Campus de Botucatu  

 

 

 

 

 

Caracterização de marcadores de espermatogônias tronco e sua 

regulação endócrina e parácrina em zebrafish (Danio rerio) 

 

 

 

 

 

Lucas Benites Doretto 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Botucatu, São Paulo 

2018 



2 
 

Campus de Botucatu  

 

 

Universidade Estadual Paulista  

“Júlio de Mesquita Filho” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU 

 

 

Caracterização de marcadores de espermatogônias tronco e sua 

regulação endócrina e parácrina em zebrafish (Danio rerio) 

 

 

 

 

Lucas Benites Doretto 

Orientador: Prof. Dr. Rafael Henrique Nóbrega 

 

 

 

Dissertação apresentada ao Instituto de 

Biociências, campus de Botucatu, UNESP, para 

obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-

graduação em Ciências Biológicas (Genética) 

Genética. 

 

 

 

Botucatu, São Paulo  

2018 



FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. 

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP 

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: LUCIANA PIZZANI-CRB 8/6772  
 

   

 Doretto, Lucas Benites. 
   Caracterização de marcadores de espermatogônias tronco e 

sua regulação endócrina e parácrina em zebrafish (Danio 

rerio) / Lucas Benites Doretto. - Botucatu, 2018 

 

   Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista 

"Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de 

Botucatu 

   Orientador: Rafael Henrique Nóbrega 

   Coorientador: Emanuel Ricardo Monteiro Martinez 

   Capes: 20204000 

 

   1. Células-tronco. 2. Peixe-zebra. 3. Espermatogênese. 4. 

Testículos. 

 

 

Palavras-chave: Células tronco; Danio rerio; 

Espermatogênese; Pou5f3; Testículo. 
 

 



3 
 

Dedicatória 

 

A minha família por todo apoio dedicado ao longo desses 

anos de formação, não só profissional, mas também, 

humana. 

 

Aos profissionais que junto a mim, construímos esse 

belo trabalho. Sem o apoio de vocês, nada disso seria 

possível. 

 

A Ivana, uma pessoa muito especial para mim e que tem 

estado sempre ao meu lado. 

 

Meu muito obrigado a todos vocês! 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



4 
 

Agradecimentos 

 

 
A Universidade Estadual de Paulista “Júlio de Mesquita Filho (UNESP), 

ao Instituto de Biociências e ao Programa de Pós-graduação em Genética e 

todos seus docentes pela oportunidade oferecida; 

 

Aos amigos e companheiros do laboratório Roproductive and Molecular 

Biology Group (RMBG), que juntos formamos um grupo de muita dedicação 

e trabalho: Arno, Juliana, Marcos, Aldo, Matheus, Ivana, Beatriz e 

Melanie; 

 

Ao meu co-orientador e agora amigo Dr. Emanuel Martinez pela confiança, 

paciência, amizade, aventuras e conhecimentos passados; 

 

Aos professores Dr. Sérgio Luis Felisbino e Dr. Luiz Henrique de Castro 

Assis pelas suas contribuições a versão final da dissertação; 

 

E principalmente ao Prof. Dr. Rafael Henrique Nóbrega, pela orientação e 

confiança na realização deste projeto, e na conquista deste sonho, agradeço 

também pela oportunidade, atenção e amizade. 

 

 

 

 

 

 

 



5 
 

Apoio financeiro 

 

 

Processos nº2016/12101-4 e nº2017/08274-3, Fundação de Amparo à Pesquisa do 

Estado de São Paulo (FAPESP). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



6 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“O amor ao estudo deve ser um traço 

característico de cada jovem. Isto é, que o 

jovem deve ampliar constantemente seu 

horizonte espiritual, aprofundar seus 

conhecimentos da teoria socialista, estudar 

história, a cultura de seu povo e finalmente, 

amar sua profissão, e melhorar 

constantemente sua qualificação técnica. Este 

é o dever de nossos jovens operários, 

estudantes e empregados” 

As Tarefas da Juventude 

Klement Gottwald, 25 de Abril de 1947 

 

 

 

 



7 
 

 

SUMÁRIO 

 

RESUMO 

ABSTRACT 

1. INTRODUÇÃO GERAL..........................................................................................................10 

1.1Células tronco e seu nicho ................................................................................................................10  

1.2 Pluripotência ..................................................................................................................................16 

1.3 Espermatogênese de peixes teleósteos e sua regulação endócrina ........................................................18 

2. JUSTIFICATIVA.........................................................................................................................24 

3. OBJETIVOS.................................................................................................................................24 

4. REFERÊNCIAS..........................................................................................................................25 

5. CAPÍTULO 1...............................................................................................................................30 

6. CONCLUSÕES FINAIS ..........................................................................................................58 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Resumo 

As células tronco são classificadas em dois grandes grupos de acordo com sua origem 1 

e capacidade de diferenciação. Células tronco embrionárias (CTE) são originadas do zigoto, 2 

e podem ser classificadas como totipotentes, isto é, capazes de originar um 3 

indivíduo inteiro, ou pluripotentes, quando originam os três folhetos embrionários (ecto, 4 

meso e endoderme). As células tronco adultas (CTA) são as células tronco encontradas nos 5 

tecidos fetais e adultos; classificadas como uni, oligo ou multipotentes dependendo da 6 

variedade de tecidos originados a partir delas. Marcadores de células tronco, como antígenos 7 

de superfície específicos, fatores de trancrição como OCT4 e NANOG são expressos em 8 

CTE e algumas CTA, mas são rapidamente reprimidos à medida que as células se 9 

diferenciam. O presente trabalho tem como objetivo identificar marcadores de células tronco 10 

e com isso, os efeitos do hormônio endócrino Fsh e do fator parácrino GDNF na atividade 11 

proliferativa e gênica dessas populações de células e também de células de Sertoli. Foi 12 

observado que os marcadores Pou5f3 e Gfra1a são principalmente expressos em 13 

espermatogônias tronco indiferenciadas e que sua expressão reduz significativamente sob 14 

efeito do recombinante zebrafish Fsh. Por outro lado, genes como o igf3, nanos3 e nanog 15 

tiveram sua expressão aumentada significativamente. O recombinante humano GDNF não 16 

altera significativamente a expressão desses genes, porém estimula a proliferação de 17 

espermatogônias tipo Aund e Adiff e células de Sertoli associadas. Logo, conclui-se que o 18 

rzfFsh atua de maneira endócrina na diferenciação de espermatogônias tronco Pou5f3+ e 19 

Gfra1a+ via células de Sertoli, visto que seu receptor é principalmente expresso em cistos 20 

indiferenciados. O rhGDNF, que por sua vez é expresso em células germinativas, estimula a 21 

proliferação de Aund e Adiff e células de Sertoli associadas através de seu receptor Gfra1a, 22 

expresso em ambas populações. 23 

 24 

 25 

 26 

 27 

 28 

 29 



9 
 

Abstract 30 

Stem cells are classified into two major groups according to their origin and capacity for 31 

differentiation. Embryonic stem cells (ESCs) originate from the zygote, and can be classified 32 

as totipotent, i.e., capable of originate whole individuals, or pluripotent, when they originate 33 

the three embryonic leaflets (ecto, meso and endoderm). Adult stem cells (ASC) are the cells 34 

found in fetal and adult tissues; classified as uni, oligo or multipotentes depending on the 35 

variety of tissues originated from them. Markers of stem cells, such as specific surface 36 

antigens and transcription factors such as OCT4 and NANOG are expressed in ESCs and 37 

some ASCs, but are rapidly repressed as the cells differentiate. The present work aims to 38 

identify stem cell markers and the effects of the endocrine hormone Fsh and paracrine factor 39 

GDNF on the proliferative activity of these cell populations and Sertoli cells as well as gene 40 

expression. It has been observed that the Pou5f3 and Gfra1a markers are mainly expressed 41 

in undifferentiated spermatogonia stem cell and their expression is significantly reducedbythe 42 

recombinant zebrafish Fsh. On the other hand, genes like igf3, nanos3 and nanog had their 43 

expression significantly increased. The human recombinant GDNF does not significantly 44 

alter the expression of these genes, but it stimulates the proliferation of Aund and Adiff 45 

spermatogonia and associated Sertoli cells. Therefore, it is concluded that rzfFsh acts as a 46 

endocrine factor in the differentiation of the spermatogonia stem cell Pou5f3+ and Gfra1a+ 47 

via Sertoli cells, since its receptor is mainly expressed in undifferentiated cysts. rhGDNF, 48 

which in turn is expressed in germ cells, stimulates the proliferation of Aund and Adiff and 49 

associated Sertoli cells through its Gfra1a receptor, expressed in both populations. 50 

 51 

 52 

 53 

 54 

 55 

 56 

 57 

 58 

 59 



10 
 

1. Introdução Geral 60 

1.1 Células tronco e seu nicho 61 

 62 

As células tronco são consideradas por definição biológica como as únicas células 63 

dos organismos multicelulares capazes de se autorrenovar como também de se 64 

diferenciarem em um ou mais tipos celulares específicos (Weissman, 2000; Fuchs et al., 65 

