UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÃMPUS DE JABOTICABAL RELATÓRIO FINAL DO ESTÁGIO CURRICULAR OBRIGATÓRIO DO CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA, REALIZADO JUNTO AO CENTRO DE AMPARO À PESQUISA VETERINÁRIA / CAPEV EM AMPARO – SP. Assunto de interesse: Método de Exclusão Competitiva utilizado para prevenir a colonização intestinal de aves por Salmonella spp. Taísa Santiago Ferreira JABOTICABAL – SP UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL RELATÓRIO FINAL DO ESTÁGIO CURRICULAR OBRIGATÓRIO DO CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA, REALIZADO JUNTO AO CENTRO DE AMPARO À PESQUISA VETERINÁRIA / CAPEV EM AMPARO – SP. Assunto de interesse: Método de Exclusão Competitiva utilizado para prevenir a colonização intestinal de aves por Salmonella spp. Taísa Santiago Ferreira Orientador: Prof. Dr. Angelo Berchieri Junior Relatório do Estágio Curricular em Prática Veterinária apresentado à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Câmpus de Jaboticabal, Unesp, para graduação em Medicina Veterinária. JABOTICABAL – SP 1° SEMESTRE DE 2022 AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, que com sua infinita bondade, me deu a saúde e a sabedoria necessária para enfrentar as dificuldades e seguir minha trajetória acadêmica. Aos meus pais, Maria Neusa e Ademir, por todo amor, dedicação, educação e incentivo. Agradeço por apoiarem as minhas decisões, serem meus maiores exemplos e por constituírem a base de minhas conquistas. Ao meu irmão, Vinícius, por todo apoio, carinho e por me auxiliar sempre que necessário. À Paula, pelos anos de amizade, companheirismo e apoio constante. Obrigada pela paciência e por estar ao meu lado em todos os momentos. Ao meu orientador, Prof. Dr. Angelo Berchieri Junior, pela oportunidade, por me aceitar como orientada e por confiar em mim. À minha supervisora de estágio, M. V. Barbara Cristina da Costa, pela oportunidade, pelos ensinamentos, pela dedicação e atenção. A toda equipe do Laboratório de Ornitopatologia – Unesp/FCAV, pelas experiências e ensinamentos compartilhados. Obrigada por me acolherem e auxiliarem no meu crescimento profissional e pessoal. As minhas amigas de turma, Amanda, Isabela e Maria Luiza, por todos os momentos felizes que vivemos ao longo da graduação e por nos apoiarmos nas dificuldades. À banca avaliadora, Prof. Dr. Angelo Berchieri Junior, Dr. Mauro de Mesquita Souza Saraiva e Ma. Julia Memrava Cabrera. Obrigada pela disponibilidade e orientação nesta etapa de finalização de um ciclo tão significativo em minha vida. À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista, Câmpus de Jaboticabal, minha gratidão aos docentes por todo aprendizado durante a minha graduação. Agradeço também a todos os funcionários. V Índice I RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR ...................................................... 6 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 6 2. CAPEV – Centro de Amparo à Pesquisa Veterinária LTDA ........................... 6 2.1. Descrição da Empresa ................................................................................. 6 2.1.1 Instalações ................................................................................................. 7 2.1.2. Ética e bem-estar animal ........................................................................ 11 3. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES DO ESTÁGIO ........................................... 11 3.1. Recebimento de ovos SPF (Specific Pathogen Free / Livres de Patógenos Específicos) ...................................................................................................... 11 3.2. Alojamento de pintos de um dia de vida .................................................... 12 3.3. Transferência de pintos recém-nascidos ................................................... 13 3.4. Alojamento de aves nos isoladores ........................................................... 14 3.5. Colheita de amostras biológicas ................................................................ 14 3.6. Manejo das aves alojadas ......................................................................... 15 3.7. Eutanásia e destino dos animais ............................................................... 15 3.8. Vacinas ...................................................................................................... 16 3.8.1. Vacinas vivas .......................................................................................... 16 3.8.2. Vacinas inativadas .................................................................................. 17 3.8.3. Vias de aplicação .................................................................................... 17 3.8.4. Estudos para Controle de Qualidade ...................................................... 17 3.8.4.1. Testes de eficácia de vacinas .............................................................. 17 3.8.4.2. Testes de inocuidade e segurança ...................................................... 21 3.8.4.3. Testes de estabilidade ......................................................................... 22 3.8.4.4. Teste de reversão de virulência ........................................................... 23 3.9. Teste de ciliostase ..................................................................................... 24 VI 3.10. Teste de Sensibilidade aos Anticoccidianos (TSA) - Anticoccidial Sensitivity Test (AST) ................................................................................................................ 25 3.11. Preparação de inóculos de Eimeria acervulina, Eimeria maxima e Eimeira tenella .......................................................................................................................... 27 3.12. Análise dos escores de lesões decorrentes do desafio por Eimeria acervulina, Eimeria maxima e Eimeira tenella .................................................. 27 3.13. Avaliação do potencial patogênico do vírus da Bronquite Infecciosa (Infectious Bronchitis Vírus - IBV) em aves adultas .......................................... 31 3.14. Avaliação da patogenicidade de uma estirpe de Salmonella Enteritidis .. 33 3.15. Controle da qualidade de água ................................................................ 33 4. DISCUSSÃO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ................................... 34 5. CONCLUSÃO ............................................................................................... 35 6. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 36 II Assunto de interesse ..................................................................................... 38 Revisão de literatura: Método de Exclusão Competitiva utilizado para prevenir a colonização intestinal de aves por Salmonella spp. .......................................... 38 1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 38 2. GÊNERO SALMONELLA ............................................................................. 39 3. IDENTIFICAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL POR MÉTODOS MOLECULARES .......................................................................................................................... 40 4. DESENVOLVIMENTO DA MICROBIOTA .................................................... 43 5. COMPOSIÇÃO DA MICROBIOTA DE ACORDO COM A LOCALIZAÇÃO DO TRATO GASTROINTESTINAL ......................................................................... 45 6. RESISTÊNCIA À COLONIZAÇÃO DE PATÓGENOS MEDIADA PELA MICROBIOTA .......................................................................................................................... 47 7. EXCLUSÃO COMPETITIVA ......................................................................... 50 8. PREBIÓTICOS ............................................................................................. 53 9. PROBIÓTICOS ............................................................................................. 54 10. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................ 56 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 58 6 I RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR 1. INTRODUÇÃO O estágio curricular obrigatório foi realizado no período de 01 de fevereiro a 30 de junho de 2022, totalizando 800 horas, como parte dos requisitos para conclusão do curso de Medicina Veterinária da Unesp/FCAV. O trabalho foi realizado sob orientação do Prof. Dr. Angelo Berchieri Junior, em uma empresa do ramo avícola, envolvida na área de experimentação animal. As atividades foram desenvolvidas junto ao CAPEV – Centro de Amparo à Pesquisa Veterinária LTDA, Amparo – SP, sob supervisão da M.V. Barbara Cristina da Costa. 2. CAPEV – Centro de Amparo à Pesquisa Veterinária LTDA 2.1. Descrição da Empresa O Centro de Amparo à Pesquisa Veterinária Ltda (CAPEV) está localizado na Estrada Municipal Amp-475, Bairro dos Rosas, na cidade Amparo-SP. A empresa foi fundada em 2012 e oferece serviços voltados a experimentação animal para realização de testes sanitários, testes de produtos biológicos e farmacêuticos veterinários. A equipe é composta por uma Coordenadora Geral, uma Coordenadora de Garantia da Qualidade, um Coordenador Financeiro, um Gerente Técnico/Administrativo, dois Pesquisadores Médicos Veterinários, uma Auxiliar de Laboratório e quatro Auxiliares de Limpeza e Manutenção. Conta com estrutura composta por dois vestiários de entrada, um escritório, uma 7 copa, uma sala de reuniões, uma fábrica de ração com misturador, uma lavanderia e seis instalações para condução de testes experimentais. O centro de pesquisa conduz experimentos para empresas do segmento de Saúde Animal. A empresa tem o objetivo de tornar-se um centro de referência nacional em testes a campo para o desenvolvimento de produtos veterinários. A instituição tem a missão de oferecer aos clientes suporte em experimentação animal de forma confiável e ética, priorizando o bem-estar animal e respeitando o meio ambiente. 