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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

FACULDADE DE MEDICINA 

 

 

 

 

  

Amanda Manoel Della Coletta 

 

 

 

Ação da Vitamina D sobre mecanismos bactericidas de 

neutrófilos humanos desafiados com diferentes cepas 

de Staphylococcus aureus 

 

 

 

 

Tese apresentada à Faculdade de 
Medicina, Universidade Estadual Paulista 
“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de 
Botucatu, para obtenção do título de 
Doutora em Patologia. 
  

 

   

  

Orientadora: Profa. Dra. Luciane Alarcão Dias-Melicio 

Coorientadora: Profa. Dra. Thaís Graziela Donegá França 

 

Botucatu 

2019 



 

 
Amanda Manoel Della Coletta 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ação da Vitamina D sobre mecanismos bactericidas de 

neutrófilos humanos desafiados com diferentes cepas 

de Staphylococcus aureus 

 

 

 

Tese apresentada à Faculdade de 
Medicina, Universidade Estadual Paulista 
“Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de 
Botucatu, para obtenção do título de 
Doutora em Patologia. 
  
 
 
 

 

  Orientadora: Profa. Dra. Luciane Alarcão Dias-Melicio 

Coorientadora: Profa. Dra. Thaís Graziela Donegá França 

 

 

 

Botucatu 

2019



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Trabalho realizado no Laboratório de Imunopatologia e 

Agentes Infecciosos (LIAI) – Unidade de Pesquisa 

Experimental (Unipex) - Faculdade de Medicina, 

UNESP – Botucatu, com auxílio do Conselho Nacional 

de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Dedicatória 



Dedico este trabalho à minha família, as vezes mais próxima, as vezes mais distante, mas 

que a todo momento me deu suporte e segurança para seguir em busca de meus sonhos. 

Aos meus pais, Luiz Antônio e Silvana, por estarem ao meu lado nos melhores e piores 

momentos, me mostrando o quão importante é acreditar na minha capacidade, mesmo diante 

das adversidades. 

Às minhas irmãs, Isabela e Renata, por estarem comigo sempre e me ensinarem a 

dimensão do amor.  

Amo vocês. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Agradecimentos  



Agradeço a Deus, por cada obstáculo em meu caminho o qual eu tive forças para lutar. 

Por me dar oportunidades de aprender com erros e acertos e nunca desistir.  

 

À minha orientadora professora Luciane Alarcão Dias-Melicio, por todos os anos de 

convivência, sempre tão harmoniosa e respeitosa. Por ser uma companheira, com a qual 

partilhei momentos felizes e tristes, mas sempre tendo a certeza de que você estaria ao meu 

lado me incentivando e dando forças para continuar. Obrigada pela confiança, pelo respeito 

e, acima de tudo, pela amizade, que levarei para o resto da vida. 

 

À minha coorientadora, Thaís, por partilhar tantos ensinamentos e compreender 

minhas inseguranças e dificuldades, estando sempre disposta a ajudar. 

 

À toda minha família, em especial meus pais e irmãs. Obrigada pela educação e 

empenho em sempre me fazer seguir em frente, muitas vezes deixando seus sonhos de lado 

para que eu pudesse seguir os meus. Em especial à Renata, meu anjo na terra, obrigada por 

me ensinar a viver cada momento e a amar incondicionalmente.  Você me inspira a ser uma 

pessoa melhor. 

 

Aos meus amigos do coração e de longa data, Juliana (Balsa), Cristiane (Dofa) e Marina 

(Hemacea), André (Qualy) e Carla (Caldo), obrigada por existirem na minha vida. Vocês me 

dão segurança e paz, me dão a certeza que os terei como amigos irmãos para o resto da vida. 

Obrigada por proporcionarem tantos momentos de diversão e companheirismo, por serem 

meu porto seguro.  

 

Às minhas irmãs, Bianca (Peks) e Raíza. Obrigada por me mostrarem que a distância 

não importa quando o sentimento é tão intenso e verdadeiro como nossa amizade. Obrigada 

por serem minhas irmãs de alma, amigas e confidentes.  

 

À Luisa, minha amiga de sempre e pra sempre. Obrigada por nunca desistir da gente, 

por estar ao meu lado, mesmo às vezes distante, nesses longos, mas nem tão longos assim, 

20 anos de amizade. Você me ensina que devemos aproveitar cada segundo da vida, a rir nos 

momentos tristes e a chorar nos alegres. Simplesmente obrigada por ser você. 



À Marcela (Teteia), obrigada por ser a amiga que o handebol me deu para a vida. 

Obrigada por estar sempre disposta a ajudar, me escutar, puxar minha orelha e ser tão 

especial na minha vida, mesmo que longe fisicamente. Obrigada por todo o carinho e os 

momentos divertidos nas aventuras do mundo do handebol.   

  

À Tatiana Bachiega, por continuar a ser uma irmã mais velha, me escutando nas minhas 

crises e me incentivando a ser melhor a cada dia. Obrigada por acreditar em mim e por 

partilhar todo o seu conhecimento comigo, inclusive nos momentos científico-culinários.  

 

Aos colegas de laboratório Luciana, Taiane, Ana Teresa, Tatiana, Yohan, Kaio, Ana Laura 

e Larissa, por todo empenho em ajudar e confiança. Obrigada pela convivência em todos esses 

anos, sempre buscando a melhor oportunidade para aprender e partilhar experiências, além 

é claro dos momentos de descontração. E à vizinha, Nathália, que sempre esteve por perto, 

me ajudando e me incentivando a seguir em busca do meu caminho. À Lari, obrigada pela 

confiança em mim depositada, fazendo com que não fosse mais uma relação de trabalho e 

sim uma amizade. Em especial, à Tai, por me desafiar a ser melhor sempre, por partilhar 

conquistas e frustrações e me dar forças para continuar em busca de meus sonhos.  

 

Ao professor Valdecir Farias Ximenes, da Unesp de Bauru, por me receber em seu 

laboratório e me ajudar sempre tão solicitamente. 

 

À professora Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha, por permitir que eu 

frequentasse seu laboratório e me receber tão prontamente. Aos colegas do Laboratório de 

Bacteriologia, por me ensinarem com tanta prontidão, dedicação e atenção de sempre. 

 

À professora Márcia Guimarães da Silva e seus alunos, pela sempre boa vizinhança e 

oportunidade de sempre aprender a cada dia. 

 

Ao professor Ramon Kaneno e Graziela, pela oportunidade de realizar meu projeto e 

me atender, sempre tão prontamente. 

 



Aos funcionários do Centro de Microscopia do Instituto de Biociências de Botucatu e 

aos funcionários da Unidade de Pesquisa Experimental (Unipex), da Faculdade de Medicina de 

Botucatu, por me proporcionarem sempre as melhores oportunidades. 

 

Aos doadores de sangue, por serem sempre tão pacientes e permitirem que meu 

trabalho fosse realizado da melhor maneira possível e a todos, que de alguma maneira, 

contribuíram para a realização desse projeto. 

 

Ao Programa de Pós-Graduação em Patologia e à coordenadora Professora Doutora 

Márcia Guimarães da Silva, por todo aprendizado e ensinamento. 

 

À Vânia Soler, secretária do Programa de Pós-Graduação em Patologia, por me salvar 

em tantos momentos, me atender tão prontamente e sempre com tanta dedicação e carinho 

pelo que faz. 

 

Ao CNPq (140332/2015-4) pela bolsa concedida. 

 

 

 

 

 



 

 

 

 

 

 

 

 
...” Uma fé genuína na preciosidade da vida. Sinto que tudo em mim se reorganiza, silenciosamente, o 

tempo todo. Que isso tem mais a ver com o meu olhar, com a natureza das sementes que rego, do que eu 

possa perceber. Minha expectativa, tantas vezes ansiosa, de que as coisas sejam diferentes, dá lugar à 

certeza tranquila de que, naquele momento, tudo está onde pode estar. Em vez de sofrer pelas 

modificações que ainda não consigo, eu me sinto grata pelas mudanças que já realizei. E relaxo... 

 

...Plenitude não é extensão nem permanência: é quando a vida cabe no instante presente, sem aperto, e a 

gente desfruta o conforto de não sentir falta de nada.” 

