Jumma Miranda Araújo Chagas Diversidade taxonômica e ecologia de Cestoda e Monogenoidea (Platyhelminthes) parasitas do gênero Potamotrygon Garman, 1877 (Myliobatiformes, Potamotrygonidae), na porção alta do Rio Paraná, Brasil. São José do Rio Preto 2024 Câmpus de São José do Rio Preto Jumma Miranda Araújo Chagas Diversidade taxonômica e ecologia de Cestoda e Monogenoidea (Platyhelminthes) parasitas do gênero Potamotrygon Garman, 1877 (Myliobatiformes, Potamotrygonidae), na porção alta do Rio Paraná, Brasil. Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biodiversidade, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CNPq – Processo 163765/2015-4 Orientador: Prof. Dr. Felipe Chinaglia Montefeltro Coorientador: Prof. Dr. Luciano Alves dos Anjos São José do Rio Preto 2024 Jumma Miranda Araújo Chagas Diversidade taxonômica e ecologia de Cestoda e Monogenoidea (Platyhelminthes) parasitas do gênero Potamotrygon Garman, 1877 (Myliobatiformes, Potamotrygonidae), na porção alta do Rio Paraná, Brasil. Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biodiversidade, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CNPq – Processo 163765/2015-4 Comissão Examinadora Prof. Dr. Felipe Chinaglia Montefeltro FEIS/UNESP – Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira Orientador Prof.ª Dr.ª Cristiéle da Silva Ribeiro FEIS/UNESP – Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira Prof. Dr. Diogo Tiago da Silva FEIS/UNESP – Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira Prof. Dr. Júlio César de Almeida Marsola UTFPR - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Câmpus Dois Vizinhos Prof.ª Dr.ª Aline Dal Olio Gomes UNESP - Instituto de Biociências, Câmpus Rio Claro São José do Rio Preto 02 de setembro de 2024 Dedico esta tese a minha irmã Hannah e ao meu companheiro Douglas Ribeiro, que foram capazes de suportar todos os meus momentos de angústia, insegurança e estresse durante o extenso processo que foi esse doutorado. AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer em primeiro lugar aos meus pais, e meus irmãos que sempre me apoiaram, incentivaram e vivenciaram comigo todos os obstáculos encontrados ao longo do doutorado. Agradeço especialmente ao meu companheiro, Douglas Ribeiro, por sempre acreditar na minha capacidade como pesquisadora, mesmo em momentos onde eu mesma não acreditava; além de ter feito parte de todas as etapas desse longo processo. Ao meu orientador, Dr. Felipe Chinaglia Montefeltro, por ter me incentivado, apoiado, orientado e acreditado que a conclusão desse doutoramento seria possível. Ao meu coorientador, Dr. Luciano Alves dos Anjos, pela confiança e autonomia na execução deste projeto. Não posso deixar de agradecer a todas as pessoas que me acompanharam, apoiaram e torceram por mim durante todo o extenso processo que foi a conclusão do meu doutorado e aos meus amigos que tornaram o período final dessa jornada mais leve. Ao Curso de Pós-Graduação em Biodiversidade (Ibilce), pela oportunidade que me foi dada de concluir a pós-graduação. Ao Prof.º Dr. João F.P. Bastos e Prof.º Dr. Marcos Chiquitelli pelo apoio durante as coletas dos hospedeiros. Ao Prof.º Dr. Fernando P.L. Marques e Prof.º Dr. Marcus V. Domingues pelo auxilio e orientações durante o processamento e identificação dos parasitas. Aos membros da banca desta defesa, que gentilmente aceitaram o convite para fazer parte desta etapa final do meu doutorado. A realização deste trabalho foi possível graças ao financiamento do CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – Brasil – Processo 163765/2015-4, pela concessão da bolsa de doutorado; "[...] nobody said that easy… no one ever said it would be this hard". The scientist, Coldplay. RESUMO As arraias neotropicais do gênero Potamotrygon apresentam uma história natural e um padrão biogeográfico único e complexo que pode ser atribuído à origem marinha e à colonização do ambiente continental durante o Mioceno. Durante a evolução dos potamotrigonídeos, diversas espécies da fauna parasitária coevoluíram e coadaptaram durante a colonização de novos ambientes. Um exemplo marcante pode ser observado durante a colonização da região do Alto Rio Paraná. No entanto, poucos estudos exploraram os aspectos ecológicos e taxonômicos dos parasitas de potamotrigonídeos. Neste trabalho investigamos aspectos da ecologia e taxonomia das espécies de Monogenoidea e Cestoda que parasitam as espécies de arraias de água doce do gênero Potamotrygon no Alto Rio Paraná. Nossos resultados indicam que pelo menos seis espécies de parasitas estão presentes em potamotrigonídeos da região. Dois dos parasitas observados são putativas novas espécies e três espécies parasitas foram registradas pela primeira vez na região, expandindo assim as suas distribuições geográficas. Quantificamos aspectos ecológicos em diferentes níveis de comunidades para as espécies de parasitas coletadas. Comparamos a diversidade em diferentes locais e hospedeiros e realizamos uma análise exploratória para investigar as diferenças na abundância de parasitas. Adicionalmente, é fornecida uma chave de identificação para as espécies de Monogenoidea e Cestoda encontradas na região amostrada. Palavras-chave: Taxonomia, Ecologia Parasitária, Helmintos, Espécies alóctones. ABSTRACT The Neotropical freshwater stingrays of genus Potamotrygon present a unique and complex natural history and biogeographical pattern that can be traced to a marine origin and the colonization of the continental environment during the Miocene. Along the evolution of potamotrygonids, several species of the parasitic fauna coevolved and coadapted during the colonization of the new environments. One striking example can be observed during the colonization of the Upper Paraná River region. However, few studies have explored the ecology and taxonomy of potamotrygonids parasites. In this work, we investigate aspects of the ecology and taxonomy of the species of Monogenoidea and Cestoda that are parasites the species of freshwater stingrays of the genus Potamotrygon in the Upper Paraná River. Our results indicate that at least six species of parasites are identified in potamotrygonids in the region. Two of the parasites are putative new species and three of the parasitic species were reported for the first time in the region, hence expanding their geographic distributions. We quantified ecological aspects at different levels of communities for the collected parasite species. We compared the diversity in different locations and hosts and performed an exploratory analysis to investigate the differences in parasite abundance. Additionally, an identification key for the Monogenoidea and Cestoda species of the sampled region is provided. Keyworks: Taxonomy, Parasite ecology, Helminths, Allochthonous species SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................ 10 2. CAPÍTULO 1. REVISÃO LITERÁRIA ....................................................................... 13 2.1 Aspectos biológicos dos hospedeiros ............................................................................. 13 2.2 Biodiversidade de parasitas em Potamotrygonidae ...................................................... 16 2.3 Aspectos Ecológicos e Coevolutivos da relação parasita/hospedeiro .......................... 19 3. OBJETIVOS .................................................................................................................... 23 4. REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 24 5. CAPÍTULO 2 - DIVERSITY AND ECOLOGICAL RELATIONSHIPS OF CESTODA AND MONOGENOIDEA PARASITES OF FRESHWATER STINGRAYS (MYLIOBATIFORMES, POTAMOTRYGONIDAE), IN THE UPPER PARANÁ RIVER, BRAZIL. ................................................................................................................... 34 Abstract ................................................................................................................................ 34 Material and Methods ........................................................................................................ 36 Sampling of hosts and parasites infracommunities ....................................................................... 36 Parasites biodiversity quantifies and data analysis ...................................................................... 38 Results .................................................................................................................................. 40 Parasite/host ecological relationships .......................................................................................... 