2.1.1 Instalações A empresa possui seis áreas para realização de estudos: instalação A, instalação B, instalação C, instalação D, salas dos isoladores e um laboratório. A instalação “A” consiste em um galpão de aviário convencional contendo 38 boxes de 3 m2 cada. É equipada com bebedouros tipo nipple, ventiladores e cortinas laterais para proteção contra luz solar e chuva. Sua finalidade é a realização de teste de desempenho, teste de resíduo e teste com vacinas inativadas. A Instalação “B” é composta por duas salas de apoio, uma sala para incubação de ovos férteis, duas salas isoladas com antessalas, uma para procedimentos com vacinas vivas ou inativadas e uma destinada à fase de cria de pintos. Possui sistema de filtração de ar de entrada e saída com filtros 8 HEPA (High Efficiency Particulate Arrestance) e exaustor com controle de temperatura, que mantém a pressão positiva nos corredores e antessalas e negativa nas salas isoladas. Para entrar no local, deve-se tomar banho, trajar o uniforme de cor branca e trocar o calçado de acordo com as normas previstas pelo Procedimento Operacional Padrão (POP) da empresa. Nas salas de apoio, Equipamentos de Proteção Individual (EPI’s) descartáveis e de uso obrigatório ficam disponíveis, sendo eles: touca, máscara e luva de látex. Após manipulação das aves, segue-se o fluxo unidirecional até os vestiários. Na saída da instalação, deve-se tomar banho e trocar o uniforme para o de cor verde. A instalação “C” consiste em um galpão de salas isoladas, com controle de pressão e filtração de ar por filtros HEPA absolutos, sendo utilizada, principalmente, para testes com vacinas vivas, desafios sanitários e testes de segurança de medicamentos. Apresenta fluxo unidirecional e é composta por quatro vestiários, sendo dois na entrada e dois na saída, duas caixas de passagem (“pass-through”), três salas de necrópsia, três salas de depósito, uma sala para incubação de ovos e 22 salas de testes com antessalas. Para acessar o galpão deve-se tomar banho no vestiário de entrada, trocar o calçado e trajar uniforme branco. EPI’s descartáveis (touca, máscara e luva de látex) ficam disponíveis no corredor de circulação. A saída da instalação se dá pelos vestiários de saída, onde novamente deve-se tomar banho e trajar novo uniforme de cor verde. 9 Nas estruturas que compõe a instalação D são realizados Testes de Sensibilidade a Anticoccidianos (TSA). Conta com dois vestiários, uma sala de apoio para necrópsias e armazenamento de ração, um galpão para criação de aves equipado com 48 gaiolas, bebedouros do tipo nipple e controle automático de temperatura e exaustão de ar. A empresa possui um laboratório para produção de inóculos de Eimeria spp. O ambiente laboratorial é composto por um escritório, área de trabalho, sala de lavagem, uma sala de criação com antessala e três infectórios para desafio de aves por Eimeria acervulina, Eimeria maxima e Eimeria tenella. A empresa conta, ainda, com 14 isoladores para aves, distribuídos em duas salas. A área dos isoladores é destinada a realização de testes de vacinas vivas, desafios sanitários e testes de segurança e eficácia de medicamentos. Esses equipamentos são fabricados em PVC flexível, polipropileno e aço inoxidável e possuem pré-filtros e filtros absolutos HEPA para entrada e saída de ar. A unidade opera em pressão positiva ou negativa que pode ser controlada por meio de válvulas, a depender do experimento. Nos isoladores que contém as aves infectadas utiliza-se pressão negativa para dificultar a saída do patógeno para o ambiente e nos isoladores que abrigam o grupo controle negativo é utilizada pressão positiva para dificultar a entrada de patógenos. O sistema de manipulação é composto de dois pares de luvas fixadas através de borracha e cinta de PVC. A entrada e retirada de materiais são realizadas por meio de uma porta de passagem lateral (Figura 01). A área dos isoladores inclui ainda uma sala com microscópio invertido para condução 10 de Testes de Ciliostase, técnica utilizada para avaliação de eficácia de vacinas vivas contendo estirpe vacinal do vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas; uma sala para incubação de ovos férteis, uma sala de necrópsia equipada com capela de fluxo laminar, utilizada para manipulação de vacinas vivas, cepas bacterianas ou virais vivas e para diluição de vacinas; um vestiário de saída; e 2 caixas de passagem (“pass-through”), para a retirada de carcaças ou materiais. Figura 01. Isolador de aves com sistema de manipulação composto de dois pares de luvas fixadas (seta de cor preta) e com porta de passagem lateral para inserir aves e materiais a serem utilizados na unidade (seta de cor verde). Fonte: Arquivo pessoal. 11 2.1.2. Ética e bem-estar animal A empresa segue princípios éticos aprovados pelo Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovações (MCTI) e Conselho Nacional de Controle da Experimentação Animal (CONCEA) conforme determinados pela Resolução Normativa n° 25, de 29 de setembro de 2015, que aprova o Guia Brasileiro de Produção, Manutenção ou Utilização de Animais para Atividades de Ensino ou Pesquisa Científica e pela Resolução Normativa n° 37, de 22 de fevereiro de 2018, que aprova as Diretrizes da Prática de Eutanásia do CONCEA. Segue ainda procedimentos previstos pela Lei 11.794 de 08 de outubro de 2008 (Lei Arouca – Procedimentos para o Uso Científico de Animais), regulamentada pelo Decreto n° 6.899 de 15 de julho de 2009. Conta também com uma Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), composta por membros da comunidade científica. Para cada estudo, são elaborados formulários para Solicitação de Autorização para Uso de Animais em Pesquisa, os quais são avaliados pela CEUA em reuniões programadas. 3. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES DO ESTÁGIO 3.1. Recebimento de ovos SPF (Specific Pathogen Free / Livres de Patógenos Específicos) Para realização dos ensaios, a empresa recebe ovos embrionados SPF provenientes do aviário VALO BioMedia do Brasil, situado na cidade de Uberlândia – MG. Um certificado de Controle de Qualidade é enviado juntamente com os ovos atestando a categoria de SPF, além de conter dados 12 referentes ao lote, linhagem, país de origem e idade das matrizes. Os ovos podem ser recebidos para incubação completa, 21 dias em incubadoras com viragem automática ou aos 18 dias de período embrionário, sendo, então, mantidos em nascedouros. Após a recepção dos ovos, estes são colocados na incubadora e os parâmetros de umidade e temperatura dos equipamentos são programados de acordo com as instruções do fabricante. Os ovos são avaliados diariamente, sendo os valores dos parâmetros anotados no Formulário de Monitoramento de Temperatura e Umidade. . 3.2. Alojamento de pintos de um dia de vida A empresa recebe também aves SPF com um dia de vida, normalmente encaminhadas diretamente pela empresa patrocinadora do estudo. Para estudos voltados à avicultura de corte, são utilizados animais provenientes do incubatório da Granja São José ou do incubatório Beretta Avicultura, ambos localizados na cidade de Amparo-SP. Após o recebimento, as aves são alojadas em salas com gaiolas ou nos isoladores a depender do estudo. As instalações são equipadas com bebedouros automáticos do tipo nipple infantil e comedouros do tipo calha ou cone. É observado o estado geral das aves e o consumo de ração e água. Os valores referentes à temperatura são registrados no Formulário de Monitoramento de Temperatura e Umidade. 13 3.3. Transferência de pintos recém-nascidos Os pintos recém-nascidos são transferidos para as criadeiras ou para gaiolas com bandejas coletoras de dejetos (Figura 02) e a temperatura é regulada automaticamente por meio do ar condicionado e pelo controle da circulação de ar das instalações. Em alguns casos, pode-se utilizar um aquecedor elétrico para aumentar a temperatura ambiente. Após o alojamento, as aves são estimuladas a ingerirem água e ração que são fornecidas ad libitum. Figura 02. Gaiolas com bandejas coletoras de dejetos utilizadas nos estudos experimentais. Fonte: Arquivo pessoal. 14 3.4. Alojamento de aves nos isoladores Em alguns experimentos, são alojadas nas unidades isoladoras aves cujos estudos sejam de curta duração e com quantidade reduzida de animais. Os isoladores possuem fundo removível, com abertura para o escoamento de dejetos. O fundo é recoberto com papelão ondulado e bebedouros do tipo nipple, adaptados para o uso em isoladores. Cada isolador possui um reservatório de água para abastecimento. Comedouros do tipo calha ou tipo cone são mantidos no piso. Para entrada ou saída de materiais, utiliza-se a porta de passagem lateral. A manipulação das aves é realizada por intermédio de luvas de borracha de cano curto. 