Campus de São José do Rio Preto João Paulo Henrique Modelagem matemática e desenvolvimento de estratégias de controle automático de biorreator de leito fixo para a produção de celulases fúngicas por cultivo em estado sólido São José do Rio Preto 2022 João Paulo Henrique Modelagem matemática e desenvolvimento de estratégias de controle automático de biorreator de leito fixo para a produção de celulases fúngicas por cultivo em estado sólido Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: FAPESP-Proc. 2014/23453-3 CAPES CNPq Orientador: Prof. Dr. João Claudio Thoméo Coorientadora: Profa. Dra. Fernanda Perpétua Casciatori São José do Rio Preto 2022 João Paulo Henrique Modelagem matemática e desenvolvimento de estratégias de controle automático de biorreator de leito fixo para a produção de celulases fúngicas por cultivo em estado sólido Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, junto ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: FAPESP-Proc. 2014/23453-3 x CAPES x CNPq Comissão Examinadora Prof. Dr. João Claudio Thoméo UNESP – São José do Rio Preto Orientador Profa. Dra. Ana Carolina Conti UNESP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Tiago Carregari Polachini UNESP – São José do Rio Preto Prof. Dr. Nivaldo Aparecido Corrêa USP – São Carlos Profa. Dra. Érika Fernanda Rezendes Tada UFRB – Feira de Santana São José do Rio Preto 31 de agosto de 2022 Dedicatória João Paulo Henrique “Dedico este trabalho à minha esposa Michele, companheira e amiga, aos meu filhos Joaquim e Maria Clara, que trazem paz e felicidade a nossa família, aos meu pais Antônio (in memoriam) e Leonice por serem vencedores na vida e serem meus primeiros professores, ensinando que a honestidade é premissa básica na vida, aos meus irmãos Jorge e Patrícia pelo carinho e companheirismo e a todos os meus familiares e amigos que sempre torceram pelo meu sucesso” Agradecimentos João Paulo Henrique AGRADECIMENTOS A Deus, fonte de graça, sabedoria e felicidade, por sempre guiar nos momentos de alegria e de dificuldade. À minha amada esposa Michele, companheira e amiga em todos os momentos, e sempre disposta a me ouvir e apoiar. Aos meus filhos Joaquim e Maria Clara que vieram ser luz e trazer ainda mais felicidade para nossa família. Ao meu pai Antônio (in memoriam) e à minha mãe Leonice, que sempre me ensinaram que o sucesso vem sempre depois de muito trabalho e sacrifícios. Aos meus irmãos, Jorge e Patrícia, que sempre presentes, participaram de todas as minhas realizações pessoais e profissionais. A todos os meus familiares que sempre estiveram por perto, ajudando e comemorando em cada conquista de minha carreira profissional. Ao Prof. Edson Antônio Batalhão, que comprometido com seu trabalho nos mostrou a beleza da matemática e despertou meu interesse pela área de exatas durante o ensino fundamental, na Escola Estadual Prof. Guines Affonso Morales em Neves Paulista/SP. Ao Sr. Amaral Crepaldi Filho, que durante o ensino médio nos ensinou, pelo exemplo, o respeito devido aos professores e a área acadêmica, na Escola Estadual Genaro Domarco em Mirassol/SP. Ao Prof. Dr. João Claudio Thoméo, orientador desta tese, pela amizade, paciência e pela grande dedicação em minha formação científica, desde os primeiros dias de minha graduação. Adotou-me logo cedo! Agradecimentos João Paulo Henrique À Profa. Dra. Fernanda Perpétua Casciatori, co-orientadora desta tese, pela paciência, empenho e cooperação para o desenvolvimento deste trabalho. Aos membros da Comissão Examinadora deste meu Exame Geral de Qualificação, Prof. Dr. Nivaldo Aparecido Corrêa e Prof. Dr. Rodrigo Béttega, que, por meio de suas sugestões, contribuíram com o direcionamento das etapas finais deste trabalho. Aos colegas do Laboratório, que se mostraram sempre dispostos a ajudar e contribuir para o bom andamento deste trabalho. Ao Departamento de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual Paulista, Campus de São José do Rio Preto (IBILCE/UNESP), e ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos (PPG-ECA), por proporcionarem apoio, suporte e infraestrutura necessários ao desenvolvimento desta pesquisa. A todos os professores e funcionários do Departamento de Engenharia de Alimentos, que dedicaram tempo e atenção para minha formação científica e acadêmica. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES), à qual agradeço o suporte financeiro. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), sob o processo nº 2014/23453-3, e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio ao projeto de pesquisa ao qual este trabalho está inserido. A todas as pessoas que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização desta Tese de Doutorado. Epígrafe João Paulo Henrique “Espero que eu sempre possua a firmeza e virtude suficientes para manter aquilo que considero o mais invejável de todos os títulos, o caráter de um homem honesto” (George Washington) Washington (1997) Resumo João Paulo Henrique RESUMO Nos últimos anos o cultivo em estado sólido (CES) tem sido bastante aplicado para a produção de celulase fúngicas que viabilizam a produção do etanol de segunda geração. Dentre os biorreatores disponíveis para o CES, os biorreatores de coluna apresentam inúmeras vantagens, porém, algumas limitações como o monitoramento das concentrações dos gases impedem a determinação do crescimento microbiano durante a fermentação. Diante desta dificuldade, este trabalho tem como objetivo a modelagem matemática e o desenvolvimento de estratégias de controle automático de temperatura para ampliação de escala para a produção de celulases fúngicas por CES, sendo proposto inicialmente o desenvolvimento de um sistema automático para monitoramento de gases em diversas posições do biorreator de leito fixo empacotado. Foram avaliados em tempo real a taxa de comunicação do sistema, perfis de temperatura, concentrações de CO2 e O2, além dos perfis de umidade e atividade enzimática CMCase no final das fermentações. Para tanto foram realizadas diversas fermentações utilizando o fungo termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b cultivado em bagaço de cana e farelo de trigo (7:3 m/m), na umidade de 75% e temperatura de 45°C variando a taxa de aeração, tamanho do biorreator, e critérios de acionamento de válvulas de amostragem de gases (Casos I a IV). Em relação à taxa de comunicação, observou-se um atraso de 1,6 s/iteração na apresentação dos dados coletados em relação ao tempo de 1 s/iteração configurado, não interferindo nos resultados apresentados. Também foi possível avaliar o efeito da sequência de ativação da válvula na concentração de gases nos módulos fermentativos. No Caso I observou-se uma maior oscilação da temperatura e das concentrações de O2 e CO2, resultando num acúmulo da concentração de CO2 até valores próximos a 9% nos módulos fermentativos. Nos Casos II a IV as condições de temperatura e concentrações de gases se mantiveram mais estáveis, resultando, nestes três últimos casos, em uma concentração máxima de CO2 de 4%, de forma que a atmosfera do meio não fosse prejudicial ao processo. Utilizando como referência um modelo matemático para simulação de biorreatores de leito fixo empacotado a duas fases (balanços energia e água), foi avaliada a sensibilidade de algumas variáveis de processo em dois Resumo João Paulo Henrique planejamentos experimentais utilizando Metodologia de Superfície de Resposta (MSR) e dentre os parâmetros avaliados, aeração, temperatura da parede e altura do biorreator apresentaram influência significativa sobre as temperaturas e teores de umidade das fases sólida e gasosa e concentrações de biomassa e substrato. Ao simular um biorreator de escala industrial de 50 m3, obteve-se perfis de temperatura máximas próximas a 53°C, semelhantes aos encontrados nos experimentos de diferentes vazões de aeração para o biorreator largo. Foram avaliadas ainda diferentes estratégias de controle do processo com a inversão do fluxo de ar e com a aeração auxiliar no centro do biorreator, demonstrando que para estes diferentes métodos de controle do processo, os perfis de temperatura e umidade podem ser controlados. Dessa forma, este sistema automatizado de acionamento de válvulas e coleta de dados em tempo real mostrou-se efetivo e permite sua aplicação em conjunto com técnicas de controle automático do processo fermentativo para otimizar as condições de produção enzimática em CES. Palavras-chave: Cultivo em estado sólido. Biorreator. Myceliophthora thermophila I-1D3b. Enzimas. Bioetanol. Modelagem matemática. Controle de bioprocessos. Abstract João Paulo Henrique ABSTRAT In recent years, solid state cultivation (SSC) has been widely applied for the production of fungal cellulase that enable the production of second- generation ethanol. Among the bioreactors available for SSC, column bioreactors have numerous advantages, however, some limitations such as monitoring of gas concentrations prevent the determination of microbial growth during fermentation. Faced with this difficulty, this work aims at mathematical modeling and the development of automatic temperature control strategies to scale up the production of fungal cellulases by SSC, initially proposing the development of an automatic system for monitoring gases in several packed bed bioreactor positions. The communication rate of the system, temperature profiles, CO2 and O2 concentrations, as well as moisture profiles and CMCase enzymatic activity at the end of the fermentations were evaluated in real time. For that, several fermentations were carried out using the thermophilic fungus Myceliophthora thermophila I-1D3b grown on sugarcane bagasse and wheat bran (7:3 w/w), at 75% moisture and 45°C, varying the aeration rate, size of the bioreactor, and criteria for triggering gas sampling valves (Cases I to IV). Regarding the communication rate, there was a delay of 1.6 s/iteration in the presentation of the collected data in relation to the configured time of 1 s/iteration, not interfering with the results presented. It was also possible to evaluate the effect of the valve activation sequence on the concentration of gases in the fermentation modules. In Case I, a greater oscillation of temperature and concentrations of O2 and CO2 was observed, resulting in an accumulation of the concentration of CO2 until values close to 9% in the fermentation modules. In Cases II to IV, the temperature conditions and gas concentrations remained more stable, resulting, in these last three cases, in a maximum CO2 concentration of 4%, so that the atmosphere of the medium was not harmful to the process. Using as a reference a mathematical model for the simulation of two-phase packed bed bioreactors (energy and water balances), the sensitivity of some process variables was evaluated in two experimental designs using Response Surface Methodology (RSM) and among the parameters evaluated, aeration, wall temperature and height of the bioreactor had a significant influence on the temperatures and moisture contents of the Abstract João Paulo Henrique solid and gas phases and concentrations of biomass and substrate. When simulating an industrial scale bioreactor of 50 m3, maximum temperature profiles were obtained close to 53°C, similar to those found in experiments with different aeration flow rates for the wide bioreactor. Different process control strategies were also evaluated with air flow inversion and auxiliary aeration in the center of the bioreactor, demonstrating that for these different process control methods, temperature and humidity profiles can be controlled. Thus, this automated system for activating valves and collecting data in real time proved to be effective and allows its application in conjunction with automatic control techniques of the fermentation process to optimize enzyme production conditions in SSC. Keywords: Solid state cultivation. Bioreactor. Myceliophthora thermophila I- 1D3b. Enzymes. Bioethanol. Mathematical modeling. Bioprocess control. Lista de Ilustrações João Paulo Henrique LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Sacos fermentadores de polipropileno em câmara de cultura DBO. 49 Figura 2. Esquema de montagem inicial do biorreator estreito com oito módulos reacionais. .................................................................................. 