2004; Mitalipov & Wolf, 2008). O balanço entre estes dois processos é essencial para 66 

garantir o funcionamento dos tecidos do organismo (de Rooij et al, 2009). Para 67 

exemplificar, se o processo de autorrenovação for favorecido, as células tronco se 68 

multiplicam e formam uma espécie de hiperplasia. Por outro lado, se a diferenciação é 69 

favorecida, o tecido gradativamente perde sua função devido a exaustão da população de 70 

células tronco e, consequentemente, da produção de células diferenciadas. Tais células 71 

podem ser classificadas de acordo com sua origem e capacidade de diferenciação; as 72 

células tronco embrionárias (CTE) e as células tronco adultas (CTA) (Smith, 2006; 73 

Mitalipov & Wolf, 2008). As CTE são originadas a partir do zigoto que se se divide e 74 

forma blastômeros totipotentes até o estágio de 4 células. Totipotência é aqui definido 75 

como a capacidade de uma única célula originar um indivíduo inteiro (Figura 1) (Mitalipov 76 

& Wolf, 2008).  77 

Com a progressão do desenvolvimento embrionário (estágio de 8 células), os 78 

blastômeros perdem gradativamente sua totipotência a qual se encerra irreversivelmente 79 

quando os mesmos se diferenciam para formar o maciço celular interno e o trofoblasto 80 

(Figura 1) (Mitalipov & Wolf, 2008). Nesta etapa, as CTE podem ser consideradas 81 

pluripotentes, pois originam os diversos tipos de tecidos do corpo (Figura 1) (Mitalipov 82 

& Wolf, 2008). No entanto, estas células perdem a capacidade de se organizar e formar 83 

um embrião propriamente dito. As células tronco pluripotentes dão origem às CTA que 84 

estão presentes nos diversos tecidos do corpo (epitelial, conjuntivo, ósseo, cartilaginoso, 85 

adiposo, muscular e nervoso) podendo se diferenciar em um (unipotente), poucos 86 

(oligopotente) ou vários (multipotente) tipos celulares (Figura 1). A Figura 1 retirada de 87 

Mitalipov & Wolf (2008), ilustra bem as diferenças entre as CTE e CTA assim como a 88 

definição de totipotência, pluripotência, multi, oligo e unipotência. 89 

 90 



11 
 

 91 
 92 

Figura 1. O desenvolvimento embrionário se inicia com o zigoto o qual se divide para formar blastômeros. O 93 
zigoto e os blastômeros (até 4 células) são totipotentes, isto é, são capazes de formar um indivíduo por si só. 94 
Esta capacidade diminui gradativamente durante o desenvolvimento, originando células tronco pluripotentes 95 
(capazes de originar diversos tecidos do corpo através dos três folhetos embrionários), multipotente (vários tipos, 96 
porém em número limitado), oligopotente (poucos tipos celulares), unipotente (um único tipo celular) ou células 97 
somáticas terminalmente diferenciadas. As células somáticas terminalmente diferenciadas podem readquirir 98 
pluripotência a partir da introdução de genes de pluripotencia (iPS = induced pluripotent stem cell), ou podem 99 
readquirir a totipotência pela transferencia nuclear somática em citoplasma de oocitos (SCNT = somatic cell 100 
nuclear transfer). Retirado de Mitalipov & Wolf (2008).  101 

 102 
 103 

Em geral, as CTA constituem uma população rara e de pequeno número e estão 104 

distribuídas em lugares específicos (nichos) nos mais diversos tecidos do corpo (Hsu & 105 

Fuchs, 2012). A atividade das CTA depende de cada tecido em função de seu turnover 106 

celular (Hsu & Fuchs, 2012). Por exemplo, tecidos como pele, intestino e sangue onde o 107 

turnover celular ocorre de forma diário, a demanda e a atividade das células tronco é elevada 108 

e constante. No folículo capilar, as células tronco são recrutadas periodicamente em 109 

função do ciclo periódico de crescimento capilar. Por outro lado, existem tecidos de baixo 110 

turnover como o tecido muscular esquelético e nervoso, nos quais as células tronco estão 111 

queiscentes ou raramente se dividem em condições homeostáticas normais. No entanto, 112 

em casos de injurias, estas células são ativadas e começam a se proliferar e diferenciar 113 

para regenerar o tecido danificado (Hsu & Fuchs, 2012). Com base na dinâmica tecidual 114 

acima mencionada e no ciclo celular, alguns autores classificam as células tronco como 115 

dormentes, quiescentes, reserva ou long-term stem cells para se referirem às células que 116 



12 
 

raramente se dividem; ou de ativas, amplificação transitória ou short-term stem cells para as 117 

células tronco que se dividem rapidamente ou de forma transitória (Figura 2) (Schulze 118 

1979,1988; Weissman, 2000; Nakamura et al., 2010; Li & Clevers, 2010). 119 

As células tronco quiescentes (long-term stem cells) dariam origem às células tronco 120 

ativas (short-term stem cells) as quais originam precursores multipotentes (Weissman, 2000). 121 

As células tronco quiescentes possuem um longo ciclo celular (demonstrado pela seta 122 

curva contínua), enquanto que as células tronco ativas têm ciclos celulares curtos (seta 123 

curva descontínua) com renovação rápida (Weissman, 2000). 124 

 125 
Figura 2. Classificação das células tronco 126 
de acordo com seu ciclo celular. “Longterm 127 
stem cells” para designar as células tronco 128 
quiescentes de baixa renovação, e “short-129 
term stem cells” para as células tronco de 130 
rápido ciclo celular. Retirado de Weissman 131 
(2000). 132 

 133 

 134 
 135 

 136 

 137 

 138 

Estudos têm demonstrado que as células tronco quiescentes e as células tronco 139 

ativas constituem diferentes subpopulações que coexistem em diferentes regiões de um 140 

mesmo tecido (ver revisão em Li & Clevers, 2010) (Figura 3). 141 

 142 

  

  

 
 
 



13 
 

 143 
 Figura 3. Coexistência das células tronco quiescentes (células coloridas em rosa) e células tronco ativas 144 
(células representadas pela cor vermelha). A é um folículo capilar, B uma cripta intestinal e C medula óssea. Retirado 145 
de Li & Clevers (2010).  146 

 147 

As células tronco residem em regiões anatômicas específicas, conhecidas como 148 

nichos. O termo nicho foi cunhado inicialmente por Schofield em 1978, mas o conceito 149 

nicho permaneceu vago até sua identificação e caracterização em gônadas de Drosophila 150 

melanogaster (Oonczy et at., 1996; Fuller, 1998; Hardy et al., 1979; Kiger & Fuller, 2001). 151 

Funcionalmente, o nicho é entendido como o microambiente tecidual que abriga as 152 

células tronco, e através de uma rede complexa de sinalização celular influencia as 153 

características e sua atividade de autorrenovação e diferenciação (ver revisão em Hsu & 154 

Fuchs, 2012). Todo nicho, além das células tronco, é constituído por células 155 

somáticas/estromais, vasos sanguíneos e matriz extracelular (Figura 4) (Fuchs et al., 2004; 156 

Jones & Wagers, 2008). As células somáticas/estromais além de fornecer suporte 157 

estrutural para as células tronco são responsáveis por secretar uma série de fatores de 158 

crescimento solúveis locais que regulam de forma parácrina a atividade das células tronco 159 

(Figura 4). 160 

 161 



14 
 

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Figura 4. Elementos do nicho das células tronco. Note células de suporte/estromais/somáticas, célula 198 
tronco, matriz extracelular, vasos sanguíneos dentre outros. Retirado de Jones & Wagers (2008)  199 

 200 

Estes fatores de crescimento também são produzidos localmente por outros 201 

tipos celulares que também influenciam o destino das células tronco (Figura 4) (Jones 202 

& Wagers, 2008).  203 

Estudos têm demonstrado o papel dos vasos sanguíneos no nicho. Evidências 204 

recentes mostram que além de ser um aporte de oxigênio, hormônios e outras 205 

substâncias vindas do sangue, as células endoteliais produzem fatores de crescimento, 206 

conhecidos como fatores angiócrinos, que também regulam a atividade das células 207 

tronco (Fuchs et al., 2004; Jones & Wagers, 2008; Butler et al., 2010). Além das células 208 

somáticas/estromais, a matriz extracelular também constitui uma fonte de fatores de 209 

crescimento solúveis que estão envolvidos na regulação parácrina do nicho (Fuchs et 210 

al., 2004; Jones & Wagers, 2008). Estes fatores de crescimento estão associados a 211 

diversos elementos da matriz extracelular e podem ser liberados quando a matriz é 212 



15 
 

degradada ou remodelada dependendo da condição fisiológica (Fuchs et al., 2004; Jones 213 