3.5. Colheita de amostras biológicas As amostras biológicas são colhidas conforme o protocolo do estudo. As colheitas de sangue para obtenção de soro sanguíneo em pintos com um dia de vida são realizadas por punção cardíaca ou da veia jugular e, em seguida, as aves são eutanasiadas conforme diretrizes propostas pela Resolução Normativa n° 37, de 22 de fevereiro de 2018 (BRASIL, 2018). Em aves mais velhas, a colheita é realizada na veia braquial. Para obtenção do soro sanguíneo, as seringas são dispostas, em posição inclinada, em bandejas plásticas e colocadas em sala aquecida para acelerar o processo de formação de coágulo e separação do soro. Quando necessário, pode-se utilizar uma centrífuga para obtenção do soro. 15 Durante o período do estágio, acompanhou-se colheitas de fragmentos de fígado, baço, ovário e conteúdo cecal para análise microbiológica. Também colheu-se fragmentos da Bursa de Fabricius, oviduto, rim e pulmão, destinados para exame histopatológico, que foram imersos em solução de formol a 10% e fragmentos dos mesmos órgãos para armazenamento em tubos criogênicos para serem submetidos à técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). 3.6. Manejo das aves alojadas As aves são observadas diariamente para avaliação do estado geral de saúde. Alguns estudos possuem cronogramas determinados, em que a equipe deve avaliar as aves, realizando exame clínico individual para verificar o local de aplicação e possíveis reações sistêmicas atribuíveis a vacinação. Periodicamente, um colaborador entra nas salas isoladas para abastecer bebedouros e comedouros e realizar a limpeza e troca do filtro. Os manejos são programados, visando na reduzir o fluxo de pessoas e materiais nas áreas isoladas. 3.7. Eutanásia e destino dos animais Após colheita de amostras biológicas, ou no final do teste, as aves são eutanasiadas conforme as Diretrizes da Prática de Eutanásia do CONCEA (Resolução Normativa n° 37, de 22 de fevereiro de 2018). A empresa prevê a prática de eutanásia pelos métodos de deslocamento cervical e com prévia 16 insensibilização com uso de anestésicos administrados via intramuscular. Após o procedimento, as aves são retiradas das salas de experimentação e encaminhadas a uma composteira ou são congeladas e retiradas pela prefeitura do município para incineração. Em alguns estudos, se faz necessário autoclavar as carcaças antes de destiná-las à compostagem. 3.8. Vacinas As vacinas podem ser classificadas como vivas atenuadas, inativadas ou de subunidades. As vacinas atenuadas contêm agentes infecciosos vivos, porém enfraquecidos. As vacinas inativadas e de subunidades contêm agentes mortos ou apenas partículas deles. 3.8.1. Vacinas vivas O manuseio de vacinas vivas é realizado na área dos isoladores, em capela de fluxo laminar, ou nas salas de testes da Instalação “C”. O sistema de filtração de ar de entrada e saída garantem a segurança na manipulação de microrganismos. As vacinas liofilizadas (vacinas em pó) são preparadas para aplicação com diluente estéril próprio, de acordo com a quantidade de doses previstas na bula. Após manipulação das vacinas, é necessário tomar banho e trocar o uniforme, como medida de reduzir possibilidade de contaminação cruzada entre os experimentos. 17 3.8.2. Vacinas inativadas O manuseio de vacinas inativadas pode ser realizado diretamente na sala de teste em que as aves estão alojadas. 3.8.3. Vias de aplicação As vias de aplicação das vacinas variam de acordo com o protocolo de estudo. Durante o estágio acompanhou-se a aplicação de vacinas pelas vias: intramuscular no músculo peitoral, subcutânea no terço inicial do pescoço e via ocular. 3.8.4. Estudos para Controle de Qualidade Os estudos de Controle de Qualidade são regulamentados pela Instrução Normativa n° 07, de 10 de março de 2006, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 2006), que estabelece os requisitos técnicos para a produção, importação, controle, comercialização e o uso de vacinas e diluentes para a avicultura, destinados a comercialização no território nacional. 3.8.4.1. Testes de eficácia de vacinas Para aferir a eficácia do produto final de vacinas vivas ou inativadas, utiliza-se um teste quantificado por sorologia, que verifica os níveis de soroconversão após a inoculação (BRASIL, 2006). 18 Acompanhou-se a avaliação da resposta imune humoral de aves a diferentes vacinas monovalentes e polivalentes contendo estirpe vacinal de Adenovírus Aviário em aves SPF. As aves foram divididas em 6 grupos e vacinadas com diferentes formulações, seguindo as doses indicadas pelo fabricante. Ao longo do estudo foram realizadas 9 colheitas de sangue pela veia ulnar para obtenção de soro sanguíneo de aves dos grupos experimentais. As amostras foram mantidas congeladas a -20° C até o envio para o laboratório responsável pela realização do ensaio imunoenzimático (ELISA). Outro teste de eficácia acompanhado foi o de uma vacina viva comercial contendo estirpe vacinal de Salmonella enterica subesp. enterica sorovar Gallinarum biovar Gallinarum (SG), comparada com outros programas vacinais. O estudo foi iniciado em dezembro de 2021, utilizando-se 370 aves fêmeas distribuídas aleatoriamente em 6 grupos experimentais. As aves foram pesadas antes de cada vacinação e submetidas a diferentes programas vacinais: as aves dos grupos 1 e 2 receberam pela via subcutânea duas doses das vacinas, sendo a 1° dose com 6 semanas de vida e a segunda dose com 14 semanas de vida; aves do grupo 3 receberam pela via intramuscular a 1° dose com 10 semanas de vida e a segunda com 14 semanas de vida; as aves do grupo 4 receberam pela via intramuscular a 1° dose com 6 semanas de vida e a 2° com 14 semanas de vida; as aves dos grupo 5 (controle positivo) e do grupo 6 (controle negativo) receberam apenas PBS, sendo a 1° dose pela via 19 subcutânea com 6 semanas de vida, a 2° dose pela via intramuscular com 10 semanas e a 3° dose pela via intramuscular com 14 semanas de vida. Posteriormente, as aves foram desafiadas com uma estirpe de SG. A dose foi definida com o objetivo de obter pelo menos 60% de mortalidade das aves controle. Após a inoculação, as aves foram observadas diariamente por 35 dias e registrou-se os sinais clínicos da doença e a mortalidade. Durante o estudo observou-se sinais de depressão (relutância em se mover, postura deprimida, pouca ou nenhuma reação a estímulos), penas arrepiadas, perda de peso (redução dos músculos do peito), dispneia, perda da consistência das fezes e fezes líquidas e esverdeadas. Realizou-se a colheita de sangue e de amostras de excreção fecal aos 0, 3 e 7 dias pós-desafio. Por fim, efetuou-se a necropsia de 5 aves por grupo para avaliação de lesões macroscópicas e obtenção de fragmentos de fígado, baço, ovário e conteúdo cecal aos 7, 14, 21, 28 e 35 dias pós-desafio. As principais lesões macroscópicas observadas foram hepatomegalia, fígado friável, esverdeado, amarelo-esverdeado a bronzeado e com presença de pontos necróticos; esplenomegalia, baço com pontos necróticos e pontos hemorrágicos; hidropericárdio, nódulos esbranquiçados no coração, pericárdio opaco; ovário e oviduto atrofiados, folículos ovarianos hemorrágicos e presença de material caseoso ou hemorrágico no seu interior dos folículos. 20 Figura 03. Fígados de aves infectadas por SG. Com coloração bronzeada, esverdeada, acentuado aumento de volume e presença de pontos necróticos. Figura 04. Baço de ave infectada por SG. Presença de esplenomegalia e pontos necróticos (esbranquiçados). 21 Figura 05. Coração de ave infectada por SG. Presença de nódulos esbranquiçados (granulomas). 3.8.4.2. Testes de inocuidade e segurança Todas as partidas das vacinas produzidas devem ser submetidas à prova de inocuidade, de acordo com a IN n° 07 (BRASIL, 2006). O teste de inocuidade tem como objetivo verificar o aparecimento de reações locais ou sistêmicas após aplicação do produto. Acompanhou-se o teste de inocuidade para vacinas inativadas contendo estirpe vacinal de Salmonella enterica subesp. enterica sorovar Enteritidis (SE), Salmonella enterica subesp. enterica sorovar Gallinarum biovar Gallinarum (SG) e Salmonella enterica subesp. enterica sorovar Typhimurium (STM). No estudo, foram utilizadas 20 aves SPF, todas de mesma idade e origem. Inoculou-se duas doses da vacina em dois pontos (direito e esquerdo) do músculo peitoral. Os testes foram conduzidos por 21 dias, observando-se o estado geral de saúde das aves experimentais, avaliando-se o local de inoculação da vacina em busca de sinais de processos inflamatórios: edema, calor, rubor, dor, perda ou redução da função. No final do estudo, as aves 22 foram eutanasiadas para avaliação interna do músculo peitoral verificando se ocorreu reação local inesperada decorrente da aplicação do produto. 3.8.4.3. Testes de estabilidade Nos estudos para avaliação da estabilidade de vacinas comerciais prepara-se um pool composto pelo conteúdo de três frascos da mesma partida da vacina conforme as normas previstas pela IN n° 7 de 10 de março de 2006. Os estudos de estabilidades são importantes para comprovar o prazo máximo de validade para cada tipo de vacina (BRASIL, 2006). Realizou-se o teste de estabilidade de uma vacina atenuada contendo a estirpe vacinal para prevenir a Doença de Gumboro em frangos de corte. Foram avaliadas partidas de vacinas produzidas há 6, 9, 12, 18 e 24 meses, em aves de um dia de vida. Vinte e um dia após a inoculação dessas vacinas nas aves, colheu-se amostras de sangue e o soro foi encaminhado para o laboratório responsável pela verificação dos níveis soroconversão. Acompanhou-se também o teste de estabilidade das partidas de uma vacina inativada polivalente para prevenir a Doença de Newcastle (DNC), Bronquite Infecciosa das Galinhas (BIG), Síndrome da Queda de Postura (EDS), Coriza infecciosa das Aves e Síndrome da Cabeça Inchada. As aves foram aleatoriamente distribuídas em 10 grupos com 12 animais cada e vacinadas via ocular ou via intramuscular, conforme o protocolo do estudo. Durante o estudo, observou-se as aves para verificar possíveis reações sistêmicas atribuíveis a vacinação ou alterações no consumo de ração e água. 23 Colheu-se amostras de sangue de todos os animais nos seguintes períodos: 21 dias antes da vacinação, no dia da vacinação e 28 dias após a vacinação. Após a obtenção do soro sanguíneo, as amostras foram congeladas e encaminhadas para o laboratório responsável pela realização das análises sorológicas. 