UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS NANOESTRUTURADOS PARA POTENCIAL ADMINISTRAÇÃO NASAL DE ZIDOVUDINA FLÁVIA CHIVA CARVALHO ARARAQUARA 2009 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS NANOESTRUTURADOS PARA POTENCIAL ADMINISTRAÇÃO NASAL DE ZIDOVUDINA FLÁVIA CHIVA CARVALHO Documento apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. ORIENTADORA: Profa. Dra. Maria Palmira Daflon Gremião CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Victor Hugo Vitorino Sarmento ARARAQUARA - SP 2009 Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Carvalho, Flávia Chiva C331d Desenvolvimento e caracterização de sistemas nanoestruturados para potencial administração nasal de zidovudina. / Flávia Chiva Carvalho. – Araraquara, 2009. 143 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas Orientador: Maria Palmira Daflon Gremião Coorientador: Victor Hugo Vitorino Sarmento . 1.AIDS. 2.Zidovudina. 3.Mucoadesão. 4.Tecnologia farmacêutica. I.Gremião, Maria Palmira Daflon, orient. II.Sarmento, Vitor Hugo Vitorino, coorient.. III.Título. CAPES: 40300005 Candidato(a): Flávia Chiva Carvalho Título da Dissertação: Desenvolvimento e caracterização de sistemas nanoestruturados para potencial administração nasal de zidovudina. A Comissão Julgadora dos trabalhos de defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada em 18/02/2009, consideraram o(a) candidato(a): ( ) REPROVADO ( x ) APROVADO 1) Examinadora Profa. Dra. Rosângela Itri 2) Examinadora Profa. Dra. Marcela Longhi 3) Presidente Profa. Dra. Maria Palmira Daflon Gremião Dedico este trabalho aos meus pais Fernando e Lenira AGRADECIMENTOS Agradeço aos meus pais, Fernando e Lenira, que nunca mediram esforços em oferecer a mim e a minha irmã segurança, apoio e carinho, e a todo empenho em nos garantir a melhor educação, tanto acadêmica como moral. Não há como expressar toda minha felicidade e orgulho em dedicar este trabalho a vocês, como forma de agradecimento a todo o amor nos dado. Agradeço a minha querida irmã, Fernanda, por ser minha grande amiga, com quem posso contar com toda confiança e apoio, sempre. Agradeço a Alexandre por ser meu grande companheiro e por todo seu amor. À minha querida orientadora Dra. Maria Palmira Daflon Gremião, por ser minha grande mestra, amiga e um exemplo pessoal e profissional a seguir. Obrigada por toda sabedoria transmitida, confiança, paciência, dedicação, e por ter tornado meu sonho realidade. Ao meu co-orientador Victor Hugo Vitorino Sarmento, pelo apoio, pela parceria em todos os resultados, e principalmente pelo carinho e amizade. Aos professores do departamento de Fármacos e Medicamentos por toda ajuda e amizade. Agradeço em especial aos professores Dra. Leila Chiavacci, Dr. Marcos Bruschi e Dr. Raul Evangelista pela contribuição neste trabalho e pela amizade. Às professoras Dra. Marcela Longhi e Dra. Rosângela Itri por terem participado de minha defesa e pela grande contribuição neste trabalho. Aos meus grandes amigos do programa de pós-graduação, principalmente aos que convivi diariamente no laboratório, Ana Luiza, Arnóbio, Beatriz, Cristina Franzine, Cristina Terrugge, Fabrício, Flávio, Giselle, Gustavo, Joceana, Hilris, Juliana Farinelli, Kelly, Pricileila e Rubiana. Cada item deste trabalho tem a contribuição e ajuda de cada um de vocês. Obrigada pelos momentos de alegria, e por tornarem o convívio no laboratório momentos de prazer e descontração. Aos alunos de iniciação científica, Bruna, Camila, Daniele, Edgar, Gabriela, Márcia, Charlene e Talita. Agradeço em especial à Mariana Barbi, por ter me acompanhado e me ajudado desde o princípio, e por ter se tornado minha grande amiga. Ao professor João Aristeu da Rosa por permitir prontamente a utilização do microscópio de luz polarizada. Ao departamento de Físico-química do Instituto de Química (UNESP) por permitir a utilização do reômetro. À professora Dra. Flávia Maria Netto da Faculdade de Engenharia de Alimentos da UNICAMP por disponibilizar o analisador de textura e por toda ajuda na interpretação dos resultados. Ao Thiago Larroca pela amizade e pela ajuda com os textos em Inglês. A todos meus amigos que me acompanham, me apóiam e dão razão a minha vida. À secretaria de pós-graduação, aos funcionários, à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (FCFAR/UNESP) e a CAPES pelo suporte financeiro. “Um dia a gente chega, no outro vai embora Cada um de nós compõe a sua história Cada ser em si carrega o dom de ser capaz E ser feliz” “Tudo é loucura ou sonho no começo. Nada do que o homem fez no mundo teve início de outra maneira. Mas já tantos sonhos se realizaram que não temos o direito de duvidar de nenhum” Monteiro Lobato Flávia Chiva Carvalho RESUMO A zidovudina (AZT) é o fármaco antiretroviral mais utilizado no tratamento da AIDS, porém possui baixa biodisponibilidade, pois sofre intenso metabolismo hepático. Para alcançar concentrações plasmáticas efetivas são requeridas doses altas e freqüentes, as quais podem chegar a níveis tóxicos. A via nasal tem sido proposta como uma rota alternativa para administração de fármacos que sofrem metabolismo pré-sistêmico, pois favorece a absorção direta para circulação sanguínea; porém, ela possui mecanismos de depuração mucociliar, os quais podem eliminar rapidamente a formulação da cavidade nasal. Sistemas de liberação mucoadesivos podem promover o contato prolongado entre a formulação e os sítios de absorção da cavidade nasal, retardando a depuração mucociliar. Alguns sistemas estabilizados por tensoativos, capazes de formar diferentes estruturas liotrópicas líquido cristalinas, têm sido propostos para aumentar o tempo de contato de formulações com as mucosas. Estes sistemas, ao entrar em contato com os fluidos aquosos que compõem o muco, se ordenam em cristais líquidos (CLs), formando uma matriz de liberação do fármaco. O objetivo deste trabalho foi desenvolver sistemas capazes de formar CLs, como potenciais sistemas mucoadesivos para administração intranasal do AZT. A caracterização por microscopia de luz polarizada e SAXS mostrou que microemulsões (MEs) formadas por AC205/ácido oléico/água formam CLs com a adição tanto de água como de fluído nasal simulado (FNS). As MEs foram capazes de incorporar cerca de 50 mg.g-1 de AZT. A mucoadesão foi avaliada por ensaios de reologia oscilatória, em que a adição de fase aquosa aumentou os módulos elásticos dos sistemas, e pela medida da força para remover as formulações a partir de um disco de mucina, obtidas através de um analisador de textura. Ensaios de liberação in vitro em célula de difusão tipo Franz mostraram, segundo o modelo de Weibull, que a mudança de fases pode prolongar a liberação do AZT. Estes resultados sugerem que estes sistemas possuem grande potencial para administração nasal do AZT. Palavras-chave: Sistemas de liberação de fármacos, AIDS, zidovudina, microemulsão, cristal líquido, mucoadesão. Flávia Chiva Carvalho ABSTRACT Zidovudine (AZT) is the most widely used drug in AIDS treatment; however, AZT shows low oral bioavailability, since it suffers extensive hepatic metabolism. In order to maintain therapeutic levels, large doses have to be given frequently, which may reach toxic levels. The nasal route has been exploited as an alternative route of drugs that suffer first pass metabolism, as it ensures the direct drug absorption to blood circulation; however, the nasal route has mucociliary clearance mechanisms which can quickly remove the formulation of the nasal cavity. Mucoadhesive drug delivery systems can improve residence time of formulation in the nasal cavity absorption sites, delaying mucociliary clearance. Some surfactants systems which are able to form different liotropic liquid crystalline structures have been explored as a strategy to increase formulation residence time on the mucosa. When these systems are placed in physiologic aqueous environment, they can form a drug delivery matrix. The aim of this work was to develop systems capable of forming CLs as potential intranasal AZT mucoadhesive systems. The polarized light microscopy and SAXS characterization showed that microemulsions (MEs) composed by AC205/oleic acid/water form CLs with the addition of either water or simulated nasal fluid (FNS). The MEs were able to incorporate about 50 mg.g-1 of AZT. The mucoadhesion was evaluated both by oscillatory rheology, in which aqueous phase addition increased the elastic modulus of the systems, and by measurement of the necessary force to remove the formulations from mucin disc, obtained through texture analyzer. In vitro Franz’ Cell drug release assay showed, according to the Weibull model, that phase transition sustained AZT release. These results suggest that the systems in hand have great potential for nasal AZT administration. Keywords: drug delivery systems, AIDS, zidovudina, microemulsion, liquid crystal, mucoadhesion. Flávia Chiva Carvalho LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química da zidovudina....................................................... 10 Figura 2. Anatomia da via nasal........................................................................ 15 Figura 3. Representação das forças que podem ser medidas em testes de mucoadesão....................................................................................... 24 Figura 4. Seqüência teórica dos diferentes tipos de fases formadas dependendo do parâmetro de empacotamento, dado pela geometria do tensoativo, teor de água, e outros fatores como temperatura, presença de sais etc............................................................................ 28 Figura 5. Representação esquemática da auto-organização de tensoativos em estruturas lamelares e hexagonais (HOLMQVIST; ALEXANDRIDIS; LINDMAN, 1997)............................................. 38 Figura 6. Fórmula estrutural de tensoativos tipo álcool graxo OE OP, alcoóis laurílico e cetílico e ácido oléico....................................................... 40 Figura 7. Esquema do teste de avaliação da mucoadesão. (a) Analisador de textura; (b) Prova analítica com o disco de mucina aderido; (c) Localização da formulação durante o ensaio; (d) curva força de adesão versus tempo.......................................................................... 51 Figura 8. Esquema da célula de difusão adaptada ao dissolutor....................... 55 Figura 9. Diagrama de fases. (AO) ácido oléico; (AL45) tensoativo; (A) água; (ME) Microemulsão................................................................. 56 Figura 10. Diagrama de fases. (AO) ácido oléico; (AL63) tensoativo; (A) água. (ME) Microemulsão; (CL) Cristal Líquido............................. 57 Figura 11. Diagrama de fases. (AO) ácido oléico; (AC205) tensoativo; (A) água; (ME) Microemulsão; (CL) Cristal Líquido............................. 58 Figura 12. Fotomicrografias das amostras F1 a F11 obtidas por microscopia de luz polarizada................................................................................ 61 Figura 13. Avaliação estrutural das amostras F1 a F11 por SAXS.................... 62 Figura 14. Espectro de absorção da formulação F3 em metanol........................ 67 Flávia Chiva Carvalho Figura 15. Espectro de absorção da solução de AZT (20 μg.mL-1) em metanol.............................................................................................. 68 Figura 16. Espectro de absorção do AZT na formulação F3 (20 μg.mL-1) diluída em metanol............................................................................ 67 Figura 17. Quantidade de AZT incorporado em F1, F2, F3, F4 e em cada componente da formulação............................................................... 