Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu Seção Técnica de Pós-Graduação Rua Professor Doutor Antonio Celso Wagner Zanin, s/nº, Botucatu, SP – CEP 18618-689 Telefone (14) 3880-0780 posgraduacao.ibb@unesp.br IMPACTO DAS ESTAÇÕES HÍDRICAS DO CERRADO PAULISTA NOS METABOLISMOS PRIMÁRIO E ESPECIALIZADO DE Xylopia Aromatica (Lam.) Mart. LETÍCIA GALHARDO JORGE BOTUCATU - SP 2024 Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- graduação em Biologia Vegetal. 2 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU IMPACTO DAS ESTAÇÕES HÍDRICAS DO CERRADO PAULISTA NOS METABOLISMOS PRIMÁRIO E ESPECIALIZADO DE Xylopia Aromatica (Lam.) Mart. LETÍCIA GALHARDO JORGE PROFª DRª CARMEN SÍLVIA FERNANDES BOARO ORIENTADORA BOTUCATU - SP 2024 Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- graduação em Biologia Vegetal. 3 4 5 Dedico Com amor e carinho, aos meus pais João Henrique Jorge, Roselaine Ap. Galhardo Jorge e ao meu irmão Rodrigo Galhardo Jorge, que sempre me incentivaram, apoiaram e me deram amor incondicional. Vocês são a minha base, exemplo de caráter, honestidade, dignidade e respeito. 6 AGRADECIMENTOS A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela concessão da bolsa de estudo e ao auxílio financeiro. Ao Instituto de Biociências de Botucatu da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. A Deus por estar sempre presente em minha vida, pelas oportunidades postas em meu caminho, por sempre me guiar e proteger, me permitindo chegar até aqui. À minha orientadora, Profa. Dra. Carmen Sílvia Fernandes Boaro pelos ensinamentos, pela paciência, amizade, sabedoria e por sua presença e dedicação em todas as etapas do projeto, e também por depositar sua confiança em mim para a realização deste trabalho. À Profa. Dra. Márcia Ortiz Mayo Marques, por toda contribuição e que gentilmente me recebeu no Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e por permitir o uso de seu laboratório. À Roselaine Facanali e Paulo Henrique Furlan pela ajuda nas análises cromatográficas realizadas no Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Aos membros da banca examinadora, pelas correções e contribuições para a melhoria deste trabalho. Aos meus pais e ao meu irmão, que são as insipirações da minha vida e que me ensinaram a agir sempre com amor ao próximo, respeito, humildade e honestidade. Mesmo diante das dificuldades que trilhamos juntos nos últimos anos, não mediram esforços para que eu pudesse chegar até aqui. Aos meus familiares, que sempre estiveram presentes em minha vida, acreditram em mim e por saber que poderia contar com o apoio de todos vocês. Ao Bruno Novaes pela ajuda nas coletas, pelo amor, compreensão, paciência, carinho, apoio e por se fazer tão presente em todos os momentos da minha vida. Aos meus professores da graduação em Ciências Biológicas (Unesp – Botucatu), por todo conhecimento adquirido. Aos meus amigos de departamento e laboratório, pelos momentos de descontração, conversas e ajuda nas análises laboratoriais, em especial ao Felipe Girotto Campos, pelo apoio 7 e colaboração na execução deste trabalho. Obrigada pela paciência e por tudo o que me ensinou. Minha eterna gratidão a você. A família do Felipe Girotto Campos, em especial a sua mãe Fátima, que me recebeu de braços abertos em sua casa durante as minhas quatro coletas em sua cidade, Santa Fé do Sul. Muito obrigada pelo acolhimento, carinho, atenção, conversas e pelas suas comidas feitas com tanto amor. Você é uma mulher incrível! Aos meus amigos de Botucatu e que vou levar comigo para o resto da vida. Obrigada pela amizade, companheirismo e momentos de descontração. A todos os professores do curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Botânica) pelos ensinamentos adquiridos. Aos funcionários do departamento de Biodiversidade e Bioestatística (setor de Fisiologia vegetal), pela disponibilidade em ajudar sempre que necessário. Por fim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram e participaram dessa fase tão importante da minha vida. Muito obrigada! 8 SUMÁRIO RESUMO..................................................................................................................................09 ABSTRACT..............................................................................................................................10 1. INTRODUÇÃO GERAL......................................................................................................11 2. OBJETIVOS.........................................................................................................................12 3. REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................................12 3.1. Metabolismo primário e especializado........................................................................12 3.2. Família Annonaceae....................................................................................................14 3.3 Atividades biológicas de compostos do metabolismo especializado do gênero Xylopia......................................................................................................................................15 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................................17 CAPÍTULO I: Modulação dos metabolismos primário e especializado de Xylopia aromatica (Lam.) Mart. nas épocas seca e chuvosa do cerrado paulista......................................................................................................................................22 Resumo......................................................................................................................................23 Abstract.....................................................................................................................................24 1. Introdução..............................................................................................................................25 2. Material e métodos.................................................................................................................27 Material vegetal e condições ambientais.................................................................................................................................27 Fluorescência da clorofila a................................................................................................29 Trocas gasosas....................................................................................................................30 Carboidratos, atividade enzimática e peroxidação lipídica.................................................30 Secagem das folhas e extração do óleo essencial................................................................31 Rendimento e caracterização da composição química do óleo essencial............................31 Extração, quantificação e perfil dos alcaloides benzilisoquinolínicos................................................................................................................31 3. Resultados.............................................................................................................................33 4. Discussão...............................................................................................................................48 9 5. Conclusão..............................................................................................................................53 6. Referências bibliográficas.....................................................................................................54 CAPÍTULO II: Terpenos e alcaloides de Xylopia aromatica (Lam.) Mart. com potencial atividade biológica....................................................................................................................62 Resumo......................................................................................................................................63 Abstract.....................................................................................................................................64 1. Introdução..............................................................................................................................65 2. Material e métodos.................................................................................................................66 Material vegetal ..................................................................................................................66 Secagem das folhas e extração do óleo essencial................................................................67 Caracterização da composição química do óleo essencial..................................................67 Extração, quantificação e perfil dos alcaloides benzilisoquinolínicos................................................................................................................67 3. Resultados.............................................................................................................................68 4. Discussão...............................................................................................................................69 5. Conclusão..............................................................................................................................74 6. Referências bibliográficas.....................................................................................................74 CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................................................80 10 Resumo Xylopia aromatica (Lam.) Mart., espécie pertencente à família Annonaceae, apresenta ampla distribuição no Brasil, sendo uma das espécies recomendadas para fins de recuperação de áreas degradadas de cerrado. O metabolismo vegetal é dividido em primário e especializado. O primário, é responsável pela síntese de carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, gerando energia e poder redutor a partir de reações de oxido-redução de compostos orgânicos. O metabolismo especializado, é responsável por produzir compostos vitais para as espécies vegetais, atuando como atrativos ou repelentes de polinizadores, na proteção contra radiação UV e poluição, estresse hídrico, sinalização intraespecífica, entre outros. Os metabólitos especializados, formados a partir de produtos gerados na fotossíntese, são responsáveis por expressar a individualidade das espécies, devido a sua grande plasticidade genética e diversidade, garantindo adaptações à mediação de fatores bióticos, relacionados a espécies de plantas e abióticos, relacionados ao ambiente em que a espécie se encontra. Existem diversos fatores capazes de influenciar a biossíntese desses compostos, levando a alterações no metabolismo especializado da planta, podendo alterar sua atividade biológica. A manutenção dos níveis normais de espécies reativas de oxigênio, em resposta a fatores bióticos e abióticos é fundamental para os mecanismos fisiológicos, como a regulação de vias de sinalização celular, ativação de genes e respostas de defesa. Sendo assim, o objetivo deste trabalho é avaliar se