40 Identification key for Monogenea parasites of Potamotrygon spp. of the upper course of the Paraná River. ................................................................................................................................ 46 Identification key for species of Cestoda parasites of Potamotrygon spp. of the upper course of the Paraná River. .......................................................................................................................... 46 Systematic Parasitology ................................................................................................................ 47 Discussion ............................................................................................................................ 55 Acknowledgements ............................................................................................................. 59 References ............................................................................................................................ 60 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................................... 65 10 1. INTRODUÇÃO GERAL A subfamília Potamotrygoninae (Myliobatiformes, Potamotrygonidae), constitui um grupo de elasmobrânquios que apresenta várias adaptações a vida em água doce. São linhagens endêmicas de águas continentais, porém intimamente relacionadas a clados que são predominantemente distribuídos em ambientes marinhos. A subfamília Potamotrygoninae representa o único clado obrigatoriamente de água doce dentre os elasmobrânquios sul- americanos, com aproximadamente 38 espécies alocadas em quatro gêneros (FRICKE et al., 2024). O táxon irmão dos Potamotrygoninae é composto por duas espécies marinhas do gênero Styracura, agrupados na subfamilia Styracurinae (CARVALHO et al., 2016a; FONTENELLE et al., 2021). Umas das hipóteses de colonização dos potamotrygoninae em ambiente dulcícola é atribuída a incursões marinhas durante o Mioceno (23 a 5 Ma) nas regiões associadas ao sistema amazônico, que consequentemente se estendeu para outros sistemas fluviais na América do Sul (FONTENELLE et al., 2021; LOVEJOY et al., 1998). A colonização dos potamotrigonídeos na região do Alto Rio Paraná se deu após a inundação do Salto de Sete Quedas atualmente submersa pelo reservatório da hidrelétrica de Itaipu, que representava uma barreira natural separando a ictiofauna da porção baixa do Rio Paraná da porção superior (LOBODA; CARVALHO, 2013). Sete espécies são registradas para a bacia do Prata, são elas: Potamotrygon amandae Loboda & Carvalho 2013, Potamotrygon falkneri Castex & Maciel 1963, Potamotrygon motoro (Müller & Henle 1841), Potamotrygon histrix (Müller & Henle 1839), Potamotrygon schroederi Fernández-Yépez 1958, Potamotrygon brachyura (Günther 1880) e Potamotrygon pantanensis Loboda & Carvalho 2013. As espécies mais comumente encontradas na porção alta do Rio Paraná são Potamotrygon amandae e Potamotrygon falkneri e mais raramente P. schroederi (GARRONE NETO, 2010) A fauna parasitária dos Potamotrygonidae está representada em sua maioria por platelmintos membros de Cestoda e Monogenoidea. A maior parte dos cestódeos e monogenóideos encontrados em Potamotrygonidae são restritos a essa família, e a sua diversidade parasitária fornece informações sobre a história evolutiva de seus hospedeiros (BROOKS; AMATO, 1992; MARQUES, 2000). Monogenoidea são ectoparasitas obrigatórios, com ciclo biológico direto, comumente encontrados infectando as brânquias ou a superfície externa de seus hospedeiros, podendo ser observado também nas narinas e olhos (BOEGER; KRITSKY, 1993). Dentre as famílias de Monogenoidea parasitas de elasmobrânquios, apenas três (Acanthocotylidae, Monocotylidae e Hexabothriidae) foram registradas para arraias da América do Sul, sendo mais frequentes em 11 espécimes pertencentes a família Rajidae (COHEN, 2013). Em Potamotrigonídeos, dois gêneros de monogenóideos foram observados Potamotrygonocotyle Mayes; Brooks; Thorson, 1981 (Monocotylidae) e Paraheteronchocotyle Mayes; Brooks; Thorson, 1981 (Hexabothriidae), inseridos em famílias cujo representantes são, em sua maioria, encontrados em elasmobrânquios marinhos (DOMINGUES; MARQUES, 2007). Os cestódeos são parasitas obrigatórios do trato digestivo de vertebrados quando adultos, e em estágios larvais podem ocorrem em outros grupos de vertebrados ou invertebrados (STUNKARD, 1953). Em elasmobrânquios geralmente são os hospedeiros finais do ciclo, sendo comumente observados na válvula espiral destes animais (SMITH; NOGA, 1993). Os representantes do grupo possuem um escólex na região anterior (fixação no hospedeiro) e um estróbilo, composto por inúmeras proglótides, onde cada proglótide possui um aparelho sexual feminino e um masculino completo. Em elasmobrânquios, o órgão mais fortemente parasitado por cestódeos é a válvula espiral, sendo comum encontrar ao menos uma espécie de cestódeo em elasmobrânquios coletados, principalmente em arraias (CARRIER et al., 2004). Na região amostrada, aspectos ecológicos da relação parasita/hospedeiro em potamotrygonídeos são escassos. Informações essas, que podem fornecer dados valiosos, não apenas sobre o hospedeiro, mas também sobre o ambiente aquático e sua integridade, permitindo a compreensão da estrutura das comunidades de parasitas e os processos envolvido na manutenção desta estrutura. Neste contexto, com base nas informações disponíveis na literatura sobre o gênero Potamotrygon e na escassez de informações sobre a helmintofauna na região do Alto Rio Paraná, algumas perguntas nortearam o projeto: (1) Com base nas espécies de cestódeos e monogenóideos descritas para a Bacia do Prata, a fauna parasitária acompanhou seus hospedeiros nesse período de colonização relativamente recente (~30 anos)? (2) Quais espécies de cestódeos e monogenóideos parasitam os potamotrigonídeos da região do Alto Rio Paraná? (3) O que podemos dizer sobre a ecologia dos parasitas e a relação parasita-hospedeiro no que tange a supracomunidade do Alto Rio Paraná? Desta maneira, o primeiro capítulo desta tese inicia-se com uma revisão literária reunindo informações sobre aspectos biológicos, de biodiversidade, ecológicos e evolutivos de grupos de parasitas e seus hospedeiros. Posteriormente, são apresentados os objetivos da tese, seguidos pelo Capítulo 2, onde os resultados obtidos são apresentados no formato em que foram 12 publicados no periódico “International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife”. Por fim, algumas considerações finais e perspectivas futuras são apresentadas. A referência completa do artigo encontra-se a seguir: CHAGAS, J. M. A.; RIBEIRO, D. D. C.; MENDES, T. F. S.; MONTEFELTRO, F. C.; ANJOS, L. A. D. Diversity and ecological relationships of Cestoda and Monogenoidea parasites of freshwater stingrays (Myliobatiformes, Potamotrygonidae), in the upper Paraná River, Brazil. International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife, [s. l.], v. 24, p. 100968, 2024. https://doi.org/10.1016/j.ijppaw.2024.100968 https://doi.org/10.1016/j.ijppaw.2024.100968 13 2. CAPÍTULO 1. REVISÃO LITERÁRIA 2.1 Aspectos biológicos dos hospedeiros A classe Chondrichthyes inclui mais de 1200 espécies, divididas nas subclasses Elasmobranchii (tubarões e raias) e Holocephali (Quimeras) (FILHO; SALES, 2017; STEDMAN; GARNER, 2018). O grupo possui amplo registro fóssil, com as primeiras indicações de sua origem evolutiva datada do período Ordoviciano (~ 488 a 443 Ma) (BOISVERT et al., 2019). Elasmobranchii é um grupo muito diversificado que ocupam diferentes nichos ecológicos, podendo ser encontrados em água doce e salgada, com diferentes profundidades (CARRIER et al., 2012). Sobreviveram a diversos eventos de extinção em massa que afetaram os vertebrados no final dos períodos geológicos Devoniano e Permiano, e embora atualmente o grupo seja menos diversificado que em seu auge (Paleozoico, ~ 542 a 251 Ma), continuam ecologicamente e morfologicamente diversos (BOISVERT et al., 2019). O comportamento alimentar do grupo pode variar entre, predação por perseguição, emboscada, até filtração de plâncton, com diferentes padrões de locomoção associados (CARRIER et al., 2012). Dentre os elasmobrânquios, um grupo se destaca por possuir características específicas, que possibilitam sua sobrevivência em águas fluviais na América do Sul. A família Potamotrygonidae (Chondrichthyes, Myliobatiformes) é um grupo monofilético (FONTENELLE et al., 2021; LOVEJOY et al., 1998; MARQUES, 2000) subdividida em duas subfamílias, seis gêneros e aproximadamente 40 espécies (FRICKE et al., 2024). Com representantes marinhos e de água doce. O grupo