69 Figura 18. Fotomicrografias das amostras de F1 a F4 após incorporação do AZT (40 mg.g-1) obtidas por MLP.................................................... 70 Figura 19. Diferenciação estrutural das formulações contendo AZT (F1A, F2A, F3A e F4A) por SAXS............................................................. 71 Figura 20. Reogramas de fluxo das formulações F1A, F2A, F3A e F4A a 25ºC. Os símbolos fechados representam as curvas de ida, e os símbolos abertos representam as curvas de volta.............................. 73 Figura 21. Índice de consistência k e índice de fluxo n das formulações com AZT a 25 oC...................................................................................... 73 Figura 22. Diagrama de fases representando os pontos do acréscimo de 5, 10, 30, 50 e 100% de água em F1, F2, F3 e F4 (símbolos em vermelho). (AO) ácido oléico; (AC205) tensoativo; (A) água......... 76 Figura 23. Fotomicrografias que ilustram o efeito da água na estruturação de F1 e F1A, obtidas por MLP (F1.n e F1An, n = 5, 10, 30, 50 100 % de água adicionada)........................................................................... 78 Figura 24. Fotomicrografias que ilustram o efeito da água na estruturação de F2 e F2A, obtidas por MLP (F2.n e F2An, n = 5, 10, 30, 50 100 % de água adicionada)........................................................................... 79 Figura 25. Fotomicrografias que ilustram o efeito da água na estruturação de F3 e F3.A obtidas por MLP (F3.n e F3An, n = 5, 10, 30, 50 100 % de água adicionada)........................................................................... 80 Figura 26. Fotomicrografias que ilustram o efeito da água na estruturação de F4 e F4A, obtidas por MLP (F4.n e F4An, n = 5, 10, 30, 50 100 % de água adicionada)........................................................................... 81 Figura 27. Efeito do acréscimo de 5 % (�), 10 % (�), 30 % (�), 50 % (�) e 100 % (�) de água nos módulos elásticos das amostras carregadas e não carregadas a 25 ºC. O G’das formulações antes da adição da água foi representado pelo símbolo (�)............................ 84 Figura 28. Efeito do acréscimo de 5 % (�), 10 % (�), 30 % (�), 50 % (�) e 100 % (�) de água nos módulos elásticos das amostras Flávia Chiva Carvalho carregadas e não carregadas a 32 ºC. O G’das formulações antes da adição da água foi representado pelo símbolo (�)............................ 85 Figura 29. Fotomicrografias que ilustram o efeito dos componentes do muco (FNS) na estruturação de F1A, obtidas por MLP a 32 oC (M1A30 = F1+30 % FNS; M1A50 = F1+50 % FNS; M1A100 = F1+ 100 % FNS).............................................................................................. 87 Figura 30. Fotomicrografias que ilustram o efeito dos componentes do muco na estruturação de F2A, obtidas por MLP a 32 oC (M2A30 = F2+30 % FNS; M2A50 = F2+50 % FNS; M2A100 = F2+ 100 % FNS)................................................................................................... 88 Figura 31. Fotomicrografias que ilustram o efeito dos componentes do muco na estruturação de F3A, obtidas por MLP a 32 oC (M3A30 = F3+30 % FNS; M3A50 = F3+50 % FNS; M3A100 = F3+ 100 % FNS)................................................................................................... 89 Figura 32. Fotomicrografias que ilustram o efeito dos componentes do muco na estruturação de F4A, obtidas por MLP a 32 oC (M4A30 = F4+30 % FNS; M4A50 = F4+50 % FNS; M4A100 = F4+ 100 % FNS)................................................................................................... 90 Figura 33. Caracterização por SAXS das formulações F1A, F2A, F3A e F4A adicionadas com 30 % (MnA30), 50 % (MnA50) e 100 % (MnA100) de FNS (n = 1, 2, 3 ou 4) a 32 oC.................................... 91 Figura 34. Caracterização por SAXS das formulações F1, F2, F3 e F4 adicionadas com 50% de FNS (Mn.50, n = 1, 2, 3 ou 4) a 32 oC...... 94 Figura 35. Efeito do acréscimo de 30 % (�), 50 % (�) e 100 % (�) de FNS nos módulos elásticos das formulações F1A, F2A a 32 ºC. Os símbolos abertos são as mesmas formulações adicionadas com 30 % (�), 50 % (�) e 100 % (�) de água............................................ 95 Figura 36. Efeito do acréscimo de 30 % (�), 50 % (�) e 100 % (�) de FNS nos módulos elásticos das formulações F3A e F4A a 32 ºC. Os símbolos abertos são as mesmas formulações adicionadas com 30 % (�), 50 % (�) e 100 % (�) de água............................................ 96 Figura 37. Comparação do efeito do acréscimo de 50 % de FNS entre os módulos elásticos das formulações carregadas (MnA50, n = 1, 2, 3 ou 4) e não carregadas com AZT (Mn.50, n = 1, 2, 3 ou 4).............. 97 Figura 38. Cromatogramas de (a) solução de trabalho a 1,0 μg.mL-1, (b) Flávia Chiva Carvalho fluído receptor após 1,0 h de ensaio de liberação de F1A a 40 mg.g-1, e (c) fluído receptor após 1,0 h de ensaio de liberação de F1 sem AZT...................................................................................... 103 Figura 39. Perfil de liberação das formulações F1A, F2A, F3A, F4A e SA (solução aquosa de AZT). As linhas foram plotadas pelo modelo de Weibull......................................................................................... 105 Figura 40. Testes dinâmicos de F1 e das amostras com 5 % (F1.5), 10 % (F1.10), 30 % (F1.30), 50 % (F1.50) e 100 % (F1.100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 128 Figura 41. Testes dinâmicos de F1A e das amostras com 5 % (F1A5), 10 % (F1A10), 30 % (F1A30), 50 % (F1A50) e 100 % (F1A100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 129 Figura 42. Testes dinâmicos de F2 e das amostras com 5 % (F2.5), 10 % (F2.10), 30 % (F2.30), 50 % (F2.50) e 100 % (F2.100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 130 Figura 43. Testes dinâmicos de F2A e das amostras com 5 % (F2A5), 10 % (F2A10), 30 % (F2A30), 50 % (F2A50) e 100 % (F2A100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 131 Figura 44. Testes dinâmicos de F3 e das amostras com 5 % (F3.5), 10 % (F3.10), 30 % (F3.30), 50 % (F3.50) e 100 % (F3.100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 132 Figura 45. Testes dinâmicos de F3A e das amostras com 5 % (F3A5), 10 % (F3A10), 30 % (F3A30), 50 % (F3A50) e 100 % (F3A100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 133 Figura 46. Testes dinâmicos de F4 e das amostras com 5 % (F4.5), 10 % (F4.10), 30 % (F4.30), 50 % (F4.50) e 100 % (F4.100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 134 Figura 47. Testes dinâmicos de F4A e das amostras com 5 % (F4A5), 10 % (F4A10), 30 % (F4A30), 50 % (F4A50) e 100 % (F4A100) de água a 25 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 135 Figura 48. Testes dinâmicos de F1 e das amostras com 5 % (F1.5), 10 % (F1.10), 30 % (F1.30), 50 % (F1.50) e 100 % (F1.100) de água a Flávia Chiva Carvalho 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 136 Figura 49. Testes dinâmicos de F1A e das amostras com 5 % (F1A5), 10 % (F1A10), 30 % (F1A30), 50 % (F1A50) e 100 % (F1A100) de água a 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 137 Figura 50. Testes dinâmicos de F2 e das amostras com 5 % (F2.5), 10 % (F2.10), 30 % (F2.30), 50 % (F2.50) e 100 % (F2.100) de água a 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 138 Figura 51. Testes dinâmicos de F2A e das amostras com 5 % (F2A5), 10 % (F2A10), 30 % (F2A30), 50 % (F2A50) e 100 % (F2A100) de água a 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 139 Figura 52. Testes dinâmicos de F3 e das amostras com 5 % (F3.5), 10 % (F3.10), 30 % (F3.30), 50 % (F3.50) e 100 % (F3.100) de água a 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 140 Figura 53. Testes dinâmicos de F3A e das amostras com 5 % (F3A5), 10 % (F3A10), 30 % (F3A30), 50 % (F3A50) e 100 % (F3A100) de água a 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 141 Figura 54. Testes dinâmicos de F4 e das amostras com 5 % (F4.5), 10 % (F4.10), 30 % (F4.30), 50 % (F4.50) e 100 % (F4.100) de água a 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´)............................................................... 142 Figura 55. Testes dinâmicos de F4A e das amostras com 5 % (F4A5), 10 % (F4A10), 30 % (F4A30), 50 % (F4A50) e 100 % (F4A100) de água a 32 oC. O símbolo� representa o módulo de armazenamento (G´) e � o módulo de perda (G´´).......................... 143 Flávia Chiva Carvalho LISTA DE TABELAS Tabela 1. Antiretrovirais: nome genérico, apresentação e meia vida plasmática.......................................................................................... 9 Tabela 2. Formulações em que a proporção de tensoativo é fixa, e as proporções de óleo e água variam..................................................... 45 Tabela 3. Formulações em que a proporção de óleo é fixa, e as proporções de tensoativo e água variam.............................................................. 45 Tabela 4. Valores de qmax (Å) e razão entre as distâncias interplanares para as formulações F1 a F11.................................................................... 63 Tabela 5. Parâmetros estruturais das formulações líquido cristalinas (F4, F5, F6, F7, F9, F10 e F11)....................................................................... 63 Tabela 6. Valores das absorbâncias das soluções de AZT em metanol obtidas por espectroscopia UV, no comprimento de onda de 265 nm, e os respectivos resultados estatísticos obtidos das amostras em triplicata............................................................................................. 66 Tabela 7. Cálculo da precisão e exatidão do método de quantificação do AZT por espectrofotometria.............................................................. 68 Tabela 8. Valores obtidos nas medidas dos limites de detecção e quantificação do AZT em metanol por espectroscopia UV............ 68 Tabela 9. Quantidade de AZT solubilizado nas formulações F1, F2, F3, F4 e em cada constituinte, obtidos por espectroscopia UV....................... 69 Tabela 10. Valores de qmax (Å) e valores da razão entre as distâncias interplanares para as formulações F1A, F2A, F3A e F4A................ 71 Tabela 11. Índices de consistência (k) e de fluxo (n) das formulações com AZT a 25 oC...................................................................................... 74 Tabela 12. Nomenclatura e proporções de fase aquosa, oleosa e tensoativo após incorporação de 5, 10, 30, 50, e 100 % de água em F1, F2, F3 e F4.................................................................................................... 77 Tabela 13. Nomenclatura das formulações F1, F2, F3 e F4 com e sem AZT após a adição de 30, 50, e 100% de FNS.......................................... 86 Flávia Chiva Carvalho Tabela 14. Valores de qmax (Å) e razão entre as distâncias interplanares das formulações F1A, F2A, F3A e F4A adicionadas com 30, 50 e 100 % de FNS, e das formulações F1, F2, F3 e F4 adicionadas com 50 % de FNS.......................................................................................... 92 Tabela 15. Parâmetros estruturais das formulações F1 a F4 após a adição de FNS.................................................................................................... 93 Tabela 16. Parâmetros de interação ou de sinergismo reológico (G’mis, ΔG’absoluto, ΔG’relativo, relação logG’) obtidos a 1 Hz, das formulações F1 a F4 após sua mistura com 30, 50 e 100 % de FNS. G’f é o módulo elástico das formulações antes da adição do FNS.................................................................................................... 98 Tabela 17. Força de mucoadesão das formulações F1, F2, F3, F4 e adicionadas com 50% de FNS (M1.50, M2.50, M3.50 e M4.50)..... 