a atividade enzimática do sistema antioxidante e a síntese de carboidratos, terpenos e alcaloides de Xylopia aromatica produzidos na época seca diferem daqueles produzidos na época chuvosa e identificar compostos do metabolismo especializado com potencial atividade biológica. Palavras-chave: fotossíntese, terpenos, alcaloides, seca, chuva 11 Abstract Xylopia aromatica (Lam.) Mart., a species belonging to the Annonaceae family, has a wide distribution in Brazil, being one of the recommended species for the purpose of recovering degraded areas of cerrado. Plant metabolism is divided into primary and specialized. The primary one is responsible for the synthesis of carbohydrates, proteins, lipids and nucleic acids, generating energy and reducing power from oxidation-reduction reactions of organic compounds. Specialized metabolism is responsible for producing vital substances for plant species, acting as attractants or repellents for pollinators, protection against UV radiation and pollution, water stress, intraspecific signaling, among others. Specialized metabolites, formed from products generated in photosynthesis, are responsible for expressing the individuality of species, due to their great genetic plasticity and diversity, ensuring adaptations to the mediation of biotic factors, related to plant species and abiotic factors, related to the environment in which the species is found. There are several factors capable of influencing the biosynthesis of these compounds, leading to changes in the plant's specialized metabolism, which can alter its biological activity. Maintaining normal levels of reactive oxygen species in response to biotic and abiotic factors is fundamental for physiological mechanisms, such as the regulation of cell signaling pathways, gene activation and defense responses. Therefore, the objective of this work is to evaluate whether the enzymatic activity of the antioxidant system and the synthesis of carbohydrates, terpenes and alkaloids of Xylopia aromatica produced in the dry season differ from those produced in the rainy season and to identify specialized metabolism substances with potential biological activity. Keywords photosynthesis, terpenes, alkaloids, drought, rain 12 1. INTRODUÇÃO GERAL Xylopia aromatica (Lam.) Mart., popularmente conhecida como pimenta-de-macaco ou pindaíba, é uma espécie arbórea pertencente à família Annonaceae (LOPES et al., 2011; LORENZI, 2014) e apresenta ampla distribuição no Brasil, podendo ser encontrada nas regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e Centro-Sul (RATTER et al., 1996). É uma das espécies recomendadas para fins de recuperação de áreas degradadas situadas principalmente em locais com solos pobres e com déficit hídrico (SOCOLOWSKI et al., 2012). O metabolismo vegetal é dividido em primário e especializado. Como metabolismo primário, caracterizam-se os processos comuns à maioria das espécies vegetais, e que levam à síntese de carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, gerando energia e poder redutor a partir de reações de oxido-redução de compostos orgânicos (DE REZENDE et al., 2016). O metabolismo especializado, não está envolvido em processos geradores de energia, no entanto, compostos provenientes de vias especializadas também são vitais para as espécies vegetais, podendo atuar como atrativos ou repelentes de polinizadores, na proteção contra radiação UV e poluição, estresse hídrico, sinalização intraespecífica, alelopatia, entre outros (DIXON; PAIVA, 1995; GOBBO-NETO; LOPES, 2007; GONÇALVEZ; GUAZZELI, 2014). Os metabólitos especializados, formados a partir de produtos gerados na fotossíntese, são responsáveis por expressar a individualidade de famílias, gêneros e, até mesmo espécies vegetais, devido a sua grande plasticidade genética e diversidade, garantindo adaptações à mediação de fatores bióticos, relacionados a espécies de plantas e abióticos, relacionados ao ambiente em que a espécie se encontra (TRAPP; CROTEAU, 2001; SHAO et al., 2007; MOORE et al., 2014; DE REZENDE et al., 2016). Os compostos do metabolismo especializado são diversos, podendo existir mais de 200.000 metabólitos conhecidos (YANG et al., 2015), que são sintetizados a partir de precursores provenientes do metabolismo primário, principalmente a acetil coenzima A (acetil- CoA), ácido chiquímico, ácido mevalônico e o metileritritol fosfato. Os metabólitos especializados são sintetizados em diferentes compartimentos celulares, por quatro vias de biossíntese, sendo: via do acetato malonato, do ácido mevalônico (MEV), do metileritritol fosfato (MEP) e do ácido chiquímico (DEWICK, 2009; SIMÕES et al., 2010) e, por meio destas vias, é que são formados os três principais grupos de metabólitos especializados, os terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados (BORGES et al., 2017). Existem diversos fatores capazes de influenciar a biossíntese de metabólitos especializados, podendo interferir na sua qualidade e quantidade (TRAPP; CROTEAU, 2001; SHAO et al., 2011). Dentre eles, pode-se citar a época de coleta do material vegetal, considerado um dos fatores de maior importância, uma vez que a quantidade e, até mesmo a 13 natureza das substâncias, não são constantes durante o ano. Na literatura, são relatadas variações sazonais no conteúdo de várias classes de metabólitos especializados, como os óleos essenciais, flavonoides, alcaloides, entre outros (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Ainda, alguns fatores fisiológicos, como fotossíntese, abertura e fechamento estomático, mobilização de reservas e expansão foliar, podem ser alterados por falta de água, levando a alterações no metabolismo especializado (GOBBO-NETO; LOPES 2007) e, podendo alterar consequentemente, a atividade biológica desses compostos. 2. OBJETIVOS O objetivo deste trabalho é avaliar se a atividade enzimática do sistema antioxidante e a síntese de carboidratos, terpenos e alcaloides de Xylopia aromatica produzidos na época seca diferem daqueles produzidos na época chuvosa e identificar compostos do metabolismo especializado com potencial atividade biológica. 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. Metabolismo primário e especializado Todos os seres vivos necessitam sintetizar uma diversidade de substâncias para garantir sua sobrevivência e, apesar das suas diferenças morfológicas, utilizam-se de uma série de reações químicas, conhecida como rota metabólica. Em espécies vegetais, muitas dessas substâncias são essenciais para manutenção da espécie e são produzidas a partir do seu metabolismo primário, responsável pela síntese de carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucleicos, gerando energia e poder redutor a partir de reações de oxido-redução de compostos orgânicos. Em contrapartida, existem rotas metabólicas responsáveis por originar substâncias que não estão envolvidas em processos fundamentais na manutenção da vida, mas que desempenham papel importante na interação das plantas e o ambiente em que se encontram, atuando na defesa vegetal, na proteção contra agentes bióticos e abióticos e auxiliando na reprodução (DEWICK, 2009; PAGARE et al., 2015; DE REZENDE et al., 2016). Há uma diversidade de metabólitos especializados, sintetizados em diferentes compartimentos celulares, por quatro vias de biossíntese, a via do acetato malonato, do ácido mevalônico (MEV), do metileritritol fosfato (MEP) e do ácido chiquímico. Através dessas vias são formados os três principais grupos de metabólitos especializados, os terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados (DEWICK, 2009; SIMÕES et al., 2010) (Figura 1). 14 Figura 1. Principais etapas envolvidas na biossíntese dos metabólitos especializados. Fonte: Adaptada de Simões e colaboradores, 2010. Apesar de existir uma regulação genética por trás dos indivíduos, a biossíntese dos metabólitos especializados representa a interação química entre a espécie vegetal e o ambiente em que se encontra, uma vez que, esses metabólitos desempenham papéis biológicos como resposta a adaptação ao meio. Sendo assim, dependendo das condições e dos estímulos ambientais em que a espécie se encontra, diferentes compostos poderão ser sintetizados em função do redirecionamento de vias metabólicas responsáveis pela produção desses compostos (DEWICK, 2009; GOBBO-NETO; LOPES, 2007; BORGES et al., 2017). Dentre os estímulos ambientais associados às alterações na síntese de metabólitos especializados, destacam-se fatores bióticos como a interação entre as plantas e outros organismos, idade e o estádio de desenvolvimento da planta e o seu ciclo circadiano; e fatores abióticos como, temperatura, umidade, intensidade da luz, sazonalidade, disponibilidade de nutrientes, água e CO2 (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Nesse contexto, fatores climáticos, como temperatura e precipitação, têm sido apontados como importantes influencias na produção e acúmulo de metabólitos especializados em várias plantas aromáticas (BOTREL, 2010). Em estudo com Xylopia sericea St. HiII., a sazonalidade e disponibilidade de água no solo interferiu no seu metabolismo especializado, mostrando-se efetivo durante a estação seca (DE MACEDO MARTINS, 2012). De acordo com Sampaio et al. (2016), a falta de água pode ocasionar em um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), aumentando a síntese de compostos fenólicos como mecanismo de defesa do vegetal. 15 Em sistemas biológicos, as ERO são constantemente geradas pelo metabolismo celular, como subprodutos de diferentes vias metabólicas que ocorrem em compartimentos celulares que apresentam alto fluxo de elétrons, como mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos. A manutenção dos níveis normais de espécies reativas de oxigênio é fundamental para os mecanismos fisiológicos, como a regulação de vias de sinalização celular, ativação de genes e respostas de defesa (BARBOSA et al., 2010; DE REZENDE et al., 2016; XU et al., 2017). As espécies vegetais como organismos sésseis estão constantemente submetidas a estresses ambientais, ocorrendo a produção de ERO, geradas principalmente pelo transporte de elétrons. De forma a controlar sua produção e evitar seu efeito tóxico, às células vegetais apresentam um sistema antioxidante presente na maioria de seus compartimentos que visa a eliminação das ERO. Este sistema inclui tanto componentes enzimáticos como não-enzimáticos (CAO et al., 2015; DE REZENDE et al., 2016). No sistema antioxidante enzimático, ocorre a ativação de enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase e peroxidases, que podem ser utilizadas como sinalizadores moleculares (VRANOVA; INZE; BREUSEGEM, 2002; SELMAR; KLEINWÄCHTER, 2013). Além disso, a peroxidação lipídica é a variável que confirma o nível de estresse e a eficiência do sistema antioxidante na sua contenção, uma vez que, permite monitorar o dano causado por ERO com o acúmulo de malondialdeído (APEL; HIRT, 2004). As espécies vegetais também possuem sistema antioxidante não enzimático exercido por substâncias do metabolismo especializado, como alcaloides, flavonoides e terpenos (DE REZENDE et al., 2016). Além disso, as mudanças climáticas recentes têm intensificado as condições de seca e chuvas intensas, impactando também a fotossíntese, produção de energia, síntese e transporte de moléculas e íons nas plantas (MARTINAZZO et al., 2013). Plantas em ambientes de estresse hídrico, por exemplo, tendem a evitar a perda excessiva de água regulando sua condutância estomática e aumentando a eficiência do uso da água (EUA), que pode variar conforme as condições ambientais (HESCHEL et al., 2002; YAN et al., 2010). A fotossíntese em plantas em condições de seca é inibida principalmente pela menor assimilação de CO2 devido à menor condutância estomática (YAN et al., 2010). 