marinho pertence a subfamília Styracurinae, que compreende apenas um gênero (Styracura) e duas espécies (Styracura pacifica (Beebe & Tee-Van 1941) e Styracura schmardae (Werner 1904). A subfamília Potamotrygoninae possui representantes exclusivos de ambientes dulcícolas sendo representada por cinco diferentes gêneros e aproximadamente 38 espécies (FRICKE et al., 2024). Os gêneros existentes incluem Potamotrygon Garman 1877, Paratrygon Duméril 1865, Plesiotrygon Rosa, Castello & Thorson 1987, Heliotrygon Carvalho & Lovejoy 2011 e Elipesurus Schomburgk 1843 (Genus inquirendum) (FRICKE et al., 2024). A família Potamotrygonidae é considerado grupo-irmão de espécies anfi-americanas do gênero Himantura Müller & Henle, 1841 e provavelmente derivado de ancestrais marinhos que conquistaram o ambiente dulcícola no Eoceno-Mioceno, durantes transgressões marinhas (FONTENELLE et al., 2021; LOVEJOY, 1997). São animais com características morfofisiológicas únicas, como a presença de processo pré-pélvico, redução da glândula retal, 14 são incapazes de acumular ureia nos tecidos, e com modificações das Ampola de Lorenzini para eletro-recepção na água doce, com mecanismos osmo-ionorregulatórios semelhantes aos teleósteos. Possuem também um eficiente sistema de transporte ativo de sais pelas brânquias, com mecanismos morfofuncionais para reduzir perda de sais e um poderoso sistema de reabsorção de sais pelos rins (LASSO et al., 2016; LOVEJOY, 1997; LOVEJOY et al., 1998; MARQUES, 2000). Sendo o gênero Potamotrygon o mais abundante e amplamente distribuído na América do Sul (CARVALHO et al., 2016a), porém, a maioria das espécies viventes são restritas às drenagens amazônica e Bacia do Prata (CARVALHO et al., 2003; ROSA, 1985). A presença de representantes do grupo Potamotrygonidae na região do Alto Rio Paraná, somente foi possível após a inundação do Salto de Sete Quedas atualmente submersa pelo reservatório da hidrelétrica de Itaipu que representava uma barreira natural separando a ictiofauna da porção baixa do rio Paraná da porção superior (LOBODA; CARVALHO, 2013). Com o fechamento da barragem e o enchimento do reservatório, a jusante em 1982, a barreira deixou de existir, proporcionando a colonização e o estabelecimento de diversas espécies de peixes anteriormente restritas ao trecho inferior do rio Paraná a porção superior (BENEDITO CECILIO et al., 1997). Posteriormente, foram construídas outras usinas hidrelétricas e sistemas de transposição de embarcações na drenagem do alto Paraná favorecendo a dispersão deste e demais grupos (GARRONE-NETO, 2014). No Alto Rio Paraná as espécies mais comumente encontradas são Potamotrygon amandae e Potamotrygon falkneri. Potamotrygon schuhmacheri também foi observada, porém, com menor frequência e apenas na porção mais baixa do sistema do Alto Rio Paraná (GARRONE NETO; HADDAD JUNIOR, 2010). A espécie Potamotrygon amandae foi descrita em 2013, sendo anteriormente identificada como Potamotrygon motoro na região e está amplamente distribuída na bacia do Prata (LOBODA; CARVALHO, 2013). Por um tempo, pensou-se que a Usina hidrelétrica de Ilha Solteira representaria o limite de dispersão desses animais no Rio Paraná, levando em consideração que esta não possui sistema para transposição de peixes e embarcações; porém, era de se esperar que as os potamotrigonídeos seguissem o trajeto utilizado pelas embarcações, através da Hidrovia Tietê- Paraná (GARRONE-NETO, 2014). Atualmente, já há relatos de espécimes de Potamotrygon à montante da Usina de Ilha Solteira. Em geral, os elasmobrânquios são predadores em praticamente todos os ambientes em que vivem, com importante papel no fluxo energético entre níveis tróficos (CORTES, 1999). As arraias de água doce podem ser observadas ocupando diferentes habitats, dentre eles, calha de grandes rios, praias e lagos, contudo são predominantemente bentônicos, sendo 15 constantemente observadas junto ao substrato, na vegetação marginal ou sobre rochas (GARRONE NETO; UIEDA, 2012; Obs. Pessoal). Em geral, são animais carnívoros, podendo se alimentar de insetos aquáticos, pequenos crustáceos, moluscos gastrópodes, pequenos peixes, iscas descartadas por pescadores e até mesmo outras arraias (GARRONE-NETO; SAZIMA, 2009; PAGLIARINI et al., 2020; SILVA; UIEDA, 2007). Potamotrygon amandae e Potamotrygon falkneri são espécies sintópicas que ocupam o mesmo nicho ecológico, consumindo itens alimentares semelhantes, exibindo flexibilidade em seu comportamento de forrageio. Isso sugere que essas espécies compartilham recursos e estão adaptadas às condições ambientais do Alto Rio Paraná, o que reduz a competição por alimento e facilita sua dispersão em áreas recentemente colonizadas. No entanto, apesar de consumirem itens alimentares similares, Potamotrygon amandae possui uma dieta mais especializada, enquanto Potamotrygon falkneri apresenta uma dieta mais generalizada (LASSO et al., 2016; SILVA; UIEDA, 2007). As estratégias de forrageio dos potamotrigonídeos na região do Alto Rio Paraná já foram analisadas. De modo geral, esses espécimes localizam e consomem presas enterradas no substrato ou aderidas a superfícies, como troncos de árvores e estruturas de concreto. Devido à sua estrutura anatômica, os potamotrigonídeos utilizam movimentos ondulatórios das nadadeiras peitorais para perturbar o substrato e desenterrar as presas, ao mesmo tempo em que as desorientam. A captura da presa é realizada por meio da mordida com movimentos repetidos de sucção e expulsão durante a manipulação do alimento, que aparentemente facilitam a ingestão (GARRONE-NETO; SAZIMA, 2009; SHIBUYA et al., 2012). Possuem como modo reprodutivo a Viviparidade histotrófica, onde os embriões se desenvolvem e são nutridos por uma secreção liberada pela mucosa do útero da mãe (BLACKBURN; HUGHES, 2024; LODÉ, 2012). As fêmeas possuem órgãos reprodutivos assimétricos, podendo haver atrofia do ovário direto, onde a produção de folículos é restrita ao ovário esquerdo (CHARVET-ALMEIDA et al., 2005). A fecundidade média dos potamotrigonídeos podem variar de um a oito, podendo chegar até 16 filhotes (CHARVET- ALMEIDA et al., 2005). Ao serem coletadas, as fêmeas grávidas abortam (RANGEL et al., 2020). É frequentemente observada uma interação negativa entre as arraias e a população ribeirinha. As arraias ao se sentir ameaçada usa sua cauda semelhante a um chicote. Na ponta da cauda está presente de um a dois ferrões com formato retroserrilhado e assim como diferentes partes do epitélio das arraias, possuem células produtoras de toxinas (toxinas mais tóxicas do que a observada em arraias marinhas), causando desde lesões mecânicas severas a necrose 16 cutânea, podendo levar também a infecções bacterianas secundárias. Esta toxina é composta por proteínas e está presente no muco da pele dos peixes, normalmente serve para protegê-los contra patógenos (MARCHIORI, 2024; PEDROSO et al., 2007). 2.2 Biodiversidade de parasitas em Potamotrygonidae Em elasmobrânquios foram registrados diversos grupos de parasitas platelmintos, dentre eles, Digenea (~50 espécies), Monogenea (~193 espécies) e Cestoda (~800 espécies). A maioria desses principais grupos possuem notável especificidade para órgãos específicos, havendo casos de especificidade extrema (CARRIER et al., 2004). O alto grau de especificidade observado em alguns grupos de parasitas permite utilizar essa estreita relação em investigações sobre padrões coevolutivos no sistema parasita/hospedeiro (CAIRA; JENSEN, 2001). Com relação aos parasitas encontrados em elasmobrânquios de água doce os padrões coevolutivos são utilizados como evidência da história evolutiva monofilética de seus hospedeiros, com a maioria dos parasitos encontrados em Potamotrygonidae restritos a essa família, e a sua diversidade parasitária nos fornece importantes informações sobre a história evolutiva de seus hospedeiros (BROOKS; AMATO, 1992, p. 199). Além disso, estes parasitas apresentam um padrão de distribuição geográfica complexo, em que alguns estão restritos a um único sistema fluvial enquanto outros apresentam distribuição geográfica mais ampla, oferecendo subsídios gerados pela história biogeográfica dos parasitos na elaboração de teorias acerca da origem e colonização dos hospedeiros potamotrigonídeos (BROOKS et al., 1981). A fauna parasitária de Potamotrygonidae está representada em sua maioria por platelmintos membros de Cestoda e Monogenoidea (BROOKS et al., 1981; BROOKS; AMATO, 1992; BROOKS; THORSON, 1976; CAIRA; JENSEN, 2017; DOMINGUES et al., 2007; DOMINGUES; MARQUES, 2007; IVANOV, 2005; MARQUES, 2000; MARQUES et al., 2001; MARQUES; BROOKS, 2003; REGO, 1979). Os