UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA CÂMPUS DE ARAÇATUBA GRAZIELLA BORGES ALVES INÁCIO Epidemiologia da Leishmaniose Visceral Canina e Distribuição do Vetor no Município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. ARAÇATUBA – SP 2019 GRAZIELLA BORGES ALVES INÁCIO Epidemiologia da Leishmaniose Visceral Canina e Distribuição do Vetor no Município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Ciência Animal (Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal). Orientadora: Profa. Ass. Katia Denise Saraiva Bresciani. Coorientadora: Dra. Lilian Aparecida Celebrusco Rodas. ARAÇATUBA – SP 2019 Á minha família pelo todo amor, por me apoiarem e incentivarem a prosseguir em direção aos meus objetivos. AGRADECIMENTOS À Deus por todas as graças alcançadas, pelos obstáculos enfrentados e superados. À minha querida orientadora Katia Denise Saraiva Bresciani, pelo apoio incondicional, pelas orientações nas minhas dúvidas e dilemas que foram surgindo durante a pesquisa, pelo meu crescimento científico, pela amizade, carinho e compreensão. Obrigada, pelo grande exemplo de pessoa e pesquisadora. À minha coorientadora Lilian Aparecida Celebrusco Rodas pela amizade, paciência, parceria e orientação nas horas dos questionamentos que foram aparecendo durante a pesquisa. Ao Dr. Jancarlo Ferreira Gomes pelo apoio e incentivo ao meu crescimento profissional e científico. Aos meus pais, Gilmar e Onofra, por me incentivar a sempre buscar o conhecimento e ao meu crescimento profissional. Como eles sempre me disseram “o estudo e o conhecimento, ninguém tira de você”. Muito obrigada por tudo. Ao meu marido, Fabio Inácio que sempre esteve ao meu lado, me apoiando e incentivando a prosseguir e nunca desistir dos meus objetivos. Á minha irmã, Daniella, e minhas queridas sobrinhas, Marina e Sarah, pelo apoio, amor e alegria que contagia o meu dia. Aos meus queridos amigos médicos veterinários Alex A. Nakamura, Carolina Beatriz Baptista, Gisele Moraes dos Santos, Talita Carolina Bragança de Oliveira e Walter Bertequini Nagata pela amizade, apoio e colaboração ao desenvolvimento do meu projeto. À minha amiga Sandra Valéria Inácio, pela amizade, pelos momentos de incentivo, apoio e principalmente pela parceria. Ás alunas de Iniciação Cientifica, Ana Carolina, Gabriely, Larianne e Nicole pela colaboração e o desenvolvimento do projeto. Ao Laboratory of Image Data Science (LIDS), por me conceder as imagens dos flebotomíneos para o desenvolvimento do meu trabalho. Aos colegas do Laboratório de Parasitologia Veterinária, pela amizade, solidariedade e companheirismo no decorrer da minha jornada. Aos Doutores que participaram do exame qualificação e da defesa, por munir-me das devidas correções e orientações para o aprimoramento do meu trabalho. Às Professoras Anaiá P. Sevá, Cáris M. Nunes, Daniela B. Rozza e Tereza Cristina C. Silva, pela ajuda e apoio científico. Aos professores da Pós-Graduação, que colaboraram com o meu crescimento profissional. À Faculdade de Medicina Veterinária e a Pós-graduação pelo suporte técnico e acessibilidade. Aos moradores que participaram e contribuíram para a realização da minha pesquisa. Aos colaboradores Paulo Donizeti Bini, Débora Bigrato, William C. de Jesus, Luiz Dantas, Ney A. Soares, Jurandir S. Cordeiro, Neusa Fernandes Chierici, Letícia da Silva Santos, Weslley de Oliveira Alves, Keuryn Mira Luz Requena, Maria Stela B. Beaudoin, Lúcia de Fátima H. Ferreira, Rubens Antônio da Silva da Superintendência de Controle de Endemias de Araçatuba/SP, pelo apoio técnico e para o desenvolvimento da minha pesquisa. Aos colaboradores Eliana Bravos Calemes, Roberto Mitsuyoshi Hiramoto, José Eduardo Tolezano, do Instituto Adolfo Lutz, Araçatuba/SP, pelo apoio técnico e para o desenvolvimento da minha pesquisa. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo financiamento da bolsa de doutorado. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo financiamento da bolsa de doutorado e da reserva técnica para o desenvolvimento do meu projeto (Processo do número 2017/24538-0). “O saber a gente aprende com os mestres e os livros. A sabedoria se aprende é com a vida e com os humildes. Feliz aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”. (Cora Coralina) INÁCIO, G. B. A. Epidemiologia da Leishmaniose Visceral Canina e Distribuição do Vetor no Município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. 2019. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2019. RESUMO A Leishmaniose Visceral (LV) apresenta uma ampla distribuição geográfica em todos os continentes, representando um sério problema de Saúde Pública. Os flebotomíneos (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) são importantes insetos vetores de microrganismos patogênicos como Leishmania spp., Bartonella spp. e arbovírus (Vesiculovirus, Phlebovirus, Orbivirus), porém, estes insetos apresentam grande importância para a transmissão das leishmanioses em várias regiões do mundo, incluindo as Américas do Sul e Central. No Brasil, há duas espécies, até o momento, relacionadas com a transmissão da Leishmania infantum: a Lutzomyia longipalpis e a Lutzomyia cruzi. Infecções por Leishmania spp. são potencialmente zoonóticas e acometem homens e diversas espécies de animais silvestres e domésticos. Os cães são importantes hospedeiros, fontes de infecções e potenciais reservatórios, não só pelo estreito relacionamento ou convívio com os seres humanos, mas também por sua incapacidade imunológica em responder à doença com sucesso. O Ministério da Saúde no Brasil, preconiza para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (LVC), o teste imunocromatográfico, como exame de triagem e o ensaio imunoenzimático, como confirmatório. Também recomenda o diagnóstico precoce e tratamento adequado dos casos humanos, o controle dos vetores, a eutanásia dos cães e atividades de educação em saúde nas áreas endêmicas para esta doença. Por tanto, foram instituídas ações de prevenção e controle da LV canina, na área urbana do Município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Palavras-chave: Leishmaniose. Cães. Flebotomíneos. INÁCIO, G. B. A. Epidemiology of Canine Visceral Leishmaniasis and Vector Distribution in Municipality of Araçatuba, São Paulo, Brazil. 2019. Tese (Doutorado) -Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2019. ABSTRACT Visceral leishmaniasis (VL) has a wide geographical distribution on all continents, representing a serious Public Health problem. Sand flies (Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) are important insect vectors of pathogenic microorganisms such as Leishmania spp., Bartonella spp. and arboviruses (Vesiculovirus, Phlebovirus, Orbivirus), however, these insects are of great importance for leishmaniasis transmission in various regions of the world, including South and Central America. In Brazil, there are two species related to the transmission of Leishmania infantum: Lutzomyia longipalpis and Lutzomyia cruzi. Leishmania spp. infections are potentially zoonotic and affect men and various species of wild and domestic animals. Dogs are important hosts, sources of infections and potential reservoirs, not only for their close relationship or contact with humans, but also for their immunological inability to successfully respond to the disease. The Health Ministry of Brazil recommends for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL), the immunochromatographic test as a screening test and the enzyme immunoassay as confirmatory. It also recommends early diagnosis and appropriate treatment of human cases, vector control, dog euthanasia and health education activities in endemic areas for this disease. Therefore, prevention and control actions of canine VL were instituted in the urban area of municipality of Araçatuba, São Paulo, Brazil. Keywords: Leishmaniasis. Dogs. Sand flies. LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Ciclo biológico da Leishmania spp. 18 Figura 2 - Flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis (macho). Figura 3 - Ciclo biológico de flebotomíneos do gênero Lutzomyia. Figura 4 - Rota de expansão de Lu. longipalpis. Distribuição de Lu. longipalpis, nos municípios do Estado de São Paulo, de acordo com o primeiro relato, entre 1970 e junho de 2014. Figura 5 - Armadilhas luminosas do tipo CDC, instaladas no intra (lado esquerdo) e peridomicílio (lado direito) das residências do estudo. Figura 6 - Flebotomíneos da espécie Lu. longipalpis, representado pelo macho (lado esquerdo) e a fêmea alimentada de sangue (direita). Figura 7 - Distribuição dos cães de acordo com seus status imunológicos e densidade Kernel de cães soropositivos para Leishmania spp. no município de Araçatuba, SP, Brasil. Figura 8 - Distribuição dos cães de acordo com seus status imunológicos e mapa de Kernel de cães soronegativos para Leishmania spp. no município de Araçatuba, SP, Brasil. Figura 9 - Distribuição de Lu. longipalpis por quebra natural dos dados nas oitos áreas no município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. 