3.2. Família Annonaceae A família Annonaceae pertence ao grupo Eudicotiledôneas e compreende aproximadamente 110 gêneros e 2400 espécies (SOUZA; LORENZI, 2008; CHATROU et al., 2012). No Brasil, estão registrados cerca de 30 gêneros e 260 espécies, presentes em praticamente todas as formações vegetais (SOUZA; LORENZI, 2008). De forma geral, as 16 espécies de anonáceas são de hábito arbóreo, folhas alternadas, dísticas, simples, sem estipulas, margem inteira e veneção peninérvea. Inflorescência cimosa, flores geralmente grandes, vistosas e bissexuadas, diclamídeas; fruto apocárpico ou sincárpico (LOBÃO et al., 2005; JUDD et al., 2009). Annonaceae desempenha um papel ecológico importante em termos de diversidade de espécies, especialmente em ecossistemas de florestas tropicais (DE SOUZA et al., 2015). No Brasil, a família tem ocorrência confirmada em todos os estados, sendo aqui descritas cerca de 380 espécies, distribuídas em 32 gêneros. O bioma Amazônia contém três quartos de todas as espécies de Annonaceae. Enquanto isso, a Mata Atlântica abriga 98 espécies e o Cerrado possui aproximadamente 52 (LOBÃO et al., 2020). Economicamente, diversos gêneros da família Annonaceae são de grande importância como fonte de grupos comestíveis e matéria prima para cosméticos, perfumaria e plantas medicinais (LORENZI, 1998; JOHNSON et al., 2000; PIMENTA et al., 2003; FERREIRA et al., 2020). Muitas espécies possuem fragrância devido à presença de óleos essenciais e aromas, que ocorrem na madeira, casca, folhas, flores, frutos e raiz (YOLANDA RÍOS et al., 2003; ALMEIDA et al., 2010; LIMA et al., 2015). Entre os gêneros de Annonaceae mais estudados, destacam-se Annona spp., Duguetia spp. e Xylopia spp., pois os diversos produtos vegetais, e as substâncias isoladas a partir destes, demonstraram potencial atividade biológica (LIMA et al., 2015). A maioria dos estudos realizados com óleos essenciais de Annonaceae ocorrendo no Brasil, publicados entre os anos de 2011 e 2021, foram realizados com espécies pertencentes aos gêneros Annona, Guatteria e Xylopia (CASCAES et al., 2021). Até o momento, cerca de 100 constituintes químicos voláteis (> 5%) foram obtidos a partir de óleos essenciais de espécies de Annonaceae coletadas no Brasil. Entre estes compostos, α-pineno, β-pineno, limoneno, (E)-cariofileno, biciclogermacreno, óxido de cariofileno, germacreno D, espatulenol e β-elemeno são os mais abundantes (CASCAES et al., 2021). O óleo essencial da espécie Annona cherimola, isolado de folhas, flores e frutos, apresentou ação antimicrobiana contra cepas de Staphylococcus aureus, Enterecoccus faecalis, Escherichia coli, Shigella sonnei, Proteus mirabilis e Candida albicans (YOLANDA RÍOS et al., 2003). Estudo realizado com óleos essenciais obtidos das folhas de Annona crassiflora revela atividade antifúngica frente a cepas de Candida albicans, C. tropicalis, C pseudotropicalis, dentre outros (LIMA; FARIAS, 1994). Além disso, os óleos essenciais de Duguetia gardneriana Mart. e D. moricandiana Mart. foram ativos contra linhagens de Candida guilliermondii e C. albicans, respectivamente (YOLANDA RÍOS et al., 2003; ALMEIDA et al., 2010). As espécies Annona muricata L., semelhantes a outras espécies de 17 Annona, incluindo A. squamosa L. e A. reticulata L., são amplamente utilizadas na medicina tradicional contra uma variedade de doenças, especialmente câncer e infecções parasitárias. Os frutos de A. muricata são usados como remédio natural para doenças como nevralgia, artrite, diarreia, disenteria, febre, malária, parasitas, reumatismo, erupções cutâneas e vermes. Além disso, muitas mulheres comem a fruta para aumentar a produção de leite materno após o parto. As folhas desta espécie são usadas para tratar cistite, diabetes, dores de cabeça e insônia. O extrato feito das folhas tem efeitos anti-reumáticos e neurológicos, enquanto as folhas cozidas são utilizadas no tratamento de abscessos e reumatismo (MOGHADAMTOUSI et al., 2015). Algumas espécies de Guatteria são utilizadas na medicina tradicional; no Norte do Brasil, as sementes de G. ouregou (Aubl.) Dunal são usadas para tratar dispepsia, dores de estômago e dores uterinas (MAIA et al., 2005). A espécie Duguetia furfuracea (A.St.-Hil.) Saff. é conhecido como “araticum-seco”. Na medicina popular, o pó de suas sementes é misturado com água para uso no tratamento de pediculose, enquanto uma infusão de suas folhas e galhos é usada para tratar reumatismo (DA SILVA et al., 2007). Duguetia lanceolata A.St.- Hil. , popularmente conhecida como pindaíba, beribá ou pinhão, é uma espécie perene distribuída em vários estados do Brasil; na medicina popular, essa planta tem sido usada como antiinflamatório, cicatrizante e como agente antimicrobiano (SOUSA et al., 2012). 3.3. Atividades biológicas de compostos do metabolismo especializado do gênero Xylopia Xylopia é um dos 33 gêneros da família Annonaceae existentes no Brasil (LORENZI, 2002) que se destaca por apresentar 150 espécies amplamente distribuídas em diversas partes do mundo (BRUMMITT, 1992). Do ponto de vista químico, esse gênero tem sido exclusivamente estudado devido às numerosas espécies odoríferas. Dentre as espécies, destaca-se a Xylopia aromatica (Lam.) Mart. (Annonaceae), conhecida popularmente como pimenta-de-macaco (MAIA et al., 2005), uma espécie arbórea cujos frutos podem ser utilizados como tempero (RIOS; PASTORES, 2011). É recomendada para a recuperação de áreas degradadas de "Cerrado" no estado de São Paulo (Resolução SMA nº 47/2003). Além disso, suas folhas, flores e frutos possuem óleo essencial, rico em mono e sesquiterpenos (LAGO et al., 2003; ANDRADE et al., 2004; MAIA et al., 2005). Alguns estudos mostram que a composição e rendimento do óleo essencial variam em função do órgão de interesse e localização das plantas. Plantas de Xylopia aromatica coletadas no estado do Pará, Brasil, revelaram nas flores e frutos a presença de limoneno (44% e 36%), α-pineno (24% e 19%) e β-pineno (16% e 13%). Biciclogermacreno (36,5%) e espatulenol 18 (20,5%) foram majoritários nas folhas (ANDRADE et al., 2004, MAIA et al., 2005). Em folhas frescas de X. aromatica coletadas no cerrado em Araraquara, São Paulo, Brasil, foram derteminados α-pineno (26%), limoneno (22%), biciclogermacreno (20%) e β-pineno (19%), com rendimento de óelo essencial de 0,08% (LAGO et al., 2003). No Brasil, espécies vegetais do Cerrado, Mata Atlântica e Floresta Amazônica têm sido estudadas e utilizadas como medicamentos para o tratamento de doenças, incluindo infecções causadas por fungos e bactérias. Isso acontece devido ao grande número de constituintes químicos encontrados nessas espécies que são responsáveis pela atividade biológica, em especial, antibacteriana e antifúngica (LIMA et al., 2015). Alguns microrganismos têm se mostrado resistentes diante da utilização de alguns medicamentos antifúngicos sintéticos (KHAN et al., 2009). Devido a isso, surge o interesse de identificar substâncias alternativas ao uso de medicamentos tradicionais. Dessa forma, foram e estão sendo desenvolvidos muitos trabalhos científicos que revelam a atividade biológica de óleos essenciais. Neste contexto, plantas do gênero Xylopia se destacam na busca de novos bioativos devido aos inúmeros compostos especializados presentes (PIMENTA et al., 2009). Existem relatos encontrados na literatura demonstrando o potencial antimicrobiano do gênero Xylopia. Em estudo recente, óleos essenciais de sementes secas de X. aethiopica apresentaram excelente atividade contra Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis e Candida albicans e atividade moderada contra Escherichia coli (NDOYE et al., 2024). Os óleos essenciais de X. aethiopica e X. parviflora foram testados e foram ativos contra Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Escherichia coli (HASSAN et al., 2014; WOGUEM et al., 2014) Alguns fungos dermatófitos como Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum spp. tiveram seu crescimento inibido pelo óleo essencial das folhas de Xylopia frutescens Aubl. (LIMA et al., 1992). Em estudo recente, a composição química e a atividade antimicrobiana de óleos essenciais de flores e folhas de Xylopia aromatica foram testados. Os principais compostos identificados no óleo essencial das folhas foram: espatulenol (27,11%), khusinol (13,04%), biciclogermacreno (8,52%), globulol (6,47%), cis-guaia-3,9-dien-11-ol (5,98%), 2-epi-α- cedren-3-ona (4,69 %) e elemicina (4,32 %). O óleo essencial das flores apresentou pentadecan- 2-ona (16,38%), biciclogermacreno (9,74%), 7-epi-α-eudesmol (7,76%), khusinol (7,23%), n- tricosano (6,17%), heptadecan-2-ona (5,83%), entre outros. Em relação a atividade biológica, as menores concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram observadas frente à Streptococcus pyogenes (200 e 100 μg mL-1) para as flores e folhas, respectivamente. Quanto ao potencial antifúngico, o óleo essencial das folhas apresentou atividade moderada (500 μg mL-1) frente à Candida albicans (DO NASCIMENTO et al., 2018). 19 Além disso, os alcaloides são um dos compostos isolados com mais frequência em espécies de Xylopia. Dímeros de benzilisoquinolina foram isolados de X. columbiana (GRANELL et al., 2004) e de X. parviflora (NISHIYAMA et al., 2006). O fracionamento guiado por bioensaios do extrato das partes aéreas de X. aethiopica levou ao isolamento de oxofebebina e liriodenina (HARRIGAN et al., 1994). Nishiyama et al. (2006), estudaram a atividade antinociceptiva da casca de X. parviflora e investigaram os principais alcaloides das frações que apresentaram efeitos significativos, como (+)-glaucina e (+)-corituberina que exibiram fortes efeitos analgésicos. Os estudos acima registrados desmonstram potencial atividade biológica do óleo essencial e alcaloides do gênero Xylopia, incluindo a espécie Xylopia aromatica. No entanto, a literatura não traz referências que relacionam o metabolismo primário e o especializado, de forma a destacar a influência das épocas seca e chuvosa na composição química e potencial atividade biológica das substâncias encontradas no perfil do óleo essencial e dos alcaloides. 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALEXIEVA, V. et al. The effect of drought and ultraviolet radiation on growth and stress markers in pea and wheat. Plant, Cell & Environment, v. 24, n. 12, p. 1337–1344, 2001. ANDRADE, E. H. A. et al. 