50 Figura 3. Configuração inicial do equipamento (linhas contínuas) e modificações propostas (linhas tracejadas). ............................................. 51 Figura 4. Configuração inicial do sistema de aquecimento das camisas do biorreator. .................................................................................................. 52 Figura 5. Configuração proposta para o sistema de aquecimento das camisas do biorreator. ............................................................................................. 53 Figura 6. Configuração inicial do sistema de umidificação do ar. .................... 54 Figura 7. Diagrama esquemático do sistema proposto para umidificação de ar. .................................................................................................................. 55 Figura 8. Diagrama do sistema proposto para monitoramento automático de dados e acionamento das válvulas solenoides para amostragem de gases para o biorreator estreito com oito módulos reacionais. ............................ 57 Figura 9. Algoritmo de aquisição/monitoramento de dados e atuação de válvulas. .................................................................................................... 59 Figura 10. Exemplo do painel frontal do software Labview® durante a fermentação. ............................................................................................. 60 Figura 11. Exemplo do diagrama de blocos do software Labview® durante a fermentação. ............................................................................................. 60 Figura 12. Esquema de experimentos para Dam = 1,0 para os biorreatores: (a) estreito e (b) largo. .................................................................................... 64 Figura 13. Esquema de experimentos para Dam = 0,5 para os biorreatores: (a) estreito e (b) largo. .................................................................................... 65 Figura 14. Configuração dos experimentos para avaliação da influência do acionamento de válvulas e amostragem de com Dam = 1,0 para: (a) Caso I; (b) Caso II; (c) Caso III e (d) Caso IV. ....................................................... 67 Figura 15. Perfil de temperatura em diferentes posições longitudinais do biorreator estreito em função do tempo de fermentação considerando vazões de ar iguais a: (a) Q = 104 L·h-1 (Dam = 0,5) e (b) Q = 52 L·h-1 (Dam = 1,0). ........................................................................................................ 72 Lista de Ilustrações João Paulo Henrique Figura 16. Perfil de umidade em diferentes posições do biorreator estreito no final da fermentação para: (a) Q = 104 L·h-1 (Dam = 0,5) e (b) Q = 52 L·h-1 (Dam = 1,0). ............................................................................................... 73 Figura 17. Perfis de atividade enzimática CMCase relativa em diferentes posições do biorreator estreito no final da fermentação para: (a) Q = 104 L·h-1 (Dam = 0,5) e (b) Q = 52 L·h-1 (Dam = 1,0). As linhas horizontais tracejadas representam a média das atividades enzimáticas entre os módulos fermentativos. ............................................................................. 74 Figura 18. Perfil de temperatura em diferentes posições do biorreator largo em função do tempo de fermentação considerando vazões de ar iguais a: (a) Q = 1442 L·h-1 (Dam = 0,5) e (b) Q = 721 L·h-1 (Dam = 1,0). ...................... 75 Figura 19. Perfil de umidade em diferentes posições do biorreator largo no final da fermentação para: (a) Q = 1442 L·h-1 (Dam = 0,5) e (b) Q = 721 L·h-1 (Dam = 1,0). ............................................................................................... 76 Figura 20. Perfis de atividade enzimática CMCase relativa em diferentes posições do biorreator largo no final da fermentação para: (a) Q = 1442 L·h-1 (Dam = 0,5) e (b) Q = 721 L·h-1 (Dam = 1,0). As linhas horizontais tracejadas representam a média das atividades enzimáticas entre os módulos fermentativos. ............................................................................. 77 Figura 21. Perfis de temperatura em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação do: (a) Caso I, (b) Caso II, (c) Caso III e (d) Caso IV. ............................................................................................ 80 Figura 22. Concentrações médias de CO2 e O2 em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação, respetivamente para: (a) e (b) Caso I; (c) e (d) Caso II; (e) e (f) Caso III; (g) e (h) Caso IV. .................................................................................................................. 83 Figura 23. Concentrações dos gases de fermentação no topo (V6) e no meio (V3) do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso I: (a) V6 - CO2; (b) V6 - O2; (c) V3 - CO2 e (d) V3 - O2. ......................................................................... 86 Figura 24. Concentrações dos gases de fermentação no topo (V6) e no meio (V3) do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso II: (a) V6 - CO2; (b) V6 - O2; (c) V3 - CO2 e (d) V3 - O2. ......................................................................... 87 Lista de Ilustrações João Paulo Henrique Figura 25. Concentrações dos gases de fermentação no topo (V6) e no meio (V3) do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso III: (a) V6 - CO2; (b) V6 - O2; (c) V3 - CO2 e (d) V3 - O2. ......................................................................... 88 Figura 26. Perfil de umidade em diferentes posições do biorreator estreito no final da fermentação do: (a) Caso I; (b) caso II; (c) Caso III e (d) Caso IV.90 Figura 27. Perfis de atividade enzimática CMCase relativa em diferentes posições do biorreator estreito no final da fermentação para: (a) Caso I; (b) Caso II; (c) Caso III e (d) Caso IV. As linhas horizontais tracejadas representam a média das atividades enzimáticas entre os módulos fermentativos. ............................................................................................ 91 Figura 28. Cinética do CO2 acumulado produzido para todas as alternativas de amostragem testadas obtidas no topo da coluna e ajuste do modelo logístico. .................................................................................................... 94 Figura 29. Perfis das taxas de crescimento específico durante a fermentação para os Casos I-IV. ................................................................................... 95 Figura 30. Perfil longitudinal de CO2 acumulado e CO2 acumulado normalizado por g.s.s. para o Caso I (a) e (b) e para o Caso II (c) e (d), respectivamente. ....................................................................................... 97 Figura 31. Quociente respiratório (QR) para o Caso I (a), Caso II (b), Caso III (c) e Caso IV (d). ....................................................................................... 98 Figura 32. Concentrações de gases em função do tempo de atuação das válvulas no Caso II pelo analisador de gases para: (a) CO2 e (b) O2. ..... 100 Figura 33. Temperaturas médias e máximas na fase sólida (a) e (b) e médias e máximas da fase gasosa (c) e (d) em função da taxa de crescimento específico e da concentração máxima de biomassa, respectivamente. .. 117 Figura 34. Umidades médias nas fases sólida (a) e gasosa (b) no tempo 96 h em função da taxa de crescimento específico e da concentração máxima de biomassa. ........................................................................................... 118 Figura 35. Concentração de biomassa no tempo 96 h em função da taxa de crescimento específico e da concentração máxima de biomassa. .......... 119 Figura 36. Concentração de substrato no tempo 96 h em função da taxa de crescimento específico e da concentração máxima de biomassa. .......... 120 Lista de Ilustrações João Paulo Henrique Figura 37. Temperaturas médias e máximas na fase sólida (a), (b) e (c) e médias e máximas da fase gasosa (d), (e) e (f) em função da temperatura na parede e do número de Damköhler modificado e da altura do biorreator, respectivamente. ..................................................................................... 125 Figura 38. Umidades médias na fase sólida no tempo 96 h em função da temperatura na parede e do número de Damköhler modificado (a) e da altura do biorreator (b), respectivamente. ............................................... 126 Figura 39. Umidades médias na fase gasosa no tempo 96 h em função da temperatura na parede e do número de Damköhler modificado (a) e da altura do biorreator (b), respectivamente. ............................................... 127 Figura 40. Concentrações de biomassa médias no tempo 96 h em função da temperatura na parede e do número de Damköhler modificado (a) e da altura do biorreator (b), respectivamente. ............................................... 128 Figura 41. Concentrações de substrato médias no tempo 96 h em função da temperatura na parede e do número de Damköhler modificado (a) e da altura do biorreator (b), respectivamente. ............................................... 129 Figura 42. Perfis simulados considerando biorreator de 50 m³ em fermentação de 96 h para: a) Ts; b) Tg; c) X; d) Y; e) B e f) Sub. ................................. 132 Figura 43. Algoritmo proposto para controle do processo fermentativo do biorreator. ................................................................................................ 134 Figura 44. Perfis simulados de temperatura da fase sólida ao longo do tempo de fermentação para o biorreator estreito submetidos aos modelos de controle: (a) e (b) Inversão de fluxo; (c) e (d) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa; (e) e (f) com aeração auxiliar central. .............. 140 Figura 45. Perfis simulados da comutação da direção do fluxo durante o tempo de fermentação para o biorreator estreito submetidos aos modelos de controle: (a) Inversão de fluxo; (b) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa. .............................................................................................. 141 Figura 46. Perfis simulados dos teores de umidade durante o tempo de fermentação para o biorreator estreito submetidos aos modelos de controle: (a) Inversão de fluxo; (b) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa; (c) com aeração auxiliar central. .......................................... 142 Figura 47. Perfis simulados das concentrações de biomassa fúngica durante o tempo de fermentação para o biorreator estreito submetidos aos modelos Lista de Ilustrações João Paulo Henrique de controle: (a) Inversão de fluxo; (b) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa; (c) com aeração auxiliar central. ...................... 143 Figura 48. Perfis simulados de temperatura da fase sólida ao longo do tempo de fermentação para o biorreator largo submetidos aos modelos de controle: (a) e (b) Inversão de fluxo; (c) e (d) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa; (e) e (f) com aeração auxiliar central. .............. 