19 20 22 31 32 35 36 39 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Cães reagentes e não reagentes pelo DPP e ELISA para Leishmania spp. de acordo com as variáveis do estudo. 37 LISTA DE ABREVIATURAS LV – Leishmaniose Visceral LVH - Leishmaniose Visceral Humana LVC - Leishmaniose Visceral Canina OIE - Word Organisation for Animal Health Lu. - Lutzomyia DPP – Dual Path Platform rK39 – “proteínas recombinantes” ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay L. - Leishmania PCR – Polymerase Chain Reaction qPCR – Polymerase Chain Reaction Real-Time DNA - Ácido desoxirribonucleico PVCLV - Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral SUCEN - Superintendência de Controle de Endemias de Araçatuba, SP - SR-09 DPVCD - Divisão do Programa de Vigilância e Controle da Dengue SRD - Sem Raça Definida EDTA - Ethylenediamine Tetraacetic Acid g – força da gravidade SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................................... ...15 1.1 Leishmaniose Visceral Humana .......................................................................................... 15 1.2 Leishmaniose Visceral Canina ............................................................................................ 16 1.3 Ciclo Biológico .................................................................................................................... 17 1.4 Vetor ................................................................................................................................... 18 1.5 Diagnósticos para a Leishmaniose Visceral Canina..............................................................22 1.5.1 Sorológico ................................................................................................................. .......22 1.5.2 Parasitológico .................................................................................................................. 23 1.5.3 Molecular........................................................................................................................... 23 1.6 Medidas de Controle para Leishmaniose Visceral Canina .................................................. 24 1.6.1 Eutanásia dos Cães Coropositivos ................................................................................... 24 1.6.2 Controle dos Flebotomíneos ............................................................................................ 24 1.6.3 Atividades de Educação em Saúde .................................................................................. 25 1.7 Objetivo .............................................................................................................................. 25 2 CAPÍTULO 1 - DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DE Leishmania spp. EM CÃES DA ZONA URBANA DE ARAÇATUBA, SÃO PAULO, BRASIL........................................................ 26 2.1 Resumo..................................................................................................................................26 2.2 Abstract..................................................................................................................................27 2.3 Introdução ........................................................................................................................... 28 2.4 Material e Métodos ............................................................................................................. 29 2.4.1 Período e Área do Estudo ................................................................................................ 29 2.4.2 Seleção das Casas .......................................................................................................... 29 2.4.3 Delineamento Experimental ............................................................................................. 30 2.4.3.1 Cálculo amostral..............................................................................................................30 2.4.3.2 População do estudo.......................................................................................................30 2.4.3.3 Coleta de material............................................................................................................30 2.4.3.4 Coletas de flebotomíneos................................................................................................30 2.4.3.5 Ficha de investigação e observação ambiental...............................................................32 2.4.4 Exames Laboratoriais.........................................................................................................32 2.4.5 Estatística...........................................................................................................................33 2.4.5.1 Análise de Kernel............................................................................................................33 2.4.5.2 Cluster local.....................................................................................................................33 2.4.5.3 Densidade do vetor..........................................................................................................34 2.4.6. Comitê de ética................................................................................................................. 34 2.5 Resultados............................................................................................................................ 34 2.6 Discussão..............................................................................................................................39 2.7 Conclusão..............................................................................................................................42 2.8 Referências............................................................................................................................42 APÊNDICE A - "Referências da Introdução Geral.......................................................................48 ANEXOS......................................................................................................................................56 15 1 INTRODUÇÃO GERAL 1.1 Leishmaniose Visceral Humana (LVH) Os protozoários causadores da LV pertencem à ordem Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (SHAW, 2006). Esta doença apresenta amplo espectro epidemiológico no mundo, ocorrendo em vastas áreas tropicais e subtropicais (PASSOS et al., 1993), podendo ser transmitida entre humanos, ou de animais para homens ou vice-versa, por meio da picada da fêmea do flebotomíneo infectado, mantendo assim ciclo de transmissão do parasito (DESJEUX, 1996) A crescente urbanização da LVH é decorrente de alterações ambientais antrópicas, como migração rápida da população rural para a periferia urbana, caracterizada pela existência de habitações