Ana Jácomo 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Resumo 
 



Resumo 

 

Recentemente, a deficiência de vitamina D vem se tornando um problema de 

abrangência mundial em virtude de hábitos rotineiros da população, como o trabalho por 

períodos prolongados em ambientes fechados e diminuição da exposição solar. Trabalhos 

recentes demonstram que a vitamina D age não somente na homeostase do cálcio, mas 

também na regulação do sistema imune. Diante da multiplicidade de funções dessa vitamina, 

sua deficiência tem sido associada ao risco de desenvolvimento de uma série de doenças, 

entre elas doenças infecciosas como as causadas por S. aureus. As infecções por essa bactéria 

têm trazido expressiva preocupação para a população humana em decorrência do aumento 

da prevalência de cepas resistentes aos fármacos antibacterianos, dificultando, dessa 

maneira, o tratamento e contribuindo para a busca de métodos alternativos para combater 

esse tipo de infecção. Além disso, o S. aureus conta com um potente arsenal de fatores de 

virulência que contribuem para a evasão da resposta imune do hospedeiro. Nesse contexto, 

torna-se importante avaliar se a vitamina D pode modular os efeitos bactericidas de 

neutrófilos humanos através de mecanismos intra e extracelulares, favorecendo, portanto, o 

combate a infecções, especialmente aquelas causadas por microrganismos resistentes aos 

principais tratamentos. Dessa maneira, nós demonstramos que neutrófilos tratados com 

vitamina D e desafiados com duas cepas de S. aureus tiveram um aumento nas taxas de 

fagocitose e atividade bactericida dependentes da cepa estudada, contribuindo para as 

propriedades antimicrobianas dos neutrófilos. Além disso, identificamos que indivíduos com 

níveis séricos de vitamina D deficientes/insuficientes estavam correlacionados com menor 

liberação de NETs e taxa de fagocitose; enquanto indivíduos com níveis séricos de vitamina D 

suficientes foram correlacionados com maior liberação de NETs, taxa de fagocitose 

intermediária e atividade bactericida. Portanto, a vitamina D pode modular a resposta imune 

inata contra S. aureus principalmente por aumento de taxas fagocíticas e atividade 

bactericida.  

 

Palavras-chave: Atividade Bactericida, Fagocitose, Vitamina D, Staphylococcus aureus, Redes 

Extracelulares de Neutrófilos (NETs). 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Abstract 



Abstract 

In the last years, vitamin D deficiency has become a worldwide problem due to routine 

population habits, such as prolonged work indoors and increased use of sunscreen/decreased 

sun exposure in attempt to avoid high rates of skin cancer. Recent studies demonstrated that 

vitamin D acts not only on calcium homeostasis, but also on the regulation and function of the 

immune system. Facing the countless functions of vitamin D, its deficiency has been 

associated with the risk of development of many diseases, including infectious diseases such 

as those caused by S. aureus. Infections caused by these bacteria have brought significant 

concern to the human population due to the increased prevalence of strains resistant to 

antibiotics, thus making it difficult to treat and contributing to the search for alternative 

methods to combat this type of infection. In addition, S. aureus have a variety of virulence 

factors, which confer the ability to evade host immune responses. In this context, it is 

important to evaluate whether vitamin D can modulate the bactericidal effects of human 

neutrophils through intra- and extracellular mechanisms, such as phagocytosis, bacterial 

killing and release of Neutrophil Extracellular Traps (NETs), thus contributing to the response 

against infections, especially those caused by microorganisms resistant to the main 

treatments. Thus, we demonstrated that neutrophils treated with Vitamin D and challenged 

with two strains of S. aureus had an increase in phagocytic rates and bactericidal activity in a 

dependence of the strain, contributing to neutrophil antimicrobial properties. Besides, we 

identified that individuals with deficient/insufficient vitamin D serum levels were correlated 

with lower NETs release and phagocytosis rate; while individuals with sufficient vitamin D 

serum levels were correlated with higher NETs release, intermediate phagocytosis rate and 

bactericidal activity. Then, Vitamin D could modulate the innate immune response against S. 

aureus mainly by phagocytic rates and bactericidal activity. Further studies are needed to 

better understand the complex capacity of Vitamin D on modulation of the innate immune 

response. 

 

Key-words: Bactericidal Activity, Phagocytosis, Vitamin D, Staphylococcus aureus, Neutrophil 

Extracellular Traps (NETs). 

 



 
 

Sumário 
Capítulo I ........................................................................................................................................... 1 

1. Revisão Bibliográfica ............................................................................................................... 2 

1.1. Vitamina D e sua potencial ação imunomoduladora em neutrófilos ................................ 2 

1.2. Deficiência de vitamina D e sua correlação com diferentes doenças ............................... 8 

1.3. S. aureus e seus mecanismos de escape .........................................................................13 

1.4. Resposta Imune Inata e seus mecanismos efetores contra S. aureus ..............................15 

1.5. Neutrófilos e Rede Extracelulares de Neutrófilos (NETs) ................................................21 

2. Referências ...........................................................................................................................28 

Capítulo II .........................................................................................................................................35 

Manuscript .......................................................................................................................................36 

ABSTRACT .....................................................................................................................................37 

INTRODUCTION .............................................................................................................................38 

EXPERIMENTAL PROCEDURES .......................................................................................................41 

− Casuistics .......................................................................................................................41 

− Neutrophil isolation .......................................................................................................41 

− Vitamin D treatment ......................................................................................................42 

− Bacterial strains and culture conditions..........................................................................42 

− Phagocytosis of S. aureus ...............................................................................................43 

− Killing assay ...................................................................................................................44 

− Hydrogen Peroxide Production (H2O2) ............................................................................44 

− Nitric Oxide Production (NO)..........................................................................................45 

− Immunofluorescence for Neutrophil Extracellular Traps (NETs) visualization ..................45 

− Neutrophil Extracellular Traps (NETs) by scanning electron microscopy .........................46 

− Neutrophil Extracellular Traps (NETs) quantification ......................................................46 

− Statistical analysis ..........................................................................................................47 

RESULTS ........................................................................................................................................47 

− Phagocytosis rate of S. aureus strains ............................................................................47 

− Vitamin D action on neutrophil bactericidal activity against S. aureus ............................48 

− Hydrogen peroxide (H2O2) Production ............................................................................49 

− Nitric Oxide (NO) Production..........................................................................................49 

− Visualization of NETs components by Immunofluorescence ...........................................50 

− NETs identification by scanning electron microscopy .....................................................50 

− NETs quantification ........................................................................................................51 

− Serum 25(OH)D3 levels and analysis of perceptual map from multiple correspondence .51 



 
 

DISCUSSION ..................................................................................................................................52 

REFERENCES ..................................................................................................................................59 

FIGURES ........................................................................................................................................63 

Conclusão .........................................................................................................................................74 

Anexos ..............................................................................................................................................76 

 

 

 



 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Capítulo I 

Revisão Bibliográfica



2 
 

1. Revisão Bibliográfica 

 

1.1. Vitamina D e sua potencial ação imunomoduladora em neutrófilos 

A vitamina D é um hormônio secosteróide produzido fotoquimicamente na pele a partir 

do componente 7-dehidrocolesterol (1,2). Sendo a forma de obtenção mais significativa, cerca 

de 90% da vitamina D obtida provém de exposição solar cutânea espontânea, a qual é 

influenciada pela estação climática, altitude e latitude (3,4). Ainda que em menor quantidade, 

pode também ser obtida pela dieta, oriunda de alimentos ricos em vitamina D como óleo de 

fígado de bacalhau, peixes como salmão e atum, cogumelos irradiados, entre outros (5,6). A 

obtenção de vitamina D via dieta depende da política de suplementação de cada país, sendo 

que alguns países como Estados Unidos e Canadá beneficiam-se dessa suplementação para 

reduzir as taxas de deficiência de vitamina D na população (4). 

Após a exposição solar (espectro de raios UVB – 290-320nm), o 7-dehidrocolesterol (ou 

provitamina D), presente na membrana plasmática de queratinócitos na epiderme, sofre 

fotoconversão para originar a pré-vitamina D3 (7). Essa, por sua vez, sofre um rearranjo 

estrutural causado por temperatura e se transforma em vitamina D3 (Colecalciferol), a qual é 

biologicamente inativa. Mediante ligação com proteína transportadora de vitamina D (DBP), 

a vitamina D3 é transportada sistemicamente até o fígado, onde é hidroxilada no metabólito 

25-hidroxivitamina D3 [25(OH)D3] pela ação de enzimas do citocromo-P450 (CYPs) como 

CYP2R1(25-hidroxilase), CYP27A1 e CYP2D25. Embora inativo, o metabólito [25(OH)D3] é 

considerado a principal forma circulante de vitamina D, tem uma meia-vida de 

aproximadamente duas semanas e reflete ingestão e produção cutânea recentes, sendo, 

portanto, utilizado para determinar os níveis séricos de vitamina D. Por fim, o [25(OH)D3] é 



3 
 

novamente transportado sistemicamente ligado ao DBP para o rim, onde, através da ação da 

CYP27B1 mitocondrial (1-α hidroxilase), é hidroxilado em 1,25 dihidroxivitamina D3 

[1,25(OH)2D3] ou calcitriol, o metabólito ativo da vitamina D (1,2,4,5,8).  

