RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 09/12/2018. GUSTAVO RAFGNIN MARTINS Potencial antioxidante, fotoprotetor e antiglicante de frutos alimentícios não convencionais para utilização na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica Dissertação de mestrado apresentada ao Instituto de Química - Campus de Araraquara da Universidade Estadual Paulista - UNESP, como requisito para a obtenção do Título de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Regildo Marcio Gonçalves da Silva ARARAQUARA 2017 FICHA CATALOGRÁFICA M379p Martins, Gustavo Rafagnin Potencial antioxidante, fotoprotetor e antiglicante de frutos alimentícios não convencionais para utilização na indústria alimentícia, cosmética e farmacêutica / Gustavo Rafagnin Martins. – Araraquara : [s.n.], 2017 62 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Regildo Marcio Gonçalvez da Silva 1. Stress oxidativo. 2. Antioxidantes. 3. Jabuticaba. 4. Mangaba. 5. Geleia. I. Título. Elaboração: Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação Biblioteca do Instituto de Química, Unesp, câmpus de Araraquara Dedicatória Dedico este trabalho aos meus pais José Claudio e Zeneide, pelo apoio incondicional, apesar das dificuldades sempre estiveram ao meu lado. Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil e, no entanto, é a coisa mais preciosa que temos. Albert Einstein Agradecimentos Ao meu orientador Prof. Dr. Regildo Marcio Gonçalves da Silva, pela dedicação e empenho diante de minha orientação, ao longo desse trabalho e de outros, desde a iniciação cientifica, e além disso pela amizade, que levarei para toda minha vida. Aos meus amigos e companheiros de laboratório Pamela, Gustavo, Bianca, Rodrigo, Valter, Kamille, Amanda Gomes, Amanda Viel, Amábile, Celia, Anderson e Janine, pelas conversas, dividindo momentos de felicidade e dificuldade, compartilhando conhecimento, sempre de prontidão; e o mais importante pela amizade. Aos funcionários da UNESP/Assis Gilberto e Alam. A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior). Á Profa. Dra. Maysa Furlan, do Instituto de Química da UNESP de Araraquara pela liberação do seu laboratório para utilização. Ao João, técnico de Laboratório do Instituto de Química da UNESP de Araraquara pela presteza durante o auxílio das análises fitoquímicas de meu projeto. Ao Instituto de Química de Araraquara - UNESP pela grande oportunidade e ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. A todos os funcionários da seção técnica de pós-graduação do Instituto de Química de Araraquara sempre atenciosos, pela prontidão e entendimento em todas as solicitações durante esses 2 anos. . Aos meus amigos, que durante esses dois anos estiveram ao meu lado, sempre apoiando, apesar das dificuldades, até muitas vezes pela minha ausência, por exigência dos estudos e mesmo assim não me abandonaram. E especialmente aos meus pais José Claudio e Zeneide, sempre ao meu lado em todos os momentos, até nos mais difíceis. Por isso tenho-lhes eterno carinho. RESUMO O estresse oxidativo está correlacionado ao aparecimento de doenças, e pode ser intensificado devido à exposição a fatores ambientais, como estresse, abuso de drogas, radiação solar, poluição entre outros. Estudos com vegetais têm demonstrado que os mesmos podem conter compostos antioxidantes passíveis de remediar ou prevenir tais complicações. Nesse contexto o presente trabalho avaliou a atividade antioxidante, antiglicante, fotoprotetora e verificou-se a presença de compostos polifenólicos dos extratos aquoso, etanólico e hidroalcoólico de frutos de Chrysophyllum cainito L, Hancornia speciosa Gomes. e P. glomerata Berg., além disso foram produzidas e analisadas geleias desses frutos. Compostos fenólicos foram determinados por técnicas espectrofotométrica e HPLC (High performance liquid cromatography). Foi verificada a presença de compostos fenólicos, incluindo flavonoides, para todos os de frutos avaliados, com destaque para os extratos de C. cainito (casca), que apresentou os maiores valores com o extrato hidroetanólico dessa espécie. Quanto a atividade antioxidante, novamenta a espécie de C. cainito obteve os mais valores entre os resultados para os diferentes testes realizados, sequestro do radical livre DPPH, potencial redutor de ferro (FRAP - ferric reducing antioxidant power), inibição da peroxidação lipídica (TBARS - thiobarbituric acid reactive substances), e sequestro do NO, entretanto os demais extratos avaliados para as outras espécies, H. speciosa e P. glomerata também obtiveram resultados significativos. Indicando potencial antioxidante para os frutos dessas espécies testadas e que estão possivelmente relacionados a presença de compostos fenólicos. Apenas