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Mart. nas épocas seca e chuvosa no cerrado paulista 24 Resumo Xylopia aromatica (Lam.) Mart., é uma espécie arbórea característica do Cerrado, encontrada também em Cerrado Amazônico e Floresta Estacional Decidual e recomendada principalmente para recuperação de áreas degradadas do Cerrado. As plantas são capazes de produzir substâncias diversas que desempenham funções importantes para sua sobrevivência e adaptação ao ecossistema, contribuindo para proteção contra estresses abióticos e bióticos, causado pela variação da intensidade das chuvas, temperatura, luminosidade, competição com outras plantas, pragas, doenças e herbívoros. Esses fatores ambientais podem influenciar o metabolismo primário das plantas e, consequentemente, o metabolismo especializado, alterando a produção e o perfil químico dos metabólitos. O crescente interesse de diversos setores industriais por matérias-primas alternativas, tem incentivado estudos envolvendo a caracterização do perfil químico dos óleos essenciais e de outros metabólitos especializados e a possível influência de fatores bióticos e abióticos na porcentagem relativa desses compostos. Sendo assim, este estudo teve como objetivo avaliar se a atividade enzimática e a síntese de carboidratos, alcaloides e terpenos de Xylopia aromatica produzidos na época seca diferem daqueles produzidos na época chuvosa. As variáveis, fluorescência da clorofila a, trocas gasosas, açúcares solúveis totais e amido, atividade enzimática do sistema antioxidante, extração, rendimento e caracterização química do óleo essencial, extração, perfil químico e quantificação dos alcaloides de Xylopia aromatica foram avaliadas em 20 plantas, coletadas nas épocas seca e chuvosa, em 2021 e reamostradas em 2022. Plantas coletadas em épocas secas de 2021 e 2022 apresentaram diferenças em relação à eficiência quântica, dissipação de energia, quenching fotoquímico e trocas gasosas. Em 2021 houve indícios de acionamento de mecanismos de fotoproteção, em 2022, houve potencial dano nos fotossistemas, com maior acúmulo de energia e menor produção de agentes redutores. Apesar disso, plantas coletadas em 2022 apresentaram maior eficiência no uso da água, indicando maior controle estomático. O rendimento do óleo essencial foi maior na época seca do ano de 2021, possivelmente devido à maior eficiência de carboxilação da RuBisCO com maior oferta de esqueletos carbônicos para síntese de terpenos. A composição química do óleo essencial e a produção de alcaloides variaram de acordo com as épocas de coleta, refletindo a influência das condições ambientais na síntese de metabólitos especializados. Palavras-chaves: fotossíntese, óleo essencial, alcaloides, disponibilidade hídrica, sistema antioxidante 25 Abstract Xylopia aromatica (Lam.) Mart., is a tree species characteristic of the Cerrado, also found in the Amazonian Cerrado and Seasonal Deciduous Forest and recommended mainly for the recovery of degraded areas of the Cerrado. Plants are capable of producing diverse substances that perform important functions for their survival and adaptation to the ecosystem, contributing to protection against abiotic and biotic stresses, caused by variations in rainfall intensity, temperature, light, competition with other plants, pests, diseases and herbivores. These environmental factors can influence the primary metabolism of plants and, consequently, the specialized metabolism, altering the production and chemical profile of metabolites. The growing interest of several industrial sectors in alternative raw materials has encouraged studies involving the characterization of the chemical profile of essential oils and other specialized metabolites and the possible influence of biotic and abiotic factors on the relative percentage of these compounds. Therefore, this study aimed to evaluate whether the enzymatic activity and synthesis of carbohydrates, alkaloids and terpenes of Xylopia aromatica produced in the dry season differ from those produced in the rainy season. The variables, chlorophyll a fluorescence, gas exchange, total soluble sugars and starch, enzymatic activity, extraction, yield and chemical characterization of the essential oil, extraction and quantification of alkaloids from Xylopia aromatica were evaluated in 20 plants, collected in the dry and rainy seasons, in 2021 and 2022. Plants collected in dry seasons of 2021 and 2022 showed differences in relation to quantum efficiency, energy dissipation, photochemical quenching and gas exchange. In 2021 there were signs of activation of photoprotection mechanisms, in 2022, there was potential damage to photosystems, with greater energy accumulation and lower production of reducing agents. Despite this, plants collected in 2022 showed greater water use efficiency, indicating greater stomatal control. The essential oil yield was higher in the dry season of 2021, possibly due to the greater carboxylation efficiency of RuBisCO with a greater supply of carbonic skeletons for terpene synthesis. The chemical composition of the essential oil and the production of alkaloids varied according to the collection times, reflecting the influence of environmental conditions on the synthesis of specialized metabolites. Keywords: photosynthesis, essential oil, alkaloids, water availability, antioxidant system 26 1. INTRODUÇÃO Xylopia aromatica (Lam.) Mart. (Annonaceae), popularmente conhecida como pimenta-de-macaco, embira, pindaíba e pimenta-de-bugre, é uma espécie arbórea característica do Cerrado, encontrada também em Cerrado Amazônico e Floresta Estacional Decidual (JUNQUEIRA et al., 2021; MAIA et al., 2005). É recomendada principalmente para recuperação de áreas degradadas do Cerrado no estado de São Paulo, Brasil (Resolução SMA nº 47/2003). Suas folhas, flores e frutos possuem óleo essencial rico em monoterpenos e sesquiterpenos (FOURNIER et al., 1994; LAGO et al., 2003; MAIA et al., 2005). Seus frutos, sementes, cascas e folhas são utilizados popularmente como vermífugo, antitérmico, no tratamento de cefaléia e processos inflamatórios renais (FAGUNDES et al., 2017; JESUS et al., 2020; MAIA, 2013; PASTORE, 2011). O metabolismo primário, que consome grande parte da energia produzida pela planta, é essencial para o crescimento, desenvolvimento, maturação e reprodução de qualquer espécie vegetal e envolve fotossíntese, respiração e transporte de nutrientes na planta. Já o metabolismo especializado, dependente do primário, é responsável por originar os metabólitos especializados, cuja composição é característica para cada espécie (GONÇALVEZ; GUAZZELLI, 2014). A produção dos metabólitos especializados depende de compostos sintetizados no metabolismo primário, que está relacionado à produtividade das plantas, determinada pela quantidade de folhas e consequentemente pela capacidade fotossintética (DE FAZIO, 2011). As plantas são capazes de produzir substâncias diversas, pertencentes a diferentes classes químicas, que desempenham funções importantes para sua sobrevivência e adaptação ao ecossistema, contribuindo também para sua proteção contra estresses abióticos e bióticos, que pode ser causado pela variação da intensidade das chuvas, temperatura, luminosidade, competição com outras plantas, pragas, doenças e herbívoros (ALVAREZ-CASTELLANOS; BISHOP; PASCUAL-VILLALOBOS, 2001.; ARIMURA; MATSUI; TAKABAYASHI, 2009). Esses fatores ambientais podem influenciar o metabolismo primário das plantas e, consequentemente, o metabolismo especializado, alterando a produção e o perfil químico dos metabólitos especializados (MACHADO et al., 2017). Sob condições de estresse, espécies reativas de oxigênio (ERO), moléculas formadas durante funções metabólicas normais em cloroplastos, mitocôndrias e peroxissomos (CAO et al., 2015), são geradas durante o sistema de transporte de elétrons, causando danos celulares ou atuando como moléculas sinalizadoras que ativam múltiplas respostas de defesa. Enzimas 27 antioxidantes, incluindo superóxido dismutase e peroxidases, podem reverter o estresse oxidativo (SPYCHALLA; DESBOROUGH, 1990). O monitoramento dessas enzimas e da peroxidação lipídica podem ser utilizados como marcadores moleculares (ENRILE et al., 2016) acompanhando os danos causados por ERO com acúmulo de malondialdeído (APEL; HIRT, 2004), para avaliação do nível de estresse em plantas. Estudos fitoquímicos mostraram que o gênero Xylopia apresenta várias classes de substâncias que pertencem ao metabolismo especializado, como terpenos, amidas, lignoides, alcaloides e acetogeninas (MAIA et al., 2005; FOURNIER et al., 1994; MOREIRA; LAGO; ROQUE, 2003; SILVA et al., 2015). Nascimento et al., 2018, avaliaram o perfil químico e a atividade antimicrobiana e antifúngica do óleo essencial de flores e folhas de Xylopia aromatica, no qual os compostos majoritários foram espatulenol, khusinol, biciclogermacreno, para folhas, e pentadecano-2-ona, biciclogermacreno, 7-epi-α-eudesmol e khusinol para flores. O óleo essencial de folhas e flores apresentou menores concentrações inibitórias mínimas (CIM) para Streptococcus pyogenes (200 e 100 μg mL-1) e o óleo essencial das folhas apresentou atividade moderada (500 μg mL-1) para Candida albicans. Outros estudos realizados com óleos essenciais extraídos de Xylopia aromatica também revelaram atividade antifúngica e antimicrobiana (ALCÂNTARA et al., 2017; FOURNIER et al., 1994; NASCIMENTO et al., 2018). Os alcaloides também são um dos compostos isolados com mais frequência em espécies de Xylopia. Dímeros de benzilisoquinolina foram isolados de X. columbiana (GRANELL et al., 2004), de X. parviflora (NISHIYAMA et al., 2006) e de X. aethiopica (HARRIGAN et al., 1994). Além da importância ecológica dos metabólitos especializados, o interesse de alguns setores industriais por matérias-primas alternativas, tem incentivado estudos envolvendo a caracterização do perfil químico dos óleos essenciais e de outros metabólitos especializados e a possível influência de fatores bióticos e abióticos na porcentagem relativa desses compostos (BAKKALI et al., 2008; FERRAZ et al., 2013). Nesse contexto, os efeitos da chuva e seca na concentração de metabólitos especializados devem ser considerados, uma vez que, esses podem ser fatores capazes de influenciar a caracterização do perfil químico desses metabólitos (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Sendo assim, este estudo teve como objetivo investigar se a atividade enzimática do sistema antioxidante e a síntese de carboidratos, terpenos e alcaloides de Xylopia aromatica produzidos na época seca diferem daqueles produzidos na época chuvosa. 