Para exercer sua função biológica, o metabólito [1,25(OH)2D3] deve ser transportado a 

órgãos alvo distais e se ligar ao receptor de vitamina D (VDR), presente em uma variedade de 

células, podendo ter efeito na proliferação, diferenciação e controle do ciclo celular, apoptose 

e produção de catelicidina, renina e insulina (9). O complexo de ligação do metabólito ativo 

da vitamina D no receptor VDR e seu co-receptor retinóico X (RXR) pode regular a transcrição 

de cerca de 3000 genes no genoma humano (10). Além de tecidos envolvidos no metabolismo 

do cálcio, o receptor VDR já teve sua presença descrita em outros tipos celulares como 

queratinócitos, fibroblastos, células do sistema imune entre outros, demonstrando que a 

vitamina D pode exercer uma variedade de funções que vão desde a homeostase óssea até 

efeito neuroprotetor (11,12). A vitamina D age via ligação a seu receptor VDR, o qual pode 

atuar como um fator de transcrição agindo pela ligação a sequências de nucleotídeos 

específicos no DNA conhecidos como elementos responsivos à vitamina D (VDREs). Pode 

também modular a transcrição gênica, afetando a atividade de fatores de transcrição, como 

fator nuclear de células T ativadas (NF-AT) e fator nuclear kappa B (NF-κB) (13). 

A principal e mais bem descrita função da vitamina D é na regulação da homeostase do 

cálcio e do fósforo. Além da presença do receptor VDR em todos os segmentos do intestino, 

o metabólito ativo da vitamina D [1,25(OH)2D3] e o paratormônio (PTH) são os responsáveis 

pela reabsorção intestinal do cálcio, regulando todos as etapas do processo de transporte 

celular do cálcio (14,15). Preservando níveis de cálcio, a vitamina D permite que os 

osteoblastos tenham íons suficientes para mineralizar a matriz de colágeno e dessa maneira, 



4 
 

prevenir as consequências de deficiência de vitamina D como o raquitismo na infância e 

osteomalácia em adultos, além de osteoporose e fraturas em idosos (8,16). Ao detectar-se 

níveis plasmáticos baixos de cálcio, a vitamina D é responsável por estimular a liberação de 

cálcio e fósforo dos ossos, mas também inibir a deposição mineral óssea. Níveis plasmáticos 

de vitamina D, cálcio e fósforo adequados, levam a conversão de [25(OH)D3] em [1,25(OH)2D3] 

por osteoblastos e osteócitos para aumentar os níveis de cálcio e fósforo no tecido ósseo e 

assim melhorar a resistência óssea (16). 

Nos últimos anos, os estudos têm buscado identificar outras ações da vitamina D no 

organismo, expandindo as avaliações das ações da vitamina no funcionamento e regulação de 

outros sistemas. Os principais indícios dessas múltiplas funções, conhecidas como funções 

não-clássicas, ocorrem pela presença do receptor VDR e da enzima 1-α hidroxilase em diversos 

tipos celulares. Esses, por sua vez, não estão relacionados com o metabolismo ósseo e 

homeostase do cálcio, como as células do sistema imune, do pâncreas, intestino entre outros, 

expandindo, dessa maneira, a produção e ação da vitamina para outros locais além do rim, o 

principal responsável pela conversão do metabólito ativo da vitamina D (17–19). Entre as 

principais funções não-clássicas estão a regulação da proliferação e diferenciação celular, 

controle do ciclo celular, apoptose e regulação do sistema imune (9,20). 

Em relação ao controle do ciclo celular, a vitamina D é responsável por parar o ciclo na 

transição entre G0 e G1, induzindo a expressão de inibidores de quinase dependentes de 

ciclina como o p27 e exercendo um efeito antiproliferativo em células HL60 e também o p21, 

responsável por desacelerar o ciclo celular de linhagem celular de carcinoma prostático (Alva-

31) (20–22). Já em relação a diferenciação celular, Abe et al. (1981) (23) identificaram que o 

metabólito ativo da vitamina D é capaz de induzir a diferenciação de células leucêmicas 



5 
 

mielóides em macrófagos, provocando alterações morfológicas, adesão celular e indução de 

atividade fagocítica, demonstrando a capacidade da vitamina D em modular a diferenciação 

de células da medula óssea.  Ma et al. 2013 (24) demonstraram a ação da vitamina D na 

apoptose através da ação do inecalcitol, um análogo da forma ativa da vitamina D, o qual 

suprimiu, in vitro, a proliferação de células de um modelo murino de carcinoma de células 

escamosas, além da ativação de caspases 8, 10 e 3 e redução dos inibidores de apoptose 

proteína inibidora de apoptose 1 (c-IAP1) e proteína inibidora de apoptose ligada ao 

cromossomo X (XIAP).   

A vitamina D também já foi descrita como uma importante reguladora do sistema 

imune, tanto inato quanto adaptativo, sendo sua ação primeiramente evidenciada pela 

presença do receptor VDR em quase todos as células, entre elas neutrófilos, macrófagos, 

células dendríticas e linfócitos ativados T CD4+ e T CD8+ (25,26). Além disso, a expressão do 

receptor VDR é diminuída com a diferenciação de monócitos em macrófagos ou células 

dendríticas, tornando-as menos sensíveis à vitamina D (27,28). Em contraste, a expressão do 

receptor é aumentada após a ativação de linfócitos T, sendo que linfócitos T naive possuem 

baixos níveis de VDR (29).   

Em relação ao sistema imune inato, vários artigos demonstram que a vitamina D pode 

ter ação em processo cruciais como fagocitose, expressão de produtos antimicrobianos, 

atividade quimiotática, entre outros. Liu et al. (2006) (30) demonstraram que a ativação de 

receptores Toll Like 2/1 (TLRs 2/1) em monócitos e macrófagos humanos com lipopeptídeo 

derivado de Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) (TLR2/1L) aumenta a expressão do 

receptor de vitamina D (VDR) e da 1-α hidroxilase, induzindo a produção de catelicidina, um 

peptídeo antimicrobiano, e consequentemente aumentando a morte de M. tuberculosis. 



6 
 

Outro estudo identificou a indução da expressão de catelicidina por queratinócitos e 

monócitos após tratamento com a forma ativa da vitamina D, aumentando a atividade 

microbicida contra Staphylococcus aureus (S. aureus) (31). Já Gombart et al. 2005 (32) 

demonstraram que o tratamento de queratinócitos imortalizados, células de câncer de cólon, 

macrófagos derivados da medula óssea e células da medula óssea de indivíduos saudáveis e 

pacientes com leucemia mieloide aguda, com a forma ativa da vitamina D e análogos 

induziram um aumento na expressão gênica do peptídeo antimicrobiano de catelicidina 

humana (CAMP). 

 Hirsch et al. (2011) (33) identificaram que o tratamento de neutrófilos de indivíduos 

adultos e neonatais com lipopolissacarídeo (LPS) e [1,25(OH)2D3] aumentaram a expressão de 

VDR em células dos indivíduos adultos, mas não teve efeito significativo nos neutrófilos dos 

neonatais. O tratamento também aumentou 5 Lipoxigenase (5-LOX), diminuiu a expressão 

gênica da Ciclooxigenase-2 (COX-2) e diminuiu significativamente a produção de mediadores 

tais como proteína inflamatória de macrófagos-1β (MIP-1β), fator de crescimento do 

endotélio vascular (VEGF) e interleucina-8 (IL-8). Além disso, a vitamina D não afetou a 

produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) por neutrófilos de adultos e neonatais. A vitamina 

D também diminuiu a produção de interleucina-12p40 (IL-12p40) e interferon-gama (IFN-γ) 

pelas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doadores saudáveis e pacientes 

com tuberculose após desafio com antígeno de filtrado de cultura (CFA) de M. tuberculosis 

(34). Já Rockett et al. (1998) (35) demonstraram que uma linhagem celular HL-60, com 

características macrofágicas, foi capaz de produzir óxido nítrico (NO) em resposta ao estímulo 

com a forma ativa da vitamina D, induzindo supressão do crescimento de M. tuberculosis, por 

mecanismo dependente de NO. Por fim, Wang et al. (2004) (36) identificaram que a forma 

ativa da vitamina D pode agir como um regulador de atividade antimicrobianas pela indução 



7 
 

da expressão gênica e atividade de genes codificadores de antimicrobianos como o peptídeo 

antimicrobiano catelicidina (CAMP) e defensina-β2 (defβ2) através dos elementos responsivos 

a vitamina D (VDREs). Assim, esses estudos demonstram que a vitamina D tem um importante 

papel na regulação do sistema imune inato. 

