RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 29/06/2022. Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Análise comparativa dos efeitos do biopesticida azadiractina e do inseticida sintético piriproxifem nos testículos de Ceraeochrysa claveri (Navás, 1911) (Neuroptera: Chrysopidae). Uma abordagem morfológica, ultraestrutural e molecular ANA SILVIA GIMENES GARCIA Orientadora: Profa. Dra. Daniela Carvalho dos Santos Co-Orientador: Prof. Dr. Elton Luiz Scudeler Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. BOTUCATU – SP 2021 Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA 1 Agradecimentos ____________________________________________________________ 2 Agradeço primeiramente à minha família, especialmente meus pais Orlando e Silvia, e minhas irmãs Selma e Tatiane, por sempre me incentivarem e compreenderem minha ausência em tantos momentos. Ao meu namorado Fernando pelo apoio incondicional em todos os momentos, e por sempre me incentivar a ser melhor. Profa. Daniela, por tudo o que fez por mim nesses mais de 10 anos de parceria. Por abrir as portas de seu laboratório e por toda a ajuda, tanto profissional quanto pessoal. Serei eternamente grata por tudo. Prof. Elton, por toda parceria nesses anos como colega de laboratório, amigo, e co- orientador. Muito obrigada por todos os ensinamentos. CAPES, pela bolsa de estudos concedida (Código de Financiamento 001). Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela bolsa de estudos e auxílio concedidos (Processos 2017/09901-1 e 2017/15120-2). Ao Marino e funcionários do laboratório CETMA - Comércio de Agentes para Controle Biológico Ltda., Lençóis Paulista-SP, pelo fornecimento de material biológico utilizado neste trabalho. Ao Fábio, por toda a ajuda com a análises de bioinformática. Aos funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica: Carolina, Claudete, Luciana, Maria Helena, Shelly e Tiago. Muito obrigada por toda a ajuda nos experimentos, e mais do que isso, pelo companheirismo e amizade durante todos esses anos. Aos amigos que fiz em Botucatu: Shelly, Márcio (Gabi e Pedrinho tb!), Aime, Mari, Junior, Bertha, Giovana, Ana Júlia, Ariane, Brenda, David e Andrea. Vocês contribuiram, e muito, para a realização desse trabalho (e para minha saúde mental!). Aos colegas e professores do departamento por toda ajuda e empréstimos de equipamentos e reagentes! Aos funcionários do Departamento de Morfologia, da Seção de Pós-graduação, biblioteca, enfim, do IB, meu muito obrigada pela atenção e serviços prestados. 3 “nós não precisamos de muita coisa só precisamos uns dos outros... e de sonhos” (Oscar Wilde) 4 SUMÁRIO RESUMO ........................................................................................................... 5 ABSTRACT ....................................................................................................... 6 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................. 7 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 12 3. REFERÊNCIAS ................................................................................................. 13 4. RESULTADOS .................................................................................................. 19 4.1. CAPÍTULO 1 ..................................................................................................... 20 4.2. CAPÍTULO 2 ..................................................................................................... 46 5. CONSIDERAÇÕES FINAIS.............................................................................. 