& Wagers, 2008).  214 

Também vale mencionar o papel das junções celulares de adesão e das 215 

integrinas em reter as células tronco em seus nichos (Fuchs et al., 2004). As primeiras 216 

se estabelecem entre as células tronco e as células de suporte enquanto que as segundas 217 

prendem estas células à matriz (Figura 4) (Jones & Wagers, 2008).  218 

A influência do nicho na atividade das células tronco pode ser compreendida 219 

nos testículos de Drosophila melanogaster (Sprandling et al., 2001). Neste modelo é 220 

proposto que quanto mais distante do nicho, maior é a probabilidade das células tronco 221 

se diferenciarem, uma vez que estas estão afastadas das condições moleculares e 222 

estruturais que as mantém no seu estado indiferenciado (Figura 5) (Sprandling et al., 223 

2001). Isso também depende muito do tipo de divisão assumido pelas células tronco; 224 

se o fuso mitótico se encontra paralelo ao maior eixo da célula, as células-filhas 225 

resultantes serão iguais e indiferenciadas (divisão simétrica) (Figura 5A) (Sprandling et 226 

al., 2001). No entanto, se o fuso mitótico for perpendicular ao maior eixo da célula, as 227 

células-filhas resultantes serão diferentes; uma se mantém indiferenciada e a outra se 228 

diferencia por estar longe do nicho (divisão assimétrica) (Figura 5) (Sprandling et al., 229 

2001). 230 

Figura 5. Influência do nicho no destino das células tronco. Quanto mais distante do nicho, as 231 

células tronco tendem a se diferenciar, uma vez que ficam distantes dos fatores que as mantém 232 

indiferenciadas. Dois tipos de divisões são conhecidas: simétrica (A) e assimétrica (B). A simétrica gera duas 233 

células tronco iguais, enquanto que a assimétrica gera uma célula tronco indiferenciada e outra célula que se 234 

diferencia. Figura retirada de Sprandling e colaboradores (2001). 235 



16 
 

1.2 Pluripotência           236 

 237 

Por definição, o termo pluripotência é usado para se referir ao potencial das 238 

células tronco em se diferenciar nos três folhetos embrionários; endoderma, 239 

mesoderma e ectoderma (ver revisão em Mitalipov & Wolf, 2008). Assim sendo, as 240 

células do maciço celular interno (MCI) do blastocisto são pluripotentes e virtualmente 241 

capazes de originar todas as células somáticas e também as da linhagem germinativa 242 

do corpo (Mitalipov & Wolf, 2008). A pluripotência do MCI diminui gradualmente até 243 

a formação da gástrula. 244 

As CTE expressam marcadores específicos que vão desde antígenos, atividade 245 

enzimática específica como da fosfatase alcalina e telomerase a fatores de transcrição, 246 

como OCT4 e NANOG, que são rapidamente reprimidos a medida que as células se 247 

diferenciam (Mitalipov & Wolf, 2008). Dentre os fatores de transcrição relacionados à 248 

pluripotência, estudos mostraram que tal estado depende de uma tríade composta 249 

pelos fatores de transcrição OCT4, NANOG e SOX2 (ver revisão em Wang et al., 250 

2012). O OCT4 (octamer-binding transcription factor 4) é codificado pelo gene Pou5f1 e 251 

trata-se de um fator de transcrição da família POU. O NANOG por sua vez, é 252 

codificado pelo gene Nanog (Wang et al., 2012). 253 

OCT4 e NANOG são proteínas chaves na manutenção da pluripotência das CTE, 254 

atuando como parceiros na autorrenovação das mesmas (Wang et al., 2012; Sánchez-255 

Sánchez et al., 2011). Os dois fatores de trancrição são expressos no MCI, epiblasto e 256 

nas células germinativas primordiais durante o desenvolvimento embrionário, e nas 257 

espermatogônias e oócitos na vida adulta (Wang et al., 2012; Sánchez-Sánchez et al., 258 

2011). Grande parte dos estudos até então disponíveis foram feitos em camundongos 259 

e humanos devido o desconhecimento das formas ortólogas em outros vertebrados. 260 

Essas formas também foram identificadas em aves, Xenopus (somente Oct4), axolote 261 

(Ambystomamexicanum), zebrafish (Danio rerio) e em medaka (Oryzias latipes), 262 

demonstrando que esses fatores não são exclusivos de mamíferos (Tapia et al., 2012; 263 

Wang et al., 2011).  264 

Em relação ao OCT4, vale mencionar que o gene ancestral foi duplicado durante 265 

a evolução dos vertebrados originando duas formas; oct4 e pou2 (Tapia et al., 2012), 266 

entretanto o oct4 foi perdido nos peixes teleósteos e Pou2 perdida nos mamíferos. 267 

Atualmente, o nome dado a zebrafish é pou5f3 (Frankenberg et al., 2014). Estudos em 268 

modelos de peixes teleósteos, como zebrafish e medaka, têm demonstrado que a 269 



17 
 

função do Oct4 relacionado à pluripotência foi mantida na cópia presente nos 270 

teleósteos. Além disso, o padrão de expressão também é o mesmo, sendo expresso do 271 

zigoto até a gástrula e também nas células germinativas primordiais (ver revisão em 272 

Sánchez-Sánchez et al., 2011). No entanto, o Oct4 (spg/pou2) parece ter adquirido 273 

outras funções em zebrafish, como na regionalização do cérebro durante o 274 

desenvolvimento embrionário, dentre outras (Lunde et al., 2004). Por outro lado, em 275 

medaka, o Oct4 não desempenha nenhum papel na regionalização do encéfalo, mas é 276 

expresso nas células germinativas primordiais e nas espermatogônias tronco dos 277 

indivíduos adultos (Sánchez-Sánchez et al., 2010).  278 

Até o presente momento, o Oct4 não foi demonstrado em espermatogônias 279 

tronco de zebrafish, mas trabalhos usando anticorpo anti-Oct4 de roedores 280 

demonstram a presença da proteína nas espermatogônias tronco de Labeo rohita, que 281 

também é membro da família Cyprinidae (Panda et al., 2011). 282 

O NANOG por sua vez é considerado um fator crucial na manutenção da 283 

pluripotência embrionária em mamíferos (Kuijk et al., 2010) e também na regulação de 284 

grupos de genes responsáveis pelo controle da pluripotência celular (Chambers et al. 285 

2003; Cavaleri e Schöler 2003; Sun et al. 2014; Mitsui et al. 2003 Zhang et al., 2009). Em 286 

peixes, sabe-se que tal gene é importante para o desenvolvimento embrionário (Camp 287 

et al., 2009), uma vez que sua depleção leva a problemas no desenvolvimento da 288 

gástrula e consequente morte em zebrafish (Wang et al., 2016) e também em medaka 289 

(Sánchez-Sánchez et al., 2010). 290 

O terceiro elemento chave da pluripotência é o SOX2 que atua como co-fator 291 

do OCT4/NANOG para manter as células tronco em seu estado indiferenciado (ver 292 

revisão em Sánchez-Sánchez et al., 2011). Outros fatores relacionados à pluripotência 293 

das CTE têm sido investigados, como por exemplo, o KLF4 (kruppel-like factor 4), 294 

TCF3 (transcription factor 3) e STAT3 (signal transducer and activator of transcription 295 

3) responsáveis por exemplo, a induzir formação das chamadas iPS (induced pluripotent 296 

stem) cells a partir de células já diferenciadas, no caso, fibroblastos (Takahashi e 297 

Yamanaka, 2006). Embora o papel desses fatores durante o desenvolvimento 298 

embrionário seja bem caracterizado em mamíferos, pouco se conhece sobre a função 299 

e regulação dos mesmos em peixes teleósteos. A identificação e a caracterização 300 

funcional dos fatores que mantém a pluripotência nos peixes são, portanto, um grande 301 



18 
 

desafio para compreender o papel e evolução destas moléculas em diversas classes de 302 

vertebrados. 303 

     1.3 Espermatogênese de peixes teleósteos e sua regulação endócrina 304 

A espermatogênese é um processo altamente conservado entre os cordados e 305 

compreende uma série de eventos altamente precisos e coordenados, nos quais uma 306 

única espermatogônia tronco se diferencia para originar milhares de espermatozóides. 307 

Este processo é dividido em três grandes fases (Russell et al., 1990; Sharpe, 1994; 308 

França & Chiarini-Garcia, 2005; Nóbrega et al., 2009; Schulz et al., 2010): (1) fase 309 

espermatogonial ou proliferativa, caracterizada por sucessivas divisões mitóticas das 310 

espermatogônias; (2) fase espermatocitária ou meiótica, em que o material genético 311 

dos espermatócitos é duplicado, recombinado e segregado, formando células haplóides 312 

denominadas de espermátides; e (3) fase espermiogênica ou de diferenciação, na qual 313 

as espermátides passam por modificações estruturais e funcionais altamente complexas 314 

para originar os espermatozóides, que estarão aptos para a fecundação. Embora 315 

conservada, a espermatogênese apresenta certas peculiaridades dependendo do grupo 316 

estudado. Em peixes teleósteos, por exemplo, a espermatogênese ocorre no interior 317 

de estruturas denominadas espermatocistos, ou cistos, que se formam quando uma 318 