o extrato hidroetanolico (70%) de P. glomerata indicou atividade antiglicante na concentração de 10mg.mL-1. Já paras as geleias produzidas, as do fruto de C. cainito também obtiveram resultados proeminentes tanto para os constituintes nutricionais como funcionais, porém as de P. glomerata apresentaram maior teor de fenóis totais e resultados mais elevados de atividade antioxidante em baixas concentrações. Diante dos resultados obtidos com o presente estudo é possível constatar que os frutos avaliados neste estudo possuem compostos com potencial antioxidante, antiglicante (P. glomerata) e são passiveis de processamento industrial na forma de geleia mantendo atividade antioxidante. Palavras-chave: Stress oxidativo. Antioxidantes. Jabuticaba. Mangaba. Geleia. ABSTRACT Oxidative stress is correlated with the onset of disease, and can be intensified due to exposure to environmental factors such as stress, drug abuse, solar radiation, pollution, among others. Studies with vegetables have shown that they may contain antioxidant compounds likely to remedy or prevent such complications. In this context, the present work evaluated antioxidant, antiglican and photoprotective activity and verified the presence of polyphenolic compounds of the aqueous, ethanolic and hydroalcoholic extracts of fruits of Chrysophyllum cainito L., Hancornia speciosa Gomes. and P. glomerata Berg. in addition, jellies of these fruits were produced and analyzed. Phenolic compounds were determined by spectrophotometric techniques and HPLC (High performance liquid chromatography). It was verified the presence of phenolic compounds, including flavonoids, for all evaluated fruits, especially the extracts of C. cainito (peel), which presented the highest values with the hydroethanolic extract of this species. As for the antioxidant activity, again the C. cainito species obtained the highest values among the results for the different tests performed, DPPH free radical sequestration, ferric reducing antioxidant power (FRAP), inhibition of lipid peroxidation (TBARS - thiobarbituric acid reactive substances), and NO scavenging. However, the other extracts evaluated for the other fruit species, H. speciosa and P. glomerata also obtained significant results. These results Indicate antioxidant potential for the fruits of these species tested and that are possibly related to the presence of phenolic compounds. Only the hydroethanolic (70%) extract of P. glomerata indicated antiglication activity at the concentration of 10mg.mL-1. As for the jellies produced, the C. cainito jelly also obtained prominent results for both nutritional and functional constituents, but the P. glomerata one presented higher total phenol content and higher antioxidant activity at low concentrations tested. In view of the results obtained with the present study, it is possible to verify that the fruits evaluated in this study have antioxidant potential compounds, antiglication (P. glomerata) and are passive of industrial processing in the form of jelly maintaining antioxidant activity. Keywords: Oxidative stress. Antioxidants. Jabuticaba. Mangaba. Jelly. LISTA DE FIGURAS Obs.: As figuras de 3 a 5 e 7 a 13 são de autoria do candidato e elaboradas ao longo do desenvolvimento deste trabalho Figura 1 - Reação de Maillard (glicação), entre glicose e proteína.........................19 Figura 2 - Estrutura básica de um flavonoide, representada pela catequina..........20 Figura 3 - O abiu roxo (C. cainito) planta adulta, e seu correspondente fruto.........22 Figura 4 - A mangabeira (H. speciosa), arvore, e seu correspondente fruto...........22 Figura 5 - A Cabeludinha (P. glomerata) planta adulta, e seu correspondente fruto.........................................................................................................23 Figura 6 - Fluxograma apresentando as concentrações de pectina que foram testadas e o pH ideal a ser atingido para a produção de geleia.............32 Figura 7 - Resultado de MRE para os extratos etanólicos (70%) dos frutos de C. cainito (casca), H. speciosa, P. glomerata e na concentração 10mg.mL-1...............................................................................................45 Figura 8 - Resultado da varredura do extrato etanólico dos frutos de H. speciosa, P. glomerata e C. cainito nas concentrações de 500 e 1000µg.mL-1 entre os comprimentos de onda de 260 a 400nm............................................46 Figura 9 - Resultado da varredura dos extratos hidroetanólico (70%) dos frutos de H. speciosa, P. glomerata e C. cainito nas concentrações de 500 e 1000µg.mL-1 entre os comprimentos de onda de 260 a 400nm.............46 Figura 10 - Perfil cromatográfico de extratos