Universidade Estadual Paulista - UNESP Campus de Araraquara Faculdade de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Cordia verbenacea DC.: estudo químico-biológico relacionado ao seu uso tradicional Isabela Jacob Moro Orientador: Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos Araraquara – SP 2022 Universidade Estadual Paulista - UNESP Campus de Araraquara Faculdade de Ciências Farmacêuticas Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas Cordia verbenacea DC.: estudo químico-biológico relacionado ao seu uso tradicional Isabela Jacob Moro Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS, área de concentração: Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para a obtenção do título de doutor. Orientador: Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos Araraquara – SP 2022 AGRADECIMENTOS À Deus, acima de todos. À minha família, a base de tudo. À UNESP (Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara), minha casa desde a graduação. Ao meu orientador, que desempenha suas funções com dedicação e ânimo, pela oportunidade, ensinamentos e compreensão. Aos meus amigos de Laboratório (André, Bianca, Caio, Stéfany, Bárbara, Winner, Flávio, Fernando, Giovana, Janaína), por tornarem as coisas mais leves e agradáveis. Aos professores (Prof. Dra. Ana Marisa Fusco de Almeida, Prof. Dr. Iguatemy Lourenço Brunetti) e alunos dos Laboratórios de Proteômica (Junya e Nathália) e Bioquímica Clínica (Renata) pela parceria e treinamento. Ao grupo GreenBiotech Network, que detém o nobre desejo produzir dados científicos e, simultaneamente, transformar a química envolvida em algo menos agressivo ao meio ambiente e às pessoas. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), que apoiou este trabalho. RESUMO Cordia verbenacea DC. é uma espécie nativa do Brasil, popularmente utilizada na forma de "garrafadas" para o tratamento contra infecções, úlceras, dores e reumatismos. A erva baleeira consta no Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira e integra a Relação de Plantas Medicinais de Interesse do SUS. Estudos preliminares de nosso grupo de pesquisa levaram ao isolamento e identificação de substâncias da espécie e a verificação da atividade antioxidante de extratos. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo averiguar a atividade antioxidante dos metabólitos secundários, e, também, a atividade anti- inflamatória de extratos. Além disso, buscou o desenvolvimento de métodos analíticos que atendessem aos Princípios da Química verde. Apesar do disseminado uso da planta, há pouca informação a respeito de sua toxicidade. Sendo assim, o trabalho também buscou avaliar a embriotoxicidade através do estudo com modelo animal alternativo (zebrafish), abarcando, mais uma vez, os princípios da Química Verde. Do ponto de vista do potencial antioxidante, é sabido que o processo de produção de radicais livres é fisiológico tendo importantes funções metabólicas. No entanto, o estresse oxidativo ocasionado quando a produção das espécies reativas de oxigênio exacerba a capacidade antioxidante do organismo, pode comprometer as biomoléculas e influenciar negativamente a homeostase dos sistemas. Por sua vez, a inflamação é uma resposta fisiológica normal do organismo frente a infecções ou lesões teciduais. Porém, o processo inflamatório pode se relacionar com o estresse oxidativo quando da ativação intensa de células do sistema imune, tal como os neutrófilos. Neste estudo, o extrato etanólico ofereceu uma resposta menos antioxidante na grande maioria dos ensaios realizados, tendo superado a atividade do extrato hidroetanólico apenas no ensaio com ácido hipocloroso. Com relação às flavonas, apenas a substância 1 atingiu valores de CE50 nos ensaios antioxidantes, porém, a mistura das substâncias 1 e 2 (PPt) obteve atividade superior nas avaliações antioxidantes. Os triterpenos não apresentaram atividade antioxidante nas concentrações avaliadas. Na avaliação anti-inflamatória, a cordialina A ofereceu melhor resposta que a flavona (substância 2), principalmente em COX1, e não atingiu os valores de CI50 em sPLA2. Contudo, os valores de inibição da atividade. Do ponto de vista da Química Verde, foi desenvolvido um método por UPLC-UV e um método OLE (online extraction)-UPLC-UV, para análise direta da droga vegetal. Esses métodos desenvolvidos por UPLC-UV e OLE- UPLC-UV foram avaliados através da métrica Agree como mais verdes do que o método HPLC-UV para análise do extrato hidroetanólico, O método UPLC-UV foi validado e foi determinado o teor de ácido rosmarínico no extrato hidroetanólico, sendo equivalente a 6,1% (m/m). O métodos desenvolvidos tinham como destaque o uso de etanol, a redução do tempo de análise e a ausência de preparo de amostra com o uso do OLE. A escassez de dados sobre a toxicidade estimulou a pesquisa por parte deste trabalho e foi observado que ambos extratos levaram a morte e malformações de embriões, sugerindo um cuidado no manejo de estantes e crianças, apesar do ensaio não descarta a necessidade de avaliação de outras concentrações e em outros modelos de estudo. Palavras-chave: antioxidante, anti-inflamatório, Varronia curassavica, Cordia verbenacea, flavonas, triterpenos. ABSTRACT Free radical production is a physiological process that has metabolic functions. However, oxidative stress, caused when the production of reactive oxygen species exacerbates the body's antioxidant capacity, can compromise biomolecules and influence systemic homeostasis negatively. In turn, inflammation is a normal physiological response of the body to infections or tissue damage. However, the inflammatory process can be related to oxidative stress when the intense activation of immune system cells occurs, such as neutrophils. This research involves the study of Varronia curassavica Jaqc., a native species of Brazil known as erva-baleeira. The objectives of the study are to evaluate the activities of its secondary metabolites regarding the anti-inflammatory and antioxidant issue, its toxicity, as well as to proceed with the identification of secondary metabolites, including the use of Green Chemistry principles like developing analysis employing the UHPLC-UV and OLE- UHPLC-UV (online extraction-liquid chromatography) system for direct analysis of the plant material. From a fraction of the ethanol extract of V. curassavica (fraction 3.2), chromatographic procedures were carried out which resulted in the isolation of 4 purified substances. The ethanol extract obtained lower antioxidant potential in the majority of performed tests. In addition to its greater antioxidant potential, the hydroethanolic extract has lower embryotoxicity in trials with zebrafish. In the evaluation of the anti-inflammatory activity, cordialin A had a better result than subsntace 1 in the inhibition of COX1, COX2 and sPLA2 activity. The developed UHPLC-UV and OLE-UHPLC-UV methods were considered greener than the described HPLC-UV method for the hydroethanolic extract, through the use of Agree tool, highlighting the use of ethanol, the lowest analysis time and the absence of sample pretreatment in the case of the OLE system. Key-words: antioxidant, anti-inflammatory, Varronia curassavica, Cordia verenaceae. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Correlação entre metabolismo primário e metabolismo secundário. Os intermediários representantes das principais vias dos metabólitos secundários estão em círculos tracejados. ............................................................................................. 18 Figura 2 Espécimes de Cordia verbenacea DC. (campo experimental do CPQBA- Unicamp, Paulínia-SP). Fonte: Autor. ....................................................................... 20 Figura 3 Em detalhe, ramo florido de Cordia verbenacea DC. (Fonte: PEREIRA 2017). ........................................................................................................................ 20 Figura 4 Estruturas químicas dos principais representantes de cada classe de metabólitos secundários presentes da C. verbenacea . ............................................ 22 Figura 5 Reação de redução do DPPH. na presença de um antioxidante. ............... 26 Figura 6 Formação do radical hidroperoxila por protonação (1), e formação de peróxido de hidrogênio e de oxigênio por reação de enzima superóxido dismutase (SOD) a partir do ânion radicalar superóxido (2). ...................................................... 27 Figura 7 Reação de formação do radical hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio e do ânion radicalar superóxido (1) e formação do radical hidroxila a partir da reação do peróxido de hidrogênio com meta de transição, Fe2+ (2). ..................................... 27 Figura 8 Formação de ácido hipocloroso a partir de peróxido de hidrogênio pela oxidação de íons cloro na presença de mieloperoxidase (MPO). ............................. 28 Figura 9 Fenótipos de malformação em zebrafish. (A) Embrião coagulado. (B) Embrião com 48hpf com edema de saco vitelínico (*) e formação distinta de somitos. (C) Embrião com 96hpf sem a presença de somitos (→), com escoliose e edema de pericárdio (*). (D) Ausência do botão do olho (*) e não descolamento da cauda (→) no embrião com 96hpf. Fonte: OCDE, 2013. ............................................................ 31 Figura 10 Membrana de nylon na parte inferior do holder e coluna de guarda vazia; B) coluna de guarda sobre o holder, preenchida com material vegetal e sílica C18 e membrana de nylon na parte superior; C) fechamento do holder. Fonte: arquivo pessoal. ..................................................................................................................... 38 Figura 11 A) injetor sem acoplamento do holder; B) holder em substituição ao loop acoplado ao injetor. Fonte: arquivo pessoal. ............................................................. 39 Figura 12 Cromatogramas em HPLC-UV (gradiente exploratório) da fração 3.2 e EEt. Gradiente exploratório: 5-100 % de metanol em 30 min, mais 100% de metanol por 5 min; coluna Thermo Scientific® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λmáx= 254 nm, vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20 uL (Fonte: PEREIRA 2017). .......... 48 Figura 13 Cromatoplaca de 3.2CC. Fase estacionária: sílica gel. Fase móvel: Hex/AcOEt/EtOH 5:4,5:0,5 (v/v). Revelador: anisaldeído sulfúrico. .......................... 49 Figura 14 Cromatoplaca de 3.2CC com as frações já agrupadas. Fase estacionária: sílica gel. Fase móvel: Hex/AcOEt/EtOH 5:4,5:0,5 (v/v). Revelador: anisaldeído sulfúrico. .................................................................................................................... 49 Figura 15 Cromatogramas em HPLC-DAD/UV-Vis das frações 1, 3 e 8, respectivamente, obtidas por 3.2CC. Modo isocrático: MeOH/H2O 80:20, 20 min; coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20uL, cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® PDA. ..................................... 51 Figura 16 Cromatogramas em HPLC- DAD/UV-Vis das frações 2 e 8, respectivamente, obtidas por 3.2CC. Modo isocrático: MeOH/H2O 80:20, 20 min; coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20uL, cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® PDA. ..................................... 52 Figura 17 Cromatogramas em HPLC-UV das frações 2 (A) e 8 (B), obtidas por 3.2EFS2. Modo isocrático: MeOH/H2O 85:15 (A) e 85:15 (B); coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 0,4 mL/min, volume de injeção de 20uL, cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis. ............................................................ 52 Figura 18 Cromatogramas em HPLC-UV de 8p1 (A), 8p2 (B) e 8p3 (C), obtidos por cromatografia preparativa a partir da fração 8. Modo isocrático: MeOH/H2O 80:20 (A); coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 1 mL/min, volume de injeção de 20uL, cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis. .......................... 