membros de Monogenoidea são platelmintos obrigatoriamente parasitas, com ciclo biológico direto e formam um grupo diverso de espécies geralmente ectoparasitas de peixes, infectando as brânquias ou a superfície externa de seus hospedeiros, podendo ser observado também nas narinas e olhos (BOEGER; KRITSKY, 1993). Caracterizados por possuir uma estrutura de fixação na extremidade posterior do corpo denominado háptor, podendo apresentar ganchos, âncoras, ventosas e grampos. São parasitas especialistas com preferência a um restrito grupo de hospedeiros (WHITTINGTON et al., 2000). No caso de grandes infestações, podem levar o hospedeiro a desenvolver anorexia, aumento da produção de muco, hemorragias 17 cutâneas, disfunção branquial, hiperplasia nos filamentos branquiais, emagrecimento, desequilíbrio osmótico e outras demandas metabólicas deletérias, podem abrir lesões facilitando a invasão por patógenos oportunistas (BENZ; BULLARD, 2004). Dois gêneros de Monogenoidea são encontrados em Potamotrygonidae: Potamotrygonocotyle Mayes; Brooks; Thorson, 1981 e Paraheteronchocotyle Mayes; Brooks; Thorson, 1981. Estes dois gêneros estão inseridos em famílias cujo representantes são em sua maioria encontrados em elasmobrânquios marinhos, no entanto as linhagens dulcícolas desses gêneros estão restritas aos espécimes de potamotrygonídeos, não sendo encontrados em outros hospedeiros de água doce sul-americanos, sugerindo um evento de colonização simultâneo dos rios da América do Sul pelos ancestrais dos parasitas monogenóideos e de seus hospedeiros (DOMINGUES; MARQUES, 2007). Para a Bacia do Prata somente três espécies são atualmente reconhecidas como válidas, todas atribuídas ao gênero Potamotrygonocotyle (DOMINGUES; MARQUES, 2007; FEHLAUER‐ALE; LITTLEWOOD, 2011). Potamotrygonocotyle está incluso na subfamília Heterocotylinae, a monofília do grupo é apoiada pela presença de esclerotizações ao redor da boca e se diferencia dos demais gêneros por possuir um lóculo central e oito lóculos periféricos no háptor, margens sinuosas levemente esclerotizadas em todos os septos do háptor, dois pares de estruturas acessórias dorsais no háptor, associadas com quatro lóculos posteriores periféricos, as estruturas acessórias anteriores dorsais podem ser bilobadas ou semicirculares e o órgão copulatório masculino não possui peça acessória (DOMINGUES; MARQUES, 2007, 2011). Os cestódeos são parasitas obrigatórios do trato digestivo de vertebrados quando adultos, e em estágios larvais podem ocorrem em outros grupos de vertebrados ou invertebrados (STUNKARD, 1953). Espécimes adultos retiram de seu hospedeiro apenas o necessário para sua sobrevivência, porém a presença de estruturas de fixação mais eficientes, podem importantes alterações do ponto de vista histopatológico (PAVANELLI et al., 2008). Espécimes desse grupo podem variar muito no tamanho, há espécies que medem apenas alguns milímetros e outras que podem ultrapassar 10 metros de comprimento. Apesar de possuir características específicas, no cestoide adulto podem ser distinguidas três regiões: escólex, colo e estróbilo (ROBERTS et al., 2009). O escólex se localiza na extremidade anterior do helminto e é responsável pela fixação do parasita em seu habitat intestinal, sendo uma estrutura extremamente variável, podendo ser observado ventosas, ganchos, acúleos e outras diversas estruturas de ancoragem. O colo é a parte mais delgado do corpo, onde as células do parênquima estão em intensa atividade, podendo ser considerada a área de crescimento do animal, o corpo alonga-se para se diferenciar-se posteriormente. Por último, é observado o estróbilo, que em 18 espécimes grandes pode corresponder a quase totalidade do volume do animal. O estróbilo e formado por um conjunto de proglótides e cada proglótide é formada por um conjunto completo de estruturas reprodutivas (masculina e feminina), na exterminada posterior são observadas as proglótides grávidas, que podem se desprender individualmente ou em grupos (apólise) (BRUSCA; MOORE, 2019; ROBERTS et al., 2009, 2024). Os elasmobrânquios são geralmente os hospedeiros finais do ciclo desses parasitas, sendo comumente localizados na válvula espiral destes hospedeiros (SMITH; NOGA, 1993). Em Potamotrygonidae os representantes de cestódeos são particularmente interessante do ponto de vista de sua especificidade e padrões coevolutivos (CAIRA; JENSEN, 2001). Há famílias extremamente diversas, como a exemplo, Onchobothriidae e Phyllobothriidae. Os representantes da família Onchobothriidae possuem ganchos esclerotizados em seu escólex, diferentemente do observado por representantes da família Phyllobothriidae, que não possuem ganchos e seus escólex lembram a forma de uma folha (CAIRA; REYDA, 2005). Ambos os grupos se destacam por possuírem espécies com diferentes origens evolutivas com gêneros tipicamente marinhos (e. g. Acanthobothrium VAN BENEDEN, 1849; Anindobothrium MARQUES; BROOKS; LASSO, 2001; Rhinebothrium LINTON, 1889 e Paraoncomegas CAMPBELL; MARQUES; IVANOV, 1999) e grupos restritos aos potamotrigonídeos (e. g. Potamotrygonocestus BROOKS & THORSON, 1976; Nandocestus REYDA, 2008; Rhinebothroides MAYES; BROOKS; THORSON, 1981). A identificação desses animais está baseada apenas em observações dos indivíduos adultos, pois não há ciclo de vida completo para conhecido para nenhum dos táxons (CAIRA et al., 1999; CAIRA; JENSEN, 2017; CAIRA; REYDA, 2005). O gênero Rhinebothrium é constituído por espécies que parasitam animais marinhos, com quatro espécies conhecidas por parasitar arraias dulcícolas, Rhinebothrium paratrygoni, Rhinebothrium copianullum, Rhinebothrium brooksi e Rhinebothrium fulbrighti (REYDA; MARQUES, 2011). O gênero Rhinebothroides é representado por cerca de cinco espécies válidas: Rhinebothroides glandularis, Rhinebothroides freitasi, Rhinebothroides moralarai, Rhinebothroides venezuelensis, e Rhinebothroides scorzai (BUENO, 2010), e é observado apenas em arraias de água doce (MARQUES et al., 2001). Espécies de Acanthobothrium possuem grande variabilidade morfológica intraespecífica e podem ser observados parasitando elasmobrânquios marinhos e dulcícolas, com apenas cinco espécies válidas parasitas de potamotrigonídeos (CARDOSO JR., 2010). Diferentemente do observado em Acanthobothrium, as espécies pertencentes ao gênero Potamotrygonocestus são estritamente parasitas de potamotrigonídeos (CARDOSO JR., 2010; LOVEJOY et al., 1998). 19 Potamotrygonocestus são caracterizados pela morfologia exclusiva de seus ganchos simples, presença de testículos anteriores ao ovário e células glandulares ao redor do vaso deferente (MARQUES et al., 2003). Há cerca de 11 espécies válidas, destas apenas quatro foram observadas na Bacia do Prata (LUCHETTI, 2011). 2.3 Aspectos Ecológicos e Coevolutivos da relação parasita/hospedeiro De forma geral, os parasitas representam um dos modos de vida mais bem sucedidos na natureza (POULIN; MORAND, 2000). As relações parasita-hospedeiro são resultado de interações antagônicas cuja coevolução levou a adaptações recíprocas, que permitem aos parasitas explorar características biológicas de seus hospedeiros para garantir sua transmissão, sobrevivência e manutenção de populações viáveis (CAMERON, 1964). Desempenhando um importante papel no equilíbrio do ecossistema e podendo afetar a biologia e o comportamento de seus hospedeiros de várias maneiras e em diferentes níveis (e. g. distribuição, dieta, seleção de habitat, morfologia, fecundidade, reprodução, comportamento e sobrevivência) (MARCOGLIESE, 2004; SURES et al., 2017; TIMI; POULIN, 2020). Os aspectos ecológicos parasitários em peixes fornecem importantes informações, não apenas sobre o hospedeiro, mas também sobre o ambiente aquático permitindo a compreensão da estrutura das comunidades de parasitas e os processos envolvido na manutenção desta estrutura (FERRARI-HOEINGHAUS et al., 2006). Em potamotrygonídeos são encontrados na literatura diversos trabalhos de sistemática e filogenia de parasitas (e. g. BROOKS et al., 1981; BROOKS; AMATO, 1992; BUENO, 2010; CARDOSO JR., 2010; DOMINGUES; MARQUES, 2007; FEHLAUER-ALE, 2009; FEHLAUER‐ALE; LITTLEWOOD, 2011; LOVEJOY, 1997; LUCHETTI, 2011; MACHADO, 2012; MARQUES, 2000; MARQUES; BROOKS, 2003; REGO, 1979; REYDA; MARQUES, 2011; REYDA; OLSON, 2003) porém, pouco se sabe sobre a ecologia da relação parasito-hospedeiro, principalmente se tratando da região do Alto Rio Paraná (apesar de ser uma das regiões mais bem amostradas e estudadas na ictiologia sul-americana), havendo apenas dois trabalhos sobre esse tema na região, restrito a uma única espécie de hospedeiro, Potamotrygon falkneri (ALVARENGA