LUZ MARIA RUIZ MACHUCA IMPACTOS FISIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS CAUSADOS PELA DEFICIÊNCIA HÍDRICA EM PLANTAS DE PIMENTÃO (Capsicum annuum L.) BOTUCATU 2018 LUZ MARIA RUIZ MACHUCA IMPACTOS FISIOLÓGICOS E BIOQUÍMICOS CAUSADOS PELA DEFICIÊNCIA HÍDRICA EM PLANTAS DE PIMENTÃO (Capsicum annuum L.) Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Agronomia (Irrigação e Drenagem). Orientador: Prof. Dr. Fernando Broetto Botucatu 2018 Aos pilares da minha vida.... Meus pais, Delia e Alfonso; Porque o amor dos pais é único e verdadeiro; Por terem confiado em mim incondicionalmente, Dedico AGRADECIMENTOS A Deus pela oportunidade de viver e cuidar de mim esses 17 anos longe de meus amados pais. Aos meus pais Delia e Alfonso, pelo apoio incondicional, amor, confiança e respeito ao longo da minha vida. Muito obrigada por tudo, não existem palavras para agradece-lhes. Amo vocês! Ao professor Fernando Broetto, agradeço de coração o apoio incondicional, por ter confiado em mim e pela orientação ao longo desta jornada. Que Deus abençoe hoje e sempre a você e sua família. Aos meus lindos irmãos e família, que além de tudo e apesar da distância a gente têm boas lembranças da nossa infância. Ao meu companheiro, amigo e amado esposo Enrique, você sabe que no amor não existem palavras e sim uma mirada para saber que a gente se ama. Aos companheiros da turma velha do laboratório: Renata, Dayanne, Erica, Ricardo, Diogo, Edilson, Vladimir e Jéssica. Obrigado pela confiança e por abrir as portas de sua casa. Aos companheiros da turma nova: Tamiris, Osvaldir, Mara, Dariane, Ícaro, Irineu e Alessandro. Muito obrigado por tudo! Às pessoas que se acercaram a mim perguntando se precisava de ajuda para meu trabalho no campo e laboratório agradeço a Danni, Tulio, Rafael, Francielly, Jannaylton, Esteban, Darlin, Vitoria e Filipe. Muito obrigado. Aos amigos brasileiros que confiaram na gente (Enrique e eu) e que sempre estarão no meu coração: Nilzinha, Ademir, Patrícia, Paulinho, Lucas Conte, Adolfo Arlanch, Dirceu e Matheus. Aos colegas e amigos “latinos” com os que a gente se reunia para falar espanhol e divertirmos: Francisco, Graciela, Deisy, Aníbal, Andrés, Fabiola, Adela e Ariel. Aos professores Rodrigo e Alba, obrigado pela sinceridade, amizade e pelos momentos de alegria que passamos juntos. Aos professores da banca, Roberto Lyra, Marcelo Leonardo, Magali Ribeiro e William Zambuzzi. À professora Marcia Pereira, pela amizade e esclarecimento de minhas dúvidas referentes a estatística. Aos funcionários do Departamento de Engenharia Rural, a Fabiana, Gilberto e Rafaela, obrigado pelo apoio. Ao pessoal da biblioteca, pela amabilidade no atendimento e profissionalismo. Ao pessoal do Departamento de manutenção do IBB, pelo apoio nas atividades realizadas em campo, especialmente ao Alexandre Gonçales e Matias. À Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Câmpus de Botucatu. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro para terminar meus estudos de doutorado. Ao Brasil, gigante pela própria natureza. Muito obrigado! RESUMO O pimentão é uma cultura de grande interesse agrícola e econômico para o Brasil. Como hortaliça, demanda práticas de irrigação, para garantir a produção e qualidade de frutos. Devido à dependência direta da água para seu manejo, este recurso pode ser fator limitante para o desenvolvimento da cultura. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar as diferenças na morfologia e fisiologia em plantas de pimentão, submetidas a diferentes lâminas de irrigação nas estações inverno e verão. As plantas foram cultivadas em vasos de 22 Kg de solo, utilizando o sistema de irrigação por gotejamento. O desenho experimental foi organizado em delineamento inteiramente casualizado (DIC) com três tratamentos e cinco repetições. Os tratamentos foram divididos em controle (C; Ψm do solo= 10 a 15 KPa); Deficiência Hídrica Moderada (DHM; Ψm do solo= 34- 40 KPa) e Deficiência Hídrica Severa (DHS; Ψm do solo= 54 a 60 KPa). As plantas se mantiveram sem restrição hídrica até os 50 dias após transplantio (DAT). Foram realizadas quatro avaliações aos 50, 65, 80 e 95 DAT em que as plantas foram coletadas e separadas para avaliar o potencial hídrico foliar (ψhf), conteúdo relativo de água, perda de eletrólitos, biometria, avaliação nutricional da folha, variáveis fisiológicas, discriminação isotópica do δ13C e δ15N e análises bioquímicas. Finalmente coletou- se frutos para determinação da produtividade. A deficiência hídrica (DH) provocou redução no potencial hídrico foliar, ocasionando diminuição geral dos parâmetros avaliados o que resultou em perdas consideráveis na produção de frutos. No entanto, o tratamento DHS ocasionou danos mais marcantes no crescimento e produtividade da cultura de pimentão. Os resultados obtidos confirmaram a hipótese da dependência da água no crescimento e produtividade da cultura do pimentão em ambiente protegido. Palavras-chave: Pimenteiro, níveis de irrigação, trocas gasosas, atividade enzimática, discriminação isotópica, produtividade. ABSTRACT Bell pepper is a crop of great agricultural and economic interest to Brazil. As a vegetable, it demands irrigation practices, to guarantee the production and quality of fruits. Due to the direct dependence of water for its management, this resource can be a limiting factor for the development of the crop. In this context, this study had as objective to evaluate the differences in morphology and physiology in Bell pepper plants, submitted to different irrigation depths in winter and summer seasons. The plants were cultivated in pots of 22 kg of soil, using the drip irrigation system. The experimental design was arranged in a completely randomized design (CRD) with three treatments and five replicates. The treatments were divided in control (C; Ψm of soil = 10 to 15 KPa); Moderate Water Deficiency (MWD; Ψm of soil = 34-40 KPa) and Severe Water Deficiency (SWD; Ψm of soil = 54 to 60 KPa). The plants were maintained without water restriction until 50 days after transplanting (DAT). Four evaluations were performed at 50, 65, 80 and 95 DAT in which the plants were collected and separated to evaluate leaf water potential (ψlw), relative water content, electrolyte loss, biometry, leaf nutrient evaluation, physiological variables, isotopic discrimination of δ13C and δ15N and biochemical analyzes. Fruits were finally collected for yield determination. The water deficit (WD) caused a reduction in the leaf water potential, causing a general decrease of the evaluated parameters, which resulted in considerable losses in the fruit production. However, the SWD treatment caused more marked damages in the growth and productivity of the Bell pepper crop. The results confirmed the hypothesis of water dependence on the growth and productivity of the pepper crop in a protected environment. Key words: Pepper, irrigation depths, gas exchange, enzymatic activity, isotopic discrimination, productivity. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AF Área foliar AFE Área foliar especifica C controle CAT Catalase Ci Concentração interna de carbono CRA conteúdo relativo de água DAT Dias após transplantio DC Diâmetro de caule DH Deficiência hídrica DHM Deficiência Hídrica Moderada DHS Deficiência Hídrica Severa E Transpiração EROs Espécies reativas de oxigênio ET evapotranspiração ETc evapotranspiração da cultura FNC Frutos não comerciáveis FP Frutos por planta FP Número de frutos por planta gs Condutância estomática MF Massa fresca MFF Massa fresca de folhas MMF Massa média de fruto MS Massa seca MTFP Massa total de frutos por planta NF Número de folhas NHC Necessidade Hídrica da Cultura NR Nitrato redutase PC Produção comercial PE Perda de eletrólitos PST Proteína solúvel total PT Produtividade total RAF Razão de área foliar RMF Razão de Massa Foliar SOD Superóxido dismutase SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 19 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 20 2.1 A cultura do pimentão .......................................................................................... 20 2.2 A importância da água para a irrigação na cultura do pimentão .......................... 20 2.3 Efeito da deficiência hídrica no crescimento vegetativo das plantas .................... 22 2.4 Efeito da deficiência hídrica na fisiologia e bioquímica das plantas ..................... 23 2.5 Aplicação dos isótopos δ 13C e δ 15N em plantas sob estresse ........................... 24 3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 26 3.1 Localização dos experimentos ............................................................................. 26 3.2 Material vegetal utilizado ..................................................................................... 26 3.3 Análise do solo e adubação mineral de plantio ................................................... 27 3.3.1. Adubação mineral de cobertura ....................................................................... 28 3.4 Irrigação .............................................................................................................. 29 3.4.1 Sistema de irrigação utilizado ........................................................................... 29 3.4.2 Curva característica de retenção de água no solo ............................................ 29 3.4.3 Manejo da irrigação ......................................................................................... 30 3.5 Tratamentos ........................................................................................................ 32 3.6 Monitoramento da tensão da água no solo .......................................................... 32 3.7 Manejo da Cultura ............................................................................................... 33 3.8 Prevenção de pragas e doenças ......................................................................... 33 3.9 Avaliações ao longo dos ensaios ......................................................................... 34 3.10 Delineamento experimental ............................................................................... 34 3.11 Plantas utilizadas em cada avaliação ................................................................ 34 3.12 Análise estatística ............................................................................................. 35 3.13 Temperatura do local de estudo ........................................................................ 35 3.14 Variáveis avaliadas ........................................................................................... 36 3.14.1 Relações hídricas ........................................................................................... 36 3.14.1.1 Potencial hídrico foliar ................................................................................. 36 3.14.1.2 Conteúdo relativo de água ......................................................................... 36 3.14.1.3 Perda de eletrólitos ..................................................................................... 