28 2. MATERIAL E MÉTODOS Material vegetal e condições ambientais Foram estudadas folhas de 20 plantas de Xylopia aromatica (Lam.) Mart (Figura 1), localizados em remanescentes de Cerrado stricto sensu em área do município de Santa Fé do Sul, São Paulo, Rodovia dos Barrageiros, coordenadas 20°12'57.6"S, 50°54'28.8"W (Figura 2), cujas características ambientais podem ser observadas na figura 3 e tabelas 1 e 2. As coletas foram realizadas nos dias 11 e 12 de março de 2021, 25 e 26 de agosto de 2021, 23 e 24 de março de 2022 e 24 e 25 de agosto de 2022. Os 20 indivíduos foram avaliados nas épocas seca e fria e chuvosa e quente, totalizando quatro coletas (duas na época seca e duas na época chuvosa). Após a realização do estudo do desempenho fotossintético, amostras de folhas foram coletadas e avaliadas junto aos laboratórios do Departamento de Biodiversidade e Bioestatistica, setor de Biologia Vegetal do Instituto de Biociências (IBB) e do Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Material botânico fértil (ramos com flores e frutos) foi coletado para confecção de exsicatas que foram depositadas (voucher 33159) no Herbário “Irina Delanova de Gemtchújnicov - BOTU” Departamento de Biodiversidade e Bioestatistica, setor de Biologia Vegetal, Instituto de Biociências de Botucatu (IBB – UNESP). As caracterisiticas químicas do solo na localidade onde foram coletadas as 20 plantas de Xylopia aromatica, na estação chuvosa (março/2021 e março/2022) e na estação seca (agosto/2021 e agosto/2022), estão apresentadas na tabela 2. Figura 1. (A) Xylopia aromatica; (B) Flor de Xylopia aromatica; (C) Fruto maduro de Xylopia aromatica. A B C 29 Figura 2. Localização da área de coleta, no município de Santa Fé do Sul, Rodovia dos Barrageiros, coordenadas 20°12'57.6"S, 50°54'28.8"W, São Paulo. Figura 3. Precipitação (mm) de Santa Fé do Sul, São Paulo, no período compreendido entre janeiro de 2021 e dezembro de 2022. Dados registrados em localidade próxima ao campo de coleta. 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 ja n /2 1 fe v/ 2 1 m ar /2 1 ab r/ 2 1 m ai /2 1 ju n /2 1 ju l/ 2 1 ag o /2 1 se t/ 2 1 o u t/ 2 1 n o v/ 2 1 d e z/ 2 1 ja n /2 2 fe v/ 2 2 m ar /2 2 ab r/ 2 2 m ai /2 2 ju n /2 2 ju l/ 2 2 ag o /2 2 se t/ 2 2 o u t/ 2 2 n o v/ 2 2 d e z/ 2 2 P re ci p it aç ão p lu vi o m ét ri ca ( m m ) 30 Tabela 1. Médias referentes a temperatura da folha, temperatura ambiente e DFFFA (densidade do fluxo de fótons fotossinteticamente ativos) no momento de cada coleta (época seca e chuvosa, em 2021 e 2022) de plantas de Xylopia aromatica, na região de Santa Fé do Sul, São Paulo. Dados obtidos por meio do equipamento “Infra Red Gas Analyser – IRGA”, modelo GSF 3000, Walz. Estação/Ano Tfolha Tamb DFFFA ºC ºC µmol m-2 s-1 Chuva/2021 29,30 28,50 685,10 Seca/2021 33,80 33,55 952,33 Chuva/2022 30,81 30,64 1315,59 Seca/2022 26,43 25,87 512,40 Tabela 2. Características químicas do solo na estação chuvosa (março/2021 e março/2022) e na estação seca (agosto/2021 e agosto/2022), da região de Santa Fé do Sul, São Paulo. Dados fornecidos por meio de análise realizada no Departamento de Solos e Recursos Ambientais. Estação/Ano pH M.O. Presina Al3+ H+Al K Ca Mg SB CTC V% B Cu Fe Mn Zn CaCl2 g/dm3 mg/dm3 ----------------mmolc/dm3 ---------------- ---------mg/dm3------------ Chuva/2021 5,0 10 7 0 19 2,9 15 9 26 45 58 0,18 0,8 43 10,7 1,2 Seca/2021 4,8 13 7 0 21 3,4 14 9 27 48 56 0,16 0,5 35 19,0 1,2 Chuva/2022 4,8 10 6 0 22 2,7 14 8 25 47 53 0,16 0,8 41 9,7 1,1 Seca/2022 5,1 13 5 0 17 2,6 17 9 28 45 62 0,21 0,5 40 10,2 1,3 Delineamento experimental Na área de estudo entre 40 indivíduos de Xylopia aromatica foram sorteados 20 espécimes. Delimitamos como época seca, a estação do inverno, com baixa temperatura e umidade relativa do ar e como época chuvosa, a estação do verão, com temperatura e umidade relativa do ar elevadas. CARACTERÍSTICAS AVALIADAS Fluorescência da clorofila a As medidas de fluorescência da clorofila a foram realizadas em 20 indivíduos de X. aromatica, entre 9:00 e 11:00 horas, em dia ensolarado, com fluorômetro portátil de luz LED- Array/PAM-Fluorometer 3055-FL, Walz, sob irradiância de saturação de 4500 μmol m-2 s-1. Foram determinados eficiência quântica potencial (Fv’/Fm’), captação de luz realizada pelo fotossistema II, eficiência quântica efetiva do (Fotossistema II) FSII (ΦPSII), cujo valor se relaciona à estimativa do nível de NADPH+H+, taxa de transporte de elétrons no 31 Fotossistema II (ETR = DFFF * ΔF/Fm’ * 0,5 * 0,84), fração de luz absorvida pela antena FSII que é dissipada como calor (D=1-Fv’/Fm’) e fração de energia de excitação não dissipada na antena que não pode ser utilizada para a fase fotoquímica (Ex= (1- qP)*(Fv’/Fm’) (DEMMIG- ADAMS et al., 1996). Trocas gasosas As avaliações de trocas gasosas foram realizadas, nos mesmos indivíduos, utilizando-se equipamento com sistema aberto de fotossíntese com analisador de CO2 e vapor d’água por radiação infra-vermelha (“Infra Red Gas Analyser – IRGA”, modelo GSF 3000, Walz). Tais medidas foram estimadas a partir da diferença entre a concentração de CO2 e vapor d’água do ar da referência (valor presente na câmara sem a folha) e da amostra (valor com a folha presente na câmara), obtendo-se as concentrações de vapor d’água e CO2 que foram liberados (transpiração – vapor d’água) e assimilados (assimilação de CO2) pelos estômatos das folhas. As medidas foram realizadas entre 9:00 e 11:00 horas, em dia ensolarado. As características de trocas gasosas analisadas foram: taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m -2s-1), taxa de transpiração (E, mmol vapor d’água m-2s-1), condutância estomática (gs, mmol m-2s-1) e concentração interna de CO2 na folha (Ci, µmol CO2 mol-1ar). A eficiência do uso da água (EUA, µmol CO2 (mmol H2O)-1) foi determinada por meio da relação entre assimilação de CO2 e taxa de transpiração (A/E), descrita por Berry e Downton (1983). A eficiência de carboxilação da Ribulose 1,5-difosfato carboxilase/oxigenasse (RuBisCO) foi determinada pela relação da taxa de assimilação de CO2 com a concentração interna de CO2 na câmara subestomática (Anet/Ci, umol m-2 s-1Pa-1). Carboidratos, atividade enzimática, peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica Para estas determinações foram coletadas 10 folhas totalmente expandidas, por planta. A coleta foi realizada tomando-se os cuidados necessários para minimizar a degradação das enzimas pela luz. As amostras foram envolvidas em papel alumínio e acondicionadas em sacos plásticos e, em seguida, congeladas em nitrogênio líquido para paralisar todas as reações. Os açúcares solúveis totais (MORRIS, 1948, YEMM; WILLIS, 1954) e amido (CLEGG, 1956) foram quantificados. O teor de proteínas totais solúveis foi determinado pelo método proposto por Bradford (1976). As leituras foram efetuadas em espectrofotômetro a 595 nm e comparadas com a curva- padrão de caseína a 1%, sendo o teor proteico da amostra expresso em mg de proteína g-1 de matéria fresca. 32 A determinação da atividade da peroxidase foi realizada de acordo com o método espectrofotométrico proposto por Teisseiree Guy (2000). A atividade específica da peroxidase será expressa em μmoles de H2O2 decomposto min-1mg-1 de proteína. A determinação da atividade da superóxido dismutase foi determinada de acordo com o método proposto por Giannopolitis e Ries (1977). O nível de peroxidação de lipídeos foi avaliado utilizando a metodologia de Heath e Packer (1968) e peróxido de hidrogênio conforme Alexieva et al. (2001). Óleo essencial Secagem das folhas e extração de óleo essencial Foram coletados ramos de diferentes posições dos 20 indivíduos de Xylopia aromatica. As folhas foram separadas dos ramos e secas em temperatura ambiente durante 15 dias, tempo suficiente para secagem e facilidade de seu acondicionamento no aparato tipo Clevenger. Os óleos essenciais das folhas foram extraídos por hidrodestilação em aparato tipo Clevenger, por 2 horas, sendo, a seguir, armazenados em frascos de vidro (Vial, 5 mL) e mantidos no freezer até a análise da composição química. Rendimento e caracterização da composição química do óleo essencial O rendimento foi determinado, de acordo com a fórmula: Re = (MOE/MFolha) x 100. Onde: Re = Rendimento (%); MOE = Massa óleo extraído (g); MFolha = Massa das folhas secas (g). A análise qualitativa dos óleos essenciais foi conduzida em cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas, operando a 70 eV, dotado de coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm), hélio como gás de arraste (1,0 mL/min), injetor a 220ºC, detector a 230ºC. Foi utilizado o programa de temperatura de 60ºC-240ºC, 3ºC/min, efetuando-se as alterações de acordo com a eficiência de separação dos componentes da mistura. A identificação das substâncias foi realizada pela comparação de seus espectros de massas com o banco de dados do sistema (CG-EM); índices de Retenção (IR) e dados de literatura (ADAMS, 2007). Os índices de retenção (IR) das substâncias foram obtidos, pela análise nas mesmas condições operacionais das amostras de uma mistura de n-alcanos (C9-C40 - Sigma Aldrich 99%) e aplicando-se a equação de Van den Dool e Kratz (1963). 33 A análise quantitativa dos óleos essenciais para estudo da sua composição química foi conduzida por cromatografia gasosa com detector por ionização em chama (GC-DIC), empregando-se as mesmas condições operacionais das análises por CG-EM. Extração, quantificação e perfil dos alcaloides benzilisoquinolínicos A extração dos alcaloides totais foi realizada em amostras foliares de 15 plantas de Xylopia aromatica através de uma extração seletiva de ácido-base em material seco e moído. Foram utilizados 5g por amostra, que foram impregnadas com 30 mL de uma solução de Na2CO3 e secas por 48h em temperatura ambiente. Após a secagem os alcaloides foram extraídos com 100 mL de CHCL3 sob agitação constante durante 1h, as amostras foram filtradas e lavadas com água deionizada. A seguir, foi realizada a separação das fases, sendo a fase clorofórmio com uma solução saturada de 60 mL de 1 N de HCl, e a fase ácida preservada e alcalinizada com solução saturada de Na2CO3 até atingir pH 7, extraindo-se novamente com CHCl3 e as amostras foram secas com Na2SO4 anidro. Finalmente as amostras foram filtradas e evaporadas em um evaporador rotativo a baixa temperatura, obtendo-se os extratos de alcaloides totais. Após a evaporação completa do CHCl3 as amostras foram diluídas com um volume conhecido de mesmo solvente e avaliado em espectrofotômetro com fonte de luz ultravioleta e o conteúdo total de alcaloides foi determinado por espectrofotometria a 254 nm utilizando liriodenina como padrão na elaboração da curva padrão (y = 0,0881x - 0,0112, R = 0,9949) (GONZÁLEZ-ESQUINCA, 2011). Os extratos foram analisados e os perfis obtidos foram comparados com padrões pré existentes utilizando cromatógrafo líquido ultra-alto desempenho (UHPLC - Thermo Fisher- Scientific ®) com bomba de gradiente e detector UV-Vis com o uso de coluna de fase reversa C 18 (150 × 4,6 mm e 5 μm de diâmetro de partícula). A fase móvel utilizada foi água (pH 3,5 com ácido acético) e 30:70 isometanol crático, com taxa de fluxo de 1mL / min, mantendo a temperatura da coluna a 30 ° C. Forma de análise dos resultados Para verificar a normalidade e a homogeneidade de variância dos dados, foram aplicados os testes de Shapiro-Wilk e de Levene (ZAR, 2010). As variáveis avaliadas foram submetidas à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade (ZAR, 2010). Análises multivariadas foram realizadas para avaliar tendências sazonais do perfil químico do óleo essencial dos indivíduos, 34 coletados em 2021 e recoletados em 2022, usando o programa XLSTAT (2017) e MetaboAnalyst. 