3.8.4.4. Teste de reversão de virulência A ausência de reversão de virulência é um requisito importante para o registro e licenciamento de vacinas vivas. Os testes de reversão de virulência são padronizados, selecionam-se animais que sejam da idade, sexo e linhagem mais sensível à estirpe vacinal (BRASIL, 2006). O estudo consiste na inoculação da Master seed (semente mãe) nas aves em uma sequência de passagens, a fim de garantir a segurança da atenuação. Acompanhou-se a produção da quinta passagem da Master seed da estirpe vacinal do vírus da Bronquite Infecciosa Aviária. No primeiro dia de vida, as aves foram alojadas em isolador e foram vacinadas pela via ocular com material proveniente de um pool de traqueias obtido no estudo da produção da quarta passagem da Master seed. Observaram-se as aves diariamente quanto à avaliação de sinais específicos da infecção, tais como: secreções oculares, descarga nasal, dispneia e estertores. Quatro dias após a inoculação, as aves foram eutanasiadas e as traqueias foram colhidas, agrupadas em um pool e processadas conforme o protocolo do estudo. As amostras obtidas foram armazenadas em gelo seco e encaminhas para o laboratório da empresa responsável pelo estudo. 24 3.9. Teste de ciliostase O Teste de Ciliostase consiste na avaliação da atividade ciliar do epitélio traquel de aves previamente expostas ao vírus de Bronquite Infecciosa das Galinhas (DARBYSHIRE & PETERS, 1985). Administrou-se uma vacina experimental e efetuou-se o desafio das aves com uma estirpe patogênica. As aves foram eutanasiadas por deslocamento cervical e colheu-se a traqueia, sendo está dividida em três porções: proximal, medial e distal. Elas foram dispostas em uma placa de Petri com meio de cultura DMEM (Dulbecco Modification Minimum Essential Media), de forma a garantir a viabilidade das células até o momento da análise. Com o auxílio de uma lâmina de navalha colheu-se cortes finos de cada porção, totalizando três partes da porção proximal e distal e quatro partes da porção medial. Os cortes obtidos foram colocados em uma lâmina e observados em microscópio invertido para visualizar a atividade ciliar e determinar dos escores de motilidade, que variam de 0 a 4. O escore 0 representa movimento vigoroso em todos os cílios, enquanto escore 4 remete a ausência de cílios ou de movimentação ciliar (ANDRADE et al., 1982). Os dados de atividade ciliar foram registrados no formulário do estudo. 25 3.10. Teste de Sensibilidade aos Anticoccidianos (TSA) - Anticoccidial Sensitivity Test (AST) Os resultados do Teste de Sensibilidade aos Anticoccidianos auxiliam na elaboração de um programa estratégico de controle de coccidiose em granjas. Por meio desse estudo é possível identificar qual produto é mais efetivo no controle de uma determinada espécie de Eimeria spp. (KRAIESKI et al., 2021). A eficácia dos anticoccidianos é avaliada por meio do ganho de peso, conversão alimentar, mortalidade e da média dos escores de lesões do trato intestinal das aves. Colheu-se 5 kg de fezes de uma granja de frangos de corte, onde as aves apresentavam sinais clínicos sugestivos de desafio de coccidiose. As fezes foram acondicionadas em um recipiente contendo solução de dicromato de potássio. No laboratório, efetuou-se a purificação e identificação dos oocistos. Os oocistos foram destinados para o processo de esporulação em estufa incubadora B.O.D (Demanda Bioquímica de Oxigênio). Após a etapa de esporulação, determinou-se a concentração do inóculo. O AST foi realizado com uma estirpe de Eimeria maxima. Utilizou-se 240 frangos de corte machos distribuídos em 10 grupos com 4 repetições. Até aos 11 dias de vida, as aves receberam uma ração sem a adição de um produto anticoccidiano. Ao completarem 12 dias de vida, administraram-se os anticoccidianos nas rações, conforme descrito na Tabela 1. Aos 14 dias de vida das aves, inoculou-se a estirpe de Eimeria maxima via gavagem. Seis dias após o desafio, efetuou-se a pesagem e a eutanásia de todos os animais. 26 Avaliou-se os intestinos para classificação dos escores de lesões, que variam de o a 4. O escore 0 representa a ausência de lesões e os escores 1, 2, 3 e 4 indicam aumento da severidade das lesões, conforme descrito no item 3.12. Tabela 1. Delineamento experimental com os tratamentos anticoccidianos incluídos no TSA. Grupos Tratamentos Aves/gaiola G 1 Controle Negativo (não infectado e não tratado) 6 G 2 Controle Positivo (infectado e não tratado) 6 G 3 Lasacocida 6 G 4 Nicarbazina + Salinomicina 6 G 5 Decoquinato 6 G 6 Nicarbazina + Senduramicina 6 G 7 Monensina 6 G 8 Salinomicina 6 G 9 Narasina + Nicarbazina 6 G 10 Nicarbazina 6 27 3.11. Preparação de inóculos de Eimeria acervulina, Eimeria maxima e Eimeira tenella O laboratório da empresa produz inóculos das espécies de Eimeria acervulina, Eimeria maxima e Eimeira tenella. As aves são desafiadas com uma estirpe de Eimeiria e as fezes são armazenadas em um recipiente contendo uma solução de dicromato de potássio. Efetua-se a purificação das fezes e contagem dos oocistos em microscópio eletrônico. Encaminha-se o produto para a etapa de esporulação em estufa incubadora B.O.D. Após o período de esporulação, determina-se a concentração do inóculo e este é armazenado em geladeira com controle de temperatura entre 2°C a 8°C. 3.12. Análise dos escores de lesões decorrentes do desafio por Eimeria acervulina, Eimeria maxima e Eimeira tenella As análises dos escores de lesões macroscópicas causadas por Eimeria spp. seguem as recomendações de JOHNSON & REID (1970). Os autores estabeleceram uma escala de graus que varia entre 0 e 4. O Escore 0 representa a ausência de lesão, enquanto o escore 4 remete ao grau máximo de lesão. Os resultados da avaliação dos escores de lesões decorrentes da infecção por Eimeria acervulina, Eimeria maxima e Eimeria tenella são utilizados para estabelecer a concentração do inóculo a ser administrada nos estudos com estes protozoários. 28 As aves foram distribuídas em 6 grupos, os quais receberam via gavagem diferentes concentrações de inóculo. A classificação dos escores das lesões intestinais foi realizada 5 dias após a infecção para as espécies de Eimeria acervulina e Eimeria tenella e 6 dias após a infecção para a espécie Eimeria maxima. Na sequência, é apresentado a descrição dos escores para cada espécie: Eimeria acervuina: Escore 1 - lesões dispersas com placas brancas, restritas ao duodeno. Podem ser observadas na mucosa e serosa intestinal e variar até um máximo de 5 lesões por centímetro quadrado; Escore 2 - lesões mais próximas entre si, porém não coalescentes. A parede intestinal não apresenta espessamento e o conteúdo do trato digestivo apresenta-se normal; Escore 3 - lesões numerosas e coalescentes, com espessamento da parede intestinal e com conteúdo aquoso. As lesões podem estender-se até o divertículo do saco da gema (Figura 06); Escore 4 - a parede da mucosa apresenta coloração acinzentada com colônias totalmente coalescentes. Áreas de congestão podem estar restritas a petéquias ou toda a mucosa pode apresentar-se em coloração vermelho brilhante. A parede intestinal encontra-se muito espessada; 29 Figura 06. Lesão escore 3 causada pela infecção por Eimeria acervuina. Fonte: Arquivo pessoal. Eimeria maxima: Escore 1 - petéquias podem aparecer na serosa do intestino médio. Não há dilatação ou espessamento intestinal; Escore 2 - a superfície da serosa intestinal pode apresentar numerosas petéquias e com muco cor de laranja e dilatação do intestino; Escore 3 - a parede intestinal se apresenta espessada e com dilatação. Conteúdo intestinal repleto de coágulos de sangue e muco; Escore 4 - a parede intestinal pode apresentar dilatação em toda extensão, contém numerosos coágulos sanguíneos e células vermelhas do sangue digeridas, dando características de cor e odor pútridos (Figura 07). 30 Figura 07. Lesão escore 4 causada pela infecção por Eimeria maxima. Fonte: Arquivo pessoal. Eimeria tenella: Escore 1 - poucas petéquias dispersas na parede dos cecos, ausência de espessamento das paredes cecais e presença de conteúdo cecal normal; Escore 2 – lesões numerosas, conteúdo cecal pode apresentar sangue, parede do ceco um pouco espessada, pouco ou nenhum conteúdo cecal; Escore 3 - grande quantidade de sangue, paredes dos cecos espessadas e pouco ou nenhum conteúdo cecal; Escore 4- parede cecal distendida com sangue e grande quantidade de material caseoso, pode ocorrer morte das aves (Figura 08). 31 Figura 08. Lesão escore 4 causada pela infecção por Eimeria tenella. Fonte: Arquivo pessoal. 