37 3.14.2 Variáveis de crescimento ............................................................................... 37 3.14.2.1 Altura das plantas........................................................................................ 37 3.14.2.2 Diâmetro do caule ....................................................................................... 37 3.14.2.3 Número de folhas e área foliar ................................................................... 37 3.14.2.4 Massa de matéria fresca e seca das raízes da planta ............................. 38 3.14.2.5 Massa de matéria fresca e seca da parte aérea da planta ..................... 38 3.14.2.6 Índices de crescimento ............................................................................... 38 3.14.3 Avaliação nutricional das folhas ..................................................................... 39 3.14.4 Características fisiológicas das plantas .......................................................... 39 3.14.4.1 Trocas gasosas ........................................................................................... 39 3.14.4.2 Teor de pigmentos ...................................................................................... 40 3.14.5 Análises bioquímicas...................................................................................... 40 3.14.5.1 Determinação da atividade da enzima nitrato redutase (NR) ...................... 40 3.14.5.2 Coleta e armazenamento do material vegetal ............................................. 41 3.14.5.3 Procedimento para obtenção do extrato bruto ............................................ 41 3.14.5.4 Determinação do teor de proteína solúvel total (PST) ................................. 42 3.14.5.5 Determinação da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) .......... 42 3.14.5.6 Determinação da atividade da enzima catalase (CAT) ................................ 42 3.14.6 Análises da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N ..................................... 43 3.14.7 Produção de frutos ......................................................................................... 44 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 46 4.1 Temperatura máxima, média e mínima do ar ...................................................... 46 4.2 Tensão de água no solo ...................................................................................... 47 4.3 Relações hídricas ................................................................................................ 49 4.3.1 Potencial hídrico foliar....................................................................................... 49 4.3.2 Conteúdo relativo de água ................................................................................ 51 4.3.3 Perda de eletrólitos ........................................................................................... 53 4.4 Variáveis de crescimento ..................................................................................... 54 4.4.1 Altura das plantas ............................................................................................. 54 4.4.6 Diâmetro de caule ............................................................................................. 55 4.4.4 Número de folhas e área foliar .......................................................................... 56 4.4.1 Massa fresca e seca de raízes ......................................................................... 57 4.4.3 Massa fresca e seca de folhas ......................................................................... 61 4.5 Índices de crescimento ........................................................................................ 62 4.5.1 Razão de área foliar (RAF) ............................................................................... 62 4.5.2 Área foliar específica (AFE) .............................................................................. 64 4.5.3 Razão de massa foliar (RMF) ........................................................................... 66 4.6 Avaliação nutricional em folhas ........................................................................... 67 4.6.1 Teor de macronutrientes em folhas de pimentão nos ensaios de inverno e verão .................................................................................................................................. 67 4.6.2 Teor de micronutrientes em folhas de pimentão nos ensaios de inverno e verão .................................................................................................................................. 68 4.7 Características fisiológicas das plantas ............................................................... 69 4.7.1 Trocas gasosas ................................................................................................ 69 4.7.1.1 Assimilação líquida de CO2 (A) ...................................................................... 69 4.7.1.2 Condutância estomática (gs) .......................................................................... 71 4.7.1.3 Concentração intercelular de CO2 (Ci) ........................................................... 72 4.7.1.4 Transpiração (E) ............................................................................................ 74 4.7.2 Teor de pigmentos ........................................................................................... 77 4.7.2.1 Clorofilas a e b .............................................................................................. 77 4.7.2.2 Carotenoides ................................................................................................. 79 4.8 Parâmetros bioquímicos...................................................................................... 80 4.8.1 Atividade da enzima nitrato redutase (NR) ....................................................... 80 4.8.2 Teor de proteína solúvel total (PST) ................................................................. 82 4.8.3 Atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) .......................................... 83 4.8.4 Atividade da enzima catalase (CAT) ................................................................ 84 4.9.1 Discriminação isotópica de nitrogênio (δ15N) .................................................... 86 4.9.2 Discriminação isotópica de carbono (δ13C) ...................................................... 87 4.10 Produção de frutos de pimentão ....................................................................... 88 5 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 91 REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 93 19 1 INTRODUÇÃO O pimentão (Capsicum annuum L.) é cultivado e consumido em todo o território nacional brasileiro, sendo os principais produtores: Minas Gerais, São Paulo, Ceará, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Pernambuco, somando 87% da produção total (HFBRASIL, 2017). Por outro lado, diversos estudos confirmam que a redução de água no solo durante a fase vegetativa e reprodutiva do pimentão pode afetar a produtividade final (GONZALEZ-DUGO et al., 2007; SEZEN et al., 2006). A deficiência hídrica (DH) é o principal problema que afeta o crescimento, produção de matéria fresca e seca das plantas, quantidade e qualidade das colheitas. A época e duração da DH são muito importantes para determinar como a planta responde a esse tipo de estresse (ANJUM et al., 2011). Delfine et al. (2001) reportam que plantas de pimentão em condições de sequeiro, a fotossíntese e condutância estomática são reduzidas com o decorrer do tempo, afetando a produção final, quando comparadas com as plantas irrigadas. Por isso é necessário abordar alguns fatores morfológicos e fisiológicos que influenciam a habilidade das plantas a se adequar a menor disponibilidade de água no solo (SANTOS et al., 1998). Desse modo, a hipótese deste trabalho é que a maior restrição de água em plantas de pimentão seu crescimento e produtividade serão afetados, havendo diferença da resposta no comportamento fisiológico e fenológico em duas estações climáticas diferentes. O objetivo geral deste trabalho foi avaliar as diferenças na fisiologia e fenologia em plantas de pimentão, submetidas a diferentes lâminas de irrigação nas estações inverno e verão. O objetivo especifico foi avaliar a resposta no crescimento, na eficiência fotossintética, na atividade enzimática, análises de razão isotópica de δ13C, δ15N e produção de frutos em plantas de pimentão cultivadas sob diferentes regimes de água no solo em ambiente protegido. . 20 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 A cultura do pimentão O pimentão (Capsicum annuum L.) pertence à família das Solanáceas, originário do México e américa central (NICK; BORÉM, 2016). A planta é herbácea perene, com crescimento arbustivo, pode atingir até 5 metros ou mais quando conduzida com tutores. Produz frutos do tipo baga, de formato cônico, cilíndrico ou cúbico (FILGUEIRA, 2012). No entanto, o pimentão se diferencia das pimentas por não possuir ou ter pouca quantidade de capsaicina que é o alcaloide que confere pungência às pimentas. Seu sistema radicular é pivotante e profundo, (dependendo da profundidade e textura do solo). O maior volume das raízes se concentra entre os 30 e 60 cm. O Caule é semilenhoso, e a partir de certa altura (cruz) tem duas ou três ramificações (dependendo da variedade) e continua ramificando-se até o final do seu ciclo. As folhas são simples, inteiras, lanceoladas ou ovadas dependendo das cultivares. As flores são pequenas, de cor branca e hermafroditas (CONDÉS RODRÍGUEZ 2017). Por outro lado, o pimentão é uma hortaliça sensível às geadas. A faixa de temperaturas para seu crescimento ótimo é de 18 a 27 °C durante o dia e de 15 a 18 °C durante a noite (FAO, 2018). A temperatura máxima para o pimentão na fase de germinação é de 35 °C, na fase de crescimento vegetativo é de 40 °C e na fase de floração e frutificação de 35 °C. 2.2 A importância da água para a irrigação na cultura do pimentão O crescimento das hortaliças é influenciado pela umidade do solo, sendo normalmente a restrição hídrica o fator mais limitante para a obtenção de elevadas produtividades (FAO, 2017). O Brasil possui 12% das águas doces superficiais do planeta, tendo um papel importante na produção agrícola mundial (FAO, 2017). No entanto, a irrigação é considerada pequena diante da boa disponibilidade dos recursos hídricos, fatores físico-climáticos favoráveis e expansão territorial. Em geral, a área irrigada incluindo diferentes sistemas de irrigação é de 6,95 milhões de hectares (ANA, 2015). 