et al., 2009; LACERDA et al., 2009). A relação parasita/hospedeiro é estreita e pode ser afetada por diversos fatores que necessitam de melhor investigados quando se pretende entender a dinâmica populacional do local analisado. Características específicas dos hospedeiros podem determinar a extensão das infecções, o sexo do hospedeiro, por exemplo, pode afetar diretamente as taxas parasitárias, 20 este efeito tem sido atribuído principalmente à causas ecológicas, como diferentes taxas de exposição devido ao comportamento, dimorfismo sexual, diferenças sexuais fisiológicas (hormonais) e suas interações com respostas imunitárias (DUNEAU; EBERT, 2012). Além disso, a carga parasitária geralmente aumenta com a idade do hospedeiro ou tamanho, resultando em padrões cumulativos de abundância (POULIN, 2000). Hospedeiros maiores são capazes de acomodar mais espécies de parasitas e sustentar um maior número absoluto de parasitas do que hospedeiros pequenos, pois exibem maiores áreas de superfície para fixação de parasitas e podem ingerir maiores quantidades de alimentos, resultando em maior exposição a estágios infecciosos (POULIN, 2000; TIMI; POULIN, 2020). Os padrões coevolutivos observados nas relações parasita/hospedeiro englobam a história evolutiva de associações do parasita com diferentes táxons hospedeiros (CAIRA; JENSEN, 2001). Há parasitas que obtêm recursos de uma diversidade restrita de hospedeiros, podendo exibir uma variação no grau de especificidade ao hospedeiro, onde alguns infectam uma única espécie e outros um número de espécies de hospedeiros um pouco maior, há também uma minoria com a capacidade de infectar um elevado número de espécies (ROBERTS et al., 2009, 2024). Neste sentindo, alguns critérios necessitam ser levados em consideração quando se trata de investigações os padrões coevolutivos nas relações parasita/hospedeiro, por exemplo: (1) tanto os grupos de hospedeiros quanto de parasitas necessitam ser corroborados como monofiléticos; (2) correta identificação dos espécimes de hospedeiros e parasitas analisados; (3) disponibilidade de filogenias com boa amostragem e qualidade metodológica do hospedeiro e do parasita; (4) ampla amostragem dos hospedeiros, e; (5) os parasitas apresentam um grau considerável de especificidade aos hospedeiros (CAIRA; JENSEN, 2001). A especificidade de uma linhagem de parasitas geralmente reflete a origem de seus antepassados, já que o parasitismo surge de associações ecológicas entre potenciais hospedeiros e parasitas que já envolvem algum grau de especificidade. Além da especificidade relacionada a espécie hospedeira, também é possível observar diferentes graus de especificidade relacionados ao habitat do parasita, é o caso da especificidade de micro-habitat (tecido/órgão) (CHAPPELL, 1969; ROHDE, 1980). A presença de uma espécie de parasita em mais de uma espécie de hospedeiro pode indicar a permanência de uma linhagem de parasitas após eventos de especiação no hospedeiro, resultando da continuidade de fluxo gênico entre as populações de parasita em hospedeiros distintos (POULIN, 2007). Fatores ligados a ecologia da relação parasita/hospedeiro podem ter um papel importante na manutenção da especificidade (ADAMSON; CAIRA, 1994). Os índices ecológicos, quando comparado com a quantificação do número de espécies hospedeira, 21 fornecem maior riqueza de informações sobre possíveis especificidades entre parasita e hospedeiro, ao menos no que diz respeito a como o parasita utiliza os seus recursos (POULIN; MOUILLOT, 2005). O nível de especificidade nas relações parasita/hospedeiro afetam diretamente a dinâmica populacional dos parasitas, podendo levar a extinção local ou a mudança para novas espécies hospedeiras (BUSH; KENNEDY, 1994). Estudos sobre especificidade parasitária focam comumente no número de espécies hospedeiras utilizadas por determinado parasita, porem o primeiro trabalho a utilizar aspectos ecológicos (i. g. intensidade e prevalência) da relação parasita/hospedeiro na determinação da especificidade parasitária foi publicado na década de 1980 (ROHDE, 1980) e desde então, esta metodologia vem sendo pouco explorada (POULIN; MOUILLOT, 2005). Analisando sob uma perspectiva ecológica, algumas espécies hospedeiras são mais intensamente utilizadas do que outras, ou seja, a prevalência, intensidade ou abundância da infecção por um parasita em particular difere entre suas espécies hospedeiras. Informações ecológicas, como o fato do parasita ser altamente prevalente em uma espécie hospedeira, mas rara em outras, são informações valiosas, podendo e devendo ser utilizadas no índice da especificidade do hospedeiro. (POULIN; MOUILLOT, 2005). Um fator que pode afetar os nichos ocupados por determinados grupos de parasitas e consequentemente, a especificidade parasitária é a competição (HOLMES, 1973; RAMASAMY et al., 1985). A Competição interespecífica ocorre quando duas ou mais espécies disputam ativamente um recurso compartilhado no mesmo nível trófico, que pode ser limitante, tanto de forma real quanto potencial (MILLER, 1967). Fato facilmente observado no intestino de peixes e aves aquáticas com alta infecção parasitária, neste caso, os efeitos dessa competição, podem se manifestar de diferentes formas, por exemplo, os parasitas podem modificar seu uso do micro-habitat na presença de outros (ADAMSON et al., 1992; BUSH; HOLMES, 1986; STOCK; HOLMES, 1988) ou os parasitas tendem a não coocorrer em um mesmo hospedeiros (exclusão competitiva) (ADAMSON et al., 1992; BATES; KENNEDY, 1990; CHAPPELL, 1969). Apesar dos estudos sobre especificidade parasitária terem um longo histórico, há poucos trabalhos que relacionam aspectos ecológicos na determinação de especificidade (POULIN; MOUILLOT, 2005; ROHDE, 1980). Os hospedeiros possuem mecanismos específicos para controlar a invasão da fauna parasitaria e a inativação desses mecanismos de defesa é um componente chave do nicho de parasita. Algumas vezes esses parasitas podem explorar esse mecanismo, podendo até mesmo, se tornar dependente deles (ADAMSON; CAIRA, 1994). A especificidade parasitária pode ser considerada então, como o resultado da combinação entre condições ecológicas atuais e eventos 22 históricos, onde hábitos ecológicos similares, propiciam a colonização de novos hospedeiros (ADAMSON; CAIRA, 1994; POULIN, 2007). O conhecimento sobre a diversidade e ecologia dos parasitas de potamotrigonídeos, principalmente em uma região onde a temática foi pouco explorada, como o Alto Rio Paraná, são importantes na compreensão da dinâmica populacional da relação parasita/hospedeiro durante a colonização deste ambiente, além disso, esses conhecimentos oferecem uma base valiosa para futuros estudos e hipóteses evolutivas sobre essas relações. 23 3. OBJETIVOS O objetivo central foi investigar qualitativamente e quantitativamente a diversidade taxonômica e aspectos ecológicos de parasitas membros dos grupos Cestoda e Monogenoidea que parasitam as espécies de raias fluviais do gênero Potamotrygon, na porção alta do Rio Paraná, Brasil. Como objetivos específicos: • Inventariar a biodiversidade da fauna parasitária de cestódeos e monogenóideos que parasitam as espécies de raias do gênero Potamotrygon na porção alta do Rio Paraná. • Criar uma chave de identificação para os táxons de Cestoda e Monogenoidea que parasitam as espécies de raias do gênero Potamotrygon na porção alta do Rio Paraná. • Estimar os descritores populacionais dos cestódeos e monogenóideos encontrados nas espécies de Potamotrygon na região amostrada. • Investigar possíveis intercorrelações biologicamente significativas entre atributos biológicos dos hospedeiros e parâmetros ecológicos dos parasitas em diferentes níveis de comunidade. 24 4. REFERÊNCIAS ADAMSON, M. L.; BUCK, A.; NOBLE, S. Transmission Pattern and Intraspecific Competition as Determinants of Population Structure in Pinworms (Oxyurida: Nematoda). The Journal of Parasitology, [s. l.], v. 78, n. 3, p. 420, 1992. ADAMSON, M. L.; CAIRA, J. N. 