53 Figura 19 Cromatograma em HPLC-UV do precipitado em Hex/AcOEt 6:4 da fração 3.2 Condições de análise: 0-10’: 6 a 20%; 10-13’: 20 a 35%; 13-60’: 35 a 68%; 60- 62’: 68 a 100%; 62-70’: 100% acetonitrila; coluna: Ace® C18 (250x4.6mm; 5um); Injeção de 20 µL; λ-254 nm; vazão de 1,0 mL/min. Preparo de amostra em: ACN (0,1% dietilamina), cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis. .............................. 54 Figura 20 Cromatograma em HPLC-UV da porção insolúvel da fração 3.2. Modo isocrático: ACN/H2O 71:29; coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 0,4 mL/min, volume de injeção de 20 uL. Cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis. .......................................................................................................... 55 Figura 21 Cromatograma em HPLC-UV da porção insolúvel da fração 3.2. Modo isocrático: ACN/H2O 71:29; coluna semi-preparativa Agilent Eclipse XDB C18 (250x 21,20 mm; 7 µm), λ= 254 nm, vazão de 8 mL/min, volume de injeção de 1 mL. Cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis. ............................................................ 56 Figura 22 Estrutura química do triterpeno cordialina A (substancia 3). .................... 58 Figura 23 Estrutura química do triterpeno (Z)-cordialina A (substancia 4). .............. 60 Figura 24 Estruturas químicas de 4’,5-dihidroxi-2’,3,5’,6,7-pentametoxiflavona (A) e 2’,5-dihidroxi-3,4’,5’,6,7-pentametoxiflavona (B), substancia 1. ................................ 62 Figura 25 Estrutura química da artemetina (5-hidróxi-3,3’,4’,6,7- pentametoxiflavona), substancia 2. ........................................................................... 64 Figura 26 Curva analítica obtida com a glicose para a determinação de açúcares redutores, utilizando DNS. ........................................................................................ 64 Figura 27 Curva analítica do ácido gálico para determinação dos fenólicos totais dos extratos de C.verbenacea. ........................................................................................ 66 Figura 28 Cromatogramas em HPLC-UV. Método OLE-HPLC (A; material vegetal seco e moído) e método convencional de análise de amostra (B; EEt). Gradiente exploratório: 5-100 % de metanol em 30 min, mais 100% de metanol por 15 min; coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20 µL (10 mg/mL) (B); 1 mg de planta seca e moída (A). ........................ 67 Figura 29 Cromatogramas em HPLC- DAD/UV-Vis (gradiente exploratório) de EEt (a) e EEtOH (b). Gradiente exploratório: 5-100 % de metanol em 30 min, mais 100% de metanol por 5 min; coluna C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λmáx= 254 nm, vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20 uL (Fonte: ROMÃO 2016). ................................... 68 Figura 30 Cromatogramas em HPLC UV. Sobreposição das análises por OLE-HPLC (planta seca e moída; linha vermelha) e método convencional (EEt; linha preta). Gradiente exploratório: 5-100 % de metanol em 30 min, mais 100% de metanol por 15 min; coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20 µL (10 mg/mL) (B); 1 mg de planta seca e moída (A). ....... 68 Figura 31 Método desenvolvido por Faibicher (2020): coluna C18, fase móvel ácido acético 2 % (A) e metanol (B) em modo gradiente: 35-42% B (0-20 min); 42-60% B (20-30 min); 60-70 % B (30-40 min); 70-100% B (40-70 min). Fonte: Faibicher, 2021. .................................................................................................................................. 69 Figura 32 Método 1(A) e Método 2(B) em UPLC-UV. Método 1: 25-32% B (0-3 min), 32-60% B (3-5,5 min), 60-90% B (5,5-10 min), 90-100% (10-12 min), 100% B (12-15 min). Método 2: 35-40% B (0-3 min), 40-45% B (3-6min), 45-50% B (6-9 min), 50- 55% (9-12 min), 55-60% (12-15 min), 100% B (15-22min). Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2 %. 0,300 mL/min, Vinj=10µL, 35°C. ........................................ 70 Figura 33 Método 3 (A) e Método 4 (B) em UPLC-UV. Método 3: 14-31% B (0-8 min), 31-80% B (8-20 min), 80-100% B (20-21 min), 100% (21-25 min). Método 4: 14-27% B (0-8 min), 27-80% B (8-22 min), 80-100% B (22-23 min), 100% (23-25 min). Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2 %. 0,300 mL/min, Vinj=10µL, 35°C, UPLC Acquity® Waters UV/Vis. ................................................................................. 71 Figura 34 Método 5 (A), Método 6 (B), Método 7 (C) e Método 8 (D) em UPLC-UV. Método 5: 14-23% B (0-8 min), 22-80% B (8-23 min), 80-100% B (23-24 min), 100% (24-26 min). Método 6: 14-20% B (0-8 min), 20-80% B (8-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-30 min). Método 7: 14-20% B (0-8 min), 20-80% B (8-24 min), 80- 100% B (24-25 min), 100% (25-30 min). Método 8: 14-17% B (0-8 min), 17-80% B (8- 23 min), 80-100% B (23-24 min), 100% (24-27 min). Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2 %. 0,300 mL/min, Vinj=10µL, 35°C. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. . 72 Figura 35 Método 9: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min). Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2 %. 0,300 mL/min, Vinj=10µL, 35°C. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. ........................................ 73 Figura 36 Método 10: 17-32% B (0-12 min), 32% B (12-18 min), 32-80% B (18-28 min), 80-100% B (28-29 min), 100% (29-32 min). Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2 %. 0,300 mL/min, Vinj=10µL, 35°C. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. .......... 74 Figura 37 Método 11 (A) e método 12 (B). Método 11: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min), 0,350 mL/min, Vinj=10µL, 45°C. Método 12: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min), 0,350 mL/min, Vinj=5µL, 45°C. Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2 %. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. ................................................... 75 Figura 38 Método 13 (A) e Método 14(B). Método 13: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min), 0,400 mL/min, Vinj=10µL, 50°C. Método 14: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min), 0,400 mL/min, Vinj=5µL, 50°C. Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2%. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. .................................................... 76 Figura 39 Scores obtidos através da métrica Agree. (A): método convencional em HPLC. (B) Método convencional em UPLC. (C) Método OLE-UPLC. ....................... 79 Figura 40 Curva analítica do ácido rosmarínico. ...................................................... 80 Figura 41 Análise gráfica dos resíduos dos padrões de ácido rosmarínico. ............. 82 Figura 42 Espectro de absorção no UV no início (A), meio (B) e fim (C) do pico cromatográfico referente ao EEtOH (1) e do ácido rosmarínico (2). ......................... 84 Figura 43 Cromatogramas de EEtOH (A) e do ácido rosmarínico resultantes da análise para a obtenção do espectro no UV. Método: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min), 0,350 mL/min, Vinj=5µL, 45°C. Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2 %. UPLC Shimadzu® PDA Nexera. .................................................................................................................................. 84 Figura 44 OLE-UPLC-UV. Coluna HSS T3. Método: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-32 min), 80-100% B (32-33 min), 100% (33-36min). Coluna HSS T3, fase móvel ácido acético 2%. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. .................................................... 86 Figura 45 Injeção de EEtOH (0,5 mg/mL) no método desenvolvido para o sistema OLE. Vinj=5µL. Coluna HSS T3. Método: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-32 min), 80-100% B (32-33 min), 100% (33-36min). Fase móvel ácido acético 2%. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. ................................................................................. 87 Figura 46 Método OLE-UPLC-UV. A: primeira extração. B: Padrão de cordialina A (Vinj=5µL) após extração exaustiva por OLE. Coluna HSS T3. Método: 17-33% B (0- 12 min), 33-80% B (12-32 min), 80-100% B (32-33 min), 100% (33-36min). Fase móvel ácido acético 2%. UPLC Acquity® Waters UV/Vis. ......................................... 88 Figura 47 Método OLE-UPLC-UV. Sobreposição das análises do EEtOH (azul), material vegetal seco e moído (vermelho) e padrão cordialina A (preto). Coluna HSS T3. Método: 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-32 min), 80-100% B (32-33 min), 100% (33-36min). Fase móvel ácido acético 2%. UPLC Acquity® Waters ................ 89 Figura 48 Curva de sobrevivência de embriões de zebrafish em 0, 24, 48 e 72hpf sujeitos à exposição ao EEt. Média em 2 ensaios independentes. hpf=horas pós fecundação. n=20 embriões. Hpf: horas pós fecundação. ........................................ 90 Figura 49 Curva de sobrevivência de embriões de zebrafish em 0, 24, 48 e 72hpf sujeitos à exposição ao EEtOH. Média em 2 ensaios independentes. hpf=horas pós fecundação. n=20 embriões. Hpf: horas pós fecundação. ........................................ 91 Figura 50 Controles de meio embrionário e de veículo (etanol) de ensaio de toxicidade em zebrafish em 24hpf, 48hpf e 72hpf. Os somitos são apontados pelas setas. Hpf: horas pós fecundação. ............................................................................ 92 Figura 51 Embrião de zebrafish tratado com EEt (50 µg/mL) apresentando malformação em 24hpf (A) e coagulação em 48hpf (B). ........................................... 92 Figura 52 Embrião de zebrafish tratado com EEt (100 µg/mL) apresentando malformação em 48hpf. Hpf: horas pós fecundação. ................................................ 93 Figura 53 Embrião de zebrafish após 24hpf tratado com EEtOH (50 µg/mL) apresentando edema pericardial (*) e atraso no desenvolvimento em A e malformação de saco vitelino em B. Hpf: horas pós fecundação. ............................. 93 Figura 54 Embrião de zebrafish após 72hpf tratado com EEtOH (50 µg/mL) apresentando edema pericardial (*), malformação de cauda e acentuada curvatura espinhal. Hpf: horas pós fecundação. ....................................................................... 94 Figura 55 Embrião de zebrafish após 48hpf tratado com EEtOH (100 µg/mL) apresentando edema pericardial (*), edema de saco vitelino (**), ausência de somitos e de pigmentação. Hpf: horas pós fecundação. ........................................... 94 Figura 56 Embrião de zebrafish após 24hpf tratado com EEtOH (200 µg/mL) apresentando variadas malformações (A a C) e morte (D e E). Hpf: horas pós fecundação. ............................................................................................................... 95 Figura 57 Embrião de zebrafish 48hpf tratado com EEtOH (200 µg/mL) apresentando variadas malformações e morte. Hpf: horas pós fecundação. ........... 95 Figura 58 Captura do radical DPPH• pela quercetina (μg/mL) em etanol. λ=517 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ............................. 96 Figura 59 Captura do radical DPPH• pelo EEt (μg/mL) em etanol. λ=517 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ....................................... 97 Figura 60 Captura do radical DPPH• pelo EEtOH (μg/mL) em etanol. λ=517 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ............................. 97 Figura 61 Captura do radical DPPH• pelo PPt (μg/mL) em etanol. λ=517 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ....................................... 98 Figura 62 Captura do radical DPPH• pela substancia 1 (μg/mL) em etanol. λ=517 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais........................ 99 Figura 63 Inibição (captura) do O2 - pela quercetina (µg/mL) em etanol. λ=560 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ........................... 100 Figura 64 Inibição (captura) do O2 - pelo EEtOH (µg/mL) em etanol. λ=560nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ..................................... 