21 A produção do pimentão no Brasil é realizada a campo aberto, em casas de vegetação e com cobertura plástica no solo, sendo o sistema de irrigação fundamental para suprir as necessidades hídricas das culturas. Para a produção de hortaliças em cultivo protegido a irrigação por gotejamento é usada pelos produtores, sendo que oferece vantagens como: menor consumo de água e energia, fornecimento dos fertilizantes via fertirrigação, aumentando assim a produção das culturas. No entanto, a irrigação por aspersão não é recomendada para o pimentão, pois beneficia a incidência de doenças na parte aérea das plantas (BRAGA; MAROUELLI, 2017). Apesar de tão conhecidos os benefícios da irrigação, ainda há dificuldades de dimensionar sua importância na quantidade e qualidade das colheitas para a segurança alimentar da sociedade brasileira (ANA, 2017). Existem inúmeros trabalhos focados na aplicação de diferentes quantidades de água nas espécies de pimentas, enfatizando a importância da aplicação de água no pimentão. Por exemplo, Delfine et al. (2001) trabalharam com pimentão em condições de campo utilizando sistemas de irrigação localizada e sequeiro, observando que em condições de sequeiro o pimentão foi afetado até a fase de maturação dos frutos afetando a produção final. Santana et al. (2004) trabalharam com plantas de pimentão sob diferentes tensões de água no solo (10, 30, 50 e 60 KPa), e obtiveram a maior produtividade total e comercial sob a tensão de 10 KPa. Ferrara et al. (2011) trabalharam com deficiência hídrica em pimentão na etapa vegetativa e reprodutiva. Os resultados obtidos pelos autores demostraram que a deficiência hídrica na etapa reprodutiva ocasionou maior repercussão na produtividade. Além disso, sabe-se que, em condições protegidas, a produtividade das culturas é maior do que em condições de sequeiro. No entanto, é importante saber realizar adequadamente o manejo da irrigação, sendo que um excesso ou restrição de água no solo pode prejudicar a produtividade final. O pimentão, quando cultivado em ambiente protegido pode ter um tempo de colheita de até nove meses, atingindo produtividade de 150 t ha-1 (HORTIFRÚTI, 2017). No entanto, a produtividade em estufa varia dependendo do controle do 22 ambiente protegido, densidade de plantação, cultivar utilizada, poda, ciclo da cultura e irrigação. 2.3 Efeito da deficiência hídrica no crescimento vegetativo das plantas O estresse hídrico (seja por excesso ou restrição) é refletido principalmente nas folhas, causando clorose, necrose, desequilíbrio hormonal, redução da expansão foliar, espessamento da cutícula, murcha e diminuição da massa foliar (HUSSAIN; BARKET, 2015). Ainda segundo os autores, o impacto negativo devido a todos esses efeitos, leva à diminuição do tempo de vida ativa das folhas (longevidade), afetando o crescimento geral da planta. Em algumas espécies vegetais a deficiência hídrica afeta principalmente a parte aérea das plantas, provavelmente aquelas em que os assimilados provenientes da parte aérea sustentam o crescimento das raízes. Além da acumulação do ácido absícico (ABA) produzido na raiz para impedir a síntese do etileno (HSIAO; ACEVEDO, 1974). As fases consideradas as mais susceptíveis à deficiência hídrica são germinação (GUIMARÃES, 1996), floração e crescimento dos frutos (JAIMEZ et al., 2000). O potencial hídrico (Ψh) é um bom indicador para medir o estado hídrico das plantas. O Ψh é o potencial químico da água (energia livre). O Ψh da água pura (a uma atmosfera) é zero, o Ψh = Ψs + Ψp + Ψg. O potencial osmótico (ΨS) da água é zero, a presença de solutos o torna negativo. O potencial de pressão (Ψp) é medido em relação ao meio ambiente na célula, podendo ser positivo (célula turgida) ou negativo (célula plasmolisada). O potencial gravitacional (Ψg) somente é significativo para árvores altas. A água nas plantas se movimenta de zonas com Ψh mais alto (menos negativo) para zonas com Ψh mais baixo (mais negativo). As células vegetais procuram o equilíbrio termodinâmico com o meio ambiente que os rodeia absorvendo ou perdendo água (TAIZ; ZEIGER, 2002). Desse modo, uma técnica relativamente fácil para medir o Ψh é com auxílio da câmera de pressão, descrita por Scholander et al. (1965). 23 2.4 Efeito da deficiência hídrica na fisiologia e bioquímica das plantas A nível celular ainda são pouco compreendidas as condições físico- mecânicas que causam alterações no metabolismo das células das plantas sob desidratação (LAWLOR, 2002). A resposta das plantas à deficiência hídrica difere entre espécies, o qual inclui diferentes processos próprios da planta e efeitos do estresse (BLUM, 1997). Diversos estudos corroboram que as plantas sob condições de restrição hídrica fecham os estômatos, causando redução na assimilação de CO2 (FARQUHAR et al., 1982; TANG et al., 2002). O fechamento estomático está ligado ao teor do ácido absicico, o qual é acumulado nas raízes e transportado para as células guarda dos estômatos, reduzindo o efeito da deficiência hídrica Em condições ambientais não favoráveis para o crescimento dos vegetais a fotossíntese diminui e a fotorrespiração aumenta, ocasionado maior produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) Mittler et al. (2010). As EROs são moléculas mais reativas que o oxigênio molecular O2, tendo maior facilidade em reagir com outras substancias, podendo gerar reações em cascata. São moléculas tóxicas, que podem causar danos oxidativos às proteínas, ao DNA e aos lipídios (APEL; HIRT, 2004). As formas mais comuns das EROs são os radicais superóxido (O2 -), hidroxila (OH-), peróxido de hidrogênio (H2O2) e oxigênio singleto (1O2). As plantas para se adaptar à diminuição do potencial hídrico e mudanças climáticas desfavoráveis, possuem sistemas enzimáticos antioxidativos e não enzimáticos, os quais ajudam a diminuir a produção das EROs. Algumas enzimas do sistema antioxidativo são a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) ascorbato peroxidase (APX), e outros antioxidantes não enzimáticos como o ácido ascórbico (AsA) e glutationa (GSH) (APEL; HIRT, 2004; DIETZ et al., 2006). A SOD é a primeira linha de defesa contra as EROs, realizando a dismutação dos radicais superóxido (O2 -), para peroxido de hidrogênio (H2O2). A enzima catalase é a principal que atua na decomposição do peroxido de hidrogênio (H2O2) até água (H2O) e oxigênio molecular (O2). E a enzima ascorbato peroxidase que catalisa a decomposição do peroxido de hidrogênio em água utilizando o ascorbato como doador de elétrons. 24 As respostas das plantas em relação ao sistema antioxidante enzimático são diferentes em cada genótipo, adaptando-se ao estresse aquele que tem à biossíntese das enzimas mais ajustada (MONTAVON et al., 2006; ALSCHER et al., 2002). Outra enzima importante é a nitrato redutase (NR), a qual é reprimida como consequência da diminuição do fornecimento de água para as plantas (MEYERS- JÚNIOR et al.,1986). Em plantas superiores, fungos e algas, a enzima nitrato redutase (NR), atua na assimilação do nitrogênio reduzindo o nitrato (NO3 -) a nitrito (NO2 -). Provavelmente a redução dos valores da NR em plantas sob estresse hídrico, está relacionado à diminuição da absorção do nitrogênio (CAMPBELL, 1988). 2.5 Aplicação dos isótopos δ 13C e δ 15N em plantas sob estresse Os isótopos δ13C e δ 15N são utilizados na ecofisiologia para avaliar as respostas das plantas a mudanças climáticas, sendo que ambos são sensíveis às restrições ambientais (PEUKE et al., 2006) As análises isotópicas do carbono medem a relação de 13C/12C das amostras e os resultados são expressos em termos de diferença de 13C em relação ao padrão. Em plantas, a maioria dos trabalhos sob o isótopo δ13C é realizado a nível foliar, sabendo-se que nesse órgão vegetativo ocorre o maior fracionamento da fotossíntese. No entanto, o carbono nas plantas pode ter variações genotípicas e ambientais diferentes, dependendo do órgão vegetativo (MATEO et al., 2004). A discriminação do isótopo δ13C pelas folhas de plantas C3 está relacionada com as trocas gasosas da fotossíntese, podendo estar controlada pela razão da concentração do CO2 nos espaços intercelulares das folhas e da atmosfera (FARQUHAR et al.,1982). As plantas sob condições de boa disponibilidade de água no solo, aproveitam a maior disponibilidade de CO2 para aumentar sua eficiência hídrica. Embora haja redução da condutância estomática nessas condições não há limitação da fotossíntese, tornando-se os valores do isótopo δ13C mais negativos (maior discriminação do δ13C) à medida que a concentração de CO2 aumenta (BEERLING; WOODWARD, 1995). 25 A composição isotópica natural do 15N/14N (δ15N) poderia ser usado como marcador do metabolismo do N em plantas sob diferentes condições. No entanto, sabe-se que o metabolismo no N primário é complexo e as perdas ou ganhos diferem com o tempo (ARIZ et al., 2015). O fracionamento do isótopo de nitrogênio na planta ocorre como resultado da assimilação do NO3 - ou NH4 + na translocação para as folhas e o metabolismo no nitrogênio no citoplasma. Diversos estudos observaram que o δ15N diminui com a idade da planta e intensidade de luz, no entanto, aumenta com maiores concentrações de NO3 - (WADA; HATTORI, 1978; KOHL; SHEARER, 1980). 26 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Localização dos experimentos Foram conduzidos dois experimentos em estufa agrícola com uma área de 63 m2 no Distrito de Rubião Júnior (Figura 1), Departamento de Química e Bioquímica do IB/UNESP em Botucatu-SP, com coordenadas geográficas 22º 53’ 25 ’ ’de latitude Sul e 48º 27’ 19’’de longitude Oeste e 840 m de a ltitude. O clima de Botucatu segundo Koppen é Cfa [clima temperado quente (mesotérmico) úmido, com temperatura média do mês mais quente superior a 22ºC]. O primeiro ensaio foi realizado entre os meses de junho-outubro de 2016 correspondente às estações de inverno-primavera e o segundo entre janeiro-maio 2017 durante as estações de verão-outono, com a finalidade de conferir se existia influência da temperatura em estações diferentes do ano além da deficiência hídrica, portanto os ensaios foram denominados inverno e verão. Figura 1- Estufa agrícola utilizada nos dois ensaios (inverno e verão), localizada no Distrito de Rubião Júnior. Departamento de Química e Bioquímica do IB/UNESP em Botucatu-SP 3.2 Material vegetal utilizado Para os dois experimentos, foram utilizadas mudas de pimentão (Capsicum annum L.), cultivar “Gaston” o qual apresenta coloração vermelha quando maduro (Figura 2). Para ambos os experimentos o transplantio foi feito 40 dias após a semeadura (de 4 a 6 folhas verdadeiras), colocando uma planta por vaso. 27 Figura 2- Transplantio das mudas de pimentão, com idade de 40 dias (de 4 a 6 folhas verdadeiras) após a semeadura 3.3 Análise do solo e adubação mineral de plantio O solo foi coletado na Fazenda Experimental São Manuel, sendo que amostras de 0 a 20 cm de profundidade foram enviadas para análise no Departamento de Solos e Recursos Ambientais da FCA/UNESP cujo resultado está resumido no Quadro 1. Quadro 1- Resultado da análise química do solo, procedente da Fazenda São Manuel-UNESP e utilizado para ambos os ensaios pH M.O. Presina Al 3+ H+Al K Ca Mg SB CTC V% S CaCl2 g/dm 3 mg/dm 3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ mmolc/dm 3 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __ mg/dm 3 6.3 7 24 0 12 1.1 18 7.0 26.2 38,2 69 7 BORO COBRE FERRO MANGANÊS ZINCO -------------------------mg/dm 3 --------------------------- 0.70 1.4 14 9.8 1.0 Baseado nos valores (Quadro 1), calculou-se e aplicou-se calcário dolomítico (5,45 g/vaso) com PRNT a 90% (Poder Relativo de Neutralização