AVALIAÇÃO DIAGNÓSTICA PARA Leishmania spp. E Trypanosoma cruzi EM GATOS DOMÉSTICOS PROCEDENTES DA ASSOCIAÇÃO PROTETORA DOS ANIMAIS DO MUNICÍPIO DE ILHA SOLTEIRA, SP, BRASIL MARIA FERNANDA ALVES MARTIN Botucatu-SP 2013 MARIA FERNANDA ALVES MARTIN AVALIAÇÃO DIAGNÓSTICA PARA Leishmania spp. E Trypanosoma cruzi EM GATOS DOMÉSTICOS PROCEDENTES DA ASSOCIAÇÃO PROTETORA DOS ANIMAIS DO MUNICÍPIO DE ILHA SOLTEIRA, SP, BRASIL Orientadora: Profª. Dra. Simone Baldini Lucheis Co-orientadora: Profª. Dra. Wilma Aparecida Starke Buzetti Botucatu-SP 2013 Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu/UNESP para obtenção de título de mestre. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Alves-Martin, Maria Fernanda. Avaliação diagnóstica para Leishmania spp e Trypanosoma cruzi em gatos domésticos procedentes da associação protetora dos animais do município de Ilha Solteira, SP, Brasil / Maria Fernanda Alves Martin. - Botucatu, 2013 Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista; Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Simone Baldini Lucheis Coorientador: Wilma Aparecida Starke Buzetti Capes: 21301026 1. Leishmaniose. 2. Gato – Doenças. 3. Tripanossomose – Diagnóstico. 4. Trypanosoma cruzi. 5. Solteira, Ilha (SP) Palavras-chave: Diagnóstico; Gato; Leishmaniose; Tripanossomíase. DEDICATÓRIA Aos meus Pais, Pedro e Diva, Pela educação, amor, incentivo, confiança e orações que me permitiram chegar até aqui. A força e o exemplo de vida de vocês foram de grande importância para que eu pudesse concluir mais esta etapa em minha vida. Amo vocês! Aos meus irmãos, Arnaldo e Maria Luana (Naldo e Ninha), Pela atenção, carinho, apoio, alegrias e estímulo demonstrados; Somos unidos não somente pelos laços sanguíneos, mas também pela verdadeira amizade que existe entre nós; É uma honra e orgulho ser irmã de vocês; Muito obrigada pela presença de vocês em minha vida! Com Amor! Ao meu Marido e o Amor da minha vida, Roger, Pelo amor, confiança, amizade, admiração e carinho que me fizeram suportar a distância; Pela paciência, palavras de incentivo, consolo, pelo seu sorriso e por suas orações que me fortaleceram dia após dia; Muito obrigada por estar sempre ao meu lado. Te amo! AGRADECIMENTO ESPECIAL Aos cães e gatos da APAISA, Que apenas amam, sem orgulho e preconceito. “Pois existe apenas uma coisa em nós que os animais não têm: O raciocínio, e ainda assim eles tentam nos ensinar o amor.” (Ket Antonio) “Quando o homem aprender a respeitar até o menor ser da criação, seja animal ou vegetal, ninguém precisará ensiná-lo a amar seu semelhante.” (Albert Schweitzer) AGRADECIMENTOS À DEUS, por fortalecer minha fé e esperança, por guiar-me em todos os momentos de minha vida e por permitir a realização dos desejos do meu coração. Aos meus pais, Pedro e Diva, pela confiança, carinho e incentivo. Ao meu marido, Roger, pelo amor verdadeiro. Aos meus irmãos, Naldo e Ninha, pelo companheirismo e apoio. Aos meus “novos pais”, Abimael e Marilaine, pelo carinho, atenção, apoio e orações. Aos meus “novos irmãos”, Kátia, Abner e Wainer, pela amizade e carinho. À minha orientadora, Profª Drª Simone Baldini Lucheis, por me aceitar como orientada, pela oportunidade e confiança. À Minha co-orientadora, Profª Drª Wilma, por me orientar desde a iniciação científica e por acompanhar cada etapa deste trabalho, pelo incentivo, valiosos ensinamentos, e pelas demonstrações de carinho e amizade em todos os momentos. Aprendi muito com o seu exemplo de ser e agir. Ao Marcelo Cilim, por autorizar a colheita de amostras dos gatos da APAISA, e pela receptividade e confiança durante todo o período do trabalho. À Programa de Pós-graduação em Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP, pela oportunidade oferecida para a realização do Curso de Mestrado. Ao Laboratório de Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu-UNESP, por permitir a realização de grande parte experimental do projeto em sua estrutura física. Ao Laboratório de Imunoparasitologia da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira –FEIS-UNESP, pelo auxílio durante a realização dos exames de RIFI e ELISA. Ao Laboratório da Sanidade Animal da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios –APTA/SAA, pela permissão da realização da técnica de hemocultura. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo suporte financeiro para a realização deste trabalho, bem como pela concessão da bolsa de mestrado. Ao Profº Drº Hélio Langoni docente Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, por disponibilizar o uso irrestrito do Laboratório do Núcleo de Pesquisas em Zoonoses durante o aprendizado das técnicas sorológicas e moleculares. Ao Profº DrºJoão Pessoa, docente do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências-UNESP, que permitiu o uso do Laboratório de Virologia durante o aprendizado e realização de técnicas moleculares. À Profª Drª Angela Maria docente do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências da Faculdade de Medicina de Botucatu, e a Drª Virginia Bodelão Richini Pereira, pesquisadora científica do Instituto Adolfo Lutz, pelas sugestões no exame de Qualificação, que muito contribuíram para melhorar a apresentação final deste projeto. Ao Profº Drº Willian M. Dourado Coelho, docente da Faculdade de Ciências Agrárias de Andradina –FEA, por ceder amostras de controle positivo para a execução das técnicas sorológicas. Ao Médico Veterinário Cláudio Nazaretian Rossi, pela contribuição e acessibilidade durante a realização do exame ELISA. À Profª Drª Assistente Sueli Aparecida Calvi, pela atenção e contribuição prestadas durante o desenvolvimento da pesquisa. Aos Médicos Veterinários Drº Rodrigo Costa da Silva e Diego Generoso pela dedicação, paciência e apoio técnico. Ao biólogo Drº Rodrigo Mattos dos Santos, pela enorme paciência e eficiência durante a fase final e da pesquisa. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, Secretaria de Pós-Graduação e da Biblioteca pela paciência, atenção e serviços prestados. Às funcionárias da limpeza, que sempre proporcionou um ambiente limpo e agradável para o trabalho. Aos funcionários dos Laboratórios Experimentais, Carlinhos, Talísia , Du e Paulinho, pelos momentos de risadas entre um experimento e outro. À Médica Veterinária Sueli “Su”, pelo grande auxílio e atenção durante a realização de trabalhos em paralelo. À amiga Doutoranda Michely Tenório “Tia Michely”, pela amizade e a imensa contribuição e ajuda prestadas para a realização da pesquisa. Às amigas do Laboratório de Doenças Tropicais, Francilene “Fran”, Mariana “Gattinho”, Mariana “Mizi”, Laura, Thatyane “Thaty”, Adriele “Drica”, Karen “Karenzinha”, Eliana “Pananã”, Camila, Daniela “Dani”, Vanessa, Priscila, Gabriela, Gustavo “Gu” e Andréia, pelas trocas de informações, experiências e também pelos prazerosos momentos de risadas, “dancinhas” com Xbox e almoços diários na copa. Aos amigos de Iniciação Científica, Diogo “Firmezza”, pela contribuição e eficiência no auxílio da colheita, processamento de materiais, na realização das técnicas sorológicas, bem como pelos diversos momentos que passamos juntos, desde o intenso trabalho em laboratório a viagens para congressos, juntamente com as meninas, Maria Luana “Xillela”, Andrea “Lesma”, Marina “Poia”, Aline “Pomba”. Às amigas eternas Luanda “Lu”, Tatiane “Tati”, Michele “Mi”, Mariana, Mayna, Michely,”MiNinaNana” Kênia, Fabiana “Fá”, Priscila “Pri”, Carol, Keila, Cinthia, Cristiane “Cris”, Sirlene “Sir”, Camila “Milla” e Kelly, que mesmo distantes, sempre me incentivaram, com mensagens, postais, ligações e encontros marcados e remarcados para se “jogar conversa fora”, comer bolo de chocolate e tortas de frango (rsrsrs). Aos meus “filhos de coração” Guilherme e Sofia, pela inocência e pureza compartilhadas... amo vocês! Às amigas de república Josiane “Josinha”, Priscila e Dona Maria, pelo ambiente tranqüilo e familiar nesse tempo de agradável convivência. À dona Marisa e o Srº José Paixão, pelo apoio prestado durante o início do mestrado, e pela cocada maravilhosa; e ao Jessé “Dentinho”, pelo grandioso auxílio na formatação do trabalho. Às amigas-irmãs, que são presentes de Deus em minha vida: Mirian e Tamiris “Tyrollezza”; pelas demonstrações de sincera amizade, pelo carinho e paciência, pela dedicação e por todos os favores prestados, pelas noites e fins de semana que passamos no laboratório, por todas as “catacreses” (rsrsrsr), pelas conversas até tarde da noite no “cativeiro da Turquia” (rsrsrs), por todas as pizzas e lanches divididos, pela ajuda na escolha do vestido de noiva, pelas caronas cheias de bagagens até a rodoviária, pelos desabafos sem fim, por todas as vezes que foi dito: “você não sabe o que aconteceu”, por todas as refeições e sobremesas, pelo silêncio respeitado, pelas gargalhadas merecidas, pelos “quilinhos” a mais, pela cumplicidade e confiança. Obrigada por me fazerem tão bem. Aos parentes, amigos, vizinhos, residentes, mestrandos, doutorandos e docentes que colaboraram direta ou indiretamente para a realização desta pesquisa. "Confia no Senhor de todo o teu coração, e não se estribes em teu próprio entendimento." Provérbios 3:5 RESUMO As leishmanioses são zoonoses