101 Tabela 18. Parâmetros utilizados na validação do método para quantificação do AZT no meio de liberação in vitro: precisão intra-dia, inter-dia e exatidão, expressa como porcentagem de recuperação.................. 104 Tabela 19. Parâmetros obtidos através da equação de Weibull, a partir dos dados de liberação in vitro das formulações F1A, F2A, F3A e da solução aquosa SA............................................................................ 108 Flávia Chiva Carvalho LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Å............................ a............................. A............................ AC205................... AIDS..................... AL36..................... AL45...................... AL63...................... AO......................... ASC....................... AZT ...................... CL.......................... CLAE.................... CMC...................... CV......................... d............................. ΔG’........................ DP.......................... F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10 e F11…………….. FnA........................ Fn.5, Fn.10, Fn.30, Fn.50, Fn.100........ Angstrom Parâmetro de rede (espaço entre os centros de duas lamelas ou entre dois cilindros da fase H1 Água Álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida, sigla originada do Inglês: Acquired Immuno Deficiency Syndrome Álcool laurílico etoxilado 3 OE e propoxilado 6 OP Álcool laurílico etoxilado 4 OE e propoxilado 5 OP Álcool laurílico etoxilado 6 OE e propoxilado 3 OP Ácido oléico Área sob a curva Zidovudina Cristal líquido Cromatografia líquida de alta eficiência Concentração micelar crítica Coeficiente de variação Distância entre os objetos espalhadores Parâmetro de interação ou sinergismo reológico Desvio padrão Formulações em que foi realizada a caracterização físico-química e estrutural Formulações carregadas com AZT, n = 1, 2, 3 ou 4 Formulações adicionadas com 5, 10, 30, 50 e 100 % de água em relação à massa inicial, n = 1, 2, 3 ou 4 Flávia Chiva Carvalho FnA5, FnA10, FnA30, FnA50, FnA100.................. FNS........................ G’........................... G’’......................... H1………………... H2………………... HIV………............ IF………............... II………………… IP………………... ITRN……………. ITRNN………….. Lα........................... LD……………….. LQ……………….. Mn30, Mn50, Mn100…………... MnA30, MnA50, MnA100…………. ME………………. MLP……………... O............................ OE.......................... OP.......................... Formulações carregadas com AZT adicionadas com 5, 10, 30, 50 e 100 % de água em relação à massa inicial, n = 1, 2, 3 ou 4 Fluído nasal simulado Módulo elástico ou de armazenamento Módulo viscoso ou de perda Fase hexagonal Fase hexagonal reversa Vírus da imunodeficiência, sigla originada do Inglês: Human Immunodeficiency Virus Inibidor de fusão Inibidor de integrase Inibidor de protease Inibidores da transcriptase reversa análogo de nucleosídeo Inibidores da transcriptase reversa não-análogo de nucleosídeo Fase lamelar Limite de detecção Limite de quantificação Formulações adicionadas com 30, 50 e 100 % de FNS em relação à massa inicial, n = 1, 2, 3 ou 4 Formulações carregadas com AZT adicionadas com 30, 50 e 100 % de FNS em relação à massa inicial, n = 1, 2, 3 ou 4 Microemulsão Microscopia de luz polarizada óleo Unidades de óxido de etileno Unidades de óxido de propileno Flávia Chiva Carvalho PEC........................ q............................. qmax......................... r.............................. r2............................ RH........................... R2 ajustado.................. rpot 2............................... δ………………….. S.............................. SA........................... SAXS...................... T………………… Parâmetro de empacotamento crítico Vetor de espalhamento Vetor de espalhamento quando a intensidade de espalhamento é máxima Coeficiente de correlação linear Coeficiente de determinação linear Raio do cilindro da fase H1 Coeficiente de determinação ajustado para ajuste de modelo matemático para liberação de fármacos Coeficiente de regressão linear correspondente à lei das potências Domínio apolar ou espessura da lamela Inclinação da reta da curva de calibração Solução aquosa de AZT a 5,0 mg.mL-1 Espalhamento de raios X a baixo ângulo Tensoativo Flávia Chiva Carvalho SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO..................................................................................................... 2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.............................................................................. 2.1.HIV e à AIDS................................................................................................ 2.2.Terapia para HIV/AIDS e suas limitações..................................................... 2.3.Zidovudina..................................................................................................... 2.4.Sistemas de liberação de fármacos antiretrovirais......................................... 2.5.Via de administração nasal............................................................................ 2.5.1Anatomia, fisiologia, mucosa e depuração mucociliar........................... 2.5.2.Bio e Mucoadesão.................................................................................. 2.5.2.1.Materiais mucoadesivos...................................................................... 2.5.2.2.Metodologias para análise da mucoadesão......................................... 2.5.2.2.1.Métodos que medem a força de mucoadesão.............................. 2.5.2.2.2.Métodos reológicos..................................................................... 2.6.Sistemas de liberação estabilizados com tensoativos.................................... 2.6.1.Diagrama de fases............................................................................. 2.6.2.Microemulsões e Cristais Líquidos................................................... 2.6.3.Caracterização físico-química........................................................... 2.6.3.1.Microscopia de luz polarizada................................................... 2.6.3.2.Reologia..................................................................................... 2.6.3.3.Espalhamento de raios-X a baixo ângulo.................................. 2.6.4.Componentes..................................................................................... 3.OBJETIVO............................................................................................................ 4.MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................. 4.1.Materiais........................................................................................................ 4.2.Métodos......................................................................................................... 4.2.1.Construção dos diagramas de fases e escolha do tensoativo................ 4.2.2.Caracterização físico química e estrutural das formulações................. 4.2.2.1.Microscopia de luz polarizada........................................................ 4.2.2.2.Espalhamento de raios-X a baixo ângulo....................................... 4.2.3.Avaliação da incorporação do AZT nos sistemas.................................. 1 6 6 7 8 11 15 16 18 20 22 24 25 27 29 29 32 32 32 34 39 41 42 42 44 44 45 45 46 46 Flávia Chiva Carvalho 4.2.3.1.Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de AZT por espectroscopia UV...................................................................... 4.2.3.2.Determinação da incorporação de AZT nos sistemas escolhidos e nos seus diferentes componentes............................................................. 4.2.3.3.Efeito da incorporação do AZT na evolução estrutural das formulações................................................................................................ 4.2.4.Avaliação da mucoadesão...................................................................... 4.2.4.1.Efeito da água na estrutura das formulações.................................. 4.2.4.2.Efeito dos componentes do muco na estrutura das formulações.... 4.2.3.2.1.Avaliação da força mucoadesiva............................................ 4.2.5.Estudos de liberação do fármaco........................................................... 4.2.5.1.Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação do AZT por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)........................ 4.2.5.2.Determinação do perfil de liberação in vitro ................................ 5.RESULTADOS.................................................................................................... 5.1.Seleção do tensoativo.................................................................................... 5.2.Caracterização físico química e estrutural das formulações........................ 5.3.Escolha dos sistemas a serem estudados....................................................... 5.4.Avaliação da incorporação do AZT nos sistemas.......................................... 5.4.1.Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação de AZT por espectroscopia UV........................................................................... 5.4.2.Determinação da incorporação de AZT nos sistemas selecionados e nos seus diferentes componentes.................................................................... 5.4.3.Efeito da incorporação do AZT na evolução estrutural das formulações..................................................................................................... 5.5.Avaliação da mucoadesão.............................................................................. 5.5.1.Efeito da água na estrutura das formulações.......................................... 5.5.2.Efeito dos componentes do muco na estrutura das formulações........... 5.5.2.1.Avaliação da força mucoadesiva.................................................... 5.6.Estudos de liberação do fármaco................................................................... 5.6.1.Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação do AZT por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)............................. 5.6.2.Determinação do perfil de liberação in vitro ........................................ 46 47 48 49 49 49 50 52 52 54 56 56 60 65 65 65 68 70 75 76 86 100 102 102 105 Flávia Chiva Carvalho 6.DISCUSSÃO........................................................................................................ 7.CONCLUSÕES..................................................................................................... 8.PERSPECTIVAS FUTURAS.............................................................................. 9.REFERÊNCIAS.................................................................................................... 10.ANEXO: Estudos de reologia oscilatória obtidos por varredura de freqüência.. 