única espermatogônia primária ou do tipo A é completamente envolvida pelos 319 

prolongamentos das células de Sertoli (Figura 6) (Grier, 1993; Pudney, 1993; 1995; 320 

Schulz et al., 2010). 321 



19 
 

 322 

Figura 6. Comparação entre a espermatogênese em estádios de amniotas (répteis, aves, mamíferos) (A) e 323 
cística dos anamniotas (peixes, anfíbios) (B). A Figura ilustra as diferenças entre a relação célula de 324 
Sertoli/célula germinativa na espermatogênese não-cística e cística. Em A, a célula de Sertoli suporta ao 325 
mesmo tempodiferentes clones de células germinativas em diferentes fases de desenvolvimento. Enquanto 326 
que em B, a célula de Sertoli suporta apenas um clone em uma mesma fase de desenvolvimento por vez. 327 
Legendas: células de Sertoli (SE); lâmina basal (BL); células peritubulares mióides (MY), células de Leydig 328 
(LE), espematogônia (SG); espermatócito (SC); espermátide arredondada (RST); espermátide alongada 329 
(EST); espermatogônia do tipo A indiferenciada* (Aund*) (célula tronco?); espermatogônia do tipo A 330 
indiferenciada (Aund); espermatogônia do tipo A diferenciada (Adiff); espermatogônia do tipo B (B early-331 
late); espermatócitos primários em leptóteno/zigóteno (L/Z), paquíteno (P), diplóteno/metáfase I (D/MI); 332 
espermatócitos secundários/metáfase II (S/MII); espermátides iniciais (E1); intermediárias (E2); finais (E3); 333 
espermatozóides (SZ); e vasos sanguíneos (BV). Retirado de Nóbrega, 2014. 334 

 335 

As células germinativas derivadas desta espermatogônia dividem-se 336 

sincronicamente e constituem um clone de células germinativas que é envolvido por 337 

um número variado de células de Sertoli, dependendo do tipo de cisto (Vilela et al., 338 

2003).  339 

Diferentemente dos mamíferos, onde as células de Sertoli estão em contato 340 

com várias gerações de células germinativas (Russell et al., 1990), na espermatogênese 341 



20 
 

cística as células de Sertoli normalmente estão em contato com apenas um tipo 342 

específico de célula germinativa durante a evolução do processo espermatogênico 343 

(Figura 6) (Nóbrega et al., 2009; Schulz et al., 2010). Estes cistos encontram-se apoiados 344 

na túnica própria dos túbulos seminíferos, que é formada por camada acelular 345 

denominada de membrana basal e pelas células peritubulares mióides (Figura 6) 346 

(Koulish et al., 2002).  347 

A continuidade da espermatogênese é fundamental para manter a fertilidade 348 

masculina, uma vez que, diariamente, milhões de espermatozóides são produzidos por 349 

grama de testículo. Em humanos, por exemplo, cerca de 13x107 espermatozóides são 350 

produzidos por dia. Ou seja, de forma mais ilustrativa, pouco mais de mil 351 

espermatozóides são formados a cada batimento cardíaco (Russell et al., 1990; Sharpe, 352 

1994; França & Chiarini-Garcia, 2005). Por essa razão, quando comparada com outros 353 

sistemas de autorrenovação do corpo, tais como pele e intestino, a espermatogênese é 354 

considerada um dos processos de reposição celular mais eficientes (Russell et al., 1990). 355 

A elevada e constante demanda de espermatozóides durante a vida reprodutiva 356 

masculina se em função das espermatogônias tronco, que são consideradas a base do 357 

processo espermatogênico. À semelhança das demais células tronco do corpo, a 358 

espermatogônia tronco tem capacidade de se autorrenovar e ao mesmo tempo originar 359 

células-filhas diferenciadas que irão formar os espermatozoides. Assim, as 360 

espermatogônias tronco são as únicas células tronco do corpo que contribuem com 361 

material gênico para a formação de novos organismos. (de Rooij & Russell, 2000; de 362 

Rooij, 2001 e 2006a,b, Ehmcke e Schlatt, 2006; Yan, 2006; Hofmann, 2008).  363 

Uma característica única do processo espermatogênico é a divisão incompleta 364 

das células germinativas, o que resulta em células conectadas por pontes 365 

citoplasmáticas (Hunckins 1971; Russell et al., 1990; de Rooij & Russell, 2000). O 366 

modelo Ais (espermatogônias isoladas), desenvolvido em 1971 por Hunckins, propõe 367 

que as Ais atuam como células tronco, e as espermatogônias conectadas por pontes 368 

citoplasmáticas são terminalmente já diferenciadas e comprometidas com a formação 369 

de espermatozóides (Figura 7). 370 

 371 



21 
 

 372 
Figura 7. Ilustração esquemática do “modelo Ais”. As espermatogônias A isoladas (Ais) atuam como células 373 
tronco, e as gerações subseqüentes conectadas  por  pontes  citoplasmáticas;  espermatogônias  pareadas 374 
(Apr), alinhadas (Aal)  e  A1,  são  espermatogônias  terminalmente  já  diferenciadas.  Neste modelo, o 375 
potencial tronco  é único e exclusivo das espermatogônias isoladas, e a diferenciação é sempre unidirecional 376 
e irreversível (Huckins, 1971). 377 

 378 

Genes como Oct4, Gfrα1, Cd24, Nanos2,3, Egr3, Plzf, Sox-3, Taf4b, Bcl6b, Ret, 379 

Sohlh2, Cdh1, Gpr125, Utf1 e Lin28 são expressos exclusivamente nas espermatogônias 380 

indiferenciadas (Ais, Apr, Aal), e têm sido apontados na última década como potenciais 381 

marcadores espermatogônias tronco (Phillips et al., 2010; de Rooij & Griswold, 2012). 382 

 383 
Figura 8. Perfil gênico 384 
expresso nos diferentes tipos 385 
de espermatogônias de 386 
roedores; espermatogônia do 387 
tipo isolada (Ais), pareada 388 
(Apr), alinhada (Aal4-16), e 389 
diferenciadas do tipo 1 (A1). 390 
Presente (+), ausente (-), 391 
transitoriamente expresso 392 
(+/-). (Modificado de 393 
Phillips et al., 2010).  394 

 395 

 396 

 397 

Em vertebrados, as gonadotropinas hipófisárias hormônio Folículo 398 

Estimulante (Fsh) e hormônio Luteinizante (Lh) controlam o desenvolvimento 399 

gonadal através de sinais locais, como os esteroides sexuais, fatores de crescimento 400 

(Pierce and Parson, 1981; McLachlan et al., 1996), small RNAs (sRNA) (van den 401 

Driesche et al., 2014; Panneerdoss et al., 2012) e mudanças epigenéticas (Skaar et al., 402 

2011). As gonadotropinas são glicoproteínas heterodiméricas com estrutura complexa 403 

consistindo em duas subunidades; α estrutura comum e β, relacionada a especificidade 404 



22 
 

hormonal. Ambas estruturas se ligam para formar uma estrutura dimérica 405 

biologicamente ativa (Pierce, 1988). Em teleósteos sazonais, o Fsh está envolvido no 406 

desenvolvimento e crescimento da gônada imatura enquanto que o Lh participa da 407 

regulação da espermatogênese tardia, incluindo a maturação final e liberação dos 408 

gametas (oocitação e espermiação) (Ogiwara et al., 2013; Chauvigne et al., 2014). Porém, 409 

suas funções ainda diferem das encontradas nos mamíferos (Zhang et al., 2015), 410 

evidenciando assim, a grande robustez evolutiva encontrada no sistema 411 

endócrino/reprodutivo de peixes. Um exemplo para tal situação é a capacidado de 412 

próprio Fsh estimular células de Leydig a liberarem andrógenos de forma mais potente 413 

que o Lh (García-Lopez et al., 2010). Além do mais, sabe-se que o Fsh é ainda capaz 414 

de induzir a produção do fator de crescimento semelhante a insulina 3 (Igf3) pelas 415 

células de Sertoli, estimulando consequentemente a diferenciação das espermatogônias 416 

tronco e também a entrada na meiose (Nóbrega et al., 2015) (Figura 9). Além do mais, 417 

ainda em teleósteos, o Fsh também é responsável por inibir a liberação do hormônio 418 

anti-Müleriano (Amh), hormônio este responsável por inibir a diferenciação das 419 

espermatogôniastronco e também o processo de esteroidogênese (Skaar et al., 2011) 420 

(Figura 9). Vale ainda ressaltar que o Fsh estimula a produção de fatores de 421 

crescimento nas células de Sertoli e também regula uma série de genes em testículos 422 

de zebrafish, como demonstrado recentemente por estudos de RNA seq (Crespo et al., 423 