144 Figura 49. Perfis simulados da comutação da direção do fluxo durante o tempo de fermentação para o biorreator largo submetidos aos modelos de controle: (a) Inversão de fluxo; (b) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa. .............................................................................................. 145 Figura 50. Perfis simulados dos teores de umidade durante o tempo de fermentação para o biorreator largo submetidos aos modelos de controle: (a) Inversão de fluxo; (b) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa; (c) com aeração auxiliar central. ................................................... 146 Figura 51 - Perfis simulados das concentrações de biomassa fúngica durante o tempo de fermentação para o biorreator largo submetidos aos modelos de controle: (a) Inversão de fluxo; (b) Inversão de fluxo com ar a temperatura mais baixa; (c) com aeração auxiliar central. .......................................... 147 Lista de Tabelas João Paulo Henrique LISTA DE TABELAS Tabela 1. Enzimas obtidas por CES a partir de rejeitos sólidos agroindustriais por linhagens de Myceliophthora sp. ......................................................... 37 Tabela 2. Enzimas obtidas por CES a partir de rejeitos sólidos agroindustriais por linhagens de Myceliophthora thermophila. .......................................... 38 Tabela 3. Definição dos parâmetros e valores para as Equações 3-5. ............ 62 Tabela 4. Sequência de atuação das válvulas solenoides durante os experimentos. ............................................................................................ 66 Tabela 5. Perfis das taxas de crescimento específico (μesp) e coeficientes de determinação (R2) durante a fermentação para os Casos I-IV. ................. 95 Tabela 6. Parâmetros, variáveis, condições e descrições das propriedades físicas e microbianas utilizadas no modelo matemático considerado. .... 109 Tabela 7. Planejamento experimental com variáveis independentes e resultados das temperaturas, umidades e concentrações de biomassa e substrato do primeiro delineamento experimental. .................................. 113 Tabela 8. Modelos significativos para as variáveis dependentes: temperaturas e umidades das fases sólida e gasosa e concentrações de biomassa e substrato. ................................................................................................ 116 Tabela 9. Planejamento experimental com variáveis independentes e resultados das temperaturas, umidades e concentrações de biomassa e substrato do segundo delineamento experimental. ................................. 122 Tabela 10. Modelos significativos para as variáveis dependentes: temperaturas e umidades das fases sólida e gasosa e concentrações de biomassa e substrato. ................................................................................................ 124 Lista de Siglas João Paulo Henrique LISTA DE SIGLAS ASD Meio de cultivo Agar-Sabouraud Dextrose; ATG Análise termogravimétrica; BC Bagaço de cana-de-açúcar; CES Cultivo em estado sólido; CMD Controle de matriz dinâmica, Etanol 2G Etanol de segunda geração; FSm Fermentação submersa; FT Farelo de trigo; FPU Unidades de atividade em papel de filtro (filter paper unit); IQ/UNESP Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Campus de Araraquara - SP; NA Válvula normalmente aberta; NF Válvula normalmente fechada; MISO Múltiplas entradas e saída única (Multiple-input single-output); MSR Metodologia de Superfície de Resposta; PVC Policloreto de vinila; PID Controlador proporcional integral derivativo; S Acionador solenoide; Snível Sensor de nível; VM Válvula manual; VS Válvula solenoide. Lista de Símbolos João Paulo Henrique LISTA DE SÍMBOLOS Parâmetros e variáveis acum 2CO Dióxido de carbono acumulado (mol); a Relação entre área superficial das partículas e volume do leito (m-1); aga Atividade de água na fase gasosa (-); 0aga Atividade de água do ar na entrada do biorreator (-); asa Atividade de água na fase sólida (-); 1A Fator de frequência para numerador (s-1); 2A Constante de ajuste para o denominador (-); AER Atividade enzimática relativa (-); stA Área da seção transversal da entrada do leito (m2); b Concentração de biomassa nos sólidos secos totais (kg-biomassa·kg- total-sólidos-secos–1); 0b Concentração de biomassa inicial nos sólidos secos totais (kg- biomassa·kg-total-sólidos-secos–1); maxb Concentração máxima de biomassa em sólidos secos totais (kg- biomassa·kg-total-sólidos-secos–1); B Concentração de biomassa (kg-biomassa·m–3); 0B Concentração de biomassa inicial (kg-biomassa·m–3); ..ub Base úmida; ..sb Base seca; asC Calor específico do ar seco (J·kg-ar-seco-1·°C-1); aC Calor específico da água (J·kg-água-1·°C-1); sC Calor específico dos sólidos secos (J·kg-sólidos-secos-1·°C-1); vC Calor específico do vapor de água (J·kg-vapor-1·°C-1); produzido 2CO Dióxido de carbono produzido (mol); inicialCO2 Concentração de dióxido de carbono inicial (mol); Lista de Símbolos João Paulo Henrique Parâmetros e variáveis - Continuação max 2CO Concentração de dióxido de carbono máxima (mol); i2CO )( Concentração de dióxido de carbono na posição i, i ϵ {1,2,...,6} (%); partd Diâmetro da partícula do substrato (mm); iD Coeficiente i do ajuste polinomial para estimativa da taxa de crescimento específico com base na atividade de água com i ϵ {1, 2, 3, 4}; mDa Número de Damköhler modificado (-); mgD , Difusividade molecular do vapor de água no ar (m2·s-1); zgD , Difusividade efetiva axial na fase gasosa (m2·s-1); zsD , Difusividade efetiva axial na fase sólida (m2·s-1); sD Difusividade efetiva na fase gasosa (m2·s-1); 1AE Energia de ativação para numerador (J·mol-1); 2AE Energia de ativação para numerador (J·mol-1); f Taxa que a capacidade de transporte de água varia com a temperatura do ar (kg-agua·kg-ar-1·°C-1); ... ssg Grama de substrato seco; ah Coeficiente de transferência de calor volumétrico na interface sólido- gás (W·m-3·°C-1); H Altura do biorreator (m); reativoH Altura reativa do biorreator (m); )( svap TH Entalpia de evaporação da água na temperatura sT (J·kg-água-1); j Contador iterativo (-); 0k Condutividade térmica efetiva estagnada (W·m-1·°C-1); sk Condutividade térmica da fase sólida (W·m-1·°C-1); partL Comprimento da partícula do substrato (mm); eM Módulo de entrada; iM Módulo reativo i, i  {1, 2,..., 8}; Lista de Símbolos João Paulo Henrique Parâmetros e variáveis - Continuação sM Módulo de saída; n Número de iterações de acionamento das válvulas solenóides; Nu Número de Nusselt (-); fcNu Número de Nusselt para fluxo cruzado (-); fpNu Número de Nusselt para fluxo paralelo (-); pNu Número de Nusselt na parede interna do biorreator (-); Nz Número de pontos de discretização para solução numérica do equacionamento diferencial (-); consumido 2O Oxigênio consumido (mol); i2O )( Concentração de oxigênio na posição i, i ϵ {1,2,...,6} (%); auxpz Posição do módulo central de aeração auxiliar nos pontos de discretização numérica (-); P Pressão atmosférica local (Pa); * aP Pressão de saturação de vapor de água no ar (Pa); Pr Número de Prandtl no ar (-); Q Vazão de ar na entrada no biorreator (L·min-1); QR Quociente respiratório (v/v); r Posição radial (m); R Raio interno do biorreator (m); GR Constante universal dos gases (J·mol-1·°C-1); AR Coeficiente estequiométrico relativo à produção de água no crescimento (kg-água∙kg-biomassa-1); QR Rendimento de calor para o crescimento (J∙kg-biomassa-1); SR Fator de conversão de total de sólidos secos por kg de biomassa fúngica produzida (kg-total-sólidos-secos kg-biomassa-1); pRe Número de Reynolds relacionado ao diâmetro da partícula e a temperatura de entrada de ar (-); fpRe Número de Reynolds relacionado ao fluxo paralelo (-); Lista de Símbolos João Paulo Henrique Parâmetros e variáveis - Continuação RES Resíduos dos modelos ajustados na MSR; S Concentração de sólidos secos totais (kg-total-sólidos-secos·m-3); Sh Número de Sherwood (-); Sub Concentração de substrato (kg-substrato-seco·m–3); 0Sub Concentração inicial de substrato (kg-substrato-seco·m–3); t Tempo (h); 0t Tempo inicial (h); AT Temperatura de alimentação da água na camisa do biorreator (°C); agT Temperatura da água no sistema de aquecimento de ar (°C); arT Temperatura do ar na entrada do biorreator (°C); saída arT Temperatura do ar na saída do biorreator (°C); gT Temperatura do ar na fase gasosa (°C); máx gT Temperatura máxima do ar na fase gasosa (°C); média gT Temperatura média do ar na fase gasosa (°C); 0gT Temperatura inicial do ar na fase gasosa (°C); auxpzgT Temperatura do ar na fase gasosa na posição de discretização auxpz (°C); Ti Temperatura na posição i, i ϵ {1, 2,..., 6} (°C); inferiorT Conjunto de dados de temperatura de todos os pontos de discretização da base ao centro do biorreator (°C); PT Temperatura da parede interna do biorreator (°C); RT Temperatura de retorno da água na camisa do biorreator (°C); sT Temperatura da fase sólida (°C); máx sT Temperatura máxima da fase sólida (°C); média sT Temperatura média da fase sólida (°C); 0sT Temperatura inicial da fase sólida (°C); Lista de Símbolos João Paulo Henrique Parâmetros e variáveis - Continuação superiorT Conjunto de dados de temperatura de todos os pontos de discretização do centro ao topo do biorreator (°C); U Atividade enzimática (atividade CMCase); iV Válvula solenoide i, i  {1, 2,..., 6}; zv Velocidade superficial na direção z (m·s-1); )(' Xv Taxa de secagem normalizada modificada (-); X Teor de umidade na fase sólida (kg-água·kg-total-sólidos-secos-1); médiaX Teor de umidade média na fase sólida (kg-água·kg-total-sólidos-secos-1); 0X Teor de umidade inicial na fase sólida (kg-água·kg-total-sólidos-secos-1); critX Teor de umidade crítica na fase sólida (kg-água·kg-total-sólidos-secos-1); Y Teor de umidade na fase gasosa (kg-vapor-água·kg-ar-seco-1); médiaY Teor de umidade média na fase gasosa (kg-vapor-água·kg-ar-seco-1); 0Y Teor de umidade inicial na fase gasosa (kg-vapor-água·kg-ar-seco-1); *Y Teor de umidade de saturação do ar na temperatura gT (kg-vapor- água·kg-ar-seco-1); metY Coeficiente de rendimento metabólico (J·kg-biomassa-1); auxpzY Teor de umidade na fase gasosa na posição de discretização auxpz (kg- vapor-água·kg-ar-seco-1); z Posição axial (m); Variáveis binárias iy Variável binária, igual a 1 se a válvula i está atuada, e 0 caso contrário, i  {1,2,...,6}; Símbolos Gregos p Coeficiente de transferência de calor parede-fluido (W∙m-2∙°C-1);  Coeficiente de transferência de massa na interface gás-sólido (m∙s-1); Lista de Símbolos João Paulo Henrique Símbolos Gregos – Continuação a Coeficiente volumétrico de transferência de massa na interface gás- sólido (s-1); i Coeficientes dos modelos lineares ajustados na MSR, i ϵ {0, 1, 2,..., k}; ij Coeficientes dos modelos polinomiais ajustados na MSR, i ϵ {1, 2,..., k} e j ϵ {1, 2,..., k};  Porosidade do leito – constante (-);  Coeficiente de crescimento de biomassa pelo substrato (kg- biomassa∙kg-substrato-seco-1 );  Entalpia de vaporização da água (J·kg-água–1 ); mg , Condutividade térmica molecular do ar (W·m-1·°C-1 ); zg , Condutividade térmica efetiva axial na fase gasosa (W·m-1·°C-1 );  Taxa de crescimento específico (h–1); a Taxa de crescimento específico com base na atividade de água (-); esp Taxa de crescimento específico (h–1); opt Taxa de crescimento específico ideal (h–1); s Taxa de crescimento específico com base na temperatura da fase sólida (-); a Viscosidade cinemática do ar (m2·s-1 ); a Densidade do ar (kg·m-3); m Densidade da biomassa (kg·m-3); i Diâmetro interno (m). Sumário João Paulo Henrique SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .......................................................................................... 27 2 OBJETIVOS .............................................................................................. 29 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 30 3.1 Cultivo em estado sólido ..................................................................... 