109 113 115 116 127 INTRODUÇÃO 1 Introdução Flávia Chiva Carvalho 1. INTRODUÇÃO O AZT, primeiro composto aprovado para uso clínico no tratamento da Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida, é o fármaco mais amplamente utilizado, tanto sozinho como em combinação com outros agentes antiretrovirais. Entretanto, o fator que limita a sua efetividade terapêutica é sua toxicidade hematológica dose- dependente (MAINARDES, 2007; OH et al.,1998; THOMAS; PANCHAGNULA, 2003). A biodisponibilidade deste fármaco via oral é de somente 60% devido ao seu metabolismo hepático; é eliminado como glicuronídeo inativo, com meia-vida de aproximadamente uma hora (MANDAL; TENJARLA, 1996). Para manter níveis terapêuticos efetivos, altas doses devem ser administradas, as quais freqüentemente alcançam níveis plasmáticos tóxicos, causando uma série de efeitos adversos graves tais como granulocitopenia e anemia (BLUM et al., 1988; MAINARDES, 2007). Esses efeitos são dose-dependente e uma redução da dose total administrada reduziria a severidade desta toxicidade (MANDAL; TENJARLA, 1996). Somados a esses fatores, as atuais terapias antiretrovirais têm um esquema de administração de doses bastante complexo. O grande número de comprimidos ou cápsulas, utilizados por tempo indeterminado, dificulta a adesão do paciente ao tratamento em longo prazo. Nos casos em que são necessárias terapias combinadas, o aumento no número de comprimidos pode trazer dificuldade na compreensão das doses e severos efeitos colaterais (BRASIL, 2006). Além disso, os medicamentos disponíveis no mercado não evitam o metabolismo hepático do AZT. A terapia hoje adotada utiliza a via oral como a principal via de administração do AZT. São inquestionáveis as vantagens que a via oral oferece, mas para fármacos 2 Introdução Flávia Chiva Carvalho que sofrem metabolismo no trato gastrintestinal e metabolismo pré-sistêmico, outras rotas de administração devem ser exploradas. A rota transdérmica tem sido amplamente sugerida, pois garante níveis plasmáticos contínuos e evita o metabolismo hepático e gastrintestinal (NARISHETTY; PANCHAGNULA, 2004a; OH et al., 1998; THOMAS; PANCHAGNULA, 2003). Entretanto, tratando-se do AZT, um problema que limita o uso dessa via é a sua relativa hidrossolubilidade e a sua baixa permeabilidade transdérmica, necessitando assim do uso de técnicas físicas que melhorem a permeação, tais como iontoforese, micro-agulhas, etc. (KUMAR et al., 1999). A via nasal tem recebido especial atenção como rota promissora para liberação sistêmica de fármacos (ILLUM, 2003) e apresenta uma série de vantagens. Seu epitélio com numerosas microvilosidades e grande área de superfície facilita a absorção de fármacos. A camada subepitelial altamente vascularizada e a membrana basal com endotélio poroso podem facilitar a permeação do fármaco. Essas características podem fazer com que o fármaco seja absorvido diretamente para circulação sistêmica, evitando metabolismo pré-sistêmico, atingindo rapidamente níveis plasmáticos terapêuticos. Todos esses fatores podem favorecer a redução da dose, a diminuição de efeitos adversos e a adesão ao tratamento. Comparando-se com outras vias, a via nasal tem representado um grande avanço na administração de fármacos como hormônio do crescimento e insulina (UGWOKE, et al., 2005). O reconhecimento do potencial da via nasal tem conduzido a um grande aumento nas pesquisas neste campo nas últimas duas décadas. A lista de produtos no mercado ou em vários estágios de desenvolvimento pré-clínico e clínico está sempre em crescimento (UGWOKE et al., 2005). Apesar do seu potencial, há algumas barreiras que limitam a absorção intranasal de fármacos, como os mecanismos de depuração 3 Introdução Flávia Chiva Carvalho mucociliar, o qual remove rapidamente a formulação da cavidade nasal, a degradação enzimática, a qual pode acontecer tanto no lúmen da cavidade nasal como na passagem através da barreira epitelial, e a baixa permeabilidade do epitélio nasal que dificulta a absorção de fármacos polares ou de alto peso molecular (ILLUM, 2003; MAINARDES et al., 2006). Várias estratégias têm sido propostas para vencer estas barreiras de absorção. Por exemplo, o emprego de sistemas mucoadesivos que promovem o contato prolongado entre a formulação e os locais de absorção na cavidade nasal retardando a depuração mucociliar, aumentando a permeação e absorção do fármaco (ILLUM, 2003; UGWOKE et al., 2005). Tais sistemas podem estar na forma de pós, líquidos ou géis líquidos (ILLUM, 2003). Microesferas de quitosana (GAVINI et al., 2006; MARTINAC et al., 2005), de poloxamers (HAN et al., 2006) e de pectina (CHARLTON et al., 2007), lipossomas (SHAHIWALA; MISRA, 2004), microemulsões (LI et al., 2002; VYAS et al., 2006a ; VYAS et al., 2006b; ZHANG et al., 2004), e sistemas mistos, como os sistemas de gelificação in situ, os quais se gelificam através da mudança de pH, temperatura e absorção de solventes quando chegam à cavidade nasal (PARK et al., 2001; UGWOKE et al., 2005) são exemplos de sistemas mucoadesivos. Há uma ampla variedade de materiais que podem ser utilizados na formulação de sistemas mucoadesivos, como carbômeros, quitosanas, alginatos e derivados da celulose (SMART, 2005). Há uma nova classe de substâncias, como monoestearato e monooleato de glicerila, sendo identificada como mucoadesiva, capazes de formar cristais líquidos in (CLs) in situ, os quais podem agir como uma matriz de liberação do fármaco, e que devido sua alta viscosidade, pode permanecer por maior tempo em contato com a 4 Introdução Flávia Chiva Carvalho mucosa (BOYD et al., 2006; SHAH et al., 2001). Alguns ácidos graxos e copolímeros etoxilados também são capazes de formar mesofases líquido cristalinas liotrópicas em presença de água na temperatura corpórea (MALMSTEN, 1996; URBAN, 2004). Os CLs são considerados estruturas ordenadas com arranjo molecular caracterizado por regiões hidrofóbicas e hidrofílicas alternadas. Alterando a concentração de solvente, podem ser formadas diferentes estruturas líquido-cristalinas, como lamelares (Lα), hexagonais (H1 para hexagonal e H2 para hexagonal reversa) e cúbicas. Os CLs vêm sendo considerados uma excelente matriz de liberação de fármacos, pois devido a sua alta viscosidade, pode prolongar a liberação dos mesmos, além de possuir uma grande área interfacial interna, com características físico-químicas diferentes da área externa, formando microambientes distintos, com diferentes constantes dielétricas, permitindo compartimentalizar fármacos polares e apolares (BOYD et al., 2006). Porém, a administração nasal de um CL estruturado torna-se difícil, devido sua alta viscosidade. Por isso, vários trabalhos têm proposto a administração de um sistema precursor de CL, ou seja, que se transforme nesta fase in situ (SHAH et al., 2001). A busca por esta interessante alternativa já foi proposta para mucosas como a periodontal (BRUSCHI et al., 2007) vaginal e trato gastrintestinal (SHAH et al., 2001). Nosso grupo de pesquisa tem mostrado que sistemas água/óleo estabilizados com tensoativo álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP (AC205) formam microemulsões (MEs) em baixas concentrações de água, e o aumento da fase aquosa resulta numa gama de diferentes tipos de mesofases líquido cristalinas com maior estruturação (CARVALHO et al., 2008; KLEIN, 2007; URBAN, 2004). A administração da fase microemulsionada seria uma vantagem, devido à alta capacidade de solubilização de fármacos, estabilidade termodinâmica e fluidez destes 5 Introdução Flávia Chiva Carvalho sistemas, que facilita a administração nasal (LAWRENCE; REES, 2000). Ao chegar à cavidade nasal, entra em contato com os fluidos aquosos que compõe o muco, podendo transformar-se então numa fase líquido cristalina mais estruturada. Tendo em vista as vantagens que a via nasal oferece na absorção de fármacos, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema precursor de CL para a administração intranasal do AZT. Para isso, foram desenvolvidos e caracterizados sistemas estabilizados com tensoativos tipo álcool graxo etoxilado e propoxilado, água e ácido oléico como fase oleosa, visando obter potenciais sistemas mucoadesivos. Os sistemas foram caracterizados quanto ao comportamento de fases através da construção do diagrama de fases e caracterização por microscopia de luz polarizada (MLP) e espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS). A avaliação da mucoadesão foi estudada através de estudos reológicos, em que é possível monitorar as mudanças viscoelásticas do sistema formado pela mistura da mucina com a formulação, e através da análise da força de mucoadesão obtida a partir de um analisador de textura, o qual mede a força aplicada na remoção da formulação a partir de um disco de mucina. A diferenciação estrutural da transição ME-CL foi elucidada por medidas de SAXS e MLP. Por fim, foi realizado estudo de liberação in vitro em célula de difusão tipo Franz. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 6 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. HIV e AIDS O vírus da imunodeficiência humana e a Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida, comumente referidos como HIV e AIDS (siglas originadas do Inglês: Human Immunodeficiency Virus e Acquired Immuno Deficiency Syndrome), constitui a doença infecciosa mais séria que desafia globalmente a saúde pública. Há atualmente 33,2 milhões de pessoas vivendo com HIV/AIDS no mundo. Mais de 6800 pessoas se tornam infectadas com o HIV e mais de 5700 pessoas morrem de AIDS por ano, principalmente pelo acesso inadequado à prevenção e tratamento. Intervenções como aconselhamento educacional e terapia com fármacos antiretrovirais têm contribuído para transformar a infecção por HIV de fatal a uma doença infecciosa crônica controlável, embora as estatísticas ainda mostrem que o número de infecções continua inaceitavelmente alto (UNAIDS, 2007). Há atualmente duas espécies conhecidas de HIV, o HIV-1 e HIV-2, com as suas respectivas subespécies. HIV-1 é a infecção mundialmente mais comum, enquanto que a HIV-2 é mais prevalente na África do Sul, a qual demora mais tempo para evoluir para imunodeficiência que a HIV-1. A infecção humana por HIV é resultante da integração do genoma viral dentro das células hospedeiras para sua replicação. A AIDS é o estágio avançado da infecção causada pelo HIV. O vírus infecta as células hospedeiras se ligando à proteína viral gp120 em dois receptores transmembrana, o CD4+ e em uma das quimiocinas CCR5 e CXCR4. O HIV infecta os macrófagos e células T auxiliares CD4+, mas o que caracteriza a AIDS é a depleção das células 7 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho CD4+. O estágio final da doença pode ser caracterizado como um espectro de doenças, incluindo infecções oportunistas como Pnuemocystis carinii e Mycobacteruim tuberculosis, demência e câncer. Em adição aos macrófagos, linfonodos, medula óssea, baço e pulmões, o sistema nervoso central representa o local anatômico mais importante de alojamento do vírus. Isto causa um significante dano neuronal e demência. Sem tratamento, a infecção por HIV-1 pode ser fatal em 5 a 10 anos (OJEWOLE et al., 2008). 