hidroetanólicos dos frutos obtidos por HPLC-PAD............................................................................................. 49 Figura 11 - Geleias de C. cainito...............................................................................54 Figura 12 -: Geleias de H. speciosa...........................................................................54 Figura 13 - Geleias de P. glomerata..........................................................................54 LISTA DE TABELAS Obs.: As tabelas de 1 a 14 são de autoria do candidato e elaboradas ao longo do desenvolvimento deste trabalho Tabela 1 - Dosagem de açucares redutores e totais dos extratos etanólico, hidroetanólico de H. speciosa, P. glomerata e C. cainito pelo método DNS...........................................................................................................34 Tabela 2 - Dosagem de fenóis e flavonoides totais dos extratos etanólico, hidroetanólico e aquoso de H. speciosa, P. glomerata e C. cainito........................................................................................................35 Tabela 3 - Atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH (%) dos extratos aquosos de P. glomerata, H. speciosa, C. cainito e ácido as- córbico......................................................................................................37 Tabela 4 - Atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical DPPH (%) dos extratos etanólico e hidroetanólico (70%) dos frutos de P. glomerata, C. cainito e ácido ascórbico.......................................................................37 Tabela 5 - Inibição da formação de TBARS (%) in vitro pelos extratos etanólico, hi- droetanólico dos frutos de H. speciosa, P. glomerata, C. cainito e Tro- lox..............................................................................................................39 Tabela 6 - Inibição da formação de TBARS (%) in vitro pelos extratos aquosos dos frutos de H. speciosa, P. glomerata e C. cainito, e Trolox........................39 Tabela 7 - Resultados do teste FRAP expressos em µM de Trolox equivalentes dos extratos etanólico e hidroetanólico de H. speciosa, P. glomerata, C. cainito e ácido ascórbico.......................................................................................41 Tabela 8 - Resultados do teste FRAP expressos em µM de Trolox equivalentes do extrato aquoso de H. speciosa, P. glomerata, C. cainito e ácido ascórbico...................................................................................................41 Tabela 9 - Atividade antioxidante pelo método de sequestro do Oxido Nítrico (%) dos extratos etanólico e hidroetanólico dos frutos de H. speciosa, P. glomerata, C. cainito e rutina.....................................................................43 Tabela 10 - Resultados das absorbâncias máximas e os respectivos comprimentos de onda (λ) dos extratos etanólico e hidroetanólico (70%) dos frutos de H. speciosa, P. glomerata e C. cainito................................................47 Tabela 11 - Análises físico-químicas das geleias extra e comum de C. cainito........50 Tabela 12 - Análises físico-químicas das geleias extra e comum de P. glomerata...51 Tabela 13 - Análises físico-químicas das geleias extra e comum de H. speciosa.....51 Tabela 14 - Avaliação da atividade antioxidante pelo teste Dpph (%) das geleias extra e comum dos frutos de C. cainito, H. speciosa e P. glomerata................................................................................................56 LISTA DE ABREVIATURAS Λmax Comprimento de onda máxima Amax Absorbância máxima AGE Produtos de glicação avançada AAPH 2,2'-Azobis (2- amidinopropano) dicloridrato AlCl3 Cloreto de alumínio ANVISA Agência brasileira de vigilância sanitária CNNPA Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl DNS Ácido 3 5-dinitrosalicílico ERN Espécies reativas de nitrogênio FRAP Poder antioxidante de redução férrica HCl Ácido clorídrico FeCl3 Cloreto de ferro K Potássio Na Sódio NaNO2 Nitrato de sódio NaOH Hidróxido de sódio NO Oxido nítrico PBS Tampão fosfato salino P/v Peso por volume RDC Resolução da Diretoria Colegiada RL Radicais livres ROS Espécies reativas de oxigênio SNP Nitruprussiato de sódio TBARS Substâncias reativas a ácido tiobarbitúrico UV Ultravioleta UV-Vis Ultravioleta-visível LISTA DE SIMBOLOS % Porcentagem °C Grau Celsius cm Centímetro Σ Somatória mL Mililitro μL Microlitro mM Milimolar M Molar μg Micrograma pH Potencial hidrogeniônico x Vezes SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 15 2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................... 