inadequadas e infraestrutura precária de saneamento básico (SILVA et al., 1997; TAUIL, 2006). Neste contexto, se promove a interação simultânea de reservatórios silvestres e cães infectados em áreas sem transmissão desta protozoose (TAUIL, 2006), bem como a rápida adaptação do flebotomíneo vetor (BRAZIL, 2013), ao peridomicílio (DIAS et al., 2003). Uma ampla distribuição geográfica ocorre principalmente em pessoas de menor poder aquisitivo em regiões da África, Ásia e América Latina e está associada a desnutrição, deslocamento da população, condições precárias de habitação, sistema imunológico e ao fator socioeconômico (ALVAR et al., 2012), sendo que mais de 98 países são endêmicos para esta doença (WHO, 2015). Entre o período de 1980 a 2005, no Brasil foram notificados 59.129 novos casos da doença, com média anual de 2.274 casos. Destes, 82,5% (48.783) foram registrados na região Nordeste. A LV gradualmente se difundiu para o Centro-Oeste, Norte e Sudeste, com dados de ocorrência de 15% em 1998, com elevação para 44% em 2005 (MAIA-ELKHOURY, 2008), com disseminação na região Sul (BIANCHI et al., 2016). No Estado de São Paulo tem ocorrido uma expansão da LVH, sendo que de 1999 até 2016, 14,26% (92/645) dos municípios apresentaram casos humanos autóctones (SÃO PAULO, 2019a). O surgimento e a dispersão desta zoonose no estado estão associados aos comportamentos antropogênicos e climáticos, migrando no sentido noroeste a sudeste (SEVÁ et al., 2017). De 2014 até abril de 2019, em São 16 Paulo, foram notificados 642 casos em humanos e 55 óbitos, sendo que no município de Araçatuba foram registrados 42 casos e três óbitos da doença, caracterizando-se como uma área endêmica (SÃO PAULO, 2019b). 1.2 Leishmaniose Visceral Canina (LVC) Os cães são epidemiologicamente importantes na transmissão da LVC, não só pelo estreito relacionamento ou convívio com os homens, mas também por sua incapacidade imunológica em responder à doença com sucesso, sendo que somente em torno de 15% dos cães infectados se curam espontaneamente (FISA et al., 1999). A infecção em cães pode ser subclínica, como também a doença pode ser autolimitante, sendo que mais comumente se manifesta na forma grave e muitas vezes, fatal (SOLANO-GALLEGO et al., 2009). A doença nesta espécie animal, pode ser assintomática ou apresentar diversas manifestações clínicas, como, dermatopatias localizadas, emagrecimento acentuado e até linfadenomegalia generalizada (OTRANTO; DANTAS-TORRES, 2013). Estas manifestações clínicas são devido aos variados tipos de resposta imune, porém o mecanismo patogênico permanece o mesmo. As lesões são uma decorrência de uma reação inflamatória contra o parasito, que pode acontecer na pele, órgãos viscerais como: fígado, rins ou intestino, olhos, ossos e mucosas. As lesões cutâneas são as principais reclamações ou queixas dos tutores, dentre este são dermatite esfoliativa não prurídica com ou sem alopecia, dermatite erosiva-ulcerativa, dermatite nodular, pústula, anemia e emagrecimento (SOLANO-GALLEGO et al., 2011). A LVC tem sua natureza zoonótica de importância na Saúde Pública, sendo que a prevenção desta infecção torna-se uma obrigação tanto para a saúde do cão quanto da saúde humana (OTRANTO; DANTAS-TORRES, 2013). Esta enfermidade é reconhecida pela Word Organisation for Animal Health (OIE) como uma importante doença, que está presente em quatro continentes, é endêmica em mais de 70 países, com acometimento em quase 2,5 milhões de cães (KASZAK et al., 2015). No Brasil, uma das medidas adotadas para o controle da propagação da LVC em áreas endêmicas, é a eutanásia de cães soropositivos (GRIMALDI JUNIOR 17 et al., 2012). Sendo que, tal medida não tem anuência dos seus tutores (COSTA, 2011). 1.3 Ciclo Biológico Para completar o ciclo de vida, a Leishmania spp. precisa de dois hospedeiros: um flebotomíneo vetor e um hospedeiro mamífero (por exemplo, o cão). Este parasito apresenta duas formas: amastigota e promastigota (DANTAS-TORRES, 2007). O protozoário Leishmania spp. ao entrar na corrente sanguínea, na forma promastigota é fagocitado pelo macrófago, onde se transforma em amastigota e sofre divisão binária, com lise celular e liberação a Leishmania spp. na forma amastigota na corrente sanguínea. A fêmea do flebotomíneo ao picar o mamífero infectado, ingere o parasito na forma amastigota, no seu estômago, retorna a forma promastigota. Esta forma se multiplica e migra para a faringe deste inseto, que ao picar um novo hospedeiro transmite promastigota referida forma evolutiva infectante (Figura 1), com perpetuação do ciclo evolutivo (BLANCO; NASCIMENTO-JÚNIOR, 2017). 18 Figura 1 – Ciclo biológico da Leishmania spp. Fonte: BLANCO; NASCIMENTO-JÚNIOR, 2017. 1.4 Vetor Os flebotomíneos (Ordem: Diptera, Família: Psychodidae, Subfamília: Phlebotominae) são importantes vetores de microrganismos patogênicos como Leishmania spp. (ALVAR et al., 2012), Bartonella spp. e arbovírus (Vesiculovirus, Phlebovirus, Orbivirus) (ALTEN et al., 2015), porém, estes insetos apresentam grande importância para a transmissão das leishmanioses em várias regiões do mundo, incluindo as Américas, Central e Sul (ALVAR et al., 2012). Estes insetos são conhecidos por suas características singulares, como seu pequeno tamanho (2 a 3 mm), corpo revestido por numerosas escamas e cerdas, com intensa pilosidade, pernas longas e delgadas, coloração palha, asas elevadas quando em repouso e voo saltitante (Figura 2). Importante evidenciar que são insetos holometábolos, com ciclo vital: ovo, larva (compreendendo quatro estágios), pupa e Ao entrar na corrente sanguínea, o parasito na forma promastigota é fagocitada pela célula. Nas células o parasito se transforma em amastigota e sobre divisão binária Ocorre a lise celular, liberando o parasito na forma amastigota na corrente sanguínea. O flebotomíneo suga o mamífero infectado. O parasito na forma amastigota, no estômago do inseto, retorna a forma promastigota. Na forma promastigota, o parasito se multiplica e se transfere para a faringe do inseto. O parasito na forma promastigota é transmitido por meio da picada do flebotomíneo. 19 adulto (Figura 3), sendo que as fêmeas necessitam de sangue para a produção de ovos (BRAZIL; BRAZIL, 2003). Figura 2 – Flebotomíneo da espécie Lutzomyia longipalpis (macho). Fonte: Cortesia de imagem do Laboratory of Image Data Science (LIDS). Instituto de Computação da UNICAMP. 20 Figura 3 – Ciclo biológico de flebotomíneos do gênero Lutzomyia. Fonte: Elaborado pelo autor. As fêmeas são atraídas pelos hospedeiros por meio da temperatura e o odor corporais, sendo ecléticos em relação à sua preferência alimentar (BRAZIL; BRAZIL, 2003), geralmente se alimentam ao crepúsculo ou a noite e durante o dia permanecem em seus abrigos (BRAZIL; RODRIGUES; ANDRADE FILHO, 2015). As formas imaturas desenvolvem-se em locais relativamente úmidos e ricos em matéria orgânica em decomposição com pouca luminosidade, onde se protegem das rigorosas mudanças climáticas (AGUIAR; MEDEIROS, 2003). Atualmente, existem aproximadamente 1.000 espécies de flebotomíneos descritos no mundo, sendo que cerca de 530 são encontradas na região Neotropical, e destas, aproximadamente 20 são comprovadamente veiculadoras da leishmaniose do Novo Mundo (GALATI, 2003). A espécie, Lu. Longipalpis tem caráter oportunista, comportamento antropofílico e hábito alimentar eclético, características estas que favorecem a transmissão de patógenos, como a L. infantum. Este vetor apresenta um alto grau de adaptação em ambientes modificados, sendo encontrado tanto no intradomicílio quanto no peridomicílio (LAINSON; RANGEL, 2005). Já foi detectado em todas as 21 regiões do Brasil, ocorrendo em áreas urbanas e/ou rurais (BRASIL, 2006), procurando fonte de alimento mais próximo ao seu criadouro (MISSAWA et al., 2008) e comumente associada com abrigos de animais domésticos (ALVES et al., 2012), Na década de 1970, foi registrada a primeira ocorrência do vetor desta parasitose, Lutzomyia