3.13. Avaliação do potencial patogênico do vírus da Bronquite Infecciosa (Infectious Bronchitis Vírus - IBV) em aves adultas Utilizou-se 50 aves adultas SPF, distribuídas aleatoriamente em 2 grupos experimentais com 25 aves cada. Desafiaram-se cada um dos grupos com estirpes diferentes do vírus de Bronquite Infecciosa Aviária. A inoculação foi realizada pela via ocular, por meio do gotejamento de 100 µL do inóculo em cada olho. A partir do desafio, monitoraram-se as aves por 30 dias, quanto à 32 manifestação de alterações clínicas: dispneia, cianose, estertores, conjuntivite, penas arrepiadas e diarreia. Avaliou-se diariamente a produção de ovos, monitorando as variáveis quantitativas (número de ovos) e qualitativas (espessura da casca, coloração, rachaduras, aspecto do albúmen e da gema). Um dia antes do desafio e no último dia do estudo colheu-se amostras de sangue. Efetuou-se a avaliação da excreção viral por meio dos suabes de traqueia e de cloaca obtidos antes do desafio e 14 dias após o desafio. Os animais foram recropsiados 30 dias após o desafio. Realizou-se o Teste de Ciliostase em cinco animais de cada grupo. Colheu-se fragmentos teciduais de traqueia, pulmão, rim e oviduto de todos os animais para avaliação histopatológica. Obtiveram-se também amostras de pulmão, rim e oviduto, as quais foram armazenadas em criotubos e mantidas congeladas para serem submetidas à realização da técnica de PCR. Observou-se a presença de áreas pálidas, pontos escuros, congestão e edema nos pulmões. Na traqueia observou-se a presença de exsudato catarral e muco. Em rins observou-se aumento de volume, urolitíase e presença de áreas pálidas. No sistema reprodutor os achados foram degeneração do oviduto, degeneração folicular e presença de gema livre no abdômen. Registraram-se as alterações no formulário do estudo. 33 3.14. Avaliação da patogenicidade de uma estirpe de Salmonella Enteritidis O objetivo do estudo foi avaliar a patogenicidade de uma estirpe de Salmonella enterica subesp. enterica sorovar Enteritidis (SE). Alojou-se 15 aves SPF no isolador e no primeiro dia de vida, inoculou-se diretamente no papo 0,1 mL da cultura de SE contendo 108 UFC/mL para cada ave. Observaram-se as aves diariamente durante todo período experimental para identificação de sinais clínicos, como: apatia, penas arrepiadas, asas caídas e diarreia. Efetuou-se necrópsias nos dias 2, 5 e 7 pós infecção para colheita de pools de fígado e baço. Os órgãos foram fragmentados com o auxílio de uma tesoura estéril e armazenados em tubos graduados. Encaminhou-se as amostras para o laboratório responsável pela realização das análises microbiológicas. 3.15. Controle da qualidade de água A empresa realiza o controle de qualidade da água seguindo os parâmetros exigidos pelo Ministério da Saúde. Diariamente é feito a leitura do cloro residual livre; semanalmente é avaliado a turbidez e mensalmente encaminham-se amostras para um laboratório especializado em monitoramento microbiológico. A concentração do cloro residual livre é obtida por meio do equipamento Colorímetro, sendo obrigatória a manutenção de no mínimo 0,2 34 mg/L e no máximo 5 mg/L em toda a extensão do sistema de distribuição e nos pontos de consumo de água. A turbidez mensura a propagação de um feixe luz na presença de partículas suspensas e é expressa por meio da Unidade Nefelométrica de Turbidez (NTU – Nephelometric Turbidity Unity). Avalia-se o nível de turbidez da água por meio do equipamento Turbidímetro e o valor máximo permitido é de 5,0 NTU. As amostras de água destinadas ao monitoramento microbiológico são armazenadas em frascos estéreis fornecidos pelo laboratório de análises. Precedentemente a colheita, as torneiras são higienizadas com álcool a 70% e deixa-se a água escoar por cerca de 2 a 3 minutos. Após a colheita, enviam-se as amostras para o laboratório. Os resultados das análises são encaminhados para o controle da Vigilância Sanitária, por meio da plataforma Sisagua- Sistema de Informação de Vigilância da Qualidade de Água para consumo humano. 4. DISCUSSÃO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS Os centros de pesquisas contribuem para a ascensão das empresas do segmento avícola. Os investimentos em estudos científicos são essenciais para o desenvolvimento de produtos veterinários que auxiliam na obtenção de aves cada vez mais saudáveis. O CAPEV é uma das poucas empresas que fornece serviços de experimentação animal e possui estrutura para condução de variados tipos de estudos. Durante o período de estágio, tive a oportunidade 35 de acompanhar as etapas iniciais do desenvolvimento de novos produtos de uso veterinário, identificar os principais sinais clínicos de doenças de importância na avicultura, além de conhecer o processo de avaliação da eficácia e inocuidade de vacinas comerciais e experimentais. 5. CONCLUSÃO Em síntese, o estágio curricular consistiu em uma experiência importante para complementar e aperfeiçoar minha formação científica e acadêmica, além de auxiliar no aprimoramento de minhas habilidades profissionais e pessoais. Como uma primeira experiência profissional na área de medicina veterinária, o estágio me proporcionou a oportunidade de vivenciar uma rotina empresarial, conhecer novos profissionais e adquirir uma preparação para o futuro mercado de trabalho como médica veterinária. 36 6. REFERÊNCIAS ANDRADE, L.F.; VILLEGAS, P.; FLETCHER, O.J.; LAUDENCIA, R. Evaluation of ciliary movement in tracheal rings to assess immunity against infectious bronchitis virus. Avian diseases, p. 805-815, 1982. BRASIL, 2006. Instrução Normativa n°7, de 10 de março de 2006. Disponível em:. Acesso em: 23 de março 2022. BRASIL, 2009. Decreto n° 6.899 de 15 de julho de 2009. Disponível em: < http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007- 2010/2009/decreto/d6899.htm#:~:text=Disp%C3%B5e%20sobre%20a%20com posi%C3%A7%C3%A3o%20do,de%20outubro%20de%202008%2C%20que>. Acesso em: 23 de março de 2022. BRASIL, 2015. Resolução Normativa n° 25, de 29 de setembro de 2015. Disponível em: < https://www.in.gov.br/materia/- /asset_publisher/Kujrw0TZC2Mb/content/id/33252781/do1-2015-10-02- resolucao-normativa-n-25-de-29-de-setembro-de-2015-33252777>. Acesso em 23 de março de 2022. 37 BRASIL, 2018. Resolução Normativa n° 37, de 22 de fevereiro de 2018. Disponível em: < https://www.in.gov.br/web/guest/materia/- /asset_publisher/Kujrw0TZC2Mb/content/id/4030569/do1-2018-02-22- resolucao-normativa-n-37-de-15-de-fevereiro-de-2018-4030565>. Acesso em: 13 de abril de 2022. DARBYSHIRE, J. H.; PETERS, R. W. Humoral antibody response and Assessment of protection following primary vaccination of chickens with maternally derived antibody against avian infection bronchitis virus. Research in Veterinary Science, v. 38, n.1, p.14-21, 1985. JOHNSON, J.; REID, W. M. Anticoccidial drugs: lesion scoring techniques in battery and floor-pen experiments with chickens. Experimental Parasitology, Philadelphia, v. 28, p. 30-36, 1970. KRAIESKI, A.L.; SALLES, G.B.C.; MUNIZ, E.C.; NASCIMENTO, D.V.J.; LIMA NETO, A.J.; SANTOS, I.L.; MADEIRA, A.M.B.M. Sensitivity of field isolates of Eimeria acervulina and E. maxima from three regions in Brazil to eight anticoccidial drugs. Poultry Science, v.100, n. 8, 2021. 38 II Assunto de interesse Revisão de literatura: Método de Exclusão Competitiva utilizado para prevenir a colonização intestinal de aves por Salmonella spp. 1. INTRODUÇÃO Os produtos avícolas podem ser fontes de agentes de salmoneloses humanas transmitidas por alimentos. A infecção de seres humanos por Salmonella spp. é um problema de saúde pública relevante em todo o mundo. De acordo com o Center for Disease Control and Preventions (CDC), somente nos Estados Unidos da América, bactérias do gênero Salmonella causam 1,35 milhão de infecções por ano. Conforme o Boletim Epidemiológico divulgado pela Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS), no Brasil, entre os anos de 2007 a 2015 ocorreram 725 surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs), sendo estas causadas principalmente pelo patógeno Salmonella (BRASIL, 2020). Embora várias medidas sejam tomadas para tentar evitar a infecção intestinal por Salmonella spp. em aves comerciais, sua ocorrência ainda é frequente (GIERALTOWSKI et al., 2016; IFSAC, 2019, CDC, 2021). A adição de antimicrobianos melhoradores de desempenho em rações é adotada na produção avícola para aumentar a produtividade. No entanto, o uso desses fármacos na dieta animal foi proibido em países europeus por acelerarem a emergência e a seleção de microrganismos resistentes (SARAIVA et al., 2021). Como alternativa aos antimicrobianos, o 39 uso de probióticos pode suprimir bactérias patogênicas do intestino de vertebrados devido à exclusão competitiva. Os produtos de exclusão competitiva têm sido aplicados com sucesso na alimentação animal, particularmente em aves, com o objetivo de reduzir as prevalências de infecções humanas por enteropatógenos como Salmonella spp. (NURMI & RANTALA, 1973; COUNCIL, 2003; Al-KHALAIFAH, 2018). Pesquisas têm abordado o uso de probióticos e prebióticos como alimentos funcionais para influenciar a microflora intestinal, os perfis microbianos, o desempenho e a saúde das aves. Os probióticos afetam beneficamente o animal, melhorando seu equilíbrio microbiano intestinal e os prebióticos beneficiam o hospedeiro estimulando seletivamente a multiplicação e a atividade de bactérias benéficas no intestino (SOHAIL et al., 2012; AL- KHALAIFA et al., 2019). Com base nesses fatores, é relevante investigar a comunidade microbiana, a fim de compreender melhor o seu comportamento e a complexa interação entre hospedeiro e microbiota dentro do Trato Gastrointestinal (TGI) de aves. Essas observações podem contribuir para fortalecer as medidas de controle da disseminação de Salmonella spp. em granjas avícolas. 