101 Figura 65 Inibição (captura) do O2 - pelo PPt (µg/mL) em etanol. λ=560 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ..................................... 102 Figura 66 Inibição (captura) do O2 - pela substância 1 (µg/mL) em etanol. λ=560 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais...................... 102 Figura 67 Inibição (captura) de HOCl/OCl- pela quercetina (µg/mL) em etanol. λ= 655 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. .............. 103 Figura 68 Inibição (captura) de HOCl/OCl― pelo PPt (µg/mL) em etanol. λ=655 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ........................... 103 Figura 69 Inibição (captura) de HOCl/OCl― pela substância 1 (µg/mL) em etanol. λ=655nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ........... 104 Figura 70 Inibição (captura) de HOCl/OCl- pelo EEt (µg/mL) em etanol. λ=655 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais. ........................... 104 Figura 71 Inibição (captura) de HOCl/OCl- pelo EEtOH (µg/mL) em etanol. λ=655 nm. CE50: concentração necessária para capturar 50% dos radicais...................... 105 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Relação de fases móveis para análise de frações obtidas em 3.2CCteste. .................................................................................................................................. 36 Tabela 2 Condições cromatográficas avaliadas no desenvolvimento de método em UPLC-UV................................................................................................................... 40 Tabela 3 Massa(mg) das frações coletadas em 3.2CC ............................................ 49 Tabela 4 Dados espectrométricos de RMN obtidos para a cordialina A (substancia 3) em 300 MHz para 1H e 75 MHz para 13C, em CDCl3. ................................................ 56 Tabela 5 Dados espectrométricos de RMN obtidos para a (Z)-cordialina A (substancia 4) em 300 MHz para 1H, em CDCl3. ....................................................... 59 Tabela 6 Dados espectrométricos de RMN obtidos para 4’,5-dihidroxi-2’,3,5’,6,7- pentametoxiflavona ou 2’,5-dihidroxi-3,4’,5’,6,7-pentametoxiflavona (sustância 1) em 300 MHz para 1H e em 75 MHz para 13C, em CDCl3. ............................................... 61 Tabela 7 Dados espectrométricos de RMN obtidos para artemetina (substancia 2) em 300 MHz para 1H e para 13C, em CDCl3. ............................................................. 63 Tabela 8 Leituras, em triplicata, das absorbâncias a 540 nm dos extratos de C. verbenacea no ensaio de determinação de açúcares redutores. .............................. 65 Tabela 9 Dados de precisão e exatidão do ácido rosmarínico para o método analítico. .................................................................................................................... 82 Tabela 10 Valores de CE50 para as diferentes amostras em diferentes ensaios de atividade antioxidante (DPPH, O2 - e HOCl/OCl―), e do controle positivo (quercetina). Valores expressos em µg/mL. ............................................................ 105 Tabela 11 Porcentagem de inibição das amostras e controles positivos sobre as enzimas COX e sobre sPLA2, e respectivos CI50. ................................................... 106 LISTA DE ABREVIATURAS AcOEt: acetato de etila MeOH: metanol AINE: anti-inflamatório não-esteroidal ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária C18: sílica octadecilsilano CC: cromatografia em coluna CCD: cromatografia em camada delgada HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência UPLC: cromatografia líquida de ultra eficiência DAD: detector de arranjo de diodos UV: detector ultravioleta/visível HPLCprep: (cromatografia líquida de alta eficiência preparativa) COX: ciclo-oxigenase COX-1: ciclo-oxigenase tipo 1 COX-2: ciclo-oxigenase tipo 2 CQA: Controle de qualidade alto d: dupleto dd: duplo dupleto DMSO: dimetilsulfóxido EEt: extrato etanólico EEtOH: extrato hidroetanólico 70% ERO: espécie reativa de oxigênio ERN: espécie reativa de nitrogênio HPF: horas pós fecundação OLE-HPLC: cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a sistema de extração sob alta pressão (online extraction). PLA2: fosfolipase A2 PGE2: prostaglandina E2 RMN: ressonância magnética nuclear PDA: ou DAD, detector de arranjo de diodos. s: simpleto SUMÁRIO 1 Introdução ........................................................................................................ 16 1.1 Espécies vegetais e importância de seus usos no restabelecimento da saúde .. 17 1.2 Metabolismo secundário...................................................................................... 17 1.3 Cordia verbenacea DC. ....................................................................................... 19 1.4 Atividade antioxidante e produtos naturais .......................................................... 25 1.4.1 Ensaios in vitro com espécie radicalar e espécies reativas de oxigênio (ERO) ............................................................................................................................... 26 1.4.1.1 Radical DPPH ............................................................................................... 26 1.4.1.2 Ânion radicalar superóxido (O2 -.) ................................................................... 26 1.4.1.3 Peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO.) ................................ 27 1.4.1.4 Ácido hipocloroso (HOCl) .............................................................................. 27 1.5 Atividade anti-inflamatória e produtos naturais .................................................... 28 1.6 Ensaios com animais alternativos: embriões de zebrafish .................................. 29 1.7 Abordagens em Química Verde: online extraction coupled to liquid chromatography analysis (OLE-HPLC, OLE-UPLC) e uso de solventes verdes ....... 31 2 Objetivos .......................................................................................................... 33 2.1 Objetivo geral ...................................................................................................... 33 2.2 Objetivos específicos .......................................................................................... 33 3 Materiais e métodos......................................................................................... 33 3.1 Obtenção e preparo do material vegetal ............................................................. 33 3.2 Análises cromatográficas .................................................................................... 34 3.3 Fracionamento de EEt ......................................................................................... 34 3.3.1 Fracionamento de 3.2 em menor escala (3.2CCteste) e análise por CCD ... 35 3.3.2 Fracionamento de 3.2 em maior escala (3.2CC) e análise por HPLC-UV .... 36 3.4 HPLC semi-preparativo das frações de 3.2CC .................................................... 37 3.5 Precipitação na fração 3.2EFS e HPLC semi-preparativo ................................... 37 3.6 OLE-HPLC .......................................................................................................... 38 3.7 Desenvolvimento de método em UPLC-UV (método convencional e OLE) ........ 39 3.7.1 Validação do método em UPLC-UV .............................................................. 42 4 Determinação estrutural dos metabólitos secundários .................................... 43 4.1 Ressonância Magnética Nuclear ......................................................................... 43 5 Determinação de açúcares redutores com DNS .............................................. 43 6 Determinação de compostos fenólicos totais ................................................... 44 7 Ensaio de embriotoxicidade em zebrafish ....................................................... 44 8 Atividade antioxidante ...................................................................................... 44 8.1 Ensaio com DPPH ............................................................................................... 44 8.2 Ânion radicalar superóxido (O2―•) ....................................................................... 45 8.3 HOCl/OCl― .......................................................................................................... 46 9 Atividade anti-inflamatória ................................................................................ 46 9.1 Inibição da atividade de cicloxigenase 1 e cicloxigenase 2 através de ensaio in vitro ........................................................................................................................... 46 9.2 Inibição da atividade da fosfolipase A2 do grupo V recombinante humana (sPLA2) através de ensaio in vitro ............................................................................. 47 10 Resultados e discussão ................................................................................. 47 10.1 Seleção da fração de EEt utilizada para a obtenção das substâncias purificadas. ................................................................................................................ 47 10.1.1 Cromatografia em coluna ............................................................................... 48 10.1.2 HPLC semi-preparativa .................................................................................. 52 10.1.3 Isolamento de substância por precipitação .................................................... 54 10.1.3.1 HPLC semi-preparativo com o precipitado .................................................. 55 10.4 Determinação estrutural .................................................................................... 56 10.4.1 Substâncias 3 e 4 ........................................................................................ 56 10.4.2 Substancia 1 e substancia 2 ....................................................................... 60 10.5 Determinação do teor de açúcares redutores em EEtOH e EEt ........................ 64 10.6 Determinação do teor de compostos fenólicos totais ........................................ 65 10.7 OLE-HPLC ........................................................................................................ 66 10.8 Desenvolvimento de método em UPLC-UV ...................................................... 69 10.8.1 Comparação dos métodos cromatográficos verdes desenvolvidos com o método convencional de análise de folhas de erva-baleeira, utilizando a métrica Agree (Analytical Greeness Metric)........................................................................ 76 10.8.2 Validação do método em UPLC-UV ............................................................ 79 10.8.2.1 Linearidade .................................................................................................. 79 10.8.2.2 Exatidão e Precisão..................................................................................... 82 10.8.2.3 Sensibilidade ............................................................................................... 83 10.8.2.4 Seletividade ................................................................................................. 83 10.8.2.5 Quantificação do ácido rosmarínico ............................................................ 84 10.9 Desenvolvimento de método em OLE-UPLC-UV .............................................. 85 11 Embriotoxicidade em zebrafish ............................................................................ 90 12 Ensaios antioxidantes .................................................................................... 96 12.1 Ensaio com o DPPH ........................................................................................ 96 12.2 Ânion radical superóxido (O2 -) .......................................................................... 99 12.3 HOCl/OCl― ...................................................................................................... 