RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 01/10/2025 Cristiane Duque Avaliação microbiológica, anti-inflamatória e da capacidade de indução de mineralização de flavonoides como agentes para aplicação em Odontologia São José do Rio Preto 2021 Campus de São José do Rio Pre to Cristiane Duque Avaliação microbiológica, anti-inflamatória e da capacidade de indução de mineralização de flavonoides como agentes para aplicação em Odontologia Tese apresentada como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientador: Prof. Dr. Luis Octavio Regasini São José do Rio Preto 2021 Cristiane Duque Avaliação microbiológica, anti-inflamatória e da capacidade de indução de mineralização de flavonoides como agentes para aplicação em Odontologia Tese apresentada como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-Graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Comissão Examinadora Prof. Dr. Luis Octávio Regasini (Orientador) UNESP – Campus de São José do Rio Preto Profa. Dra. Anuradha Prakki University of Toronto – Toronto, Canadá Profa. Dra. Denise Madalena Palomari Spolidorio UNESP – Campus de Araraquara Profa. Dra. Regianne Umeko Kamiya Universidade Federal de Alagoas - UFAL Profa Dra. Ana Claudia Okamoto UNESP – Campus de Araçatuba São José do Rio Preto 01 de outubro de 2021 Dedico este trabalho à minha família, em especial ao meu marido Luís Fernando Custódio Talora e meu filho Felipe Duque Talora e à minha querida amiga Karina S. Caiaffa AGRADECIMENTOS À Deus, por me guiar durante todos os momentos, dar amparo a mim e à minha família ao longo das provas que passamos nessa vida. À minha mãe Doraci Fenerick Duque, pelo amor, carinho, dedicação à minha família, por me apoiar em todas as decisões e por me auxiliar nos momentos mais difíceis. Aos meus queridos marido Luis Fernando Custódio Talora e filho Felipe Duque Talora por todos os momentos de alegria, de carinho, de compreensão pela minha ausência, por deixarem meus dias mais leves e felizes. Às famílias Duque e Talora pelo carinho, apoio e momentos de alegria e descontração. Ao meu orientador, Prof. Dr. Luis Octávio Regasini, por todos os ensinamentos, pela parceria nas pesquisas, por acreditar nesse meu sonho e apoiar minhas decisões. Aos meus queridos alunos da FOA/UNESP, em especial àqueles que me apoiaram na realização desta tese: Karina Sampaio Caiaffa, Vanessa Rodrigues dos Santos, Jesse Augusto Pereira, Amanda Caselato Andolfatto Souza, Rafaela Laruzo Rabelo, Gabriela Pacheco de Almeida Braga, Daniela Alvim Chrisóstomo, Warlley Campos de Oliveira, Rafael Araújo Rios, Maria Eduarda de Souza, Larissa de Souza Oliveira e Ana Beatriz Maciel de Souza. Muito obrigada por toda a confiança e carinho. Aos amigos que conquistei durante esse período de doutorado no Ibilce/UNESP: Carlos Roberto Polaquini, Graciele Ribeiro de Moraes, Mariana Bastos, Laíza Araújo de Almeida, Guilherme Silva Torrezan, Luana Mourão, Gabriela Ayusso, entre outros que estiveram comigo nas aulas da pós-graduação. Aos colegas Gabriel Abuna Flores (FOP/UNICAMP), Marcia Sirlene Zardin Graeff (FOB/USP) e Elton José de Souza (FEIS/UNESP), pelo apoio com as análises de microscopia confocal e de varredura. Aos colegas Maria Luisa Leite, Igor Mendes Soares, Josimeri Hebling e Carlos Alberto de Souza Costa, pelo apoio com as análises de PCR. Aos meus colegas e ex-colegas de trabalho, Sandra Aguiar, Juliano Pelim Pessan, Robson Frederico Cunha, Alberto Carlos Botazzo Delbem e Célio Percinoto, pelo apoio para a realização deste segundo doutorado. Às minhas queridas amigas Aimée Maria Guiotti, Karina Sampaio Caiaffa, Letícia Helena Theodoro, Natália Leal Vizoto e Thais de Cássia Negrini, pelo companheirismo, carinho e cumplicidade. À banca examinadora dessa tese: Prof. Dr. Luis Octavio Regasini, Profa. Dra. Anuradha Prakki, Profa. Dra. Regianne Umeko Kamiya, Profa. Dra. Ana Cláudia Okamoto e Profa. Dra. Denise Madalena Palomari Spolidorio, que contribuíram muito com o trabalho apresentando suas críticas e sugestões. Agradeço pela disponibilidade e carinho na leitura dessa tese. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001, à qual agradeço. Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão de auxílio à pesquisa, sob o processo nº 2017/10940-1. Esse processo estava vinculado à Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, na qual sou docente. “Pensamento é vida. Vida é criação. Criação vem do desejo. Desejo é semente. Semente plantada no terreno da ação que traz o fruto que lhe corresponde. Toda semente produz. A escolha é nossa.” (EMMANUEL, 1980, mensagem 34) RESUMO Terapias biológicas atuais visam recuperar as funções fisiológicas do complexo dentino- pulpar, preservar os tecidos pulpares/periapicais remanescentes e permitir a formação radicular completa em dentes permanentes jovens com infecções endodônticas. Neste contexto, os flavonoides poderiam ser moléculas interessantes a serem empregadas no tratamento endodôntico devido à sua amplitude terapêutica. Este estudo teve três objetivos principais: (1) avaliar a citotoxicidade e os efeitos antimicrobiano/antibiofilme de flavonoides sobre microrganismos de interesse endodôntico; (2) avaliar a citotoxicidade e o efeito de flavonoides sobre marcadores fenotípicos e genotípicos de dentinogênese em células odontoblastóides e (3) avaliar a citotoxicidade e o efeito de flavonoides sobre a produção de marcadores de estresse oxidativo por macrófagos. A atividade antimicrobiana/antibiofilme dos flavonoides EGCG, taxifolina, miricetina, pinocembrina, crisina, galangina, canferol, quercetina e naringina foram avaliadas pela determinação da concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM) e ensaios de biofilme mono-espécies, dual- espécies, multiespécies em microplacas e biofilme em dentina radicular com bactérias de interesse odontológico. Os compostos também foram analisados quanto à sua toxicidade sobre fibroblastos L929, pelo ensaio de MTT. Em cultura de células odontoblastóides MDPC- 23, os flavonoides foram avaliados quanto ao efeito citotóxico, sobre a atividade de fosfatase alcalina (ALP), na deposição de matriz mineralizada e expressão gênica de ALP, metaloproteinases -2 e -9 (MMP-2 e MMP-9), proteína da matriz dentinária-1 (DMP-1) e sialofosfoproteína dentinária (DSPP). Os flavonoides também foram triados em cultura de macrófagos RAW.267 quanto a citotoxicidade, por ensaios de resazurina, e submetidos aos ensaios de inibição de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS), na presença de lipopolissacarídeo (LPS). Os dados foram