que acometem o homem e outras espécies de mamíferos silvestres e domésticos. É uma doença causada por protozoários intracelulares do gênero Leishmania. O agente causador da leishmaniose visceral no Novo Mundo é Leishmania infantum (syn. L. chagasi), sendo Lutzomya longipalpis o principal vetor responsável pela sua transmissão. O gato doméstico também desenvolve a infecção, geralmente de forma assintomática, podendo atuar também como reservatório destes protozoários. Tendo em vista a inespecificidade dos achados clínicos da leishmaniose felina (LF), a ausência de sinais e a semelhança dos aspectos clínicos dessa enfermidade com outras enfermidades em gatos, como a micoplasmose, leucemia felina (FIV) e síndrome da imunodeficiência felina (FeLV), esta zoonose deve ser sistematicamente incluída nas suspeitas clínicas de gatos em áreas endêmicas para leishmanioses canina e humana. Foram utilizadas amostras de sangue de 55 gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais (APAISA) de Ilha Solteira, co- habitantes com cães portadores de leishmaniose visceral. À técnica de hemocultura, 16,4% (9/55) dos gatos apresentaram protozoários flagelados. A Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para L. infantum (syn. L. chagasi) foi testada em 51 gatos, revelando 62,7% (32/51) de animais reagentes. Testando-se a técnica de RIFI para Trypanosoma cruzi, 54,9% (28/55) dos animais foram reagentes. Pela busca de anticorpos anti-Leishmania e anti- Trypanosoma, pela técnica de ELISA indireto com antígeno bruto, encontrou-se 72,5% (37/51) e 39,2% (20/55) de animais reagentes, respectivamente. Com o teste de ELISA indireto com rK39 para Leishmania infantum (syn. L.chagasi), obteve-se a positividade em 21,6% (11/51) dos felinos testados. Pela Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), das 55 amostras de sangue total testadas, cinco (9,1%) foram positivas para Leishmania spp. Confrontando-se todos os resultados obtidos com as técnicas diagnósticas empregadas, possibilitou-se determinar a importância dos gatos deste estudo como reservatórios de Leishmania spp., pela confirmação diagnóstica com a prova da PCR. Palavras-chave: Leishmaniose, tripanossomíase, diagnóstico, gato doméstico ABSTRACT The leishmaniasis are zoonoses that affect humans and other species of wild and domestic mammals. It is a disease caused by intracellular protozoa of the genus Leishmania. Leishmania infantum (syn. L. chagasi) is the causative agent of visceral leishmaniasis in the New World, Lutzomyia longipalpis is the main vector responsible for transmission. The cat, besides living closely with humans, also develops infection, usually asymptomatic and may also act as a reservoir of these protozoa. Given the specificity of clinical feline leishmaniasis (LF), the absence of pathognomonic signs and symptoms, and the similarity of the clinical aspects of this disease with other very common in cats, as mycoplasmosis, feline leukemia virus (FIV) and immunodeficiency syndrome FeLV (Feline), this zoonosis should be systematically considered in the clinical suspicions of cats in of the areas endemic for canine and human leishmaniasis. Samples of blood from 55 cats coming from the Association for the Protection of Animals (APAISA) of Ilha Solteira, co-inhabitants with dogs with visceral leishmaniasis, were collected. The blood culture technique showed 16,4% (9/55) flagellate protozoa. The technique of indirect fluorescent antibody (IFA) for L. infantum (syn. L. chagasi) was tested on 51 cats, showing 62,7% (32/51) of animals reagents. Testing the technique of IFA for Trypanosoma cruzi, 54,9% (28/55) of animals were reactive. The search for anti-Leishmania antibodies and anti-Trypanosoma, the technique of ELISA with crude antigen, we found 72,5% (37/51) and 39,2% (20/55) of animals reagents, respectively. By ELISA with indirect rK39 for Leishmania infantum (syn. L.chagasi) gave a positive result in 21,6% (11/51) of tested cats. For the PCR, the 55 whole blood samples tested, five (9.1%) were positive for Leishmania spp. Confronting all the results obtained with the diagnostic techniques , is possible to determine the importance of the cats in this study as reservoir of Leishmania spp., and the PCR as an important tool for diagnostic confirmation. Key words: leishmaniasis, trypanosomiasis, diagnosis, domestic cat SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 16 2-OBJETIVOS ......................................................................................................... 