Quando é relacionada ao sistema imune adaptativo, a vitamina D exerce função via 

expressão de seu receptor (VDR) em linfócitos T e B, além de células apresentadoras de 

antígeno, as quais funcionam como ponte entre o sistema imune inato e adaptativo (26). Em 

um estudo realizado em 2017 (37), foi demonstrado que a incubação com vitamina D induziu 

um perfil de células dendríticas com capacidade tolerogênica via diminuição da expressão de 

MHC de classe II e CD86. Essas células foram transferidas para camundongos com encefalite 

autoimune experimental (EAE), exibindo uma melhora no quadro clínico, acompanhado da 

diminuição do infiltrado inflamatório na medula espinhal dos camundongos. Além disso, as 

células foram capazes de inibir o recrutamento de células Th1 e Th17 para a medula espinhal 

e aumentar a proporção de células T reguladoras (Treg), CD4+, IL-10+ T e B reguladoras (Breg) 

nos órgãos imunes periféricos, atenuando, dessa maneira os sintomas da EAE.  Outro estudo 

demonstrou que a incubação de monócitos com [1,25(OH)2D3] inibiu a diferenciação e 

maturação das células dendríticas em importantes células apresentadoras de antígeno, 

apresentando expressão elevada de receptor de manose (MR), CD32, moléculas envolvidas 

na captura de antígenos e no aumento da capacidade endocítica, além de CD14 e MHC de 

classe I, enquanto que MHC de classe II, CD40 e CD86 estavam diminuídas (38).  

Além disso, Hewison et al. (2003) (28) identificaram que células dendríticas 

apresentavam um aumento na expressão de mRNA de 1-α hidroxilase, com consequente 

capacidade de sintetizar [1,25(OH)2D3]. Embora haja o aumento na síntese de [1,25(OH)2D3], 



8 
 

com a diferenciação das células dendríticas a partir de monócitos, ocorre uma diminuição na 

expressão do receptor VDR, demonstrando uma possível função autorreguladora limitando 

uma reação imune não desejada. Em relação aos linfócitos T, o tratamento com vitamina D 

induziu uma polarização para um perfil anti-inflamatório (Th2), com aumento na frequência 

de células produtoras de IL-4 (Th2) e diminuição nas células produtoras de IFN-γ (Th1), levando 

ao aumento da expressão do fator de transcrição GATA-3 e das citocinas IL-4, IL-5, e IL-10 (13).  

Já Jeffery et al. (2009) (39) demonstraram que [1,25(OH)2D3] pode agir diretamente 

sobre as células T CD4+, diminuindo a produção de citocinas como IFN-γ, IL-17 e IL-21. Além 

disso, foi identificado que a presença da forma ativa da vitamina D acrescida de IL-2 levaram 

a uma elevada expressão de FOXP3 e antígeno-4 associado ao linfócito T citotóxico (CTLA-4), 

adquirindo características de células Treg, com potente ação imunossupressora. Em relação 

às células Th17, Joshi et al. (2011) (40) observaram que o tratamento com vitamina D induziu 

uma diminuição nos níveis de mRNA de IL-17 e IL-17 e IL-22 e aumento de IL-10, através do 

bloqueio do fator de transcrição fator nuclear para células T ativadas (NFAT) e indução de 

FoxP3, diminuindo a paralisia e progressão da EAE. Por fim, foi identificado que [1,25(OH)2D3] 

teve efeito inibitório na síntese de DNA e produção de imunoglobulinas IgG e IgM células 

mononucleares ativadas in vitro (41). 

 

1.2. Deficiência de vitamina D e sua correlação com diferentes doenças 

Diante da variedade de funções da vitamina D, sua deficiência tem sido associada ao 

risco de desenvolvimento de uma série de doenças como as doenças ósseas, diabetes mellitus, 

determinados tipos de câncer, doenças autoimunes e infecciosas.  



9 
 

Nos últimos anos, a deficiência de vitamina D vem sendo considerada um problema de 

escala mundial em decorrência da mudança de hábitos da população, como a permanência 

por longos períodos em locais fechados e a diminuição da exposição solar, além do uso de 

protetor solar para conter as elevadas taxas de câncer de pele (42). Apesar disso, já foi  

demonstrado que a utilização de protetor solar não interfere nos níveis de produção da 

vitamina D (43).  

Pesquisas indicam que a deficiência de vitamina D tem uma prevalência elevada, 

podendo afetar aproximadamente 90% da população, dependendo da área global em que a 

avaliação foi realizada (6,44). Em um estudo conduzido no Brasil com 603 voluntários 

saudáveis, foi identificada uma prevalência de 77,4% de indivíduos insuficientes de vitamina 

D (45).  Apesar de existir um consenso sobre o metabólito 25(OH)D3 ser o que melhor se 

adequa para se definirem os níveis séricos de vitamina D, os valores de referência para 

classificação do status dos indivíduos ainda é controverso. Os valores para a classificação dos 

pacientes em deficientes, insuficientes ou suficientes diferem nas principais sociedades.  

A Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia (SBEM) descreve que níveis 

séricos maiores que 30ng/mL são considerados adequados para o benefício ósseo, porém 

deve-se levar em consideração dados como idade, obesidade, osteoporose, fraturas, entre 

outros (6). O Vitamin D Council, organização sem fins lucrativos dos Estados Unidos declara 

que valores menores que 30ng/mL são considerados deficientes, entre 31 e 39ng/mL 

insuficientes e entre 40 e 80ng/mL valores suficientes de vitamina D (46). Já Pludowski et al. 

2013 (47) descreveram as recomendações da Europa Central, onde níveis séricos menores que 

20ng/mL são considerados deficientes, de 20 a 30ng/mL insuficientes e de 30 a 50ng/mL níveis 

adequados de vitamina D. 



10 
 

Uma das principais doenças ósseas relacionadas à deficiência de vitamina D é a 

osteomalácia. Essa patologia é caracterizada pelo risco aumentado de fraturas por toda a vida, 

além de hipocalcemia e hipofostatemia, baixos níveis de 25(OH)D3 e elevados níveis de PTH. 

Como a vitamina D é responsável pela reabsorção de cálcio e fósforo, pacientes com essa 

doença possuem dificuldades na mineralização óssea, ocasionando elevado risco de fraturas 

(48).  

Em relação ao diabetes mellitus, o receptor VDR já foi identificado em células 

pancreáticas e em tecidos influenciados por insulina (49). Além disso, Alkhatatbeh et al. (2018) 

(50) identificaram que pacientes diabéticos com nível glicêmico controlado possuíam maiores 

níveis séricos de vitamina D em comparação com aqueles indivíduos com níveis glicêmicos 

descontrolados. Ainda, pacientes com níveis suficientes de vitamina D exibiram baixos níveis 

de hemoglobina A1c (HbA1c), uma medida de controle glicêmico importante para avaliar 

complicações vasculares, demonstrando que uma possível suplementação de vitamina D pode 

melhorar as medidas de controle glicêmico.  

Quando relacionada ao câncer, um estudo retrospectivo realizado em 2016 demonstrou 

que pacientes com deficiência de vitamina D (<20ng/mL) tinham maiores riscos de terem 

estágios mais avançados de melanoma e morrer durante o follow-up do que aqueles que 

tinham níveis séricos maiores que 20ng/mL. Os autores ainda identificaram que aqueles 

pacientes com melanoma metastático e baixos níveis de vitamina D que não foram capazes 

de elevar seus níveis séricos tiveram piores prognósticos quando comparados com aqueles 

que tiveram elevação nos níveis de vitamina D (51). A ação da vitamina D durante o câncer 

pode estar relacionada com suas funções durante a regulação do ciclo celular, pelo aumento 



11 
 

da expressão de inibidores de quinase dependentes de ciclina p27 e p21, da indução de 

apoptose, de seus efeitos anti-inflamatórios, entre outros (52).  

Em relação a doenças autoimunes, Handono et al. (2013) (53) identificaram menores 

níveis de vitamina D em pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico em comparação com 

controles saudáveis, com taxa de 71% de hipovitaminose entre os pacientes com Lúpus.  

Houve também uma correlação positiva entre níveis de vitamina D e a redução da capacidade 

migratória das células Treg. Estudos relatam que níveis séricos de vitamina D são mais baixos 

em pacientes, embora a suplementação oral de vitamina D não seja recomendada para esses 

pacientes, uma vez que foi demonstrado que não impacte no desenvolvimento da psoríase  

(54,55).   

Dentre as doenças infecciosas, destacam-se HIV, hepatite B, mononucleose, aspergilose, 

tuberculose, infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), além daquelas 

causadas pelo S. aureus, entre outras. Em relação ao HIV, estudos demonstraram que a 

deficiência de vitamina D pode contribuir para a progressão do HIV por meio de sua ação 

moduladora no sistema imune, por modular negativamente o sistema imune adaptativo (56).  

Em um estudo de 2016, foi demonstrado que 100µg/mL foram capazes de induzir um 

efeito fungicida direto contra Candida albicans (C. albicans), possivelmente devido a 

lipossolubilidade da vitamina D, levando a desintegração da membrana (57). Quando 

relacionadas a infecções bacterianas, Nouari et al. (2016) (58) identificaram que o tratamento 

de macrófagos com [1,25(OH)2D3] e infectados com P. aeruginosa induziu um aumento na 

produção de óxido nítrico (NO) comparado com macrófagos não tratados. Entretanto, os 

autores não identificaram diferença estatisticamente significativa nos níveis de peróxido de 

hidrogênio (H2O2) produzidos por macrófagos tratados com a forma ativa da vitamina D e 



12 
 

desafiados com P. aeruginosa.  Além disso, foi demonstrado que macrófagos tratados com 

vitamina D e não desafiados tiveram aumento nos níveis de IL-10 e diminuição em IL-1β, 

enquanto que os infectados e tratados, apresentaram diminuição nos níveis de IL-10 e 

aumento nos níveis de IL-1β. Tanto fagocitose quanto atividade bactericida tiveram suas taxas 

aumentadas após o tratamento com vitamina D, demonstrando um potencial papel da 

vitamina D na prevenção contra infecções por P. aeruginosa. Já em relação a infecções por M. 

tuberculosis, Zeng et al. (2015) (59) demonstraram, em um estudo de meta-análise, que níveis 

séricos menores que 25ng/mL estavam correlacionados com elevado risco de 

desenvolvimento de tuberculose ativa.   