analisados estatisticamente (p<0,05). EGCG e taxifolina apresentaram os melhores efeitos inibitórios contra as espécies bacterianas testadas, principalmente E. faecalis e não foram citotóxicos dentro das CIM obtidas. Além disso, ambos reduziram estatisticamente os biofilmes monoespécies de E. faecalis, A. israelii, S. mutans, L. casei e F. nucleatum, dual-espécies entre essas espécies e E. faecalis, multiespécies com todas essas espécies e em dentina radicular com E. faecalis. EGCG, taxifolina e canferol estimularam a atividade de fosfatase alcalina e a deposição de matriz mineralizada. Além disso, taxifolina e EGCG aumentaram a expressão de ALP sem diferença estatística entre eles, enquanto a taxifolina aumentou notavelmente a expressão de DMP-1 e DSPP. Na presença de LPS, os flavonoides testados levaram à redução dos níveis de NO e ROS, em macrófagos, destacando-se EGCG, taxifolina, miricetina e canferol. Conclui-se que EGCG e taxifolina apresentam potencial antimicrobiano, antibiofilme, anti-inflamatório e indutor de mineralização. Esses flavonoides poderiam ser agentes promissores para aplicação em Endodontia, visando promover a desinfecção dos canais radiculares, controlar a inflamação e estimular o reparo dentinário. Palavras-chave: Flavonoides. Ação antimicrobiana. Biofilmes. Citotoxicidade. Dentinogênese, Atividade anti-inflamatória. ABSTRACT Current biological therapies aim to recover the physiological functions of the pulp-dentin complex, preserve the remaining pulp/periapical tissues and allow complete root formation in young permanent teeth with endodontic infections. In this context, flavonoids could be interesting molecules to be used in endodontic treatment due to their therapeutic range. This study had three main objectives: (1) to evaluate the cytotoxicity and antimicrobial/antibiofilm effects of flavonoids on microorganisms of endodontic interest; (2) to evaluate the cytotoxicity and effect of flavonoids on phenotypic and genotypic markers of dentinogenesis in odontoblast-like cells and (3) to evaluate the cytotoxicity and effect of flavonoids on the production of oxidative stress markers by macrophages. The antimicrobial/antibiofilm activity of the flavonoids EGCG, taxifolin, myricetin, pinocembrin, chrysin, galangin, kaempferol, quercetin and naringin were evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and monospecies, dual-species and multispecies biofilm assays in microplates and biofilm in root dentin with bacteria of dental interest. The compounds were also analyzed for their toxicity on L929 fibroblasts by the MTT assay. In MDPC-23 odontoblast-like cell cultures, flavonoids were evaluated for their cytotoxicity, effect on alkaline phosphatase (ALP) activity, in the deposition of mineralized matrix and gene expression of ALP, metalloproteinases -2 and -9 (MMP-2 and MMP- 9), dentin matrix protein-1 (DMP-1) and dentin sialophosphoprotein (DSPP). Flavonoids were also screened in RAW.267 macrophage cultures for cytotoxicity, by resazurin assays, and submitted to nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) inhibition assays in the presence of lipopolysaccharide (LPS). Data were analyzed statistically (p<0.05). EGCG and taxifolin showed the best inhibitory effects against the bacterial species tested, mainly E. faecalis and were not cytotoxic within the MICs obtained. Furthermore, both flavonoids statistically reduced the monospecies biofilms of E. faecalis, A. israelii, S. mutans, L. casei and F. nucleatum, dual-species biofilms between these species and E. faecalis, multispecies biofilms with all these species and in root dentin with E. faecalis. EGCG, taxifolin and kaempferol stimulated alkaline phosphatase activity and deposition of mineralized matrix. Furthermore, taxifolin and EGCG increased ALP expression without statistical difference between them, while taxifolin increased DMP-1 and DSPP expression. In the presence of LPS, the flavonoids tested reduced the levels of NO and ROS in macrophages, especially EGCG, taxifolin, myricetin and kaempferol. It is concluded that EGCG and taxifolin have antimicrobial, antibiofilm, anti-inflammatory and potential to induce dentin mineralization. These flavonoids may be promising agents for application in Endodontics, aiming to promote the disinfection of root canals, control inflammation and stimulate dentin tissue repair. Keywords: Flavonoids. Antimicrobial action. Biofilms. Cytotoxicity. Dentinogenesis. Anti- inflammatory activity. LISTA DE FIGURAS Capítulo 1 Figure 1. Effect of the flavonoids EGCG and taxifolin (Tax) and the control chlorhexidine (CHX) on the viability of L929 fibroblasts after 24h of exposure, after staining with MTT. Concentrations in mg/ml. ....................................................................................................... 45 Figure 2. Effect of flavonoids and controls on monospecies biofilms (48-72h) of oral bacteria after 24h of treatment. EGCG - 2.5 mg/mL and Taxifolin - 5mg/mL (10x the highest MIC value) CHX 10x - 0.05 mg/mL (10x the highest MIC value) CHX 100x - 0.5 mg/mL (100x the highest MIC value) Control – Bacterial growth without antimicrobial agents. ................................... 45 Figure 3. Effect of flavonoids and controls on dual-species biofilms (48-72h) of oral bacteria after 36h of treatment. Values are presented as means and standard deviations. EGCG - 2.5 mg/mL (10x the highest MIC value), Taxifolin – 5 mg/mL (10x the highest MIC value), CHX 10x - 0.05 mg/mL (10x the highest MIC value), CHX 100x - 0.5 mg/mL (100x the highest MIC value) and Control – Bacterial growth without antimicrobial agents. ............................................... 46 Figure 4. Representative scanning electron microscopy images of 14 days multispecies biofilms under low (1000x) and high magnification (5000x). Biofilms were treated for 48 hours with: A – EGCG 2.5 mg/ml; B – taxifolin 5 mg/ml; C - CHX 10x MIC (0.05 mg/ml); D – CHX 100x MIC (0.5 mg/mL) and E: Control (culture media without antimicrobials). F. Mean (SD) of the bacterial counts detected after 48h of the biofilm treatment with flavonoids and controls. 47 Figure 5. Representative confocal microscopy images of bovine root dentin specimens contaminated for 14 days with E. faecalis biofilm and treated for 48 hours with the following groups: A – EGCG 2.5 mg/ml; B – taxifolin 5 mg/ml; C - CHX 10x MIC (0.05 mg/ml); D – CHX 100x MIC (0.5 mg/mL) and E: E. faecalis control. In green: live cells and in red: dead cells. F. Mean (SD) of the percentages of dead cells of E. faecalis biofilm formed in root dentin of bovine teeth, after 48h of treatment with flavonoids and controls. ...................................... 