3. RESULTADOS Relações hídricas A umidade relativa foi maior na época chuvosa no ano de 2021. O déficit de pressão de vapor foliar foi maior na época seca no ano de 2021 e na época chuvosa no ano de 2022 (Figura 4). Figura 4. A. Umidade relativa (RH, %); B. déficit de pressão de vapor foliar (DPVf, kPa) de Xylopia aromatica, nas épocas seca e chuvosa coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). Fluorescência da clorofila a A eficiência quântica potencial adaptada a luz (Fv’/Fm’) foi maior na época chuvosa no ano de 2021 e na época seca no ano de 2022. A dissipação de calor no complexo antena (D) foi maior na época chuvosa no ano de 2022 e na época seca no ano de 2021. Não houve interação entre época e ano de coleta para as variáveis transporte fotoquímico de elétrons (øPSII) e taxa de transporte de elétrons (ETR), sendo essas variáveis maiores no ano de 2021 e na época chuvosa. O quenching fotoquímico (qP) foi menor na época seca no ano de 2022. A dissipação do excesso de energia do centro de reação do FSII (Ex) foi maior na época seca no ano de 2022 e na época chuvosa no ano de 2021 (Figura 5). 35 Figura 5. (A). Eficiência quântica potencial adaptada a luz (Fv’/Fm’); (B). Dissipação do excesso de energia do centro de reação do FSII (Ex); (C) e (D). Transporte fotoquímico de elétrons (øPSII); (E) e (F). Taxa de transporte de elétrons (ETR); (G). Quenching fotoquímico (qP); (H). Dissipação de calor no complexo antena (D) de Xylopia aromatica, nas épocas seca e chuvosa coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). 36 Trocas gasosas A taxa de assimilação de CO2 (A) foi maior na estação chuvosa nos dois anos de coleta. A taxa de transpiração (E) foi maior na época chuvosa no ano de 2022 e na época seca no ano de 2021. Não houve interação entre época (chuva e seca) e ano de coleta (2021 e 2022) para condutância estomática (gs), sendo esta variável maior no ano de 2021 e na época chuvosa. A concentração interna de CO2 na folha (Ci) foi menor na época seca no ano de 2021. A eficiência do uso da água (EUA) foi maior na época chuvosa de 2022 e na época seca de 2021. A eficiência de carboxilação da RuBisCO (Anet/Ci) foi menor na época seca de 2022 (Figura 6). 37 Figura 6. (A). Taxa de assimilação de CO2 (A, μmol CO2 m -2s-1); (B). Taxa de transpiração (E, mmol vapor d’água m-2s-1); (C) e (D). Condutância estomática (gs, mol m-2s-1); (E). Concentração interna de CO2 na folha (Ci, µmol CO2 molar-1); (F). Eficiência do uso da água (EUA, µmol CO2 (mmol H2O)-1); (G). Eficiência de carboxilação da RuBisCO (Anet/Ci, umol m-2 s-1Pa-1), em Xylopia aromatica, nas épocas seca e chuvosa, coletados em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). Carboidratos, atividade enzimática, peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica Tecidos foliares de plantas de Xylopia aromatica coletadas nas épocas chuvosa e seca, nos anos de 2021 e reamostradas em 2022, não apresentaram diferenças no teor de açúcares solúveis totais (p > 0,6419). O acúmulo de amido não diferiu quanto as épocas de coletas (chuva e seca), sendo maior no ano de 2022 (Figura 7). Figura 7. Teor de amido foliar de folhas (mg g-1 massa fresca) de Xylopia aromatica, coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). 38 Plantas de Xylopia aromatica coletadas na época chuvosa no ano de 2021 apresentaram menor teor de proteínas solúveis totais (Figura 8). Figura 8. Teor de proteínas solúveis totais em Xylopia aromatica, nas épocas seca e chuvosa, coletados em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). Não houve interação entre época (chuva e seca) e ano de coleta (2021 e 2022) para a atividade da superóxido dismutase (SOD), sendo esta variável maior no ano de 2021 e na época chuvosa (Figura 9). Para a enzima peroxidase (POD) houve interação entre os fatores estudados, sendo sua atividade maior nas épocas chuvosa no ano de 2021 e seca de 2022 (Figura 9). 39 Figura 9. Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e peroxidase (POD) de Xylopia aromatica, nas épocas seca e chuvosa, coletados em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). Plantas de Xylopia aromatica coletadas na época seca no ano de 2022, apresentaram menor peroxidação lipídica (Figura 10). Figura 10. Atividade da peroxidação lipídica (expresso pela formação de malonaldeído, MDA) de plantas Xylopia aromatica, nas épocas seca e chuvosa, coletados em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). Não houve interação entre época (chuva e seca) e ano de coleta (2021 e 2022) para o peróxido de hidrogênio (H2O2), apresentando-se maior em plantas coletadas no ano de 2021 e na época chuvosa (Figura 11). 40 Figura 11. Peróxido de hidrogênio (H2O2), µmol g −1 de massa fresca de plantas Xylopia aromatica, nas épocas seca e chuvosa, coletados em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). Rendimento e caracterização da composição química do óleo essencial A porcentagem relativa (%), índice de retenção da literatura, índice de retenção calculado, bem como valores mínimo e máximo das 44 substâncias encontradas no óleo essencial de Xylopia aromatica, coletadas na época chuvosa (CV) e seca (SC), em 2021 e reamostradas em 2022 estão apresentadas na tabela 3. Dentre as 44 substâncias encontradas, nove não foram identificadas (NI). Tabela 3. Porcentagem relativa (%) do óleo essencial de Xylopia aromatica, coletadas na época chuvosa e seca, no ano de 2021 e reamostradas no ano de 2022, Santa Fé do Sul, São Paulo, Brasil. Substâncias LIRE LIRL Chuva (CV) – Março/2021 Seca (SC) – Agosto/2021 Chuva (CV) – Março/2022 Seca (SC) – Agosto/2022 Min Max Média Min Max Média Min Max Média Min Max Média α-thujene 931 930 - 1,14 0,17 - 0,73 0,34 - 0,36 0,07 - 0,33 0,09 α-pinene 939 939 9,48 39,04 26,70 0,73 51,84 34,41 - 44,77 24,52 12,7 41,49 24,16 camphene 956 954 - 0,34 0,06 - 0,27 0,12 - - 0,04 - - 0,04 thuja-2,4(10)-diene 962 960 - 1,22 0,52 - 0,26 0,06 - 0,21 0,06 - - 0,04 sabinene 983 975 - 3,68 0,71 0,8 2,82 1,17 - 2,82 0,85 - 2,08 1,09 β-pinene 987 979 3,86 27,93 18,08 - 36,34 24,69 - 33,15 18,94 9,41 25,32 19,31 mircene 1001 990 - 2,31 0,22 - 5,41 1,29 - 2,67 0,51 - 2,39 0,86 α-phellandrene 1014 1002 - 2,77 0,35 - 3,78 0,54 - 1,89 0,27 - 1,09 0,16 o-cimene 1035 1026 - 4,05 0,68 - 2,33 0,21 - 0,68 0,11 - 0,77 0,19 limonene 1038 1029 - 32,46 9,80 - 72,26 15,96 - 38,64 9,15 0,17 34,05 10,31 1,8-cineole (eucalyptol) 1040 1031 - 0,64 0,23 - 0,98 0,20 - 0,78 0,29 - 2,29 0,56 <(E)>-, β> ocimene 1045 1050 - - 0,04 - 1,94 0,58 - 0,99 0,34 - 0,82 0,14 41 NI/1 1068 - 0,37 0,06 - 0,18 0,05 - - 0,04 - 0,35 0,11 camphenol <6-> 1105 1113 - 1,42 0,55 - - 0,04 - - 0,04 - - 0,04 α-campholenal 1141 1126 - 6,77 3,46 - 0,85 0,26 - 3,17 1,65 0,55 3,55 1,46 cis cis-limonene-oxide 1152 1136 - 1,43 0,20 - - 0,04 - 1,03 0,14 - - 0,04 trans-pinocarveol 1165 1139 - 3,59 1,97 - 0,64 0,13 - 2,25 0,89 - 4,03 1,73 trans-verbenol 1172 1144 - 3,13 1,46 - 2,58 0,18 - 3,77 0,64 - 4,51 1,19 pinocarvone 1181 1164 - 3,59 1,61 - 0,81 0,10 - 2,81 1,01 - 1,89 0,23 NI/2 1184 - 1,66 0,56 - - 0,04 - 3,23 0,22 - - 0,04 terpinen-4-ol 1196 1177 - 1,66 0,26 - 0,72 0,41 - 1,81 0,65 - 0,9 0,59 NI/3 1199 - 1,32 0,62 - 0,29 0,05 - 0,85 0,21 - - 0,04 cryptone 1210 1185 - 7,56 0,69 - 0,29 0,09 - 3,28 0,43 - 2,72 0,91 mirtenal 1216 1195 0,81 3,72 3,65 - 1,11 0,46 - 3,95 1,78 0,53 2,8 1,27 verbenone 1233 1205 - 3,94 1,33 - 0,45 0,09 - 2,27 0,59 - 1,37 0,33 carvone 1266 1243 - 4,41 0,80 - - 0,04 - 3,28 0,45 - 0,76 0,08 phellandral 1295 - 5,88 0,51 - - 0,04 - 2,27 0,24 - 1,18 0,27 bornyl acetate 1299 1285 - 0,36 0,10 - 0,67 0,10 - 0,32 0,05 - 0,91 0,18 α-copaene 1384 1376 - 1,22 0,57 - 2,68 0,52 - 1,86 0,48 0,35 2,13 0,87 geranyl acetate 1399 1381 - 0,72 0,07 - 1,83 0,24 - 2,72 0,30 - 2,29 0,25 aromadendrene 1449 1441 - 1,41 0,93 - 3,18 0,75 - 2,4 1,00 - 2,12 0,57 prezizaene 1469 1446 - 0,06 0,04 - - 0,04 - 1,05 0,09 - 0,61 0,11 NI/4 1471 - 0,63 0,08 - 1,12 0,23 - 0,73 0,15 - 1,12 0,30 germacrene D 1492 1481 - - 0,04 - 0,68 0,19 - 0,99 0,15 - 1,19 0,35 bicyclogermacrene 1508 1500 - 5,59 1,46 1,35 28,51 7,54 1,64 24,5 7,54 5,56 23,66 12,35 NI/5 1535 - - 0,04 - 0,79 0,08 - 0,48 0,06 - 0,64 0,11 NI/6 1593 - - 0,04 - 0,27 0,05 - 8,99 0,49 - - 0,04 spathulenol 1601 1578 6,66 45,49 21,09 1,05 38,99 7,04 6,54 57,77 23,34 5,12 37,48 16,06 NI/7 1613 - - 0,04 - 0,4 0,06 - - 0,04 - 1,38 0,36 guaiol 1619 1600 - - 0,04 - 10,65 0,77 - 3,82 0,91 - 4,46 1,08 NI/8 1641 - - 0,04 - 0,14 0,05 - - 0,04 - 1,82 0,30 NI/9 1665 - - 0,04 - 0,26 0,05 - - 0,04 - 2,71 0,47 bulnesol 1691 1671 - - 0,04 - 7,24 0,49 - 2,11 0,37 - 4,83 0,87 mustakone 1703 1677 - 0,74 0,08 - 1,08 0,10 - 1,24 0,10 - - 0,04 LIRE =Retention index experimental; LIRL= Retention index literature (Adams, 2017); (-) ≤ 0,04 As substâncias majoritárias identificadas no óleo essencial de Xylopia aromatica foram α-pineno, β-pineno, espatulenol, limoneno e biciclogermacreno e estão representadas na figura 12. 42 Figura 12. Média da proporção relativa (%) de cinco substâncias majoritárias identificadas no óleo essencial de Xylopia aromatica, coletadas na época chuvosa e na época seca no ano de 2021 e reamostradas em 2022. O rendimento médio do óleo essencial de 20 plantas de Xylopia aromatica, coletadas na época chuvosa e na época seca no ano de 2021 e reamostradas em 2022 foi maior na época chuvosa no ano de 2022 e na época seca em 2021 (Figura 13). Figura 13. Rendimento médio do óleo essencial de 20 plantas (P) de Xylopia aromatica, na época chuvosa (CV) e seca (SC), coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). 43 A análise de componentes principais (PCA) revela que as substâncias thuja-2,4(10)- diene, <6-> camphenol, mirtenal, campholenal, pinocarvone discrimanam grande parte das plantas coletadas na época chuvosa, principalmente no ano de 2021. As substâncias α-thujene, α-pineno, β-pineno, discriman plantas coletadas na época seca e chuvosa, nos dois anos de coleta (Figura149) Figura 14. Análise de componentes principais (PCA) (correlação de Spearman) com base em 44 substâncias constituinte do óleo essencial de 20 plantas (P) de Xylopia aromatica, na época chuvosa (CV) e seca (SC), coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. O dendograma apresenta a composição quimica das 20 plantas, coletadas na época chuvosa e seca em 2021 e reamostradas nas mesmas épocas em 2022. A formação de cinco clusters podem ser observados. No cluster I (azul marinho) verifica-se o agrupamento de seis plantas coletadas na época chuvosa nos dois anos (CV 2021 P4; CV 2022 P4, CV 2021 P9; CV 2022 P9, CV 2021 P10; CV 2022 P10, CV 2021 P2; CV 2022 P2, CV 2021 P14; CV 2022 P14, CV 2021 P11; CV 2022 P11) e dez plantas coletadas na época chuvosa no ano de 2021 (CV 2021 P18, CV 2021 P12, CV 2021 P17, CV 2021 P13, CV 2021 P19, CV 2021 P8, CV 2021 P1, CV 2021 P16, CV 2021 P15, CV 2021 P7) (Figura 15). Esse cluster demonstra que várias 44 plantas mantiveram o seu perfil em anos sucessivos e outras não, embora poucas diferenças tenham sido notadas. O cluster II (vermelho) agrupou cinco plantas coletadas na época seca nos dois anos (SC 2021 P5; SC 2022 P5, SC 2021 P8; SC 2022 P8, SC 2021 P1; SC 2022 P1, SC 2021 P6; SC 2022 P6, SC 2021 P4; SC 2022 P4), doze plantas na época seca em 2021 (SC 2021 P20, SC 2021 P3, SC 2021 P13, SC 2021 P15, SC 2021 P10, SC 2021 P2, SC 2021 P16, SC 2021 P14, SC 2021 P7, SC 2021 P9, SC 2021 P18, SC 2021 P19), uma planta na época chuvosa nos dois anos (CV 2021 P20; CV 2022 P20), uma planta na época chuvosa no ano de 2021 (CV 2021 P6) e duas plantas na época chuvosa em 2022 (CV 2022 P16, CV 2022 P19) (Figura 15). O cluster III (verde) agrupou uma planta coletada na época seca nos dois anos (SC 2021 P11; SC 2022 P11), uma planta na época seca em 2021 (SC 2021 P17), quatro plantas na época seca em 2022 (SC 2022 P3, SC 2022 P10, SC 2022 P7, SC 2022 P18), três plantas na época chuvosa coletada no ano de 2022 (CV 2022 P1, CV 2022 P3, CV 2022 P7) (Figura 15). O cluster IV (roxo) agrupou duas plantas coletadas na época chuvosa em 2021 (CV 2021 P3, CV 2021 P5) e cinco plantas coletadas na época chuvosa no ano de 2022 (CV 2022 P13, CV 2022 P12, CV 2022 P15, CV 2022 P17, CV 2022 P18) (Figura 15). No cluster V (azul claro) foram agrupadas dez plantas coletadas na época seca no ano de 2022 (SC 2022 P2, SC 2022 P20, SC 2022 P14, SC 2022 P13, SC 2022 P15, SC 2022 P9, SC 2022 P16, SC 2022 P19, SC 2022 P12, SC 2022 P17) (Figura 15). 