longipalpis, na Serra da Mantiqueira, região leste do Estado de São Paulo (FORATTINI et al., 1970). Posteriormente, em 1997, no município de Araçatuba, região Oeste do Estado foi relatada a presença deste flebotomíneo (COSTA et al., 1997). Neste mesmo Estado, um total de 14 gêneros foram registrados, com 69 espécies de flebotomíneos, por meio de check list dos exemplares catalogadas até o momento (SHIMABUKURO; GALATI, 2011). No Brasil, há duas espécies, até o momento, relacionadas com a transmissão da Leishmania infantum: a Lutzomyia longipalpis (GALATI et al., 1997) e a Lutzomyia cruzi (OLIVEIRA et al., 2017). Recentemente, Pintomyia fischeri foi incriminada como um potencial vetor da leishmaniose visceral no estado de São Paulo (GALVIS-OVALLOS et al., 2017). Entre 1998 a 2014, este flebotomíneo foi notificado em outros 164 municípios (Figura 4), esta é a maior expansão territorial deste vetor, em áreas urbanas no Estado de São Paulo (CASANOVA et. al., 2015). No entanto, Leishmania spp. também foi detectado em pulgas (COLOMBO et al., 2011) e carrapatos (VIOL et al., 2016) coletados de cães infectados. Por tanto, o papel do carrapato da espécie Rhipicephalus sanguineus na transmissão não foi estabelecido, apesar de vários relatos apresentarem a detecção de DNA deste parasito neste ectoparasito (SOLANO-GALLEGO et al. 2012). 22 Figura 4 - Rota de expansão de Lu. longipalpis. Distribuição de Lu. longipalpis, nos municípios do estado de São Paulo, de acordo com o primeiro relato, entre 1970 e junho de 2014. Fonte: CASANOVA et al., 2015 1.5 Diagnósticos para a Leishmaniose Visceral Canina 1.5.1 Sorológico No Brasil, onde LVC representam sério problema de saúde pública, o diagnóstico em cães é de grande importância, pois uma das medidas preconizadas para controlar a propagação desta doença, consiste na eutanásia dos cães sororeagentes. Para isso, o Ministério da Saúde preconiza o uso do Dual Path Platform (DDP®) como teste de triagem (BRASIL, 2011), onde emprega a proteína recombinante K39 (rK39) como antígeno, com uma sequência de 39 aminoácidos clonada da região quinase específica de L. chagasi, o qual tem sido estudada no diagnóstico da LVC (BURNS JUNIOR et al., 1993). Para confirmar os resultados positivos do DPP, preconiza-se o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) com antígenos solúveis Leishmania major-like, ambos fabricados pela empresa Bio- Manguinhos (Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil) (BRASIL, 2011). 23 1.5.2 Parasitológico O método parasitológico consiste na observação direta de formas amastigotas, por meio do esfregaço de linfonodo e medula óssea obtendo assim, prova definitiva da infecção (CRMV, 2015). Neste exame o grau de parasitemia é muito variável, não tendo correlação com a sintomatologia dos animais (PALTRINIERI et al., 2010), por isso, na fase inicial da doença é difícil detectar os parasitos, podendo ocorrer resultados negativos. Desse modo, este diagnóstico apresenta alta especificidade, mas a sua sensibilidade é baixa (FAYET, 1999). 1.5.3 Molecular A polymerase chain reaction (PCR) baseia-se na amplificação in vitro de sequências de nucleotídeos específicos presentes no parasito, sendo um método bastante sensível e específico para detectar DNA de Leishmania spp em ampla variedade de amostras clínicas de reservatórios e vetores (GOMES et al., 2008). O método molecular de polymerase chain reaction real-time (qPCR) amplifica as sequências de DNA do parasito, sendo uma técnica utilizada para confirmar o diagnóstico da Leishmania spp. (MARTÍNEZ et. al., 2011). Contudo, estudos têm demonstrado resultados favoráveis com amostras de pele, conjuntiva, medula óssea e aspirados de linfonodos, no entanto, menor sensibilidade e especificidade em sangue periférico, isso pode ser devido ao número de parasitos presentes neste material (FERREIRA et al., 2008). No entanto, o swab conjuntival associado com a PCR tem apresentado elevada sensibilidade diagnóstica em cães naturalmente infectados com o protozoário (GEISWEID, 2013). Por meio da PCR, este material obteve resultados promissores (LOMBARDO et al., 2012), o que foi confirmado recentemente (LOPES et al., 2017). 24 1.6 Medidas de Controle para Leishmaniose Visceral Canina As medidas recomendadas pelo Ministério da Saúde no Brasil são controle do reservatório canino, do vetor e atividades de educação em saúde nas áreas endêmicas para esta doença. 1.6.1 Eutanásia dos Cães Soropositivos A principal recomendação para o controle da LVC, é a eutanásia (BRASIL, 2014). No entanto, a mesma não tem aprovação da população, devido à importância dos cães para seus tutores (COSTA, 2011). Por isso, parte da comunidade científica que estuda o assunto tem discutido a eficácia da referida medida (OTRANTO; DANTAS-TORRES, 2013). Em algumas pesquisas, existe a concordância de que eutanasiar cães não minimiza a prevalência desta doença em áreas endêmicas (MACHADO et al., 2016). Com isso, é necessário suprir esta medida preventiva, por outras mais adequadas, como por exemplo uso de coleiras impregnadas com inseticidas piretróides (ROMERO, 2016; SEVÁ et al., 2016) e as vacinas (SILVA et al., 2017). 1.6.2 Controle dos Flebotomíneos O manejo ambiental seguido da pulverização de inseticida é uma estratégia de controle para os vetores da Leishmania spp. sendo utilizados os piretróides sintéticos (cipermetrina e deltametrina) (BRASIL, 2014). O inseticida de ação residual indicado pelo O Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral (PVCLV) para municípios com transmissão humana e canina, é borrifado deltametrina em toda a extensão das paredes do intradomicílio e peridomicílio das residências (von ZUBEN; DONALÍSIO, 2016). Na aplicação do PVCLV, profissionais de saúde de órgãos governamentais enfrentam consideráveis desafios, como: recusas dos moradores em não deixar borrifar o intra e peridomicílio, casas fechadas e terrenos baldios (ALVES; BRESCIANI; RODAS, 2017). Alternativas de intervenções, são por exemplo, o uso de feromônio sexual sintético ((S) -9-methylgermacrene-B) de Lu. longipalpis e o inseticida (Lambda- 25 cialotrina), em casas com presença de galinheiros em uma área endêmica para LVH e LVC. Esses componentes juntos tem a capacidade de atraír e eliminar este vetor, evitando assim, que as fêmeas procurem outros hospedeiros para se alimentar e podendo completar o ciclo de infecção desta doença (BRAY et al., 2010). Esta associação supramencionada pode ser empregada no controle de flebotomíneos por um longo período de tempo, e consequentemente na prevenção desta enfermidade (BRAY et al., 2014). 1.6.3 Atividades de Educação em Saúde A educação em saúde deveria estar implantada em todos os serviços públicos que desenvolvem as ações de controle da LV, promovendo assim um envolvimento eficaz de equipes multidisciplinares visando um só objetivo na sua comunidade (BRASIL, 2014). Assim, os atos de educação em saúde têm que apresentar um caráter informativo que visa esclarecer sobre as formas de prevenção e controle da doença, instigando a posse responsável de animais e medidas de manejo ambiental (von ZUBEN; DONALÍSIO, 2016). Entretanto, a população demonstra duvidas e dificuldades em diferenciar a LV da dengue, uma doença também muito presente no cotidiano dos moradores, porém com diferenças especificas, tanto em relação ao seu vetor como em sua prevenção (CARMO et. al., 2016). Por isso, há uma importância da conscientização da população no que concerne a medidas de controle bem como as diferenças entre estas doenças emergentes. 1.7 Objetivo Neste estudo o objetivo foi instituir ações de prevenção e controle da leishmaniose visceral canina, na área urbana do Município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. 26 2 CAPÍTULO 1 - DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DE Leishmania spp. EM CÃES DA ZONA URBANA DE ARAÇATUBA, SÃO PAULO, BRASIL. 