30 3.2 Enzimas celulolíticas para bioconversão de resíduos lignocelulósicos ............................................................................................. 34 3.3 Myceliophthora thermophila I-1D3b: aplicações e condições de cultivo .............................................................................................................. 37 3.4 Modelos matemáticos para cultivo em estado sólido em biorreator de leito fixo empacotado ............................................................................... 39 3.5 Estratégias de controle de operacional para cultivo em estado sólido em biorreator de leito empacotado ................................................... 41 3.6 Análise de sensibilidade de variáveis de modelos matemáticos para biorreatores de leito fixo empacotado ......................................................... 44 4 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 47 4.1 Microrganismo ...................................................................................... 47 4.1.1 Fungo termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b ................. 47 4.2 Substratos ............................................................................................. 48 4.3 Cultivo em embalagens de polipropileno ........................................... 48 4.4 Esquema de montagem inicial do equipamento ................................ 49 4.5 Modificação estrutural do equipamento ............................................. 51 4.5.1 Sistema de aquecimento encamisado do biorreator ..................... 52 4.5.2 Sistema de aquecimento e umidificação de ar ............................. 54 4.5.3 Sistema automático de acionamento de válvulas e monitoramento 56 4.6 Ensaios fermentativos ......................................................................... 62 4.6.1 Avaliação da influência do número de Damköhler modificado (Dam) e da dimensão do biorreator sobre as condições operacionais ................. 62 4.6.2 Avaliação da influência do acionamento de válvulas e amostragem de gases sobre as condições operacionais ............................................... 65 Sumário João Paulo Henrique 4.6.3 Avaliação da capacidade computacional para controle do processo 68 4.6.4 Avaliação do tempo de resposta do sistema de análise de gases 68 4.7 Modelo matemático do processo de fermentação ............................ 69 4.8 Análise de sensibilidade do modelo matemático .............................. 69 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 71 5.1 Ensaios fermentativos ......................................................................... 71 5.1.1 Avaliação da influência do número de Damköhler modificado (Dam) e da dimensão do biorreator sobre as condições operacionais ................. 71 5.1.2 Avaliação da influência do acionamento de válvulas e amostragem de gases sobre as condições operacionais do biorreator estreito ............. 77 5.1.3 Avaliação da capacidade computacional e do tempo de resposta para controle do processo ......................................................................... 99 5.2 Modelo matemático do processo de fermentação .......................... 101 5.2.1 Balanço de massa para água na fase gasosa ............................ 101 5.2.2 Balanço de massa para água na fase sólida .............................. 102 5.2.3 Balanço de energia na fase gasosa ............................................ 103 5.2.4 Balanço de energia na fase sólida .............................................. 104 5.3 Análise de sensibilidade do modelo matemático ............................ 111 5.3.1 Primeiro delineamento experimental .......................................... 111 5.3.2 Segundo delineamento experimental ......................................... 120 5.4 Simulação de um biorreator de grande escala ................................ 129 5.5 Propostas e simulações de modelos de controle operacionais do biorreator ...................................................................................................... 133 5.5.1 Modelo de controle operacional A: Inversão de fluxo de ar baseado nos perfis de temperatura máxima no biorreator ..................................... 135 5.5.2 Modelo de controle operacional B: Inversão de fluxo de ar baseado nos perfis de temperatura máxima no biorreator com diferentes ofertas de ar 135 5.5.3 Modelo de controle operacional C: Aeração auxiliar no centro do biorreator ................................................................................................. 135 5.5.4 Resultados das simulações dos modelos de controle propostos 139 Sumário João Paulo Henrique 6 CONCLUSÃO .......................................................................................... 149 7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ...................................... 151 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 152 APÊNDICE A – Esquema eletrônico do modulo de umidificação de ar .. 175 APÊNDICE B – Esquema eletrônico do modulo de amplificação e acionamento das válvulas ........................................................................... 176 APÊNDICE C – Diagrama de blocos do software Labview® – Configuração do experimento para avaliação da influência do acionamento de válvulas e amostragem de gases sobre as condições operacionais - Caso I ....... 177 APÊNDICE D – Diagrama de blocos do software Labview® – Configuração do experimento para avaliação da influência do acionamento de válvulas e amostragem de gases sobre as condições operacionais - Caso II ...... 178 APÊNDICE E – Diagrama de blocos do software Labview® – Configuração do experimento para avaliação da influência do acionamento de válvulas e amostragem de gases sobre as condições operacionais - Caso III ..... 179 APÊNDICE F – Diagrama de blocos do software Labview® – Configuração do experimento para avaliação da influência do acionamento de válvulas e amostragem de gases sobre as condições operacionais - Caso IV ..... 180 APÊNDICE G – Concentrações de CO2 em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso I: (a) V6; (b) V5; (c) V4; (d) V3; (e) V2 e (f) V1 ................................................................................................. 181 APÊNDICE H – Concentrações de O2 em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso I: (a) V6; (b) V5; (c) V4; (d) V3; (e) V2 e (f) V1 182 APÊNDICE I – Concentrações de CO2 em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso II: (a) V6; (b) V5; (c) V4; (d) V3; (e) V2 e (f) V1 ................................................................................................. 183 Sumário João Paulo Henrique APÊNDICE J – Concentrações de O2 em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso II: (a) V6; (b) V5; (c) V4; (d) V3; (e) V2 e (f) V1 184 APÊNDICE K – Concentrações de CO2 em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso III: (a) V6; (b) V5; (c) V4; (d) V3; (e) V2 e (f) V1 ................................................................................................. 185 APÊNDICE L – Concentrações de O2 em diferentes posições do biorreator estreito em função do tempo de fermentação e do tempo de acionamento de cada válvula para o Caso III: (a) V6; (b) V5; (c) V4; (d) V3; (e) V2 e (f) V1 186 27 Introdução João Paulo Henrique 1 INTRODUÇÃO Desde a década de 1910, a produção de enzimas industriais por cultivo em estado sólido (CES) tem sido aplicadas (TAKAMINE, 1914; UNDERKOFLER; BARTON; RENNERT, 1958). Essa técnica tem sido considerada promissora para sintetizar biocompostos valiosos a partir de resíduos sólidos produzidos por atividades agrícolas e urbanas. Dentre esses compostos de interesse podem-se considerar enzimas, biocombustíveis, ácidos orgânicos, ração animal e agentes de controle biológico (YAZID et al., 2017; NAIDU; SIDDIQUI; IDRIS, 2020; INTASIT et al., 2021; MONTEIRO et al., 2021). No contexto de biocompostos enzimáticos e biocombustíveis, com a necessidade de reduzir o consumo de combustíveis fósseis e a busca de alternativas na produção de etanol a partir de biomassa vegetal, essa técnica tem sido amplamente utilizada na produção de celulases fúngicas, que hidrolisam a biomassa lignocelulósica, gerando açúcares fermentáveis para a produção de etanol de segunda geração (Etanol 2G) (NOVELLO et al., 2014). Com foco nestes produtos de interesse e dentre os biorreatores disponíveis para CES, os biorreatores de coluna (leito empacotado) têm grande aplicabilidade na produção de diversos compostos de alto valor agregado, como enzimas para a indústria de biocombustíveis, por exemplo (IDRIS et al., 2017; SARATALE et al., 2017; SINGHANIA et al., 2017; INTASIT et al., 2020; ROTH; HOELTZ; BENITEZ, 2020; SIQUEIRA et al., 2020). Esta classe de biorreator é de design simples, custo reduzido, baixa necessidade de manutenção e, devido à ausência de movimento de partículas, é ideal para micróbios sensíveis ao estresse de cisalhamento. No entanto, poucos biorreatores para CES industriais estão disponíveis comercialmente devido a contratempos na ampliação de escala de bancada como determinação do crescimento microbiano, controle automático do processo de fermentação e um terceiro aspecto que deve ser melhorado em processos de CES confiáveis que é o monitoramento on-line das variáveis de processo (MITCHELL, et al., 1999; BÜCK et al., 2015; ASHOK; KUMAR, 2021). Em relação ao crescimento microbiano, sabe-se que não há análise direta deste crescimento em CES, portanto essa determinação é indireta, 28 Introdução João Paulo Henrique podendo ser realizada pela técnica de respirometria, caracterizada pela determinação dos gases de fermentação, ou pela determinação de algum marcador das células fúngicas, como a de N-acetilglucosamina, um dos constituintes da quitina que é o principal composto da parede celular dos fungos (LEVY; FINK, 2004; KENDRICK, 2017). Outro grande desafio para tornar o CES em uma realidade industrial é o controle e a remoção do calor gerado metabolicamente pelos microrganismos. Tal dificuldade deve-se à baixa condutividade térmica efetiva do meio de cultivo, em geral partículas orgânicas, e às baixas taxas de aeração empregadas, tornando os biorreatores de leito empacotado particularmente limitados para ampliação de escala. No grupo de pesquisa do Laboratório de Bioenergia do IBILCE/UNESP, diferentes alternativas de introdução do ar nos biorreatores foram testadas (ZANELATO et al., 2012; CASCIATORI, 2015; PEREZ; CASCIATORI; THOMÉO, 2019), com resultados promissores. Devido à baixa vazão de ar aplicada no modo de operação de ponta a ponta (única coluna, sem separação por módulos) e à baixa condutividade térmica efetiva dos sólidos orgânicos frequentemente usados em CES, os biorreatores de leito empacotado são estreitos e curtos, limitando a possibilidade de ampliação. Para grandes biorreatores, geralmente são relatados problemas de aumento de temperatura e diminuição do teor de umidade ao longo da operação para grandes aparatos, mas pouco se comenta sobre a concentração de gases respiratórios. Neste sentido, o objetivo da presente tese foi desenvolver estratégias de controle automático de temperatura para a produção de celulases fúngicas por cultivo em estado sólido empregando-se o fungo termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b em um biorreator de coluna vertical. 