45 Figura 15. Dendrograma de similaridade (correlação de Sperman) com base em 44 substâncias constituintes do óleo essencial de 20 plantas (P) de Xylopia aromatica, na época chuvosa (CV) e seca (SC), coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. A análise de variância (Figura 16) mostrou que existem algumas substâncias que podem ser responsáveis por explicar a separação dos clusters no dendrograma (Figura 105. Pode-se observar que as substâncias thuja-2,4(10)-diene, <6-> camphenol, carvone e mirtenal foram as principais responsáveis pelo agrupamento das plantas coletadas na época chuvosa, no ano de 46 2021 no Cluster I (Figura 10). As substâncias trans-pinocarveol e pinocarvone podem ter sido responsáveis pelo agrupamento das plantas coletadas na época chuvosa no ano de 2021 e 2022 (Figura 11). Germacreno D foi responsável por agrupar as plantas coletadas na época seca nos dois anos, principalmente no ano de 2022 (Figura 11). Camphene foi responsável principalmente pelo agrupamento das plantas na época seca de 2021 (Figura 11). Biciclogermacreno destaca-se na época seca de 2022 (Figura 11). Cryptone foi encontrado principalmente na época seca no ano de 2022 (Figura 11). O myrcene esteve presente principalmente na época chuvosa no ano de 2022 e na época seca nos dois anos de coleta (Figura 11). Esses resultados podem ser confirmados no mapa de calor exibido na figura 12. Figura 16. Análise de variância (ANOVA) com base em 44 substâncias constituintes do óleo essencial de 20 plantas (P) de Xylopia aromatica, na época chuvosa (CV) e seca (SC), coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. 47 No mapa de calor (Figura 17), as substâncias cymene , thuja-2,4(10)-diene, camphenol <6->, agruparam principalmente plantas coletadas na época chuvosa no ano de 2021. Na época seca no ano de 2021, as substâncias que se destacaram foram pinene , limonene, thujene e camphene. Na época chuvosa em 2022, destacam-se as substâncias terpinen-4-ol e NI/6. Na época seca no ano de 2022, as substâncias copaene , cineole <1,8- >, bornyl acetate, NI/7, NI/8 e NI/9 se destacaram. Figura 17. Mapa de calor (distância euclidiana) com a porcentagem relativa das substâncias do óleo essencial de Xylopia aromatica avaliadas na época chuvosa e época seca, no ano de 2021 e reamostras no ano de 2022. 48 Extração, quantificação e perfil dos alcaloides benzilisoquinolínicos A concentração de alcaloides totais em folhas de Xylopia aromatica foi superior em plantas coletadas na época chuvosa no ano de 2022 e na época seca no ano de 2021 (Figura 18). Figura 18. Concentração de alcaloides totais em folhas de Xylopia aromatica, na época chuvosa e seca, coletadas em 2021 e reamostradas em 2022. Médias seguidas de letras diferentes diferem ao nível de 5% de significância. Letras minúsculas comparam época de coleta (seca e chuva) e letras maiúsculas comparam ano de coleta (2021 e 2022). 4. DISCUSSÃO Plantas coletadas na época seca no ano de 2021 apresentaram menor eficiência quântica potencial adaptada a luz (Fv’/Fm’), menor dissipação de energia do centro de reação do fotossistema II (Ex) e maior dissipação de energia na forma de calor no complexo antena (D), indicando que essas plantas podem ter acionado mecanismos de fotoproteção, uma vez que, não houve acúmulo de energia nos fotossistemas, possibilitando maior eficiência quântica efetiva (ΦPSII), e taxa de transporte de elétrons (ETR) no ano de 2021 (KROMDIJK et al., 2016; FLEXAS et al., 2014; NIYOGI et al., 1999). Além disso, na época seca houve menor quenching fotoquímico (qP), responsável pela menor taxa de transporte de elétrons (ETR) e eficiência quântica efetiva (ΦPSII), indicando que apesar da fotoproteção, a produção de agentes redutores foi menor nessa época. No ano de 2022, as plantas coletadas na época seca apresentaram maior eficiência quântica potencial adaptada a luz (Fv’/Fm’), maior dissipação de energia do centro de reação do fotossistema II (Ex), menor dissipação de energia na forma de calor no complexo antena (D) e menor quenching fotoquímico (qP), o que pode sugerir potencial dano nos fotossistemas, visto 49 que, observou-se maior acúmulo de energia, resultando em menores taxas de transporte de elétrons e produção de agentes redutores (NADPH2) (DEMING-ADAMS et al., 2006; RUBAN et al., 2009; WALTERS, 2005). Em relação as trocas gasosas, plantas coletadas na época seca em 2022 apresentaram maior eficiência do uso da água (EUA). Vale destacar que, quando comparadas ao ano de 2021, plantas coletadas em 2022 revelaram condutância estomática (gs) aproximadamente 1,3 vezes menor e transpiração (E), aproximadamente, três vezes menor, fato que pode ser explicado pelo menor déficit de pressão de vapor foliar, associado a menores temperaturas ambiental e foliar, permitindo maior aproveitamento do recurso hídrico conforme observado em estudos prévios (FLEXAS et al., 2012; ZHAO et al., 2020). Deve ser ressaltado que a figura 3, revela precipitação um pouco maior na seca de 2022 e esse fato pode não ter influenciado disponibilidade hídrica do solo. No entanto, houve menor eficiência de carboxilação da RuBisCO (Anet/Ci) (Ribulose 1,5-difosfato carboxilase/oxigenasse), o que pode ser justificado pela menor produção de agentes redutores na fase fotoquímica e maior acúmulo de energia no fotossistema II, limitando assim, a atividade da enzima RuBisCO e contribuindo com maior acúmulo de carbono interno (Ci) (FLEXAS et al., 2012). Esses resultados podem estar relacionados com a temperatura mais baixa na coleta na época seca em 2022, condição que não é habitual nessa região, que apresenta em média temperaturas mais elevadas. Deve ser registrado que as características químicas e físicas do solo não apresentaram variações nos anos e épocas de coleta avaliadas (Tabela 2). O acúmulo de amido foi maior no ano de 2022, independente da época de coleta. Esse resultado sugere que no ano de 2022 as plantas foram capazes de otimizar a utilização dos recursos disponíveis, como água e luz, para uma maior eficiência fotossintética e produção de açúcares, resultando em maior acúmulo de amido. No ano de 2022, na época chuvosa, a eficiência de carboxilação da enzima RuBisCO foi maior que 2021 na época seca, o que pode ter contribuído com os resultados acima mencionados. O amido desempenha um papel crucial como reserva de carboidratos nas plantas, sendo sua síntese e metabolismo mais bem compreendidos nas folhas. Durante o dia, ele é produzido ativamente por meio da fotossíntese, enquanto durante a noite, é mobilizado para fornecer um suprimento contínuo de carbono e energia quando a fotossíntese não é possível. Esse ciclo de síntese e mobilização do amido nas folhas garante uma reserva vital de energia para as plantas, permitindo-lhes enfrentar períodos de escassez de água e manter seu metabolismo energético funcionando de forma eficiente (STITT; ZEEMAN, 2012; THALMANN; SANTELIA, 2017). O teor de proteínas solúveis totais menor na época chuvosa em 2021 pode sugerir menor necessidade de síntese de proteínas de defesa e reparo, possivelmente devido a condições menos 50 estressantes em comparação com a época seca. As proteínas solúveis totais desempenham uma variedade de funções vitais nas células vegetais, incluindo enzimas antioxidantes, proteínas estruturais e proteínas envolvidas na sinalização celular. Durante condições de estresse, as plantas frequentemente reorganizam sua expressão gênica e sintetizam proteínas específicas para se aclimatarem às novas condições ambientais (OLIVEIRA, 2015). A maior atividade da superóxido dismutase (SOD) em 2021 e na época chuvosa sugere uma resposta de aclimatação das plantas para o enfrentamento ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio durante esse período, uma vez que, a SOD é uma enzima antioxidante chave envolvida na defesa contra as ERO (ALSHER et al., 2002), responsável por dismutar o superóxido (O2 -) em peróxido de hidrogênio (H2O2) no cloroplasto, mitocôndria, citoplasma e peroxissomo (HABIB et al., 2016; SCANDALIOS, 1993; WANG et al., 2009). O aumento da enzima peroxidase (POD) na época chuvosa em 2021 também pode contribuir com aclimatação das plantas para enfrentar estresse oxidativo na época e ano de coleta, uma vez que, essa enzima está envolvida na neutralização do peróxido de hidrogênio gerado pelas ERO e podem ter contribuído para o desempenho fotossintético dessas plantas. A lipoperoxidação observada nessas plantas revelam, de fato, estresse durante essa época, ao contrário do esperado. Talvez a espécie esteja aclimatada para o enfrentamento das condições mais secas, verificadas habitualmente na região de cerrado em que a espécie foi estudada. As PODs utilizam compostos de natureza fenólica como doadores de elétrons para catalisar as reações de dismutação do H2O2 e localizam-se principalmente na parede celular e no vacúolo (LOCATO et al., 2011). Maior peroxidação lipídica na época chuvosa nos dois anos e na época seca em 2021, pode ser uma consequencia da ação das ERO a maior estresse oxidativo. Quando células eucarióticas são expostas a estresses, sejam eles bióticos ou abióticos, a primeira reação bioquímica que ocorre é a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO), resultando no que é conhecido como estresse oxidativo nas plantas. Essas ERO têm o potencial de causar danos às membranas celulares, ao DNA e às proteínas, cuja extensão pode ser avaliada pela peroxidação lipídica, sendo o ácido malondialdeído (MDA) um indicador desse dano (APEL; HIRT, 2004; MOLLER et al., 2007). Outro fator que está relacionado ao estresse oxidativo enfrentado pelas plantas coletadas no ano de 2021 e na época chuvosa é o aumento do peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 desempenha papéis como mensageiro de estresse