2.1 Resumo A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença de grande importância epidemiológica mundial. Esta parasitose é transmitida aos seres humanos, animais silvestres e domésticos pelas fêmeas dos flebotomíneos vetores. Para tanto, este estudo foi realizado com objetivo de investigar a distribuição espacial de cães infectados por Leishmania spp. por meio dos testes sorológicos, bem como, comparar com a densidade vetorial na região urbana de Araçatuba, SP, Brasil. Um total de 131 cães domiciliados foram examinados sorologicamente, por meio do Dual Path Platform (DPP) e do Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) para o diagnóstico de Leishmania spp. Informações sobre o ambiente peridomiciliar foram registradas nas fichas de investigação. Também, as coletas entomológicas foram realizadas no mês de março de 2018. Por meio do DPP, em 27 (20,61%) caninos foram detectados anticorpos para este protozoário, com confirmação sorológica em 11 (40,74%) por meio do ELISA. Os cães sororeagentes foram encontrados principalmente na região norte, sendo que, nenhum foi encontrado no centro do município. A densidade de vetores por área não apresentou relação com a presença destes cães. Esta pesquisa foi realizada em Araçatuba, SP, região endêmica para Leishmania spp. e poderá contribuir com a vigilância epidemiológica, pela investigação diagnóstica em caninos, bem como as densidades dos flebotomíneos. A análise espacial com uso dos testes recomendados pelo Ministério da Saúde para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina foi realizada pela primeira vez na região urbana de Araçatuba, SP. Palavras-chave: Flebotomíneos. Leishmaniose visceral canina. Sorologia. 27 2 CHAPTER 1 - SPATIAL DISTRIBUTION OF Leishmania spp. IN DOGS OF URBAN AREA OF ARAÇATUBA, SÃO PAULO, BRAZIL. 2.2 Abstract Visceral Leishmaniasis (VL) is a disease of great worldwide epidemiological importance. This parasitosis is transmitted to humans, wild and domestic animals by females of the sand flies. Therefore, this study was performed with the objective to investigate the spatial distribution of dogs infected with Leishmania spp. through serological tests, as well, compare with vector density in the urban region of Araçatuba, SP, Brazil. A total of 131 domiciled dogs were serologically examined by the Dual Path Platform (DPP) and the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the diagnosis of Leishmania spp. Information about the peridomiciliary environment was recorded in the investigation forms. Also, entomological collections were performed in March 2018. Through DPP, in 27 (20.61%) canines were detected antibodies to this protozoan, with 11 (40.74%) serological confirmation by ELISA. Seroreagent dogs were found mainly in the northern region, and none were found in the city center. Seroreactive dogs were found mainly in the northern region, and none were found in the city center. The vector density per area was not related to the presence of these dogs. This research was conducted in Araçatuba, SP, endemic region for Leishmania spp. and may contribute to epidemiological surveillance, diagnostic investigation in canines, as well as sand flies densities. Spatial analysis using the tests recommended by the Ministry of Health for the diagnosis of canine visceral leishmaniasis was performed for the first time in the urban region of Araçatuba, SP. Keywords: Sand flies. Canine visceral leishmaniasis. Serology. 28 2.3 Introdução A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença zoonótica ocasionada pelo protozoário Leishmania infantum (sin. Leishmania chagasi) no Brasil (LAINSON; RANGEL, 2005). Este é transmitido por fêmeas dos flebotomíneos (BRAZIL et al., 2015), Lutzomyia longipalpis (GALATI et al., 1997), Lu. cruzi (OLIVEIRA et al., 2017) e possivelmente pela Pintomyia fischeri, que foi incriminada como potencial vetora no Estado de São Paulo (GALVIS-OVALLOS et al., 2017). Anualmente são estimados cerca de 50.000 a 90.000 novos casos de leishmaniose visceral humana (LVH), sendo o Brasil, um dos dez países que apresentam maior prevalência da referida enfermidade (WHO, 2019). No Estado de São Paulo, o Lu. longipalpis foi detectado pela primeira vez na cidade de Araçatuba, SP, em 1997 (CAMARGO-NEVES et al., 2003). No mesmo município, nos anos de 1998 e 1999, foram notificados respectivamente, casos autóctones de leishmaniose visceral canina (LVC) (COSTA et al., 1997) e humana (CAMARGO-NEVES et al., 2001). Desde então, tem ocorrido uma expansão da LVH no Estado de São Paulo, sendo que até 2016 em 14,26% (92/645) dos municípios houve casos humanos autóctones (SÃO PAULO, 2019a). O surgimento e a dispersão desta zoonose estão associados aos comportamentos antropogênicos e climáticos, migrando no sentido noroeste a sudeste do estado (SEVÁ et al., 2017). De 2014 até abril de 2019, em São Paulo, foram notificados 642 casos em humanos e 55 óbitos, sendo que em Araçatuba foram registrados 42 casos e três óbitos da doença (SÃO PAULO, 2019b). O cão doméstico é visto como um importante reservatório de L. infantum no Brasil (ALVAR et al., 2006). Importante notar, que há relatos de que a presença do vetor, aumenta a prevalência da doença canina e aumenta a possibilidade de infecção humana (CAMARGO-NEVES et al., 2001; DI LORENZO; PROIETTI, 2002). Por este motivo, o cão é alvo de programa de controle em alguns países, como no Brasil (DANTAS-TORRES et al., 2012). Em 2018, foram registrados 574 casos de LVC do município de Araçatuba (dados do Centro Municipal de Controle de Zoonoses de Araçatuba, SP, não publicados), por meio do inquérito canino, no entanto não foi realizado em todo município. 29 A partir do Decreto Nº 51.838, de 14 de março de 1963, a lei de eutanásia de cães soropositivos tornou-se Nacional, bem como o diagnóstico da LVC como medida de prevenção e controle (DIÁRIO OFICIAL DA UNIÃO, 1963) A partir de 2012, o Ministério da Saúde (MS) preconizou o protocolo com o uso do Dual Path Platform (DPP), como exame de triagem, e o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) como confirmatório (BRASIL, 2011). O quadro epidemiológico desta parasitose envolve o vetor e os reservatórios silvestres e domésticos e o homem, todos com diferentes capacidades de dispersão e movimentação, portanto, os processos envolvidos nessa infecção são espacialmente dependentes (COSTA et al., 2018). Considerando que a LVH e a LVC apresentam acentuado impacto em Saúde Pública, este estudo foi realizado com objetivo de investigar a distribuição espacial de cães infectados por Leishmania spp. por meio dos testes sorológicos DPP e ELISA, bem como, analisar a densidade vetorial na região urbana de Araçatuba, SP, Brasil. 2.4 Material e Métodos 2.4.1 Período e Área do Estudo O estudo foi desenvolvido durante o mês de março de 2018, na zona urbana do município de Araçatuba, localizada na região noroeste do estado de São Paulo, Brasil, com uma área de 1.167,129 km2 e população estimada em 195.874 habitantes (IBGE, 2019). A referida cidade foi dividida em oito áreas, com cinco setores cada, exceto a oitava área que tinha apenas um setor, totalizando 36 setores, de acordo com, a Divisão do Programa de Vigilância e Controle da Dengue (DPVCD). Em cada setor, foram selecionadas duas casas com distância mínima de 250m entre elas, obedecendo a dispersão na área urbana da espécie Lu. longipalpis (OLIVEIRA, et al., 2013). 2.4.2 Seleção das Casas As 72 residências foram selecionadas por amostragem por conveniência, em quadras onde foram confirmados casos de leishmaniose visceral humana ou 30 canina, nos últimos quatro anos, com base em informações compartilhadas pela Superintendência de Controle de Endemias de Araçatuba, SP - SR-09 (SUCEN). Como critério de exclusão, não foram arroladas as casas que os tutores afirmavam ter vacinado seus cães contra a leishmaniose visceral. Todas as residências foram georreferenciadas para posterior análises espaciais. 