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Jumma Miranda Araújo Chagas¹*, Douglas de Castro Ribeiro¹, Thalita Fischer Santini Mendes², Felipe Chinaglia Montefeltro², Luciano Alves dos Anjos² ¹Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Campus São José do Rio Preto, Ibilce-UNESP, Rua Cristóvão Colombo, 2265, São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil, 15054-000. * jumma.chagas@unesp.br ²Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, Departamento de Biologia e Zootecnia, FEIS-UNESP, Passeio Monção, 830, Ilha Solteira, São Paulo, Brazil, 15385-000. ABSTRACT The Neotropical freshwater stingrays of Potamotrygon genus present a unique and complex natural history and biogeographical pattern that can be traced to a marine origin and the colonization of the continental environment during the Miocene. During the evolution of potamotrygonids, several species of the parasitic fauna coevolved and co-opted concomitantly to their hosts during the colonization of the new environments. One striking example can be observed during the colonization of the upper Paraná River region. However, few studies explored the ecological and taxonomic aspects of potamotrygonid parasites. In this work, we investigate aspects of the ecology and taxonomy of the species of Monogenea and Cestoda that are parasites the species of freshwater stingrays of the genus Potamotrygon in the upper Paraná River. Our results indicate that at least six species of parasites are present in potamotrygonids in the region. Two of the observed parasites are putative new species and three of the parasitic species were identified for the first time in the region, hence expanding their geographic distributions. We quantified ecological aspects at different levels of communities for the collected parasite species. We compared the diversity in different locations and hosts and performed an exploratory analysis to investigate the differences in parasite abundance. Additionally, an identification key for the Monogenea and Cestoda species of the sampled region is provided. Keyworks: Taxonomy, Parasite ecology, Helminths, Allochthonous species 35 Introduction It is estimated that almost 90% of helminth diversity are unknown to science (Carlson et al., 2020). The global description of the parasite fauna is complex, involving a series of stages such as survey, collection and description of diversity, geographic distribution data and ecological associations with the host species. It is a time-consuming process in which distorted analyses generate quantitative differences between the diversity of recognized species and the expected diversity (Carlson et al., 2020). One of the groups with the most information are cestodes parasites of Chondrichthyes. However, the available information totals only 28% of the number of species expected in this group (Carlson et al., 2020). Potamotrygon Garman 1877 is the most specious genus of freshwater stingrays in the Potamotrygonidae family in South America, with 30 valid species (Fricke et al., 2024), with most species restricted to the Amazon and Prata basin drainages (Carvalho et al., 2013, 2016). The colonization of potamotrygonids in the upper Paraná River region in the 1970s was possible after the flooding of the Sete Quedas falls, currently submerged by the Itaipu hydroelectric reservoir. The Sete Quedas falls represented a natural barrier separating the fauna of the lower portion of the Paraná River from the higher (LOBODA; CARVALHO, 2013). Seven species of the genus Potamotrygon are recorded in the Prata basin (i.e. Paraná, Paraguay, and Uruguay Rivers drainages), they are: Potamotrygon amandae Loboda & Carvalho 2013, Potamotrygon falkneri Castex & Maciel 1963, Potamotrygon motoro (Müller & Henle 1841), Potamotrygon histrix (Müller & Henle 1839), Potamotrygon schroederi Fernández-Yépez 1958, Potamotrygon brachyura (Günther 1880) and Potamotrygon pantanensis Loboda & Carvalho 2013. The species most commonly found in the upper Paraná River are P. amandae and P. falkneri and more rarely P. schroederi (Garrone Neto, 2010). P. amandae was described in 2013, having previously been identified as P. motoro in the region, and is the species with the greatest geographic distribution among the other species recorded in the Prata basin (Loboda and Carvalho, 2013). The parasite fauna of the Potamotrygonidae is mostly represented by helminths Monogenea van Beneden 1858 and Cestoda van Beneden 1849. Two genera of Monogenea are recognized in Potamotrygonidae: Potamotrygonocotyle Mayes, Brooks & Thorson 1981 and Paraheteronchocotyle Mayes, Brooks & Thorson 1981. These genera are in families with representatives that are, for the most part, found in marine elasmobranchs (i.e. Monocotylidae Taschenberg, 1879 and Hexabothriidae Price, 1942). However, the lineages of Monogenea and Cestoda that colonized the freshwater environment are restricted to potamotrygonids and are 36 not found in other host lineages. This fact suggests a simultaneous colonization event of South American rivers by the ancestors of parasites and their hosts (Domingues and Marques, 2007). Cestodes adults are obligatory parasites of the digestive tract of vertebrates, and in larval stages they can infest other groups of vertebrates and invertebrates (Stunkard, 1953). In elasmobranchs, tapeworms are the most diverse group; they are generally the final hosts of the cycle, being commonly located in the spiral valve of these animals (Caira and Healy, 2004). Cestodes are frequently found parasitizing potamotrygonids, with groups of typically marine parasites (e.g. Acanthobothrium van Beneden 1849, Anindobothrium Marques, Brooks & Lasso 2001, Rhinebothrium Linton 1889 and Paraoncomegas Campbell, Marques & Ivanov 1999) and groups restricted to potamotrygonids in freshwater (e.g. Potamotrygonocestus Brooks & Thorson 1976, Nandocestus Reyda 2008 and Rhinebothroides Mayes, Brooks & Thorson 1981). In this work, we investigate the taxonomic diversity of Cestoda and Monogenea parasites in freshwater stingrays of the genus Potamotrygon in the upper Paraná River and describe some ecological relationships between these helminths and their hosts. Material and Methods Sampling of hosts and parasites infracommunities Two host species of Potamotrygonidae (i.e. P. amandae and P. falkneri) were analyzed. The potamotrygonids were collected between 05/2015 and 02/2016, using a casting net, harpoon, and artisanal fishing in two locations on the upper Paraná River, between the states of São Paulo and Mato Grosso do Sul (figure 1). Collection site 1 (S1, three points, -20.52; -51.48, -20.46; -51.43 and -20.40; -51.37) corresponds to the upper stretch of the Paraná river where there is a well-established population of freshwater stingrays (Dagosta et al., 2024; Langeani et al., 2007). This location has only two significant tributaries, the Tietê and Sucuriú Rivers. In this location, the main channel of the river is approximately 53 km long, with a water regime strongly controlled by two large hydroelectric dams, the Ilha Solteira dam upstream, and the Engenheiro Souza Dias dam downstream. Site 2 (S2, -20.96; -51.70) is also delimited by two dams, the Engenheiro Souza Dias dam (upstream) and the Porto Primavera dam (downstream), approximately 240 km long and with a greater number of tributaries, also with aquatic biodiversity and more diverse allochthonous when compared to S1 (Dagosta et al., 2024). 37 In the field, the stingrays were temporarily placed in 25-liter plastic boxes. Subsequently, the animals were euthanized with 800 mg/l-1 of benzocaine in ethanol (1:10, v:v) intracardiacally (Leary, 2013; West et al., 2007) and the parasites were collected. To collect monogeneans, the gill chamber of the hosts was exposed by removing the integument, followed by separation of the gill arches. Subsequently, the gill arches were fixed in a 4% formaldehyde solution in sodium phosphate buffer at 60ºC for 48h. After fixation, the gill arches were washed in distilled water (on a 20 µm steel sieve) and preserved in 70% ethanol until the screening and removal of the parasites under a stereoscope. The collected monogeneans were mounted on slides and coverslips with Gray & Wess or Hoyer’s and stained with Gomory’s trichrome (Domingues and Marques, 2007). To collect the cestodes, the host’s spiral valves were removed, opened longitudinally, and fixed in a 4% formaldehyde solution in sodium phosphate buffer at 60ºC for 48 hours. Subsequently, the material was carefully washed in distilled water and preserved in 70% ethanol and screened using a stereoscope to separate the parasites from the intestinal contents. The cestodes were rehydrated in a regressive alcohol series followed by two baths with distilled water (15 minutes each step), and stained with Delafield’s hematoxylin, dehydrated in a progressive alcohol series, diaphanized in Methyl Salicylate and mounted on a slide and coverslip with Canada Balm (Marques, 2000). The slides with parasites were analyzed and photographed using a Leica DM 2500 microscope equipped with a Leica DMC 2900 camera. Some of the specimens were analyzed using Scanning Electron Microscopy (SEM). These specimens were fixed in 2.5% Glutaraldehyde solution and stored in a refrigerator until dehydration. Dehydration was carried out in an increasing alcohol series (7.5, 15, 30, 50, 70, 80, 90 and 100%) with two baths of 15 minutes each. Finally, the material was submitted to the Critical Point using liquid CO2 (Balzers Union), mounted on metal bases (stubs) and metallized with gold-palladium ions (Metalizer MED 010, Balzers Union). The material was examined and electron micrographed using an SEM QUANTA 200 Scanning Electron Microscope. All procedures followed the guidelines and policies for ethical conduct in the use of animals in Brazil, approved by the Universidade Estadual Paulista - UNESP and Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal – CONCEA (authorization number CEUA/FEIS 15/2017), and registered in Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e Conhecimento Tradicional Associado – SisGen (registration number A001CBE). Permission for collection was provided by Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis – IBAMA and Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade – ICMBio (authorization number SISBIO 50019-4). 