48 Capítulo 2 Figure 1. Effect of flavonoids and chlorhexidine (CHX) control on the viability of MDPC-23 odontoblast-like cells, after 24h (A) and 48h (B) of rezasurin exposure and staining. ........... 61 Figure 2. Alkaline phosphatase activity after 48 hours of exposure to flavonoids and 8 days of growth in osteogenic medium. Control: osteogenic DMEM ................................................... 62 Figure 3. Production of mineralization nodules (% in relation to untreated control) after 48 hours of exposure to flavonoids and 13 days of growth in osteogenic medium. Control: osteogenic DMEM. .................................................................................................................. 62 Figure 4. Representative images of alizarin red staining showing mineralization ability of MDPC-23 cells after 48h of EGCG at 100 (A), 50 (B) and 25 μM (C) and taxifolin at 100 (D), 50 (E) and 25 μM (F) and 13 days of growth, compared to osteogenic DMEM (G) and DMEM (H). ................................................................................................................................................ 63 Figure 5. Expression of alkaline phosphatase – ALP (A), metalloproteinase -2 – MMP-2 (B) and MMP-9 (C), dentin matrix protein – 1 – DMP-1 (D) and dentin sialophosphoprotein – DSPP (E) from MDPC-23 cells after 48 hours of exposure to EGCG and taxifolin and 13 days of growth. Control: osteogenic DMEM. The relative mRNA expression of mineralization marker genes was analyzed by quantitative real-time PCR using housekeeping gene GAPDH. ........................... 64 Capítulo 3 Figure 1. Effect of flavonoids and dexamethasone control on the viability of RAW 264.7 lineage macrophages, after 72 hours of exposure and staining with resazurin. ................................. 74 Figure 2. Effect of flavonoids and dexamethasone control on the viability of RAW 264.7 lineage macrophages, in the presence of LPS at 100ng/mL and 1 μg/mL, after 72h exposure and staining with resazurin. ........................................................................................................... 75 Figure3. Effect of flavonoids and dexamethasone control on the production of nitric oxide (NO) by macrophages of the RAW 264.7 lineage, in the presence of LPS of 1 μg/mL, after 72 hours of exposure. .................................................................................................................. 76 Figure 4. Effect of flavonoids and dexamethasone control on the production of reactive oxygen species (ROS) by macrophages of the RAW 264.7 lineage, in the presence of LPS of 1 μg/mL, after 72 hours of exposure. .................................................................................................... 76 LISTA DE TABELAS Table 1. Flavonoids used in this study: codes, synonyms, chemical structure, empirical formula, and molecular weight. ................................................................................................................................. 42 Table 2. Minimal inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal/fungicidal concentration (MBC) in mg mL-1 for the flavonoids and control chlorhexidine against the oral microorganisms tested. .............................................................................................................................................................. 44 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ALP: fosfatase alcalina ATCC: Coleção Americana de Culturas (American Type of Culture Collection) BHI: meio de infusão cérebro-coração (Brain Heart Infusion) Ca: cálcio cDNA: DNA complementar CHX: clorexidina CLSI: Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (Clinical and Laboratory Standards Institute) CO2: dióxido de carbono COX-2: cicloxigenase-2 DCF: 20,70-dichlorofluorescein (DCF) DEX: dexametasona DMEM: Meio de cultura Dulbelco Modified Eagle Medium DMP-1: proteína da matriz da dentina-1 (dentin matrix protein-1) DSPP: sialofosfoproteína da dentina (dentin sialophosphoprotein) EGCG - epigalocatequina galato EPS: matriz de polímero extracelular (extracelular polymeric substance) H2DCFDA: dichlorodihydrofluorescein diacetate acetylester hBMSCs: células tronco mesenquimais da medula óssea humana (human bone marrow mesenchymal stem cells) hDPSC: células tronco da polpa dental humana (human dental pulp stem cells) IL-12p70: gene da interleucina-12 p70 IL-17: interleucina-17 IL-1β: interleucina-1β IL-6: interleucina-6 IL-8: interleucina-8 iNOS: óxido nítrico sintase induzível (inducible nitric oxide synthase) IκB: Ikinase (IKK) KAS III: enzima β-ketoacyl synthase KCl: cloreto de potássio Log: logaritmo LPS: lipopolissacarídeo LTA: ácido lipoteicoico (lipoteichoic acid) MAPK: proteinas quinases ativadas por mitógeno (mitogen-activated protein kinases) MBC (CBM): concentração bactericida mínima (minimal bactericidal concentration) MDPC-23: células da papila dental de camundongo (mouse dental papilla cells-23) MEC: matriz extracelular MH: Miller Hinton MIC (CIM): mínima concentração inibitória (minimal inhibitory concentration) MMPs: metaloproteinases MTA: agregado de trióxido mineral (mineral trioxide aggregate) MTT: metiltetrazólio MV (VM): vesículas da matriz (matrix vesicles) NaCl: cloreto de sódio NaOCl: hipoclorito de sódio NCP (PNC): Proteínas não colagenosas (non-collagenous proteins) NED: N-1-napthylethylenediamine dihydrochloride NIK: nuclear factor-inducing kinase (NIK) NO: óxido nítrico (nitric oxide) PBS: tampão de fosfato de sódio (sodium phosphate buffer) PGE: prostaglandinas PI: iodeto de propídio qPCR: reação em cadeia da polimerase quantitativo (quantitative PCR) RANKL – ligante do receptor do fator nuclear kappa-Β ROS: espécies reativas de oxigênio (reactive oxygen species) RPMI: Roswell Park Memorial Institute SCAP: célula tronco da papila dental (dental papilla stem cells) SDA: Sabouraud Dextrose Agar SYTO 9: corante SYTO-9 TGF-β: fator de crescimento- β (transforming growth fator- β) TNF-α: fator de necrose tumoral-α UFC (CFU): unidades formadoras de colônias (colony forming units) Zn: zinco SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 15 2. OBJETIVOS ................................................................................................................ 