29 Objetivos João Paulo Henrique 2 OBJETIVOS Essa tese tem como objetivo geral a modelagem matemática e desenvolvimento de estratégias de controle automático de biorreator de leito fixo empacotado para a produção de celulases fúngicas por cultivo em estado sólido empregando-se o fungo termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b, cultivado em bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo. Para tanto, os objetivos específicos são:  Desenvolver um sistema automático de aquisição de dados de temperatura e concentração de gases e controle da temperatura no leito em um biorreator de coluna vertical;  Avaliar as estratégias de aeração e de controle de temperatura e umidade do biorreator que aumentem a produção de enzimas;  Avaliar, por meio de simulações, o efeito da variação da temperatura da parede, aeração, altura e diâmetro do biorreator, além de caracatrísticas de crescimento fúngico sobre as condições operacionais no eixo central longitudinal do biorreator;  Simular o aumento de escala para biorreatores de até 50 m3, de modo a avaliar as reais potencialidades de ampliação de escala industrial;  Adaptar modelo a duas fases disponíveis na literatura para a simulação do CES em biorreator de leito fixo empacotado com entrada de ar auxiliar na coluna;  Propor estratégias de controle baseadas no tempo de resposta do sistema (meio fermentativo), atuando sobre temperatura da parede do biorreator, vazões de ar de entrada na base e/ou no topo e distribuídas ao longo do biorreator. 30 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Cultivo em estado sólido O Cultivo em Estado Sólido (CES) tem sido utilizado desde a década de 1910, quando o Dr. Jokichi Takamine percebeu a possibilidade de implementar uma técnica já utilizada de cultivo enzimático em nível industrial (TAKAMINE, 1914; HOOGERHEIDE, 1954). Essa inspiração nasceu da técnica de uso do fungo Aspergillus oryzae, que já havia sido utilizado por muitos anos no Japão para diversos fins, como a produção de cerveja de saquê ou arroz, soja e missô. Buscava-se na época utilizar este e outros fungos para outros tipos de fermentação, principalmente para a produção em larga escala de enzimas (HOOGERHEIDE, 1954; UNDERKOFLER, 1954; FORBATH, 1957). Atualmente, além de aplicações já conhecidas para a produção de esporos, ácido cítrico, alpha amilase, ácido lático, pigmentos, lipases, e muitos outros, o CES tem sido usado para a produção de enzimas microbianas, metabólitos secundários e compostos bioativos (GOWTHAMAN; KRISHNA; MOO-YOUNG, 2001; SINGHANIA et al., 2009; BARRIOS-GONZÁLEZ, 2012). Outra característica interessante do CES, são suas vantagens em relação ao processo convencional de fermentação submersa (FSm) que apresenta fase aquosa abundante em comparação com fase não-aquosa predominante, no caso do CES (ZANELATO, 2011). Em CES as culturas microbianas estão mais próximas de seu habitat natural e possibilita o uso adequado dos rejeitos sólidos agroindustriais (PANDEY, 2003). Outras vantagens do CES em relação a FSm são a utilização de meio de cultivo natural, pouca adição de nutrientes, menores riscos de contaminação devido à baixa umidade do meio fermentativo, facilidade de aeração do meio devido a sua grande porosidade, facilidade de extração do material de interesse, entre outras (UMSZA-GUEZ, 2009). Sadh, Chawla e Duhan (2018) ainda destacam que o CES pode ser considerado mais atraente em termos de fermentação frente a FSm, devido a suas várias vantagens, como alta produtividade, simplicidade, baixo custo de 31 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique produção, baixo consumo de energia, melhor recuperação do produto e menor repressão por catabólitos. Em contrapartida, a FSm sempre encontrou preferência no ramo industrial pois, neste processos, há maior facilidade de transferência de massa para todos os componentes de fermentação (exceto para oxigênio dissolvido), apresentando assim maior reprodutibilidade e maior facilidade de monitoramento do processo produtivo em relação ao CES, além do relativo pouco conhecimento da fisiologia de fungos e outros microrganismos que crescem na CES, o que torna a FSm mais viável (CASCIATORI, 2015). Viniegra-González et al. (2003) propuseram desenvolver uma abordagem geral para a comparação da produtividade de enzimas empregando CES e FSm, e tentaram explicar o motivo de maior produção em CES. Dentre os resultados, maior biomassa, alta produção de enzimas e menor quebra de proteínas contribuem para uma melhor produção em CES. No entanto, poucos biorreatores para CES industriais estão disponíveis comercialmente devido a contratempos na ampliação de escala de bancada como determinação do crescimento microbiano, controle automático do processo de fermentação e um terceiro aspecto que deve ser melhorado em processos de CES confiáveis que é o monitoramento on-line das variáveis de processo (MITCHELL et al., 1999; BÜCK et al., 2015; ASHOK; KUMAR, 2021). Para a determinação do crescimento microbiano, tem-se utilizado a técnica de respirometria que pode ser aplicada durante a fermentação (on-line) e requer que os gases sejam removidos do biorreator e fluídos para o analisador de gases. Portanto, a maioria dos experimentos amostraram os gases na saída do leito para evitar perturbar o fluxo dentro da coluna e apenas a concentração gasosa total é obtida (SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1990; DESGRANGES et al., 1991; SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1994; DORTA; ERTOLA; ARCAS, 1996; TORRES-MANCERA et al., 2018; DA CUNHA et al., 2020). Poucos trabalhos na literatura produziram perfis axiais de concentração gasosa em biorreatores de leito empacotado (BASTOS; MOTTA; SANTANA, 2014) usaram colunas de diferentes alturas e mediram as concentrações de CO2 e O2 na saída das colunas em experimentos individuais, assumindo assim que biorreatores longos se comportam como a soma de colunas curtas 32 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique (GOWTHAMAN et al., 1993, 1995), desviou parte da vazão de entrada de três alturas de leito para a análise gasosa, mas foram fornecidos dados para poucos tempos de cultivo e poucos detalhes sobre a técnica de amostragem. A cinética dos gases respiratórios pode estar relacionada a diversas informações importantes do CES, como a cinética de crescimento fúngico, geração de calor metabólico, propriedades reológicas do meio de cultivo e cinética de síntese de enzimas, entre outras. Sabe-se que todos os métodos de estimativa de biomassa microbiana em CES são indiretos, pois não é prático separar o substrato do microrganismo (DU PLESSIS et al., 2001; PLIEGO- SANDOVAL et al., 2012; MANAN; WEBB, 2018). A maioria dos métodos exige procedimentos analíticos trabalhosos e a destruição das amostras para estimar a concentração de algum constituinte da célula microbiana, como o teor de N- acetilglicosamina, por exemplo (AIDOO; HENDRY; WOOD, 1981). Portanto, toda a cinética do crescimento da biomassa demanda uma série de experimentos sequenciais. Por outro lado, a técnica respirométrica é prática para estimativa de biomassa, pois é processada na hora e os parâmetros de crescimento podem ser avaliados diretamente a partir da curva cinética de crescimento, desde que se conheça a relação entre biomassa e concentração gasosa (DORTA; ERTOLA; ARCAS, 1996). A partir da concentração de oxigênio é possível estimar o calor gerado metabolicamente (ROELS, 1983), uma informação crucial a ser aplicada na modelagem de transferência de calor e massa (SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1990; SANGSURASAK; MITCHELL, 1995a, b; CASCIATORI et al., 2016). O crescimento microbiano determinado na literatura por meio de análise respirométrica foi relacionado à colonização do substrato e à modificação das propriedades reológicas do meio de cultura, como dureza, resistência à tração e agregação (SCHUTYSER et al., 2003; CANEDO; FIGUEIREDO; THOMÉO, 2022). Além da respirometria, variáveis como a temperatura e o teor de umidade também foram amplamente explorados em biorreatores de leito empacotado e gradientes relacionados ao tempo para as coordenadas radiais e axiais foram publicados. Para medir a temperatura, termopares revestidos geralmente são inseridos radialmente na coluna em diferentes alturas e locais 33 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique radiais (SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1990; PANDEY; RADHAKRISHNAN, 1992; GHILDYAL et al., 1994; ZANELATO et al., 2012; CASCIATORI et al., 2016; PEREZ; CASCIATORI; THOMÉO, 2019, 2021), enquanto para determinar o teor de umidade uma porção do meio colonizado deve ser removida do biorreator após o cultivo e o teor de umidade é determinado por meio de métodos gravimétricos (GOWTHAMAN et al., 1993; DORTA; ERTOLA; ARCAS, 1996; ZANELATO et al., 2012; CASTRO; CASTILHO; FREIRE, 2015; CASCIATORI et al., 2016). Em CES, a demanda de aeração contribui significativamente para o consumo geral de energia (KREYENSCHULTE et al., 2016). Consequentemente, operar com o mínimo possível de transferência de oxigênio é economicamente atraente. Além disso, as chamadas condições de cultivo microaeróbicos são frequentemente benéficas para a produção biotecnológica de compostos como aminoácidos, vitaminas, polissacarídeos, enzimas e álcoois (ZENG; DECKWER, 1996). Sob condições limitadas de oxigênio, o equilíbrio NADH2/NAD+ intracelular não pode ser mantido apenas pela oxidação do NADH2 na cadeia respiratória. Consequentemente, a formação de metabólitos reduzidos é favorecida para regenerar NAD+ para manter a produção de energia via glicólise (ZENG et al., 1994). Para controlar a taxa de aeração, o quociente respiratório (QR ) tem sido aplicado com sucesso para monitoramento e controle de processos durante cultivos microaeróbicos submersos (BRANDBERG; GUSTAFSSON; FRANZÉN, 2007). O QR é o quociente de formação de dióxido de carbono e consumo de oxigênio e fornece informações adicionais sobre a atividade metabólica do organismo. Dependendo da fonte de carbono utilizada, formação de biomassa e formação de metabólitos de transbordamento, diferentes valores de QR são observados. Geralmente, um QR de 1 resulta quando substrato e produto têm o mesmo grau de redução. O QR tem valores superiores a 1 quando o produto é mais reduzido que o substrato e valores inferiores a 1 no caso contrário (HEYMAN et al., 2019). Em se tratando do substrato, as propriedades reológicas também devem ser consideradas para a operação de biorreatores de leito estático e móvel, uma vez que é possível prever a tendência de compactação do substrato em 34 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique colunas verticais compactadas e de impedimento do movimento de partículas em biorreatores de tambor rotativo. A relação entre o crescimento fúngico e a síntese de enzimas é frequentemente avaliada em processos de CES para determinar a atividade máxima de algumas enzimas de interesse ou para desvendar mecanismos de desestruturação de tecidos vegetais (VOLKE- SEPULVEDA et al., 2016; FONSECA et al., 2018; FRASSATTO et al., 2021; SANTOS GOMES et al., 2021). 3.2 Enzimas celulolíticas para bioconversão de resíduos lignocelulósicos Dentre as citadas anteriormente, uma das grandes aplicabilidades desta tecnologia de CES tem sido a bioconversão de resíduos lignocelulósicos em bioetanol, pois utiliza resíduos industriais transformando-os em produtos de alto valor agregado e principalmente por ter caráter renovável. Diante dessa necessidade de redução do consumo de combustíveis fósseis e a busca por alternativas na produção de etanol, esta técnica vem sendo bastante utilizada para a produção de celulases fúngicas, que hidrolisam a biomassa lignocelulósica, gerando assim açúcares fermentescíveis para a produção do etanol de segunda geração (NOVELLO et al., 2014). Essa técnica vem sendo cada vez mais estudada e aperfeiçoada, principalmente devido à Guerra do Oriente Médio, em 1975, e a elevação do preço do barril de petróleo. Neste contexto o governo brasileiro implantou o Programa Nacional de Álcool (Pró Álcool) tornando o Brasil o primeiro país do mundo a desenvolver um programa alternativo de substituição da gasolina por outro combustível. No entanto, para que haja redução ainda maior no consumo de combustíveis fósseis, há a necessidade de se aumentar a produção de álcool. Neste contexto, para que não seja necessário o aumento da área plantada de cana de açúcar, que passaria a ocupar áreas agrícolas de produção de bens alimentícios ou áreas de proteção ambiental, o uso de biomassa para a produção de etanol se faz necessário, o chamado etanol de segunda geração. 