103 13 Avaliação in vitro da atividade anti-inflamatória ........................................... 106 14 Conclusões .................................................................................................. 107 Referências ....................................................................................................... 109 Apêndices...........................................................................................................116 16 1 Introdução A justificativa para a propositura deste trabalho foi embasada na literatura e em recentes estudos desenvolvidos pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Farmacognosia da FCF-Unesp envolvendo os extratos de folhas de C. verbenacea etanólico (EEt) e hidroetanólico 70% (EEtOH), sendo que EEtOH apresentou ação antioxidante e teores de compostos fenólicos e flavonoides superiores aos extratos etanólico e o aquoso (ROMÃO, 2016). O EEtOH foi capaz de capturar, in vitro, os radicais DPPH. e ABTS+., e inibir a ação oxidante de outras espécies reativas presentes no organismo como O2-., ROO., HOCl e H2O2. O O2 é essencial a vida e uma pequena quantidade dele pode ser convertida em ERO. As ERO tem importantes funções de regulação metabólica e nas defesas contra infecções. No entanto, condições em que a produção de ERO excede a capacidade do organismo de se proteger podem gerar danos e comprometer a homeostase das biomoléculas. Desta forma, a inflamação pode se relacionar ao estresse oxidativo, uma vez que as células do sistema imune podem produzir ERO em excesso como resposta frente a uma doença inflamatória (BAYNES; DOMINICZAK, 2010). Os resultados obtidos por Romão (2016) sugeriram os flavonoides e compostos fenólicos como responsáveis pela pronunciada atividade antioxidante. Com relação às análises químicas, foram identificadas e quantificadas nos extratos 4´,5-dihidroxi-2´,3,5´,6,7-pentametoxiflavona, cordialina A e (Z)-cordialina A. Porém, tais substâncias apresentaram baixo teor (m/m) neste extrato (0,66%, 0,67% e 0,12%, respectivamente), sugerindo que há outras substâncias responsáveis por tal atividade. Estes resultados e o uso popular da erva-baleeira ilustram a necessidade de aprofundamento do estudo fitoquímico da espécie associado as suas atividades anti-inflamatória e antioxidante. Em complementação aos métodos instrumentais de análise química, os ensaios in vitro propiciam a triagem das atividades biológicas que substâncias ou derivados vegetais possam apresentar, embasados no uso tradicional ou mesmo em relatos de literatura. A partir daí, mecanismos de ação podem ser investigados e medicamentos desenvolvidos (YUNES; CECHINEL FILHO, 2014). Portanto, em linhas gerais, o presente trabalho propôs o isolamento, a purificação e identificação dos componentes majoritários do extrato EEtOH, a avaliação das atividades 17 antioxidante e anti-inflamatória dos componentes isolados e, também, a análise cromatográfica por OLE-HPLC e OLE-UPLC e a verificação do potencial embriotóxico através de ensaios em embriões de zebrafish. Neste trabalho foram atendidos princípios da química verde no desenvolvimento de métodos cromatográficos. O resumo gráfico das etapas do trabalho está no Apêndice 1. 1.1 Espécies vegetais e importância de seus usos no restabelecimento da saúde A diversidade dos metabólitos secundários produzidos pelas espécies vegetais acompanha um largo portfólio de estruturas químicas geralmente complexas que são alvos de estudo e fontes para o desenvolvimento de novos tratamentos de afecções e também para a manutenção do bem-estar físico como um todo (EFFERTH et al., 2011). Desta forma, as substâncias de origem vegetal e seus derivados sintéticos integram grande parcela dos medicamentos disponíveis na terapêutica, além de serem abundantemente utilizados pela população, que também faz o uso tradicional das plantas medicinais na forma de chás ou garrafadas, por exemplo (NEWMAN; CRAGG, 2020; LIMA et al., 2008). Esta realidade evidencia a importância do estudo para avaliação do potencial terapêutico, segurança e composição química das espécies vegetais utilizadas com fins medicinais. 1.2 Metabolismo secundário O metabolismo secundário, diferentemente daquele dito primário cujas funções são produção energética e biossíntese de substâncias, diz respeito a micromoléculas produzidas em menor escala, com especificidade e funções adaptativas. O metabolismo secundário é construído a partir do metabolismo primário, tendo o fornecimento de energia e metabólitos intermediários para o seu desenvolvimento a partir dos processos de glicólise, ciclo de Krebs e ciclo das pentoses-fosfato, conforme exposto na Figura 1. Isto é bem embasado quando analisada a complexidade estrutural das moléculas e uma biossíntese programada por muitos pares de bases de DNA, despendendo alta taxa metabólica para perdurar frente à seleção natural (WILLIAMS et al., 1989). 18 Figura 1 Correlação entre metabolismo primário e metabolismo secundário. Os intermediários representantes das principais vias dos metabólitos secundários estão em círculos tracejados. Suas principais vias de produção são as vias do ácido chiquímico, ácido mevalônico, metileritritol (ou deoxixilulose) e do acetato. A via do chiquimato e a via do acetato se relacionam à grande classe dos alcaloides, taninos e flavonoides (compostos fenólicos). A via do mevalonato e da deoxixilulose se relacionam aos terpenos. Metabólitos secundários podem ser produzidos por mais de um órgão da planta, podem ser translocados e geralmente são armazenados em vacúolos quando hidrofílicos, ou em estruturas secretoras (tricomas secretores, cavidades e canais secretores) ou associados a outros componentes mais hidrofóbicos (ex. membranas fosfolipídicas) quando possuem característica mais lipofílica. Sua 19 produção sofre influência das exigências do ambiente e, portanto, os perfis químicos das plantas podem variar de acordo com o ciclo circadiano ou sazonal, idade, necessidades relacionadas a sobrevivência e perpetuação da espécie (fatores ambientais), características genéticas e nas diferentes partes do vegetal. Ao final, serão utilizados ou apenas degradados (GOBBO-NETO et al., 2007; SIMÕES et al., 2017). 1.3 Cordia verbenacea DC. Popularmente conhecida como erva-baleeira, caatinga-de-barão, maria-preta e maria-milagrosa, Cordia verbenacea DC., cujas sinonímias são Varronia curassavica (Jacq) e Cordia curassavica (Jacq.) Roem. & Schult são amplamente empregadas, é nativa do Brasil e pertencente à família Boraginaceae (Figura 2). A espécie consta no Formulário de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira, com sugestão do uso da infusão da folha seca (3 g) em água (q.s.p 150 mL) para uso extemporâneo na forma de compressas na região afetada, ou na forma de gel, a partir do extrato hidroetanólico 70% (10 mL) em gel base (q.s.p 100 g), ambas preparações como auxílio no alívio de sintomas inflamatórios localizados (BRASIL, 2021). Ainda a respeito do Formulário, dentre as advertências está o uso não recomendado das preparações da espécie em gestantes e lactantes, o que reforça a questão da avaliação da embriotoxicidade que será abarcada neste trabalho, em decorrência da falta de dados sobre segurança nesses casos. A C. verbenacea também integra a Relação de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS, uma lista criada a partir do Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos que elenca espécies com potencial para gerar produtos de interesse ao SUS, e é norteada pela melhoria da atenção à saúde, uso sustentável da biodiversidade, geração de renda, desenvolvimento tecnológico e por outros princípios (BRASIL 2006). Trata-se de um arbusto perene de no máximo 3 m, com folhas simples, alternas, coriáceas e aromáticas, pequenas flores de corolas brancas e reunidas em inflorescências escorpioides e vistosas (Figura 3). 20 Figura 2 Espécimes de Cordia verbenacea DC. (campo experimental do CPQBA-Unicamp, Paulínia-SP). Fonte: Autor. Figura 3 Em detalhe, ramo florido de Cordia verbenacea DC. (Fonte: PEREIRA 2017). Seu óleo essencial (OE), extratos hidroetanólico e etanólico de partes aéreas tem sido relatados na literatura recente por suas atividades antioxidante, antiulcerogênica e anti-inflamatória (MEDEIROS et al., 2007; ROLDAO et al., 2008; SANTI et al., 2014). 21 Estudos fitoquímicos realizados com a espécie já identificaram triterpenos cordialina A e B, (Z)-cordialina A (cis-cordialina A), as isoflavonas 7,4’- diidroxi-5’- carboximetóxi isoflavona e 7,4’-diidroxi-5’-metil isoflavona, 4’,5-diidroxi-2’,3,5’,6,7- pentametoxiflavona,5,6´-diidróxi-3,6,7,3´,4´-pentametoxiflavona (LINS et al., 19801), além da artemetina (flavonol) e do ácido rosmarínico (derivado do ácido cinâmico) que apresentam ação anti-inflamatória (VELDE et al., 1982; BAYEUX et al., 2002; SERTIE et al., 1990; MATOS et al., 2015; PEREIRA 2017; Martim et al., 2021). O OE contém monoterpenos e sesquiterpenos, sendo o α-pineno seu principal constituinte, além da presença de (E)-cariofileno, aloaromadendreno e α-humuleno (Figura 4). O medicamento fitoterápico Acheflan®, indicado como anti-inflamatório tópico, contém o OE das folhas de C. verbenacea como insumo farmacêutico ativo e como marcador ativo o α-humuleno (LAMEIRA et al., 2009; DE CARVALHO JR. et al., 2004; LINS et al., 1980; ROLDÂO, 2008; SERTIE et al., 1990; VELDE et al., 1982; ACHE, 2015). 22 Figura 4 Estruturas químicas dos principais representantes de cada classe de metabólitos secundários presentes da C. verbenacea . Em 1991, Sertié e demais autores (SERTIÉ et al., 1991) demonstraram a atividade anti-inflamatória do extrato etanólico 70% das folhas em diferentes modelos experimentais (edema induzido por nistatina e dermatite induzida por óleo de cróton), e efeito protetor da mucosa gástrica. Em estudo realizado por Sertié et al. (2005), a administração tópica do extrato etanólico 70% inibiu o edema em ratos Wistar Hanover induzido por nistatina proporcionalmente às doses utilizadas. Ribeiro e demais autores (2011) concluíram que a administração sistêmica (por via oral) do OE ou do extrato etanólico de hastes e folhas secas são opções para tratamento de doenças inflamatórias, especialmente as que apresentam um perfil crônico, tendo 23 apresentado diminuição da perda óssea na periodontite induzida por ligadura em ratos. As observações sobre as atividades anti-inflamatórias dos extratos e do OE podem ser consequência da presença de metabólitos secundários tais como flavonoides, ácido rosmarínico e sesquiterpenos. Apesar da baixa polaridade dos sesquiterpenos ativos do OE, os mesmos podem ser extraídos com etanol e estarem presentes em extratos de partes aéreas de C. verbenacea. Ademais, um ponto a ser retomado nesta introdução diz respeito à presença de ácido rosmarínico e de artemetina em extratos de C. verbenacea. O ácido rosmarínico é comumente relatado na família Boraginaceae. As principais atividades biológicas relatadas e relacionadas com a substância são antioxidante, anti- inflamatória e antibacteriana (PETERSEN; SIMMONDS, 2003). De acordo com Lee e colaboradores (2006), o seu efeito anti-inflamatório está provavelmente relacionado a redução na expressão de genes promotores de NF-κ B. Com relação à presença do ácido rosmarínico, em tinturas de C. verbenacea , observou-se a presença deste composto e sua maior quantidade em períodos de chuva, tendo diminuído em 12,05% a quantidade em maio (2 mm de precipitação) com relação a março que teve 20 mm de precipitação (MATOS et al., 2015). Não obstante, o ácido rosmarínico obtido a partir de extrato metanólico de C. verbenacea foi avaliado em ensaios de edema de pata induzidos por veneno de Bothrops jararacussu, que possui uma mistura complexa que inclui a presença de fosfolipase A2 (TICLI et al., 2005). O extrato metanólico das folhas foi mais eficiente na redução do edema comparado ao ácido rosmarínico, sugerindo que outros compostos ativos podem ter somado atividades no extrato metanólico. Ainda neste estudo, os dados obtidos sugeriram que o ácido rosmarínico interagiu mais especificamente com fosfolipases básicas através de prováveis