22 3. CAPÍTULO 1 - CYTOCOMPATIBILITY AND ANTIMICROBIAL/ANTIBIOFILM POTENTIAL OF EGCG AND TAXIFOLIN AGAINST ORAL PATHOGENIC BACTERIA RELATED TO ENDODONTIC INFECTIONS* .................................................................................................................... 23 Abstract ............................................................................................................................... 23 3.1. Introduction ............................................................................................................ 24 3.2. Material and methods ............................................................................................ 25 3.2.1. Flavonoids and controls ...................................................................................... 25 3.2.2. Microbial strains and growth conditions ............................................................ 26 3.2.3. Determination of Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) ................................................................................... 26 3.2.4. Cell viability assays .............................................................................................. 27 3.2.5. Mono-species biofilms ......................................................................................... 28 3.2.6. Dual-species biofilms ........................................................................................... 28 3.2.7. Multispecies biofilms and scanning electron microscopy ................................... 29 3.2.8. E. faecalis biofilms in root dentin specimens ....................................................... 29 3.2.9. Statistical analysis ............................................................................................... 30 3.3. Results ..................................................................................................................... 31 3.3.1. Antimicrobial activity of the flavonoids .............................................................. 31 3.3.2. Effect of flavonoids on fibroblast viability ........................................................... 31 3.3.3. Antibiofilm activity of the compounds on microplates ........................................ 31 3.3.4. Antibiofilm activity of the compounds on root dentin specimens ....................... 32 3.4. Discussion ............................................................................................................... 33 References .......................................................................................................................... 37 Tables .................................................................................................................................. 42 Figures ................................................................................................................................. 45 4. CAPÍTULO 2 - EFFECT OF FLAVONOIDS ON ODONTOBLASTS SECRETORY ACTIVITY AND EXPRESSION OF DENTINOGENESIS MARKERS* .................................................................. 49 Abstract ............................................................................................................................... 49 4.1. Introduction ............................................................................................................ 50 4.2. Material and Methods ............................................................................................ 51 4.2.1. Flavonoids and controls ...................................................................................... 51 4.2.2. Viability of odontoblast-like cells ........................................................................ 51 4.2.3. Alkaline Phosphatase Activity (ALP) assays ......................................................... 52 4.2.4. Alizarin red staining and quantification of mineralized nodules ......................... 52 4.2.5. Gene expression of dentinogenesis markers by quantitative PCR ....................... 53 4.2.6. Statistical analysis ............................................................................................... 53 4.3. Results ..................................................................................................................... 54 4.3.1. Viability of odontoblast-like cells ........................................................................ 54 4.3.2. Alkaline phosphatase activity ............................................................................. 54 4.3.3. Production of mineralized nodules ...................................................................... 54 4.3.4. Gene expression of ALP, MMP-2, MMP-9, DMP-1 and DSPP .............................. 54 4.4. Discussion ............................................................................................................... 55 References .......................................................................................................................... 57 Figures ................................................................................................................................. 61 5. CAPÍTULO 3 - COMPARATIVE EFFECT OF FLAVONOIDS ON METABOLISM AND OXIDATIVE STRESS OF LPS-STIMULATED MACROPHAGES* ............................................... 65 Abstract ............................................................................................................................... 65 5.1. Introduction ............................................................................................................ 66 5.2. Material and Methods ............................................................................................ 67 5.2.1. Flavonoids and controls ...................................................................................... 67 5.2.2. Macrophage culture ............................................................................................ 67 5.2.3. Cell viability assays .............................................................................................. 68 5.2.4. Nitric oxide (NO) production ............................................................................... 68 5.2.5. Reactive Oxygen Species (ROS) quantification .................................................... 69 5.2.6. Statistical analysis ............................................................................................... 69 5.3. Results ..................................................................................................................... 69 5.3.1. Macrophage viability .......................................................................................... 