Pesquisas que relacionaram a deficiência de vitamina D com infecções por S. aureus 

demonstraram que pacientes infectados com S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) tinham 

níveis mais baixos de vitamina D em comparação àqueles com infecção não MRSA, embora os 

autores não tenham assumido se deficiência é um resultado da infecção ou pode contribuir 

para o risco de infecção por MRSA (60). Além disso, Wang et al. (2015) (61) descreveram que 

crianças com deficiência ou insuficiência de vitamina D apresentavam alto risco de infecção 

recorrente de pele e tecidos moles por S. aureus.  

Em relação a suplementação com vitamina D, Slow et al. (2014) (62) demonstraram que 

a administração de vitamina D por 18 meses aumentou os níveis de [25-(OH)D] nos pacientes 

em tratamento em comparação ao grupo placebo, mas não reduziu o porte nasal de S. aureus 

naqueles pacientes classificados como infecção persistente. Corroborando esses dados, a 

suplementação diária com vitamina D por 12 meses não reduziu a infecção por MRSA em 

pacientes portadores persistentes em relação ao grupo placebo, conforme descrito por 

Björkhem-Bergman et al. (2018) (63). Em contraste, Udompataikul et al. (2015) (64) 



13 
 

descreveram que uma suplementação oral com Vitamina D reduziu a colonização da pele por 

S. aureus em pacientes com dermatite atópica, levando a uma melhora nos desfechos clínicos. 

Outro estudo realizado por Björkhem-Bergman et al. (2018) (65) demonstrou que os níveis do 

carreador de vitamina D, DBP, não foram alterados nos indivíduos portadores de infecção 

persistente por MRSA ao longo de seis meses, tanto nos indivíduos suplementados com 

vitamina D quanto naqueles que receberam placebo.  

 

1.3. S. aureus e seus mecanismos de escape 

O S. aureus é uma bactéria Gram-positiva geralmente encontrada na pele e narina de 

pessoas saudáveis, sendo considerada tanto um comensal quanto um patógeno humano. Em 

um estudo realizado em 2018, foi demonstrado que a prevalência de colonização por cepas 

resistentes a meticilina (MRSA) em uma comunidade na cidade de São Paulo é de apenas 2,3% 

(66), embora artigos demonstrem que a colonização assintomática e persistente da narina é 

de aproximadamente 30% (67).  

É considerada um patógeno oportunista associado a infecções hospitalares e à diversas 

patologias como endocardite, bacteremia, infecções osteoarticulares, de pele e tecidos moles, 

dentre outras. As principais taxas de bacteremia ocorrem nos estágios iniciais da vida, com 

uma queda da taxa de infecção na fase adulta e um aumento gradual com o avanço da idade 

(68). As infecções por S. aureus têm se tornado relevantes para a população humana em 

virtude do aumento da prevalência de cepas resistentes aos fármacos antibacterianos, 

principalmente devido a inapropriada prática de automedicação (69), dificultando, dessa 

maneira, o tratamento e contribuindo para a busca de métodos alternativos para combater 



14 
 

este agente patogênico. Além disso, essa bactéria conta com um potente conjunto de fatores 

de virulência que contribuem para o escape da resposta imune do hospedeiro. 

Entre os fatores de virulência estão as toxinas (enterotoxinas, α e β toxinas), fatores 

associados à adesão às células do hospedeiro (proteínas de ligação à fibronectina, proteínas 

de aderência extracelular), superantígenos, além de proteínas e enzimas (coagulases, 

hidrolases, proteases), os quais podem agir através de ligação aos fatores de coagulação, 

colágeno, P-selectina, conferindo à bactéria a capacidade de interferir na resposta do 

hospedeiro. Dentre as possibilidades de escape da resposta imune estão a resistência ao 

estresse oxidativo, alteração do processo de quimiotaxia, lise de neutrófilos, bloqueio do seu 

processo de rolamento, inativação do sistema complemento, degradação de imunoglobulinas, 

resistência à catelicidina, alteração na taxa de fagocitose, inativação de espécies reativas de 

oxigênio, entre outros (70). A resistência à catelicidina ocorre por meio de alguns fatores de 

virulência como a aureolisina, a qual age clivando e inativando o peptídeo ativo LL-37 (71). 

Essa resistência é especialmente importante, uma vez que a catelicidina é um dos principais 

peptídeos antimicrobianos induzidos pela forma ativa da vitamina D.  

Outro fator de virulência é a proteína A, uma proteína envolvida na evasão da fagocitose 

por sua ligação à porção Fc de anticorpos, impedindo a opsonização, sendo também associada 

à liberação de Redes Extracelulares de Neutrófilos (NETs). Em um estudo realizado em 2018, 

foi sugerido que além impedir a fagocitose, a proteína A poderia estimular a formação de NETs 

a fim de levar os neutrófilos envolvidos na resposta à morte, induzindo o processo de NETose, 

do qual as bactérias poderiam escapar devido à produção de nucleases (72). 

Além dos já descritos fatores de virulência, o S. aureus tem a capacidade de produzir 

biofilme, um importante fator associado à severidade das doenças causadas por essa bactéria. 



15 
 

As infecções associadas ao biofilme geralmente são crônicas e persistentes devido a 

habilidade de se aderir e persistir em tecidos do hospedeiro ou em implantes médicos, 

resistindo aos principais tipos de tratamento e à resposta imune (73). O biofilme é descrito 

como uma comunidade multicelular séssil agregada por uma matriz extracelular composta 

por carboidrato, DNA extracelular e proteínas, as quais se ligam em fatores do hospedeiro 

como fibronectina e colágeno para permitir a adesão (73,74). Esse mecanismo de ação da 

bactéria pode conferir sua evasão da resposta imune possivelmente através da dificuldade de 

penetração de leucócitos no biofilme e diminuição da capacidade de fagocitose, um processo 

denominado “fagocitose frustrada”.  

Em um estudo realizado em 2002, Leid et al. (75) demonstraram que, sob condições 

semelhantes as fisiológicas, leucócitos foram capazes de se aderirem e penetrarem no 

biofilme formado por S. aureus, embora essas células não tenham sido capazes de fagocitar e 

matar as bactérias agregadas ao biofilme, apenas aquelas que estavam isoladas. 

 

1.4. Resposta Imune Inata e seus mecanismos efetores contra S. aureus 

Apesar dos inúmeros fatores de virulência, o sistema imune inato desempenha papel 

crucial no combate à infecção por S. aureus. A imunidade inata é considerada a primeira linha 

de defesa do organismo contra os mais diversos tipos de microrganismos. É composta por 

inúmeras células, dentre elas, as que possuem função de defesa para impedirem infecções, 

agindo via reconhecimento de Padrões Moleculares Associados a Patógenos (PAMPs) por 

Receptores de Reconhecimento de Padrões (PRRs), como por exemplo receptores Toll-Like 

(TLRs), produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio, citocinas e peptídeos 

antimicrobianos e pela resposta das células fagocíticas como macrófagos e neutrófilos (76).  



16 
 

Os PRRs estão presentes na membrana celular, nuclear, e no citoplasma das células, 

sendo expressos por diversos tipos celulares, entre eles neutrófilos, macrófagos, células 

dendríticas e epiteliais. Entre os principais PRRs estão os TLRs, os quais estão presentes tanto 

na superfície quanto em membranas intracelulares, sendo capazes de reconhecerem 

diferentes microrganismos em diferentes localizações (77,78). Uma vez reconhecidos os 

PAMPs, ocorre a ativação de vias de sinalização, levando a expressão de genes responsáveis 

por produtos envolvidos na resposta inflamatória, incluindo a produção de citocinas como 

TNF, IL-1 e IFN, quimiocinas e moléculas de adesão endotelial por neutrófilos e macrófagos. 

Além dos processos de quimiotaxia e adesão neutrofílica ao endotélio para posterior migração 

para o tecido alvo, ocorre liberação mais mediadores pró-inflamatórios no intuito de dar 

continuidade ao processo de resposta imune. Para evitar respostas inflamatórias exacerbadas, 

ocorre liberação de citocinas anti-inflamatórias como IL-10, promovendo assim um equilíbrio 

na resposta imune do hospedeiro e evitando potenciais danos teciduais causados por 

respostas descontroladas (79). 