38 Vouchers of the hosts were deposited in DZSJRP fish collection (Departamento de Ciências biológicas of the Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas) of the São Paulo State University 'Júlio de Mesquita Filho', São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. Vouchers of the parasites were deposited in LAPEISA collection (Departamento de Biologia e Zootecnia of the Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira) of the São Paulo State University 'Júlio de Mesquita Filho', Ilha Solteira, São Paulo, Brazil. Parasites species names follow the World Register of Marine Species (WORMS EDITORIAL BOARD, 2024). Figure 1. Collection area for potamotrygonids and their parasites. (a) Highlight (red) of the upper Paraná River system (Brazilian portion). (b) Collection sites (red triangles), S1 with three points and S2 with one point, in the upper Paraná River, between the states of São Paulo and Mato Grosso do Sul, Brazil. Parasites biodiversity quantifies and data analysis Parasite biodiversity was characterized by parameters of infection, richness, and diversity. The definitions of prevalence, abundance and degree of intensity of infection follow Bush et al. (1997). The terms infracommunity, component community, supracommunity with respect to scale follow Poulin and Morand (2000). The community status (or degree of importance) of the taxa within the parasite communities was classified based on Caswell (1978) and Hanski (1982) adapted by Bush and Holmes (1986), considering species with prevalences greater than 66% as core species, prevalences between 33% and 66% as secondary species, and 39 prevalences lower than 33% as satellite species. Additionally, we evaluated the frequency of parasite dominance. We used Quantitative Parasitology v. 3.0 (Reiczigel et al., 2019) to quantification of ecological parameters. The dominance (Simpson index - Ranges from 0 (all taxa are equally present) to 1 (one taxon dominates the community completely) and evenness index were calculated in the software Past v. 4.09 (Hammer et al., 2001). We compared parasite richness between hosts and locations using the diversity t-test (Magurran, 1988) with 1000 bootstrap replicas in software Past v. 4.09 ( Hammer et al., 2001; Faul et al., 2009). Additionally, we calculated the test power and effect size using the software GPower v. 3.1 (Faul et al., 2009). Component community richness and meta-community richness was estimate using the sample-size-based diversity accumulation curves using hosts as unit of sampling and Hill numbers. Diversity metrics were species richness, Shannon Index and Simpson Index values (Chao et al., 2014). Values were calculated and visualized for hosts (to visualize component community richness) and sites (to visualize meta-community richness). The iNEXT function of package iNEXT (Hsieh et al., 2016) was used to extrapolate species richness these curves (asymptotic estimate). We used 100 bootstrap iterations, and 95% confidence intervals generate by function iNEXT. We used generalized linear mixed modeling (GLMM) with a negative binomial distribution and log link (estimated using Maximum Likelihood and Nelder-Mead optimizer) to determine if infracommunity abundance varied between sampling (function glmer.nb of package lmer4, Bates et al., 2014). The fixed part of the model has as its response variable the abundance of all parasite species together. We used as predictors the disc length (DL), sex (males or females), gonadal development stages (immature, initial development, advanced development, mature (including pregnant females) and resting) and Condition Factor (used as syntax for the length-weight relationship, calculated according to Peig and Green (2009)). We assume that the host species (i.e. P. amandae or P. falkneri) and collection site (S1 or S2) did not set up independent samples and were included in the model as random variables. Graphs of GLMM results were made with the package effects (Fox et al., 2016). Version 4.2.2 of R software (R Core Team, 2020) was used to perform statistical analyzes of the mentioned packages. 40 Results Parasite/host ecological relationships A total of 84 host specimens were analyzed, of which 39 specimens of P. falkneri and 45 specimens of P. amandae. The disc length of the animals ranged from 20.5 to 52.0 cm (35.99 ± 5.65) in P. amandae and 18.5 to 71.0 cm (34.97 ± 11.65) in P. falkneri. In P. falkneri, 87% of the specimens were parasitized. In P. amandae 42% of individuals were parasitized in S1 and 75% in S2. The supracommunity in the hosts analyzed was 6.643 parasite specimens. The richness found in the host community was six species of helminths, consisting of one species of Monogenea (Potamotrygonocotyle tsalickisi Mayes, Brooks & Thorson 1981) and five species of Cestoda (Acanthobothrium quinonesi Mayes, Brooks & Thorson 1978, Rhinebothrium paratrygoni Rego & Dias 1976, Rhinebothroides glandularis Brooks, Mayes & Thorson 1981, Potamotrygonocestus sp. 1 and Potamotrygonocestus sp. 2). Infracommunities richness ranged from one to five parasite species and no co-parasitism was observed between Cestoda and Monogenea. Information by parasite species is available in Table 1. The component community in P. falkneri is made up of five species of cestodes, with R. paratrygoni being the species with the highest prevalence and abundance. In P. amandae component community was composed of four taxa from both groups, Cestoda and Monogenea, with P. tsalickisi being the species with the highest prevalence and abundance (Table 1). 41 Table 1. Ecological aspects of parasites found in species of the genus Potamotrygon in the upper Paraná River, Brazil. Abbreviations: Ab= Abundance, AF = Analyzed Fishes, Do = Dominance, Ev = Evenness, In = Intensity, PF = Parazited Fishes, Pr (%) = Prevalence (percent). Potamotrygon amandae Potamotrygon falkneri Potamotrygon amandae Site 1 Site 2 Site 2 Taxa Infection Sites AF PF Pr (%) Ab In Do Ev AF PF Pr (%) Ab In Do Ev AF PF Pr (%) Ab In Do Ev Monogenea Potamotrygonocotyle tsalickisi Gills 11 11 100 4810 153 0.25 0.69 11 0 - - - - - 9 6 66.7 1026 126 0.33 0.75 Cestoda Acanthobothrium quinonesi Spiral valve 36 5 13.9 61 4 0.54 0.53 39 22 56.4 77 2.5 0.07 0.93 9 2 22.2 3 2 1 Rhinebothrium paratrygoni Spiral valve 36 4 11.1 70 7 0.59 0.50 39 31 79.5 392 6 0.07 0.85 9 2 22.2 1 1 - Rhinebothroides glandularis Spiral valve 36 0 - - - - - 39 12 30.8 24 1 0.12 0.96 9 0 - - - - Potamotrygonocestus sp. 1 Spiral valve 36 0 - - - - - 39 18 46.2 167 1 0.48 0.47 9 1 11.1 1 1 - Potamotrygonocestus sp. 2 Spiral valve 36 0 - - - - - 39 5 12.8 11 2 0.18 1.02 9 0 - - - - 42 The results of the diversity t-test suggest a statistically significant difference in parasite diversity between locations (S1 < S2, t = -40.00; p = < 0.001; d = 3.76; β = 0.99) and between host species (P. amandae < P. falkneri, t = -29.68; p = < 0.001; d = 0.52; β = 0.21) (Figure 2). Rarefaction and extrapolation values of the diversity estimates generated by iNEXT for different sites and host are presented in Figure 3. In S1, P. tsalickisi was considered a core species and A. quinonesi and R. paratrygoni were considered satellite species. In S2, in P. falkneri, R. paratrygoni was recognized as the core species, A. quinonesi and Potamotrygonocestus sp. 1 were considered secondary species and R. glandularis and Potamotrygonocestus sp. 2 as satellite species. In P. amandae, P. tsalickisi was considered secondary species and A. quinonesi, R. paratrygoni and Potamotrygonocestus sp. 2 as satellite species. The results of GLMM (Table 2 and Figure 4) show total explanatory power is substantial (conditional R2 = 0.62) and the part related to the fixed effects alone (marginal R2) is of 0.61. The effect of sex and gonadal development were statistically non-significant and positive. On other hand, the effect of DL and Condition Factor were statistically significant (positive and negative respectively). Figure 2. Component community richness and meta-community richness of helminths species in potamotrygonids from the upper Paraná River. Results of diversity t-test suggest a statistically significant difference between sites (S1 < S2, t = -40.00; p = < 0.001; d = 3.76; β = 0.99) and between host (Potamotrygon amandae < Potamotrygon falkneri, t = -29.68; p = < 0.001; d = 0.52; β = 0.21). Mean and Median values are indicated by black square and horizontal black line respectively. 