2.4.3 Delineamento Experimental 2.4.3.1 Cálculo amostral A amostragem mínima necessária para a execução deste projeto, no nível de confiança de 95%, com precisão absoluta de 10% e levando em consideração a população canina de Araçatuba, que foi estimada em 39.175 animais (NUNES et al., 1997) foi calculada em 96 amostras, usando uma prevalência da doença de 50% (LWANGA; LEMESHOW, 1991). 2.4.3.2 População do estudo Para haver margem de segurança, um total de 131 cães domiciliados foram examinados sorologicamente, sendo 49 machos e 82 fêmeas, sem raça definida (SRD), residentes nas 72 casas selecionadas. Em relação às faixas etárias, estes animais foram classificados como jovens, adultos e idosos respectivamente cães menores de dois anos, de dois a sete anos e acima de sete anos (BORTOLETTO et al., 2016). 2.4.3.3 Coleta de material Amostras individuais de 3,0 mL de sangue foram coletadas por meio de venopunção cefálica com seringas e agulhas descartáveis, e armazenadas em tubos contendo Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA). Os soros das amostras foram obtidos por centrifugação a 1000 força da gravidade (g) por 10 minutos e armazenados a -70°C até o momento de execução das análises sorológicas. 2.4.3.4 Coletas de flebotomíneos As coletas de flebotomíneos foram realizadas com armadilhas luminosas do tipo CDC (Figura 5), que foram dispostas nas residências de todos os participantes 31 do projeto. Duas armadilhas foram instaladas, sendo uma no intradomicílio e outra no peridomicílio. Assim, as capturas destes insetos foram conduzidas durante três noites consecutivas, com um período de exposição 19:00 as 07:00. Ao final deste período, os sacos coletores foram removidos e acondicionados em embalagens plásticas, até o laboratório. Os flebotomíneos capturados foram submetidos a uma triagem sob estereomicroscópio, para suas separações dos demais insetos (Figura 6). Figura 5 - Armadilhas luminosas do tipo CDC, instaladas no intra (lado esquerdo) e peridomicílio (lado direito) das residências do estudo. Fonte: Elaborado pelo autor. 32 Figura 6 – Flebotomíneos da espécie Lu. longipalpis, representado pelo macho (lado esquerdo) e a fêmea alimentada de sangue (direita). Fonte: Elaborado pelo autor. 2.4.3.5 Ficha de investigação e observação ambiental Ficha de investigação (Anexo A) para cada cão foi preenchida em nome do seu tutor, para obtenção de dados específicos, como gênero, faixa etária e estilo de vida - animais domiciliados (aqueles dependentes de seus tutores que saem do domicílio acompanhados e contidos por meio de guias e coleiras) ou semi- domiciliados (dependentes de seus tutores, que permanecem fora do domicílio por um tempo indeterminado). O questionário (Anexo B), foi efetuado em forma de entrevista individual, sendo aplicado para a obtenção de dados de cada morador participante, com o intuito de definir as variáveis epidemiológicas que poderiam estar correlacionadas com a ocorrência da LV, bem como presença de outros animais domésticos, de vegetação e árvores frutíferas. 2.4.4 Exames Laboratoriais Dois testes sorológicos para a detecção de anticorpos para Leishmania spp. nos cães, sendo o primeiro o teste rápido imunocromatográfico, Dual-Path Plataform (TR DPP® - Bio-Manguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil) empregado com proteínas recombinantes rK39 de L. chagasi e a Proteína A Conjugada ao Ouro 33 Coloidal (HIRSCHMANN et al., 2015). O teste confirmatório das amostras positivas para o DPP foi o Ensaio Imunoenzimático (ELISA - Bio-Manguinhos/Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil) para constatação de anticorpos Anti-L. major-like. O cut-off foi definido com base nas instruções do fabricante e considerado a partir da média da densidade óptica dos controles negativos multiplicada por dois (COURA-VITAL et al., 2014). Ambos os testes foram executados conforme as orientações recomendadas pelos fabricantes. 2.4.5 Estatística A análise dos dados constituiu-se de estatística descritiva, análise de regressão logística multivariada para verificar fatores de risco para LVC. As estatísticas foram consideradas significativas quando p<0,05. 2.4.5.1 Análise de Kernel Esta análise permite a visualização tanto da distribuição espacial quanto da intensidade dos eventos (PFEIFFER, 2008). Uma função de intensidade de Kernel quártico foi utilizada para compor uma superfície suavizada, cujo valor é proporcional à intensidade de eventos por unidade de área (CÂMARA; CARVALHO, 2004). A análise foi estimada tanto para animais soronegativos quanto soropositivos, a partir do programa computacional QGIS VERSÃO 3.2, assim como todos os mapas foram realizados nele. 2.4.5.2 Cluster local O método de varredura espacial (KULLDORFF & NAGARWALLA, 1995) foi realizado usando o programa computacional SatScan® versão 9.5. Desde modo, foram considerados para a análise, os casos (soropositivos) e os controles (soronegativos) usando o modelo estatístico com distribuição de Bernoulli. Para cada cluster em potencial, foi calculado o teste da razão de verossimilhança comparando a hipótese de que o risco da doença é maior no interior do círculo contra a hipótese de que o risco é igual para as áreas dentro e fora do círculo. O círculo com máximo valor da razão de verossimilhança é considerado o cluster mais provável (PFEIFFER et al., 2008). O nível de significância considerado para os clusters foi p<0.05. 34 2.4.5.3 Densidade do vetor A densidade vetorial em cada uma das oito áreas do estudo foi estimada pelo cálculo do número de vetores capturados pela sua área geográfica (em km²). 2.4.6 Comitê de ética O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animal (CEUA) da Faculdade de Odontologia de Araçatuba e da Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba (FMVA) UNESP, Campus de Araçatuba, processo FOA n° 00870-2016 (Anexo C) e pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Odontologia de Araçatuba-UNESP, Campus de Araçatuba, processo FOA n° 61241216.4.0000.5420 (Anexo D). 2.5 Resultados Pela análise de casos e controles, pôde ser observado que os cães soropositivos para Leishmania spp. se concentraram principalmente na região norte (Figura 7). Já os soronegativos se encontraram em toda região, com maior evidência no centro e sul da área do estudo (Figura 8). A densidade de cães soronegativos foi muito maior do que de cães soropositivos. Entretanto, embora estas sejam áreas diferentes, não foi encontrada significância na prevalência espacial (p>0.05) em toda a região do estudo, de acordo com a análise do cluster local. Houve duas residências com cães soropositivos e negativos. 35 Figura 7 - Distribuição dos cães de acordo com seus status imunológicos e densidade Kernel de cães soropositivos para Leishmania spp. no município de Araçatuba, SP, Brasil. Fonte: Elaborado pelo autor. 36 Figura 8 - Distribuição dos cães de acordo com seus status imunológicos e densidade de cães soronegativos para Leishmania spp. no município de Araçatuba, SP, Brasil. Fonte: Elaborado pelo autor. 37 De um total de 131 cães, 27 (20,61%; IC 95%: 14,57-28,33%) foram reagentes no teste DPP para Leishmania spp. e 11 destes (40,74%; IC 95%: 24,51- 59,27%) foram confirmados no exame do ELISA, resultando em uma prevalência de 8,4% (11/131). Pela análise de estatística descritiva e de regressão não foi observada associação (P < 0,05) das variáveis analisadas sobre a ocorrência da Leishmania spp. nos cães avaliados (Tabela 2). Tabela 1 - Cães reagentes e não reagentes pelos DPP e ELISA para Leishmania spp. de acordo com as variáveis do estudo. Variáveis Categorias (N) DPP + ELISA Reagente Não reagente N % N % Gênero F (82) 5 6,10 77 93,90 M (49) 6 12,24 43 87,76 Faixa etária Jovem (23) 2 8,70 21 91,30 Adulto (78) 6 7,69 72 92,31 Idoso (30) 3 10,00 27 90,00 Domiciliado Domiciliado (102) 8 7,84 94 92,16 Semi-domiciliado (29) 3 10,34 26 89,66 Local onde o cão dorme Dentro de casa (27) 0 0,00 27 100,00 Fora de casa (104) 11 10,58 93 89,42 Presença de galinha Sim (37) 2 5,41 35 94,59 Não (94) 9 9,57 85 90,43 Presença de gato Sim (40) 2 5,00 38 95,00 Não (91) 9 9,89 82 90,11 Presença de Pássaro Sim (36) 5 13,89 31 86,11 Não (95) 6 6,32 89 93,68 Presença de Flebotomíneo Sim (31) 1 3,23 30 96,77 Não (100) 10 10,00 90 90,00 Vegetação na casa Sim (118) 11 9,32 107 90,68 Não (13) 0 0,00 13 100,00 Árvore Frutífera Sim (88) 8 9,09 80 90,91 Não (43) 3 6,98 40 93,02 N= Número de cães; %= porcentagem; F= fêmea; M= macho; (+) = realização dos testes DPP como triagem e o ELISA como confirmatório; Fonte: Elaborado pelo autor. 