65 5 Resumo Insetos da família Chrysopidae são inimigos naturais utilizados no controle biológico, sendo uma importante ferramenta na agricultura orgânica e no manejo integrado de pragas. Além do controle biológico utilizando esses insetos, o uso de inseticidas naturais vem ganhando grande destaque, pois são menos prejudiciais ao homem e ao ambiente. Entretanto, o uso de inseticidas sintéticos ainda é muito alto e acaba interferindo no ciclo de vida dos inimigos naturais, e consequentemente, no controle biológico de pragas. Com o propósito de avaliar o efeito da azadiractina e piriproxifem sobre os testículos do crisopídeo Ceraeochrysa claveri, insetos foram expostos a esses compostos nas concentrações 12 e 36mg i.a./L para a azadiractina (formulação comercial Azamax®), e 50 e 100mg i.a./L para o piriproxifem (formulação comercial Tiger 100 EC®). Os testículos de adultos foram avaliados através de técnicas morfológicas e análise do transcriptoma, além da avaliação do ciclo de vida dos insetos, fecundidade e fertilidade. Os resultados mostraram que os dois inseticidas causaram poucas alterações morfológicas nos testículos, como espaçamento entre os cistos, e alterações na túnica que o recobre. Os grupos tratados não apresentaram alterações nas marcações dos filamentos de actina e microtúbulos, bem como nas análises estatísticas, onde houve apenas redução da fecundidade, mas mantendo a viabilidade dos indivíduos gerados. Já a análise do transcriptoma apontou diferença na expressão dos genes de nucleoporinas, proteínas ribossomais e dedo de zinco, podendo estar relacionadas ao processo de espermatogênese e fecundidade dos insetos. Esses resultados nos mostram que os dois inseticidas podem ser adequados para uso em programas de manejo que visam conservar e aumentar a população de inimigos naturais, entretanto a compatibilidade em campo desses inseticidas com C. claveri deve ser avaliada. Palavras-chave: Ceraeochrysa claveri; morfologia; azadiractina; piriproxifem; transcriptoma; testículos 6 Abstract Insects of the Chrysopidae family are natural enemies used in biological control, being an important tool in organic agriculture and in integrated pest management. In addition to the biological control using these insects, the use of natural insecticides has gained great prominence, as they are less harmful to man and the environment. However, the use of synthetic insecticides is still very high and ends up interfering in the life cycle of natural enemies, and consequently, in the biological control of pests. In order to evaluate the effect of azadirachtin and pyriproxyfen on the testes of the chrysopid Ceraeochrysa claveri, insects were exposed to these compounds in concentrations 12 and 36mg ia / L for azadirachtin (commercial formulation Azamax®), and 50 and 100mg ia / L for pyriproxyfen (commercial formulation Tiger 100 EC®). Adult testes were evaluated using morphological techniques and transcriptome analysis, in addition to assessing the life cycle of insects, fecundity and fertility. The results showed that the two insecticides caused few morphological changes in the testes, such as spacing between the cysts, and changes in the tunic that covers it. The treated groups showed no changes in the markings of the actin filaments and microtubules, as well as in the statistical analyzes, where there was only a reduction in fecundity, but maintaining the viability of the generated individuals. The analysis of the transcriptome pointed out a difference in the expression of the genes of nucleoporins, ribosomal proteins and zinc finger, which may be related to the process of spermatogenesis and fecundity of insects. These results show us that the two insecticides may be suitable for use in management programs that aim to conserve and increase the population of natural enemies, however the compatibility in the field of these insecticides with C. claveri must be evaluated. Keywords: Ceraeochrysa claveri; morphology; azadirachtin; pyriproxyfen; transcriptome; testis 7 1. Introdução A família Chrysopidae contém cerca de 1200 espécies distribuídas em 75 gêneros e 11 subgêneros. As larvas de todas as espécies, bem como alguns adultos, são predadoras e podem ser importantes no controle biológico de insetos praga. Ceraeochrysa é um dos gêneros de Chrysopidae mais diversos, com 46 espécies descritas no