interações eletrostáticas. Tanto o extrato metanólico quanto a fração rica em ácido rosmarínico reduziram os efeitos inflamatórios nos animais. No tocante a artemetina, outra substância cuja presença foi verificada em C.verbenacea, Sertié et al. (1990) indicaram ser a pentametoxiflavona em foco o marcador da atividade anti-inflamatória de C. verbenacea em modelos de estudo em ratos (granuloma induzido por corpo estranho e edema induzido por carragenina), que demonstraram a redução do edema de pata além de reduzir a permeabilidade vascular causada pela indução intracutanea de histamina tal como outros agentes não esteroidais disponíveis, à exemplo do ácido acetilsalicílico. Ainda neste estudo, 24 a artemetina se mostrou pouco tóxica de maneira geral, sendo que ratos tratados com 44 e 100,6 mg.kg-1, por via oral não demonstraram alterações significativas no consumo de água, alimentos e no peso corporal, além de não indicarem alterações macroscópicas em rins, fígado, baço e estomago. Conquanto, pesquisa dirigida por Bayeux et al. (2002) não atribuiu à artemetina a redução da atividade inflamatória observada com o extrato diclorometano das folhas e caules de C. curassavica, sugerindo não ser esta a principal substância relacionada a atividade e contradizendo o proposto no estudo anteriormente citado (SERTIÉ et al., 1990). De tal modo, os achados da literatura com relação à artemetina, presente em nossa espécie de estudo, despontam a sugerir uma busca mais refinada a cerca de tal composto em extratos e suas atividades. O fato do extrato etanólico de folhas de C. verbenacea apresentar tanto atividade anti-inflamatória quanto antiulcerogênica (ROLDÃO et al., 2008) destaca V. curassavica e seus metabólitos secundários (ex. artemetina e ácido rosmarínico) como interessantes opções para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas, pois uma das principais restrições para o uso contínuo dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINE) é justamente o aparecimento de úlceras pépticas (BRUNTON; LAZO; PARKER, 2011; RANG et al, 2011). Apesar da reiterada menção na literatura da atividades anti-inflamatória da erva-baleeira, ainda pouco se relatou sobre a atividade antioxidante e sua composição química com relação aos metabólitos secundários não voláteis de extratos. Além disso, seu uso popular na forma de extratos hidroetanólico e etanólico sugere a realização de estudos fitoquímicos para identificação destes componentes, incluindo o isolamento e/ou a determinação estrutural de substâncias com o uso de técnicas hifenadas (ex. HPLC-DAD, HPLC-EM, HPLC-RMN). Tais metabólitos secundários isolados podem ter suas ações biológicas avaliadas, conforme também proposto em nosso trabalho. Do ponto de vista citotóxico, o extrato etanólico 70% não agiu interferindo a formação óssea de ratos e sua prole, nem a maturidade sexual ou a fertilidade (SERTIÉ et al., 2003). As partes aéreas ou folhas da espécie são popularmente utilizadas na forma de “garrafadas” para tratamentos contra infecções, úlceras gástricas, dores e reumatismo (DE CARVALHO JR. et al., 2004; PASSOS et al., 2006), bem como em 25 Farmácias Vivas como a de Jurucê-SP, que reforça a importância acerca do estudo de extratos etanólicos e hidroetanólicos (PEREIRA et al., 2014). 1.4 Atividade antioxidante e produtos naturais Nos últimos anos, a busca por produtos naturais com atividade antioxidante tem sido pertinaz, dado que o desequilíbrio entre as espécies reativas e os antioxidantes contribuem para a excessiva geração de espécies reativas, levando ao estresse oxidativo. O excesso de reações com substratos biológicos pode desencadear danos às biomoléculas, a exemplo do material genético, cujo estresse oxidativo pode colaborar no desencadeamento da oncogênese, ou a oxidação de lipídeos que pode instigar o processo de aterosclerose e, consequentemente seus problemas secundários tais quais trombose ou infarto do miocárdio (RANG-DALE et al., 2011; BAYNES et al., 2015). O oxigênio está envolvido na fosforilação oxidativa, reações de hidroxilação e oxigenação, sendo que, uma fração residual se converte em espécies reativas de oxigênio (ERO). As ERO compreendem, entre outros, os radicais ânion superóxido (O2 -.), peroxila (ROO.) e hidroxila (HO.), e derivados não radicalares como peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singlete (1O2) e ácido hipocloroso (HOCl). ERO podem ser substratos para enzimas atuarem na regulação do metabolismo e nas defesas contra agentes infecciosos. As espécies reativas de nitrogênio (ERN), por exemplo o peroxinitrito (ONOO-), também possuem suas funções na regulação metabólica e renovação de biomoléculas (BAYNES; DOMINICZAK, 2015). No entanto, ERO e ERN podem causar danos quando em quantidades excessivas e que superem a capacidade das defesas antioxidantes de protegerem os tecidos, levando ao estresse oxidativo, que é típico de processos inflamatórios em que as células do sistema imunológico produzem as espécies em resposta a doenças e elas podem causar danos em proteínas, lipídios e DNA. Além disto, espécies reativas estão envolvidas em patologias como Alzheimer, Parkinson e câncer (DURACKOVA, 2010; MATTILA et al., 2015). Existem fontes exógenas naturais de antioxidantes e que incluem compostos fenólicos como flavonoides, antocianinas e ácidos fenólicos, além de carotenoides e vitaminas, dentre outros. Um clássico exemplo é a quercetina (flavonol), que influencia vias de transdução de sinal relacionadas a atividade antioxidante, enzimas 26 e produção de espécies reativas de oxigênio, além de apresentar ação antirradicalar (XU et al., 2019). 1.4.1 Ensaios in vitro com espécie radicalar e espécies reativas de oxigênio (ERO) 1.4.1.1 Radical DPPH O DPPH. ou radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila é um radical livre detentor de estabilidade em decorrência de seu efeito ressonante (duplas alternadas nos anéis benzênicos). Sua captura em ensaios antioxidantes gera a redução em sua estrutura (Figura 5), sendo o elétron desemparelhado do nitrogênio atrelado a um elétron cedido por um antioxidante, modificando a coloração púrpura, típica do DPPH não reduzido, para amarela, proporcionalmente ao grau de redução observado; tal mudança pode então ser avaliada fotometricamente (MOLYNEUX, 2004; SHARMA et al., 2009). Figura 5 Reação de redução do DPPH. na presença de um antioxidante. 1.4.1.2 Ânion radicalar superóxido (O2 -.) O ânion radicalar superóxido é bastante reativo e participa de diversas atividades biológicas. A partir de sua redução pode ser formado o radical hidroperoxila, ainda mais reativo (figura 6, reação 1), em pH 7,0, a partir de reação de protonação. Ambos radicais interagem com moléculas biológicas como ácidos nucleicos, proteínas e lipídeos, provocando danos. O radical livre formado é causa de danos teciduais, porém é importante para os fagócitos uma vez que é produzido durante a ativação desses na defesa do organismo. Biologicamente estes mecanismos são controlados pelas defesas antioxidantes naturais (MATTILA et al., 27 2015). Como exemplo deste mecanismo, pode ser citada a indução de enzimas superóxido dismutase, que reduzem a concentração de ânion radicalar superóxido catalisando a formação de peróxido de hidrogênio e oxigênio (Figura 6, reação 2). Figura 6 Formação do radical hidroperoxila por protonação (1), e formação de peróxido de hidrogênio e de oxigênio por reação de enzima superóxido dismutase (SOD) a partir do ânion radicalar superóxido (2). 1.4.1.3 Peróxido de hidrogênio (H2O2) e radical hidroxila (HO.) O peróxido de hidrogênio se trata de uma espécie química mais estável do que as anteriores, e suas funções incluem a sinalização celular contra patógenos. Apesar de sua baixa reatividade, pode ser convertido a ERO mais danosas, tais como o radical hidroxila. Por definição, não se trata de um radical livre, mas atravessa membranas celulares e favorece a formação do radical hidroxila, que é danoso aos tecidos (BARREIROS et al., 2006). O radical hidroxila tem um intenso potencial danoso ao sistema biológico uma vez que seu elétron desemparelhado pode aceitar facilmente outro da região eletrônica vizinha (MATTILA et al, 2015). Este radical se forma a partir de reações entre H2O2 e O2 •- (figura 7, reação 1), ou entre H2O2 e metais de transição (figura 7, reação 2), como ilustrado abaixo: Figura 7 Reação de formação do radical hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio e do ânion radicalar superóxido (1) e formação do radical hidroxila a partir da reação do peróxido de hidrogênio com meta de transição, Fe2+ (2). 1.4.1.4 Ácido hipocloroso (HOCl) O HOCl é formado no processo inflamatório a partir de neutrófilos que se infiltram nos tecidos, se ativam e formam os fagossomas. Por sua vez, na presença de H2O2, o HOCl é produzido nos neutrófilos quando íons Cl- são oxidados pela hemeproteína presente em neutrófilos e monócitos chamada mieloperoxidase (MPO), conforme a figura (figura 8) abaixo: 28 Figura 8 Formação de ácido hipocloroso a partir de peróxido de hidrogênio pela oxidação de íons cloro na presença de mieloperoxidase (MPO). 1.5 Atividade anti-inflamatória e produtos naturais A inflamação é a resposta fisiológica normal do organismo à infecção ou lesão tecidual que permite que o indivíduo sobreviva às adversidades do meio e que mantenha a homeostase dos tecidos sob diversas condições nocivas, tais como vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e recrutamento de células e liberação de mediadores citotóxicos, inflamatórios e quimiotáticos (RANG-DALE et al., 2011; BAYNES et al., 2015). A inflamação é caracterizada como um processo desencadeado nas injúrias teciduais e na resposta às infecções, seja no intuito de erradicar microrganismos, agentes irritantes ou, ainda, facilitar a reparação tecidual. Possui como sinais clássicos rubor, calor, edema, dor e perda de função, decorrentes da liberação de mediadores químicos. Mediadores como a histamina, serotonina, bradicinina e prostaglandinas desencadeiam a fase aguda, que é caracterizada por aumento da permeabilidade vascular e infiltração celular, o que leva ao inchaço devido ao extravasamento de fluidos. Células fagocitárias, à exemplo dos neutrófilos, são atraídas quimicamente para o foco inflamatório por prostaglandina E2, leucotrienos, citocinas, componentes do sistema complemento, e outras moléculas liberadas por células de defesa envolvidas no processo inflamatório. Além disso, os micro- organismos contra quem o sistema imunológico se defende, também liberam moléculas quimioatraentes (RANG-DALE et al., 2011; BAYNES et al., 2015). O processo de infiltração celular e reações bioquímicas envolvidas levam a produção de radicais livres, correlacionando o processo inflamatório à atividade oxidante, sendo, portanto, inoportuno que ocorra de forma descontrolada, uma vez que pode gerar resultados danosos ao tecido inflamado. Neutrófilos quando ativados em áreas de inflamação sofrem alterações que resultam na formação de ERO. Quando em excesso, estas alterações podem se relacionar com o aparecimento de processos degenerativos das inflamações crônicas e diversas patologias (SUZUKI; CHOW; DOWNEY, 2008; WRIGHT et al., 2010). 29 Há vários medicamentos anti-inflamatórios inibidores das enzimas cicloxigenase 1 e/ou 2 disponíveis no mercado para o tratamento de dores agudas ou crônicas, tendo atividades anti-inflamatórias, analgésicas e antipiréticas, e existem, ainda, os anti-inflamatórios esteroidais, comuns no tratamento de doenças reumáticas, com riscos de uso a longo prazo que incluem retenção hídrica, osteoporose e outros, enquanto que o uso indiscriminado de AINEs podem levar a problemas renais, gastrointestinais, hepáticos e outros mais (SILVA et al., 2019). As espécies vegetais possuem a capacidade de síntese de uma grande variedade de metabólitos secundários, incluindo aqueles com habilidade para agirem como anti-inflamatórios. Curcuma longa L., por exemplo, regula o processo inflamatório em várias vias, incluindo a redução da ativação de citocinas pró- inflamatórias, interferência em vias importantes de sinalização e inibição da liberação de prostaglandinas através do bloqueio da via de ácido araquidônico (TASNEEM et al., 2019). Uma grande classe de notório destaque no que diz respeito a atividade em pauta é a dos flavonoides, como os flavonóis kaempferol, rutina, quercertina, flavanois como a hesperidina, flavonas como a luteolina e muitos outros descritos por atuarem modulando a produção de citocinas pró-inflamatórias, interferindo na via do ácido araquidônico, modulação da óxido nítrico sintase, dentre outros (COUTINHO et al., 2009). 