69 5.3.2. NO and ROS production ...................................................................................... 70 5.4. Discussion ............................................................................................................... 70 References .......................................................................................................................... 72 Figures ................................................................................................................................. 74 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................................... 77 7. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 80 REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 81 15 1. INTRODUÇÃO A Endodontia é a ciência que estuda a biologia, o diagnóstico e os principais tratamentos indicados para infecções nos tecidos pulpares e periapicais do dente. Um grande desafio clínico na Endodontia e na Odontopediatria é o tratamento de dentes permanentes jovens que sofreram danos pulpares antes da completa formação radicular, processo que pode levar até 4 anos, mesmo após o irrompimento do dente na cavidade bucal. A ocorrência de um trauma ou infecção pode interromper o desenvolvimento dos canais e o fechamento dos ápices radiculares, resultando em dentes com raízes malformadas e mais susceptíveis a fraturas (DIANGELIS et al., 2012; ANDREASEN & KAHLER, 2015). Além disso, as paredes dentinárias finas divergentes ou paralelas, canais amplos e raízes curtas do dente imaturo dificultam a execução dos procedimentos endodônticos convencionais, comprometendo o resultado a longo prazo (RAFTER, 2005; IGLESIAS-LINARES et al., 2013). Mais de 500 espécies ou filotipos bacterianos diferentes já foram detectados em canais radiculares infectados, por métodos de cultura ou moleculares (Gomes e Herrera, 2018). Firmicutes e Bacteroidetes foram os principais filos relatados em todos os tipos de infecções endodônticas, com Fusobacteria mais comumente associada a infecções agudas e Actinobacteria com infecções crônicas (SANTOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2011; GOMES & HERRERA, 2018). Fungos e leveduras, principalmente Candida albicans, vírus e Archaea também foram detectados em canais infectados (SIQUEIRA JUNIOR et al., 2002; SABETI et al., 2003; VIANNA et al., 2006; SIQUEIRA & RÔÇAS, 2009). Os microrganismos da polpa necrótica formam biofilmes polimicrobianos dentro dos complexos sistemas de canais radiculares, atingindo canais secundários e foraminas, ampliando a dificuldade de erradicação microbiana por intervenções químico-mecânicas convencionais (NEELAKANTAN et al., 2017). Particularmente, bactérias anaeróbias facultativas e Gram-positivas, como Streptococcus, Lactobacillus, Actinomyces, Enterococcus faecalis e Gram-negativas como Fusobacterium nucleatum, são mais frequentemente encontradas em canais com falha no tratamento endodôntico, possivelmente devido à sua capacidade de sobreviver em ambientes hostis e expressar diferentes fatores de virulência, mecanismos de formação de biofilme e resistência antimicrobiana (KAYAOGLU et al., 2009; KUMAR et al., 2015; NEELAKANTAN et al., 2017; PRADA et al., 2019). As bactérias causam danos diretos ou indiretos à polpa dentária por meio da liberação de seus produtos metabólicos ou componentes estruturais da membrana ou parede celular. 16 Os lipopolissacarídeos (LPS) ou endotoxinas são um dos constituintes mais importantes da parede celular das bactérias Gram-negativas e podem formar vesículas ou serem liberadaos após a desintegração bacteriana. O LPS está altamente envolvido na ativação de células do sistema imunológico, induzindo o desenvolvimento de processos inflamatórios (DARVEAU et al., 2004). O LPS pode ativar vários mecanismos do sistema imunológico, incluindo imunidade inata e adaptativa. Um dos primeiros efeitos biológicos do LPS é a ativação de macrófagos/monócitos induzindo a produção e liberação de citocinas pró-inflamatórias, como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β), interleucina-8 (IL-8), interleucina- 6 (IL-6), leucotrienos, prostaglandinas (PGE) e outros (HENDERSON & WILSON, 1996; DARVEAU et al., 2004). As endotoxinas também estimulam a produção de enzimas que induzem o estresse oxidativo, como a óxido nítrico sintase induzível (iNOS), que nos macrófagos modula a produção de óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigênio (ROS). Grandes quantidades de NO têm sido diretamente relacionadas à etiologia de uma variedade de doenças, incluindo Infecções odontogênicas (MARLETTA, 1993; HUSSAIN et al., 2016). ROS também atua como uma molécula de sinalização e um mediador da inflamação. Na forma de superóxido, pode combinar-se rapidamente com o NO para formar peroxinitrito e estresse nitrosativo, que aumenta a carga pró-inflamatória das ROS (MITTAL et al., 2014). Como a iNOS, a cicloxigenase-2 (COX-2) é altamente regulada em resposta à infecção bacteriana e tem um papel primordial na inflamação aguda, mediando a quebra do ácido araquidônico e a biossíntese de isoformas de PGE. Essas moléculas são responsáveis pelo recrutamento de leucócitos e pela infiltração de células imunes subsequentes (RICCIOTTI & FITZGERALD, 2011). Odontoblastos são células especializadas na deposição da matriz dentinária durante a odontogênese, ao longo da vida do dente e diante de processos patológicos. Essas células pulpares são a primeira linha de defesa do complexo polpa-dentina e, portanto, as primeiras células a sofrerem efeitos deletérios (KAWASHIMA & OKIJI, 2016). Eles também estão em continuidade com a papila apical e com as células-tronco na porção apical em dentes imaturos, e ambos são importantes para a formação contínua da raiz (BLEICHER, 2014). O processo de dentinogênese envolve uma ampla gama de enzimas e proteínas colagenosas e não colagenosas (PNC). A fosfatase alcalina é uma enzima presente na superfície externa das vesículas da matriz (VM) produzida pelos odontoblastos, responsável pela hidrólise do pirofosfato inorgânico extracelular em fosfato inorgânico para formar cristais de hidroxiapatita e promover a biomineralização. Portanto, a atividade de ALP pode ser usada como um marcador de estágio inicial de mineralização (GOLUB, 2009; LARMAS & SÁNDOR, 17 2014). As metaloproteinases (MMPs) também são encontradas em VM na dentina. Elas são uma família de enzimas dependentes de Zn2+ e Ca2 + que participam da organização da matriz extracelular (MEC) e dos compartimentos durante a formação da dentina. MMP-2 e MMP-9 (gelatinases) são secretadas por