38 Lu. longipalpis foi o único inseto vetor da L. infantum capturado na cidade de Araçatuba, SP, no período do estudo. Um total de 120 espécimes do vetor foram capturadas em sete das oito áreas investigadas. Isto pode ter sido evidenciado pelo fato da área oito ter apenas duas casas e as outras áreas terem dez. Com relação a distribuição do Lu. longipalpis, foi observado que não houve correlação entre as áreas de maior densidade vetorial com taxas de maior ocorrência da LVC (Figura 9). Dessa forma, as áreas um (A1) e dois (A2) demostraram a mesma densidade vetorial. No entanto, na primeira foi verificada maior prevalência de cães sororeagentes para Leishmania spp. 36,36% (4/11) em relação a segunda 18,18% (2/11). Já a quarta área (A4) apresentou prevalência baixa, de 9,09% (1/11), porém maior densidade vetorial. As áreas três (A3) e seis (A6) mostraram a mesma densidade vetorial, porém, a prevalência de animais sororeagentes foi 18,18% (2/11) e 9,09% (1/11), respectivamente. Nas áreas cinco (A5) e sete (A7) também foi observada a mesma densidade de insetos, no entanto a prevalência de cães soropositivos foi 9,09% (1/11) e 0% (0/11), respectivamente. 39 Figura 9 - Distribuição de Lu. longipalpis por quebra natural dos dados nas oitos áreas no município de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Fonte: Elaborado pelo autor. 2.6 Discussão De maneira inédita, a distribuição espacial e análise dos casos caninos soropositivos e soronegativos pelos testes DPP e ELISA para Leishmania spp. está representada na área urbana do município de Araçatuba, SP. Um estudo anteriormente foi realizado com outros testes sorológicos (CAMARGO-NEVES et al., 2001). Apesar de não ter ocorrido significância da prevalência nas diferentes áreas, os animais soropositivos para Leishmania spp. estavam concentrados na região norte, com alguns na região sul. Em outro trabalho, também houve maior prevalência na região norte, sem soropositividade na região sul (CAMARGO-NEVES 40 et al., 2001), o que demonstrou que provavelmente com o tempo houve dispersão nesta área urbana do município. A soroprevalência da LVC no estudo foi de 8,4%, coerente com trabalhos realizados no município, como 12,1% no censo sorológico canino (CAMARGO- NEVES et al., 2001) e 8,1% em uma determinada região da cidade (COSTA et al., 2018). Neste estudo, foram examinados 131 cães, sendo 27 sororeagentes para Leishmania spp. pelo DPP e apenas 11 confirmados por meio do ELISA. Esta diferença pode ser explicada, devido ao teste rápido apresentar uma sensibilidade e especificidade baseada nas proteínas rK39, sendo que já foi demonstrado em estudos uma sensibilidade maior para detecção de cães sintomáticos do que assintomáticos (GRIMALDI JR et al., 2012; NUNES et al., 2015; CARVALHO et al., 2018). Em cidades endêmicas, como Araçatuba, onde a eutanásia de cães soropositivos para LVC é adotada como medida de controle, foi verificado que a população tende a ser mais jovem devido à substituição de cães pelos tutores, e, portanto, mais suscetível a doenças infecciosas (NUNES et al., 2008; BORTOLLETO et al., 2016). Por outro lado, em áreas onde não se aplica eutanásia com frequência a prevalência da LVC tende a aumentar conforme a idade. (MOREIRA et al., 2003). Embora nesta pesquisa tenha sido avaliada uma área com frequente eutanásia e reposição de cães, os resultados não foram observados diferença significativa de infecção entre as faixas etárias. No presente estudo, embora tenha ocorrido mais machos infectados do que fêmeas, esse resultado não foi significativo. Isto já foi previamente observado assim como observado por outros autores (MOREIRA et al., 2003). No entanto, tem sido notado que a infecção por Leishmania spp. em cães machos foi mais prevalente do que em fêmeas (DANTAS-TORRES et al., 2006). O estilo de vida dos cães mantidos no peridomicílio durante a noite, período de maior atividade dos Lu. longipalpis (BRAZIL; BRAZIL, 2003), pode aumentar o risco de exposição aos flebotomíneos e consequentemente a esta parasitose (DANTAS-TORRES, 2009). O vetor é ativo a partir do crepúsculo (BRAZIL et al., 2015). Assim, isto possivelmente pode ser uma questão de exposição ambiental e comportamental e não devido ao gênero (MICHELIN et al., 2018). Ou até mesmo, um estilo de criação, em que tutores mantém seus animais dentro ou fora de casa. No presente estudo, embora 100% dos animais 41 que dormem dentro de casa tenham sido soronegativos, essa variável não foi significativa. Dos espécimes capturados, Lu. longipalpis foi o único vetor encontrado nas sete das oito áreas investigadas. A baixa densidade vetorial da área oito, pode ser explicada pela quantidade de residências nesta área e consequentemente a ausência da LVC. Apesar das coletas entomológicas terem sido executadas em apenas um mês, foi notado que a expansão destes insetos pela área urbana de Araçatuba, SP, pois em estudo anterior, estes apresentavam uma maior densidade nas regiões centro e sul da cidade (CAMARGO-NEVES et al., 2001). Apesar de não ter sido evidenciada associação da ocorrência de anticorpos contra Leishmania spp. e a presença de galinhas, isso provavelmente pode ser explicado, em virtude da baixa frequência de domicílios com galináceos. As galinhas podem ser uma fonte de abrigo e alimento para os flebotomíneos, bem como, a vegetação na residência (OLIVEIRA et al., 2012), principalmente as árvores frutíferas (JUNNILA et al., 2011), que já foram apontados como fatores de risco para a presença desta enfermidade em virtude de atrair flebotomíneos (VIANNA et al., 2016). Entretanto, no presente estudo este fator também não demonstrou significância para os casos caninos. A região central (A4) continua sendo uma área de maior densidade vetorial, como foi destacado em outro estudo (CAMARGO-NEVES et al., 2001), isso pode ser explicado por estas áreas apresentarem residências com quintais grandes, com árvores de médio a grande porte, em sua maioria frutíferas, causando sombreamento e umidade no solo, assim como criação de outros animais como gatos, pássaros e galinhas, bem como sabemos estes fatores podem propiciar a criação e proliferação de flebotomíneos. No presente estudo, também não foi observada associação da distribuição do vetor com residência de cães infectados por Leishmania spp. Este resultado já foi observado (CAMARGO-NEVES et al., 2001) e pode ser decorrente do fato que as capturas de vetor foram feitas em tempo pontual, enquanto que o resultado sorológico para Leishmania spp. pode ser decorrente de infecções recentes ou tardias, uma vez que os títulos altos de anticorpos em cães podem se manter por mais de um ano (OLIVA et al., 2006; GARCIA et al., 2009). 42 2.7 Conclusão A análise espacial com uso dos testes recomendados pelo MS para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina foi realizada pela primeira vez na região urbana de Araçatuba, SP. 2.8 Referências ALVAR, J.; S, YACTAYO, BERN, C. Leishmaniasis and poverty. Trends Parasitol., Oxford, v. 22, n. 12, p. 552-557, Oct. 2006. BRASIL. Ministério da saúde. Secretaria de vigilância em saúde. 