  Outros PRRs incluem os receptores semelhantes a NOD (NLR), os quais agem via 

formação de inflamassomos; receptores de carboidratos, como o receptor de manose e os 

receptores de dectinas; e os receptores scavengers (80). Os principais peptídeos 

antimicrobianos são defensinas, catelicidinas, calprotectina, mieloperoxidase, entre outros, 

os quais podem ter ação tóxica direta no microrganismo ou através da ativação de outras 

células envolvidas na resposta imune (78). As principais citocinas envolvidas na resposta 

inflamatória são TNF, IL-1, IL-6, IFN, entre outras, levando a ativação das células associadas à 

resposta do hospedeiro frente ao agente agressor e induzindo células endoteliais a 

expressarem moléculas de adesão, tais como P-selectina e E-selectina em sua superfície e a 

produzirem quimiocinas (77,78). Os neutrófilos presentes na corrente sanguínea ligam-se a 



17 
 

essas moléculas e respondem às quimiocinas, recrutando mais células para o sítio de infecção. 

Devido à força de cisalhamento do fluxo sanguíneo, ocorre o processo de rolamento pela 

parede do vaso sanguíneo próximo ao sítio da infecção, seguida de sua adesão estável ao 

endotélio mediada por ação de integrinas e migração para o tecido alvo por entre as junções 

entre as células endoteliais, em um processo conhecido como diapedese, para então realizar 

sua função (81).  

Em relação ao S. aureus, o mais importante PRR envolvido na ativação da resposta 

imune é o TLR-2, podendo fazer dímeros com TLR-1 ou TLR-6. Entretanto, outros receptores 

também podem ser associados ao reconhecimento de S. aureus, como os receptores NOD, 

NOD2 e NLRP3 (82). Componentes da membrana de S. aureus como lipoproteínas (LPPs) são 

importantes PAMPs reconhecidos por TLR-2, levando a ativação da via de sinalização celular 

via MyD88, com consequente translocação de NF-κB para o núcleo e expressão de genes de 

citocinas pró-inflamatórias envolvidas na resposta imune do hospedeiro.  Já ácido lipoteicóico 

(LTA) e peptideoglicano (PGN) também são podem ser reconhecidos por TLR-2, embora 

existam resultados conflitantes na literatura sobre esse reconhecimento (83,84).  

Um importante mecanismo de ação das células da resposta imune inata é a fagocitose. 

Esse processo pode ocorrer de duas maneiras, seja por reconhecimento de PAMPs por PRRs 

ou por opsonização dos patógenos (componentes do sistema complemento, imunoglobulinas, 

os quais se ligam a superfície do patógeno para permitir reconhecimento via receptores das 

células fagocíticas como Fcy e receptor de complemento 3 – CR3) (85). Quando em contato 

com o patógeno, as células fagocíticas são capazes de emitir prolongamentos de sua 

membrana plasmática (pseudópodes) e englobar o microrganismo em vesículas intracelulares 

conhecidas como fagossomos. Inicialmente, os fagossomos se ligam a endossomos iniciais, 



18 
 

adquirindo suas propriedades como o pH levemente ácido. Posteriormente, ligam-se aos 

endossomos tardios, onde o ambiente fica mais ácido e enriquecido de proteases e proteínas 

associadas as membranas dos lisossomos (LAMPs). Por fim, ocorre a fusão com lisossomos, 

dando origem ao fagolisossomo, estrutura com ambiente altamente ácido na qual ocorrerá a 

morte do patógeno por meio de mecanismos dependentes e independentes de oxigênio e 

nitrogênio. A acidificação do microambiente ocorre pela ação de v-ATPases, criando um 

ambiente hostil que limita o crescimento microbiano e favorece a ação de enzimas que 

necessitam do pH baixo para exercerem suas funções (85,86). 

Além da acidificação do ambiente, as células fagocíticas podem se utilizar de espécies 

reativas de oxigênio (EROs) e nitrogênio (ERNs) para exercerem suas funções e assim eliminar 

os patógenos. Os mecanismos dependentes de oxigênio são exercidos via enzima NADPH 

oxidase, a qual é responsável pela produção de ânions superóxido (O2-) em células ativadas. 

O O2- sofre dismutação quando ligado à água, levando à formação de derivados tóxicos de 

oxigênio, como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxila (OH-). A H2O2 também 

pode ser catalisada pela ação da enzima mieloperoxidase, gerando um potente oxidante, o 

ácido hipocloroso (HOCl), considerado como um dos principais mediadores de morte de 

patógenos por mecanismos dependentes de oxigênio (87,88). Já os mecanismos dependentes 

de nitrogênio ocorrem pela ação da óxido nítrico sintase (NOS2). EROs e ERNs agem 

sinergicamente para gerar efeitos altamente tóxicos, inativando proteínas e levando a danos 

no DNA dos microrganismos, prejudicando, dessa maneira, seu metabolismo e inibindo seu 

crescimento (85). 

Por fim, para auxiliar no processo de fagocitose, as células contam com a presença de 

uma variedade de peptídeos antimicrobianos como lactoferrina, lisozimas, defensinas e 



19 
 

catelicidinas, entre outros, que podem exercer tanto efeitos bacteriostáticos quanto 

bactericidas. Esses agem principalmente pela permeabilização de membrana, privação 

nutricional, entre outros mecanismos para induzir a morte do patógeno (85).   

Em um estudo realizado em 2016 (89), foi demonstrado que monócitos de indivíduos 

neonatais saudáveis e nascidos com sepse tiveram sua capacidade fagocítica reduzida em 

comparação aos indivíduos adultos quando expostos a S. aureus e Escherichia coli (E. coli). Já 

a capacidade fagocítica de S. aureus pelos neutrófilos foi mais alta, embora ainda tenha se 

demonstrado reduzida nos neonatais em comparação com os adultos. Ademais, foi 

demonstrado um aumento na expressão de citocinas pró-inflamatórias como IL-8, IL-6 e IL-1β 

nos neonatais com sepse, além da elevada produção de H2O2 após a fagocitose de E. coli e S. 

aureus, em níveis semelhantes aos adultos. Outro estudo demonstrou que neutrófilos e 

monócitos de pacientes sépticos, após desafio com S. aureus e P. aeruginosa, apresentaram 

aumento na produção de EROs e NO, demonstrando que S. aureus tem a capacidade de induzir 

um aumento nos níveis tanto de EROS quanto de NO (90).  

No entanto, Guerra et al. (2016) (88) descreveram que o fator de virulência de S. aureus 

SaeR/S, envolvido na evasão da morte de S. aureus por neutrófilos, induz uma diminuição na 

produção de H2O2 e HOCl por essas células em resposta ao desafio com a bactéria in vitro, 

resultando na sobrevivência do S. aureus. Já Kremserova et al. (2018) (91) demonstraram que 

neutrófilos humanos pré-sensibilizados com LPS que continham S. aureus viáveis no interior 

de seus fagossomos foram capazes de produzir IL-1β, enquanto que aqueles que continham 

S. aureus mortos ou opsonizados com zimozan liberaram IL-1β em níveis semelhantes aos 

neutrófilos não estimulados. A produção ocorreu via receptor com proteína serina/treonina 

quinase 3 (RIPK3) e independente de ativação de inflamassomo e caspase-1. Recentemente, 



20 
 

Berends et al. (2019) (92) identificaram que um importante fator de virulência de S. aureus 

envolvido na formação de poros na membrana das células imunes, a leucocidina AB (LukAB) 

foi envolvida tanto na morte de neutrófilos quanto de células dendríticas, 

independentemente do tempo de infecção ou da quantidade de inóculo.   

Como primeira linha de combate a microrganismos, os neutrófilos, além de sua 

capacidade fagocítica após o recrutamento para o sítio de infecção em resposta a citocinas e 

quimiocinas, também podem agir através da liberação de seu conteúdo granular, os quais 

possuem proteínas e enzimas com atividades microbicidas. Os grânulos primários ou 

azurófilos são caracterizados pela ampla presença de peptídeos antimicrobianos, como 

mieloperoxidase (MPO), defensinas, lisozimas, elastase, catepsina G, entre outros. Grânulos 

secundários e terciários contêm proteínas importantes para o extravasamento e migração de 

neutrófilos e proteínas com efeito antimicrobiano, como lactoferrina, colagenase e gelatinase, 

os quais permitem que neutrófilos cheguem ao sítio de infecção e comecem a resposta 

antimicrobiana (86,93).  

As vesículas secretoras, presentes nas células maduras e compostas por integrinas e 

outras proteínas associadas ao recrutamento neutrofílico e à fagocitose, como integrina Mac-

1 e quimiocinas e receptores de citocinas como o CXCR2 (C-X-C motif chemokine receptor 2), 

são também importantes fatores, sendo que a liberação de seus conteúdos resulta num 

aumento de receptores quimiotáticos e integrinas na superfície dos neutrófilos, permitindo a 

aderência firme ao endotélio e entrada no sítio de inflamação. Um novo tipo de grânulo foi 

descrito recentemente caracterizado por conter ficolina-1, um membro da via das lectinas do 

sistema complemento, entretanto informações sobre seu conteúdo, degranulação e função 

são pouco conhecidos (93).  