2. GÊNERO SALMONELLA As bactérias do gênero Salmonella pertencem à família Enterobacteriaceae, são gram-negativas, em forma de bastonetes, não esporuladas, anaeróbias facultativas, produtoras de sulfeto de hidrogênio https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119479637#bib35 40 (H2S), não fermentadoras de lactose e, em sua maioria, possui flagelos peritríqueos (GRIMONT et al., 2000). Foram identificados 2.659 sorovares do gênero Salmonella. O gênero é dividido em duas espécies: S. bongori e S. enterica, sendo que a última compreende mais de 99% dos sorovares. Salmonella enterica é subdividida em seis subespécies subspecies: enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica (GRIMONT & WEILL, 2007; ISSENHUTH-JEANJEAN et al., 2014). A distinção dos sorovares segue o esquema proposto por White- Kauffmann-Le Minor por meio da identificação dos antígenos de superfície somático (O), flagelar (H) e capsular (Vi). O antígeno “O” possui diferentes carboidratos terminais, parte essencial do lipopolissacarídeo (LPS) na parede celular bacteriana. O antígeno “H” é composto pelas proteínas denominadas flagelinas e está presente em bactérias móveis. O antígeno “Vi”, de virulência ou capsular também pode ser identificado em sorovares específicos (GRIMONT & WEILL, 2007). 3. IDENTIFICAÇÃO DA MICROBIOTA INTESTINAL POR MÉTODOS MOLECULARES Em 1975, o conceito de sequenciamento de DNA foi introduzido e essa tecnologia foi baseada na incorporação de um desoxinucleosídeo trifosfato, marcado com fluorescência e primers de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (SANGER & COULSON, 1975). Posteriormente, outras tecnologias foram desenvolvidas e deram origem às plataformas conhecidas 41 como NGS (next-generation sequencing) e WGS (Whole Genome Sequencing). Essas plataformas de sequenciamento permitiram obter informações relacionadas à genômica, metagenômica (sequenciamento de todo o genoma) e transcriptômica (estudo do transcriptoma). Atualmente, essas ferramentas ômicas são utilizadas para investigar os genes contidos em um organismo, o microbioma presente em diferentes tecidos e o perfil de expressão de genes em diversas condições. O desenvolvimento da metagenômica possibilitou o estudo do genoma microbiano e revelou que a microbiota intestinal desempenha papéis importantes na fisiologia e imunidade do hospedeiro (CLEMENTE et al., 2012). A microbiota intestinal pode aumentar a eficiência digestiva, promover o desenvolvimento do sistema imunológico e limitar a colonização de patógenos (FRAUNE & BOSCH, 2010; OAKLEY et al., 2014). Os métodos clássicos baseados em cultura são amplamente utilizados para estudar a microbiota intestinal de frangos. No entanto, esses métodos são seletivos para bactérias cultiváveis sob condições específicas e maioria das bactérias permanecem não cultivadas (HUGENHOLTZ et al., 1998; SIEGERSTETTER et al., 2017). O desenvolvimento da biotecnologia molecular ofereceu novas ferramentas para estudar a composição, diversidade, função e interação da microbiota intestinal em seções do TGI. Atualmente, diversas técnicas moleculares estão disponíveis, entre as quais, o sequenciamento de alto rendimento de amplicons do gene 16S RNA ribossomal (rRNA) é um dos métodos de escolha. A molécula de rRNA 16S é uma pequena subunidade do https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2017.01967/full#B22 https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2017.01967/full#B46 42 ribossomo que possui regiões de similaridade de sequência que são altamente conservadas em todas as bactérias. Para amplificar esses genes, o DNA microbiano é extraído de amostras fecais ou da digesta e primers que visam regiões conservadas do gene 16S rRNA, são utilizados para amplificação por PCR (APAJALAHTI et al., 2004). O sequenciamento desses produtos amplificados (amplicons) pode distinguir as bactérias, geralmente em nível de gênero ou espécie (WEISBURG et al., 1991; FLINT et al., 2006). Assim, o sequenciamento de genes 16S rRNA fornece um censo de uma comunidade bacteriana, definindo os tipos de bactérias presentes em uma amostra e suas abundâncias relativas. Com esses avanços metodológicos é possível avaliar uma amostra intestinal com precisão para determinar, por exemplo, como o microbioma responde a diferentes aditivos alimentares, condições de criação ou estados de doença (SHANG et al., 2018). A tecnologia de sequenciamento genético WGS possibilita o diagnóstico e a tipagem molecular de patógenos (TASMIN et al., 2017). O WGS é um método confiável para distinguir isolados de surtos provocados por Salmonella spp., pois permite a detecção de alterações em poucos nucleotídeos entre estirpes aparentemente clonais. Ademais, o WGS proporciona à visualização do genoma bacteriano com alto grau de resolução, permitindo à visualização de alterações estruturais ligadas a evolução dos microrganismos e aquisição de características de virulência (WALKER et al., 2013; HOFFMANN et al., 2014). Monte et al. (2019), ao utilizarem técnicas de WGS, identificaram sorovares resistentes a antimicrobianos na cadeia 43 produtivas de alimentos no Brasil, demonstrando ser um meio útil de conhecer as interações filogenéticas e fornecer genotipagem de alta resolução em bactérias do gênero Salmonella. Essas contribuições favorecem a implementação de estratégias que reduzam a presença de patógenos na avicultura e também são úteis na geração e análise de informações ômicas que podem resultar na formulação de produtos terapêuticos. 4. DESENVOLVIMENTO DA MICROBIOTA A microbiota é definida como uma comunidade microbiana que inclui microrganismos comensais, simbióticos e patogênicos, que geralmente colonizam uma área de organismos humanos e animais (SENDER et al., 2016). O genoma coletivo desses simbiontes é conhecido como microbioma que, por sua vez, exerce uma influência importante na saúde e no desenvolvimento dos hospedeiros (TURNBAUGH et al., 2007). O trato gastrointestinal das aves abriga uma comunidade diversificada e dinâmica de microrganismos, consistindo principalmente de bactérias. A microbiota em aves varia de acordo com diversos fatores, como a dieta, sexo, genética e idade. Por esta razão, os perfis de composição taxonômica diferem nos estudos relatados (ZHU et al., 2002). O desenvolvimento do embrião aviário ocorre em um ovo extracorpóreo, ou seja, não está diretamente associado ao corpo materno. O estabelecimento do microbioma do embrião aviário é pouco conhecido. https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/microbial-communities#_blank https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/microbiome#_blank https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119310922?via%3Dihub#bib102 44 Estudos sugerem que a herança da microbiota intestinal é derivada da mãe pelo processo de fertilização e formação do ovo no oviduto (STANLEY et al., 2015; PEDROSO et al., 2016). Ding et al. (2017) utilizaram o DNA genômico microbiano isolado de embriões para estabelecer o perfil da microbiota embrionária de aves. Neste estudo, identificou-se 28 filos, 162 gêneros e 76 espécies presentes nos embriões de 4 e 19 dias de vida, sendo que o filo mais abundante foi Proteobacteria (86%), seguido por Firmicutes (5%), Bacteroidetes (4%) e Actinobacteria (3%). Os gêneros microbianos dominantes foram Halomonas (79%) e Ochrobactrum (5%), que pertencem ao filo de Proteobacteria. Além disso, o estudo relatou diferenças nas vias metabólicas da microbiota de embriões, pintos e galinhas. À medida que a microbiota intestinal dos embriões evolui, pode desenvolver vias funcionais mais complexas, como metabolismo de substâncias, sinalização celular e metabolismo de vitaminas. Comparar a capacidade funcional da microbiota intestinal em diferentes estágios de desenvolvimento do hospedeiro pode auxiliar a entender as relações entre a microbiota intestinal e seu hospedeiro. A comunidade microbiana do trato intestinal de animais adultos de sangue quente consiste em até 1010 células bacterianas por grama de digesta. Embora se estime que aproximadamente 1.000 espécies bacterianas diferentes compõem a microbiota do trato intestinal, essas pertencem apenas a dois filos principais: Firmicutes Gram-positivos e Bacteroidetes Gram-negativos. Representantes desses dois filos comumente formam cerca de 95% da microbiota intestinal total e os 5% restantes são formados principalmente por 45 membros de Proteobacteria e Actinobacteria (HILL et al., 2017; SERGEANT et al., 2014). Em um ambiente natural, as aves são chocadas em contato com uma galinha adulta, enquanto que na produção comercial atual de aves, baseia-se na incubação artificial. A colonização intestinal de aves incubadas comercialmente é dependente de fontes ambientais durante as quais o ceco das aves é colonizado por Enterobacteriaceae (filo Proteobacteria), que são substituídos por Lachnospiraceae e Ruminococcaceae (filo Firmicutes) durante a segunda semana de vida. Por volta de um mês de idade, Firmicutes passa a ser complementado por isolados bacterianos pertencentes ao filo Bacteroidetes (VIDENSKA et al., 2014). A microbiota de pintos criados na presença de uma galinha adulta desenvolve-se rapidamente e, em uma semana, atinge uma composição semelhante à observada em aves adultas. O desenvolvimento gradual da microbiota durante as primeiras semanas de vida deixa as aves altamente suscetíveis a diferentes patógenos, como os do gênero Salmonella. Por outro lado, a inoculação de pintos com microbiota de galinhas adultas pode aumentar sua resistência à infecção (RANTALA & NURMI, 1973; VARMUZOVA et al., 2016; KUBASOVA et al., 2019). 