2016). Em conjunto, esses resultados mostram que o Fsh é tido como um fator crucial 424 

na regulação do nicho espermatogonial em peixes teleósteos.    425 

Outro fator importante para a regulação de espermatogônias em mamíferos é 426 

o GDNF (Glial cell line-derived neurotrophic fator) (Meng et al., 2000; Yomogida et 427 

al., 2003; Naughton et al., 2006). Sob influência do FSH, o GDNF é secretado pelas 428 

células de Sertoli e atua por meio de seu receptor GDNF family receptor alpha-1 (GFRα1) 429 

localizado na superfície das espermatogônias tronco (De Rooij, 2006b; Hess et al., 430 

2006; Cooke et al., 2006). Estudos demonstram que camundongos deficientes para 431 

Gdnf (heterozigotos) (Meng et al., 2000) e camundongos knockouts para Gdnf/Gfrα1/c-432 

Ret (Naughton et al., 2006) perdem progressivamente suas espermatogônias tronco 433 

devido à incapacidade das mesmas de se autorrenovarem e manterem seu estado 434 

indiferenciado. Sabe-se que em peixes que seu homólogo gfra1a, é expresso em 435 

espermatogônias indiferenciadas de tilápia do Nilo (Lacerda et al., 2013), dogfish 436 

(Bosseboeuf et al., 2013) e truta Arco-íris (Nakajima et al., 2014). No entanto, nessa 437 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096495901005358?via%3Dihub#BIB46


23 
 

classe de vertebrados pouco se sabe a respeito da função do Gdnf na regulação de 438 

células germinativas e somáticas. 439 

 440 

 441 

Figura 9. Representação esquemática 442 
da atividade biológica do Fsh na 443 
espermatogênese em zebrafish 444 
(Nóbrega et al., 2015). O Fsh estimula 445 
a produção de andrógenos nas células 446 
de Leydig, que por sua vez promove a 447 
diferenciação das células germinativas. 448 
Ao mesmo tempo, o Fsh reduz (linha 449 
pontilhada) a expressão do Amh nas 450 
células de Sertoli, caso contrário, 451 
poderia inibir a produção de 452 
andrógenos e a diferenciação das 453 
espermatogônias. O Fsh também 454 
estimula a expressão de Igf3 nas células 455 
de Sertoli, que promove a 456 
diferenciação das células germinativas; 457 
Andrógenos também (fracamente) 458 
estimulam a produção de Igf3. Imagem 459 
retirada de Nóbrega et al, 2015. 460 

 461 

 462 

 463 

 464 

Ainda recentemente, Zhang e colaboradores (2015) demonstraram que na 465 

ausência de Fsh e/ou Lh, machos de zebrafish são completamente férteis, apesar do 466 

atraso no crescimento do testículo em ambos heterozigotos e homozigotos para esta 467 

mutação. Este resultado sugere uma visão diferente da regulação da espermatogênese 468 

em teleósteos, sugerindo que tal processo é complementar a outras vias de indução de 469 

sinalização. Semelhantemente, em mamíferos, o FSH tem capacidade de iniciar a 470 

espermatogênese, mas não em mantê-la nos indivíduos adultos (Kumar et al,. 1997; 471 

Plant &Marchall., 2001; Tapanainen et al., 1997). Sendo assim, análises mais detalhadas 472 

das vias de regulação do nicho espermatogonial são cruciais e necessárias para um 473 

entendimento mais robusto da biologia das espermatogônias tronco.     474 

 475 

 476 

 477 



24 
 

2. Justificativa 478 

As células germinativas são as únicas células de organismos metazoários capazes de 479 

transmitir o material genético de uma determinada população de indivíduos para as 480 

conseguintes gerações. Logo, tal população de células garante a sobrevivência de 481 

espécies ao longo do tempo evolutivo. Tendo isso em vista, este trabalho fornece 482 

informações a respeito dos efeitos de fatores de regulação endócrino e parácrino na 483 

atividade proliferativa e gênica de espermatogônias tronco. Tais fatores, que direta ou 484 

indiretamente são responsáveis pelo controle de diferenciação e autorrenovação dessas 485 

células, vão por fim, contribuir para a homeostase do processo espermatogênico. 486 

 487 

3. Objetivos 488 

 O objetivo geral desse trabalho foi caracterizar populações de espermatogônias 489 

tronco de zebrafish (Danio rerio) a partir de marcadores moleculares e analisar os efeitos 490 

do Fsh e do GDNF nessas células e também em células de Sertoli, no que diz respeito 491 

a proliferação conjunta entre ambas populações e análise de expressão gênica. 492 

Objetivos específicos: 493 

1 – Identificar marcadores de espermatogônias tronco presentes no interior e na 494 

membrana celular dessas células e; 495 

2 – Analisar os efeitos dos hormônios Fsh e GDNF nessas populações de células. 496 

 497 

 498 

 499 

 500 

 501 

 502 

 503 

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 505 



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30 
 

 797 

 798 

 799 

 800 

 801 

 802 

 803 

 804 

 805 

Capítulo 1  806 

 807 

 808 

 809 

 810 

Cross-talk between Sertoli and Spermatogonial Stem cells 811 

via Fsh (Follicle stimulating hormone) and Gdnf (Glial cell-812 

derived  neurotrophic factor) in zebrafish (Danio rerio)  testis  813 

 814 

 815 

Artigo em preparação 816 

 817 

 818 

 819 

 820 

 821 

 822 

 823 

 824 



31 
 

Introduction 825 

Spermatogenesis is a biological process in which a single spermatogonia stem cell 826 

(SSC) is able to produce a large number of haploid cells (Hess & Franca, 2008; Rüdiger 827 

et al., 2010). To maintain this process throughout life, SSC self-renew to produce more 828 

stem cells, and/or produce differentiated daughter cells ultimately committed with the 829 

sperm formation (De Rooij and Russell, 2000; De Rooij, 2001 and 2006a, b, Ehmcke et 830 

al., 2006; Yan, 2006). The balance between these two processes (self-renewal and 831 

differentiation) is finely and precisely coordinated in the so-called spermatogonial stem 832 

cell niche (De Rooij, 2001 and 2006a, b; Yan, 2006). The niche is composed by the SSC 833 

itself and the surrounding Sertoli cells and the nearby elements from the interstitial 834 

compartment, such as Leydig cells, peritubular myoid cells, blood vessels and the 835 

extracellular matrix (Spradling et al., 2001; Fuchs et al., 2004). There is a remarkable 836 

difference between ammniotes (reptiles, birds and mammals) and anammiotes (fish and 837 

amphibians) with regards the spermatogonial niche (Schulz et al., 2005). In the 838 

ammniotes, SSC is located at the basal compartment of the seminiferous epithelium, lying 839 

directly on the basal lamina (extracelullar matriz) of the epithelium (Schulz et al., 2010) 840 

which is nearby to the interstitial cells. While in the anammiote group, SSC are separated 841 

from the basal lamina and the interstitium throughout Sertoli cells, which completley 842 

surrounded a single SSC, forming the spermatocyst or cyst (Callard, 1996). Therefore, 843 

anammiote Sertoli cells are considered important elements which mediate and integrate 844 

signals in the niche (Yan, 2006; Hess et al., 2006; Cooke et al., 2006; Yoshida, 2015). 845 

Pituitary gonadotropin Fsh (Follicle-stimulating hormone) seems to be an 846 

important endocrine signal that regulates spermatogonial niche in fish (Pierce and Parson, 847 

1981; McLachlan et al.,1996; Huhtaniemi and Themmen, 2005; Ohta et al., 2007; García-848 

López et al., 2009 and 2010; De Rooij and Griswold, 2012). In zebrafish, Fsh stimulates 849 



32 
 

spermatogonial proliferation and differentiation in an androgen independent manner 850 

(Nóbrega et al., 2015; de Castro Assis et al., 2018). Studies have shown that in the 851 

zebrafish testis, Sertoli cells transduce signals from Fsh into the production of growth 852 

factors that are required by spermatogonia proliferation and differentiation (Meng et al., 853 

2000; Yomogida et al.,2003; Nagano et al., 2003; Loveland and Robertson, 2005; De 854 

Rooij and Griswold, 2012; Savitt et al., 2012). In general Fsh modulates the balance 855 

between stimulatory and inhibitory growth factors; increasing Igf3 (Insulin-like growth 856 

factor 3) that promotes spermatogonial proliferation and differentiation (Nóbrega et al., 857 

2015; de Castro Assis et al., 2018), while decrease Amh (Anti-Müllerian hormone) which 858 

is involved on blocking spermatogonial differentiation and mantaining cells at their 859 

quiescence state (Skaar et al., 2011). Recent studies showed that Fsh-stimulated 860 

spermatogonial proliferation modulated several signaling system (i.e. Tgf-b, Hedgehog, 861 

Wnt, Notch and β-catenin pathways) (Crespo et al., 2016; Safian et al., 2018). In 862 

mammals, FSH also regulates Sertoli cell growth factor production involved on 863 

spermatogonia development [e.g. Activin, Amh, Inhibin, BMPs, CSF (colony-stimulating 864 

factor)] (Oatley et al., 2009; Skaar et al., 2011; Barakat et al., 2008; Zhao et al., 2001; 865 

Neumann et al., 2011; Loveland and Robertson, 2005). Among these factors, FSH 866 

induced the Sertoli cell release of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) 867 