30 3-MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 32 3.1 – LOCAIS DE REALIZAÇÃO DAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS .................................. 32 3.2- COLHEITA DE SANGUE ..................................................................................... 32 3.2.1- Identificação.............................................................................................33 3.3- HEMOCULTURA ................................................................................................... 33 3.3.1- Leitura das hemoculturas ......................................................................... 34 3.4- PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE EM MEIO LIT PARA EXTRAÇÃO DO DNA DE LEISHMANIA INFANTUM (SYN. L. CHAGASI) E TRYPANOSOMA CRUZI. ............. 34 3.5- EXTRAÇÃO DO DNA PARA PESQUISA DE LEISHMANIA SPP. E TRYPANOSOMA CRUZI ................................................................................................................................ 34 3.6- REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) PARA TRYPANOSOMA CRUZI ..... 35 3.6.1- Eletroforese em gel de agarose ................................................................ 36 3.7- REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) PARA LEISHMANIA SPP. ........... 36 3.7.1- Eletroforese em gel de agarose ................................................................ 37 3.8 - REAÇÃO DE IMUNOFLORESCÊNCIA INDIRETA (RIFI) PARA LEISHMANIA INFANTUM (SYN. L. CHAGASI) E TRYPANOSOMA CRUZI ............................................... 37 3.8.1- Preparação dos antígenos (manutenção das formas promastigotas de leishmanias e epimastigotas de tripanossomas) ................................................. 37 3.8.2- Obtenção das promastigotas e epimastigotas para a preparação de lâminas ............................................................................................................................ 38 3.8.3 – Confecção de lâminas para Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e para Trypanosoma cruzi . 39 3.9- MÉTODO ELISA INDIRETO PARA LEISHMANIA INFANTUM (SYN. L. CHAGASI) E TRYPANOSOMA CRUZI ............................................................................................... 39 3.9.1- Antígenos brutos ...................................................................................... 39 3.9.2 – Preparação dos antígenos brutos de Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e Trypanosoma cruzi ............................................................................ 40 3.9.3- ELISA indireto com antígeno bruto de Leishmania infantum (syn. L. chagasi). ............................................................................................................. 40 3.9.4- ELISA indireto com antígeno recombinante rK39 de Leishmania infantum (syn. L. chagasi). ................................................................................................ 41 3.9.5- ELISA indireto para Trypanosoma cruzi ................................................. 41 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 43 5– RESULTADOS ................................................................................................... 45 5.1- Alterações clínicas ...................................................................................... 45 5.3 – EXAMES PARASITOLÓGICOS ............................................................................ 47 5.3.1- Hemocultura ............................................................................................. 47 5.4 – EXAMES SOROLÓGICOS ................................................................................... 48 5.4.1 – Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) ................................................................................................. 48 5.4.2 – Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Trypanosoma cruzi ............................................................................................................................ 51 5.4.3 – Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para Leishmania infantum (syn. L. chagasi). ............................................................................................................. 53 5.4.4- Ensaio Imunoenzimático (ELISA) com rk39 para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) ................................................................................................. 55 5.4.5 – Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para Trypanosoma cruzi ................. 57 5.5- EXAMES MOLECULARES .................................................................................. 