mundo, dentre elas Ceraeochrysa claveri (Canard et al., 1984; Freitas, 2002; Pappas et al., 2011). Os insetos da família Chrysopidae são encontrados em diversas culturas de interesse econômico como algodoeiro, citros, milho, entre outras. Podem alimentar-se de ovos, lagartas neonatas, pulgões, cochonilhas, ácaros e vários outros artrópodes de pequeno tamanho e de tegumento facilmente perfurável. Os crisopídeos se destacam pela voracidade na fase jovem, facilidade de criação em laboratório, elevado potencial de reprodução, além de não necessitarem de presas na fase adulta (Freitas, 2002; Gallo et al., 2002; Pappas et al., 2011). Os crisopídeos são insetos holometabólicos, caracterizados por apresentarem as fases de ovo, larva, pupa e adulto (Figura 1). Os ovos são colocados na extremidade de um pedicelo, que serve como mecanismo de proteção contra predação ou canibalismo (Canard et al., 1984; Gallo et al., 2002; Pappas et al., 2011). O desenvolvimento larval apresenta três instares, nos quais as larvas são predadoras. As larvas possuem o hábito de cobrirem-se com detritos diversos ou com suas próprias exúvias, o que lhes confere o nome de bicho-lixeiro (Gepp, 1984; Pappas et al., 2011). Ao final do terceiro instar, as larvas tecem um casulo e empupam, e, ao completarem o seu desenvolvimento, abandonam o casulo por meio de uma abertura circular, passam por mais uma ecdise e surge o adulto (Gepp, 1984; Canard et al., 1984; Bezerra et al., 2009; Scudeler et al., 2013). Segundo Canard et al. (1984), os adultos são insetos pequenos, apresentando corpo delicado e coloração geralmente esverdeada, asas membranosas reticuladas e pernas ambulatórias normais (Gallo et al., 2002; Freitas, 2002). Seus hábitos alimentares são variáveis, sendo constituídos de pólen, exsudatos açucarados das plantas, honeydew e néctar; outras podem ser predadoras (Freitas, 2002). 8 Figura 1. Esquema representando o ciclo de vida de Ceraeochrysa claveri e a duração dos estágios de desenvolvimento. A presença de crisopídeos é relatada em diferentes ecossistemas naturais e implantados. Dentre os gêneros que ocorrem no Brasil, Ceraeochrysa Adams (Neuroptera: Chrysopidae) contém espécies com atributos que podem torná-las predadoras importantes em vários ecossistemas agrícolas (Medina et al., 2003). Algumas espécies são consideradas relativamente tolerantes a alguns pesticidas, podendo desenvolver resistência seja consumindo outros insetos que foram expostos com inseticidas ou por contato direto com inseticidas (Wu; Miyata, 2005; Pathan et al., 2008; Sayyed et al., 2010; Mansoor et al., 2017; Mansoor; Shad, 2019). O Manejo Integrado de Pragas (MIP) visa reduzir a quantidade de pragas a níveis toleráveis utilizando métodos de manejo ecologicamente corretos e economicamente sustentáveis, envolvendo o uso de pesticidas quando necessário. Portanto, o conhecimento sobre os efeitos dos pesticidas em organismos benéficos é indispensável, (Chen; Liu, 2002; Medina et al., 2003; Cloyd; Dickinson, 2006; Jonsson et al., 2008; Biondi et al., 2012), e a seleção daqueles que podem ser utilizados em conjunto é considerado crucial (Roubos et al., 2014). A busca por métodos alternativos de controle inclui a utilização de produtos naturais que geralmente são menos prejudiciais ao ambiente, dentre os quais destacam-se os inseticidas de origem vegetal (Adnan et al., 2014; Celestino et al., 2014). Pesquisas envolvendo plantas com 9 atividade inseticida evoluíram bastante nas últimas décadas e a família Meliaceae têm sido uma das mais investigadas. O nim indiano (Azadirachta indica A. Juss) tem se destacado devido à presença de um composto denominado azadiractina, presente nas folhas, frutos e sementes, cuja atividade sobre alguns insetos é comparável à dos melhores inseticidas sintéticos encontrados no mercado (Schmutterer, 1990; Benelli et al., 2014). A azadiractina foi um dos primeiros componentes ativos a serem isolados do nim, e provou ser o principal