(Tadokoro et al., 2002) which has a remarkable role on SSC self-renewal and 868 

maintenance (Meng et al., 2000; Gautier et al., 2014; de Castro Assis et al., 2018). GDNF 869 

is a member of the transforming growth factor-β superfamily and was originally identified 870 

as a survival factor for midbrain dopaminergic neurons (Lin et al, 1993) and an important 871 

factor for SSC in rodents (Meng at al., 2000), dogfish (Gautier et al., 2014) and zebrafish 872 

(de Castro Assis et al., 2018) so far. Knockout studies in mice with either GDNF or its 873 

receptor GFRα1/c-RET showed a progressively loss of SSCs due their inability to self-874 



33 
 

renew and maintenance (Naughton et al., 2006). Interestingly, gdnf is expressed in trout 875 

germ cells (from spermatogonia to spermatocyte) (Nakajima et al., 2014) but not in 876 

Sertoli cells, as found in mouse (Meng at al, 2000).  877 

In this study, we evaluated the effects of Fsh into SSC gene expression and how 878 

Fsh affected Sertoli and spermatogonial proliferation. To first address this question, we 879 

characterized SSC transcripts/protein in the zebrafish testes and also Fsh receptor 880 

localization. Further, we examined whether Gdnf is involved in SSC niche by evaluating 881 

the expression sites of Gdnf and its receptor in the testes and the biological effects of this 882 

same ligant on Sertoli and spermatogonial proliferation. We found a bilateral cooperation 883 

between Sertoli and spermatogonial cells to regulate the spermatogonial niche in 884 

zebrafish.     885 

 886 

Results 887 

Identification of SSC transcripts and protein in the zebrafish testes 888 

 We have analyzed the presence of selected mRNA (pou5f3, nanog and nanos3) 889 

considered to be related with SSC pluripotency in mammals (Table 1). In order to identify 890 

their pluripotency in zebrafish, expression analysis in embryos at different stages of 891 

development, early (blastula - undifferentiated state) and late stage (long-pec - more 892 

differentiated stage), were evaluated. The mRNA levels of pou5f3, nanog and nanos3 893 

decreased in the long-pec stage (Fig. 1), suggesting that these genes might be involved in 894 

the pluripotency state of the embryo. Further, we have identified their expression (mRNA 895 

and protein) sites in the adult testes by qPCR, in situ hybridization and 896 

immunofluorescence. The transcripts of pou5f3, nanog and nanos3 are expressed in both 897 

adult gonads (Fig. 1), and their sites of expression were identified in early spermatogonia 898 



34 
 

from type A undifferentiated spermatogonia (Aund) to type A differentiated spermatogonia 899 

(Adiff) (Supplemental Fig. 1). The immunofluorescence has shown that Pou5f3 protein 900 

was localized preferentially in type Aund (Fig. 2). Less or no signal could be found in 901 

differentiated germ cells (type B, spermatocytes and spermatids) (Fig. 2). The 902 

immunodetection for Nanos3 and Nanog have not been optimized yet, although the 903 

protein has been detected in the testes (Data not shown). 904 

 905 

Effects of rzf Fsh on SSC gene expression and Sertoli and germ cell proliferation  906 

Testicular explants treated with 100ng/mL rzf Fsh showed differential expression 907 

for the SSC transcripts (Fig. 3). Interestingly, pou5f3 mRNA levels decreased while 908 

nanog and nanos3 were up-regulated with the Fsh treatment (Fig. 3A). Evaluating the 909 

Gdnf (gdnfa; gdnfb was not evaluated because it is not expressed in the testis) and its 910 

receptor (gfrα1a and gfrα1b), we found that rzf Fsh did not stimulate gdnfa and gfrα1b 911 

expression, but decreased gfrα1a mRNA levels (Fig. 3A). No changes were detected for 912 

dmrt, and as expected, igf3 was highly expressed in the testes stimulated with rzf Fsh 913 

(Fig. 3A). When examining the Sertoli and spermatogonial proliferation, rzf Fsh 914 

stimulated proliferation of type Aund and Sertoli cells belonging to the same cyst (Fig. 3 915 

B). Interestingly, immunofluorescence showed a strong and concentrated signal for Fsh 916 

receptor in Sertoli cells associated with type Aund and Adiff (Fig 3C). Fshr could also be 917 

detected in Sertoli cells associated with other germ cell types and in Leydig cells, as 918 

expected (Fig. 3C). 919 

 920 

 921 

 922 



35 
 

Localization of Gdnfa/Gfrα1a in the zebrafish testes  923 

 During embryonic development, gdnfa and gfrα1a transcript levels increased 924 

significantly from blastula to long-pec stage (Fig. 4A). gdnfa and gfrα1a are also 925 

expressed in both adult gonads (Fig. 4A). To determine the gdnfa expressing cells in the 926 

zebrafish testes, two approaches were employed; in situ hybridization (Fig. 4B) and qPCR 927 

expression analysis in the somatic and germ cell enriched fractions obtained from a 928 

differential plating method (Fig. 4C). While the in situ hybridization showed signal that 929 

could be either in Sertoli or germ cell (Fig. 4B), qPCR analysis showed higher gdnfa 930 

transcript levels in the germ cell enriched fraction (Fig. 4C). The Gdnf receptor, Gfrα1a 931 

was found in the cell surface of type Aund and Adiff , and also in the membrane of Sertoli 932 

cells (Fig. 4D). 933 

 934 

Biological effects of rh GDNF on zebrafish spermatogenesis  935 

 Testicular explants treated with 100 ng/ml rh GDNF for 7 days of culture showed 936 

an increased proportion of types Aund and Adiff in the zebrafish testes (Fig. 5A). A 937 

reduction of type B spermatogonia is seen in the GDNF treatment (Fig. 5A). In agreement 938 

with the morphometrical analysis, the spermatogonial mitotic index showed an increased 939 

of BrdU incorporation by types Aund and Adiff in the zebrafish testes treated with rh GDNF 940 

(Fig. 5B). Interestingly, the mitotic index for Sertoli cells was also elevated (Fig. 5C), 941 

showing that the dividing Sertoli cells were found in association with cysts of Aund and 942 

Adiff which were also BrdU-positive (Fig. 5C). Expression analysis, on the other hand, 943 

showed no changes on the selected transcripts, including the SSC mRNAs (Fig. 5D).     944 

 945 

 946 



36 
 

Discussion 947 

Sertoli cell acts as a paracrine relay station for different endocrine or paracrine 948 

signals (e.g., gonadotropins, sexual steroids, growth factors, among others), transducing 949 

these different signals into growth factors that are required for germ cell development 950 

(Tadokoro et al., 2002; Miura et al., 2002; Skaar et al.,2011; Meng et al., 2000; Yomogida 951 

et al., 2003; Savitt et al., 2012; Loveland and Robertson, 2005; Nagano et al., 2003; 952 

Yoshida et al., 2015). In the cystic spermatogenesis, this function is more evident, once 953 

all germ cells, from a single SSC until late spermatids, are completely surrounded by 954 

cytoplasmic extensions of Sertoli cells (Schulz et al., 2010). Studies in zebrafish have 955 

shown that Fsh is a major regulator of spermatogonial proliferation and differentiation 956 

through production of stimulatory growth factors in Sertoli cells, such as Igf3 (Nóbrega 957 

et al., 2015). Fsh also down-regulated inhibitory factors in Sertoli cells creating a 958 

permissive condition for spermatogonial proliferation in the zebrafish testes (Miura et al., 959 

2002; Skaar et al., 2011). In this work, we have studied how Fsh regulates SSC genes and 960 

affects Sertoli cell proliferation and spermatogonial proliferation. To address this 961 

question, we first characterized some selected SSC transcripts in zebrafish testes. For this 962 

selection, we found ortologues of stem cell pluripotent transcripts (pou5f3, nanog and 963 

nanos3) of mammals in zebrafish. These transcripts showed higher expression at early 964 

stages of development (blastula), decreasing their levels in a more differentiated stage 965 

(long-pec stage) which confirms that they are involved in pluripotency.  966 

Pou5f3 is expressed in zebrafish testes, preferentially located in type Aund 967 

spermatogonia. Similar results were found in medaka (Sanchez-Sanchez et al., 2010b) in 968 

which pou5f1 was expressed in type Aund. Rhandia quelen also showed pou5f3 expression 969 

in types Aund and Adiff spermatogonia (Lacerda et al., 2018). Therefore, pou5f3 can be 970 

considered a SSC marker in D. rerio. 971 



37 
 

In zebrafish, nanos3 was expressed in early spermatogonia, although we could not 972 

show its localization by immunofluorescence. In rainbow, nanos2 (an isoform of nanos3) 973 

was found restricted to subpopulations of type A spermatogonia (Bellaiche et al., 2014). 974 