59 5.5.1- Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. ........... 59 5.5.1.1- Região do cinetoplasto (kDNA) de 720 pares de bases (pb) ................ 59 5.5.2- Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Trypanosoma cruzi ...... 61 5.5.2.1- Região de nDNA de 188 pares de bases (pb) ........................................ 61 5.6- APRESENTAÇÃO GERAL DOS RESULTADOS DOS EXAMES DE HEMOCULTURA, REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (RIFI), ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) COM AG. BRUTO E AG. RECOMBINANTE (RK 39) E REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (PCR) PARA LEISHMANIA SPP. E TRYPANOSOMA CRUZI. ............... 61 5.7- ANÁLISE COMPARATIVA DOS RESULTADOS DAS TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ...... 63 5.7.1- Reação em Cadeia pela Polimerase para Leishmania spp. ...................... 63 5.7.2 –Hemocultura e técnicas diagnósticas para Leishmania spp. .................... 64 5.7.3 – Hemocultura e técnicas diagnósticas para Trypanosoma cruzi .............. 65 5.7.4 – Comparação dos resultados dos animais com alterações clínicas, com os testes de hemocultura, sorológicos RIFI e ELISA (bruto e rK39) e da Reação em Cadeia pela Polimerase para Leishmania spp. ................................................... 66 5.7.5- Comparação entre os testes de ELISA com antígeno bruto e ELISA com antígeno recombinante para L.infantum (syn. L. chagasi) .................................. 67 5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA- RESULTADOS ................................................................ 68 6- DISCUSSÃO ........................................................................................................ 71 7-CONCLUSÕES ..................................................................................................... 84 8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 86 ANEXOS ................................................................................................................. 106 APÊNDICES .......................................................................................................... 117 INTRODUÇÃ0 16 1. INTRODUÇÃO As leishmanioses são zoonoses que acometem o homem e outras espécies de mamíferos silvestres e domésticos, de forma crônica com diversas manifestações clínicas. É uma doença causada por protozoários parasitos intracelulares do gênero Leishmania (1, 2, 3). Ela é endêmica em 98 países ao redor do mundo, cuja estimativa é de 50000 mortes por ano, classificando-a em nono lugar das doenças infecciosas (4). Leishmania infantum (syn. L. chagasi) é o agente causador da Leishmaniose Visceral (LV) no Novo Mundo, com regiões endêmicas que se estendem desde o sul dos estados Unidos para o norte da Argentina, incluindo o Brasil (5). Diferentes espécies de flebotomíneos pertencentes ao gênero Lutzomyia são transmissoras das leishmanioses nas Américas e, assim como os reservatórios, os vetores também mudam de acordo com a espécie de Leishmania (6). Os cães, domésticos e selvagens, são os principais hospedeiros reservatórios desta zoonose, mas outras espécies de animais podem ser infectadas. No entanto, muitas espécies animais podem agir como reservatórios para o organismo (7). Canídeos tanto domésticos como selvagens são os hospedeiros mais importantes, mas outras espécies de animais podem ser infectadas, incluindo pequenos roedores e felinos, como os gatos (8, 9, 10, 11), caprinos (12) e equinos (13, 14, 15, 16) Esses animais reservatórios praticamente não apresentam sinais clínicos, mesmo estando infectados com agentes etiológicos, constituindo-se importantes fontes de infecção para os animais domésticos, homens ou vice-versa (17,18). A LV 17 é uma doença frequente em cães (sintomáticos ou assintomáticos) e menos comum em gatos e seres humanos (19, 20). Com a disseminação da doença e o número progressivo de casos, a LV tornou-se, para a Organização Mundial de Saúde, uma das prioridades dentre as doenças tropicais (21). Os dados epidemiológicos dos últimos dez anos revelam a periurbanização e a urbanização da leishmaniose visceral, destacando-se os surtos ocorridos no Rio de Janeiro (RJ), Belo Horizonte (MG), Araçatuba (SP), Santarém (PA), Corumbá (MS), Teresina (PI), Natal (RN), São Luís (MA), Fortaleza (CE), Camaçari (BA) e dados de 2006, as epidemias ocorridas nos municípios de Três Lagoas (MS), Campo Grande (MS) e Palmas (TO) (22). Em 2010, a região Nordeste representou 47,1% dos casos, seguida pelas regiões Norte (18,0%), Sudeste (17,8%), Centro-Oeste (8,6%) e Sul (0,1%). Atualmente, está distribuída em 21 Unidades Federadas, atingindo as cinco regiões brasileiras (23). As manifestações clínicas da LV canina e humana são muito semelhantes e caracterizam-se por febre irregular por longos períodos, anemia, perda progressiva de peso e caquexia no estágio final da enfermidade (24). A LV causada no Brasil pela Leishmania infantum (syn. L. chagasi), é considerada emergente, sendo uma das enfermidades mais importantes, principalmente em crianças desnutridas, e indivíduos portadores de vírus da imunodeficiência adquirida (HIV) não tratados, ocasionando óbito em 90% dos casos (22). Nos cães, a doença apresenta uma evolução crônica com sinais viscero-cutâneos, tais como linfoadenomegalia, onicogrifose, lesões oculares, emese, diarréia, melena, pneumonia, epistaxe, disfunções urinárias, hepáticas e neurológicas, apatia, intolerância aos exercícios, poliúria, polidipsia, poliartrite, polimiosite e lesões 18 osteolíticas, que podem afetar cerca de 50% dos animais infectados (25). Comumente, enfermidades imunossupressoras como babesiose, ehrlichiose e dirofilariose estão associadas à presença de Leishmania spp. (26). No entanto, devido à urbanização acentuada da leishmaniose (27) o envolvimento de outras espécies domésticas na epidemiologia da LV torna possível novos focos endêmicos. No Brasil, a migração do meio rural para o urbano foi um fator que acelerou a expansão da LV (28), especialmente no Nordeste e Sudeste do país (29), com a introdução de animais silvestres e gambás (30). Na região Sudeste, o primeiro registro de suspeita de autoctonia de caso humano de leishmaniose visceral americana do Estado de São Paulo, ocorreu em 1978 na grande São Paulo (31). No ano de 1998, foram registrados os primeiros casos caninos na região de Araçatuba (32) e em 1999 casos humanos da doença na mesma região (33). A partir destes primeiros casos, encontrou-se o vetor Lu. longipalpis em 125 municípios das regiões administrativas de Araçatuba, Bauru, Marília, Presidente Prudente e São João da Boa Vista, sendo que no Estado de São Paulo, mais de 1,7 mil casos humanos foram confirmados desde 1999, com letalidade média de 8% (as letalidades registradas em 1999 e em 2010, respectivamente, foram 29,4% e 9,3%) (34). No município de Ilha Solteira, localizado na região noroeste do Estado de São Paulo (Latitude 20º 25’ 58” S e Longitude 51º 20’ 33” W), entre julho de 2006 a janeiro de 2007 apresentou 355 cães positivos para Leishmaniose Visceral Canina (LVC), dentre 3798 cães examinados, com uma positividade de 9,3%, confirmando sua expansão na área urbana (35). De acordo com o Centro de Controle de Zoonoses local, entre 2007 e 2008, foram registrados 469 casos de cães positivos (36). Em outros trabalhos conduzidos por Queiroz et al (37) e Assis et al (38), verificaram um 19 número comprovadamente considerável de cães positivos para LV canina no município de Ilha Solteira. De acordo com o Centro de Vigilância Epidemiológica (39) de São Paulo, nos períodos de 2010 a 2012 foram registrados 107 casos de LV humana na região de Araçatuba, resultando em 11 óbitos, sendo um caso registrado no município de Ilha Solteira. Em todo o Estado de São Paulo foram registrados 450 casos da doença em humanos, sendo que 35 casos resultaram em óbito. Até recentemente, os gatos eram considerados hospedeiros acidentais de leishmanias, porém fortes evidências têm estabelecido que os gatos também desempenhem importante papel epidemiológico na leishmaniose acerca do potencial reservatório de gatos naturalmente infectados por Leishmania infantum (syn. L. chagasi), quando testados por xenodiagnóstico (40, 41, 42). Infecção por Leishmania spp. em gatos já foi documentada, como casos esporádicos, em outros países do Mediterrâneo, Ásia e América, embora os parasitas possam causar tanto a leishmaniose tegumentar quanto a visceral (43). Algumas características comportamentais dos felinos, como caça predatória noturna e trânsito de até 1,5 Km de distância de suas residências, co-habitando áreas silvestres e domésticas, favoreceriam a infecção e disseminação do parasito por essa espécie (44, 45). Desde 1912, quando Sergent et al. (46) encontraram o primeiro gato infectado, outros casos têm sido relatados de espécies diferentes, como Leishmania mexicana, Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum e Leishmania major (47, 48). Ocasionalmente, casos de leishmaniose felina devido à L. infantum (syn. L. chagasi) foram descritos na França, Itália, Espanha, Suíça e Brasil (43, 49, 50, 51). 