estudar exclusivamente as sucessivas gerações (F1 e F2). As ratas não-diabéticas que receberam o veículo foram utilizadas posteriormente em outros experimentos. Geração F1 Obtenção da Geração F1 Os recém-nascidos (RN) foram obtidos por parto vaginal a partir da Geração F0. Após o nascimento, os RN foram pesados e foi realizada sexagem dos mesmos. Os RN fêmeas (F1) foram mantidos na presença da mãe para amamentação durante 21 dias, com número máximo de oito fêmeas, correspondentes aos oito tetos de cada mãe, para que a distribuição alimentar materna fosse equivalente para toda a prole. Os RN do sexo masculino só foram utilizados neste projeto para completar o número de oito filhotes porque o objetivo foi avaliar exclusivamente as alterações transgeracionais sob o ponto de vista do sexo feminino. Além disso, os RN machos oriundos de mães diabéticas (F0) não foram utilizados em outro ensaio, visto que poderiam apresentar alterações metabólicas decorrentes da presença do diabete materno, sendo então mortos por anestesia com tiopental sódico (Thiopentax - 50 mg/kg). Os RN machos oriundos de mães controle foram reutilizados em outros ensaios. Classificação dos pesos corpóreos dos recém-nascidos F1 A classificação dos pesos corpóreos fetais foi realizada de acordo com a média ± 1,0 x desvio-padrão dos pesos fetais obtidos da prole das ratas controle, que definiu três classes diferentes de pesos (Corvino & Damasceno, 2013) em: AIP – recém-nascidos de peso adequado para idade de prenhez: peso corpóreo compreendido entre a média de peso do grupo controle mais ou menos 1,0 x desvio-padrão; PIP – recém-nascidos pequenos para idade de prenhez: peso corpóreo inferior à média de peso do grupo controle menos 1,0 x desvio-padrão e GIP – recém-nascidos grandes para idade de prenhez: peso corpóreo superior à média de peso do grupo controle mais 1,0 x desvio- padrão. 21 O segundo critério de inclusão para a geração F1 foi a obtenção de RN classificados como PIP originados de ratas diabéticas e a obtenção de RN AIP originados de ratas não-diabéticas. Período Pós-desmame e Acasalamento No 22o dia de vida pós-natal (equivalente ao 1o dia de desmame), as ratas F1 foram separadas de suas mães e mantidas até a fase adulta. Na fase adulta (em torno do 90o dia de vida), as ratas da geração F1 (AIP e PIP) foram submetidas ao acasalamento com ratos Wistar machos não-diabéticos, conforme procedimento realizado com as ratas da geração F0. Período de Prenhez Durante a prenhez, as fêmeas foram mantidas em gaiolas individuais e distribuídas em quatro grupos experimentais (n mínimo = 4 ratas com prenhez a termo com filhotes): - Ratas (filhas de mães não-diabéticas) que nasceram com pesos adequados (AIP) e não foram submetidas à natação, - Ratas (filhas de mães não-diabéticas) AIP e foram submetidas à natação, - Ratas (filhas de mães diabéticas) que nasceram com pesos inferiores (PIP) e não foram submetidas à natação, - Ratas (filhas de mães diabéticas) PIP e foram submetidas à natação, 22 Geração F0: Fase adulta Ratas normoglicêmicas (não-diabéticas) e com diabete grave (diabéticas) Geração F1 Acasalamento (com machos sem qualquer doença clínica aparente) Estudo dos dados e da genotoxicidade materna cujas fêmeas (AIP ou PIP), exercitadas ou não, acasalaram com machos não-diabéticos (sem qualquer intervenção ou doença aparente) Acasalamento Prenhez Ao nascimento: classificação dos pesos corpóreos dos fetos AIP PIP Fêmeas Exercitadas e Não-exercitadas Fêmeas Exercitadas e Não-exercitadas Prenhez Geração F2 Ao nascimento: Estudo de danos no DNA (genotoxicidade) dos recém-nascidos com 10 dias de vida pós-natal 23 Intervenção: Prática do exercício físico (Natação) Uma semana antes do início da prática do exercício físico, as ratas dos grupos exercitados (PIP e AIP) foram colocadas diariamente em tanques de cimento (100 cm de comprimento x 70 cm de largura x 60 cm de profundidade), contendo nível máximo de 10 cm de água aquecida a temperatura de 31°C durante 10 minutos. Este procedimento permitiu a adaptação dos animais ao meio líquido, sem proporcionar condicionamento físico. O programa de natação, desenvolvido para a prática de exercício, seguiu a padronização de Volpato et al. (2006). As ratas submetidas ao exercício foram colocadas nos mesmos tanques de adaptação ao meio líquido, contendo 40 cm de água a 31°C, nível suficiente para que fossem estimuladas a nadar, sem sobrecarga adicional ao corpo. Esta atividade foi praticada diariamente em horário fixo durante seis dias por semana. A duração