1.6 Ensaios com animais alternativos: embriões de zebrafish Ensaios com animais alternativos permitem uma triagem a respeito da toxicidade e de suas consequências de maneira mais preditiva que ensaios convencionais de contaminantes (NOYES et al, 2016). Os ensaios com zebrafish abarcam princípios da química verde e dela fazem parte, seja pela praticidade, uso reduzido de reagentes e tempo de resposta, além da aplicabilidade em segurança química, podendo ser utilizado para caracterizar os efeitos biológicos de substâncias que podem agir negativamente na busca pela química sustentável (NOYES et al, 2016). Zebrafish (Danio rerio), popularmente também conhecido por paulistinha, é um peixe de água doce originário da Ásia e pertence à família dos Cyprinidae. Os ensaios com seus embriões são importantes ferramentas disponíveis para os estudos de prospecção de fármacos e produtos naturais bioativos através, por exemplo, da observação do efeito tóxico e do mecanismo de ação, além de estudos 30 de impactos ambientais de moléculas ou estudos em genética química (MAES et al., 2012). O desenvolvimento do embrião de zebrafish até a formação da larva jovem se dá, em média, em 72h. Após a fecundação, em menos de 1h o zigoto sofre clivagem e, até a quinta hora já passou pelo estágio de blástula seguindo para a etapa de gástrula. Na décima hora, no período de segmentação, pode ser notada a presença de somitos, que são importantes para a formação do corpo e organização do sistema nervoso periférico. Também ocorre o desenvolvimento de neurômeros e o aparecimento da cauda. Após a organogênese, em 24h se tem a formação do saco vitelino, responsável pela nutrição do embrião, e o aparecimento de pigmentação e circulação. Em 48h, a rápida morfogênese é concluída e ocorre a eclosão do ovo. Em 72h, a bexiga natatória infla e a larva começa a ter comportamentos ativos de prevenção e sobrevivência (KIMMEL et al., 1995). Diante da tendência científica em reduzir o número de animais mamíferos sacrificados em experimentos, o zebrafish surge como um modelo animal alternativo que permite a observação de parâmetros de toxicidade pela transparência no estágio embrionário e larval e fornecem resultados consideráveis por envolver processos de absorção, metabolização e excreção. Além disso, a experimentação com embriões de zebrafish possui menos restrições éticas, menor custo de manutenção e mais rapidez para aquisição de resultados quando comparamos com a utilização de modelos mamíferos (BHUSNURE et al., 2015). Além disso, cerca de 70% dos genes humanos tem ao menos um ortólogo do zebrafish, ou seja, possuem ancestral comum apesar de serem de espécies diferentes, e possuem a mesma função (HOWE et al 2013). De acordo com a OCDE (2013), fenótipos de malformação e toxicidade podem ser analisados em até 96h pós fertilização (hpf). A coagulação do embrião (Figura 9A) representa sua total inviabilidade, apresentando inclusões escuras na célula. Além disso, fenótipos de malformação podem ser observados, como por exemplo a malformação de saco vitelínico (Figura 9B), curvatura de coluna e edema de pericárdio (Figura 9C), ausência de botão do olho e não descolamento da cauda (Figura 9D). 31 Figura 9 Fenótipos de malformação em zebrafish. (A) Embrião coagulado. (B) Embrião com 48hpf com edema de saco vitelínico (*) e formação distinta de somitos. (C) Embrião com 96hpf sem a presença de somitos (→), com escoliose e edema de pericárdio (*). (D) Ausência do botão do olho (*) e não descolamento da cauda (→) no embrião com 96hpf. Fonte: OCDE, 2013. 1.7 Abordagens em Química Verde: online extraction coupled to liquid chromatography analysis (OLE-HPLC, OLE-UPLC) e uso de solventes verdes O OLE-HPLC/OLE-UPLC se trata de um sistema de extração sob alta pressão de matriz sólida acoplada em série. Neste sistema, matrizes sólidas, à exemplo das partes das plantas, tecidos de animais, solos e outras, podem ser analisadas pela inserção direta da amostra no sistema, dispensando as etapas de pré-tratamento e incluindo o processo de extração com os solventes do método cromatográfico a ser empregado na análise (FERREIRA et al., 2016). Dentre outras vantagens do sistema otimizado estão inclusas apenas o uso de peças, tais quais bombas e válvulas, próprias dos equipamentos HPLC e UPLC, holders e cartuchos vazios de colunas de guarda, sílica e filtros de membrana (FERREIRA et al., 2016). O sistema traz consigo a celeridade do processo científico e vai ao encontro da tendência mundial em Química Verde por dispensar etapas como obtenção de extrato, secagem, moagem de material vegetal e pré-tratamento de amostras (diluição, extração em fase sólida, secagem, solubilização e filtração) para injeção em HPLC (FERREIRA et al, 2016). É uma ferramenta que economiza solventes e valoriza a prevenção do desperdício, o uso da química com pouca ou nenhuma toxicidade aos seres vivos e ao meio ambiente e evita o uso de solventes e outros auxiliares tóxicos sempre que possível (ABDUSSALAM-MOHAMMED et al, 2020). A química verde tem como base 12 princípios: prevenção de modo a evitar a produção de resíduos, economia de átomos através de metodologias adequadas, síntese de produtos menos perigosos, ou seja, atóxicos ou com baixa toxicidade para os seres vivos e o meio ambiente, desenho de produtos seguros, solventes e auxiliares mais seguros, eficiência energética, uso de fontes renováveis de matéria 32 prima, evitar a formação de derivados, catálise, desenho para a degradação dos produtos químicos, análise em tempo real para a prevenção da poluição e a química segura para a prevenção de acidentes (LENARDÃO et al., 2003). A possibilidade de substituição de solventes convencionais por solventes verdes para análise cromatográfica, a adaptação de métodos mais curtos para validação e quantificação e desnecessidade da etapa de preparo de amostras com solventes para análises químicas impulsionam a abordagem em química verde. O conceito de química verde envolve a percepção dos riscos relacionados ao uso de produtos químicos, com vistas a gerenciar o perigo e a exposição ao mesmo. Diante desta vertente, existe uma tendência de buscar solventes viáveis do ponto de vista ambiental, da saúde e da segurança nos processos. O etanol, por exemplo, é considerado um solvente verde, sendo biodegradável, menos tóxico para peixes, e sem grandes impactos para sua produção, ao contrário do que ocorre com o 1- propanol, bastante impactante na sua produção petroquímica (TOBISZEWSKI et al., 2017). O etanol é um solvente com propriedades similares a acetonitrila e ao metanol para análises cromatográficas, além de apresentar menor custo de descarte que os anteriores e menor partição com o ar, ou seja, menor toxicidade. As desvantagens são com relação ao limite de detecção do UV (210 nm) superior a metanol e acetonitrila e que podem gerar ruídos maiores na linha de base, mas que não interferem caso o analito tenha grupos com boa absorção no UV. Outra possível desvantagem é com relação a viscosidade, sendo necessários ajustes no sistema cromatográfico, como aumento da temperatura de análise ou redução da vazão, para que se mantenha uma pressão aceitável no sistema, utilização de sistemas ternários de solventes, ou o uso de sistemas com alta pressão, como o UPLC (PLOTKA et al., 2013; YABRÉ et al., 2018). Os álcoois 1-propanol, etanol, 1-butanol e tert-butil álcool ocupam os primeiros lugares no ranking de risco ao meio ambiente definido no trabalho de Tobiszewski et al. (2017), tendo os menores impactos e atendendo a princípios da química verde. Em contrapartida, metanol e acetonitrila, comumente utilizados em análises químicas cromatográficas, ocupam, respectivamente, as posições 33 e 31 do ranking composto por 78 solventes. 33 2 Objetivos 2.1 Objetivo geral Realizar um estudo fitoquímico e verificar a embriotoxidade de extratos, avaliar a atividade antioxidante e a atividade anti-inflamatória de metabólitos secundários. 2.2 Objetivos específicos  Isolar, purificar e identificar metabólitos secundários de EEt das folhas de C. verbenacea para posterior avaliação biológica ou quantificação;  Avaliar a atividade antioxidante in vitro (DPPH.,O2 -. e HOCl) dos extratos e de metabólitos secundários;  Avaliar a atividade anti-inflamatória in vitro de metabólitos secundários;  Avaliar a embriotoxicidade dos extratos empregando modelo animal alternativo com zebrafish.  Desenvolver e validar métodos em cromatografia líquida que atendam a princípios da Química Verde. 3 Materiais e métodos 3.1 Obtenção e preparo do material vegetal O material vegetal e EEt foram obtidos por PEREIRA (2017), do Lab. de Farmacognosia (FCF-UNESP; Fapesp 13/242989). EEtOH foi obtido por Romão (2016), a partir da mesma coleta. As folhas foram coletadas no CPQBA-UNICAMP (Paulínia-SP), coordenadas geogrnadaso - 22° 47' 52" S, -47° 6' 49" secas em estufa (3 dias, 40° C) e moídas em moinhos de facas. Os extratos hidroetanólico 70% (EEtOH) e etanólico (EEt) foram obtidos por remaceração em 3 etapas (com troca do líquido extrator) por 7 dias (1:15, m/v) e, após processo de secagem, mantido sob refrigeração em frasco vedado. Este trabalho está registrado no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) do Conselho de Gestão do Patrimônio Genético do Ministério do Meio Ambiente sob o número A55E317/2018 (Unesp, 48.031.918/0001-24). 34 3.2 Análises cromatográficas Para as análises em HPLC, os extratos, frações e substâncias purificadas foram submetidos a um pré-tratamento. As análises foram desenvolvidas por cromatografia líquida em modo reverso, utilizando colunas C18, inicialmente em condições de gradiente exploratório: 5-100% de metanol em 30 min, mais 100% de metanol por 5 min; vazão de 1,0 mL/min; detector do tipo DAD/UV-Vis ou UV; Vinj: 20 uL (modo analítico) ou 1 mL (modo preparativo). Quando necessário, aditivo foram adicionados à fase móvel (ex. ácido acético 1 %). A partir do resultado destas análises, foram desenvolvidos métodos em modo isocrático ou gradiente. O pré- tratamento de amostras consistiu em 10 mg de amostra dissolvidos em 1 mL de metanol/H2O 95:5 (v/v) e, posteriormente, submetida a uma EFS em cartucho SampliQ® (C18; 45 µm; 500 mg; 6 mL) previamente ativado com metanol e condicionado com metanol/H2O 95:5 (v/v). Após a aplicação da amostra no cartucho, efetuou-se eluição com 4 mL de metanol/H2O 95:5 (v/v). O eluato foi seco em capela e em dessecador com sílica gel, sob pressão reduzida, e solubilizado de acordo com a fase móvel a ser empregada na análise por HPLC. Em seguida, a solução foi filtrada em membrana PVDF (0,22 µm; PerkinElmer® PVDF Syring Filters) diretamente para vial de 2 mL. O pré-tratamento para a injeção em UPLC foi realizado com etanol ao invés de metanol, nas mesmas condições acima citadas. Nas análises por CCD, as placas utilizadas para o procedimento analítico foram confeccionadas em placa de vidro de 20x20 cm com camada de sílica gel G (Merck®) de 0,25 mm de espessura, para análises qualitativas, tendo sido utilizadas também placas de sílica gel em suporte de alumínio adquiridas comercialmente (20x20 cm, 15-40 µm, Fluka™ Analytical). Previamente às análises, as placas de sílica gel foram submetidas a aquecimento em estufa a 110°C por 1 h para a retirada de umidade que pudesse desativar grupamentos silanóis da sílica. Foram utilizados cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis, cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® PDA, UPLC Acquity® Waters UV/Vis e UPLC Shimadzu® PDA Nexera. 