21 
 

A liberação do conteúdo dos grânulos neutrofílicos deve ser um processo bem regulado, 

sendo o cálcio um fator muito importante para essa liberação em todos os tipos de grânulos, 

sendo que as vesículas secretórias são as primeiras a liberarem seu conteúdo, seguidas dos 

grânulos terciários, secundários e finalmente os primários ou azurofílicos (94). Em algumas 

patologias como a sepse e doenças autoimunes, a degranulação pode ocorrer de maneira 

descontrolada, sistemicamente e não apenas no sítio de infecção, levando a danos teciduais 

em múltiplos órgãos e possivelmente morte (93).  

Além de mecanismos intracelulares, as células fagocíticas possuem a capacidade de 

combater patógenos extracelularmente via um mecanismo denominado Extracellular Traps 

(ETs), o qual foi descrito pela primeira vez em neutrófilos humanos desafiados com S. aureus 

por Brinkmann et al. (2004) (95). ETs são redes liberadas para o meio extracelular após a 

ativação celular e compostas por conteúdos granulares e nucleares, como histonas e 

cromatina descondensada no intuito de eliminar os patógenos através de seu conteúdo 

microbicida ou de aprisioná-lo temporariamente para permitir o recrutamento de outras 

células do sistema imune, as quais poderão contribuir para a morte do microrganismo.  

 

1.5. Neutrófilos e Rede Extracelulares de Neutrófilos (NETs) 

Redes Extracelulares de Neutrófilos (NETs) são estruturas formadas por fibras com 

diâmetro entre 15 e 17nm e domínios globulares de aproximadamente 25nm, compondo um 

material frágil não circundado por membranas (95), liberadas por neutrófilos e que, além de 

cromatina descondensada e histonas, possuem componentes dos grânulos primários, como 

elastase, mieloperoxidase, catepsina G, grânulos secundários e terciários (95).  



22 
 

Elastase e mieloperoxidase possuem importante papel na descondensação do DNA pela 

degradação das ligações das histonas (localizadas no núcleo), permitindo assim elas também 

participem do processo de formação de NETs. Durante o processo de NETose, a elastase migra 

para o núcleo e promove a degradação de histonas como a H1 e H4, promovendo a 

descondensação da cromatina (96). Já a mieloperoxidase, assim como EROS, são necessários 

para a liberação de elastase dos grânulos durante a liberação das ETs (97). Estudos 

demonstraram que neutrófilos de indivíduos deficientes na produção de mieloperoxidase e 

indivíduos portadores de doença granulomatosa crônica (CGD), os quais têm atividade da 

NADPH oxidase deficiente, apresentaram ausência da migração de elastase para o núcleo, 

mantendo-se no interior dos grânulos, demonstrando a importância do EROS nesse processo 

(97).  

Primeiramente, o processo de NETose foi descrito como um processo de morte celular, 

a qual ocorria de maneira distinta de outros processos como necrose e apoptose (95,98). Em 

um estudo realizado em 2007, Fuchs et al. (98) demonstraram que, durante a Netose, a 

membrana nuclear é rompida, fato que não ocorre durante a Necrose. Já em comparação com 

Apoptose, na NETose não ocorre fragmentação do DNA e nem exposição de fosfatidilserina, 

passos importantes durante a morte celular por Apoptose. 

Além de neutrófilos, macrófagos, monócitos, eosinófilos, basófilos e mastócitos 

também foram descritos como capazes de liberar essas redes para o meio extracelular (99–

101) na tentativa de controlar a infecção e eliminar o agente patogênico. Uma vez liberadas, 

as ETs são responsáveis por aprisionar o microrganismo e assim evitar a disseminação do 

patógeno na tentativa de auxiliar o desfecho da infecção ou mesmo por eliminar o patógeno 

através dos inúmeros componentes microbicidas presentes nessas redes (102,103). 



23 
 

Diversos estímulos já foram descritos como potenciais indutores de ETs, entre eles IL-8, 

forbol miristato acetato (PMA), LPS, entre outros (95). O PMA age pela ativação da enzima 

NADPH oxidase, induzindo a produção de EROS, essenciais para a ativação da célula e 

consequente liberação de ETs. EROS foram associados com a formação dessas redes, uma vez 

que pessoas com deficiência na enzima NADPH oxidase, como os pacientes portadores de 

CGD, apresentavam capacidade de atividade microbicida reduzida, e incapazes de liberar NETs 

quando em contato com Aspergillus nidulans (A. nidulans), sendo essa capacidade recuperada 

após terapia gênica dos pacientes (104). Além desses, foi identificada uma grande variedade 

de microrganismos capazes de induzir a formação de ETs, entre eles bactérias Gram-positivas 

e negativas, vírus, fungos e protozoários (95,103,105,106). Entretanto, alguns agentes 

patogênicos possuem mecanismos de evasão dessas redes como é o caso de S. aureus, M. 

tuberculosis e Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) (102,107,108), fazendo com que as ETs 

possuam apenas o papel de aprisionamento temporário.  

Diversos artigos descrevem a ação das ETs em resposta ao S. aureus. Brinkmann et al. 

(2004) (95) descreveram pela primeira vez que essa bactéria era capaz de induzir a formação 

de NETs em neutrófilos humanos. Fuchs et al. (2007) (98) identificaram que o processo de 

liberação de redes para o meio extracelular em resposta ao PMA e S. aureus envolvia a morte 

da célula em questão. Diversas alterações morfológicas, tanto no núcleo quanto no citoplasma 

foram observadas em diferentes períodos, entre elas a perda da característica lobular do 

núcleo, descondensação da cromatina, com posterior degradação da membrana nuclear e 

junção com o conteúdo granular no citoplasma, já disperso. Por fim, poros na membrana 

celular permitiam a liberação desse material e a morte do neutrófilo ocorria. Entretanto, em 

2010, Pilsczek et al. (109) demonstraram que esse mecanismo de defesa não necessariamente 

dependia da morte do neutrófilo envolvido. Yipp et al. (2013) (110) identificaram que a 



24 
 

NETose é um mecanismo de defesa celular que pode ser classificado em NETose vital ou 

NETose suicida. A NETose vital caracteriza-se pela liberação do conteúdo das NETs e ainda 

permite que o neutrófilo seja capaz de exercer suas funções. Esse mecanismo ocorre através 

da formação de vesículas na membrana nuclear e a consequente liberação das mesmas para 

o meio extracelular, sem que ocorra a morte da célula envolvida. Outra maneira de ocorrer a 

NETose vital foi descrita por Yousefi et al. (111), em 2009, os quais demonstraram que cerca 

de 80% de neutrófilos pré-estimulados com fator estimulador de colônias de granulócitos e 

macrófagos (GM-CSF) e posteriormente ativados com LPS ou fator do sistema complemento 

C5a, foram capazes de liberar NETs, com DNA de origem mitocondrial. Já a NETose suicida é 

aquela em que necessariamente ocorre a morte da célula envolvida, como anteriormente 

descrito por Fuchs et al. (2007) (98).  

Como o S. aureus possui uma variedade de fatores de virulência, já foi descrito que essa 

bactéria conta com mecanismos de escape dessas redes, dificultando a resposta do 

hospedeiro durante o processo infeccioso. Em um estudo realizado por Berends et al. (2010) 

(107), foi demonstrado que S. aureus é capaz de degradar NETs geradas após ativação com 

PMA via expressão de nuclease, tornando a bactéria resistente à morte extracelular causada 

pelas NETs. Outro estudo demonstrou que leucocidinas liberadas por S. aureus podem levar 

neutrófilos a morte, sendo que esse processo de morte é acelerado a partir da ação conjunta 

das leucocidinas PVL e HlgAB, liberadas durante a formação de biofilme. Além disso, essas 

leucocidinas associadas ao biofilme são responsáveis por induzir a liberação de NETs e que, 

mesmo após o contato dos neutrófilos com as bactérias, ainda existiam bactérias viáveis na 

formação do biofilme, indicando que o S. aureus pode evadir-se da atividade bactericida 

oriundas das proteínas com capacidade antimicrobiana presente nas NETs (112). 