e regulador do metabolismo celular. Durante condições de estresse, como períodos de chuva intensa, as plantas podem ser expostas a uma série de fatores ambientais adversos, como aumento da umidade, baixa luminosidade e aumento da temperatura, que podem desencadear a produção excessiva de ERO, incluindo o H2O2. O 51 H2O2 pode causar danos às células das plantas por meio da oxidação de moléculas biológicas, como proteínas, lipídios e DNA, levando a uma variedade de efeitos adversos, como peroxidação lipídica, inativação de enzimas e danos ao material genético (BARBOSA et al., 2014; KARUPPANAPANDIAN et al., 2011). Portanto, o aumento do H2O2 observado nas plantas coletadas no ano de 2021 e na época chuvosa pode indicar uma resposta de aclimatação das plantas a essas condições. Talvez a espécie esteja aclimatada para o enfrentamento das condições mais secas, verificadas habitualmente na região, conforme acima citado. A figura 3 revela que no período chuvoso, compreendido entre janeiro e março de 2021 e 2022, a média de precipitação igual a 118 e 189 mm, respectivamente, deve ter sido um fator de estresse. Para lidar com o estresse oxidativo induzido pelo aumento do H2O2, as plantas ativam mecanismos de defesa antioxidante, como a superóxido dismutase (SOD) e peroxidase (POD), que trabalham em conjunto para neutralizar e eliminar o excesso de H2O2 e outras ERO, restaurando assim o equilíbrio redox e protegendo as células contra danos oxidativos. No entanto, em condições de estresse intenso ou prolongado, os mecanismos de defesa antioxidante podem ser sobrecarregados, levando a danos celulares significativos e comprometendo o crescimento e desenvolvimento das plantas (BARBOSA et al., 2014; LOCATO, 2010; MITTLER, 2002). No presente estudo, a atividade enzimática antioxidante da SOD e POD foram relevantes em 2021 e na época chuvosa, em acordo com a peroxidação lipídica. Em resumo, os resultados indicam que as plantas de Xylopia aromatica apresentaram diferentes respostas fisiológicas e bioquímicas em função das variações nas condições ambientais ao longo dos anos e épocas de coleta. Essas respostas refletem a capacidade das plantas de se aclimatarem aos desafios impostos pelo ambiente, otimizando a eficiência do seu metabolismo fotossintético e desenvolvendo mecanismos de defesa antioxidante para mitigar os efeitos do estresse oxidativo. O maior rendimento do óleo essencial na época seca em 2021 pode ser explicado pela maior eficiência de carboxilação da RuBisCO, que é responsável pela produção de esqueletos carbônicos utilizados na síntese de terpenos. Os terpenos são uma classe ampla de metabólitos especializados que desempenham funções importantes na defesa contra herbívoros e patógenos, atração de polinizadores e adaptação a condições ambientais adversas, incluindo falta de água. Eles são sintetizados a partir de precursores isoprenóides, que são produzidos na via do mevalonato ou da metileritritol-fosfato (MEP). A via do MEP é particularmente importante para a síntese de terpenos, uma vez que, fornece precursores para a síntese de isoprenoides plasmáticos e cloroplastídicos, como o fitol, que é o precursor da cadeia lateral do grupo heme nos complexos do fotossistema e da clorofila. A carboxilação da RuBisCO é uma etapa chave na fixação do carbono na fotossíntese, responsável por produzir triose-fosfato, um precursor 52 essencial na síntese de açúcares e outros metabólitos. A RuBisCO é uma enzima altamente regulada, cuja atividade pode ser afetada por fatores ambientais, como temperatura, umidade e disponibilidade de CO2 e luz. Sendo assim, maior eficiência de carboxilação da RuBisCO pode fornecer mais precursores carbônicos para a síntese de terpenos, o que pode levar a um maior rendimento de óleo essencial em algumas espécies vegetais, conforme observado em outros estudos (YANG et al., 2012; GERSHENZON; DUDAREVA, 2007; SHARKEY; YEH, 2001). O óleo essencial de X. aromatica sugere que as plantas coletadas na estação chuvosa apresentam composição similar em algumas substâncias, uma vez que, nessa época, seis plantas coletadas nos dois anos e dez plantas coletadas no ano de 2021 foram agrupadas (cluster I). Além disso, há a formação de outro cluster (cluster IV) com um individuo coletado na época chuvosa no ano de 2021 e cinco indivíduos coletados nessa mesma época no ano de 2022. Por outro lado, plantas coletadas na época seca também apresentaram composição similar em algumas substâncias, visto que, o cluster II agrupou cinco plantas coletadas na época seca nos dois anos e doze plantas na época seca em 2021. Além disso, o cluster V agrupou dez plantas coletadas na época seca no ano de 2022, com composição similar em algumas substâncias. Certas substâncias químicas, como thuja-2,4(10)-diene, camphenol <6->, carvone, mirtenal, trans-pinocarveol, germacreno D, camphene, entre outras, foram responsáveis por agrupar as plantas em diferentes clusters, indicando que sua presença no perfil quimico pode estar relacionada à época de coleta, conforme revela a análise de variância da figura 16. Esses resultados são importantes, pois podem ajudar a entender como as plantas respondem a diferentes condições ambientais e como isso pode afetar seu perfil quimico. Nesse sentido, a presença de certos compostos pode estar relacionada a mecanismos de defesa contra estresses ambientais, como a seca. Além disso, a identificação de compostos específicos em determinadas épocas pode ser útil para fins medicinais, uma vez que, muitas plantas e compostos especializados são utilizados na produção de medicamentos devido a sua atividade biológica (VALAREZO et al., 2012; ALMEIDA et al., 2014). Os resultados observados no presente estudo estão de acordo com observações de diferentes pesquisadores, em que componentes do óleo essencial estão relacionados com a época de coleta e sazonalidade (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). A época em que uma substância é coletada é fator de grande importância, uma vez que, muitas vezes, a natureza dos constituintes ativos não é constante durante o ano (GOBBO-NETO; LOPES, 2007). Há relatos de variações sazonais em quase todas as classes de metabólitos especializados, como óleos essenciais (SCHWOB; BESSIERE, 2004), flavonóides (BROOKS; FEENY, 2004), alcaloides (ROCA-PÉREZ et al., 2004), entre outros, o que justifica a realização do seu estudo. 53 Muitos compostos são geralmente sintetizados pelas plantas de acordo com as suas necessidades específicas, que incluem as condições ambientais, as interações com outras plantas e a proteção contra predadores (RAO; SAVITHRAMMA; SUHRULATHA, 2011). No presente estudo os terpenos alfa-pineno e beta-pineno apresentaram variação mas foram os componentes que apresentaram maior porcentagem relativa nas épocas chuvosa e seca nos dois anos. Esses resultados estão de acordo com aqueles observados em estudos que avaliaram óleos essenciais em folhas, flores e frutos de X. aromatica e α e β-pineno foram os compostos marjoritários (LAGO et al., 2003; ANDRADE et al., 2004). Assim como o rendimento dos óleos essenciais, a produção de alcaloides totais foi maior na época seca de 2021 e na época chuvosa no ano de 2022. Sabe-se que os metabólitos especializados são sintetizados como parte de uma rede bioquímica muito complexa, regulada pela expressão de genes aliado a modulação enzimática e apresentam propriedades funcionais diversas, oferecendo meio de comunicação entre as plantas, alelopatia, defesa a ataque de patógenos e herbívoros, atração de polinizadores e auxílio nas adaptações climáticas (HAGEL; FACCHINI, 2008; LAURSEN; MØLLER; BASSARD, 2015). Em plantas expostas a situações de estresse geralmente se acumulam concentrações mais elevadas de metabólitos especializados, isso acontece devido ao fato de que essas condições levam ao fechamento estomático e à absorção reduzida de CO2 e como consequência, há diminuição considerável no consumo de NADPH + H+ para a fixação do CO2 via ciclo de Calvin, gerando maior oferta e acúmulo desse equivalente redutor. Dessa forma, os processos metabólicos são direcionados para síntese de compostos altamente reduzidos como isoprenoides, fenóis e alcaloides com o emprego desses agentes redutores acumulados (SELMAR & KLEINWÄCHTER 2013). Fotossíntese, comportamento estomatal, mobilização de reservas, expansão foliar e crescimento podem ser alterados de acordo com a disponibilidade hídrica, consequentemente, levando a alterações no metabolismo especializado. Na vegetação devem ser considerados o índice de chuva e sua distribuição pelo ano, assim como seu efeito na umidade e na capacidade de retenção de água do solo (FIGUEIREDO et al., 2008; GOBBO-NETO; LOPES, 2007). O estresse hídrico frequentemente tem conseqüências significantes nas concentrações de metabólitos especializados em diferentes espécies vegetais e há relatos de que estas condições geralmente levam a um aumento na produção de vários tipos de metabólitos, como alguns terpenóides, antocianinas e alcalóides. Os resultados no presente estudo nas épocas seca e chuvosa em dois anos consecutivos, demonstram que o metabolismo especializado reagiu de modo semelhante aumentando a produção de terpenos e alcaloides quando o estresse ocorreu por elevada precipitação ou por seca, uma vez que, entre janeiro e março de 2021 e 2022 a 54 média de precipitação foi igual a 118 e 189 mm, respectivamente, enquanto entre abril e agosto de 2021 e 2022 foi igual a 9 e 29 mm, respectivamente (Figura 3). Em resumo, plantas coletadas em épocas secas de 2021 e 2022 apresentaram diferenças em relação à eficiência quântica, dissipação de energia, quenching fotoquímico e trocas gasosas. Enquanto em 2021 houve indícios de acionamento de mecanismos de fotoproteção, em 2022, houve maior acúmulo de energia e menor produção de agentes redutores. Apesar disso, plantas coletadas em 2022 apresentaram maior eficiência no uso da água, indicando maior controle estomático, o que pode auxiliar o enfrentamento da falta de água. O rendimento do óleo essencial foi maior na época seca em 2021 e chuvosa em 2022, possivelmente devido à maior eficiência de carboxilação da RuBisCO com maior oferta de esqueletos carbônicos para síntese de terpenos nessa época e ano de coleta. A composição química do óleo essencial e a produção de alcaloides variaram de acordo com as épocas de coleta, refletindo a influência das condições ambientais na síntese de metabólitos especializados, como terpenos e alcaloides. O efeito da seca na concentração de metabólitos é, às vezes, dependente do grau de estresse e do período em que ocorre, sendo que efeitos a curto prazo parecem levar a uma produção aumentada, enquanto a longo prazo é observado um efeito oposto (GOBBO-NETO; LOPES, 2007; NIINEMETS, 2010). Embora no presente estudo não tenham sido identificadas diferenças relevantes nas variáveis relacionadas ao clima e ao solo, exceto diferenças de precipitação nas épocas chuvosa e seca, os perfis químicos dos óleos essenciais dos diferentes indivíduos avaliados apresentaram alterações, que podem estar associadas a quantidade de água, em conjunto com outros fatores não