35 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique Segundo estimativa da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2021), a safra 2021/22 terá 570 milhões de toneladas de cana-de-açúcar gerando em torno de 157 milhões de toneladas de bagaço. Este resíduo agroindustrial é constituído de aproximadamente 50% celulose, 25% hemicelulose e 25% lignina, sendo assim, uma potencial fonte de açúcares fermentescíveis para produção de etanol de segunda geração. Para realizar a produção de etanol a partir de resíduos lignocelulósicos é necessário o pré-tratamento da biomassa para quebrar o complexo de lignina- hemicelulose-celulose. Após esta etapa realiza-se a hidrólise para a quebra de celulose e hemicelulose em açúcares monoméricos, disponibilizando-os para a fermentação e consequente recuperação do etanol por meio da destilação (HU; HEITMANN; ROJAS, 2008). Essa biomassa é comumente misturada a alguma fonte de nitrogênio facilitada (como o farelo de trigo, por exemplo), com a função de induzir o crescimento fúngico, e após consumida essa fonte, o microrganismo tende a gerar a enzima lignocelulósica. A etapa de hidrólise ou sacarificação pode ocorrer por via química, gerando resíduos tóxicos que necessitam de tratamento, ou por via enzimática que apresenta diversas vantagens sobre a rota química, dentre as quais se destacam o menor gasto energético e a alta especificidade pelo substrato, evitando a produção de compostos indesejáveis (CASCIATORI, 2015). No entanto, as enzimas respondem pelo terceiro maior custo na produção de etanol de segunda geração, ficando atrás apenas dos custos de capital e de matéria-prima (NOVELLO et al., 2014). Neste contexto, diversos trabalhos têm sido realizados para a produção destas enzimas fribrolíticas, como por exemplo, o uso de Aspergillus niger e outros microrganismos na bioconversão de resíduos sólidos como cascas de batata, bagaço de maçã, bagaço de uva, bagaço de beterraba açucarada, caules de sorgo doce, bagaço de cana e resíduos de alimentos na produção de bioetanol (RODRÍGUEZ et al., 2010; KANWAR et al., 2012; DU et al., 2014; KIRAN; LIU, 2015; LIU et al., 2015; CHINTAGUNTA; JACOB; BANERJEE, 2016). Chintagunta, Jacob e Banerjee (2016) apresentaram uma interessante bioconversão integrada de casca de batata por CES para a produção de 36 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique bioetanol e biocompostos empregando leveduras e fungos como Aspergillus niger, A. variabilis e S. cerevisiae em um esforço para atingir zero geração de resíduos. Outros trabalhos utilizaram o tronco de palmeira (ANG et al., 2015), a palha de arroz (SURESH; SRUJANA; MURALIDHARAN, 2015; THOMAS; PARAMESWARAN; PANDEY, 2016) e o pseudo-tronco de banana (INGALE; JOSHI; GUPTE, 2014) para produzir bioetanol com alto rendimento (84%) de Aspergillus sp. e T. reesei por meio da CES. Du et al. (2014) confirmaram a viabilidade de aumentar a bioconversão de caules de sorgo doce por S. cerevisiae de experimentos de bancada (500 mL) para um fermentador de tambor rotativo de 127 m3 e subsequentemente em um fermentador de tambor rotativo de 550 m3 com 88% de rendimento teórico relativo de etanol em menos de 20 h. Na comparação entre a CES e a fermentação submersa (FSm), trabalhos já evidenciam uma maior produção utilizando a técnica de CES. Por exemplo, o rendimento de etanol em uma bioconversão de bagaço de uva e beterraba sacarina foi superior a 82% obtido em 48 h e foi maior do que em FSm (RODRÍGUEZ et al., 2010). Além disso, o etanol obtido foi mais concentrado do que na FSm, reduzindo os custos de recuperação. A utilização de todo o meio fermentado contendo um coquetel enzimático de Trichoderma reesei, A. niger, A. oryzae (PIROTA; DELABONA; FARINAS, 2014) e Kluveromyces marxianus (SINGHANIA et al., 2015) evidenciaram uma redução de custo eficiente, reduzindo a extração enzimática que permite o uso de um único sistema de biorreator no CES. Da mesma forma, um bioprocesso consolidado que integra produção, sacarificação e fermentação de enzimas para produção de bioetanol em CES por Trichoderma sp., Penicillium sp. e Saccharomyces cerevisiae evitou a preparação de enzimas e reduziu o consumo de energia e o investimento em equipamentos (LIU et al., 2015). 37 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique 3.3 Myceliophthora thermophila I-1D3b: aplicações e condições de cultivo Dentre os microrganismos produtores de celulases e hemicelulases encontrados na literatura algumas linhagens do fungo termófilo Myceliophthora sp. têm apresentado resultados promissores, como por exemplo, os apresentados na Tabela 1 abaixo: Tabela 1. Enzimas obtidas por CES a partir de rejeitos sólidos agroindustriais por linhagens de Myceliophthora sp. Microrganismo Substrato Atividade enzimática1 (U·g.s.s.-1) Referência CMCase Xilanase FPU2 Myceliophthora sp. (U2A2) Palha de arroz 31 590 0,6 Soni et al. (2008) Myceliophthora fergusii (T41) Palha de arroz 37 885 2,3 Soni et al. (2008) Myceliophthora sp. (MYC) Palha de arroz 35 900 2,4 Soni et al. (2008) Myceliophthora sp. (IMI389099) Bagaço de cana 7 620 0,7 Badhan et al. (2007) Myceliophthora sp. (IMI389099) Farelo de trigo 27 129 0,7 Badhan et al. (2007) Myceliophthora thermophila (M.77) Bagaço de cana e Farelo de trigo - - 10,6 Kilikian et al. (2014) 1 U·g.s.s. -1 : unidades de atividade enzimática por grama de substrato sólido seco; 2 FPU: unidades de atividade em papel de filtro (filter paper unit). Fonte: Elaborado pelo autor. Além destes trabalhos, o fungo Myceliophthora thermophila têm sido aplicado com sucesso em biorreatores pelo Grupo de Bioenergia e Meio Ambiente do IBILCE/UNESP (MORETTI, 2010; ZANELATO et al., 2012; 38 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique CASCIATORI, 2015). Os maiores valores das atividades enzimáticas obtidas nestes trabalhos estão apresentados na Tabela 2. Tabela 2. Enzimas obtidas por CES a partir de rejeitos sólidos agroindustriais por linhagens de Myceliophthora thermophila. Microrganismo Substrato Atividade enzimática1 (U·g.s.s.-1) Referência CMCase Xilanase FPU2 Myceliophthora sp (M.77) Bagaço de cana e Farelo de trigo 54 1045 2,0 Moretti (2010) Myceliophthora thermophila (I-1D3b) Bagaço de cana e Farelo de trigo - 900 8,3 Zanelato et al. (2012) Myceliophthora thermophila (I-1D3b) Bagaço de cana e Farelo de trigo 786 2124 16,4 Casciatori (2015) Myceliophthora thermophila (I-1D3b) Bagaço de cana e Farelo de trigo 210 1100 - Perez et al. (2021) 1 U·g.s.s. -1 : unidades de atividade enzimática por grama de substrato sólido seco; 2 FPU: unidades de atividade em papel de filtro (filter paper unit). Fonte: Elaborado pelo autor. Moretti (2010) avaliou a linhagem Myceliophthora sp M.7.7, e os picos de produção das enzimas xilanase (1044,6 U·g-1 de substrato) e endoglucanase (53,7 U·g.s.s.-1) foram obtidos quando este foi cultivado em mistura de bagaço de cana e farelo de trigo (9:1 p/p) a 45°C por 14 dias. Zanelato et al. (2012) avaliaram a produção de endoglucanase pela linhagem de Myceliophtora thermophila I-1D3b usando uma mistura de farelo de trigo (FT) e bagaço de cana (BC) como meio de cultura cultivados em sacos plásticos e biorreator de leito empacotado. Neste trabalho foram avaliadas as condições de temperatura (40, 45, e 50°C), umidade inicial (75, 80, e 85%, b.u.), e a proporção de BC/FT (1:1, 7:3, e 9:1). As maiores atividades enzimáticas em sacos plásticos para endoglucanase foram obtidas utilizando a 39 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique proporção de substrato de 7:3, temperatura de 50°C e teor de umidade inicial de 80% (878 U·g.s.s.-1). Nestas condições também foram observados ótimos resultados de atividade para xilanase e FPU na ordem de 900 e 8,3 U·g.s.s.-1, respectivamente. Casciatori (2015) avaliou diversas proporções e condições de substrato, aeração, e temperatura, e os resultados mais promissores foram considerando uma proporção de BC:FT 7:3 (m/m), aeração entre 30 e 360 L·h-1, além de uma temperatura de fermentação em torno de 45°C. Por outro lado, Perez, Casciatori e Thoméo (2021) avaliaram a produção de enzimas neste mesmo equipamento alterando as condições de aeração e porosidade do meio e nas melhores condições obtiveram resultados máximos de 210 U·g.s.s.-1 para CMCases e 1100 U·g.s.s.-1 para xilanase. Esses valores baixos, em relação aos resultados apresentados por Casciatori (2015) confirmam a grande variabilidade de resultados em diferentes épocas e replicação do fungo. 3.4 Modelos matemáticos para cultivo em estado sólido em biorreator de leito fixo empacotado Visando o aumento das performances destes biorreatores, tem-se utilizado a modelos matemáticos em CES com o objetivo de determinar expressões matemáticas que representem o sistema reacional, de forma que, validados com base em dados obtidos em escala laboratorial, possam ser usados como ferramentas no dimensionamento de biorreatores e possibilitem o aumento de escala e aperfeiçoamento de equipamentos sem a necessidade de experimentos. Baseados em equações diferenciais, estes modelos devem considerar os efeitos das variações das condições operacionais além de predizer como a taxa de escoamento do ar, sua umidade relativa e temperatura irão afetar a temperatura e o conteúdo de umidade do substrato e formação do produto de interesse (CASCIATORI, 2015). Por exemplo, ao considerar a transferência de calor e de água em biorreatores, os modelos matemáticos aplicados a simulações dos processos de produção podem, por exemplo, fornecer informações de prováveis pontos 40 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique quentes e secos no interior do leito tornando possível a atuação manual ou automática para evitar essas condições (SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1990; MITCHELL et al., 1999; THOMÉO; ROUILLER; FREIRE, 2004; CASCIATORI, 2015). Nestes modelos utiliza-se alguns números adimensionais para avaliar a condições operacionais. Por exemplo, utiliza-se o Número de Damköhler modificado ( mDa ) que correlaciona a geração de calor pelo meio fermentativo sobre a capacidade de remoção por meio da aeração, ou seja, quanto maior a aeração, menor será o valor de mDa (COONEY; WANG; MATELES, 1968; MITCHELL et al., 1999). Utiliza-se também o número de Nusselt ( Nu ) para avaliar a realção entre transferência de calor convectivo e condutivo e para avaliar a tranferência de massa (por exemplo, a tranferência de umidade no meio) utiliza-se o número de Sherwood (Sh ) que é obtido pela razão entre a capacidade de tranferência de massa convectiva sobre a capacidade de transeferência de massa difusiva. O modelo de Sangsurasak e Mitchell (1998) visa simular a transferência de calor de forma bidimensional e foi validado por dois estudos experimentais da literatura que descrevem o crescimento de Aspergillus niger durante o cultivo em estado sólido em biorreatores de leito compactado. Apesar dos resultados sugerirem que a evaporação pode remover até 78% do calor do leito durante os períodos de pico de geração de calor, os autores sugerem que são necessárias melhorias adicionais no equacionamento, como por exemplo, o coeficiente de transferência de calor parede-fluido, a porosidade do leito e o valor da condutividade térmica do meio sólido (CASCIATORI, 2015). Saucedo-Castañeda et