Total), visando elevar a V% a 80, valor recomendado para a cultura do pimentão de acordo com Raij et al. (1997). De acordo com a análise do solo (Quadro 1) e conforme recomendado no boletim técnico 100 do IAC (Quadro 2), foi feita a adubação mineral de plantio por ocasião da estruturação dos experimentos (inverno e verão). Adaptando-se os valores para o volume de 22L, aplicou-se 40 kg ha-1 de Nitrogênio, 600 kg ha-1 de P2O5, e 180 kg ha-1 de K2O, nas formas de Nitrato de amônio (2 g/vaso) 28 Superfosfato simples (19 g/vaso), Termofostato (20 g/vaso) e Cloreto de potássio (4 g/vaso), respectivamente. Desse modo, pode-se observar que utilizou-se duas fontes de fosfato, pois o Superfosfato simples proporciona enxofre, elemento essencial para o crescimento do pimentão e o Termofostato (fonte de micronutrientes). Em ambos os ensaios utilizou-se solo da fazenda são Manuel como explicado no item 3.3. Ao final do primeiro ensaio o solo foi descartado, trazendo novamente solo do mesmo local para o segundo ensaio, aplicando-se as mesmas quantidades de calcário e fertilizantes para a correção e adubação do solo (RAIJ et al., 1997; TRANI; CARRIJO, 2004). Para a adubação mineral de plantio os fertilizantes e o calcário foram misturados numa betoneira junto com o solo correspondente para cada vaso (40 dias antes do transplantio das mudas), efetuando-se a irrigação até capacidade de campo. Posteriormente foi colocado plástico acima dos vasos, com a finalidade de que os fertilizantes e o calcário reagirem com o solo. Quadro 2- Quantidade de nutrientes (kg ha-1) recomendadas pelo Boletim Técnico 100 do Instituto Agronômico de Campinas P resina, mg dm3 K trocável, mmolc dm3 0-25 26-60 >60 0-1,5 1,6-3,0 >3,0 N kg ha-1 P2O5 kg ha-1 K2O kg ha-1 40 600 320 160 180 120 60 3.3.1. Adubação mineral de cobertura A adubação de cobertura, para cada planta por vaso y para ambos os ensaios (inverno e verão) foi baseada nas recomendações de Trani e Carrijo (2004), a qual faz um balanço dos nutrientes para cada etapa de crescimento. Utilizou-se os fertilizantes: Fosfato monoamônico, (2 g/vaso) Nitrato de potássio (13 g/vaso), Nitrato de cálcio (8 g/vaso), e Sulfato de magnésio (12 g/vaso). Dependendo da época de aplicação (fase vegetativa, floração e frutificação) os fertilizantes aplicados Nitrogênio 29 foram misturados em um balde com água e aplicados em partes iguais para todas às plantas. 3.4 Irrigação 3.4.1 Sistema de irrigação utilizado Foi utilizado sistema de irrigação por gotejamento em ambos os ensaios (Figura 3). Composto por caixa de água, bomba hidráulica, manômetro, filtro de discos, válvulas de pressão, ventosa, linhas principais de PVC, válvulas solenoides, hidrômetros e linhas de derivação. Foram utilizados gotejadores com vazão de 2 L h-1, com distribuidor (manifold) de duas saídas, em cada saída foi integrado um microtubo e um gotejador tipo flecha com vazão de 1 L h-1. A distância entre plantas foi adequada conforme a dimensão da estufa, o que resultou em espaçamento entre plantas de 50 cm e entre linhas de irrigação 40 cm. Figura 3- Sistema de irrigação localizada, utilizado em ambos os ensaios 3.4.2 Curva característica de retenção de água no solo Para monitorar a umidade no solo por meio da técnica de tensiometria, foi necessário determinar previamente a curva de retenção de água no solo. Para tanto, foram coletadas amostras de solo e encaminhadas para o Departamento de Engenharia Rural da FCA/UNESP sendo que a curva foi obtida utilizando-se o método da câmara de pressão de Richards. Para a modelagem da curva e determinação da capacidade de água disponível no solo foi utilizado o software SWRC (Soil Water Retention Curve) versão 3.0 conforme descrito por Dourado Neto et al. (1995). 30 Figura 4 - Diagrama da curva característica de retenção de água (θ, umidade volumétrica) do solo A curva de retenção de água foi ajustada pelo modelo de Van Genuchen (1980) e está determinada pela Equação 1. 𝜃 = θs−θr [1+(α⌊Ψm⌋)n]m (1) Em que: θ (ѱm) = umidade volumétrica em função do potencial mátrico, cm3 ·cm3; θr = umidade volumétrica residual do solo, em cm3·cm3; θs = umidade volumétrica do solo saturado, em cm3·cm3; n e m = parâmetros de regressão da equação, adimensionais; α = parâmetros com dimensão igual ao inverso da tensão, em KPa-1; ѱm = potencial matricial de água no solo, em KPa. 3.4.3 Manejo da irrigação Com os valores de potencial matricial do solo obtidos da curva característica e ajustada pelo modelo de Van Genuchen (1980) calculou-se as lâminas de irrigação, considerado o conceito da capacidade de água disponível (CAD), demonstrado pela Equação 2. 31 CAD = (CC − PMP)x Z (2) Em que: CAD - capacidade de água disponível (mm); CC - teor volumétrico de água na capacidade de campo (cm3 cm-3); PMP - teor volumétrico de água no ponto de murcha permanente (cm3 cm-3); Z - profundidade efetiva do sistema radicular (mm). Também foi feito o teste de uniformidade de distribuição de água no sistema de irrigação pelo método de Coeficiente de Uniformidade de Distribuição (CUD) antes do início dos ensaios (Equação 3). CUD = ( X25 X ) . 100 (3) Em que: CUD - coeficiente de uniformidade de distribuição em (%); X 25 - média dos 25% menores valores de vazão coletados (L h-1); X - vazão média aplicada (L h-1). A determinação da lâmina de irrigação (mm), foi baseada na Equação 4 e posteriormente determinou-se o tempo de irrigação (minutos) para cada tratamento conforme a Equação 5. La = FCAD Ef 4 Em que: La - lâmina aplicada (mm); FCAD – frações da capacidade de água disponível (mm); Ef - eficiência de irrigação. Ti = ( La x A n x q ) ∗ 60 (5) 32 Em que: Ti - tempo de irrigação (min); La - lâmina aplicada (mm); A - área ocupada por planta (m2); n - número de emissores por planta (1); q - vazão do gotejador (L h-1). 3.5 Tratamentos Quadro 3- Lâminas de irrigação utilizadas como tratamentos nos ensaios inverno e verão Tratamentos Necessidade Hídrica da Cultura (NHC) Ψm do solo (kPa) Controle (C) 100 % 10-15 Deficiência hídrica moderada (DHM) 70 % 34-40 Deficiência hídrica severa (DHS) 50 % 54-60 3.6 Monitoramento da tensão da água no solo Para manter a tensão de cada tratamento (item 3.5) foram instalados seis tensiômetros por tratamento a uma distância de 5 cm do caule da planta e 15 cm de profundidade do solo. Diariamente no período da manhã das 8:00 a 8:30 horas, a leitura da tensão do solo foi efetuada com auxílio do tensímetro digital, o qual foi inserido na borracha superior (tampa) do tensiômetro. Após se estabilizar os valores do tensímetro estes foram registrados e prosseguiu-se a calcular a média da leitura dos seis tensiômetros, em seguida calculou-se o tempo necessário de irrigação para cada tratamento. 33 Figura 5 - (A) Tensiômetro instalado a uma distância de 5 cm do caule da planta de pimentão e 15 cm de profundidade do solo e (B) Tensímetro para determinar a tensão da água no solo 3.7 Manejo da Cultura Utilizou-se fitilho branco para a condução de hastes livres das plantas, efetuando-se nos dois experimentos. Estes fitilhos foram fixados nos vasos e atados a arames colocados na parte superior da estufa (Figura 6). Foi retirado o primeiro botão floral (relativo ao primeiro internódio) como prática cultural. Figura 6- (A) Plantas de pimentão com sistema de irrigação localizada e tutoramento com fitilho. (B) Retirada do primeiro botão floral 3.8 Prevenção de pragas e doenças Foram aplicados produtos fitossanitários preventivos como o inseticida/acaricida abamectina, inseticida CapatazBR e o fungicida oxicloreto de cobre, para manter os cultivos livres de pragas e doenças durante os experimentos. B A A B a 34 3.9 Avaliações ao longo dos ensaios Para ambos os ensaios todas as plantas de pimentão foram irrigadas a capacidade de campo até os 50 DAT, em que todas as plantas apresentavam floração. No ensaio de inverno os primeiros botões florais apareceram no dia 13 de julho (35 DAT), portanto, no dia 28 de julho (50 DAT), iniciou-se com a primeira avaliação. No ensaio de verão os primeiros botões florais apareceram no dia 6 de fevereiro (30 DAT), assim no dia 25 de fevereiro (50 DAT) realizou-se a primeira avaliação. Deste modo, para ambos os ensaios aos 51 DAT iniciou-se com a aplicação dos tratamentos, quando as plantas apresentaram 80% do florescimento. Quadro 4 - Avaliações ao longo dos experimentos, a saber: 3.10 Delineamento experimental Os ensaios foram organizados em delineamento inteiramente casualizado com três tratamentos e cinco repetições. Para os dois ensaios se estabeleceram 180 plantas de pimentão (uma planta por vaso). 3.11 Plantas utilizadas em cada avaliação O total de plantas estabelecidas em cada ensaio foram 180, em que 30 foram utilizadas por avaliação, resultando 120 plantas no total das 4 avaliações. As demais plantas foram utilizadas para determinação da produção de frutos, utilizando 20 plantas por tratamento. Dias Após Transplantio (DAT) Inverno (2016) Verão (2017) 50 28 julho 24 de fevereiro 65 12 de agosto 11 de março 80 27 de agosto 26 de março 95 11 de setembro 10 de abril 35 Para a medição do potencial hídrico foliar, retirou-se uma folha, essa folha foi colocada de novo no saco de papel para a determinação do número total de folhas, massa fresca e seca das folhas, assim como a área foliar total de cada planta, sabendo que foram utilizadas cinco repetições (plantas) por tratamento. A mesma planta foi separada para obter a massa fresca e seca de raiz, caule e botões florais. Também foi obtida a massa seca dos frutos para a determinação dos índices de crescimento. Finalmente, foram moídas as folhas secas para a determinação de macro e micronutrientes. Para as demais variáveis e análises bioquímicas, utilizaram-se outras cinco plantas por tratamento. Em que, folhas do terço médio foram retiradas rapidamente e colocadas em sacos de papel alumínio e submergidas num isopor o qual continha nitrogênio líquido para a determinação do teor de proteína solúvel total, atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) e atividade da enzima catalase (CAT). Da mesma planta também foram retiradas 5 folhas para determinação do conteúdo relativo de água, perda de eletrólitos, teor de clorofilas, determinação da atividade enzimática da nitrato redutase e análises da razão isotópica de δ15N e de δ13C Cabe mencionar que para a medição das trocas gasosas foram utilizadas as plantas destinadas para a produção de frutos, nas quais não foram retiradas folhas e nem utilizadas para outras avaliações. A determinação da produção de frutos foi realizada quando estes apresentaram 70% de coloração vermelha. 3.12 Análise estatística Para análise dos resultados, aplicou-se analise de variância pelo teste de F, sendo as médias comparadas pelo teste Tukey, a 5% de probabilidade, utilizando o software Statistical Analysis System (SAS) v. 9.2. Os gráficos foram elaborados com auxílio do software Sigma Plot v. 11.0. 3.13 Temperatura do local de estudo Foram registrados valores de temperatura mínima, média e máxima com termo higrômetro digital (datalogger), durante a condução de ambos os ensaios (inverno-verão). Com os valores médios realizaram-se os gráficos de temperaturas para ambos os ensaios. 