20 A Leishmaniose Felina (LF), desde os anos 90 tem sido extensivamente investigada e, quando os primeiros casos foram relatados, alguns pesquisadores hipotetizaram a participação do gato doméstico (Felis catus) na epidemiologia dessa enfermidade (52, 53). Mais de 40 casos de LF foram relatados na literatura científica mundial (54). Segundo Ozon et al. (11) o caso documentado de leishmaniose felina relatado no Sul da França ocorreu em uma área endêmica enzoótica em que ambos os cães e os seres humanos encontravam-se infectados com L. infantum (syn. L. chagasi). Entre os casos detectados no Novo Mundo, dez foram diagnosticados na América do Sul, onde segundo Schubach et al. (55) dois casos clínicos foram notificados no Brasil. É possível que, dentro de uma área endêmica para leishmaniose ocorra um percentual elevado de indivíduos saudáveis, mas sem apresentarem sinais clínicos. A baixa prevalência da leishmaniose felina em áreas endêmicas poderia ser devido à resistência felina natural à infecção (56). No entanto, em áreas endêmicas há uma grande possibilidade de infecção e neste caso, o gato poderia constituir um reservatório do parasita. O gato doméstico pode ser infectado por diversas espécies de Leishmania, podendo ou não ser sintomático (29). Atualmente o Brasil é o detentor do maior número de casos de LF do mundo, mas sua distribuição no país permanece incerta, sendo relatada em diversos estados brasileiros. Passos et al. (42) relataram um caso de LT por L. braziliensis em gato diagnosticado em Belo Horizonte, que apresentava lesões na região interdigital. No município do Rio de Janeiro, foram descritos os primeiros dois casos de LT em felinos pelo mesmo agente referido acima, em que os animais apresentavam somente manifestações cutâneas com lesões em mucosa nasal (55). Em Cotia, município do estado de São Paulo, foi 21 diagnosticado um gato com LF, que apresentava lesão nodular nasal e linfoadenomegalia, título 80 para Leishmania spp. na Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), título 400 para peritonite infecciosa felina (PIF) e negativo para FeLV e FIV. Pelo método parasitológico direto de Giemsa, foram encontradas formas amastigotas e, após a eutanásia do animal, a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) identificou a presença de Leishmania infantum (syn. L. chagasi) a partir de fragmentos do baço (57). De Souza et al. (48) no Mato Grosso do Sul, descreveram um caso de LF decorrente de L. amazonensis, em que o gato apresentava lesões nodulares nasais, auriculares e interdigitais que, pelo método de Giemsa, detectou a presença de formas amastigotas do agente. Em estudo no município de Barra Mansa, Rio de Janeiro, área considerada não endêmica, 43 gatos foram examinados e, embora nenhum tenha apresentado lesões cutâneas, todos foram não reagentes à RIFI; entretanto ao ELISA, 2,4% apresentaram reatividade e 4,8% mostraram resultados indeterminados (58). Da Silva et al. (45), referiram um caso de LV em gato doméstico (Felis catus domesticus) em uma área endêmica do Rio de Janeiro, com soroprevalência relativamente elevada (25%), sugerindo a possibilidade do gato atuar como hospedeiro doméstico alternativo da LV e considerando as investigações sorológicas realizadas em áreas endêmicas de fundamental importância. Em uma região endêmica de Portugal (Lisboa), pesquisando-se 23 gatos assintomáticos, detectou-se o DNA de Leishmania no sangue periférico em sete felinos (30,4%) (59). Em alguns relatos, a leishmaniose felina foi relacionada com a Imunodeficiência Natural Adquirida; no entanto, a susceptibilidade real dos gatos à infecção por Leishmania spp. e os resultados da leishmaniose nestes animais são mal 22 compreendidos (49). Assim, a falta de diagnóstico precoce da LF em áreas endêmicas, pode implicar com que o animal continue a representar um risco potencial de transmissão de leishmanias aos vetores. Além disso, é importante enfatizar que estudos anteriores mostraram que os gatos são atrativos ao repasto de flebotomíneos (60, 61, 62). As lesões cutâneas em gatos naturalmente infectados com Leishmania spp. ocorrem principalmente no nariz, seguido pelas orelhas, ou em ambos (63, 64, 65, 66). Conforme consta na literatura, os gatos infectados geralmente apresentam envolvimento dos linfonodos e do sangue, indicando a disseminação de Leishmania nos hospedeiros felinos. As manifestações oculares são comuns nas leishmanioses caninas (67), mas dois casos foram relatados em gatos (68, 69). Em áreas endêmicas, a LF deve ser incluída como diagnóstico diferencial de uveíte e úlceras corneanas (70). Os sinais clínicos da LF são inespecíficos