al. (1990) apresentaram um modelo cinético baseado na equação logística para a taxa de crescimento microbiano. Além da proposição deste modelo, foram propostos modelos de dependência da temperatura sobre o crescimento e um modelo de transporte para avaliar mecanismos de condução e convecção na transferência de calor no CES. Mais tarde, Fanaei e Vaziri (2009) propuseram um modelo cinético para o crescimento microbiano baseado na influência das temperaturas passadas e atuais no crescimento que normalmente ocorre durante o cultivo em estado 41 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique sólido em biorreatores de larga escala. Este modelo de transferência dinâmica de calor apresenta algumas vantagens em comparação com os modelos logísticos, pois considera duas premissas principais. Em primeiro lugar, as variações radiais de temperatura são ignoradas porque o fluxo de ar foi disposto através do leito aerado de ponta a ponta (end-to-end) e, em segundo lugar, o equilíbrio térmico era suposto entre o ar e as partículas de substrato em qualquer ponto do leito. Casciatori (2015) e Casciatori et al. (2016) sugeriram um modelo para a transferência de calor, baseado nos modelos de Sangsurasak e Mitchell (1998), e um modelo para a transferência de umidade, baseado nos modelos de Von Meien e Mitchell (2002). Os modelos propostos englobaram ainda a cinética de crescimento do microrganismo e o efeito das variáveis de processo sobre o crescimento microbiano, previamente determinadas por meio de ensaios fermentativos. Para a simulação, foram utilizadas propriedades físicas reais das partículas e do leito. Os coeficientes de interface foram calculados com base em correlações clássicas. Apesar destes avanços, algumas lacunas ainda estão abertas nesta área de estudo, principalmente pela dificuldade de determinar a taxa de crescimento fúngico em função da posição e das condições de cultivo, além do efeito de ampliação de escala e de possibilitar a otimização dos processos produtivos por meio de estratégias de controle. 3.5 Estratégias de controle de operacional para cultivo em estado sólido em biorreator de leito empacotado Baseados em modelos matemáticos ou na obtenção de dados on-line do processo de fermentação, as estratégias de controle deste tipo de processo visam monitorar e controlar diversas variáveis de fermentação que são importantes para garantir uma alta produtividade em CES. Basicamente as variáveis monitoradas são as concentrações de gases no leito, temperaturas, umidades, aeração, taxa de crescimento especifico (  ) e etc (LONSANE et al., 1985, 1992). 42 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique Neste contexto, a falta de equipamentos de monitoramento destas variáveis de processo e condições adequadas de controle impediram, em parte, o aumento deste tipo de processo até 1980 (SAUCEDO-CASTAÑEDA et al., 1994). Dentre as variáveis manipuladas, a aeração do meio sólido úmido é um dos fatores críticos que regem a produtividade (LONSANE et al., 1992), pois não apenas fornece O2, mas também remove calor metabólico, produtos gasosos e voláteis da massa fermentativa. Dessa forma, essas características influenciam no meio fermentativo, e a medição das concentrações de gases, como a concentração de O2 ou do acúmulo de CO2 devem ser consideradas, pois, além de influenciar o processo fermentativo, são frequentemente utilizadas para a estimativa indireta da biomassa (CARRIZALEZ; RODRÍGUEZ; SARDIÑA, 1981). Na época em que este tipo de monitoramento estava sendo criado, Saucedo-Castañeda et al. (1994) propuseram um sistema que envolvia o monitoramento automatizado on-line da concentração de CO2 e O2 nos gases de escape de oito fermentadores ou oito portas de amostragem de gás em um fermentador grande. Eles focaram na obtenção de informações sobre o estado fisiológico e sobre a taxa de respiração da cultura em um processo em tempo real. Além disso, a taxa de crescimento específico pôde ser estimado de forma confiável por medições de gás em culturas aeróbicas. Outro sistema proposto naquele trabalho foi o controle automatizado dos gases de saída dos cultivos aeróbios em estado sólido. Dessa forma, permitiram a eliminação de gradientes de biomassa e temperatura em um fermentador grande devido à manutenção da cultura sob condições não limitantes de oxigênio. As primeiras tentativas para o controle da fermentação de levedura de panificação utilizaram o controle PID clássico (Controlador proporcional integral derivativo), baseado na estratégia de controle de feedback (WANG; COONEY; WANG, 1977; DAIRAKU et al., 1982; AXELSSON et al., 1988; POMERLEAU; VIEL, 1992; KEULERS, 1993; VON MEIEN et al., 2004). Nestes trabalhos a estratégia era regular a taxa de crescimento específico e a concentração de etanol com base na taxa de alimentação do substrato. 43 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique Von Meien et al. (2004), por exemplo, apresentaram uma abordagem de controle de feedback MISO (multiple-input single-output) usando PID e CMD (controle de matriz dinâmica) para a temperatura média do leito em um biorreator de cultivo em estado sólido misto, onde a mistura alcança implicitamente uma equalização dos gradientes de temperatura e umidade (BÜCK et al., 2015). Renard e Wouwer (2008) projetaram dois controladores robustos diferentes para maximizar a produtividade de biomassa em culturas aeróbicas de S. cerevisiae. O controle da concentração do metabólito de transbordamento (por exemplo, etanol e acetato para S. cerevisiae e Escherichia coli, respectivamente) em valores mínimos pode ser visto como uma maneira alternativa de controlar a taxa de crescimento específico próxima ao valor máximo (VELUT; DE MARÉ; HAGANDER, 2007; DEWASME et al., 2010). Hocalar e Türker (2010) implementaram um controle do metabólito mínimo de transbordamento sugerido por Valentinotti et al. (2003) e Cannizzaro, Valentinotti e Von Stockar (2004) à escala de fermentação de leveduras em bateladas alimentadas (fed-batch yeast fermentation). O controlador foi baseado no método de linearização de feedback de estado. O objetivo do controlador foi regular a concentração de etanol em um ponto fixo (setpoint) de 8% ou em um tempo pré-determinado, variando o perfil definido ao longo da fermentação, manipulando a taxa de alimentação do substrato. Os resultados apresentam uma estabilização da concentração de etanol a partir das 10 h de fermentação, com pequenas oscilações próximas a 4%. Em se tratando de biorreatores de leito empacotado (packed-bed bioreactors), Bück et al. (2015) propuseram um esquema de controle com esquema feedback baseado em modelo matemático com o objetivo de manipular as condições térmicas de modo a evitar condições operacionais desfavoráveis em todo o leito que pudessem inibir o crescimento de microrganismos e afetar negativamente a produção de enzimas. Diante do grande número de parâmetros do processo influenciando o desempenho do processo, o conjunto de variáveis manipuladas são referentes ao lado do gás, ou seja, temperatura da entrada de gás, teor de umidade da entrada de gás e 44 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique fluxo de massa de gás. O controle se baseou na mudança do fluxo do ar de entrada e os resultados mostraram a efetividade da comutação da direção do fluxo de ar pelo controlador de realimentação mantendo a temperatura entre 44,5 e 49,0°C, bem próximas a temperatura ideal (setpoint) de fermentação. 3.6 Análise de sensibilidade de variáveis de modelos matemáticos para biorreatores de leito fixo empacotado A partir dos modelos matemáticos disponíveis para essas simulações, uma ferramenta interessante para analogia e utilização na análise de sensibilidade das variáveis do modelo matemático é a Metodologia de Superfície de Resposta (MSR). Esta metodologia é um método de otimização combinando técnicas estatísticas e permite a construção de modelos empíricos a fim de verificar o efeito de um conjunto de variáveis independentes sobre uma ou mais variáveis dependentes (variáveis resposta). Na área de Engenharia de Alimentos, pode ser utilizada como uma ferramenta para determinar as condições ótimas de um processo, na obtenção de características desejáveis ou ótimas de um resultado especificado (BOX; DRAPER, 1987). De acordo com Barros-Neto, Scarminio e Bruns (2010) esta metodologia consta de duas etapas distintas, sendo elas modelagem e deslocamento. A modelagem é a primeira etapa onde se busca o melhor ajuste (linear ou quadrático) às respostas obtidas com o planejamento fatorial utilizado. Já o deslocamento é a etapa onde se busca o caminho de máxima inclinação de um determinado modelo, ou seja, onde a resposta é mais pronunciada em relação à uma variável independente. Outra característica interessante da MSR é minimizar o número de ensaios necessários, por exemplo, em um exemplo que contém três variáveis independentes e cinco níveis para cada fator, ou seja, cinco valores para cada variável, o delineamento experimental é realizado com apenas 17 ensaios (BARROS-NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2010). Segundo Montgomery e Runger (2009), na Metodologia de Superfície de Resposta, parte-se do princípio que as relações entre as respostas e as 45 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique variáveis independentes são desconhecidas, e, por isso, é necessário encontrar uma aproximação adequada para a relação verdadeira entre a resposta (Y) e as variáveis independentes. Assim, emprega-se um polinômio de baixo grau em alguma região das variáveis independentes e, se a resposta se ajustar bem ao modelo de uma função linear das variáveis independentes, a função de aproximação será o modelo de primeira ordem a seguir: RESxxxY kk   ...22110 (1) Porém, se houver curvatura no sistema, um modelo polinomial de maior grau deve ser usado, tal como o modelo de segunda ordem: RESxxxxY j ji iij k i iii k i ii     1 2 1 0 (2) A MSR é um método sequencial, ou seja, espera-se que em um ponto da superfície de resposta longe do ponto ótimo, há pouca curvatura no sistema e o modelo de primeira ordem é apropriado. Por outro lado, uma vez que o objetivo é chegar à vizinhança do ponto ótimo ou mais precisamente ao ponto ótimo, um modelo mais elaborado, tal como o modelo de segunda ordem, pode ser empregado. Assim, para avaliar numericamente a qualidade de ajuste de um modelo, a Análise de Variância (ANOVA) costuma ser o método mais utilizado (MONTGOMERY; RUNGER, 2009; BARROS-NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2010). No processo de cultivo em estado sólido, a MSR tem sido utilizada para demostrar o efeito da temperatura, tempo de fermentação e atividade de água na produção de enzimas celulolíticas (endoglucanase e atividade total de celulase) por meio de resíduos de cirigueleira por meio do fungo Aspergillus niger (DOS SANTOS et al., 2013). Neste trabalho, em ambos os modelos, o melhor ajuste foi o polinomial onde a atividade de água teve contribuição quadrática e o tempo de fermentação e a temperatura de fermentação tiveram contribuições lineares. 46 Revisão Bibliográfica João Paulo Henrique Singh, Chauhan e Jindal (2018) também aplicaram esta metodologia em CES para avaliar a produção de inulinase a partir de farelo de milho usando o fungo Penicillium oxalicum. A inulinase é uma classe de enzimas que hidrolisam a ligação β-2,1 glicosídica para produzir frutose, inulo- oligossacáridos e glicose a partir de alimentos como cebola, alho, aspargo e alcachofra. Neste contexto, avaliaram o efeito de variáveis independentes como tempo, pH e umidade de fermentação sobre a variável dependente produção de inulinase, também encontrando ajuste polinomial com efeito quadrático nas três variáveis independentes avaliadas. 