36 3.14 Variáveis avaliadas 3.14.1 Relações hídricas 3.14.1.1 Potencial hídrico foliar Foram feitas medidas do potencial da água no xilema das folhas (Ψhfolha) antes do amanhecer 5:00 am (predawn). As folhas avaliadas foram escolhidas no terço médio das plantas. Utilizou-se a câmara de pressão tipo Scholander (SCHOLANDER et al., 1965), da Soil Moisture Equipment Co., Santa Barbara, CA, USA, conforme descrito por Kramer e Boyer (1995). Figura 7- Medição do potencial da água no xilema das folhas (Ψhfolha) antes do amanhecer 5:00 am (predawn). 3.14.1.2 Conteúdo relativo de água O conteúdo relativo de água (CRA) da folha (folha do terço médio da planta) foi obtido pela equação 6: [(MF − MS)/(MT − MS)] X 100 (6) Para esta análise, MF representa a massa fresca, para o qual foram extraídos três discos foliares (0,69 cm2 cada); MT= Massa turgida, que foi obtida pela reidratação dos discos foliares em água deionizada por 19 h. Após deste tempo retirou-se o excesso de água com papel lençol e se pesaram novamente os discos. Por último a MS= Massa seca foi obtida depois que os discos foliares foram secos por 48 horas a 80° C em estufa de circulação de ar forçada (JAMAUX et al., 1997). 37 3.14.1.3 Perda de eletrólitos O aumento de perda de eletrólitos é usado como uma medida da alteração da permeabilidade de membranas celulares. Esta variável foi feita conforme a metodologia de Lafuente et al. (1991). Em que foram cortados 30 discos foliares de 2 mm de diâmetro por repetição para cada tratamento e, transferindo-os para frascos com solução de manitol (10 mL, 0.3 M de manitol), mantidos sob agitação por 24 h. Após este período, mediu-se a condutividade elétrica 1 (C.E 1) da solução, (condutivímetro digital Lutron, Taiwan). Posteriormente foram pesados os frascos (solução de manitol mais discos foliares) e em seguida se deixaram ferver por 10 minutos. Uma vez resfriada a solução, a temperatura ambiente, pesaram-se novamente os frascos, repondo a diferença do volume evaporado com água destilada, os frascos foram levados para agitação durante 30 minutos e finalmente se determinou a leitura de Condutividade elétrica 2 (C.E 2). A perda de eletrólitos é expressa em % a partir da equação 7: C. E. total = ( C1 C2 ) ∗ 100 (7) 3.14.2 Variáveis de crescimento 3.14.2.1 Altura das plantas Para essa variável utilizou-se uma trena métrica em que mediu-se do colo até o ápice planta. 3.14.2.2 Diâmetro do caule Foi medido no colo da planta com auxílio de um paquímetro digital. 3.14.2.3 Número de folhas e área foliar Foi feita a contagem do número total de folhas para cada planta e posteriormente mediu-se a área foliar (cm² planta-1) no equipamento LiCOR (mod. Li-3000). 38 3.14.2.4 Massa de matéria fresca e seca das raízes da planta As raízes das plantas foram separadas do solo com uma peneira, lavando-as cuidadosamente, determinando sua massa fresca (g planta-1) em balança digital. Uma vez determinada a massa, foram colocadas em sacos de papel e levadas a estufa de circulação forçada a 70° C até obter massa constante. Figura 8- (A) Massa fresca de raízes na primeira avaliação (B) massa fresca de raízes na última avaliação. (B1) Raízes do controle (B2) raízes do tratamento deficiência hídrica moderada (B3) raízes do tratamento deficiência hídrica severa 3.14.2.5 Massa de matéria fresca e seca da parte aérea da planta As plantas foram separadas em caule, folhas, botões florais e frutos. Os órgãos vegetativos de cada planta foram pesados em balança digital para determinar a massa de matéria fresca (g planta-1). Uma vez pesados os órgãos vegetativos foram colocados em sacos de papel e levados a estufa de ar forçado a 70 °C até obter massa seca constante. 3.14.2.6 Índices de crescimento Com os dados obtidos da massa de matéria seca de raiz, caule, folhas, botões florais, frutos e área foliar foram determinados os seguintes índices de crescimento (HUNT, 1982). RAF: Razão de Área Foliar. (Medida da superfície fotossintética em razão à massa respiratória). RAF= Área foliar Massa seca total cm2 g-1 (8) AFE: Área Foliar Especifica. (Medida da espessura relativa, densidade ou extensão das folhas). A B A B1 B2 B3 39 AFE= Área foliar Massa seca das folhas cm2 g-1 (9) RMF: Razão de Massa Foliar (Medida de alocação de biomassa para as folhas) RMF= Massa seca das folhas Massa seca total (10) 3.14.3 Avaliação nutricional das folhas As plantas coletadas para determinação da massa seca foliar ao início e fim das avaliações (50 e 95 DAT), foram moídas e levadas ao laboratório de Nutrição Mineral de Plantas da FCA/UNESP – Botucatu, SP para a determinação do teor de macro e micronutrientes. 3.14.4 Características fisiológicas das plantas 3.14.4.1 Trocas gasosas Avaliaram-se as variáveis fisiológicas: assimilação líquida de CO2 (A), condutância estomática (gs), transpiração (E) e concentração interna de carbono (Ci), nas folhas do terço médio da planta. Para a medição destas variáveis foi utilizado o medidor portátil de trocas gasosas Mod. IRGA LI-6400 (Figura 9). As medidas foram realizadas entre 09:00 e 11:30 horas. Figura 9- Medições de trocas gasosas, no período da manhã (09:00 e 11:30 horas) com auxílio do medidor portátil de trocas gasosas Mod. IRGA LI-6400 40 3.14.4.2 Teor de pigmentos Para a extração de clorofilas (a,b) e carotenoides, foram utilizados discos foliares com 1,01 cm de diâmetro, mantidos em tubos de ensaio contendo 2 mL de dimetil formamida (DMF) por 24 h, no escuro. Após este período se fez a leitura de densidade ótica no espectrofotômetro nos comprimentos de onda 480; 646,8 e 663,8 nm. O teor das clorofilas a e b, e dos carotenoides foi determinado a partir das equações descritas por Lee et al., (1987). Clorofila a = (12 x A663,8 – 3,11 x A646,8)/ π*r 2 (11) Clorofila b = (20,76 x A646,8 – 4,88 x A663,8) (12) Carotenóides = (1000 x A480 – 1,12 Clorofila a – 34,07 Clorofila b)/ 245 (13) Em que, A = absorbância no comprimento de onda indicado. 3.14.5 Análises bioquímicas 3.14.5.1 Determinação da atividade da enzima nitrato redutase (NR) Após quatro horas de iluminação (horário solar) foram coletadas folhas do terço médio das plantas, as quais foram cortadas (50 mg) de tecido foliar fresco das plantas de cada tratamento. O tecido foliar foi transferido para tubos de ensaio com 10 mL de solução de extração, a qual estava constituída por: tampão fosfato de potássio (KH2PO4 0,1 M; pH 7,0), 1 mL de nitrato de potássio (KNO3 0,1M), e 1mL de n-propanol (C3H8O 1%). O tecido vegetal foi infiltrado a vácuo por três vezes durante dois minutos com intervalo de um minuto. Após a infiltração, os tubos foram cobertos com papel alumínio e mantidos em banho-maria a 30° C, por 60 minutos. Em seguida foi retirado 1 mL da solução de extração e transferidos para tubos esterilizados. Adicionou-se 1 mL de sulfanilamida 1% e 1 mL de N- naftil 0,02%. Depois os tubos com a solução de extração e estes reagentes foram levados de novo a banho-maria por 15 minutos a 30 °C no escuro. Finalmente se fez a leitura da D.O. em espectrofotômetro a 540 nm (Figura 10). A atividade da enzima foi expressa em nM de NO2 por grama de matéria fresca por hora de incubação (nM NO2 h g-1 MF). A metodologia de análise foi descrita por Jaworski (1971). 41 Figura 10- Infiltração de nitrato a vácuo em lâminas foliares de plantas de pimentão, para análise da atividade da enzima Nitrato Redutase 3.14.5.2 Coleta e armazenamento do material vegetal Para a realização das análises bioquímicas foi coletado material foliar (cinco plantas por tratamento) nos mesmos dias correspondentes às avaliações. As folhas foram imediatamente acondicionadas em papel alumínio e congeladas em N liquido sendo mantidas em Freezer a -80 °C, até o momento das extrações. 3.14.5.3 Procedimento para obtenção do extrato bruto As folhas foram maceradas em almofariz com N liquido, até obtenção de um pó fino, o qual foi transferido para tubos Falcon, sendo novamente mantidas em Freezer a -80 °C, para realizar as análises do teor de proteínas solúveis e atividade enzimática. O extrato para as análises da concentração de proteínas solúveis e atividade enzimática (SOD e CAT), foi obtido pela resuspensão do material vegetal (400mg) em 5,0 mL de tampão fosfato de potássio 0,1 M, pH 6,7 e suplementando com 300 mg de PVPP (polivinilpolipirolidona). Depois, foi centrifugado por 15 minutos a 5000 x g, sendo o sobrenadante coletado e armazenado em freezer -80 ° C. Figura 11- Maceração das folhas para obter os extratos brutos 42 3.14.5.4 Determinação do teor de proteína solúvel total (PST) A concentração de proteína solúvel foi determinada em triplicata, pelo método de Bradford (1976), ao extrato obtido (100µL) foram adicionados 4,9 mL do reativo Bradford, após 15 minutos se fez a leitura no espectrofotômetro no comprimento de onda 595 nm. A leitura obtida foi comparada com a proteína padrão albumina de soro bovino (BSA) a traves da equação da reta. 3.14.5.5 Determinação da atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) A atividade desta enzima foi determinada pela adição de 50 µL de extrato bruto a uma solução contendo 13 mM de metionina, 75 µM de NBT, 100 nM de EDTA e 2 µM de riboflavina em 3,0 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7.8, conforme descrito por (DEL LONGO et al., 1993). A reação foi iniciada pela iluminação das placas, em câmara composta por tubos fluorescentes (15 W), a 25°C. Após 5 minutos de incubação, o final da catálise foi determinado pela interrupção da luz (GIANNOPOLITIS; RIES, 1977). O composto azul formado (formazana) pela fotoredução do NBT foi determinado pelo incremento na absorção, feita por espectrofotometria com leituras a 560 nm. Os tubos considerados branco para a análise receberam os mesmos reagentes, porém foram mantidos cobertos com papel alumínio. Uma unidade de SOD é definida como a quantidade de enzima necessária para a inibição de 50 % da fotorredução do NBT. Para o cálculo da atividade específica da enzima toma-se a percentagem de inibição obtida, o volume da amostra e a concentração de proteína na amostra (µg µL-1). Atividade específica = Controle−Amostra Controle x 100% inibição (14) 3.14.5.6 Determinação da atividade da enzima catalase (CAT) Foram utilizados 50 µL de extrato bruto, adicionando 950 µL de solução tampão fosfato de potássio 50 nM, pH7,0 complementado com peróxido de hidrogênio a uma concentração final de 12,5 mM. A atividade desta enzima foi determinada pela leitura no espectrofotômetro a um comprimento de onda de 240 nm, pelo monitoramento da variação de absorção do peróxido de hidrogênio (80 s), 43 conforme Peixoto et al. (1999). Na atividade especifica da catalase, se levou em consideração a concentração de proteína solúvel (µKat µg Prot-1). 