inicial foi de 20 minutos, com aumento progressivo de 10 minutos por dia até o máximo de 60 minutos, este tempo foi mantido até o 20º dia de prenhez. Teste Oral de Tolerância à Glicose (TOTG) No 17o dia de prenhez, foi realizado o TOTG para avaliação do desenvolvimento de alterações do metabolismo glicêmico, um marcador empregado rotineiramente na clínica, de acordo com o protocolo clínico para diagnóstico do diabete, em todas as ratas. Após seis horas de jejum, foi coletada uma gota de sangue por punção venosa da cauda das ratas para determinação glicêmica (tempo 0). Logo após, as ratas receberam solução de glicose (0,2 g/mL) via intragástrica (gavage) na dose de 2,0 g/kg de peso corpóreo. Decorridos 10, 20, 30 e 120 minutos após a administração da solução de glicose, foram determinadas as glicemias (Mello et al., 2001) e também estas medidas foram avaliadas pela estimativa da área total sob a curva usando matematicamente o método trapezoidal (Tai, 1994). Avaliação da glicemia e peso materno Nas tardes dos dias 0, 7º, 14º e 20º de prenhez, foram realizadas pesagens corpóreas e determinações glicêmicas utilizando glicosímetro convencional. Coleta de amostras de sangue total das ratas F1 para determinação de danos no DNA No final do experimento (10º dia pós-parto), foram coletados amostras de sangue total das mães F1 (volume de 500l) em um eppendorf contendo 100l de dimetilsulfóxido (DMSO) e 400l de RPMI 1640. Em seguida, foram levados para o freezer a -20° C por 24 horas. No dia seguinte, as amostras foram levadas para o freezer a -80° C e permaneceram lá até o preparo das lâminas para análise de danos no DNA (Netto & Damasceno, 2013) 24 Geração F2 Morte e obtenção das amostras de sangue Após o nascimento, foi realizada pesagem e sexagem de cada RN. Os recém-nascidos (F2), obtidos por parto vaginal das ratas da Geração F1, foram anestesiados e mortos para análise de danos no DNA no 10º dia de vida, pois esse período corresponde à fase de desenvolvimento do recém-nascido humano que acabou de desmamar (Quinn, 2005). Coleta de amostras de sangue total de recém-nascidos (10º dia de vida pós-natal) para determinação de danos no DNA Foram coletadas amostras de sangue de dois recém-nascidos (RN) por mãe (volume mínimo de 500l de sangue total dos RN). Cada eppendorf continha uma mistura de 100l de dimetilsulfóxido (DMSO) e 400l de RPMI 1640. Em seguida, foram levados para o freezer a -20°C por 24 horas. No dia seguinte, as amostras foram levadas para o freezer a -80°C e permaneceram lá até o preparo das lâminas para análise dos danos por no máximo quatro meses (Hininger et al., 2004). Teste do Cometa Para a avaliação dos níveis de danos no DNA, foram analisadas amostras do sangue total de dois recém-nascidos de cada mãe por grupo. Para esse teste, foram utilizados os seguintes materiais: agarose com ponto de fusão normal (Normal Melting Point - NMP) e agarose com baixo ponto de fusão (Low Melting Point - LMP) (Collins et al., 1998), cloreto de sódio, brometo de etídio, dimetilsulfóxido (DMSO), etil-diaminotetracetato de sódio, ácido clorídrico, hidróxido de sódio, N- Lauroil-sarcosinato, tampão salina fosfato (PBS) livre de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2+), Tris e Triton X-100. Preparo das lâminas Cada lâmina foi imersa em uma solução de agarose NMP e PBS livre de cálcio (Ca2+) e magnésio (Mg2) e colocadas para secar em temperatura ambiente. Preparo das amostras de sangue total e confecção de lâminas Com o auxílio de micropipeta, o sangue total das mães e dos RN (20l) foram misturados à agarose LMP (120l) e colocados sobre a lâmina com agarose NMP. Em seguida, foram colocadas lamínulas sobre as lâminas e foram levadas a geladeira (4oC) a fim de que a agarose se solidificasse. Foram feitas duas lâminas por amostra. Na etapa seguinte, as lâminas foram mergulhadas em solução de lise previamente gelada contendo NaCl (2,5 M), EDTA (100 mM), Tris (10mM), Triton X- 25 100 (1ml), DMSO (10 mL), N-Lauroil-sarcosinato (1%) e levadas à geladeira para obtenção dos nucleóides. As lâminas foram retiradas da solução de lise e lavadas com PBS gelado por 5 minutos. Eletroforese O Teste do Cometa foi realizado segundo o protocolo descrito por Tice (2000) com algumas modificações (Lima et al., 2008). As lâminas foram colocadas na cuba de eletroforese horizontal onde foram incubadas em solução tampão de eletroforese (pH=13), composta por NaOH e EDTA por 20 minutos a 4o C. Em seguida, foi realizada a corrida de eletroforese (25v, 30 minutos e 300 mA). Após a eletr