3.3 Fracionamento de EEt Para as técnicas de cromatografia em coluna (CC) e extração em fase sólida (EFS) o empacotamento, com sílica, das colunas de vidro utilizadas para os 35 processos de EFS e CC foi feito a seco. O volume morto foi medido experimentalmente através do acondicionamento da sílica e medição do volume do primeiro eluente a ser utilizado no procedimento. A fim de evitar desperdícios e estabelecer condições de separação adequadas, estas foram otimizadas em pequena escala para verificar o quão apropriado estava o método, verificando os resultados obtidos e então, se necessário, aprimorando as condições para, em seguida, reproduzir em maior escala. Inicialmente, o EEt seco foi submetido a uma extração em fase sólida (EFS). O procedimento foi realizado por PEREIRA (2017), da seguinte forma: 30 g de extrato seco foram misturados com a fase estacionária (1:1, m/m) e aplicados em coluna de vidro (h=12 cm, d=10 cm) contendo sílica gel (0,060-0,200 mm). A eluição (Veluente: 1800 mL) foi realizada sob vácuo como segue ordenado a seguir: 1. hexano/acetato de etila 8:2 (frações: EFS 1.1 e 1.2); 2. hexano/acetato de etila 6:4 (frações: EFS 2.1 e 2.2); 3. Acetato de etila (frações: EFS 3.1 e 3.2); 4. acetato de etila/metanol 90:10 (frações: EFS 4.1 e 4.2); 5. Metanol (frações: EFS 5.1 e 5.2). 3.3.1 Fracionamento de 3.2 em menor escala (3.2CCteste) e análise por CCD Inicialmente, a fração 3.2EFS foi escolhida para o fracionamento em menor escala (3.2CCteste). Para isto, 50 mg foram parcialmente dissolvidos no eluente 1 (hexano/acetato de etila 6:4), tendo se formado um precipitado amarelo, que foi colocado, juntamente com a parte solúvel, em coluna de vidro (dcol=1 cm) contendo sílica gel (0,040-0,063 mm; h= 20 cm). A eluição foi realizada sob pressão (Veluente: 50 mL) da seguinte maneira: 1.Hexano/acetato de etila 6:4 (frações 1 a 8); 2. hexano/acetato de etila/etanol 5,9:4,05:0,05 (frações 9 a 16); 3. hexano/acetato de etila/etanol 5,6:4,15:0,25 (frações 17 a 25); 4. hexano/acetato de etila/etanol 5,0:4,7:0,30 (frações 26 a 34); acetato de etila (frações 35 a 42); 5. etanol/H2O 9,5:0,5 (fração 43). A escolha pelo etanol em lugar do metanol partiu do interesse em começar a introduzir critérios que atendessem aos princípios da Química Verde neste trabalho. As amostras obtidas no fracionamento de 3.2CCteste foram solubilizadas em etanol (3 mg/mL, Vapl.: 0,2 mL) e submetidas à análise com diferentes fases móveis 36 (Tabela 1), tendo como reveladores anisaldeído sulfúrico ou ácido sulfúrico 10% em etanol (110º C; 10 min). Tabela 1 Relação de fases móveis para análise de frações obtidas em 3.2CCteste. Fração Fase móvel – hexano/acetato de etila/etanol 1 a 14 5,9:3,9:0,2 15 a 25 5,0:4,8:0,2 26 a 30 5,0:4,7:0,3 + 1% ácido acético 27 a 39 5,0:4,7:0,3 + 1% ácido acético 41 a 46 5,0:4,7:0,3 + 1% ácido acético As cromatoplacas de 20x20 cm continham uma camada de sílica gel G (Merck®) de 0,25 mm de espessura, e foram previamente submetidas a aquecimento em estufa a 110°C por 1 h para a retirada de umidade que pudesse desativar seus grupamentos silanóis. 3.3.2 Fracionamento de 3.2 em maior escala (3.2CC) e análise por HPLC-UV Baseado nos resultados obtidos com 3.2CCteste (3.3.1), as condições para o fracionamento de 3.2EFS em maior escala foram otimizadas (3.2CC). Em uma coluna de vidro (dcol=2,5 cm) contendo sílica gel (0,040-0,063 mm, h= 20 cm) foram aplicados 1.250 mg da fração 3.2 dissolvidos no eluente 1 (hexano/acetato de etila 6:4), e separados da parte precipitada, no intuito de realizar uma separação prévia da fração. A eluição foi realizada sob pressão reduzida (Veluente: 1.300 mL) da seguinte maneira: 1.hexano/acetato de etila 6:4 (frações 1 a 7); 2. hexano/acetato de etila /etanol 5,9:4,05:0,05 (frações 8 a 16); 3. hexano/acetato de etila /etanol 5,0:4,7:0,30 (frações 17 a 25); acetato de etila (frações 26 a 34); 5. etanol (fração 35). As amostras foram solubilizadas em etanol (3 mg/mL, Vapl.:0,2 mL) e submetidas à análise com hexano/acetato de etila /etanol 5:4,5:0,5 tendo como revelador anisaldeído sulfúrico e ácido sulfúrico (110º C; 10 min). Para estas análises, foram utilizadas placas de sílica gel 60G (20 cm x 20 cm x 0,25 mm), ativadas a 110ºC por 1 h. Uma vez analisados os perfis das frações após o uso do revelador, elas foram agrupadas de acordo com a semelhança do perfil observado, sendo ele a coloração das manchas e o fator de retenção (Rf). 37 As frações 2 e 8 obtidas no 3.2CC foram submetidas a análise por HPLC-UV (1mg/mL, metanol/H2O 80:20), em modo isocrático (metanol/H2O 80:20, 20 min; coluna Ace® C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 e 365 nm, vazão de 1,0 mL/min, volume de injeção de 20 µL. 3.4 HPLC semi-preparativo das frações de 3.2CC As frações 2 e 8 obtidas em 3.2CC foram definidas para injeção em HPLC semi-preparativo (10 mg/mL, metanol/H2O 80:20). A condição de fase móvel para HPLC semi-preparativo foi escalonada a partir de informações obtidas por HPLC-UV utilizando uma coluna analítica Ace® C18 (250x4,6 mm; 5 μm; Injeção de 20 μL; λ=254 nm; vazão de 0,4 mL/min), em modo isocrático (metanol/H2O 80:20, 30 min, fração 8; metanol/H2O 85:15, 20 min, fração 2), Vinj: 20uL, tendo em vista as características da coluna, fase estacionária e fase móvel, sendo a vazão preparativa calculada segundo a relação abaixo: Onde: Fp=vazão no modo semi-preparativo; Fan=vazão no modo analítico; dp=diâmetro interno da coluna semi-preparativa; dan=diâmetro interno da coluna analítica A purificação foi realizada em cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis, acoplado a uma coluna semi-preparativa Agilent Eclipse XDB C-18 (250 mm x 21,20 mm; 7 µm), com vazão de 8,0 mL/min e detecção em 254 nm, na condição metanol/H2O 85:15 por 15 min, para a fração 2, e metanol/H2O 80:20 por 30 min para a fração 8; volume de injeção: 1 mL (10 injeções por amostra). 3.5 Precipitação na fração 3.2EFS e HPLC semi-preparativo A fração 3.2 se mostrou parcialmente solúvel em hexano/acetato de etila 6:4 no momento de sua solubilização para o fracionamento em menor escala, dando origem a um precipitado de cor amarela. O precipitado foi recolhido para análise em HPLC-UV. Para isto, 10 mg foram utilizados e intentados á solubilização em 1 mL de: metanol, metanol/H2O 80:20, metanol/H2O 80:20 (0,5 e 1% dietilamina), metanol/H2O 80:20 (0,5 e 1% ácido acético), acetonitrila, acetonitrila/H2O 80:20 (0,1% dietilamina). Por fim, a amostra 38 pode ser solubilizada em acetonitrila (0,1% dietilamina) para injeção em HPLC semi- preparativo. A purificação foi realizada em cromatógrafo Perkin Elmer® Flexar® UV/Vis, acoplado a uma coluna semi-preparativa Agilent Eclipse XDB C-18 (250 x 21,20 mm; 7 µm), com vazão de 8,0 mL/min e detecção em 254 nm, na condição acetonitrila/H2O 71:29 por 18 min; volume de injeção: 1 mL (12 injeções). 3.6 OLE-HPLC Para a execução e montagem do sistema OLE-HPLC, foi utilizada coluna Ace® C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), holder e coluna de guarda Phenomenex®, sílica C18 (Supelco® DSC) e planta seca e moída com granulometria padronizada em tamis 4. A coluna de guarda foi preenchida com 1,0 mg do material vegetal e seu volume completado com a sílica C18. Uma membrana de nylon (Phenomenex®) foi colocada na parte inferior da coluna de guarda e, após seu preenchimento, na parte superior (Figura 10). Figura 10 Membrana de nylon na parte inferior do holder e coluna de guarda vazia; B) coluna de guarda sobre o holder, preenchida com material vegetal e sílica C18 e membrana de nylon na parte superior; C) fechamento do holder. Fonte: arquivo pessoal. O holder foi fechado e acoplado ao injetor sendo colocado diretamente na porta 4 e na porta 1, de modo que, ao ser acionada a posição inject, ocorresse a extração sólido-líquido, extração em fase sólida, filtração e análise concomitantemente (FERREIRA et al., 2016), conforme figura 11. 39 Figura 11 A) injetor sem acoplamento do holder; B) holder em substituição ao loop acoplado ao injetor. Fonte: arquivo pessoal. O método de análise utilizado foi um gradiente exploratório: 5-100 % de metanol em 30 min, mais 100% de metanol por 15 min; coluna Ace® C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), λ= 254 nm, vazão de 1,0 mL/min, e o volume de injeção de EEt (10 mg/mL) para comparação dos sistemas foi de 20 µL. Para o sistema OLE-UPLC, foi utilizado 0,5 mg de material vegetal seco e o holder foi acoplado diretamente a uma coluna Acquity UPLC®HSS T3 (2,1 x 100mm; 1,8 µm). O método de análise utilizado foi composto por etanol e água acidificada, e seu desenvolvimento foi de acordo com o item 3.7. 3.7 Desenvolvimento de método em UPLC-UV (método convencional e OLE) Com vistas ao uso de princípios da Química Verde, foi desenvolvido um método de análise para a erva-baleeira utilizando um cromatógrafo líquido de ultra eficiência (UPLC -Ultra High Performance Liquid Chromatography). A UPLC utiliza os mesmos princípios de separação da HPLC, tais como a alta pressão e partículas de fase estacionária de pequeno diâmetro, porém, as partículas das colunas de UPLC possuem até 2 µm, e a pressão gerada e suportada pelos equipamentos podem chegar, por exemplo, a 15000 psi (MALDANER et al, 2012), levando a análises mais eficientes e rápidas, contribuindo com a economia de energia e solvente, indo ao encontro da Química Verde. Para este trabalho, foi utilizado um UPLC Acquity® Waters, equipado com bomba quaternária, injetor automático, forno de coluna e detector no UV/Vis de comprimento de onda variável. Para o desenvolvimento do método, foi considerado aquele desenvolvido em HPLC-UV por Faibicher (2021), cujas condições são: coluna ACE® C18 (250 x 4,6 40 mm, 5 μm); fase móvel ácido acético 2 % (A) e metanol (B), em modo gradiente: 35- 42% B (0-20 min); 42-60% B (20-30 min); 60-70 % B (30-40 min); 70-100% B (40-70 min); vazão de 1,0 mL/min; volume de injeção de 20 μL e detector UV/Vis com comprimento de onda em 254 nm. Por ocasião da substituição do equipamento de HPLC por UPLC, de imediato houve a substituição da coluna analítica utilizada em HPLC por uma Acquity UPLC® HSS T3 C18 (2,1 x 100mm; 1,8 µm). O modificador ou solvente orgânico de escolha foi o etanol (B), pois era desejável um método em Química Verde, variando-se os tempos de gradiente, vazão, temperatura do forno de coluna e força de eluição (Ɛ). A água acidificada (A) foi mantida como um aditivo de fase móvel, para evitar a ionização dos componentes do extrato da erva-baleeira e o alargamento dos picos, tendo sido verificado o resultado com ácido acético e com ácido fórmico. Inicialmente, as condições foram definidas no método convencional, sem a presença do sistema OLE. As condições para as variáveis estudadas estão na tabela abaixo (Tabela 2). A condição inicial (método 1), foi determinado a partir do software HPLC Calculator v3.1 (GUILLARME et al, 2007; GUILLARME et al, 2008), tendo sido inseridas as condições iniciais do método de Faibicher (2021), em metanol. A partir da observação da resposta cromatográfica, houve a substituição por etanol e ajustes foram realizados no intuito de chegar à uma condição ideal. Tabela 2 Condições cromatográficas avaliadas no desenvolvimento de método em UPLC- UV. M é to d o Gradiente Vazão mL/min Vinj µL Temp. °C Aditivo de fase aquosa 1 25-32% B (0-3 min), 32-60% B (3-5,5 min), 60-90% B (5,5-10 min), 90-100% (10-12 min), 100% B (12-15 min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 2 35-40% B (0-3 min), 40-45% B (3-6min), 45- 50% B (6-9 min), 50-55% (9-12 min), 55- 60% (12-15 min), 100% B (15-22min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 3 14-31% B (0-8 min), 31-80% B (8-20 min), 80-100% B (20-21 min), 100% (21-25 min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 4 14-27% B (0-8 min), 27-80% B (8-22 min), 80-100% B (22-23 min), 100% (23-25 min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 5 14-23% B (0-8 min), 22-80% B (8-23 min), 0,300 10 35 Ácido 41 80-100% B (23-24 min), 100% (24-26 min). acético 2% 6 14-20% B (0-8 min), 20-80% B (8-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-30 min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 7 14-20% B (0-8 min), 20-80% B (8-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-30 min). 