odontoblastos e ativam o TGF-β na dentina mineralizada ou na borda dentina-polpa, e então produzem efeitos complexos na reação defensiva do complexo dentina-polpa (MAZZONI et al., 2013; TJÄDERHANE et al., 2015). Dentre as PNCs, a proteína da matriz da dentina-1 (DMP1) e a sialofosfoproteína da dentina (DSPP) são membros da família das pequenas glicoproteínas SIBLINGS (small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins) e são comumente detectadas na MEC e desempenham um papel importante na mineralização da dentina (GOLUB, 2009; PRASAD et al., 2010). Os materiais sintéticos mais indicados para o tratamento de dentes permanentes com comprometimento pulpar/periapical são o hidróxido de cálcio e agregado de trióxido mineral (MTA). Diversos trabalhos têm mostrado que estes materiais apresentam atividade antimicrobiana e podem estimular a apicificação ou formação de barreira mineralizada em dentes permanentes jovens, porém esse processo não conduz à formação completa da raiz (DA SILVA et al., 2010; PARIROKH &TORABINEJAD, 2010). O contato desses materiais sintéticos com o tecido vital residual causa severa inflamação e consequente impacto sobre a bainha epitelial de Hertwig, o que indubitavelmente inibirá sua capacidade de estimular as células estaminais da papila apical em se diferenciarem em odontoblastos e terminarem a formação radicular (BANCHS & TROPE, 2004). Embora esses tratamentos frequentemente conduzam à resolução dos sinais e sintomas das doenças pulpares (PARIROKH &TORABINEJAD, 2010), promovem pouco ou nenhum benefício para a continuidade do desenvolvimento radicular, manutenção da nocicepção pulpar normal e defesa imune esperada para um dente permanente jovem (DIOGENES et al., 2014). Assim, há uma corrente de pesquisadores estudando materiais biológicos que apresentem múltiplas atividades biológicas, reduzindo bactérias e inflamação decorrente da infecção, além de permitir a continuidade na formação da raiz dentária preservando a bainha epitelial de Hertwig, a papila dentária e a camada de odontoblastos na área apical (JUNG et al., 2008, TANEJA et al., 2010; IGUESIAS-LINARES et al., 2013; XIe et al., 2021). Flavonoides constituem as classes mais importantes de polifenóis, com mais de 5000 compostos já descritos na literatura (PIETTA, 2000; TRIPOLI et al., 2007). Estão presentes em pequenas quantidades em frutas e vegetais, geralmente como metabólitos secundários e apresentam papel importante para defesa das plantas contra agentes externos. Estudos têm apontado 18 diversas propriedades farmacológicas dos polifenóis, como ação antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória, osteogênica e antiosteoclastogênica (PIETTA, 2000; TRIPOLI et al., 2007; PILSAKOVA Et al., 2010; YAHFOUF et al., 2018; CARVALHO et al., 2021). Eles apresentam uma estrutura comum (flavona), sendo constituídos por um núcleo 2-fenil-1,4- benzopirona com dois anéis aromáticos (A e B) unidos por três carbonos que formam um anel heterocíclico, denominado de anel C. De acordo com as variações no anel C, os flavonoides são divididos em: flavonas, flavonóis, flavanonas (3-hidroxi-flavona), flavanonol (2,3- dihydroflavonol), flavanóis (ou catequinas), antocianidinas e chalconas. Outros tipos de compostos são incluídos no grupo de flavonoides, os isoflavonoides e os neoflavonoides. Substituições nos anéis A e B originam diferentes compostos dentro de cada classe de flavonoides e flavonoides com o anel C aberto são denominados de chalconas (CUSHNIE & LAMB, 2005). Entre os representantes do grupo dos flavonóis destacam-se a quercetina, a miricetina e o canferol. A quercetina é um dos flavonoides mais abundantes na dieta humana sendo encontrada principalmente em cebolas, maçãs, chás e vinhos (RUSSO et al., 2012). A quercetina é considerada um forte antioxidante devido à sua capacidade de eliminar os radicais livres, provinda da presença de dois farmacóforos antioxidantes (grupo catecol no anel B e o grupo OH na posição 3 do anel A) (HEIJNEN et al., 2002) e ligar íons de metal de transição (DE SOUZA et al., 2004). Estudo mostrou o efeito inibitório moderado da quercetina sobre bactérias orais, com valores de concentração inibitória mínima (MIC) e concentração bactericida mínima (MBC) entre 1 e 16 mg/mL para Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus sanguis, Agregatibacter actinomycetemcomitans e P. intermedia (SHU et al., 2011). Quercetina causa um aumento na permeabilidade da membrana bacteriana e uma dissipação do potencial de membrana (MIRZOEVA et al., 1997). Adicionalmente, a quercetina conseguiu promover a proliferação e diferenciação de células tronco mesenquimais de medula óssea de ratos em osteoblastos (SRIVASTAVA et al., 2013) e induzir a diferenciação de células da polpa dentária humana, atividade de ALP e expressão gênica de DSPP, sugerindo atividade dentinogênica (KIM et al., 2013). A miricetina é um flavonol que contém hidroxilas nas posições dos carbonos 3, 5, 7, 3', 4' e 5'. Encontra-se presente em diversos vegetais, bagas e frutas, chás e vinho tinto, principalmente na forma de glicosídeos, ao invés de agliconas livres (KOEPPEN & HERRMANN, 1977; CANADA, 1990). A miricetina exerce efeitos anti-inflamatórios e imunomoduladores, 19 como evidenciado na supressão da síntese de TNF-α, IL-6 e IL-12p70 por células dendríticas estimuladas por LPS e macrófagos (KO, 2012; FU et al., 2013); na redução da secreção de citocinas e histaminas pró-inflamatórias por mastócitos (PARK et al., 2008) e no aumento da produção de IL-10 anti-inflamatória por macrófagos (FERREIRA et al., 2013). Cai e Wu (1996) mostraram que a miricetina apresentou efeito inibitório contra patógenos periodontais Gram- negativos como Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia em baixa concentração (20µg/mL), mas baixa atividade contra S. mutans e Actinomyces viscosus. Na concentração de 500 µg/mL, a miricetina apresentou significantes zonas de inibição, variando entre 13,4 e 19,2mm contra inúmeras espécies bacterianas, incluindo, Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. saprophyticus, E. faecalis, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, entre outras, mas a potência foi maior para bactérias Gram positivas (THIYAGARAJAH et al., 1991). A miricetina também promoveu um efeito estimulatório na diferenciação celular em osteoblastos humanos, aumento na atividade da ALP e produção de osteocalcina (KUO et al., 2005; HSU et al., 2007), síntese de colágeno tipo I e mineralização óssea (HSU et al., 2007) O canferol, outro membro da classe dos flavonóis, encontra-se