5. COMPOSIÇÃO DA MICROBIOTA DE ACORDO COM A LOCALIZAÇÃO DO TRATO GASTROINTESTINAL Os órgãos do sistema digestivo desempenham funções importantes para o processo de digestão e absorção de nutrientes. Cada seção do TGI tem 46 diferentes funções metabólicas que moldam a comunidade microbiana e, portanto, é importante considerar o local de amostragem (YEOMAN et al., 2012). Wielen et al. (2002) demonstram que cada parte do TGI tem sua comunidade bacteriana específica e pode ser considerada como um ecossistema separado. De acordo com Menten & Pedroso (2005), as diferenças entre microbiotas do trato gastrointestinal decorrem de alterações do pH, de secreção enzimática da região, da velocidade de trânsito do bolo alimentar e da concentração de ácidos graxos voláteis. Na moela, as atividades de fermentação bacteriana são baixas, principalmente devido ao pH reduzido. A maioria das bactérias deste órgão são lactobacilos, enterococos, enterobactérias lactose-negativas e coliformes (REHMAN et al., 2007). A comunidade bacteriana duodenal consiste principalmente de clostrídios, estreptococos, enterobactérias e lactobacilos (WAITE & TAYLOR, 2015). Lu et al. (2003) avaliaram a comunidade bacteriana ileal examinando sequências do gene 16S rRNA e encontraram Lactobacillus como o grupo principal (70%), seguido por membros da família Clostridiaceae (11%), Streptococcus (6,5%) e Enterococcus (6,5%). O ceco contém maior diversidade e abundância taxonômica, por ser a unidade do trato digestivo que retém alimento por mais tempo (12 a 20 h) (CLAVIJO & FLÓRES, 2018). Outras características que fazem desse órgão um nicho importante para a microbiota são o fato de ser o local de maior absorção de água, responsável pela regulação da ureia e por realizar a fermentação dos carboidratos. Normalmente, a riqueza e a diversidade no ceco 47 aumentam durante as 6 primeiras semanas de vida da ave. A composição taxonômica da comunidade muda rapidamente de Proteobacteria, Bacteroides e Firmicutes para quase inteiramente Firmicutes às 3 semanas de vida (OAKLEY et al., 2014; KOGUT & OAKLEY, 2016). No entanto, Kumar et al. (2018) encontraram que Firmicutes foi o filo mais abundante tanto no ceco quanto no íleo em todas as idades (dia 0 ao dia 42). 6. RESISTÊNCIA À COLONIZAÇÃO DE PATÓGENOS MEDIADA PELA MICROBIOTA A composição da microbiota é conduzida pela competição entre as espécies e por fatores ambientais, denominados filtros de habitat, que determinam as características dentro da comunidade microbiana. Esses filtros de habitat incluem a dieta, recursos derivados do hospedeiro e metabólitos derivados da microbiota, como ácidos graxos de cadeia curta. A competição e a filtragem do habitat impedem a inserção de novos microrganismos, fornecendo proteção contra infecções oportunistas (ROGERS et al., 2020). A competição é comum entre espécies semelhantes e pode levar à exclusão competitiva, limitando assim, o número de espécies coexistentes. Em contraste, a filtragem de habitat limita as estratégias bem-sucedidas entre os microrganismos coexistentes, o que pode levar espécies com características ou fenótipos particulares a dominarem a comunidade microbiana (MACARTHUR & LEVINS, 1967; KEDDY, 1992). 48 Os subprodutos mais abundantes do metabolismo fermentativo da microbiota são os ácidos graxos de cadeia curta: acetato, propionato e butirato. Esses ácidos conseguem inibir o crescimento de Salmonella Enteritidis em camundongos, tendo um papel crucial na mediação da resistência à colonização (BOHNHOFF et al., 1964). Segundo Meynell et al. (1963), a perturbação da microbiota de camundongos pelo tratamento com estreptomicina reduz as concentrações de ácidos graxos de cadeia curta e aumenta o pH luminal do intestino grosso, gerando condições favoráveis à multiplicação de sorovares de Salmonella spp. in vivo e in vitro. Embora os camundongos sejam usados como modelo animal em estudos de infecções por Salmonella spp., tem sido indicado que os genes envolvidos na colonização intestinal bacterina podem ter papéis diferentes entre as espécies (SARAIVA et al., 2021; GAO et al., 2022). Estudos sugerem que a supressão da multiplicação de Salmonella spp. pela filtragem de habitat mediada pela microbiota não se limita a produção de ácidos graxos de cadeia curta, mas também inclui o esgotamento de recursos, como aminoácidos. Uma depleção de aminoácidos mediada pela microbiota filtra o ambiente para excluir bactérias que não possuem vias de biossíntese de aminoácidos (CABALLERO-FLORES et al., 2020). Durante a infecção intestinal, Salmonella enterica é capaz de se multiplicar induzindo a inflamação. Os subprodutos da resposta inflamatória, como o 1,2 - propanodiol e o tetrationato podem favorecer a multiplicação de Salmonella spp. O 1,2-propanodiol é utilizado como fonte de energia e o 49 tetrationato promove respiração anaeróbica, proporcionando, assim, vantagens metabólicas para a bactéria competir com a microbiota residente no hospedeiro (WINTER & BÄUMLER, 2011). Winter et al. (2010) demonstraram que os genes que conferem a capacidade de usar tetrationato como aceptor de elétrons podem favorecer a multiplicação de Salmonella Typhimurium sobre a microbiota concorrente no lúmen intestinal de camundongos. No entanto, Saraiva et al. (2021) investigam o papel dos genes codificadores de tetrationato (ttrA) e propanodiol (pduA) durante a infecção de aves comerciais desafiadas por Salmonella Enteritidis (SE) e Salmonella Typhimurium (STM) e não encontraram diminuição na virulência bacteriana. A resistência à colonização por sorovares de Salmonella spp. também envolve a competição com espécies bacterianas que são residentes na microbiota intestinal. Litvak et al. (2019), demonstraram que um isolado comensal de Escherichia coli compete com mais sucesso com SE quando o comensal estabelece uma colonização intestinal prévia em pintos recém- nascidos. Este achado sugere que as Enterobacterales endógenas têm uma vantagem competitiva sobre espécies semelhantes que tentam entrar no ecossistema, uma vez que os efeitos prioritários proporcionam acesso a recursos limitadores de crescimento. Embora os membros dos Enterobacterales sejam espécies minoritárias dentro da microbiota intestinal, desempenham um papel fundamental na proteção contra patógenos anaeróbios facultativos, como sorovares de Salmonella spp. (VELAZQUEZ et al., 2019; ROGERS et al., 2020). 50 7. EXCLUSÃO COMPETITIVA Segundo a ecologia, duas espécies competindo pelos mesmos recursos não podem coexistir de forma estável. Portanto, um dos concorrentes sempre dominará o outro, levando a uma modificação evolutiva, mudança para outro nicho ou extinção. A microbiota intestinal compete com as bactérias patogênicas colonizadoras e é capaz de reduzir a adesão e colonização de patógenos no intestino. Essa redução pode ser resultado de diferentes mecanismos, como a ocupação física do espaço e a competição por recursos com o potencial colonizador (CHAUCHEYRAS-DURAND & DURAND, 2010). A atividade inibitória da microbiota intestinal pode ser explorada pelas preparações de conteúdo intestinal ou fezes, cultivadas in vitro e administradas para pintos recém-nascidos. Esse procedimento é chamado de exclusão competitiva (EC) ou o "conceito Nurmi". Nurmi & Rantala (1973) demonstraram os efeitos benéficos da microbiota intestinal contra a colonização por Salmonella Infantis quando aceleraram o processo de colonização da microflora pela administração a aves jovens de culturas fecais obtidas de aves adultas. No entanto, um dos problemas associados ao seu uso é o potencial de introdução de outros patógenos intestinais (vírus, protozoários e bactérias) em lotes não infectados com as culturas intestinais. Para prevenir este problema, pode-se realizar cultivos seriados para evitar a presença de patógenos (SNOEYENBOS et al., 1978; MEAD & YMPEY, 1987). Almeida et al. (2002) analisaram uma preparação da flora intestinal que foi submetida várias https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119310922?via%3Dihub#bib16 51 vezes a processos in vitro, armazenada e testada quanto à sua atividade inibitória contra SE em aves. Os resultados desse estudo mostraram que o cultivo repetido por 14 vezes não prejudicou a ação protetora da cultura (EC), a qual continuou inibindo a colonização cecal por SE. O método de exclusão competitiva pode auxiliar na formação de uma barreira microbiana protetora que se fixa às paredes epiteliais do enterócito e, assim, reduz a oportunidade de colonização por bactérias patogênicas (YEGANI & KORVER, 2008). Essas bactérias produzem vitaminas (por exemplo, vitamina K e vitamina B), ácidos graxos de cadeia curta (ácido acético, ácido butírico e ácido propiônico), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido lático), compostos antimicrobianos (por exemplo, bacteriocinas) e induzem respostas que favorecem a nutrição e proteção ao animal (JEURISSEN et al., 2002; SHANG et al., 2018). A microbiota comensal pode estimular o desenvolvimento do sistema imunológico, incluindo a camada de muco, a monocamada epitelial, as células imunes intestinais (por exemplo, células T citotóxicas, células produtoras de imunoglobulinas e células fagocitárias) e a lâmina própria (SHAKOURI et al., 2009.; OAKLEY et al., 2014). Milbradt et al. (2014) relataram que a suplementação contínua na ração com produto de EC reduziu a colonização por SE no ceco de perus, levando a um menor risco de contaminação da carne durante o abate. Rambousck et al. (1995) identificaram que a administração de culturas da microbiota fecal a pintos recém-nascidos é capaz de prevenir a infecção por https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2018.00254/full#B13 https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2018.00254/full#B13 https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2018.00254/full#B13 https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fvets.2018.00254/full#B13 https://sfamjournals.onlinelibrary.wiley.com/action/doSearch?ContribAuthorRaw=Milbradt%2C+EL 52 Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Agona e Salmonella Infantis. O sucesso na proteção da colonização intestinal de Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis em pintos também foi demonstrado com a administração de produto comercial de EC (NAKAMURA et al., 2002). Braukmann et al. (2016) avaliaram o uso combinado de uma vacina viva com uma cultura de exclusão competitiva contra a exposição por Salmonella Enteritidis em pintos. A combinação resultou em um efeito protetor aditivo e evitou completamente a disseminação sistêmica da bactéria. O método de EC também se mostrou eficaz para o controle de outros patógenos. Dame-Korevaar et al. (2020) demonstraram que o fornecimento de produtos de exclusão competitiva pode reduzir a prevalência de Escherichia coli produtora de ESBL (beta lactamase de espectro estendido) em frangos de corte. Szott et al. (2022) relataram que a utilização de culturas de EC pode ser considerada uma estratégia para reduzir a colonização de Campylobacter jejuni aves. O processo de exclusão competitiva é uma das abordagens mais eficaz para prevenir a colonização intestinal por Salmonella spp. em frangos de corte. Assim, diversos produtos têm sido desenvolvidos visando o controle desse patógeno, que vão desde o uso de probióticos até a inoculação de culturas extraídas do material fecal produzido em galpões mais produtivos e com melhor saúde intestinal (OLIVEIRA et al., 2000; ALMEIDA et al., 2002; CHAMBERS & GONG, 2011). https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/broiler-chickens#_blank https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119310922?via%3Dihub#bib15 53 8. PREBIÓTICOS Os prebióticos são definidos como ingredientes que estimulam o aumento da atividade microbiana benéfica no sistema digestivo, a fim de melhorar a saúde do hospedeiro (PATEL & GOYAL, 2012). O termo prebióticos inclui alguns carboidratos e compostos relacionados, como galacto-oligossacarídeos (GOS), manano-oligossacarídeos (MOS) e fruto-oligossacarídeos (FOS), que, após a ingestão, são digeridos pelo hospedeiro ou pela microbiota intestinal. Portanto, os prebióticos geralmente são administrados para induzir um efeito modulador na microbiota intestinal, aumentando a incidência de bactérias benéficas. As bactérias probióticas exercem efeito competitivo no intestino e produzem bacteriocinas, que têm efeito antimicrobiano sobre outras bactérias (PATTERSON & BURKHOLDER, 2003; KHAN et al., 2020; RICKE et al., 2020;). Autores demonstraram o potencial dos prebióticos para reduzir a incidência de Salmonella spp. no trato gastrointestinal de aves. A suplementação de prebióticos como FOS, farinha de Aspergillus ou trealose reduziu significativamente a bactéria em conteúdo cecal de frangos de corte e perus (LONDERO et al., 2011). Esse efeito benéfico é atribuído à capacidade dos prebióticos de modular a microbiota intestinal, promovendo a expressão de moléculas como o receptor toll-like (TLR-4), associado à resistência à infecção por Salmonella spp. (EL-SHALL et al., 2020). A administração de prebióticos aumenta o acúmulo de células IgA na mucosa intestinal, o que previne a colonização por Salmonella spp. (ADHIKARI et al., 2018; WU et al., 2020). https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/lantibiotics#_blank https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib54 54 Assim, a administração de prebióticos às aves promove a modulação da microbiota gastrointestinal e, posteriormente, desencadeia os mecanismos necessários para inibir a infecção e a transmissão horizontal por Salmonella spp. 9. PROBIÓTICOS Os probióticos são compostos contendo microrganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um efeito benéfico à saúde do hospedeiro. Um microrganismo pode ser considerado um probiótico, quando atende a uma série de requisitos, como: não patogênico; capacidade de aderir às células epiteliais; capacidade de colonizar e reproduzir-se no hospedeiro; capacidade de sobreviver à passagem pelo TGI; resistente à acidez gástrica e ao conteúdo da bile e produzir metabólitos que inibem ou matam bactérias patogênicas e ser submetido a ensaios in vitro e in vivo que demonstram seus benefícios (SYNGAI et al., 2016). Sua inclusão como suplementos dietéticos em aves oferece resultados positivos associados à sua capacidade de inibir a multiplicação de bactérias patogênicas. Nesse contexto, algumas bactérias probióticas (sozinhas ou combinadas) têm sido utilizadas para prevenir ou controlar infecções por Salmonella spp. durante a produção avícola (ROBERFROID, 2000, PARVEZ et al., 2006; HILL et al., 2014). 55 Al-Zenki et al. (2009) investigaram o efeito de produtos probióticos comerciais contendo Saccharomyces cerevisiae e Pediococcus acidilactici no controle de Salmonella spp. em frangos de corte. Verificaram que os tratamentos reduziram a incidência de Salmonella spp. no ceco e na carcaça de frangos. Arreguin-Nava et al. (2019) relataram que o produto probiótico contendo Lactobacillus spp. reduziu significativamente a presença de Salmonella Enteritidis em ceco e tonsila cecal de perus. Ademais, Al-Khalaifa et al. (2019) não registraram a presença de Salmonella spp. durante o ciclo de criação de frango de corte após a utilização de probióticos à base de Bacillus coagulans e Lactobacillus spp. A suplementação dietética com probióticos pode melhorar também o desempenho produtivo das aves. Relatos sobre o uso de probióticos na produção avícola demonstraram efeitos positivos nos diferentes parâmetros de desempenho em frangos de corte, incluindo status imunológico e eficiência alimentar (MOUNTZOURIS et al., 2007; MIDILLI et al., 2008; AWAD et al., 2009; HUYGHEBAERT et al., 2011; REHMAN, 2020). Os mecanismos pelos quais as bactérias intestinais inibem patógenos incluem a competição por locais de colonização no epitélio intestinal, competição por nutrientes e produção de compostos tóxicos, como ácidos graxos voláteis e bacteriocinas ou modulação do sistema imunológico (AL-KHALAIFAH, 2018). As bacteriocinas são peptídeos produzidos por bactérias que são ativos contra outras bactérias e têm sido um critério https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib3 https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/saccharomyces-cerevisiae#_blank https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/bacillus-coagulans#_blank https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/bacillus-coagulans#_blank https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/lactobacillus#_blank https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib45 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib8 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib35 https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/volatile-fatty-acids#_blank 56 importante na seleção de uma cepa probiótica (BRAUN et al., 1994; PARKER et al., 1992). As bactérias probióticas também são capazes de aumentar as respostas imunes específicas e inespecíficas, por meio da ativação de macrófagos, produção de citocinas e imunoglobulinas, especialmente IgA. Os efeitos imunomoduladores dos probióticos podem incluir alterações nas vias de sinalização intracelular e na atividade do fator de transcrição. A suplementação dietética com probióticos potencializa a expressão de RNA mensageiro (mRNA) de genes relacionados à resposta imune inata (CASAS et al., 1998; HAGHIGHI et al., 2006; ALAVI et al., 2012; AL-KHALAIFAH, 2018). 10. CONSIDERAÇÕES FINAIS A infecção de aves por membros do gênero Salmonella ainda é um dos principais desafios para a indústria avícola, seja pelas enfermidades que acometem as aves, seja pelo fato de os produtos de origem avícola serem associados, frequentemente, às salmoneloses humanas de origem alimentar. A resistência aos antimicrobianos levou ao surgimento de alternativas para controlar a infecção por Salmonella spp., prevenir as doenças e aumentar o desempenho produtivo das aves. O método de Exclusão Competitiva pode auxiliar na redução de Salmonella spp., quando inserido em um programa de biossegurança. Nos últimos anos, um progresso significativo foi feito na compreensão da composição taxonômica do microbioma do TGI e suas https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib11 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib52 https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/immunoglobulins#_blank https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib12 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib31 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032579119304845#bib4 57 contribuições para a saúde intestinal. É importante que estudos futuros apliquem abordagens multiômicas para aumentar a compreensão do papel do microbioma na nutrição, saúde e produtividade de aves comerciais. O progresso neste campo pode ajudar a entender como gerenciar a microbiota intestinal e avançará na compreensão da modificação das vias metabólicas associadas à microbiota, proporcionando novas estratégias para o controle de patógenos como Salmonella spp. 58 REFERÊNCIAS ADHIKARI, P.; COSBY, D.E.; COX, N.A.; FRANCA, M.S.; WILLIAMS, S.M.; GOGAL, R.M.; RITZ, C.W.; KIM, W.K. Effect of dietary fructooligosaccharide supplementation on internal organs Salmonella colonization, immune response, ileal morphology, and ileal immunohistochemistry in laying hens challenged with Salmonella Enteritidis. Poult. Sci., v. 97, p. 2525–2533, 2018. AL-KHALAIFA, H.; AL-NASSER, A.; AL-SURAYEE, T.; AL-KANDARI, S.; AL- ENZI, N.; AL-SHARRAH, T.; RAGHEB, G.; AL-QALAF, S.; MOHAMMED, A. 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