47 Materiais e Métodos João Paulo Henrique 4 MATERIAIS E MÉTODOS Este projeto foi desenvolvido no Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus São José do Rio Preto. 4.1 Microrganismo 4.1.1 Fungo termofílico Myceliophthora thermophila I-1D3b Para a preparação da fermentação foram utilizadas soluções estoque do fungo Myceliophthora thermophila I-1D3b (termofílico). Este fungo foi isolado pela Profª. Drª. Daniela Alonso Bocchini (IQ/UNESP) a partir de pilhas de cana- de-açúcar em uma indústria de etanol em Olímpia, Estado de São Paulo, Brasil e já foi utilizado pelo Grupo de Bioenergia e Meio Ambiente (ZANELATO et al., 2012; CASCIATORI, 2015; PEREZ; CASCIATORI; THOMÉO, 2019). Este fungo já se caracterizou como produtor de celulases e hemicelulases de altos títulos, as quais foram utilizadas com sucesso para a despolimerização de materiais lignocelulósicos em escalas de frascos e de biorreator de leito empacotado de bancada. Estas soluções estoques foram armazenadas em tubos de ensaio criogênicos de glicerol (20%) a -80°C, mantidas em tubos de ensaio e cultivadas por 96 h a 45°C em meio Agar-Sabouraud Dextrose (ASD). Depois, foram cobertas por uma fina camada de óleo mineral e mantidas a 5°C. Destas culturas, os esporos foram removidos e colhidos em erlenmeyers inclinados contendo o meio ASD, considerando o tempo e condição de temperatura supramencionados. Ao meio de cultura foi adicionada solução estéril de nutrientes que consiste em uma solução salina contendo 0,35% (p/v) de (NH4)2SO4, 0,3% (p/v) de KH2PO4, 0,05% (p/v) de MgSO4∙7H2O, 0,05% (p/v) CaCl2 e Tween 20 a 0,1% (v/v) em pH 5,0. A concentração final da suspensão foi ajustada para 107 esporos·mL-1 a partir da contagem de esporos da câmara de Neubauer (ZANELATO, 2011). Neste trabalho, a concentração de esporos foi fixada em 107 esporos·g-sólido-seco-1 (doravante g.s.s.). 48 Materiais e Métodos João Paulo Henrique 4.2 Substratos Como substrato, foram utilizados bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo, na proporção bagaço de cana/farelo de trigo 7/3 e umidade de 75% (b.u.) (ZANELATO, 2011). O bagaço foi doado por uma produtora de etanol de Onda Verde, Estado de São Paulo, Brasil, seco em estufa convectiva a 60°C até peso constante, peneirado (fibras entre 1,41 e 4 mm) e armazenados sob refrigeração. O farelo de trigo foi adquirido em um revendedor local, seco em estufa a 40°C até peso constante e armazenado sob refrigeração. Ambos foram embalados em sacos de polietileno de paredes espessas em uma câmara de refrigeração até o uso. Para os testes, o substrato foi autoclavado, juntamente com a solução nutriente, e depois inoculado com a suspensão do fungo até umidade de 75% (b.u.) para então ser homogeneizado e empacotado no biorreator. Para manter as mesmas condições do substrato, utilizou-se como referência a proporção da mistura bagaço de cana/farelo de trigo seco com uma densidade de 0,57 g·cm-3 do meio (considerando somente a massa seca), ou seja, para um volume de módulo de 785 cm3 foi usado uma mistura de substrato de 45 g.s.s. Outra característica importante para padronização do meio foi o uso de telas perfuradas entre cada módulo do biorreator para que o substrato previamente preparado fosse inteiramente acondicionado em cada módulo do biorreator. 4.3 Cultivo em embalagens de polipropileno Para comparação dos resultados com os obtidos em biorreator, foram realizadas fermentações em sacos de polietileno. Nestas embalagens plásticas de dimensões 14 x 22 cm foram acondicionados 5 g de substrato (bagaço de cana e farelo de trigo, b.s.), e as mesmas foram esterilizadas em autoclave por 30 minutos a 121ºC. Após esta etapa foi adicionada solução nutriente e a suspensão de esporos de forma a atingir uma umidade de 75% (b.u.). Este material foi então lacrado com bocais de tubos de policloreto de vinila (PVC), tampão de algodão, para possibilitar a troca de gases e acondicionado em 49 Materiais e Métodos João Paulo Henrique câmara de cultura DBO por 96 h e 45°C, como pode ser observado na Figura 1. No interior das embalagens plásticas foram colocados arames em forma de espiral para facilitar a aeração do meio, evitar a aglomeração do substrato e evitar o colapso da embalagem plástica no momento da esterilização em autoclave. A seguir, quando se refere à atividade enzimática CMCase relativa, esta foi calculada como a razão da atividade enzimática real determinada a partir de amostras extraídas do biorreator pela atividade enzimática média obtida nos experimentos em embalagens plásticas. Essa é uma prática comum de nosso grupo de pesquisa para filtrar possíveis problemas de manipulação do fungo antes dos experimentos no biorreator. Figura 1. Sacos fermentadores de polipropileno em câmara de cultura DBO. Fonte: Elaborado pelo autor 4.4 Esquema de montagem inicial do equipamento Dentre os biorreatores de leito empacotado para a produção em batelada, disponíveis no Grupo de Bioenergia e Meio Ambiente do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos do IBILCE/UNESP, foram utilizados dois biorreatores. Um biorreator estreito composto de módulos construídos com aço inox de 7,62 cm de diâmetro e 10 cm de comprimento, e um biorreator largo composto de módulos de 20 cm de diâmetro e 20 cm de comprimento. 50 Materiais e Métodos João Paulo Henrique Estes biorreatores já foram utilizados por diversos trabalhos no grupo de pesquisa ao qual este projeto está inserido. A Figura 2 apresenta o esquema de montagem do biorreator estreito com oito módulos reacionais. O biorreator largo é montado de forma análoga. Figura 2. Esquema de montagem inicial do biorreator estreito com oito módulos reacionais. Fonte: Elaborado pelo autor. Um módulo de entrada não reacional ( eM ) foi posicionado na parte inferior da coluna e preenchido com bagaço de cana-de-açúcar úmido para evitar a secagem do primeiro módulo reacional. Um módulo de saída não reacional ( sM ), preenchido com bagaço de cana-de-açúcar seco, foi posicionado no topo da coluna, a fim de evitar que o refluxo da água condensada do ar aumentasse o teor de umidade do módulo reacional superior. Foram utilizados de quatro a oito módulos reacionais, dependendo do 51 Materiais e Métodos João Paulo Henrique tipo do biorreator estreito ou largo. Para o biorreator estreito, cada módulo reacional continha 45 g (massa seca) de mistura inoculada bagaço de cana/farelo de trigo com 75% de umidade (b.u.). Para o biorreator largo, cada módulo reacional continha 625 g (massa seca) de mistura inoculada bagaço de cana/farelo de trigo e ajustada para o mesmo teor de umidade de 75% (b.u.). Para manter a temperatura do meio reacional, água percorria ao longo da camisa dos módulos a 45°C, mantida por um banho termostático, com ramificações para cada módulo na alimentação e no retorno (detalhes na Figura 2). 4.5 Modificação estrutural do equipamento Visando aperfeiçoar o processo de produção enzimática e propor estratégias de controle, algumas modificações estruturais foram propostas, sendo estas destacadas na mesma Figura 3, por meio de indicativos tracejados. Figura 3. Configuração inicial do equipamento (linhas contínuas) e modificações propostas (linhas tracejadas). Fonte: Elaborado pelo autor. A seguir são apresentados os detalhes destas modificações. 52 Materiais e Métodos João Paulo Henrique 4.5.1 Sistema de aquecimento encamisado do biorreator Como é apresentada nas Figuras 2 e 4, a configuração inicial para o sistema de aquecimento encamisado do biorreator apresentava uma complexa montagem, gerando vazamentos e uma grande oscilação da temperatura da água no leito encamisado. Essas montagens das tubulações de alimentação de água (saída do banho termostático a 45°C) e de retorno para o banho termostático eram realizadas por meio de mangueiras azuis de poliuretano e as conexões com o biorreator eram realizadas por meio de conexões de engate rápido. Figura 4. Configuração inicial do sistema de aquecimento das camisas do biorreator. Fonte: Elaborada pelo autor. Como propostas para a modificação do sistema de aquecimento encamisado do biorreator, foram alterados os tipos de conexões com o biorreator e a configuração de aquecimento das camisas, de acordo com a Figura 5. Como mangueira foi proposta a utilização de um tipo destinada para 53 Materiais e Métodos João Paulo Henrique uso industrial, fabricadas em três camadas, sendo duas delas de uma blenda polimérica com borracha nitrílica e, entre elas, uma de reforço com malha de fios de poliéster industrial de alta tenacidade. Para conexão entre as mangueiras e o banho termostático, e entre as mangueiras e os módulos do biorreator, foram utilizados espigões e abraçadeiras. Neste contexto o fluxo de água quente deveria aquecer os módulos da base para o topo, em sequência, e já retornar para o banho termostático, garantindo que, após atingir a condição de equilíbrio, o banho termostático atuasse de forma efetiva e garantisse que as temperaturas da parede de todos os módulos estivessem praticamente na mesma temperatura. Figura 5. Configuração proposta para o sistema de aquecimento das camisas do biorreator. Fonte: Elaborado pelo autor 54 Materiais e Métodos João Paulo Henrique 4.5.2 Sistema de aquecimento e umidificação de ar No sistema de aquecimento e umidificação de ar foi proposta uma modificação para possibilitar que o ar carregasse umidade na condição de saturação e temperatura ideal de operação do biorreator. De acordo com a configuração inicial, apresentada na Figura 6, o ar entrava no umidificador na temperatura ambiente e ao passar pela água e esferas de vidro, adquiria umidade e era aquecido por meio da camisa de aquecimento, porém não atingia a temperatura ideal de processo como, por exemplo, os 45°C. Outra dificuldade era a necessidade de reposição de água à medida que a mesma era carregada pelo ar. Essa reposição era feita por meio da válvula manual. Figura 6. Configuração inicial do sistema de umidificação do ar. Fonte: Elaborado pelo autor. Para o novo sistema de umidificação, foi proposta a instalação de uma resistência elétrica no interior do módulo de umidificação. Esta resistência foi conectada eletricamente ao módulo eletrônico que, por sua vez, recebeu sinal 55 Materiais e Métodos João Paulo Henrique de dois termopares, um posicionado na água ( agT ) e um posicionado na mangueira flexível na entrada de ar do biorreator ( arT ), como apresenta a Figura 7. Dessa forma, considerando um setpoint de temperatura de 45°C para a fermentação, o módulo eletrônico para o sistema de umidificação do ar acionou a resistência de forma on/off para que a temperatura do ar ( arT ) atingisse o setpoint. Figura 7. Diagrama esquemático do sistema proposto para umidificação de ar. Fonte: Elaborado pelo autor. O esquema eletrônico do módulo de umidificação de ar pode ser verificado no Apêndice A. Outra modificação executada foi a instalação de uma válvula solenoide (VS) automática (DANFOSS, Nordborg, Dinamarca), também interligada ao módulo eletrônico. Esta válvula é normalmente fechada (NF) e foi acionada 56 Materiais e Métodos João Paulo Henrique quando o sensor de nível acusasse nível baixo no interior módulo umidificador. A alimentação de água nesta válvula foi realizada por meio de uma mangueira interligada ao banho termostático. 4.5.3 Sistema automático de acionamento de válvulas e monitoramento Além das modificações estruturais dos equipamentos já existentes, foi proposta a instalação de um sistema de válvulas automáticas que permitisse a coleta e leitura das concentrações de O2 e CO2 em diversas posições do biorreator. Como existem diversas condições de concentrações de gases dentro de um biorreator, foi proposta a instalação de diversas válvulas e tubulações interligadas em um único analisador de gases, sendo este conectado a um sistema supervisório pertencente ao grupo d