ingrediente no combate aos insetos, atuando por contato ou ingestão (Schmutterer, 1990; Medina et al., 2003; Isman, 2006). Esta molécula interfere no sistema endócrino ao prejudicar as vias do hormônio juvenil (JH) e 20-hidroxiecdisona, que estão envolvidas na regulação de muitas funções fisiológicas, levando a efeitos deletérios no desenvolvimento e reprodução, como efeito anti-alimentar, redução do crescimento, inibição da ecdise, redução da fecundidade e longevidade de adultos, esterilização, inibição de oviposição, mortalidade e repelência (Mordue (Luntz); Blackwell, 1993; Coats, 1994; Mordue (Luntz) et al., 2005; Isman, 2006; Bernardi et al., 2013; Correia et al., 2013; Adnan et al., 2014; Aribi et al., 2017; Oulhaci et al., 2018). Como o uso de inseticidas sintéticos ainda é muito grande, estudos têm sido realizados para avaliar a compatibilidade desses inseticidas com insetos predadores, incluindo algumas espécies de crisopídeos (Medina et al., 2003; Cloyd; Dickinson, 2006). A maioria dos estudos avaliou principalmente os efeitos letais de inseticidas sintéticos, no entanto, é importante avaliar os efeitos subletais ou a longo prazo, que também podem afetar a viabilidade do uso de inimigos naturais com pesticidas (Cloyd; Dickinson, 2006). Entre os inseticidas sintéticos utilizados que mimetizam o hormônio juvenil, destacamos o piriproxifem, que provoca desequilíbrio nos níveis desse hormônio no inseto, resultando em forte supressão da embriogênese, metamorfose, formação de adultos e esterilidade em muitos insetos praga (Boina et al., 2010; Fernandez et al., 2012). É bastante utilizado no controle de mosca branca, cochonilhas e em programas de manejo em culturas de algodão (Ishaaya et al., 1994; 2007). Os efeitos de ambos os inseticidas sobre insetos alvo (pragas) são bem conhecidos, principalmente os efeitos relacionados ao ciclo de vida e a reprodução dos mesmos, devido ao objetivo de se criar estratégias efetivas no controle destas pragas. Contudo, os inimigos naturais que se encontram nesses ecossistemas/ambientes ou que fazem parte do manejo integrado de pragas, também sofrem as ações desses inseticidas, e conhecer os efeitos destes produtos nesses 10 indivíduos e em especial, na sua reprodução, é de extrema importância para a manutenção destas espécies, assegurando uma agricultura mais sustentável. Nos crisopídeos, o aparelho reprodutor masculino é constituído por um par de testículos, vasos deferentes, vesículas seminais, glândulas acessórias e canal ejaculador, onde a principal função é a produção e armazenamento de espermatozoides e seu transporte, de forma viável, para o trato reprodutivo feminino (Chapman, 1998; Gullan, 2007). Os testículos são constituídos por folículos testiculares, e em larvas de C. claveri apresentam-se em pares, com formato arredondado e coloração esbranquiçada, passando para formato alongado em pupas e espiralados em adultos, adquirindo coloração amarela intensa (Garcia et al., 2019). Dentro dos folículos, as células germinativas são agrupadas em cistos, que se encontram em diferentes estágios de maturação, no sentido apical-basal. Dentro de cada cisto o desenvolvimento é sincrônico, devido à presença de pontes citoplasmáticas que surgem durante a citocinese incompleta das células germinativas (Gullan, 2007; Klowden, 2007; Garcia et al., 2019). Diversos autores relataram efeitos da azadiractina em testículos de insetos praga, como degeneração dos feixes de espermatozoides, espermatócitos, diminuição do número de cistos por testículo, e ainda ação direta da azadiractina na membrana testicular (Shimizu, 1988; Linton et al., 1997; Abdel-Rahman et al., 2004; Tayade, 2012; Aribi et al., 2017; Oulhaci et al., 2018), mas seus efeitos sobre insetos não-alvo ainda são pouco conhecidos. A literatura aponta a existência de efeitos negativos sobre os inimigos naturais, embora pareçam ser menos intensos do que sobre as pragas (Schmutterer, 1990; Isman, 2006; Celestino et al., 