25 
 

O papel das NETs não se restringe a seus efeitos benéficos ao hospedeiro, atuando de 

maneira significativa no combate aos mais diversos tipos de infecção. Diversos trabalhos vêm 

identificando a presença dessas estruturas em outras condições humanas e correlacionando-

as com as mais diversas patologias. Em um estudo realizado em 2018, foi demonstrado que 

neutrófilos de 53.57% de pacientes com câncer cervical foram capazes de formar NETs 

espontâneas antes de receber tratamento, porém, essa capacidade variou bastante após 

radioterapia (66.67%) sozinha ou acrescida de outros tratamentos quimioterápicos como 

ftorafur (50%) e cisplatina (37.50%) após avaliação do sangue dos pacientes. Houve também 

a detecção de liberação de ETs por basófilos (113). J 

á em doenças autoimunes como a psoríase, foi identificado o aumento de neutrófilos 

liberando NETs no sangue periférico de pacientes com psoríase em comparação aos indivíduos 

saudáveis (114). Além disso, os autores demonstraram que a incubação de neutrófilos com 

soro de pacientes com psoríase induziu um aumento na capacidade de indução de NETs, além 

correlacionarem a quantidade de NETs formadas com a severidade da doença. Ainda, foi 

observado que pacientes com psoríase apresentam NETs em suas lesões, o que foi confirmado 

pelas técnicas de HE (Hematoxilina e Eosina) e microscopia confocal, com marcação de DNA, 

elastase e histona (114).  

Em relação ao processo de trombose, a redução do fluxo sanguíneo induz um estado de 

hipóxia, induzindo uma ativação do endotélio com consequente liberação do fator von 

Willebrand o que por sua vez leva ao recrutamento de plaquetas e neutrófilos. As plaquetas 

presentes são capazes de induzir a liberação de NETs, as quais servem de suporte para adesão 

e agregação de mais plaquetas, eritrócitos e fibrina, proporcionando a estabilização e 

formação de mais trombos (115,116). Além disso, foi demonstrado que histonas, um dos 



26 
 

componentes das NETs, são capazes de induzir ativação plaquetária, podendo 

consequentemente agravar o processo trombótico (115).  Quando relacionado a patologias 

gestacionais como a pré-eclâmpsia, foi demonstrado que micro-debris originados da placenta 

e outros fatores como IL-8 levam a ativação de neutrófilos, com consequente liberação de 

NETs, as quais ocupam grande parte do espaço interviloso da placenta (117,118). Outro 

processo importante que ocorre durante a pré-eclâmpsia é a hipóxia. A presença das NETs no 

espaço interviloso pode dificultar ainda mais a reperfusão, aumentando o grau de hipóxia e 

estresse oxidativo, sendo, portanto, a presença das NETs associada a essa patologia (117). Por 

fim, o processo de NETose também já foi correlacionado com diabetes mellitus. Em um estudo 

realizado em 2015, os autores demonstraram que neutrófilos de indivíduos saudáveis 

incubados com altas concentrações de glicose (25mM), na presença ou ausência de PMA, 

tiveram um aumento na produção de NETs em comparação com concentrações menores de 

glicose (5mM). Além disso, foi identificado um aumento nos níveis circulantes de 

componentes das NETs como elastase e DNA dupla fita em soro de pacientes com diabetes 

tipo 2 em comparação com indivíduos controle, comprovando o fato de que o processo de 

NETose é associado à hiperglicemia encontrada nos pacientes com diabetes tipo 2 (119). 

Algumas drogas já tiveram sua ação relacionada à liberação de ETs. Antibióticos como a 

fosfomicina, drogas imunossupressoras como a ciclosporina A, drogas anti-inflamatórias, 

mucolíticas e cardiovasculares e suplementos vitamínicos foram descritos como potenciais 

indutores ou redutores do processo de NETose (120–122). A vitamina D é um exemplo de 

suplemento vitamínico que também já teve seu papel relacionado à liberação de ETs, 

ampliando assim sua relação com o sistema imune. Handono et al. (2014) (123) identificaram 

que o tratamento de neutrófilos de pacientes com Lúpus Eritematoso Sistêmico pode reduzir 

o dano tecidual causado pela NETose através da diminuição da externalização de elastase 



27 
 

durante o processo de NETose. Já Agraz-Cibrian et al. (2019) (124) demonstraram que o 

tratamento de neutrófilos com a forma ativa da vitamina D induziu a liberação de estruturas 

semelhantes às NETs, além do aumento da expressão de mRNA de produtos associados às 

proteínas das NETs como elastase e PAD4 (protein arginine deiminase 4) e de TLR7 e IFN-α, 

correlacionando o papel da vitamina D com a possibilidade de evitar a disseminação de 

patógenos.  

Assim, considerando a atuação da vitamina D no sistema imune e os potenciais 

benefícios no combate a infecções, torna-se extremamente interessante verificar se a 

vitamina D pode modular os mecanismos efetores intra e extracelulares de neutrófilos 

humanos contra o S. aureus, contribuindo, dessa maneira, ao combate à infecções, 

especialmente aquelas causadas por microrganismos resistentes aos principais tratamentos. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



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Capítulo II 

Artigo Científico 

Manuscrito redigido de acordo com as normas da Revista Plos One



 

 

Manuscript 
Effect of vitamin D upon intra and extracellular bactericidal mechanisms 

from human neutrophils against Staphylococcus aureus: role on 

bactericidal activity, phagocytosis and Neutrophil Extracellular Traps 

(NETs)  

 

Amanda Manoel Della Coletta1, Taiane Priscila Gardizani1, Tatiana Cristina Figueira1, 

Yohan Ricci Zonta1, Kaio Shu Tsyr Yu1, Larissa Carvalho1, Thaís Graziela Donegá França2, 

Graziela Gorete Romagnoli2, Valdecir Farias Ximenes3, Maria de Lourdes Ribeiro de 

Souza da Cunha2, Helio Amante Miot4, Luciane Alarcão Dias-Melicio1,5* 

 
1 São Paulo State University (Unesp), Medical School of Botucatu, Laboratory of 

Immunopathology and Infectious Agents - LIAI, UNIPEX - Experimental Research Unity, Sector 5, 

Botucatu/SP - Brazil;  

2 São Paulo State University (Unesp), Institute of Biosciences, Department of Microbiology and 

Immunology, Botucatu/SP – Brazil. 

3 São Paulo State University (Unesp), School of Sciences, Department of Chemistry, Bauru/SP- 

Brazil. 

4 São Paulo State University (Unesp), Medical School of Botucatu, Department of Dermatology 

and Radiotherapy, Botucatu/SP – Brazil 

5 São Paulo State University (UNESP), Medical School of Botucatu, Department of Pathology, 

Botucatu/SP – Brazil.  

 

Short title: Effect of vitamin D on human neutrophils effector mechanisms against 
Staphylococcus aureus 
 
 

Funding: This work was suported by CNPq PhD fellowship (AMDC - 140332/2015-4). The funders 

had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of 

the manuscript. 

 

Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. 

 

* E-mail: dias.melicio@unesp.br 

 

Manuscript written according to PLOS ONE Submission Guidelines 



37 
 

ABSTRACT 

Vitamin D deficiency has become extremely relevant worldwide in the last years, mainly due 

to populations behavior changes, such as reduced sun exposure and insufficient vitamin intake in the 

diet. Vitamin D role in maintenance of calcium homeostasis is already established, and now, studies 

have focused on vitamin D role on the regulation and function of the immune system. Its deficiency 

has been associated with several diseases such as bone diseases, cancer, diabetes mellitus, 

autoimmune and infectious diseases such as those caused by Staphylococcus aureus (S. aureus). Innate 

immune system plays a major role against S. aureus infections through response mediated by pattern 

recognition receptors (PRRs), reactive oxygen species (ROS), cytokines and antimicrobial peptides 

production, and the response of phagocytic cells such as macrophages and neutrophils by intra and 

extracellular mechanisms. In this manner, the aims of this study were to evaluate the role of Vitamin 

D upon the intra and extracellular effector mechanisms of human neutrophils against different strains 

of S. aureus. In this context, we demonstrated that neutrophils treated with Vitamin D and challenged 

with two strains of S. aureus had an increase in phagocytic rates and bactericidal activity in a 

dependence of the strain, contributing to neutrophil antimicrobial properties. Besides, we identified 

that individuals with deficient/insufficient vitamin D serum levels were correlated with lower NETs 

release and phagocytosis rate; while individuals with sufficient vitamin D serum levels were correlated 

with higher NETs release, intermediate phagocytosis rate and bactericidal activity. Then, Vitamin D 

could modulate the innate immune response against S. aureus mainly through phagocytic rates and 

bactericidal activity. Further studies are needed to better understand the complex capacity of Vitamin 

D on modulation of the innate immune response. 

 

Key-words: Bactericidal Activity, Phagocytosis, Vitamin D, Staphylococcus aureus, Neutrophil 

Extracellular Traps (NETs). 

 

 



38 
 

INTRODUCTION 

In the past decades, vitamin D deficiency has become extremely relevant worldwide, 

mainly due to populations behavior changes, such as reduced sun exposure and protection to 

avoid elevated skin cancer rates (1). Although there are conflict data about 25-hydroxyvitamin 

D (25(OH) vitamin D) states, serum levels lower than 20ng/mL are considered as deficiency  

(2). Vitamin D is produced in the skin upon a photochemical conversion of 7-

dehydrocholesterol, which is present in the epidermis, in Vitami