principalmente na composição de maçãs, brócolis, morangos, feijões (SOMERSET E JOHANNOT, 2008) e em plantas usadas na medicina tradicional (DEVI et al. 2005, CALDERÓN-MONTAÑO et al., 2011). Têm mostrado excelente atividade antioxidante e pode reagir com H2O2, HOCl, superóxido, óxido nítrico, entre outros, em ensaios em cultura de células (VELLOSA et al., 2011). Diversos trabalhos relatam que o canferol, os glicosídeos de canferol e/ou as plantas contendo canferol apresentaram atividade anti-inflamatória não apenas in vitro, mas também in vivo (PARK et al., 2009; KIM et al., 2010; DE MELO et al., 2009). A administração oral de canferol-7-O-metil- 3-sulfato (2 mg/Kg, diariamente por 7 dias) aumentou significativamente a sobrevida de camundongos infectados com a bactéria Klebsiella pneumoniae (HABBU et al., 2009). Estudo têm apontado que o canferol pode ser usado em combinação com antibióticos em casos de resistência, pois pode atuar sinergicamente com esses fármacos contra bactérias (LIM et al., 2007; OTSUKA et al., 2008; XU et al., 2001). Osteoblastos humanos MG-63 foram tratados com 50 μM de quercetina e canferol e ambos os compostos aumentaram em 1,5 e 1,7 vezes a atividade da fosfatase alcalina quando comparados ao controle, de maneira dose e tempo dependente (PROUILLET et al., 2004). A taxifolina (ou dihidroxiquercetina) é um tipo de flavanonol que é amplamente distribuída nas cascas do gênero Pinus ou Larix e em sementes do gênero Silybum e encontrado em frutas, especialmente laranjas, uvas e toranjas (WEIDMANNET al., 2012). 20 Difere da quercetina somente por apresentar ligação simples nos C2-C3 do anel C, ao invés de dupla ligação como a quercetina. A taxifolina tem apresentado ampla ação terapêutica, entre as quais, atividade antimicrobiana contra E. faecalis resistente a vancomicina (JEONG et al. 2009), Acinetobacter hemolyticus (Chatzopoulou et al. 2010) e atividade antifúngica (KANWAL et al. 2010). Taxifolina-6-C glucopiranosídio extraída de Ulmus macrocapra Hance (Ulmaceae) mostrou moderado efeito antioxidante, reduzindo a produção de NO e a expressão de iNOS e COX-2 (KWON et al., 2011). Osteoblastos tratados com taxifolina secretaram um nível maior de osteocalcina e induziram maior mineralização, quando comparados aos controles. Além disso, baixas doses de taxifolina diminuíram a expressão do gene RANKL nessas células, sugerindo inibição na formação de osteoclastos (SATUÉ et al., 2013). O EGCG (epigalocatequina galato) é uma das mais abundantes e importantes catequinas ou flavanóis e componente bioativo da folha da planta Camellia sinensis (SAITO Et al., 2009, CHACKO et al., 2010). Ele possui esqueleto químico semelhante a miricetina nos anéis A e B, porém apresenta diferenças no anel C que conferem sua classificação como flavanol ou catequina. Essas diferenças são na ligação simples nos carbonos C2-C3, um H no C4 e um grupamento galato ligado ao anel C. EGCG tem mostrado ação anti-inflamatória, anti- tumoral, antioxidante, na prevenção de doenças cardiovasculares, efeitos imunomodulatórios e neuroprotetores, além da inibição de infecção por diversos microrganismos (SAITO et al., 2009, CHACKO et al., 2010; STEINMANN et al., 2013; LEGEAY et al., 2015), bem como efeito anticariogênico e anti-halitose (XU et al., 2012; MORIN et al., 2015). Estudos mostraram que EGCG foi capaz de inibir o crescimento de patógenos bucais, como E. faecalis e S. mutans (LEE & TAN, 2015; XU et al., 2012). Também reduz a secreção de citocinas pró-inflamatórias por fibroblastos gengivais, células epiteliais e por células endoteliais (WHEELER et al., 2004; LEE et al., 2009; HOSOKAWA et al., 2009, 2010; ASAHI et al., 2014). Baixas doses de EGCG (1 or 10 μM) estimularam a proliferação/diferenciação de células tronco da papila dentária (SCAP) em linhagens osteogênica/odontogênica, com aumento da atividade de fosfatase alcalina e deposição mineral. Diferenciação odontogênica foi observada pelo aumento da expressão de marcadores de mineralização como DMP-1 e DSPP por essas células tronco (LIU et al., 2021). A naringina é uma flavanona que ocorre naturalmente em frutas cítricas, especialmente na toranja, sendo responsável pelo seu gosto amargo. Tem apresentado efeitos benéficos sobre desordens cardiovasculares, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, doenças pulmonares, neurodegenerativas e do tratogastrointestinal (RIVOIRA et al., 2020). Naringina mostrou atividade contra algumas espécies orais, como A. 21 actinomycentemcomitans, A. naeslundii, C. albicans, E. coli, E. faecalis, L. casei e S. aureus, porém, em concentrações acima de 10 mg/mL (GUTIERREZ-VENEGAS et al., 2019). A própolis, substância resinosa produzida por abelhas por meio da mistura de suas secreções com produtos obtidos de diversas plantas, tem sido amplamente estudada devido as suas propriedades terapêuticas (ARAL et al., 2015, ASAWAHAME et al., 2015). Dentre os principais compostos isolados da própolis estão os flavonoides galangina, crisina e pinocembrina. A galangina reduziu as citocinas inflamatórias IL-1β, TNF-α e IL-17; inibiu a formação de osteoclastos e fatores osteoclastogênicos, além de aumentar a expressão gênica de osteoprotegerina em osteoblastos (HUB et al., 2013). Liu et al. (2017) também observaram um aumento na expressão de marcadores de diferenciação osteogênica, como colágeno, ALP, osteocalcina e osteopontina em células derivadas de osteosarcoma após o tratamento com galangina. Esse flavonoide mostrou ainda atividade inibitória contra S. aureus e Enterococcus (LI et al., 2012). A crisina também demonstrou atividade contra bactérias Gram positivas e Gram negativas, incluindo S. aureus e E. coli com MICs que variaram de 6,25 a 50 µg/mL (LIU et al., 2010) e promoveu aumento da expressão de marcadores osteogênicos, como colágeno, osteocalcina e osteopontina em osteoblastos (ZENG ET al., 2013). A pinocembrina apresentou atividade antimicrobiana contra C. albicans e S. aureus (KATERERE et al. 2012), além de atenuar a resposta inflamatória induzida por lipopolissacarídeos (GIRI et al., 2016). Quando isolada das folhas de Alpinia zerumbet, a pinocembrina mostrou aumentar a atividade de ALP e a mineralização, além da expressão de genes ALP e osteocalcina em células osteoblásticas MC3T3-E1 (NATSUME et al., 2020). A busca por tratamentos capazes de induzir a diferenciação de células ou bioestimular células remanescentes em concentrações não tóxicas, promover uma desinfecção eficaz sem citotoxicidade e controlar a inflamação gerada pelo processo infeccioso tem sido alvo de diversos estudos no campo da endodontia regenerativa. Dentro desse contexto, os flavonoides poderiam ser moléculas interessantes para o tratamento de dentes permanentes jovens, desde que apresentam inúmeras propriedades terapêuticas. Este trabalho de tese está dividido em três capítulos que serão apresentados em sequência. 