16 2.1 Estresse oxidativo .......................................................................................... 16 2.1.1 Danos oxidativos no organismo ....................................................................... 16 2.1.2 Espécies reativas ............................................................................................. 16 2.1.3 Glicação proteica .............................................................................................. 17 2.2 Antioxidantes de origem vegetal .................................................................. 18 2.2.1 Compostos fenólicos ........................................................................................ 19 2.2.3 Espécies com potencial para aplicação na área antioxidante .......................... 20 2.2.4 Chrysophyllum cainito (Abiu Roxo)................................................................... 20 2.2.3 Hancornia speciosa (Mangaba) ........................................................................ 21 2.2.4 Plinia glomerata (Cabeludinha) ........................................................................ 22 3 OBJETIVOS ..................................................................................................... 23 3. 1 Geral ................................................................................................................ 23 3. 2 Específicos ..................................................................................................... 23 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 24 4. 2 Preparo dos extratos brutos ......................................................................... 24 4.2.1 Extrato hidroetanólico ....................................................................................... 24 4.2.2 Extrato etanólico ............................................................................................... 24 4.2.3 Extrato aquoso ................................................................................................. 25 4.3 Quantificação dos constituintes das polpas dos frutos ............................. 25 4.3.1 Dosagem de açúcares redutores e totais pelo método DNS ............................ 25 4.3.2 Dosagem de fenóis totais ................................................................................. 26 4.3.3 Dosagem de flavonoides por método espectrofotométrico ............................... 26 4. 4 Atividade Antioxidante ................................................................................... 26 4.4.1 Sequestro do radical DPPH .............................................................................. 26 4.4.2 Potencial redutor de ferro (Ferric Reducing Antioxidant power - FRAP) ......... 27 4.4.3 Teste da inibição da formação de TBARS ........................................................ 27 4.4.4 Atividade sequestradora de óxido nítrico (NO) ................................................. 28 4.4.5 Determinação da atividade antiglicante por MRE (Mobilidade Relativa em Eletroforese) ..................................................................................................... 29 4.5 Atividade Fotoprotetora dos extratos: Determinação do comprimento de onda para a absorbância máxima dos extratos dos frutos e FPS in vitro .......................................................................................................................... 29 4.6 Perfil cromatografico dos Extratos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-PAD) .................................................................................... 30 4.7 Produção Geleias dos diferentes frutos e avaliação da atividade antioxidante ..................................................................................................... 30 4.7.1 Produção das geleias ....................................................................................... 30 4.7.2 Avaliação das características físico-químicas e antioxidante ........................... 31 4.8 Analises estatísticas ...................................................................................... 32 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 33 5.1 Quantificação dos constituintes das polpas dos frutos ............................. 33 5.1.1 Açucares redutores e totais pelo método DNS ................................................. 33 5.1.2 Fenóis e flavonoides totais ............................................................................... 33 5. 2 Atividades antioxidante ................................................................................. 35 5.2.1 Sequestro do radical livre estável DPPH .......................................................... 35 5.2.2 Potencial redutor de ferro (FRAP) .................................................................... 