2.2.Terapia para HIV/AIDS e suas limitações Embora o desenvolvimento de fármacos para infecção do HIV tenha progredido, ainda persistem numerosas incertezas a respeito da melhor maneira de se controlar a doença. Atualmente, os antiretrovirais são classificados em categorias como inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN), inibidores da transcriptase reversa não-análogos de nucleosídeos (ITRNN), inibidores de protease (IP), e mais recentemente inibidores de fusão (IF) e de integrase (II). A Tabela 1 mostra a classificação, apresentação e meia vida plasmática dos antiretrovirais. Estes medicamentos são administrados em terapia combinada. Eles adiam o início dos sintomas da doença, diminuindo o ritmo da redução das células de proteção do sistema imunológico, mas, ainda assim, não conseguem eliminar o HIV do organismo, além da terapia estar associada com vários efeitos adversos (BRASIL, 2006). Os efeitos adversos estão associados à curta meia vida e baixa biodisponibilidade da maioria dos antiretrovirais, devido ao seu metabolismo pré- sistêmico e degradação gastrintestinal. Além disto, os locais de alojamento do vírus, 8 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho como sistema nervoso central, sistema linfático e macrófagos, são compartimentos que não podem ser acessados pela maioria dos fármacos na concentração terapêutica requerida. Como nestes locais a concentração é subterapêutica, com tempo de residência média curto, o HIV não consegue ser eliminado de seus reservatórios. Todos estes fatores fazem com que posologia dos medicamentos antiretrovirais seja alta e freqüente, o que leva a baixa adesão do paciente a terapia (OJEWOLE et al., 2008). Estratégias para superar essas limitações incluem a identificação de novas moléculas, modificação química das já existentes e desenvolvimento de novos sistemas de liberação de fármacos. Esta última pode promover a eficácia de fármacos já existentes e explorar novas vias de administração (OJEWOLE et al., 2008) A introdução de um novo fármaco no mercado, além de levar vários anos de pesquisa, envolve custos altíssimos. Assim, a procura por novos sistemas de liberação é importante no sentido de se estabelecer alternativas terapêuticas mais eficientes, que possibilitem administrar os fármacos com mais segurança e com efeitos colaterais minimizados (MAINARDES et. al., 2004; MAINARDES et al., 2005a). 2.3.Zidovudina A zidovudina é também conhecida como Retrovir, AZT, ZDV ou 3’-azido-3’- desoxitimidina. AZT é um análogo da timidina que possui um grupamento 3’-azido em lugar de 3’-hidroxila. A zidovudina é um sólido cristalino solúvel em água na proporção de 20 mg.mL-1 (SILVA, 2006). Sua estrutura química está representada na Figura 1. 9 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho Tabela 1: Antiretrovirais: nome genérico, apresentação e meia vida plasmática. Classe Nome genérico Apresentação Meia vida plasmática ITRN ABACAVIR Comprimido 300 mg 1,5 h DIDANOSINA Comprimidos tamponados de 25 e 100 mg, Comprimidos revestidos para liberação entérica de 250 e 400 mg 1,6 h ESTAVUDINA Cápsula 30 e 40 mg 1,4 h LAMIVUDINA Comprimido 150 mg Associação com AZT 300 mg + lamivudina 150 mg 5-7 h TENOFOVIR Comprimido 300 mg 17 h ZALCITABINA Comprimido 0,75 mg 1,2-2 h ZIDOVUDINA Cápsula 100mg e Associação de lamivudina 150 mg com AZT 300 mg 1.1 h ITRNN DELAVIRDINA Comprimido 100 mg 5,8 h EFAVIRENZ Cápsulas de 200 e 600 mg 40-55 h NEVIRAPINA Comprimido 200 mg 25-30 h IP AMPRENAVIR Cápsula 150 mg 7-10,5 h INDINAVIR Cápsulas 400 mg 1,5-2 h LOPINAVIR Cápsula 133,3 e 33,3 mg 5-6 h NELFINAVIR Comprimido 250 mg 3,5-5 h RITONAVIR Cápsula 100 mg 3 – 5 h SAQUINAVIR Cápsula 200 mg 1 – 2 h II EFUVIRTIDE Cápsulas 3,8 h MARAVIROC Comprimidos 14-18 h RALTEGRAVIR Comprimidos 9 h Fonte: BRASIL, 2006; OJEWOLE et al., 2008. 10 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho Figura 1: Estrutura química da zidovudina. A zidovudina é rapidamente absorvida e sua biodisponibilidade varia de 60 a 70%. Nos pacientes infectados com HIV, a absorção varia amplamente e é retardada após a ingestão de alimentos. As concentrações plasmáticas máximas e mínimas são, respectivamente, de 0,4 a 0,5 μg.mL-1 e 0,1 μg.mL-1, com a posologia de 400 mg de quatro em quatro horas. A meia vida plasmática de eliminação é de aproximadamente 0,9 a 1,5 horas. Sofre metabolismo hepático pré-sistêmico e é rapidamente transformada no metabólito 5’-0-glicuronídeo, que possui a mesma meia vida de eliminação, mas é destituído de atividade anti HIV (SILVA, 2006). Em relação ao seu mecanismo de ação, após a difusão do fármaco para o interior das células do hospedeiro, a zidovudina é inicialmente fosforilada pela timidina cinase, em seguida é transformada em difosfato pela timidilato cinase, e por fim se converte na forma trifosfatada. O trifosfasto de zidovudina, que tem uma meia vida intracelular de eliminação de 3 a 4 horas, inibe a transcriptase reversa em competição com o trifosfato de timidina. Como o grupamento 3’-azido evita a formação da ligação 5’-3’- fosfodiéster, a incorporação da zidovudina provoca o término da cadeia de DNA. A seletividade antiviral da zidovudina se deve a sua maior afinidade pela transcriptase 11 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho reversa do HIV do que pelas DNA polimerases humanas. Na AIDS, ela prolonga a sobrevida, reduz as infecções oportunistas, promove ganho de peso, melhora o estado funcional geral e aumenta a contagem de linfócitos T CD4+ (SILVA, 2006). A zidovudina foi o primeiro fármaco empregado no tratamento da AIDS, que comprovadamente proporcionou benefícios clínicos importantes. No Brasil, a associação zidovudina/lamivudina foi considerada a dupla de análogos de nucleosídeos de primeira escolha para compor o esquema terapêutico inicial. O perfil favorável de toxicidade de ambos ITRN, a facilidade de adesão à combinação e a larga experiência com ela justificam esta opção (BRASIL, 2006). 2.4.Sistemas de liberação de fármacos antiretrovirais A ação de fármacos já existentes pode ser potencializada através do desenvolvimento de novos sistemas de liberação. A liberação controlada consiste em técnicas que tornam os agentes químicos ativos disponíveis para um alvo, com taxas de liberação e duração adequadas para produzir um efeito desejado. Assim, os sistemas de liberação controlada são tidos como aqueles que podem fornecer algum tipo de controle, seja temporal, espacial ou ambos (EVANGELISTA, 2006). A maioria dos sistemas de liberação controlada apresenta vantagens como redução da freqüência de dosagem; redução da oscilação do nível do fármaco na circulação sistêmica e fluídos biológicos; aumento da adesão do paciente; esquema terapêutico adequado às necessidades do paciente; garantia de efeito terapêutico mais uniforme; minimização de irritação de mucosas ou tecidos e outros efeitos adversos dependentes da dose e via de administração (LI; ROBINSON; LEE, 1987). A aplicação de sistemas nanoestruturados como sistemas de liberação tem sido alvo de crescente 12 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho interesse dado às inúmeras vantagens que essas formulações oferecem como aumento da solubilidade e estabilidade de fármacos, possibilidade de incorporação de fármacos hidrofílicos e lipofílicos, capacidade de agir como sistemas reservatórios, diminuição da toxicidade, assim como alterar a disponibilidade de fármacos dependendo da forma de interação entre o fármaco e o sistema (EVANGELISTA, 2006). Como a terapia utilizando análogos de nucleosídeos comumente está associada a efeitos adversos tóxicos e severos, o desenvolvimento de sistemas de liberação pode ser uma alternativa para o tratamento da AIDS. Há vários estudos envolvendo sistemas de liberação de fármaco antiretrovirais e uma boa revisão sobre este assunto pode ser encontrada em Ojewole e colaboradores (2008). A utilização de sistemas de liberação de fármacos antiretrovirais começou em 1990, porém foram nos últimos cinco anos que o maior número de publicações começou a surgir, mas há uma falta de dados no avanço de estudos de caracterização físico-química e mecanismos de ação destas formulações (OJEWOLE et al., 2008). Alguns sistemas desenvolvidos para melhorar a eficácia do AZT estão descritos a seguir. Benghuzzi e colaboradores (1990, 1989) estudaram a administração subcutânea em ratos de implantes cerâmicos de tricálcio de fósforo contendo AZT utilizando técnicas cirúrgicas. Estes sistemas mostraram sustentar a liberação por mais de 26 dias em ratos com doses entre 20 e 60 mg de AZT. O perfil de liberação obtido indicou que as flutuações plasmáticas do AZT puderam ser eliminadas utilizando estes tipos de sistemas de liberação. 13 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho Há estudos de encapsulação de AZT em lipossomas, os quais mostraram que a administração parenteral em ratos não desenvolveu toxicidade na medula, exibindo perfis normais de leucócitos e eritrócitos, além de atingir órgãos de alojamento do vírus como pulmões e baço (PHILLIPS; SKAMENE; TSOUKAS, 1991; PHILLIPS; TSOUKAS, 1992). A aplicação de lipossomas de AZT transdérmico aumentou o fluxo do fármaco através da pele de ratos quando comparado com o fármaco livre, contribuindo para o aumento da biodisponibilidade e direcionamento do AZT para determinados sítios de ação (SUBHEET; TIWARY; JAIN, 2006). Devido à baixa eficiência de encapsulação do AZT em lipossomas, foi testado o pró-fármaco AZT- miristato, cuja eficiência de encapsulação foi 98 % e os níveis plasmáticos e cerebrais foram maiores quando comparados com o AZT em solução, mostrando que o pró- fármaco associado a um sistema lipossomal pode direcioná-lo e melhorar sua ação (JIN et al., 2005). Os sistemas nanoparticulados estão ganhando bastante destaque na busca de melhores tratamentos para a AIDS (MAINARDES, 2007). Muitos desses estudos envolvem a encapsulação de antiretrovirais para direcionar a liberação para macrófagos. Recentemente, a afinidade de nanopartículas de ácido polilático e polietilenoglicol por leucócitos polimorfonucleares mostrou ser dependente das quantidades destes polímeros (MAINARDES et al., 2008). Nanocápsulas de AZT trifosfatado de poliisobutilcianoacrilato também promoveu a liberação celular in vitro em macrófagos (HILLAIREAU, et al., 2006). A liberação do AZT pode ser direcionada também para outros locais, como a mucosa gastrointestinal, como no estudo de Dembri e colaboradores (2000), que 14 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho desenvolveu nanopartículas de poli isohexilcianoacrilato para administração gastrintestinal. Dentre os antiretrovirais, o AZT é o mais estudado em sistemas transdémicos, e sua limitação é a baixa permeação cutânea (OJEWOLE et al., 2008). Por isso a maioria dos estudos foca a investigação de agentes permeantes, como carvacrol, timol, linalol e mentol (KARARLI; KIRCHHOFF; PENZOTTI, 1995). Para aplicação vaginal, D’Cruz e Uckun (2001) incorporaram um derivado do AZT em MEs, vaginal, pois este veículo mostrou ter alta capacidade para sua incorporação. Porém as MEs são fluidas, e para garantir viscosidade ideal do sistema e sua fixação na vagina foi adicionado carragena na formulação, para a ME adquirir consistência de gel (D’CRUZ; UCKUN, 2001). Há outros exemplos para aplicação vaginal do AZT, como o desenvolvimento de anéis vaginais para liberação diária do AZT composto por goma acácia, hidroxietilmetacrilato e metacrilato de sódio (HAN et al., 2007), e nanogéis de aplicação intravaginal constituídos de polietilamina e polímeros PEG/Pluronic® (KOHLI et al., 2007). A via retal tem sido considerada como efetiva para liberação do AZT, pois ela evita o metabolismo hepático e degradação gástrica. Foram encontrados na literatura dois estudos que incorporaram o AZT em supositórios (KAWAGUCHI et al., 1991; WINTERGERST et al., 1997), porém esta via não é muito explorada pela baixa adesão, além dos pacientes com AIDS freqüentemente apresentarem quadros de diarréia. 15 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho 2.5.Via de administração nasal Figura 2: Anatomia da via nasal. Até algumas décadas, a cavidade nasal tem sido considerada como uma via de administração de fármacos para terapias tópicas, como descongestionantes nasais. Recentemente, a possibilidade da cavidade nasal servir como via de administração em terapias sistêmicas, sobretudo com peptídeos e fármacos que sofrem metabolismo pré- sistêmico, como o AZT, tem tornado-se um tema importante de pesquisa (AULTON, 2005; MAINARDES et al., 2006; MAINARDES, 2007). 