Moreover, these authors showed that both nanos2 and nanos3 are highly expressed in 975 

gonads composed by type A spermatogonia, while lower levels of expression were found 976 

when these cells enter into differentiation (Bellaiche et al., 2014). Although it is known 977 

that nanos3 transcripts are present in rainbow trout and zebrafish gonads, the specific role 978 

of Nanos2 and Nanos3 are still unknown.  979 

Nanog is considered to be a crucial factor for the maintenance of embryonic 980 

pluripotency (Kuijk et al., 2010) and germ cell development (Theunissen and Jaenisch, 981 

2014). In zebrafish, it has been shown that Nanog play an important role during early 982 

embryonic development (Camp et al., 2009). Studies in zebrafish (Wang et al., 2016) and 983 

medaka (Sánchez-Sánchez et al., 2010) have demonstrated that Nanog deficient embryos 984 

had problems in the gastrula development and are lethal. Little is known about the role of 985 

Nanog in fish gonads. In the present study, we detected nanog expression in adult testes 986 

and showed its transcripts restricted to early spermatogonia. We could not demonstrated 987 

yet the localization of the expressing protein, although Western Blot analysis confirmed 988 

the presence of Nanog in the zebrafish testes. Although not yet conclusive for Nanos3 989 

and Nanog, we believe that these genes are expressed in SSCs in zebrafish testes, based 990 

on data from literature and for our expression analysis during embryonic development. 991 

Further studies showing the protein localization in the testes will answer this question. 992 

Another interesting issue to be addressed is whether these proteins are co-localized or not 993 

in the same cell. 994 

Once characterized the SSC transcripts in the zebrafish testes, we evaluated their 995 

expression under Fsh stimulation. Interestingly, we found two different patterns of 996 



38 
 

expression among them; a decreased expression for pou5f3, while nanog and nanos3 997 

transcripts were up-regulated by Fsh. Considering that previous studies have show that 998 

Fsh stimulates both proliferation and differentiation, increasing type Aund and Adiff in 999 

zebrafish testes (Nóbrega et al., 2015), our results indicate that higher expression of 1000 

nanog and nanos3 could indicate the formation of new cysts of Aund. However, this 1001 

observation did not matched with pou5f3 expression. Previous studies in zebrafish have 1002 

shown two populations of type Aund; one with long S-phase, named as slow-dividing cells 1003 

(quiescent stem cells), and another population with short S-phase, named as active-1004 

dividing cells (active stem cells) (Nóbrega et al., 2010). We believe that pou5f3would be 1005 

related to the slow dividing cells (quiescent stem cells), that under Fsh stimulation is 1006 

decreasing its expression to originate the active stem cells. Further studies will make an 1007 

effort to co-localize markers of S-phase and these proteins (Pou5f3, Nanog and Nanos3) 1008 

in the zebrafish testes.  1009 

In this study, immunofluorescence for Fsh receptor showed a strong signal in 1010 

Sertoli cells surrounding type Aund, where most of the SSC transcripts were found. When 1011 

evaluating the proliferation of Sertoli and spermatogonia, we found that Fsh stimulates 1012 

both Sertoli and type Aund proliferation from the same cyst. In agreement with nanog and 1013 

nanos3 expression, this data indicates the formation of new cysts. In zebrafish, as in other 1014 

vertebrates, Fsh modulates the production of growth factors in the Sertoli cells (Barakat 1015 

et al.,2008; Mullaney and Skinner, 1992; Nicholls et al., 2012; Pitetti et al., 2013; 1016 

Tadokoro et al., 2002). Among the Fsh-induced stimulatory growth factors produced by 1017 

Sertoli cell, Igf3 role has been well described in zebrafish testes in the last years (Nóbrega 1018 

et al., 2015; Safian et al., 2018). Igf3 promotes spermatogonial proliferation and 1019 

differentiation and antagonizes inhibitory factors, such as Amh (Nóbrega et al., 2015). 1020 

Therefore, we can conclude that Fsh acts in Sertoli cells surrounding type Aund, increasing 1021 



39 
 

and releasing stimulatory factors (e.g. Igf3), which promote type Aund proliferation. At 1022 

the same manner, Fsh also stimulates Sertoli cell proliferation, which together with type 1023 

Aund, lead to the formation of new cysts. Based on this findings, we suggest that Fsh 1024 

orchestrates and integrates the functions of both somatic and germ cell in the SSC niche.  1025 

In rodents, FSH stimulates the expression and release of GDNF (Meng et al., 1026 

2000) which is crucial factor for SSC self-renewal and maintenance in the testis. GDNF 1027 

is produced by Sertoli cells and its receptor, Gfrα1/c-Ret, are found in SSCs (Naughton 1028 

et al., 2006). In teleosts, there are two isoforms of Gdnf, Gdnfa and Gdnfb (Bellaiche et 1029 

al., 2014). Gdnfb is expressed in the brain, while Gdnfa in the gonads. The receptors, 1030 

Gfrα1a and Gfrα1b are both expressed in the adult testes of zebrafish. In this study, we 1031 

showed that Fsh did not modulate the expression of Gdnfa, different from mammals 1032 

(Simon et al., 2007; Takodoro et al., 2002; Ding et al., 2011). Conversely, in rainbow 1033 

trout, Fsh had a negative effect on gdnfb, which is the isoform present in the gonads 1034 

(Bellaiche et al., 2014). In our study, we showed using a differential plate method that 1035 

gdnfa is expressed in germ cell enriched fraction. This result is in agreement with 1036 

Nakajima and collaborators (2014) who demonstrated that gdnf is expressed in type Aund 1037 

of rainbow trout. The presence of Gdnf in germ cells and not in Sertoli cells explain the 1038 

non-modulation of gdnfa expression by Fsh in zebrafish testes. With regards to its 1039 

receptor, Gfra1a, immunofluorescence has demonstrated that the receptor is present in 1040 

the cell membrane of Sertoli cells and also in early spermatogonia, such as type Aund. 1041 

Such transcripts were also found in type Aund of different fish species, as in Nile-tilapia 1042 

(Lacerda et al., 2013), dogfish (Bosseboeuf et al., 2013) and rainbow trout (Nakajima et 1043 

al., 2014). Therefore, we demonstrated here that Gdnf is a germ cell paracrine factor and 1044 

the Gdnf/Gfrα1a signaling occurs in an autocrine fashion in germ cells, while in Sertoli 1045 

cells, Gdnf acts through a paracrine manner. With regards to the biological effects of rh 1046 

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016648014002512#b0215
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016648014002512#b0045
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016648014002512#b0340
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016648014002512#b0340


40 
 

GDNF (high homology with zebrafish Gdnfa), we showed an increase of cysts of type 1047 

Aund and Adiff, but no changes in the SSC gene expression. The higher frequency of Aund 1048 

and Adiff is in line with the higher mitotic index of these cells when zebrafish testes were 1049 

treated with GDNF. Similar results were seen in dogfish, where rh GDNF promoted 1050 

expansion of SSC colonies in vitro (Gautier et al., 2014). Interestingly, we also found that 1051 

GDNF increased the number of BrdU-positive Sertoli cells which were found in 1052 

association with cysts of Aund and Adiff, also positive for BrdU. We conclude that GDNF 1053 

promoted spermatogonial proliferation, increasing cysts of types Aund and Adiff but did 1054 

not change SSC gene expression. This result suggests that GDNF might be involved in 1055 

SSC maintenance. On the other hand, we showed for the first time that a germ cell growth 1056 

factor affected gfrα1a expressing Sertoli cells. As germ cell divides, the secreted GDNF 1057 

might stimulate Sertoli cell proliferation as well aiming to form new cysts or 1058 

accommodate the newly-formed germ cells in the cyst.  1059 

As conclusion, we showed that endocrine (Fsh) and paracrine signals integrate 1060 

and coordinate both Sertoli and germ cell functions in the SSC niche (Figure 6). Sertoli 1061 

cells transduce the pituitary gonadotropin signal, Fsh, into growth factor production 1062 

which affect SSC proliferation. As consequence of SSC proliferation, Fsh also stimulates 1063 

Sertoli cell mitotic division in order to create new cysts (Figure 6). On the other side, 1064 

GDNF, a germ cell paracrine signal, acts in the maintenance of SSC, but also stimulates 1065 

Sertoli cell proliferation in order to create cysts or accommodate the newly-formed germ 1066 

cells in the cyst (Figure 6). The cross-talk between SSCs and the surrounding Sertoli cells 1067 

through endocrine and paracrine factors assure the proper development of both cells and 1068 

spermatogenesis per se along the entire reproductive life. 1069 

 1070 

 1071 



41 
 

Material and Methods 1072 

Animals, sampling and ethics statement  1073 

The animals were kept in facility system under photothermal and water controlled 1074 

conditions. For experimentation, they were euthanized by overdose with benzocaine 1075 

hydrochloride (≥250mg) previously dissolved in ethanol and then mixed in appropriated 1076 

volume of water. The animals were immersed in the benzocaine solution until death. 1077 

A number of about 100 animals (zebrafish) were used in this project. This project 1078 

(protocol 666-CEUA) is in accordance with the current legislation (Law 11.794/2008 and 1079 

Decree 6.899/2009) and with the normative resolutions applicable by the Ethical 1080 