77 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS O tratamento endodôntico em dentes permanentes jovens visa não somente promover a desinfecção microbiana dos canais radiculares, mas também controlar a inflamação pulpar/periapical e ainda induzir o reparo dentinário, por meio de deposição de matriz mineralizada. Sendo assim, diversos estudos no campo da endodontia regenerativa investigam compostos que possuam múltiplas propriedades terapêuticas, sem causar toxicidade às células remanescentes. Este estudo foi dividido em três capítulos. No primeiro capítulo, entre os flavonoides testados, a taxifolina e o EGCG se destacaram como agentes antimicrobianos, mostrando valores de MIC/MBC entre 0,031 e 1mg/mL, contra espécies bacterianas de interesse odontológico, bem como não apresentando toxicidade em cultura de fibroblastos nessas concentrações. Baseado nisso, ensaios de biofilme com Enterococcus faecalis, Actinomyces israelii, Streptococcus mutans, Lactobacillus casei e Fusobacterium nucleatum foram conduzidos em mono-espécie, dual-espécies entre essas bactérias e E. faecalis, multiespécies com todas essas bactérias e biofilme em bloco de dentina radicular bovina com E. faecalis. Comparado aos controles, tanto EGCG quanto taxifolina reduziram os biofilmes em mono-espécie (entre 2,98 e 11 log UFC/mL) e em dual-espécies (entre 2,29 e 11 log UFC/mL). Também reduziram consideravelmente os biofilmes multiespécies (entre 6,43 e 7,27 log UFC/mL) e em canal radicular (entre 72 e 76%). Prévios estudos mostram efeito antimicrobiano de EGCG e taxifolina (Jeong et al., 2009; Xu et al., 2012; Lee e Tan, 2015; Shevelev et al., 2018), porém, a ação desses compostos em biofilmes foi pouco explorada para EGCG (Xu et al., 2012; Lee e Tan, 2015) e nenhum estudo foi encontrado para taxifolina. Alguns prováveis mecanismos de ação antimicrobiana dos flavonoides foram documentados, principalmente para as catequinas, como ruptura da membrana celular, como inibição de fatores de virulência (toxinas bacterianas e matriz extracelular), inibição de enzimas, bombas de efluxo de múltiplas drogas, estresse oxidativo, quelação de ferro, danos ao DNA, modulação da expressão gênica, entre outras, por meio de ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas (Renzetti et al., 2020, Donadio et al., 2021). No capítulo 2, os flavanoides EGCG, taxifolina, miricetina, quercetina e canferol aumentaram a atividade de fosfatase alcalina, entre 25 e 100 μM, em 1,3; 1,75; 1,31; 1,48 e 1,35 vezes comparada ao controle meio osteogênico. Houve maior deposição de nódulos de mineralização quando as células foram tratadas com EGCG (até 129%) e taxifolina (até 148%) comparadas também ao controle. A expressão gênica de ALP foi aumentada pela taxifolina (2 78 vezes) e EGCG (1,8 vezes) e somente taxifolina aumentou a expressão gênica de DMP-1 (9,1 vezes) e DSPP (26 vezes) comparada ao controle. Estudo têm mostrado efeito positivo de alguns flavonoides sobre células pulpares por meio da estimulação da diferenciação, secreção de matriz e deposição mineral (Kim et al., 2013; Liu et al., 2021, Li et al., 2021, Baldion et al., 2021, Huo et al., 2021). EGCG (entre 1 e 10 μM) induziu a migração/proliferação, atividade de fosfatase alcalina e deposição mineral em células pulpares indiferenciadas da papila (SCAP) (Liu et al., 2021), porém não teve o mesmo efeito para células pulpares indiferenciadas da polpa na concentração de 10μg/mL (21.8 μM) (Li et al., 2021). Estudos não foram encontrados avaliando o efeito de taxifolina sobre células pulpares. Contudo, taxifolina entre 50 e 100 μM estimulou a diferenciação osteogênica de células tronco da medula óssea, além de induzir a atividade de ALP e produção de nódulos de mineralização (Wang et al., 2017). Os mecanismos de ação dos flavonoides sobre as células pulpares ainda não foram explorados, porém, em osteoblastos, sugere-se ativação de canais de cálcio relacionados com a osteogênese (Chan et al., 2020). No estudo 3, todos os flavonoides (EGCG, taxifolina, miricetina, canferol e pinocembrina) não afetaram a viabilidade de macrófagos, em concentrações abaixo de 50 μM, além de reduzirem a produção de NO e ROS, na presença de LPS, quando comparados ao controle meio de cultura. Dentre esses, EGCG, miricetina e canferol tiveram melhor efeito sobre a redução de ROS, similares a dexametasona. Estudos prévios com esses mesmos flavonoides analisados de forma individual e não comparativa, mostraram redução na produção de marcadores inflamatórios induzidos por LPS em macrófagos, como NO e radicais de oxigênio, além de atenuação da produção de citocinas e enzimas inflamatórias (Alvarez et al., 2002; Kwon et al., 2011, Hou et al., 2018). Mecanismos diretos e indiretos foram sugeridos para explicar a capacidade antioxidante/anti-inflamatória dos polifenóis, incluindo desde a quelação de íons e radicais livres até inibição de vias de sinalização, como NF-κB e MAPK (Park et al., 2009; Jung et al., 2003; Ruijters et al., 2013). Baseado nos resultados dos estudos, EGCG e taxifolina poderiam ser promissores agentes antimicrobianos, anti-inflamatórios e indutores de mineralização com aplicação em terapia endodôntica para dentes permanentes jovens. Estudos estão sendo desenvolvidos por nosso grupo de pesquisa visando buscar veículos de liberação lenta e controlada para a aplicação clínica desses flavonoides, como hidrogéis termossensíveis. Considerando também a importância do conhecimento dos mecanismos de ação dos flavonoides no contexto das 79 propriedades biológicas avaliadas nos três capítulos deste trabalho de tese, novos estudos estão sendo planejados para suprimir essa limitação desses estudos. 80 7. CONCLUSÃO Conclui-se que EGCG e taxifolina tiveram o melhor efeito antimicrobiano e na redução de biofilme de espécies bacterianas de importância endodôntica. Esses flavonoides também estimularam importantes marcadores de mineralização em células odontoblastóides e reduziram os níveis de NO e ROS em macrófagos. 81 REFERÊNCIAS 1. ALVAREZ, E.; LEIRO, J.; ORALLO, F. Effect of (-)-epigallocatechin-3-gallate on respiratory burst of rat macrophages. International Immunopharmacology, v. 2, n.6, p. 849-855, 2002. 2. 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