0,300 10 35 Ácido fórmico 0,1% 8 14-17% B (0-8 min), 17-80% B (8-23 min), 80-100% B (23-24 min), 100% (24-27 min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 9 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 10 17-32% B (0-12 min), 32% B (12-18 min), 32-80% B (18-28 min), 80-100% B (28-29 min), 100% (29-32 min). 0,300 10 35 Ácido acético 2% 11 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min). 0,350 10 45 Ácido acético 2% 12 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min). 0,350 5 45 Ácido acético 2% 13 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min). 0,400 10 50 Ácido acético 2% 14 17-33% B (0-12 min), 33-80% B (12-24 min), 80-100% B (24-25 min), 100% (25-28 min). 0,400 5 50 Ácido acético 2% Observação: destacadas em negrito e sublinhado as condições alteradas com relação ao método da linha anterior da tabela 2. Além disso, foi desenvolvido um método para análise em OLE-UPLC, tendo sido utilizado como matriz 0,5 mg de planta seca e moída (droga vegetal). O método de escolha foi o 14, com modificações relativas ao tempo de gradiente, uma vez que os picos apresentados no cromatograma com o sistema OLE possuíam mais intensidade e se sobrepunham nas condições exatas do método 14. Portanto, para a análise por OLE-UPLC, as condições foram as seguintes: 17-33% B (0-12 min), 33- 80% B (12-32 min), 80-100% B (32-33 min), 100% (33-36min), vazão=0,400 mL/min, 50°C. Para a montagem do sistema OLE, foi acoplada à coluna o mesmo holder utilizado na análise por HPLC. Os métodos em HPLC convencional, UPLC convencional e OLE-UPLC foram comparados do ponto de vista da Química Verde através da calculadora Agree (PENA-PAREIRA et al., 2020), que está disponível em https://mostwiedzy.pl/AGREE. https://mostwiedzy.pl/AGREE 42 Esta métrica-Agree-permite que o operador atribua pesos a cada um dos 12 critérios avaliados de acordo com o seu princípio de maior interesse. Para o trabalho atual, por se desejar uma visão ampla sore os métodos a fim de compara-los, os pesos foram mantidos em 2, para todos os critérios. 3.7.1 Validação do método em UPLC-UV A validação parcial, que avaliou linearidade, precisão, exatidão, sensibilidade e seletividade, se deu com base nas normas estabelecidas pela ANVISA, através da Resolução RDC ANVISA n. 166/2017 (BRASIL, 2017), e considerou alguns parâmetros, sendo, portanto, considerada parcial. O padrão escolhido para a validação foi o ácido rosmarínico (Sigma Aldrich®), presente entre os componentes majoritários no extrato hidroetanólico (dados do grupo de pesquisa não publicados), e cedido pelo laboratório de Bioquímica Clínica (FCFAR/UNESP), sob responsabilidade do professor Dr. Iguatemy Brunetti. Os perfis cromatográficos foram tratados matematicamente, considerando as integrais da área do pico de interesse, para a montagem da curva analítica e quantificação do padrão no extrato hidroetanólico 70%. Os parâmetros avaliados foram: - Seletividade: parâmetro que verifica a capacidade do método em identificar ou quantificar o composto de interesse dos demais, que podem ser impurezas, componentes de matriz ou produtos de degradação. O espectro no UV do pico do ácido rosmarínico foi analisado para verificar a pureza cromatográfica. Para este parâmetro, foi utilizado com UPLC-DAD para a obtenção do espectro no UV. - Linearidade: através da linearidade, é demonstrada a capacidade do método de oferecer respostas analíticas diretamente proporcionais à concentração do analito. Para este parâmetro, deve ser traçada uma curva analítica. Para a elaboração dessa, foi considerado um intervalo de concentrações entre 0,500 e 0,044 mg/mL de ácido rosmarínico. - Precisão: avalia a proximidade e a concordância entre as replicatas. Através do desvio padrão das replicatas é possível ser determinado coeficiente de variação (CV%). 43 - Exatidão: verifica a proximidade entre os valores encontrados. Foi avaliada como o erro padrão relativo das replicatas. - Sensibilidade: determinada a partir do limite de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ), ou seja, menor quantidade a ser detectada do analito na amostra e menor quantidade do analito que pode ser quantificada com precisão e exatidão. Pode ser determinada por razão sinal-ruído, ou, al qual nesse trabalho, matematicamente através de parâmetros da curva de calibração (intercepto com o eixo x e coeficiente angular). 4 Determinação estrutural dos metabólitos secundários 4.1 Ressonância Magnética Nuclear Para análise estrutural de metabólitos secundários purificados, os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) unidimensionais de 1H foram obtidos a 300 MHz para 1H em um espectrômetro Bruker® Fourier 300 (7,0 T). Utilizou-se CDCl3 como solvente e TMS como referência interna. As amostras foram analisadas na concentração de 10 mg/mL. 5 Determinação de açúcares redutores com DNS Monossacarídeos como a glicose ou a frutose e alguns dissacarídeos como a maltose são chamados açúcares redutores pela presença de grupos carbonílicos ou cetônicos livres que podem ser oxidados, em meio básico, diferentemente dos açúcares não redutores que precisam sofrer hidrólise para que oxidem, à exemplo da sacarose (frutose+glicose). Foi realizado o teste para determinação de açúcares redutores com DNS (3-5´-dinitroalicílico) segundo a metodologia de Miller (1959), a fim de verificar a presença deles e, em caso positivo, verificar a possibilidade de interferirem nos ensaios antioxidantes. Para a elaboração da curva analítica foi utilizada glicose (0, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,6, 0,8 e 1,0 mg/mL) e um volume fixo de DNS em cada tubo de ensaio (0,5 mL). Os tubos foram colocados em banho fervente por 5 min, resfriados em gelo e o volume completado com água. As absorbâncias foram medidas em 540 nm. Para a glicose, os extratos e o branco (DNS e ausência de glicose) as leituras foram realizadas em triplicata. Os extratos foram analisados na concentração de 1,0 mg/mL. 44 6 Determinação de compostos fenólicos totais O teor de compostos fenólicos totais dos extratos foi determinado por fotometria no visível utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau e curva analítica de ácido gálico seguindo o método descrito por Singleton e colaboradores (1999). As absorbâncias das amostras foram medidas em 760 nm em espectrofotômetro UV/Vis de cubetas. Ambos extratos foram solubilizados em etanol e para a análise tinham a concentração de 25,0 μg/mL. Para a construção da curva analítica do ácido gálico, solubilizado em água deionizada, foram utilizadas as concentrações 1,3, 2,5, 4,0, 5,0, 7,5, 10,0 e 20,0 μg/mL. Os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados foram expressos em miligramas de compostos fenólicos totais equivalentes ao ácido gálico por grama de extrato seco. 7 Ensaio de embriotoxicidade em zebrafish Os peixes machos e fêmeas foram mantidos em aquário com temperatura controlada (28 ± 0,5° C) com ciclo de 14 h de luz e 10 h de escuro. Os embriões foram coletados e postos em meio embrionário (NaCl 10 mM, KCl 0,34 mM, 0,66 mM CaCl2·2H2O, 0,66 mM MgCl2·6H2O) suplementado com 0,00003% de azul de metileno, e transferidos para placas de 96 poços, contendo 2 embriões cada poço a ser utilizado. As análises dos extratos foram realizadas nas concentrações de 50,0, 100,0 e 200 µg/mL. As placas foram incubadas a 28 ° C e os fenótipos de malformação observados após 24, 48 e 72 horas pós fecundação (OCDE, 2013). Foram realizados dois ensaios independentes (SINGULANI et al., 2018). 8 Atividade antioxidante 8.1 Ensaio com DPPH O ensaio foi realizado segundo descrito por Sharma e Bhat (2009) e com alterações, tendo-se utilizado 30 µL de solução de DPPH. em etanol (620 µM), e o volume tendo sido completado para 300 µL com amostras e controles em placas de 96 poços. A absorbância decorrente do reagente, das cores dos extratos, mistura e substâncias foi descontada dos valores obtidos nos ensaios (branco). Foram utilizadas diferentes concentrações de EEt (15,0, 25,0, 35,0, 50,0, 55,0 µg/mL), 45 EEtOH (5,0, 10,0, 18,0 25,0 e 35,0 µg/mL), Ppt, (11,0, 15,0, 20,0, 25,0, 35,0 e 40,0 µg/mL), substância 1 e substância 2 (11,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0,40,0 e 45,0 µg/mL), substância 3 e substância 4 (70,0, 110,0, 150,0, 180,0, 200,0, 300,0 µg/mL), solubilizados em etanol, tendo sido este utilizado como branco da reação, e sua absorbância descontada das leituras das amostras. A amostra Ppt era composta por substância 1 + substância 2. Como controle positivo foi utilizada quercetina (1,0, 2,0, 3,0, 4,0 e 4,5 µg/mL) por se tratar de um flavonoide com antioxidante descrita na literatura. A leitura das absorbâncias foi feita em 517 nm em leitor de placas. As leituras foram realizadas em triplicata e foram computadas as médias das absorbâncias de cada concentração, sendo a porcentagem de captura do radical DPPH calculada tendo por base o controle (MOLYNEUX, 2004). 8.2 Ânion radicalar superóxido (O2 ―•) Este ânion é formado pela reação entre o metassulfato de fenazina (PMS) e a nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADH) e reage com o azul de nitrotetrazólio (NBT), reduzindo-o, para gerar uma formazana, na qual a intensidade de cor é diretamente proporcional à concentração do radical. O experimento foi realizado em tampão pirofosfato de sódio (pH 8,3; 25 mmol/L), contendo PMS (372 μmol/L), NBT (600 μmol/L), NADH (1.560 μmol/L) e diferentes concentrações dos extratos (100,0, 150,0, 200,0, 250,0 e 300,0 µg/mL) e da quercetina (controle positivo; 10,0, 20,0, 30,0, 50,0, 70,0, 85,0,0 e 100,0 µg/mL). Para os extratos foram utilizados: 25,0, 100,0, 150,0, 250,0, 280,0 e 300,0 µg/mL; PPt: 25,0, 100,0, 150,0, 250 e 300 µg/mL; substância 1 e substância 2: 100,0, 150,0, 200,0, 250,0, 300,0 e 350 µg/mL. Foi utilizado tampão pirofosfato de sódio (pH 8,3) e como branco da reação foram utilizados o tampão, PMS, NBT e água, completando o volume de 300 μL. Após incubação de 7 min à temperatura ambiente, a absorbância foi monitorada em 560 nm, a fim de determinar a quantidade de formazana gerada (HAZRA; BISWAS; MANDAL, 2008). Moléculas que agem como antioxidantes interagem com o radical e inibem a produção de formazana, que tem coloração púrpura (ALVES et al., 2010) 46 8.3 HOCl/OCl― Por este ensaio a capacidade antioxidante se relaciona a habilidade do analito em capturar o HOCl de tal forma que ele impeça a oxidação do TMB, fenômeno que gera um cromóforo azul com absorbância máxima em 655 nm. Para obter o agente oxidante padrão foi feita uma diluição do NaOCl 12 % em NaOH 10 mmol/L. A concentração do HOCl foi determinada através do valor de absorbância obtido e de sua absortividade molar (Ɛ = 350 L M-1cm-1, a 292 nm) (ZGLICZYNSKI et al., 1971). A solução de TMB (2,8 mmol/L) foi preparada com dimetilformamida 50 %, ácido acético 0,8 mol/L e iodeto de potássio 0,01 mol/L em um volume final de 5 mL, na proporção de 50:49:1 (v/v), respectivamente. As concentrações utilizadas para os extratos foram 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 7,0 μg/mL, para PPt 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,5 μg/mL, para substância 1 e substância 2 foram 0,5, 1,0, 3,0, 5,0, e 7,0 μg/mL, e, para o padrão quercetina foram utilizadas concentrações equivalentes a 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 e 0,6 μg/mL, solubilizados em etanol. O ensaio foi realizado em microplaca com meio tamponado com fosfato de sódio pH 7,4 (50 mmol/L), HOCl (30 μmol/L), incubação de 10 min e, após, foi adicionado o TMB (2,8 mmol/L), mantendo o volume de 60 μL, e variando o volume da amostra e as concentrações equivalentes aos padrões, de acordo com suas concentrações analisadas, totalizando 300 μL de volume final; como branco da reação foram utilizados o tampão e TMB. As incubações foram realizadas em temperatura ambiente por 5 min na ausência de luz, e as leituras da absorbância foram realizadas em triplicata em 652 nm e a partir d