3.14.6 Análises da razão isotópica de 13C/12C e de 15N/14N As amostras foram analisadas no Centro de Isótopos Estáveis do Instituto de Biociências da Unesp - campus de Botucatu. As amostras vegetais (folhas) foram secas em estufa de ventilação forçada, a temperatura de 50° C por um período de 48 h. Todas as amostras foram moídas individualmente durante três minutos a -196 °C, em moinho criogênico de nitrogênio líquido (Spex 6700-230 freezer/mill – Spex Industries, Edison, Estados Unidos). O material obtido foi homogêneo e de finíssima granulométria (DUCATTI et al., 1982). Foram utilizadas entre 50-70 µg de material vegetal moído para análise da razão isotópica 13C/12C e aproximadamente 500-700 µg para a medida da razão isotópica 15N/14N. As amostras foram pesadas em cápsulas de estanho e introduzidas por meio de amostrador automático no analisador Elemental (EA 1108 – CHN – Fisons Instruments, Rodano, Itália) onde, em presença de oxigênio (O2) e óxido de cobre (CuO) a amostra foi incinerada quantitativamente para a obtenção de CO2 e NOX; este último fo i reduzido a N2 na presença de cobre. Os gases formados foram separados em coluna cromatográfica gasosa e analisados no espectrômetro de massas de razões isotópicas (Delta S – Finnigan MAT, Bremen, Alemanha). Os valores das razões isotópicas foram expressos em delta per mil (δ‰) relativos aos padrões internacionais PeeDee Belemnite (PDB) para o 13C e, nitrogênio do ar atmosférico para 15N, de acordo com a seguinte equação geral: δ‰ (amostra, padrão) = [(Ramostra – Rpadrão) / Rpadrão] x 1000 (15) Em que R representa a razão entre o isótopo menos abundante e o mais abundante, em particular 13C/12C e 15N/14N. Cada amostra foi analisada duas vezes para a obtenção dos valores médios; as medidas foram repetidas quando o desvio padrão for superior que 0,2‰ para δ‰ 13C e 0,4‰ para δ‰ 15N. 44 3.14.7 Produção de frutos Foram designadas 20 plantas por tratamento. A colheita foi feita sempre e quando os frutos apresentaram 70% de coloração vermelha. Frutos com deformidades, podridões ou queimadura, foram considerados como não comerciais (NC). Além disso determinou-se o número e massa de cada fruto. A cultura de pimentão em estufa tem uma duração de colheita de até 270 dias, com uma produção total de 150 t ha-1 (HORTIFRÚTI, 2017). Porém para os dois ensaios (inverno e verão) o período de colheita teve uma duração de 28 dias. Ressalta-se que esse período foi determinado devido a que as plantas do tratamento controle depois da retirada dos frutos com coloração vermelha, apresentavam frutos de tamanho considerável e continuavam florescendo, enquanto que as plantas dos tratamentos sob DH apresentavam o mínimo pegamento de flores, o que se traduz em desvantagem para avaliação da produtividade nas plantas com restrição hídrica. A massa total de frutos por planta é calculada conforme equação 16. MTFP = NFP* MMF (16) Em que: MTFP = massa total de frutos por planta (kg); NFP = número de frutos por planta; MMF = massa média de fruto (kg). Para a determinação da produção total (PT) foi considerada uma densidade de 2,5 plantas por m2 (densidade recomendada para a cultura) e conforme a equação 17 foi obtida a PT. PT= (MTFP *DP)/1000 (17) Em que: PT= produção total (t ha-1); MTFP = massa total de frutos por planta (kg); DP= densidade de plantação recomendada para a cultura (25 mil plantas ha-1). 45 A equação 18 demonstra como foi obtida a porcentagem de frutos não comerciáveis. % FNC = NFP * 100 / FNC (18) Em que: % FNC= porcentagem de frutos não comerciáveis; NFP= número de frutos por planta; FNC= frutos não comerciáveis. Finalmente foi obtida a produção comercial de frutos maduros determinada pela equação 19. PC=PT-(%FNC*PT/100) (19) Em que: PC= produção comercial (t ha-1); PT= produção total (t ha-1); % FNC= porcentagem de frutos não comerciáveis. Figura 12- Frutos de pimentão (verdes) sob três lâminas de irrigação. (A) Frutos do tratamento controle, (B) frutos do tratamento deficiência hídrica moderada e (C) frutos do tratamento deficiência hídrica severa Figura 13- Frutos de pimentão (maduros) sob três lâminas de irrigação. (A) Frutos do tratamento controle, (B) frutos do tratamento deficiência hídrica moderada e (C) frutos do tratamento deficiência hídrica severa A B C A B C 46 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados apresentados no presente trabalho são referentes aos ensaios de inverno e verão, conforme descrito em matérias e métodos (item 3.1). Serão apresentadas temperaturas máximas, medias e mínimas do interior da estufa agrícola, relações hídricas, parâmetros de crescimento, avaliação nutricional das folhas, características fisiológicas das plantas, analises bioquímicas, discriminação isotópica do 13C e 15N e produção de frutos. 4.1 Temperatura máxima, média e mínima do ar Na Figura 14 se observam os valores registrados da temperatura máxima, média e mínima no interior da estufa para o ensaio de inverno. Em que a faixa da temperatura máxima foi entre os 24 e 46 ºC, a temperatura média entre os 14 e 29 ºC, já a temperatura mínima registrada foi entre os 4 e 20 ºC. Figura 14- Valores da temperatura máxima, média e mínima (ºC) no interior da estufa no inverno 0 10 20 30 40 50 T e m p e ra tu ra ° C Máxima Média Mínima Período do ensaio de inverno 2016 47 Na figura 15 se observa que a faixa de temperaturas máximas registradas no ensaio de verão foi entre os 27 e 49 °C as temperaturas medias entre os 19 e 30 °C, finamente as temperaturas mínimas registradas foram entre a faixa de 12 e 21 °C. Pode-se observar nas figuras 14 e 15 que o ensaio de verão apresentou as faixas de temperaturas máximas médias e mínimas maiores do que no inverno, o que provavelmente influenciou na diferença no crescimento e produtividade de frutos de pimentão entre os dois ciclos, além dos tratamentos hídricos. Figura 15- Valores da temperatura máxima, média e mínima (ºC) no interior da estufa no verão 4.2 Tensão de água no solo Para o tratamento controle a tensão de água no solo tentou-se manter na faixa de 10 a 15 kPa, para o tratamento DHM de 34 a 40 KPa e para o DHS de 54 a 60 kPa. No entanto, com o processo da evapotranspiração (parâmetros climáticos) e crescimento da planta, procedeu-se a irrigar ou não, dependendo da tensão média registrada diariamente em cada tratamento. Na figura 16 se observa a tensão de água no solo registrada diariamente para o ensaio de inverno. 0 10 20 30 40 50 T e m p e ra tu ra ° C Máxima Média Mínima Período do ensaio de verão 2017 48 Figura 16- Tensão de água no solo no ensaio de inverno A quantidade de água aplicada foi conforme a tensão correspondente para cada tratamento. Na figura 17 pode-se observar as tensões de água no solo para os três tratamentos no ensaio de verão. Figura 17 Tensão de água no solo, no ensaio de verão A quantidade de água aplicada para cada tratamento foi diferente nos ensaios de inverno e verão (quadro 5), sendo as plantas do tratamento controle no ensaio de inverno as quais consumiram a maior quantidade de água, quando comparadas com o ensaio de verão. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 T e n s ã o d e á g u a n o s o lo ( k P a ) C DHM DHS 0 10 20 30 40 50 60 70 80 T e n s ã o d e á g u a n o s o lo ( k P a ) C DHM DHS Período do ensaio de verão Período do ensaio de inverno 2016 Período do ensaio de verão 2017 49 4.3 Relações hídricas 4.3.1 Potencial hídrico foliar O potencial hídrico foliar (ψhf) é um indicador real do estado hídrico das plantas. Observou-se que aos 50 DAT, quando todas as plantas estavam sendo irrigadas regularmente, os valores de ψhf não se diferenciaram entre os tratamentos (Figura 18). Nas quatro avaliações feitas aos 50, 65, 80 e 95 DAT, as plantas do tratamento controle mantiveram valores de potencial hídrico entre -0,22 e -0,26 MPa. Após a imposição da DH nas plantas do tratamento DHM e DHS os valores de ψhf começaram a diminuir. Neste contexto, as estratégias das plantas à tolerância da deficiência hídrica, incluem vários processos fisiológicos e bioquímicos, entre eles redução do ψhf ocasionado pelo fechamento dos estômatos (NARDINI et al., 2001) induzido pela biossíntese de ABA (ácido abcísico) na zona radicular e translocado para a parte aérea (KRAMER; BOYER, 1995). Neste ensaio, comprovou-se que o ψhf diminuiu nas plantas dos tratamentos DHM e DHS paralelamente com a condutância estomática (gs) conforme resumido na Tabela 17, o que corrobora relação direta entre ambas as variáveis quando as plantas têm menor disponibilidade de água no solo. Quadro 5- Quantidade de água aplicada (L planta-1) na cultura de pimentão, nos ensaios de inverno e verão Tratamentos Inverno Verão C 71 68 DHM 44 49 DHS 35 38 50 Figura 18- Potencial hídrico foliar (MPa) medido antes do amanhecer em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95  h f ( M P a ) -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 C DHM DHS No cultivo de verão se observou que as plantas do controle mantiveram valores de potencial hídrico entre -0,24 e - 0,27 MPa durante as avalições realizadas. Entretanto, as plantas dos tratamentos DHM e DHS após a imposição dos tratamentos apresentaram valores entre -0,58 e -0,65 MPa, -0,80 e -0,93 MPa respectivamente. Esses resultados indicam que as plantas sob DH tiveram menor disponibilidade de água no solo conforme a severidade da deficiência hídrica. Reduções da umidade no solo podem afetar a produtividade final das culturas, já que o pimentão foi afetado conforme a severidade da redução de água no solo, diminuindo a produção dos frutos nos ensaios inverno e verão (Quadros 6 e 7). 51 Figura 19- Potencial hídrico foliar (MPa) medido antes do amanhecer em plantas de pimentão cultivadas no verão sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95  h f ( M P a ) -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 C DHM DHS 4.3.2 Conteúdo relativo de água O conteúdo relativo de água (CRA) em órgãos vegetais é uma ferramenta útil para avaliar o estado hídrico da planta. Neste estudo, o CRA diminuiu em função da redução de água, indicando restrição da disponibilidade de água no solo (Figura 20). No inverno observou-se que os tratamentos hídricos se diferenciaram em relação ao controle, principalmente aos 80 DAT. Igualmente para a cultura do tomateiro, valores de CRA foram reduzidos significativamente em diferentes níveis de irrigação (KUSVURAN; DASGAN, 2017). 52 Figura 20 - Conteúdo relativo de água (%) em folhas em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 C o n te ú d o r e la tiv o d e á g u a ( % ) 60 65 70 75 80 85 90 C DHM DHS No verão (Figura 21), o CRA em tecidos foliares diminuiu no tratamento DHM em 5,5, 2,9 e 7,2% aos 65, 85, e 95 DAT, quando comparado com o tratamento controle. Já para o tratamento DHS o CRA diminuiu em 7% 9,7% e 10% aos 65, 85, e 95 DAT, respectivamente, quando comparado ao tratamento controle. A diminuição de água no solo reflete menor CRA nas folhas, o que pode se correlacionar com à maior transpiração das plantas. Esse comportamento, aparentemente foi ocasionado pelo efeito das altas temperaturas e a deficiência hídrica. Figura 21 - Conteúdo relativo de água (%) em folhas em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 C o n te ú d o r e la tiv o d e á g u a ( % ) 60 65 70 75 80 85 90 C DHM DHS 53 4.3.3 Perda de eletrólitos A variável perda de eletrólitos (PE) implica dano pelo estresse oxidativo na membrana das folhas, resultando em vazamento de eletrólitos, água e materiais solúveis da célula para o espaço intercelular das plantas (SHARMA et al., 2012). Na Figura 22 se observa que para o ensaio de inverno a porcentagem de perda de eletrólitos foi aumentando conforme a severidade da deficiência hídrica e no decorrer do tempo. O qual está relacionado com potencial hídrico foliar mais negativo e menor CRA. Figura 22- Perda de eletrólitos (%) em plantas de pimentão cultivadas no inverno, sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 P e rd a d e e le tr o lit o s ( % ) 0 10 20 30 40 50 C DHM DHS Os resultados de PE no ensaio de verão foram similares aos de inverno, porém com valores levemente maiores, provavelmente à maior área foliar (Tabela 8) o que representa folhas mais delgadas. Desse modo, diferentes estudos corroboram aumento da PE em plantas sob DH. Resultados similares foram encontrados em plantas de Solanum scabrum Mill. (espécie solanácea) submetidas à deficiência hídrica severa, em que houve aumento considerável da PE o que levou a seu crescimento mais lento (ASSAHA et al., 2016). 