16 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho Os medicamentos atualmente comercializados ou nos diversos estágios de investigação clínica para liberação nasal incluem a lisipressina (Sandoz), oxitocina (Sandoz), desmopressina (Ferring), buserelina (Aventis), nafarelin (Searle), calcitocina (Novartis), vitamina B12 (Nature’s Bounty), nicotina, beclometasona, estradiol, progesterona, testosterona, propranolol, atenolol, metoprolol, buprenorfina, fenobarbital, nitroglicerina, penicilina, gentamicina, cocaína, diidroergotamina, leuprolida, insulina, interferon, glucagon e vacinas contra influenza, sarampo, poliomelite, etc (AULTON, 2005; ILLUM, 2003; MAINARDES et al., 2006). 2.5.1.Anatomia, fisiologia, mucosa e depuração mucociliar A região mais externa do nariz é o vestíbulo nasal, que abrange aproximadamente 15 mm, estendendo-se das narinas até a válvula nasal, com um comprimento de cerca de 60 mm e um volume de 20 mL, que chega até a nasofaringe. A cavidade nasal está dividida verticalmente, em quase toda a sua extensão, pelo septo nasal. Cada parede da cavidade nasal apresenta três dobras ou recortes denticulares conhecidos como cornetos ou conchas nasais. Essas dobras fazem com que a cavidade nasal possua uma área superficial relativamente grande (160 cm2), em comparação ao seu volume (300 μL). A elevada área superficial da cavidade nasal e abundante vascularização subjacente tornam esta via um bom lugar para absorção de fármacos (AULTON, 2005). A parte anterior do nariz, compreendida pelo vestíbulo nasal até a concha nasal, apresenta um epitélio escamoso estratificado. A parte superior da cavidade, que abrange 5 % da superfície total, é a membrana olfativa. Esta última apresenta células sensitivas 17 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho olfativas, assim como células serosas e mucóides, que estão aí localizadas por ser esta a região que passa o ar inspirado. A maior parte da cavidade nasal, contudo, é revestida por uma membrana mucóide que contém uma mistura de células colunares, calciformes e basais. As células colunares presentes no terço anterior do epitélio são células não ciliadas, enquanto que as restantes são ciliadas. Os cílios são pequenas projeções piliformes localizadas sobre a superfície exposta das células epiteliais. Cada célula contém em torno de 300 cílios, que medem entre 5 e 10 μm de comprimento e 0,1 a 0,3μm de diâmetro. Esses cílios ondulam em ritmo uniforme, com uma freqüência de 10Hz. Sua função é facilitar o movimento do muco da cavidade nasal para a nasofaringe e, finalmente, para o trato gastrintestinal. O efeito combinado desses cílios é denominado depuração mucociliar. O tempo estimado total de reposição do muco varia de 10 a 15 minutos, aproximadamente, sendo a meia vida de depuração mucociliar estimada em 20 minutos, e a taxa de depuração em torno de 5 mm/min. A depuração mucociliar é basicamente uma função de defesa, mas que constitui uma barreira à absorção de fármacos (AULTON, 2005; HAGERSTROM, 2003; ILLUM, 2003). A camada de muco tem, normalmente, uma espessura de 5 a 20 μm (AULTON, 2005) e consiste principalmente em 95 % de água, 2 % de mucina, 1 % de sais, 1 % de outras proteínas como albuminas, imunoglobulinas, lisozimas e lactoferrinas, e menos que 1 % de lipídeos. As moléculas de mucina são responsáveis pela característica viscosa do muco (DAVIES; VINEY, 1998). É produzido diariamente cerca de 1,5 a 2,0L de muco, o qual consiste em duas camadas, uma inferior solúvel e a superior gelificada (UGWOKE et al., 2005). 18 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho 2.5.2.Bio e Mucoadesão A bioadesão pode ser definida como o estado em que dois materiais, dentre os quais pelo menos um é de natureza biológica, sejam mantidos juntos por um período prolongado de tempo através de forças interfaciais (SMART, 2005). Na década de 1980 esse conceito começou ser aplicado em sistemas de liberação de fármacos. Ele consiste na incorporação de moléculas adesivas em algum tipo de formulação farmacêutica, a qual fica em contato íntimo com o tecido de absorção, liberando o fármaco perto do local de ação, com o conseqüente aumento da biodisponibilidade, promovendo efeitos locais e sistêmicos (HÄGERSTRÖM, 2003; WOODLEY, 2001). O potencial dos sistemas mucoadesivos consiste em prolongar o tempo de residência da formulação no local de absorção e promover o contato intensificado com a barreira epitelial (HÄGERSTRÖM, 2003). As mucosas são as principais vias de administração para os sistemas bioadesivos, embora também seja relatada a necessidade de desenvolvimento de novas formulações bioadesivas para aplicação dérmica, quando se deseja uma ação cutânea prolongada. É difícil esperar um efeito prolongado com a aplicação de cremes, soluções e loções, pois a umidade, a temperatura e os movimentos podem removê-los facilmente da pele (SHIN et al., 2003). A mucosa mais utilizada para administração e absorção de fármacos é a gastrintestinal (JUNGINGER; THANOU; VERHOEF, 2002), mas outras rotas também são estudadas, como a nasal, ocular, bucal, vaginal, retal, oral e periodontal (BRUSCHI, 2007; HÄGERSTRÖM, 2003; WOODLEY, 2001). Sistemas bioadesivos aplicados em mucosas freqüentemente são definidos como mucoadesivos, mas os termos podem ser intercambiáveis (LEUNG; ROBINSON, 19 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho 1990). Há autores que definem sistemas mucoadesivos como aqueles que se liga com as moléculas da camada de muco, mas na verdade, é difícil distinguir se a ligação se dá entre a superfície celular ou entre as moléculas da camada de muco e, além disso, muitos bioadesivos se ligam a ambas as estruturas (WOODLEY, 2001). É possível delinear um sistema mucoadesivo nas mais variadas formas farmacêuticas, uma vez que a propriedade da adesão depende das características do material utilizado para sua preparação (EVANGELISTA, 2006). Portanto, diferentes sistemas de liberação já conhecidos podem ser formulados utilizando moléculas mucoadesivas, e tornarem-se assim, mucoadesivos. Essa estratégia para conferir mucoadesão foi empregada no desenvolvimento de vários tipos de sistemas de liberação, e alguns exemplos estão citados a seguir. Sistemas sólidos nano e microparticulados que controlam a liberação do fármaco através da erosão da matriz, podem adicionalmente ter capacidade mucoadesiva se em sua formulação for adicionado polímeros bioadesivos (BRAVO- OSUNA et al., 2007; WITTAYA-AREEKUL; KRUENATE; PRAHSARN, 2006). As microemulsões podem ser formuladas com polímeros bioadesivos, como o policarbofil, e manter suas características de estabilidade termodinâmica, isotropia, fluidez e solubilização de fármacos (VYAS et al., 2006). As formulações para higienização bucal também podem empregar polímeros bioadesivos no desenvolvimento de dispersões coloidais para prolongar o contato com a mucosa bucal (KOCKISCH, et al., 2001). Embora os estudos dos mecanismos envolvidos na mucoadesão e o desenvolvimento de novos sistemas e polímeros mucoadesivos tenham evoluído nos últimos vinte anos, a mucoadesão ainda não é totalmente compreendida. As técnicas empregadas na quantificação e qualificação ainda são tratadas de forma isolada. Uma 20 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho ampla revisão sobre o assunto pode ser encontrada em Andrews, Laverty e Jones (2008) e Carvalho et al. (2009). 2.5.2.1.Materiais mucoadesivos O primeiro trabalho que propôs a utilização de um material mucoadesivo foi desenvolvido por Nagai e colaboradores (1984), o qual promoveu a melhora do tratamento local de afta na mucosa oral, utilizando comprimidos adesivos. Adicionalmente, foi observado um aumento da biodisponibilidade sistêmica da insulina quando administrada por via nasal na forma de pó bioadesivo em cães (NAGAI, 1985). A partir de então, materiais bioadesivos passaram a ser utilizados como promotores da absorção através de várias vias de administração. As primeiras experiências utilizaram polímeros já conhecidos e encontrados no mercado, como os ácidos poliacrílicos. Atualmente, as novas pesquisas procuram desenvolver materiais que direcionam a formulação no local de ação, e que além da mucoadesão, ofereça outras funções, como, por exemplo, a modulação da permeação em tecidos epiteliais, e inativação de enzimas que possam inibir a ação do sistema de liberação (HÄGERSTRÖM, 2003). Há uma variedade de materiais empregados no desenvolvimento desses sistemas e os mais estudados são os polímeros derivados do ácido poliacrílico, como o policarbofil e os carbômeros, polímeros derivados da celulose, como a hidroxietilcelulose e a carboximetilcelulose, os alginatos, a quitosana e derivados e, mais recentemente, os chamados sistemas multifuncionais (GRABOVAC; GUGGI; BERNKOP-SCHNÜRCH, 2005; SMART, 2005). Esses novos sistemas mucoadesivos multifuncionais são classificados na literatura como polímeros de segunda geração (LEE; PARK; ROBINSON, 2000). Eles são uma alternativa aos bioadesivos não- 21 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho específicos (SMART, 2005), pois se ligam ou se aderem em estruturas químicas específicas na superfície das células ou muco. Bons exemplos dessas moléculas são as lectinas, invasinas, proteínas fimbriais (WOODLEY, 2001), anticorpos (CHOWDARY; RAO, 2004) e adição de grupos tiólicos em moléculas já conhecidas (BRAVO-OSUNA et al., 2007). Há também os hidrogéis que possuem a capacidade de se gelificar in situ após o contato com algum estímulo ambiental no local de ação. São os polímeros denominados sensíveis ao ambiente, classificados como termosensíveis, como os poloxâmeros e os carbômeros (BRUSCHI et al., 2007; PARK et al., 2001), sensíveis ao pH, como o ácido poliacrílico, os quais apresentam viscosidade aumentada em valores altos de pH, sensíveis à glicose, como polímeros ligados a concavalina A, sensíveis a um sinal elétrico, como ácido polimetacrílico, sensíveis à luz, como ácido hialurônico (QIU; PARK, 2001) e sensíveis à concentração iônica, como a goma gelana (HAGERSTROM; PAULSSON; EDSMAN, 2000). Utilizando o mesmo raciocínio, há outra classe de substâncias sendo identificada como mucoadesivas, capazes de formar cristais líquidos (CLs), os quais podem agir como uma matriz de liberação do fármaco, e que devido sua alta viscosidade, pode permanecer por maior tempo em contato com a mucosa (SHAH et al., 2001). Alguns ácidos graxos como os monoglicerídeos monoleato e monolinoleato de glicerila, e copolímeros etoxilados são capazes de formar mesofases líquido cristalinas em presença de água na temperatura corpórea (MALMSTEN, 1996; SHAH et al., 2001; URBAN, 2004). A alta viscosidade dos CLs torna difícil sua administração, mas a administração de um sistema precursor de CL pode levar à formação da rede líquido cristalina após o contato com a mucosa, através de um estímulo orgânico, como temperatura e 22 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho concentração de líquidos (BRUSCHI et al., 2007; NIELSEN; SCHUBERT; HANSEN, 1998; SHAH et al. 2001). A mucoadesão tanto dos hidrogéis como das matrizes líquido cristalinas pode ser explicada pelas propriedades reológicas destes sistemas, que diminuem a depuração mucociliar e aumentam o tempo de contato da formulação com a mucosa (BRUSCHI et al., 2007; NIELSEN; SCHUBERT; HANSEN, 1998). Com o desenvolvimento de materiais mucoadesivos mais inteligentes, é possível oferecer uma característica carreadora única para muitos fármacos. Eles podem ser projetados para aderir em qualquer mucosa, como a nasal, ocular, bucal, respiratória, urinária, gastrintestinal, etc. Os materiais mucoadesivos podem melhorar a biodisponibilidade, diminuir efeitos sistêmicos indesejáveis, melhorar a absorção e transporte de fármacos. Finalmente, com esses materiais é possível empregar fármacos já conhecidos e produzir novos produtos com menores custos. 