Principles in Animal Experimentation elaborated by the Brazilian Society of Science in 1081 

Laboratory Animals (SBCAL/COBEA) and approved by the Committee of Ethics in 1082 

animal use (CEUA) of the Institute of Biosciences of Botucatu on October 14, 2014. 1083 

 1084 

Pluripotency genes expression: RT-qPCR and RT-PCR  1085 

 To evaluate gene expression, RNA from samples was obtained using PureLink® 1086 

RNA Mini Kit Kit (Ambion®) following the manufacturer’s protocol. DNase treatment 1087 

using DNase I, RNase-free kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was performed and 1088 

subsequently, cDNA was synthetized using SuperScript® II Reverse Transcriptase kit 1089 

(Invitrogen ™, Carlsbad, CA, USA) using random hexamers according to standard 1090 

protocols (Nobrega., 2010). RT-PCR and qPCR reactions were conducted using specific 1091 

primers for zebrafish pou5f3, nanos3, nanog, and gdnf (Table 1 and 2). Zebrafish β-actin 1092 

(NCBI: AF057040.1) (Table 1) was used as endogenous reference gene for RT-PCR 1093 

reactions, while elongation factor 1α (ef1α) and β-actin were used as housekeeping genes 1094 

for RT-qPCR. The RT-PCR products were separated on a 1-1,5% agarose gel and 1095 

visualized over a UV transilluminator. For RT-qPCR, the quantification cycle (cq) values 1096 



42 
 

of those genes were determined in a StepOne system (Life Technologies) using SYBR 1097 

Green (Invitrogen) and specific primers (Table 1). All RT-qPCR reactions (10-20 µl) used 1098 

900 nM for each primer and 300 ng of total cDNA. Each reaction was performed in 1099 

duplicate. Relative gene expression levels were calculated according to the ΔΔCt method 1100 

as described previously (Vischer, Teves, Ackermans et al., 2003). Expression levels for 1101 

each gene were normalized with two endogenous reference genes (see above) and 1102 

subsequently calibrated to the Cts of the proper group of genes (ΔΔCt) for each 1103 

experiment. 1104 

 1105 

Protein localization for the pluripotency genes 1106 

For immunohistochemistry, zebrafish anti bodies were synthetized using specific 1107 

antigens. Testis (n = 5 animals) were fixed 2 hours in 4% paraformaldehyde and 1108 

incorporated in paraplast (Paraplast®, Sigma Aldrich). Cuttings of 5μm thickness were 1109 

mounted on silanized slides. After depparafinization and hydration, the sections were 1110 

submitted to antigenic recovery in a humid chamber sodium citrate (10nM; pH 6.0) in 1111 

microwave for 10 minutes. For blocking, BSA 1% was used for 1 hour.  Subsequently, 1112 

the slides were incubated overnight at 4°C with the anti-Pou5f3 (dilution 1: 200). After 1113 

washing, the slides were incubated for 60 minutes at 37ºC with the secondary antibody 1114 

corresponding to their primer (all diluted 1:200). Subsequently, the sections were 1115 

counterstained and mounted with ProLong (DAPI). Germ cells were classified based on 1116 

morphological criteria (Leal et al., 2009b). The secondary antibody only control was done 1117 

without the primary antibody. Secondary antibody was let 1 hour at 37ºC (figure S2). 1118 

Testis tissue cultures and differential plating method 1119 

The effect of recombinant zebrafish Fsh (rzfFsh) (100ng/ml) on pluripotency genes 1120 

expression was analyzed using a previously described organ culture system for Japanese 1121 



43 
 

eel (Miura et al., 1991) and zebrafish testes (Leal et al., 2009). The morphology of the 1122 

testis and the populations identification was done by toluidine blue immersed for 10 1123 

minutes, then washed under tap water and mounted for light microscope. rzfFsh was 1124 

purchased from U-Protein Express B.V; Utrecht, the Netherlands, and detailed 1125 

information about rzf Fsh synthesis was provided by García-López and collaborators 1126 

(2010). For expression analysis, testes from 15 animals collected and placed on 1127 

nitrocellulose membrane on top of agar blocks, which were incubated in Leibovitz (L-15) 1128 

(Sigma) culture medium containing or not rzf Fsh (100ng/ml). After 7 days (medium was 1129 

refreshed every 3 days), testis were collected for RT-qPCR analysis as described above. 1130 

BrdU (100 µg/ml; 5-bromo-2-deoxyuridine; Sigma Aldrich) was added in the last 6 hours 1131 

of incubation, and samples were collected for BrdU immunodetection as described 1132 

previously (Nóbrega et al, 2015). The mitotic index was determined by counting the 1133 

number of Aund-BrdU positive cells in 50 randomly chosen optical fields (100x) between 1134 

basal and Fsh conditions. Also, in order to separate somatic from germ cells, testes from 1135 

10 animals were submitted to the differential plating method as described by Luo and 1136 

collaborators (2006). By this technique, somatic cells firmly adhere to the bottom of the 1137 

plate while germ cells remain in suspension for 2-3 days of culture or are weakly 1138 

associated with the somatic cells (Figure 5). 1139 

Statistical analyses  1140 

Results were expressed as mean values ± SEM. Significant differences between two 1141 

groups were identified using paired Student's t-test (p<0.05) for Fsh treatment and 1142 

unpaired for the others treatments. Comparisons of more than two groups were performed 1143 

with one-way ANOVA followed by Student-Newman-Keuls test (p<0.05). Graph Pad 1144 

Prism 4.0 (Graph Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA, http://www.graphpad.com) 1145 

was used for all statistical analysis. 1146 



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 1340 

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 1342 

 1343 

 1344 

 1345 

 1346 

 1347 



49 
 

 1348 

Figure 1. A. RT-PCR for 8-cell stage and hatching on zebrafish embryos. RT-PCR shows differential 1349 
expression for pluripotency genes candidates in two different stages of development. B, C and D. Relative 1350 
expression of mammalian orthologue genes present in gonads and zebrafish embryos. A. b-actin was used 1351 
as positive control. Gene expression in B, C and D were normalized with reference gene (ef1α) and 1352 
expressed as relative values of the lower expression (somite). Different letters indicate significant 1353 
differences among the groups (P <0.05). 1354 

 1355 

 1356 

 1357 

 1358 

 1359 

 1360 

 1361 

 1362 



50 
 

 1363 

Figure 2. (A-B) Toluidine blue staining of testes showing the different populations of spermatogonial cells. 1364 
(C, G and F) Immunostaining of Pou5f3 [C – DAPI counterstaining and D, F and G propidium iodide (PI) 1365 
counterstain]. (E) Pou5f3 staining without PI. The proteins are concentrated in undifferentiated 1366 
spermatogonia stem cells (Aund) as indicated by arrows in C, F and G. Aund, type A undifferentiated 1367 
spermatogonia; Adiff, type A differentiated spermatogonia; SPG B, spermatogonia type B; SPZ, 1368 
spermatozoa; SC, Sertoli cells. Bars – 5uM; (H) Pou5f3 immunoblot of whole testis.1369 



 



Figure 3 – rzfFsh effects on germ and somatic cells proliferation and fluorescence immunohistochemistry 

for Fshr in zebrafish testis of adult individuals. (A) Relative expression of selected genes in adult zebrafish 

testis under influence of 100ng/uL of rzf Fsh culture for 7 days. (B) Sertoli cells proliferation in association 

with undifferentiated (Aund) or differentiated (Adiff) spermatogonia BrdU-positive or negative. Results 

are presented as mean ± standard error (n = 8). (A, B) Significant statistical differences (p<0.05) related to 

control (horizontal line) are denoted by asterisks (*). (C-D) Immunofluorescence detection for Fshr in 

zebrafish testis. (E-G) Sertoli cells associated with type A undifferentiated  (Aund) positive for Fshr. (H-J) 

Fshr expressing Sertoli cells belonging to different germ cell cysts. Note that Leydig cells are also positive 

for Fshr. Aund, type A undifferentiated spermatogonia; Adiff, type A differentiated spermatogonia; SPG 

B, spermatogonia type B; ST, spermatids; SPZ, spermatozoa; SC, Sertoli cells; LC, Leydig cells. Bars A-

E 5uM and F-H 10uM. 

 



53 
 

 

 



54 
 

Figure 04 – gdnfa/gfra1 expression in embryonic and adult cells and its sites of expression in testes of adult 

zebrafish. (A) Expression of gdnfa/gfra1 present in gonads and zebrafish embryos. Different letters indicate 

significant differences among the groups (P <0.05). Genes were normalized with reference gene (ef1α) and 

calibrated with the presented lower expression (somite). (B) mRNA sites of expression for gdnfa transcripts. 

We were unable to determine if the expression if concentrated either in germinative or Sertoli cells. (C) 

Differential platting technique. GC – germinative cells. SC – Sertoli cells. (E-H) Colocalization of Fshr and 

DAPI. (D) gdnfa is expressed in germ cells. Control has both germinative and Sertoli cells. Different letters 

indi