37 5.2.3. Inibição da peroxidação lipídica (TBARS) ....................................................... 39 5.2.4 Sequestro do íon óxido nítrico (NO) ................................................................. 41 5.2.5 Determinação da atividade antiglicante por MRE (Mobilidade Relativa em Eletroforese) ..................................................................................................... 42 5.3 Atividade fotoprotetora .................................................................................. 44 5.4 Perfil cromatografico dos extratos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-PAD) .................................................................................... 47 5.5 Produção de Geleia das polpas dos frutos .................................................. 49 5.5.1 Análises físico-químicas das geleias ................................................................ 49 5.5.2 Atividade antioxidante das geleias ................................................................... 53 6 CONCLUSÂO .................................................................................................. 56 REFERÊNCIAS.................................................................................................57 15 1 INTRODUÇÃO Reações oxidativas são essencias a vida, pois estão envolvidas em uma série de processos essenciais, como na geração de energia, pela oxidação de carbohidratos e β-oxidação de lipídeos, algumas reações tem até a finalidade da produção de radicais livres (RL), como as de defesa (CONNER; GRISHAM, 1996). Em infecções, que são frequentes no organismo, células do sistema imune como os macrofagos e neutrofilos são capazes de liberar espécies reativas de oxigenio que auxiliam na contenção da infecção e fazem parte do processo inflamatório, porém há situações em que a presença de RL é excessiva, sendo uma condição biológica em que ocorre desequilíbrio, o stress oxidativo, relacionado a uma série de desordens no organismo (CONNER e GRISHAM, 1996, BETTERIDGE, 2000; BIRBEN et al., 2012). Esse quadro se caracteriza pelo aumento significativo do potencial de redução no organismo, devido a um aumento na produção de compostos químicos ou oriundos de fontes exógenas, como a poluição, abuso de drogas, radiação (solar principalmente, dieta pobre, estresse entre outros fatores (BETTERIDGE, 2000). Esses compostos com elevado grau de reatividade em altas concentrações são apenas parcialmente contidos através de sistemas biológicos, neutralizando-os ou reparando danos por eles gerados como indicado por Roesler et al. (2007). Nesse contexto pesquisas vêm demonstrando que antioxidantes de origem vegetal têm muita importância, com destaque para compostos fenólicos, principalmente os flavonoides, reduzindo ou até mesmo eliminando os efeitos deletérios dos processos oxidativos, podendo assim ser intensivamente empregados na forma in natura ou na indústria na forma de diversos produtos na área de alimentos, cosméticos e farmacológica (ROESLER et al., 2007). http://pt.wikipedia.org/wiki/Potencial_de_redu%C3%A7%C3%A3o http://pt.wikipedia.org/wiki/Potencial_de_redu%C3%A7%C3%A3o 56 6 CONCLUSÂO Os resultados obtidos no presente estudo são promissores na avaliação da atividade antioxidante a antiglicante, além de contribuir para a identificação dos compostos ativos dos frutos não convencionais dos frutos das espécies vegetais avaliados, somado a isso tais frutos possuem potencial para processamento industrial, na forma de geleia, mantendo compostos bioativos e dessa forma atividade antioxidante. Desse modo estes frutos apresentam várias opções de uso de alimentos, mas são subutilizados ou totalmente desconhecidos. Espera-se que esses dados sejam subsídios básicos para pesquisas em áreas relacionadas, por exemplo, Nutrição, Engenharia de Alimentos, Fitoquímica, Agronomia e Ecologia. A partir desta informação, novas pesquisas devem ser conduzidas selecionando-se as espécies mais promissoras para os altos níveis de compostos ativos com potencial antioxidante e antiglicantes de interesse nutricional, farmacêutico e cosmético. 57 REFERÊNCIAS AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução - CNNPA n° 12, de 1978. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 12 jul. 1978. Disponível em: . Acesso em: 25 abr. 2017. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Resolução - RDC n° 237, de 2002. Aprova regulamento técnico de protetores solares em cosméticos. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 23 ago. 2002. Disponível em: . Acesso em: 25 abr. 2017. ANGERHOFER, C. K.; MAES, D.; GIACOMONI, P. 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