2.5.2.2.Metodologias para análise da mucoadesão O número de metodologias empregadas para analisar a mucoadesão está constantemente em crescimento, embora o emprego dos mais diferentes métodos cause às vezes incoerência entre os resultados, os quais ficam difíceis de comparar, devido às diferenças entre os parâmetros e condições experimentais (SIGURDSSO; LOFTSSON; LEHR, 2006). Há várias metodologias propostas, e elas podem ser divididas entre testes in vivo e testes in vitro/ex vivo. Como exemplos de testes in vivo podem ser citados os que utilizam gamacintilografia (SÄKKINEN et al., 2006) e os que medem o tempo de trânsito gastrintestinal em animais de uma maneira não invasiva; os sistemas de liberação 23 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho podem ser formulados com radioisótopos opacos e monitorados por raios-X sem afetar a motilidade normal do trato gastrintestinal (CHOWDARY; RAO, 2004). Os testes in vitro/ex vivo encontrados foram técnicas que utilizam saco intestinal de ratos (SANTOS et al., 1999; TAKEUCHI et al., 2005); técnicas que analisam interações moleculares envolvidas na mucoadesão, como a utilização da espectroscopia dielétrica de baixa freqüência (HÄGERSTRÖM; EDSMAN; STRØMME, 2003) e potencial zeta (TAKEUCHI et al., 2005); métodos de escoamento de líquidos que simulam a depuração em mucosas (NIELSEN; SCHUBERT; HANSEN, 1998; RANGO RAO; BURI, 1989); métodos que utilizam imagem, como a microscopia eletrônica (MATHIOWITZ; CHICKERING; LEHR, 1999), microscopia de força atômica (CLEARY; BROMBERG; MAGNER, 2004; MATHIOWITZ; CHICKERING; LEHR, 1999), microscopia de fluorescência e microscopia confocal com varredura a laser (KEELY et al., 2005). Há também os testes que medem a força de mucoadesão e que utilizam reologia, os quais são objetos de pesquisa neste trabalho, e que serão detalhados no próximo item. Os testes in vitro/ex vivo são importantes durante o desenvolvimento do sistema bioadesivo de liberação controlada, pois contribuem para estudos de permeação, liberação, compatibilidade, estabilidade mecânica e física das formulações, análise da interação superficial da formulação com a mucosa e força da ligação bioadesiva. Estes testes podem simular as mais diferentes mucosas, como nasal, oral, bucal, periodontal, nasal, gastrintestinal, vaginal e retal (BRUSCHI; FREITAS, 2005), e diminuir assim o uso de animais. 24 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho 2.5.2.2.1.Métodos que medem a força de mucoadesão A maioria das metodologias in vitro/ex vivo encontradas na literatura baseia-se na avaliação da força de mucoadesão, ou seja, da força requerida para quebrar a ligação entre a membrana modelo e o mucoadesivo. Dependendo da direção em que o mucoadesivo é separado do substrato, pode-se obter a força de destacamento, a força de cisalhamento e a força de tensão à ruptura (HÄGERSTRÖM, 2003), conforme indicado na Figura 3. Figura 3: Representação das forças que podem ser medidas em testes de mucoadesão. O tipo de força mais avaliado nesses testes é a tensão à ruptura (BROMBERG et al., 2004; BRUSCHI et al., 2007; HÄGERSTRÖM, 2003). O equipamento é normalmente um analisador de textura ou uma máquina universal de ensaios, o qual mede a força aplicada na remoção da formulação a partir de uma membrana modelo, que pode ser um disco de mucina (BRUSCHI et al., 2007) ou um pedaço de mucosa animal, como mucosa nasal suína (HÄGERSTRÖM, 2003) e mucosa de intestino de rato (BROMBERG et al., 2004). A partir dos resultados obtidos, pode ser construída a curva força-distância, em que são obtidos a força de separação e o tempo de contato (BRUSCHI et al., 2007), o trabalho de tração (área sob a curva durante a retirada da mucosa), o pico de força e a deformação do sistema até a ruptura (HÄGERSTRÖM, 2003). Esse método é mais utilizado para analisar sistemas sólidos, como microesferas 25 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho (CHOWDARY; RAO, 2004), embora haja também estudos de materiais semi-sólidos (BROMBERG et al., 2004; BRUSCHI et al., 2007). 2.5.2.2.2.Métodos reológicos Essa categoria de métodos é realizada totalmente in vitro e foi proposta primeiramente por Hassan e Gallo (1990), utilizando ensaios viscosimétricos para analisar macroscopicamente a interação formulação-mucina. A partir desse teste, é possível obter a força de mucoadesão através do monitoramento das mudanças viscosimétricas do sistema formado pela mistura da mucina e o do sistema escolhido. A maior desvantagem desse método é quebra das cadeias formadas pelo sistema e a mucina sob escoamento contínuo. Para evitar esse problema, adaptou-se método viscosimétrico utilizando a reologia oscilatória (CALLENS, et al., 2003; HÄGERSTRÖM, 2003). Partindo do mesmo pressuposto de que a resposta reológica da mistura sistema-mucina deve ser maior que as contribuições da formulação e da mucina isolados, pode ser obtido o parâmetro denominado sinergismo reológico ou parâmetro de interação. Esse método é mais vantajoso em relação ao de origem, pois a reologia oscilatória é uma técnica não destrutiva, a qual mede, simultaneamente, tanto a viscosidade como o comportamento viscoelástico e pode ser usada para determinar mucoadesão entre o sistema mucoadesivo e mucina (CALLENS et al., 2003). Nos ensaios oscilatórios podem ser obtidos os módulos elástico (G´) e viscoso (G´´) e a magnitude destes módulos é uma indicação qualitativa da estrutura do sistema. Se G’>> G”, pode-se sugerir que o sistema está interligado quimicamente, ou se G’>G” o sistema está estruturado por ligações secundárias, mas se G’≤ G”, diz-se que as moléculas do sistema estão ligadas apenas por interações físicas (CEULEMANS; VINCKIER; LUDWIG, 2002). 26 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho A medida quantitativa do sinergismo reológico (ΔG’) pode ser calculada tanto em relação ao G’ como ao G” (CALLENS et al., 2003; CEULEMANS; VINCKIER; LUDWIG, 2002), como segue na Equação 1. [ ]mucinasistemamistura GGGG ´´´´ +−=Δ (Eq. 1) Sob uma tensão constante e em baixas freqüências, sistemas mais estruturados apresentam o módulo elástico G’ maior que o viscoso G’’ e ambos são independentes da freqüência. Num gráfico duplo logarítmico são representados por uma reta constante. Para sistemas mais fracamente estruturados, os módulos dinâmicos são dependentes da freqüência e é observada nesse mesmo gráfico uma inclinação da curva (CALLENS et al., 2003; CEULEMANS; VINCKIER; LUDWIG, 2002). Hägerström (2003) expõe um parâmetro de sinergismo reológico alternativo, denominado parâmetro de sinergismo reológico relativo ( relativoG´Δ ), calculado a partir da Equação 2 e com o qual é possível comparar quantitativamente a força da mistura sistema-mucina em relação ao sistema isolado: ( ) s smistura s relativo G GG G GG ´ ´´ ´ ´´ − = Δ =Δ (Eq. 2) em que ´GΔ é o sinergismo reológico, dado pela diferença do módulo elástico da mistura (G’mistura) e o módulo elástico do sistema (G’s). Com essa relação, pode ser consideradas quantas vezes a mistura da formulação com a mucina é mais forte ou mais fraca que a formulação sozinha. Entretanto, relativoG´Δ tem a desvantagem de ter um limite negativo até -1, enquanto que os valores positivos vão até o infinito. Por isso, a magnitude dos valores positivos não pode ser comparada com os negativos. É proposto então um novo parâmetro relativo, chamado relação logarítmica do módulo elástico ( ´logG ), dado pelo 27 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho logaritmo da divisão do módulo elástico da mistura ( misG ) pelo módulo elástico do sistema (G’s), indicado na Equação 3. ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ = s mis G GG ´ ´log´log (Eq. 3) O uso desse parâmetro oferece a vantagem dos valores positivos e negativos terem a mesma magnitude e poderem ser comparados. Por exemplo, o valor 1 significa que o G´ da mistura é 10 vezes maior que do sistema isolado. Esta relação pode ser feita desde que não atinja valores na escala negativa (HÄGERSTRÖM, 2003). 2.6.Sistemas de liberação estabilizados com tensoativos Moléculas de tensoativos podem se auto-agregar na presença de água formando uma rica variedade de estruturas. Quando são incorporados em misturas imiscíveis de óleo e água, eles podem se localizar na interface óleo/água, resultando em diferentes estruturas de escala macroscópica ou microscópica, como as MEs e CLs. A Figura 4 dá uma indicação das possíveis estruturas que os tensoativos podem formar na presença de água, óleo, ou na combinação de ambos (LAWRENCE; REES, 2000). Esse fenômeno comum de auto-organização molecular para atingir a estabilidade termodinâmica é a base para a aplicação tecnológica dos tensoativos como potencial sistema de liberação de fármacos. A mistura de componentes de diferentes polaridades, com diferentes constantes dielétricas, como óleo e água, na presença do tensoativo, agregam-se de tal forma a possibilitar diferentes regiões adicionais de solubilização (KREILGAARD, 2002). Essa propriedade possibilita compartimentalizar o fármaco, podendo direcioná-lo para os 28 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho sítios onde deverá exercer o efeito farmacológico, além de poder controlar a velocidade de liberação, sem alterar a estrutura química da molécula transportada, sendo considerados, portanto sistemas reservatórios. Nestes tipos de sistemas, o fármaco encontra-se separado do meio de dissolução através de um revestimento, uma membrana, ou uma interface, devendo transpor essa barreira para ser liberado do meio. As MEs e CLs são sistemas reservatórios, nos quais a face interna constitui um microambiente restrito, com propriedades particulares, podendo ligar ou associar moléculas com diferentes polaridades (OLIVEIRA et al., 2004). Figura 4: Seqüência teórica dos diferentes tipos de fases formadas dependendo do parâmetro de empacotamento, dado pela geometria do tensoativo, teor de água, e outros fatores como temperatura, presença de sais etc. Fonte: LOPES, 2005. 29 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho 2.6.1.Diagrama de fases Como a existência dos diferentes tipos de agregados é decorrente do comportamento termodinâmico exibido pelas diferentes combinações dos componentes do sistema, pode ser utilizado um diagrama ternário para avaliar o comportamento de fases de sistemas dessa natureza. Eles são constituídos na forma de triângulos eqüiláteros, onde os lados são usados como eixos, correspondendo aos constituintes. Geralmente, a proporção de cada componente é representada como porcentagem de peso total da formulação, e assim, cada vértice corresponde a 100% do componente indicado. No interior do triângulo, o comportamento termodinâmico é descrito delimitando-se as regiões em que ocorrem MEs, CLs, emulsão ou separação de fases. Tais diagramas possibilitam a visualização simultânea entre a quantidade relativa dos constituintes e o decorrente comportamento físico-químico do sistema obtido. Desta forma, os diagramas são como ferramentas capazes de identificar as regiões em que ocorrem as MEs e CLs e, através deles os pesquisadores podem escolher sistemas com viscosidade e características apropriadas aos seus propósitos (OLIVEIRA et al., 2004). 