54 Figura 23- Perda de eletrólitos (%) em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 P e rd a d e e le tr o lit o s ( % ) 0 10 20 30 40 50 C DHM DHS 4.4 Variáveis de crescimento 4.4.1 Altura das plantas Para a variável altura de plantas no ensaio de inverno (Tabela 1), apenas a DHS ocasionou alterações aos 80 e 95 DAT, em que as plantas apresentaram os valores mais baixos, quando comparadas às do tratamento controle. Resultados similares aos deste ensaio foram constatados por Morales et al. (2015) em plantas de tomateiro em ambiente protegido, em que a variável altura de plantas foi diminuída paralelamente com redução da umidade no solo. Tabela 1- Altura (cm) em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT C 51,2 a 63,4 a 71,2 a 73,7 a DHM 53,2 a 63,6 a 66,3 ab 71,1 ab DHS 48,1 a 59,3 a 59,2 b 62,6 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT= Dias Após Transplantio; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 55 No verão (Tabela 2), exclusivamente a DHS influenciou na altura das plantas após a imposição da deficiência hídrica e ao longo das avaliações. As respostas das plantas à DH no seu crescimento diferem entre espécies vegetais. Por exemplo, em plantas de melão (Cucumis melo L.) a altura das plantas sob o 80% e 60% da evapotranspiração da cultura (ETc) diferiu significativamente das plantas irrigadas sob o 100% da ETc (MIRABAD et al., 2013). Tabela 2-. Altura (cm) em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT C 78,9 a 105,2 a 107,2 a 115,6 a DHM 77,8 a 98,8 a 100,1 ab 104,0 ab DHS 83,1 a 88,0 b 90,3 b 102,6 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT: Dias Após Transplantio; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 4.4.6 Diâmetro de caule No inverno (Tabela 3), os tratamentos DHM e DHS afetaram de maneira similar o diâmetro de caule (DC) das plantas, exclusivamente aos 80 e 95 DAT. Os resultados obtidos neste trabalho diferem aos reportados por Padron et al. (2010), os quais trabalharam com plantas de pimentão sob diferentes lâminas de irrigação, esses autores não encontraram diferenças significativas no DC por efeito da DH, quando comparadas com as plantas controle. Tabela 3 - Diâmetro (mm) de caule em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT C 8,3 a 9,6 a 12,8 a 12,8 a DHM 8,4 a 9,5 a 10,1 b 11,3 b DHS 7,6 a 9,0 a 9,7 b 10,4 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT= Dias Após Transplantio; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 56 No ensaio de verão (Tabela 4) aos 65 DAT unicamente a DHS repercutiu na redução do DC. Já na última avaliação (95 DAT) as plantas dos tratamentos DHM e DHS sofreram alterações negativas para essa variável. Tabela 4-. Diâmetro (mm) de caule em plantas de pimentão, cultivadas sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT C 4,9 a 11,6 a 11,3 a 12,4 a DHM 4,5 a 10,7 ab 10,8 a 11,2 b DHS 5,6 a 9,7 b 10,3 a 10,5 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT= Dias Após Transplantio; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 4.4.4 Número de folhas e área foliar No ensaio de inverno (Tabela 5) para as variáveis número de folhas (NF) e área foliar (AF), houve alterações após 15 dias do início dos tratamentos somente por efeito da DHS, repetindo-se ao final do experimento (95 DAT). Apenas aos 80 DAT, os tratamentos hídricos DHM e DHS se comportaram de maneira semelhante, ocasionando menor NF e AF quando comparados ao controle. Para a variável área foliar (AF), os resultados obtidos diferem dos reportados por Shao et al. (2010), os quais fizeram quatro avaliações com pimentão e na última (102 DAT), a área foliar diminuiu para todos os tratamentos, inclusive para o controle. No presente estudo, aos 95 DAT, a AF aumentou para os três tratamentos. No entanto o controle foi numericamente maior que o tratamento DHM e significativamente superior ao DHS. Este resultado indica efeito da diminuição geral da área foliar em função da severidade da DH. Tabela 5- Número de folhas e área foliar (cm2/planta) em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT NF AF (cm2) NF AF (cm2) NF AF (cm2) NF AF (cm2) C 26,0 a 988,2ª 62,0a 2062,7 a 101,0a 2513,1 a 112,0a 3025,3 a DHM 26,0 a 1085,7a 57,0ab 1862,0ab 65,0b 1610,5 b 88,0ab 2558,9 ab DHS 27,0 a 1032,2a 45,0b 1556,6b 48,0b 1104,1 b 67,0b 1750,6 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT= Dias Após Transplantio; NF= Número de Folhas; AF= Área Folhar; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 57 As folhas se expandem recebendo luz e CO2 para realizar o processo de fotossíntese, ocorrendo também a transpiração de água para seu resfriamento. A expansão foliar é determinada por fatores genéticos ou ambientais (HUSSAIN; BARKET, 2015) e também pode ser afetada pela disponibilidade de água no solo. Diante disso, observou-se diferenças no NF e AF, com menores valores no ensaio de inverno quando comparado com o verão. Provavelmente pelo efeito do aumento das temperaturas e maior transpiração (Figura 33) o que demanda maior água para o crescimento vegetativo. Consequentemente, no verão aos 65 DAT apenas a DHS ocasionou efeito negativo no NF e AF (Tabela 6). Já aos 95 DAT, unicamente a DHS repercutiu na variável AF. Os resultados obtidos neste ensaio concordam aos citados por Ahmed et al. (2014) em plantas de pimenta ardida (Capsicum annuum cv. Battle), os quais reportaram que a área foliar diminuiu consideravelmente conforme a severidade da restrição hídrica no solo (85, 70 e 55% da capacidade de campo). 4.4.1 Massa fresca e seca de raízes No ensaio de inverno a massa fresca (MF) e massa seca (MS) de raízes não foi alterada aos 50 DAT, ou seja, até o momento do início dos tratamentos hídricos (Tabela 7). Nos demais tempos de avaliação (65, 80 e 95 DAT) DHS acumulou massa fresca significativamente menor denotando que o fator água restringiu o crescimento radicular. No entanto, para a variável massa seca nas quatro Tabela 6- Número de folhas e área foliar (cm2/planta) em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação. Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT NF AF (cm2) NF AF (cm2) NF AF (cm2) NF AF (cm2) C 50,4 a 1605,9 a 118,8 a 4911,6 a 99,0 a 3972,1 a 116,8 a 4667,9 a DHM 47,4 a 1436,7 a 85,8 ab 3665,8 ab 93,8 a 3870,4 a 96,4 a 4118,4 ab DHS 50,0 a 1521,7 a 65,4 b 2236,8 b 71,4 a 2835,9 a 74,0 a 2956,6 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT= Dias Após Transplantio; NF= Número de Folhas; AF= Área Foliar; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa 58 avaliações, os tratamentos tiveram o mesmo comportamento exceto aos 80 DAT em que o tratamento controle foi significativamente maior que o DHS. Resultados diferentes aos deste estudo foram publicados por Kulkarni e Phalke (2009) que, ao aplicarem 50% da NHC da cultura de pimenteira, verificaram que plantas sob DH apresentaram significativamente menor MS de raiz quando comparadas com as plantas do tratamento controle. No entanto, todas as cultivares sob DH apresentaram maior comprimento de raiz primaria quando comparadas com as plantas controle. As respostas das plantas à escassez de água são complexas, envolvendo mudanças deletérias ou adaptativas sob essas condições. Por exemplo, no ensaio de verão (Tabela 8) exclusivamente aos 65 DAT, a DHS causou diminuição considerável na massa fresca e seca de raízes embora este efeito tenha sido superado nas demais avaliações (80 e 95 DAT). Resultados similares foram reportados por Dorjik et al. (2005) em plantas de pimenteira irrigadas com 50 % da NHC. Com este tratamento, não observaram diferença significativa de MS da raiz em relação às plantas do controle. Para as plantas de pimentão, concluiu-se que sob DH, a raiz é um órgão vegetativo de resistência capaz de atender suas necessidades de absorção de água e nutrientes, impulsionando o crescimento mesmo em condições de deficiência hídrica. Tabela 7- Massa fresca e seca de raízes (g) em plantas pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT MF MS MF MS MF MS MF MS C 18,6 a 1,8 a 43,9 a 6,3 a 66,9 a 7,8 a 83.4 a 10,3 a DHM 17,1 a 1,5 a 30,4 ab 5,6 a 50,9 ab 6,4 ab 70.3 ab 9,1 a DHS 15,4 a 1,5 a 21,3 b 4,5 a 47,1 b 6,0 b 50.9 b 7,3 a Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT: Dias Após Transplantio; MF= Massa Fresca; MS= Massa Seca; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 59 4.4.2 Massa fresca e seca de caule No ensaio de inverno a comparação de médias da MF de caule (Tabela 9) apenas as plantas do tratamento DHS foram alteradas, apresentando menor massa aos 65 e 95 DAT. Já os 80 DAT a MF de caule diminuiu com efeito similar pelos tratamentos sob DH. A MS de caule diminuiu aos 65 e 80 DAT em resposta à DHS. Ressaltasse que a DHM teve efeito na massa seca de caule até os 95 DAT, apresentando comportamento similar à DHS. Assim, a MF e MS de caule refletem e se correlacionam bem com o efeito da DHS sobre a variável de altura de plantas (Tabela 1), o qual foi significativamente diferente quando comparado às plantas do controle. O mesmo efeito não se repetiu para as plantas do tratamento DHM, sendo similarmente correlacionado com esta variável. Da mesma forma, Morales et al. (2015) trabalharam com duas cultivares de tomateiro mantidos sob deficiência hídrica verificaram que, quanto maior for a redução da umidade do solo as plantas tendem a diminuir a massa fresca e seca do caule. Tabela 8- Massa fresca e seca de raízes (g) em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação. Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT MF MS MF MS MF MS MF MS C 30.7 a 3,9 a 47.3 a 6,9 a 51.8 a 7,9 a 82,3 a 9,4 a DHM 31.7 a 3,6 a 43.8 a 5,6 ab 47.2 a 6,7 a 81,3 a 9,1 a DHS 33.8 a 4,1 a 28.3 b 4,3 b 41.4 a 6,7 a 65,5 a 7,1 a Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT: Dias Após Transplantio; MF= Massa Fresca; MS= Massa Seca; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 60 Tabela 9- Massa fresca e seca de caule (g) em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação. Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT MF MS MF MS MF MS MF MS C 18,8 a 2,7 a 51,3 a 7,8 a 78,7 a 11,8 a 79,2 a 14,0 a DHM 19,3 a 2,8 a 47,1 a 7,2 a 56,0 b 9,8 ab 68,8 ab 12,3 b DHS 18,0 a 2,3 a 32,7 b 5,4 b 42,3 b 7,8 b 49,6 b 9,1 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT: Dias Após Transplantio; MF= Massa Fresca; MS= Massa Seca; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. Muitos trabalhos agronômicos têm buscado correlação entre redução no potencial hídrico foliar e crescimento vegetal, considerando-se a sensibilidade de cada espécie à DH. Porém, tudo depende da espécie, duração da DH, condições ambientais e época de aplicação (HSIAO; ACEVEDO,1977). Como pode-se observar, no ensaio de verão (Tabela 10) a MF de caule foi afetada paralelamente com a severidade da DH apenas aos 65 DAT, no entanto aos 80 DAT a DH não teve efeito negativo para essa variável. O efeito da restrição hídrica foi observado novamente aos 95 DAT, sendo a DHS que provocou diminuição significativa da MF de caule. Do mesmo modo, a MS de caule teve repercussão aos 65 e 95 DAT por efeito da DHS, o que sugere que as plantas de pimentão sob DHM conseguiram se adaptar bem mantendo o seu crescimento vegetativo similar às plantas do controle. Tabela 10- Massa fresca e seca de caule (g) em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT MF MS MF MS MF MS MF MS C 53,6 a 7,4 a 162,3 a 24,0 a 124,4 a 25,1 a 150,3 a 30,9 a DHM 52,4 a 7,8 a 108,5 b 20,1 a 104,5 a 18,3 a 133,7 a 27,8 a DHS 55,9 a 7,8 a 65,5 c 11,2 b 101,7 a 18,4 a 91,4 b 19,3 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT: Dias Após Transplantio; MF= Massa Fresca; MS= Massa Seca; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 61 4.4.3 Massa fresca e seca de folhas A massa fresca de folhas no inverno (Tabela 11), sofreu diminuição significativa em consequência da DHS aos 65 e 95 DAT, no entanto, aos 80 DAT a redução dessa variável foi ocasionada de maneira similar pela DHM e DHS. Para a variável massa seca de folhas aos 65 e 80 DAT, houve diminuição semelhante entre os tratamentos da deficiência hídrica. Já aos 95 DAT, aparentemente as plantas da DHM conseguiram se adaptar à falta de água, sendo o tratamento da DHS que manteve o mesmo comportamento negativo, desde o início da DH até o final do período avaliado. Estes resultados concordam aos obtidos por Silva et al. (2016) que ao irrigar pimenta (Capsicum chinense) até 80% da necessidade hídrica, não verificaram efeitos significativos na produção de folhas, embora uma porcentagem menor da produção de biomassa vegetal tenha sido afetada negativamente. No verão, pode-se observar que os valores da massa fresca e seca de caule e folhas, foram superiores aos registrados no ensaio de inverno. Isto pode ser provavelmente devido ao aumento das temperaturas e maior fotoperíodo, trazendo como consequência maior consumo hídrico das plantas o que pode ter contribuído ao crescimento acelerado das mesmas. Esse efeito também foi notado na produtividade de frutos. Por outro lado, no ensaio de verão após 15 dias da aplicação da deficiência hídrica (65 DAT) apenas o tratamento DHS apresentou diminuição drástica na MF e MS de folhas, enquanto que DHM foi indiferente. Aos 80 DAT, o efeito da DH aparentemente não ocasionou efeito algum, quando os tratamentos de estresse não se diferenciaram do controle, seja para MF Tabela 11- Massa fresca e seca de folhas (g) em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT MF MS MF MS MF MS MF MS C 40,9 a 5,4 a 81,5 a 11,2 a 85,7 a 12,1 a 104,0 a 15,3 a DHM 42,0 a 5,6 a 69,3 ab 9,0 b 55,1 b 8,7 b 90,0 ab 13,6 ab DHS 43,1 a 5,8 a 58,3 b 8,2 b 39,4 b 7,0 b 64,0 b 9,9 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT: Dias Após Transplantio; MF= Massa Fresca; MS= Massa Seca; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 62 ou MS. No final do ensaio (95 DAT), o resultado observado aos 65 DAT se repetiu com ênfase para o tratamento DHS. Buscando correlações com outros parâmetros biométricos, observa-se que a massa foliar acompanha os efeitos da DH observados sobre o número de folhas e área foliar (Tabela 6). Além disso, os índices de transpiração a serem discutidos no item 4.7.1.4 também acompanharam os efeitos do estresse de DH, porém variando em função da época de cultivo. No inverno, as plantas utilizaram uma estratégia de menor desenvolvimento em área foliar, diminuindo assim a superfície de transpiração para menor perda de água (Tabela 21). No verão, a área foliar foi maior em resposta a fotoperíodo mais longo, o que resultou em MF e MS relativamente maiores que as plantas cultivadas no inverno. 4.5 Índices de crescimento 4.5.1 Razão de área foliar (RAF) O cálculo da razão de área foliar revela a direção da translocação de assimilados para as folhas em relação com a massa seca total da planta. No presente ensaio (Figura 24), houve diminuição geral de RAF indicando que a partir de 65 DAT os fotoassimilados nos três tratamentos foram translocados para outros órgãos vegetativos das plantas. Este efeito, inicia-se provavelmente em função do início do processo de frutificação, quando os fotoassimilados geralmente são de fato, translocados para a formação dos frutos. Aos 80 DAT o tratamento controle apresentou maior RAF, isto é atribuído a que a área foliar (Tabela 5) foi significativamente maior quando comparada com a dos tratamentos sob DH. Na Tabela 12-. Massa fresca e seca de folhas (g) em plantas de pimentão, cultivadas no verão, sob três níveis de irrigação. Tratamentos 50 DAT 65 DAT 80 DAT 95 DAT MF MS MF MS MF MS MF MS C 44,7 a 6,7 a 136,4 a 19,3 a 112,5 a 17,3 a 134,4 a 23,5 a DHM 40,1 a 6,1 a 98,9 ab 15,3 a 109,3 a 17,6 a 111,2 ab 21,1 ab DHS 42,5 a 6,8 a 60,0 b 9,0 b 90,1 a 12,9 a 79,7 b 16,3 b Medias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem estatisticamente entre si pelo teste Tukey ao nível de 5% de probabilidade. DAT: Dias Após Transplantio; MF= Massa Fresca; MS= Massa Seca; C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. 63 última avaliação, houve equilíbrio para os três tratamentos, sendo que nesta fase (95 DAT) os fotoassimilados ao invés de translocar-se para órgãos vegetativos, foram direcionados para frutos. No cultivo do pimentão Silva et al. (2010) analisaram RAF em função do espaçamento entre plantas. Os autores reportaram neste trabalho, que a RAF diminuiu em função da fase fenológica das plantas. Figura 24- Razão de área foliar (RAF) em plantas pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 R a z ã o d e á re a f o lia r (c m 2 g -1 ) 20 40 60 80 100 120 140 160 C DHM DHS No ensaio de verão, a RAF das plantas de todos os tratamentos também foi diminuindo com o decorrer do tempo. Na primeira avaliação (50 DAT) as plantas de todos os tratamentos, tiveram valores similares, no entanto na segunda avaliação as plantas do controle apresentaram maior RAF, isto é atribuído a que as plantas tinham maior área foliar em razão a sua massa seca total. Já na terceira avaliação (80 DAT) a RAF das plantas controle diminuiu apesar de ter maior área foliar, isto é, porque a partir dessa avaliação as plantas deste tratamento apresentaram a maior massa seca de frutos, o que representa maior massa seca total em razão à área foliar. As plantas sob DHM e DHS apresentaram o mesmo comportamento, tendo maior RAF na terceira avaliação em comparação ao controle. Já na última avaliação as plantas dos três tratamentos apresentaram o mesmo comportamento indicando que as plantas estão enviando fotoassimilados 64 para o crescimento dos frutos. Estudos feitos por Anyia e Herzog (2004), em diferentes cultivares de feijão na etapa de florescimento a DH diminuiu a RAF entre 5 e 20 % em quase todas as cultivares. Pelo qual pode-se disser que o comportamento de uma planta em condições de DH além da severidade da restrição hídrica no solo, as mudanças adaptativas nas plantas também vão depender da espécie. Figura 25- Razão de área foliar em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa. Dias após transplantio 50 65 80 95 R a z ã o d e á re a f o lia r (c m 2 g -1 ) 20 30 40 50 60 70 80 90 100 C DHM DHS 4.5.2 Área foliar específica (AFE) A AFE é um índice de crescimento que relaciona a superfície foliar total com a massa seca da mesma (Figura 26). A DH é uma modalidade de estresse físico que pode afetar a expansão foliar (JENSEN et al., 1996). Na avaliação do ensaio de inverno, plantas do tratamento controle não apresentaram alterações em AFE na primeira e segunda avaliação. Este bloco aumentou AFE aos 80 DAT, com expansão foliar maior na faixa de 207.7 cm2 g-1 com leve diminuição aos 95 DAT, com valores na faixa de 197.5 cm2 g-1. Quando as plantas mantidas sob DH foram avaliadas, AFE aumentou entre a primeira e segunda coleta, com queda brusca aos 80 DAT, sempre com o tratamento DHS apresentando valores inferiores ao DHM. 65 Ao final do experimento, esses tratamentos com DH aumentaram AFE, embora sempre apresentaram taxas menores que o tratamento controle. Nesse sentido, estudos feitos em diferentes espécies vegetais sob deficiência hídrica mostraram aumento ou diminuição da AFE, em função da espécie vegetal, etapa de crescimento, condições ambientais do cultivo, cultivar, fertilização, irrigação, etc. Por exemplo, entre diferentes genótipos de amaranto (Amaranthus spp.) a AFE diminuiu quando as plantas foram submetidas à DH comparadas com plantas regularmente irrigadas (LIU; STUTZEL, 2004). Em cultivares de amendoim e gergelim não houve diferença significativa na AFE para cultivar e regime hídrico, no entanto em mamona houve diferenças entre cultivares, e 19.39% de incremento da AFE das plantas estressadas quando comparadas com plantas controle (PINTO et al., 2008). Figura 26- Área foliar específica em plantas de pimentão, cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 Á re a f o lia r e s p e c íf ic a ( c m 2 g -1 ) 140 160 180 200 220 240 260 C DHM DHS A área foliar especifica tem sido usada como um indicador de espessura foliar. Uma estratégia das plantas sob DH é diminuir sua área folhar e apresentar folhas mais grossas para que a transpiração seja menor. Observe-se na Figura 27 que AFE nas plantas dos três tratamentos aumentaram na segunda avaliação e diminuíram com o decorrer do tempo (80 e 95 DAT). Diante disso, pode-se concluir que a DH para o ensaio de verão não repercutiu na expansão foliar nas plantas de pimentão. 66 Figura 27- Área foliar especifica em plantas de pimentão, cultivadas no verão sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 Á re a f o lia r e s p e c íf ic a ( c m 2 g -1 ) 140 160 180 200 220 240 260 C DHM DHS 4.5.3 Razão de massa foliar (RMF) A razão de massa foliar representa um índice de crescimento inverso à AFE (Figura 28). No ensaio de inverno observou-se que para os três tratamentos houve diminuição geral de RMF em função do tempo, sem discriminar qualquer tratamento. Figura 28- Razão de massa foliar em plantas pimentão cultivadas no inverno sob três níveis de irrigação. C= Controle; DHM= Deficiência Hídrica Moderada; DHS= Deficiência Hídrica Severa Dias após transplantio 50 65 80 95 R a z ã o d e m a s s a f o lia r 0.2 0.4 0.6 0.8 C DHM DHS 67 Na Figura 29 se observa que a razão da massa foliar no verão tendeu a diminuir nas plantas dos trê