2014). A compatibilidade de piriproxifem com crisopídeos e outros inimigos naturais tem sido relatada na literatura como segura (Rugno et al., 2015; 2016), mas em alguns estudos mostrou- se prejudicial, possuindo efeito ovicida e larvicida, reduzindo fecundidade de fêmeas e viabilidade de ovos, e sua compatibilidade vem sido questionada, (Chen; Liu, 2002; Cloyd; Dickinson, 2006; Ginjupalli; Baldwin, 2013; Fogel et al., 2016; Ono et al., 2017; He et al., 2018; Sohail et al., 2019). A maioria desses estudos relatam apenas os efeitos no ciclo de vida e alguns aspectos reprodutivos dos insetos como fecundidade e fertilidade, enquanto aspectos morfológicos e/ou ultraestruturais dos órgãos reprodutivos não são abordados. Outra forma de conhecer esses efeitos é através da introdução de novas tecnologias como o sequenciamento de próxima geração (NGS), que é uma ferramenta valiosa para a obtenção de grandes quantidades de informação genética de organismos não-modelo, como insetos (Schuster, 2008). Análise de transcriptoma é uma poderosa ferramenta para a pesquisa, permitindo o desenvolvimento de estratégias de controle de pragas com base na caracterização e 11 exploração de genes relacionados a vários fatores importantes, como a ação inseticida e o desenvolvimento de mecanismos de resistência (Oppenheim et al., 2015; Liu et al., 2016), tendo sido bastante utilizada em estudos com insetos praga (Ridgeway; Timm, 2014; Nascimento et al., 2015; Gao et al., 2018; Merlim; Cônsoli, 2019; Wei et al., 2019; Chen et al., 2020; Meng et al., 2020; Chen et al., 2021). O uso de ferramentas de bioinformática também tem sido amplamente utilizadas no âmbito de expressão gênica baseada em read counts (Anders; Huber, 2010; Anders et al., 2013). Tais ferramentas associadas a análises de ontologia permitem estabelecer uma relação entre genes alterados e respectivas funções de uma forma global e eficaz, possibilitando um melhor entendimento sobre as variações presentes entre tipos diferentes de tratamento. Considerando a importância econômica de C. claveri na agricultura e manejo integrado de pragas, este trabalho tem por objetivo avaliar o efeito do biopesticida azadiractina e do inseticida sintético piriproxifem neste inimigo natural. Com base em análises morfológicas, ultraestruturais e moleculares dos testículos desse inseto, pretendemos avaliar o efeito da ingestão de azadiractina e piriproxifem neste órgão, bem como avaliar a fecundidade de fêmeas e a fertilidade dos ovos provenientes do cruzamento entre fêmeas controle e machos tratados. 58 Referências Adnan, S.M.; Uddin, M.M.; Alam, M.J.; Islam, M.S.; Kashem, M.A.; Rafii, M.Y.; Latif, M.A. Management of mango hopper, Idioscopus clypealis, using chemical insecticides and neem oil. The Scientific World Journal, 2014: 1-5, 2014. Antony, B.; Johny, J.; Abdelazim, M.M.; Jakše, J.; Al-Saleh, M.A.; Pain, A. Global transcriptome profiling and functional analysis reveal that tissue-specific constitutive overexpression of cytochrome P450s confers tolerance to imidacloprid in palm weevils in date palm fields. BMC Genomics, 20: 1-23, 2019. Aribi, N.; Oulhaci, M.C.; Kilani-Morakchi, S.; Sandoz, J.C.; Kaiser, L.; Denis, B.; Joly, D. 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O estudo gerou, pela primeira vez, um banco de dados moleculares e de bioinformática com a análise da expressão gênica para essa espécie, tanto aquela obtida em resposta aos tratamentos investigados, como para a própria espécie, o que certamente enriquece o conhecimento sobre a biologia desta espécie de inimigo natural, contribuindo para pesquisas futuras e estratégias de controle de pragas. Uma vez que, um dos principais objetivos do manejo integrado de pragas seja a combinação do uso de inseticidas seletivos com inimigos naturais de pragas, este estudo fornece importantes e promissoras informações sobre a possibilidade de uso da azadiractina e do piriproxifem em associação a espécie predadora C. claveri.