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IDENTIFICAÇÃO A /S Quadra 1 – Data___/___/_____ 2 – Investigador: GRAZIELLA 3 - Médico Veterinário (a): TALITA 4 - Nome do morador / proprietário: 5 - Telefone: 6 - Endereço completo: RUA IDENTIFICAÇÃO DO CÃO 7 – Nome: 8 – Nº da amostra__________ 9 - Gênero ( ) Macho ( ) Fêmea 10 – Idade: SINAIS CLINICOS 11 - Sinais clínicos (Observado pelo Médico Veterinário (a)): ( ) Linfadenomegalia ( ) Esplenomegalia ( ) Perda de peso ( ) Letargia ( ) Poliúria ( ) Polidípsia ( ) Onicogrifose ( ) Diarreia ( ) Epistaxe ( ) Lesões oculares ( ) Lesões cutâneas : ( ) Outros: RESULTADOS 12 – DPP: ( ) Negativo ( ) Positivo 13 – ELISA: D.O: 14 – PCR Sangue: 15 - PCR Swab Conjuntival: 57 ANEXO B - Questionário aplicado para a obtenção de dados a cada morador participante. IDENTIFICAÇÃO 1 – Data___/___/_____ 2 – Investigador __________ 3 – nº da entrevista__________ 4 - Endereço completo: __________________________________ 5 – CEP:_________________ 6 - Código ponto GPS : X(Long) _________ Y(Lat) _______ 7 – Nome do morador / proprietário:_____________________________________________ 8 – Profissão: ________________________________________ 9 – Telefone: Fixo ( ) ____________________ ( ) não sabe ( ) não tem Celular: ( ) ___________________ ( ) não sabe ( ) não tem 10 – Data da próxima visita ___/___/____ 11 – Horário para próxima visita: _____________ 12–Escolaridade: ( )1º ciclo fundamental completo ( )1º ciclo fundamental incompleto ( ) 2º ciclo fundamental completo ( ) 2º ciclo fundamental incompleto ( ) Ensino médio completo ( ) Ensino médio incompleto ( ) Superior completo ( ) Superior incompleto ( ) Sem instrução 13 – Gênero: ( ) Feminino ( ) Masculino ( ) Outros 14 – Raça/Cor: ( ) Branca ( ) Negro ( ) Amarela ( ) Parda ( ) Indígena 15 - Data de Nascimento____/___/____ 16- Idade:____________________ 17 – Estado Civil: ( ) Solteiro(a) ( ) Casado(a) ( ) União estável ( ) Divorciado (a) ( ) Separado ( ) Viúvo (a) 18 - Esta residência é: ( ) Própria ( ) Alugada ( ) Cedida ( ) Outro tipo___________________ 19 - Tempo de moradia:___________ 20 – Você permanece em casa no período noturno: ( ) Sim ( ) Não 21 – Nº de moradores no domicilio ___________ 22 – Quantidade de residentes com as seguintes faixa etárias: ( ) 0 a 17 anos ( ) 18 a 30 anos ( ) 31 a 50 anos ( ) acima de 51 anos 23 – Renda Familiar: ( ) Até 1 salário mínimo ( ) Acima de 1 até 3 salários mínimos ( ) Acima de 3 até 5 salários mínimos ( ) Acima de 5 até 7 salários mínimos ( ) Acima de 7 salários mínimos ( ) Nenhuma ( ) Não quis responder CARACTERÍSTICAS DO DOMICILIO 24 – Destino da água servida e dejetos: ( ) Sistema de esgoto ( ) Fossa ( ) Céu aberto ( ) Outros:________________ 25 – Possui água encanada? ( ) Sim ( ) Não 26 – Vegetação na casa ( ) Sim ( ) Não 27- Se sim, densidade de vegetação: ( ) Alta1 ( ) Alta 2 ( ) Média 1 ( ) Média 2 ( ) Baixa 1 ( ) Baixa 2 ( ) Não se aplica 28 - Coleta Urbana de lixo: ( ) Não há coleta ( ) Diariamente ( ) 1 vez por semana ( ) 2 vezes por semana ( ) 3 vezes ( ) Outros:______________ 29 – Tipo de parede predominante da moradia: ( ) Alvenaria com reboco ( ) Alvenaria sem reboco ( ) Alvenaria com reboco/ Alvenaria sem reboco ( ) Madeira ( ) Meio tijolo / Meio madeira ( ) Outros___________________ 58 30 – Presença de anexo? ( ) Sim ( ) Não (Se a resposta for não pular para pergunta nº 33) 31 – Anexos: ( ) Quarto de despejos ( ) Abrigo de animais ( ) Outros _____________________ 32 – Tipo de parede predominante no anexo: ( ) alvenaria com reboco ( ) alvenaria sem reboco ( ) meio tijolo/ meio madeira ( ) outros _________________ 33 – A residência possui muro? ( ) Sim ( ) Não 34 – Se sim, tipo de muro: ( ) alvenaria com reboco ( ) alvenaria sem reboco ( ) madeira ( ) arame ( ) placa de concreto ( ) cerca viva ( ) outros ____________________ CONHECIMENTO SOBRE LV 35 – Você sabe o que é Leishmaniose? ( ) Sim, o que é:_________________________ ( ) Não (Se a resposta for não pular para pergunta nº 43) 36 – Quem pode ter Leishmaniose? ( ) Homem ( ) Cão ( ) Gato ( ) outros _________ 37 – Você sabe como a LV é transmitida? ( ) sim ( ) Não 38 – Se sim, como é transmitida? ( ) Picada de mosquito qual?_______________ ( ) Água contaminada ( ) Contato com animais ( ) outros ______________ 39 – Você sabe identificar os sintomas de LV no homem? ( ) Sim ( ) Não 40 – Se sim quais os sintomas da doença no homem?: ( ) Emagrecimento ( ) Febre ( ) Inchaço no abdômen ( ) Hemorragias/sangramentos ( ) Franqueza ( ) Anemia ( ) Outros _________________ 41 – Você sabe identificar os sintomas da LV no cão? ( ) Sim ( ) Não 42 - Se sim, quais os sintomas da doença no cão? ( ) Queda de pelo ( ) Ferida na pele ( ) Unhas grandes ( ) Emagrecimento ( ) Secreção nos olhos ( ) Perda de apetite ( ) Diarreia ( ) Outros__________________________ IDENTIFICAÇÃO DO CÃO 43- Possui cão(s) atualmente? ( ) Sim, nº de cães______ ( ) Não, motivo por não ter:_________ (Se a resposta for não pular para questão nº 49) Identificação do animal nº 1 Nome______________________________ Gênero ( ) Masculino ( ) Feminino Raça______________________ Idade: ____________________ O cão é: ( ) Domiciliar ( ) Semi domiciliado Com qual frequência você dá banho no seu cão? ( ) Semanalmente ( ) quinzenalmente ( ) Mensalmente ( )Não dá banho ( ) Não sabe ( ) Outros ___________________ O ambiente onde o cão é criado, é de: ( ) Terra ( ) Cimento ( ) Terra/Cimento Onde o cão dorme? ( ) Dentro de casa ( ) Fora de casa ( ) Ambos os ambientes Identificação do animal nº 2 Nome______________________________ Gênero ( ) Masculino ( ) Feminino Raça______________________ Idade: ____________________ O cão é: ( ) Domiciliar ( ) Semi domiciliado Com qual frequência você dá banho no seu cão? ( ) Semanalmente ( ) quinzenalmente ( ) Mensalmente ( )Não dá banho ( ) Não sabe ( ) Outros ___________________ 59 O ambiente onde o cão é criado, é de: ( ) Terra ( ) Cimento ( ) Terra/Cimento Onde o cão dorme? ( ) Dentro de casa ( ) Fora de casa ( ) Ambos os ambientes Identificação do animal nº 3 Nome______________________________ Gênero ( ) Masculino ( ) Feminino Raça______________________ Idade: ____________________ O cão é: ( ) Domiciliar ( ) Semi domiciliado Com qual frequência você dá banho no seu cão? ( ) Semanalmente ( ) quinzenalmente ( ) Mensalmente ( )Não dá banho ( ) Não sabe ( ) Outros ___________________ O ambiente onde o cão é criado, é de: ( ) Terra ( ) Cimento ( ) Terra/Cimento Onde o cão dorme? ( ) Dentro de casa ( ) Fora de casa ( ) Ambos os ambientes Identificação do animal nº 4 Nome______________________________ Gênero ( ) Masculino ( ) Feminino Raça______________________ Idade: ____________________ O cão é: ( ) Domiciliar ( ) Semi domiciliado Com qual frequência você dá banho no seu cão? ( ) Semanalmente ( ) quinzenalmente ( ) Mensalmente ( ) Não dá banho ( ) Não sabe ( ) Outros ___________________ O ambiente onde o cão é criado, é de: ( ) Terra ( ) Cimento ( ) Terra/Cimento Onde o cão dorme? ( ) Dentro de casa ( ) Fora de casa ( ) Ambos os ambientes Identificação do animal nº 5 Nome______________________________ Gênero ( ) Masculino ( ) Feminino Raça______________________ Idade: ____________________ O cão é: ( ) Domiciliar ( ) Semi domiciliado Com qual frequência você dá banho no seu cão? ( ) Semanalmente ( ) quinzenalmente ( ) Mensalmente ( ) Não dá banho ( ) Não sabe ( ) Outros ___________________ O ambiente onde o cão é criado, é de: ( ) Terra ( ) Cimento ( ) Terra/Cimento Onde o cão dorme? ( ) Dentro de casa ( ) Fora de casa ( ) Ambos os ambientes Identificação do animal nº 6 Nome______________________________ Gênero ( ) Masculino ( ) Feminino Raça______________________ Idade: ____________________ O cão é: ( ) Domiciliar ( ) Semi domiciliado Com qual frequência você dá banho no seu cão? ( ) Semanalmente ( ) quinzenalmente ( ) Mensalmente ( ) Não dá banho ( ) Não sabe ( ) Outros ___________________ O ambiente onde o cão é criado, é de: ( ) Terra ( ) Cimento ( ) Terra/Cimento Onde o cão dorme? ( ) Dentro de casa ( ) Fora de casa ( ) Ambos os ambientes Identificação do animal nº 7 Nome______________________________ Gênero ( ) Masculino ( ) Feminino Raça______________________ Idade: ____________________ 60 O cão é: ( ) Domiciliar ( ) Semi domiciliado Com qual frequência você dá banho no seu cão? ( ) Semanalmente ( ) quinzenalmente ( ) Mensalmente ( ) Não dá banho