2.6.2.Microemulsões e Cristais Líquidos As MEs são definidas como sistemas transparentes, caracterizados pela mistura de óleo, água, tensoativo e co-tensoativo, formando um sistema isotrópico, termodinamicamente estável e que se forma espontaneamente. São geralmente caracterizados como agregados esféricos com diâmetro muito pequeno, na faixa de 5 nm a 140 nm, enquanto que o diâmetro das gotículas de uma emulsão estável é da ordem de 0,1 μm a 100 μm. As MEs são classificadas como sistemas coloidais com 30 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho diâmetro de partícula menor que ¼ do comprimento de onda da luz incidente e, portanto, não espalham luz. Este fato explica porque as MEs são sistemas opticamente transparentes. As MEs diferem das emulsões comuns não só por serem transparentes, mas essencialmente pela estabilidade termodinâmica. A utilização de co-tensoativos em MEs não é obrigatória, e sistemas microemulsionados formados na sua ausência têm sido descritos na literatura (AULTON, 2005; LAWRENCE; REES, 2000). Dados da literatura sugerem que microemulsões A/O possam ser usadas para aumentar significativamente a absorção de moléculas hidrossolúveis (OLIVEIRA et al., 2004). Os CLs são sistemas cujas características físicas os posicionam entre sólidos e fundidos, com parcial ordem/desordem das espécies atômicas. Por esse motivo, são também chamados de mesofases (HYDE, 2001). Podem ser consideradas estruturas ordenadas com arranjo molecular caracterizado por regiões hidrofóbicas e hidrofílicas alternadas. Conforme altera a concentração de tensoativo, diferentes formas líquido- cristalinas podem ser formadas, como lamelares, hexagonais e cúbicas. Materiais que formam CLs pela adição de solventes são chamados CLs liotrópicos, enquanto CLs termotrópicos têm sua estrutura dependente da temperatura. A fase lamelar é formada por camadas paralelas e planares de bicamadas de tensoativo separadas por camadas de solvente, formando uma rede unidimensional. Já na fase hexagonal, os agregados são formados pelo arranjo de cilindros longos formando estruturas bidimensionais. Nos sistemas de fase cúbica, as moléculas estão arranjadas numa estrutura tridimensional, a qual consiste de duas redes congruentes de canais de água envolvidos por bicamadas lipídicas ou de tensoativo (FORMARIZ et al., 2005, URBAN, 2004). Vários autores reportam que estruturas líquido cristalinas apresentam baixas velocidades de liberação de fármacos, já que os CLs possuem microestruturas altamente organizadas e alta viscosidade (MUELLER-GOYMANN; HAMENN, 1993; TROTTA et al., 1995). 31 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho Para entender a formação destas estruturas, deve-se levar em consideração a composição do sistema, presença de sais, óleos e co-tensoativos, temperatura e estrutura do tensoativo. Para formação de lamelas, os tensoativos normalmente têm a forma cilíndrica, e para formação da fase hexagonal e micelar, ele ocupa a área de um cone. Para entender qual tipo de estrutura do tensoativo é preferida para formar determinado sistema, pode ser considerado o parâmetro de empacotamento crítico (PEC), definido como PEC=v/a.l, em que v é volume da cadeia hidrofóbica, a é área da cabeça polar e l o comprimento da cadeia hidrofóbica. Como pode ser visto na Figura 4, há uma correlação direta entre os valores de PEC e o tipo de agregado formado (MALMSTEN, 1999). Na literatura são reportadas inúmeras maneiras de se aplicar estes sistemas na liberação de fármacos, mas em particular, para a via nasal, não há muitos relatos. Como exemplos, podem ser citados os estudos que utilizam a via nasal como rota para atingir o sistema nervoso central, como MEs compostas de polioxietileno-35-ricinoleato como tensoativo e polisorbato 80 como co-tensoativo para liberação do clonazepam (VYAS et al., 2006a), e compostas pelo tensoativo glicerídeo macrogol caprilocaproil, mistura de dietilenoglicol éter monoetílico como fase oleosa e polietilenoglicol como co-tensoativo para liberação do sumatriptam (VYAS et al., 2006b). Foi encontrado também ME composta por Tween 80 como tensoativo e pela mistura de propilenoglicol e etanol como co-tensoativos para rápida liberação nasal do diazepam (LI; NANDI; KIM, 2002). 32 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho 2.6.3.Caracterização físico química Para identificar as fases ou investigar as suas microestruturas, deve-se garantir primeiramente que elas estejam quimicamente estáveis, em equilíbrio (MALMSTEN, 1999). 2.6.3.1.Microscopia de Luz Polarizada A microscopia de luz polarizada (MLP) permite estudar estruturas anisotrópicas e birrefringentes. O microscópio de luz polarizada é um microscópio comum, onde junto ao condensador se coloca um polarizador, que orienta as ondas luminosas provenientes da fonte de luz em uma só direção, em um só plano. As alterações que uma substância birrefringente provoca na direção da propagação da luz, em um equipamento desse tipo, são feitas graças ao analisador, um segundo sistema de polarização, junto à ocular. O máximo de luz é obtido quando o polarizador e analisador estão com eixos em paralelo e, ao contrário, a luz extingue quando são perpendiculares (ABRAMOWITZ et al., 2005). Alguns CLs exibem estruturas anisotrópicas, e com isso são obtidas imagens característica do tipo de fase formada. Por exemplo, a fase lamelar pode ser identificada através da visualização das “cruzes de malta” e a fase hexagonal através da presença de estrias ou estruturas parecidas com fibras. Já as estruturas isotrópicas como as MEs e as fases cúbicas, por não desviarem a propagação da luz polarizada, são visualizadas como campo escuro. 2.6.3.2.Reologia Na década de 1990 houve aumento no interesse em estudos reológicos de CLs liotrópicos devido à semelhança desses sistemas coloidais com sistemas em organismos 33 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho vivos. Além disso, dependendo da concentração do solvente (água ou soluções aquosas) e da polaridade do solvatado, os CLs podem submeter-se a várias transformações e modificações estruturais (MAKAI et al., 2003). Essa resposta reológica durante o processo está diretamente relacionada com as mudanças na microestrutura, a qual pode contribuir significativamente para benefícios funcionais. A reologia ajuda a estabelecer um entendimento teórico das relações entre as propriedades viscoelásticas e as microestruturas do sistema (SIDDIG; RADIMAN; MUNIANDY, 2006). A correlação entre tensão de cisalhamento e taxa de cisalhamento que define o comportamento de fluxo de um líquido é mostrada graficamente em diagramas chamados de curvas de fluxo. Os diferentes tipos de curva de fluxo têm seus correspondentes tipos de curva de viscosidade. As curvas de fluxo representam duas partes do experimento, a curva ascendente que indica o aumento da taxa de cisalhamento, e a curva descendente, quando a taxa de cisalhamento é reduzida continuamente (SCHRAMM, 2006). A curva ascendente representa o comportamento do fluxo, que pode ser comportamento de fluxo newtoniano, pseudoplástico, plástico e dilatante. O fluxo newtoniano é representado por uma reta, e a razão de todos os pares de valores de tensão e taxa de cisalhamento pertencentes a essa reta é constante. Isso significa que a viscosidade não é afetada por mudanças na taxa de cisalhamento, já que ela é a tangente do ângulo α. O fluxo é pseudoplástico quando sofre diminuição de viscosidade quando a taxa de cisalhamento aumenta. Esse aumento favorece a reorientação das partículas rígidas na direção do fluxo, e as interações intermoleculares que causam resistência ao fluxo tornam-se menores, provocando o afinamento do fluxo, conhecido por shear thinning. O fluxo plástico é descrito como os líquidos pseudoplásticos, mas com limite 34 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho de escoamento, e na curva intercepta a ordenada não na origem, mas no ponto crítico (yield point). O comportamento de fluxo dilatante é caracterizado pelo aumento da viscosidade quando a taxa de cisalhamento aumenta (SCHRAMM, 2006). A partir da curva descendente obtemos informações quanto à tixotropia do sistema. Um líquido tixotrópico é definido pelo seu potencial de ter uma estrutura reversível, sempre que a amostra for mantida em repouso, e essa mudança deve ser reprodutível diversas vezes. A reconstrução pode ser tempo independente quando as curvas de ida e de volta se sobreporem, indicando que o sistema reverte rapidamente para sua estrutura original. Será tempo dependente quando a viscosidade retorna a aumentar mais lentamente do que diminuiu inicialmente com o shear thining, e entre as duas curvas forma uma área de histerese, que define a magnitude da tixotropia. Essa área indica a energia necessária para quebrar a estrutura tixotrópica. Graficamente, a histerese da curva de fluxo gira no sentido horário (SCHRAMM, 2006). 2.6.3.3.Espalhamento de raios X a baixo ângulo A utilização da técnica de Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) na caracterização de sistemas é explicada pela possibilidade de se determinar o tamanho médio e a distância entre os objetos espalhadores, como gotículas, micelas ou estruturas cristalinas. Além disso, essa técnica permite avaliar a estrutura de objetos espalhadores mesmo que eles não estejam organizados de forma ordenada. Ao irradiar uma amostra bifásica numa plaqueta relativamente fina, com um feixe de luz monocromático (luz visível, raios-x, nêutrons, elétrons), observa-se o espalhamento da radiação na vizinhança angular próxima a do feixe transmitido. O espalhamento de raios X deve-se às heterogeneidades na densidade eletrônica das 35 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho estruturas do sistema. Considerando uma partícula de tamanho e forma qualquer, a intensidade espalhada I(q) é proporcional ao fator de forma P(q) desta partícula, em que q é o vetor de espalhamento (NIELSEN et al., 1993). É possível observar diferentes regiões na curva de intensidade do feixe espalhado em função do vetor de espalhamento q, as quais são exploradas na técnica de SAXS, como a região de Porod para altos valores de q, e para valores em baixos limites de q tem-se a região de Guinier. Nessas regiões é onde ocorre o espalhamento de raios- X a baixo ângulo, que fornece informações a respeito da morfologia e mecanismos de agregação estrutural (CHIAVACCI, 1996). Num sistema diluído, em que as partículas são isoladas uma das outras e não interagem entre si, a intensidade espalhada é descrita unicamente pelo fator de forma P(q) (GUINIER, 1964). Sistemas formados pela associação de água, óleo, estabilizados com quantidades de tensoativo abaixo da concentração micelar crítica (CMC) requerida, a intensidade obtida pelo SAXS pode ser similar à observada em partículas diluídas ou monodispersas. A intensidade resultante é a soma das contribuições de cada partícula, de modo que, para n partículas distribuídas ao acaso têm-se: ∑∝ n n qPqI )()( (Eq. 4) Em um sistema concentrado, as partículas espalhadoras são numerosas e interagem entre si, e o espalhamento medido refletirá sua geometria e arranjo. Sistemas cuja concentração de tensoativo é superior à CMC, as interações entre as moléculas de tensoativo começam a ocorrer em diferentes graus de organização. O padrão de espalhamento poderá então ser similar ao observado em partículas dispersas numa matriz homogênea (FORMARIZ et al., 2007). Para N partículas idênticas, distribuídas 36 Revisão Bibliográfica Flávia Chiva Carvalho ao acaso, a intensidade espalhada é descrita pela Equação 5, em que S(q) é o fator de estrutura do conjunto: )()( ..)( qq SPNqI =