43 Figure 3. Rarefaction and extrapolation of component community richness and meta-community richness of helminths species in potamotrygonids from the upper Paraná River. Sample-size-based diversity accumulation curves (with 95% confidence intervals of lower and upper limits) using hosts as unit of sampling and Hill numbers. Diversity metrics were species richness (0), Shannon Index (1) and Simpson Index (2) values. 44 Table 2. Results of Generalized Linear Mixed Model (GLMM) with negative binomial distribution and log link explaining the abundance of helminth species. Disc length (DL), sex (males or females), gonadal development stages (immature, initial development, advanced development and resting) and Condition Factor are predictors. Host species and collection site are random variables. Marginal significance statistical (*) and significant statistically (**) of p-values are indicates. Fixed effects Category Estimate (SE) z value p value Intercept 3.86 (2.03) 1.89 0.0585* Disc length 0.10 (0.05) 2.18 0.0287** Sex Male vs. Female 0.35 (0.69) 0.49 0.6208 Gonadal development 0.59 (0.33) 1.74 0.0819 Condition Factor (K) -5.24 (1.61) -3.23 0.0012** Random effects Variance (SE) Correlation Locality (intercept) 0.01 (0.11) Host Potamotrygon amandae vs. Potamotrygon falkneri 0.39 (0.62) -1.00 45 Figure 4. Relationship of infracommunity abundance of helminths inferred by mixed generalized linear modeling (GLMM) in potamotrygonids of the upper Paraná River. Abundance vs. (a) disc length (DL), (b) gonadal developmental stages (immature = 0, early development = 1, advanced development = 2, mature = 3 and rest = 4), (c) condition factor and (d) sex (males or females). (e) Host species (i.e. Potamotrygon amandae or Potamotrygon falkneri) and collection sites (S1 or S2) are random variables. 46 Identification key for Monogenea parasites of Potamotrygon spp. of the upper course of the Paraná River. (One species) Haptor with one central loculus and eight peripheral loculi; haptor septa with slightly sclerotized margins; two pairs of dorsal accessory structures, associated with four posteriors peripheral loculi; each dorsal haptoral accessory structure with sclerotized margins; anterior pair of dorsal haptoral accessory structures bilobate; male copulatory organ with subterminal aperture, without an accessory piece. .................... Potamotrygonocotyle tsalickisi Identification key for species of Cestoda parasites of Potamotrygon spp. of the upper course of the Paraná River. 1.1. Hooks of the scolex absent. ................................................................................................ 2 1.2 Sclerotized hooks of the scolex present. .............................................................................. 3 2. Fusiform bothridia, without central constriction; medial longitudinal septum of the scolex originating from the posterior margin of the anterior loculus to the posterior margin of the bothridium; strobila craspedote; ovarian lobes symmetrical; paravaginal glandular cells absent .......................................................................................................... Rhinebothrium paratrygoni 2.1 Pedunculated bothridia; marginal and transverse septa of the scolex forming loculi; strobila acraspedote; ovarian lobes asymmetrical; paravaginal glandular cells present Rhinebothroides glandularis 3. Septate bothridia, triloculated, with a pair of bifid hooks, medial and lateral branches of the hook subequal, with the distal cusp of the lateral branch surpassing the median region of the medial branch; loculi asymmetrical, anterior loculus conspicuously larger, reaching or exceeding the medial region of the scolex, posterior loculus well reduced, with the anterior edge entering the medial loculus; testes surpassing the cirrus sac, reaching the anterior margin of the ovary; vitellaria extending beyond the anterior margin of the ovary ............... Acanthobothrium quinonesi 47 3.1 Non-septate bothridia, with a pair of simple, non-bifurcated hooks; testes not exceeding the cirrus sac; vitellaria not exceeding the anterior margin of the ovary ........................................ 4 4. Proximal portion of hook at an angle greater than 130º in relation to the anterior process of the base; furcation laterally arched, with cusp directed posteromedially; posterolateral genital pore, not exceeding the posterior portion of the ovary lobes ........... Potamotrygonocestus sp. 1 4.1 Proximal portion of hook at an angle of approximately 100º in relation to the anterior process of the base; furcation arched anteriorly, with cusp directed medially; terminal genital pore, surpassing the posterior portion of the ovary lobes .................. Potamotrygonocestus sp. 2 Systematic Parasitology Monocotylidea (sensu Boeger and Kritsky 1993) Monocotylidae Taschenberg 1879 Potamotrygonocotyle Mayes, Brooks & Thorson 1981 Potamotrygonocotyle tsalickisi Mayes, Brooks & Thorson 1981 Figure 5. Morphology of Potamotrygonocotyle tsalickisi. Whole specimen (a); haptor (b and c), and male copulatory organ (d and e). Abbreviations: A = anchor; DhAsA = anterior dorsal haptoral accessory structure; DhAsP = posterior dorsal haptoral accessory structure; H = haptor; HCL = haptor central loculi; HPL = haptor peripheral loculi; HS = haptoral septa; MCo = male copulatory organ, and MCoA = male copulatory organ aperture. 48 Remarks: Four species of the genus Potamotrygonocotyle are described for the Prata Basin (i.e. Potamotrygonocotyle chisholmae Domingues & Marques 2007, Potamotrygonocotyle dromedarius Domingues & Marques 2007, Potamotrygonocotyle rionegrensis Domingues, Pancera & Marques 2007 and Potamotrygonocotyle tsalickisi Mayes, Brooks & Thorson 1981. However, only P. tsalickisi was recorded in the present study. Domingues and Marques (2007) describe Potamotrygonocotyle eurypotamoxenus and Potamotrygonocotyle uruguayense in the Prata Basin. Subsequently, Domingues and Marques (2011) proposed these species as junior synonyms of P. tsalickisi and P. chisholmae, respectively. P. tsalickisi readily differentiates itself from its congeners from the Prata Basin due to the morphology of the copulatory organ, with a subterminal opening (vs. terminal opening in P. dromedarius, P. rionegrensis and P. chisholmae). P. tsalickisi has a wide distribution in the Amazon and Prata Basins and relatively low parasite specificity (DOMINGUES; MARQUES, 2007). Rhinebothriidea Healy, Caira, Jensen, Webster & Littlewood 2009 Rhinebothriidae Euzet 1953 Rhinebothrium Linton 1890 Rhinebothrium paratrygoni Rego & Dias 1976 Figure 6. Morphology of Rhinebothrium paratrygoni. Morphology of scolex (A); Details of bothridium (B); Terminal mature proglottid (C); Cross-copulation between mature proglottids (D), and partial strobila (E). Abbreviations: B = bothridia; Cc = Cross-copulation; O = ovary, and S = scolex.). 49 Remarks: Rhinebothrium paranaensis Menoret & Ivanov 2009 was considered a junior synonym of Rhinebothrium paratrygoni by Reyda and Marques (2011), but this has not been accepted by Ruhnke et al. (2017) and is still considered valid in the Global Cestode database (GCD) and in the WoRMS (WoRMS Editorial Board, 2024). Rhinebothrium paranaensis together with Rhinebothrium paratrygoni corresponds to the two valid species of the genus Rhinebothrium described for the Prata Basin. Rhinebothrium paratrygoni can be differentiated from other congeners by the following characteristics: strobilous conspicuously craspedote (vs. acraspedote in Rhinebothrium brooksi Reyda & Marques 2011 and Rhinebothrium copianullum Reyda 2008) and the smaller size of microtrichia (<5µm vs. >7µm in R. br