e similares aos observados em outras enfermidades infecciosas comuns em gatos causadas por vírus (Vírus da Leucemia Felina - FeLV e Vírus da Imunodeficiência Felina - FIV), bactérias, protozoários e fungos (histoplasmose, micoplasmose, esporotricose e criptococose) (48). Um estudo no qual relata o segundo caso de LF em Mato Grosso do Sul, na qual Leishmania (Leishmania) amazonensis foi encontrada em um gato doméstico de Ribas do Rio Pardo, os sinais clínicos foram semelhantes aos observados em outras doenças comumente diagnosticadas em gatos, como a criptococose e esporotricose (71). Dessa forma, a LF deve ser incluída no diagnóstico diferencial em gatos que apresentem lesões cutâneas compatíveis, realizando-se pesquisas sorológicas e histopatológicas apropriadas especialmente em áreas endêmicas de leishmaniose 23 canina, uma vez que não há sinais patognomônicos dessa enfermidade (45, 51, 72), Um melhor entendimento da relação hospedeiro/parasita/vetor e a maior preocupação com a sanidade dos animais de companhia, os diagnósticos de LF aumentaram, mas provavelmente muitos casos ainda não são diagnosticados (48). Outra zoonose de extrema importância e que é motivo de estudos em humanos, animais domésticos e silvestres pelo seu caráter epidemiológico é a doença de Chagas. Também denominada de tripanossomíase americana, é uma zoonose latino-americana importante, essencialmente crônica, dispersando-se, praticamente, do México à Patagônia, infectando entre 16 e 18 milhões de indivíduos, com padrões diferentes de morbi-mortalidade, em diferentes países ou regiões. Seu agente etiológico é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi). Neste grupo encontram-se flagelados com uma organela conhecida por cinetoplasto, a qual corresponde a uma condensação do DNA localizado no interior de uma mitocôndria única e ramificada por todo o corpo do protozoário (73). Primitivamente, esta doença era considerada uma enzootia, pois afetava exclusivamente mamíferos silvestres e era transmitida por triatomíneos (vetores) de hábitos silvestres. Como ocorre na leishmaniose, devido ao desequilíbrio ecológico, os vetores naturais do T.cruzi passaram a invadir os abrigos dos animais domésticos e as habitações humanas, adaptando-se progressivamente a estes ecótopos artificiais. Assim, o T. cruzi passou a infectar o homem e os animais domésticos susceptíveis, como o cão e o gato, tornando a doença de Chagas uma típica zoonose (74). Há mais de cem espécies vetoras responsáveis pela transmissão natural do T. cruzi, interferindo diretamente na sua veiculação no ambiente domiciliar ou participando na manutenção da enzootia chagásica (75). Dentre as principais espécies 24 vetoras em potencial para o T. cruzi, seis têm importância epidemiológica na América do Sul: Triatoma infestans, Triatoma brasiliensis, Triatoma dimidiata, Triatoma sordida, Panstrongylus megistus e Rhodnius prolixus. Nos vertebrados, o T. cruzi circula no sangue e multiplica-se nos tecidos, sob a forma de amastigotas. Nos triatomíneos, as formas infectantes multiplicam-se no tubo digestivo, sendo eliminadas com as fezes e urina, sob a forma de tripomastigotas metacíclicos. A transmissão ocorre, principalmente, quando há a deposição de fezes do vetor com as formas infectantes sobre os tecidos cutâneos e mucosas (76). A doença está diretamente relacionada a cães e gatos infectados, que são os reservatórios mais importantes para tripanossomatídeos dentre os animais domésticos, devido a sua maior proximidade com o homem e sua susceptibilidade à infecção chagásica. Assim, a presença destes parasitas em cães e gatos representa um sinal de alerta para ações efetivas de controle de vetores, no caso os triatomíneos, vulgarmente conhecidos por “barbeiros” (77). No homem e nos animais domésticos e silvestres, o T. cruzi vive no sangue periférico e nas fibras musculares, especialmente as cardíacas e digestivas. No inseto transmissor, vive no tubo digestivo. O homem infectado pode apresentar na fase aguda uma série de sinais e sintomas, como febre, mal estar, falta de apetite, edemas localizados nas pálpebras (sinal de Romaña) ou em outras partes do corpo (chagoma de inoculação), enfartamento de gânglios, aumento do baço e do fígado e distúrbios cardíacos. Em crianças, o quadro pode se agravar e levar à morte. Os pacientes, em fase crônica, podem passar um longo período, ou mesmo toda a sua vida, sem apresentar nenhuma manifestação da doença, embora sejam portadores do T.cruzi, http://www.sucen.sp.gov.br/doencas/chagas/texto_chagas_pro.htm#tinfes#tinfes http://www.sucen.sp.gov.br/doencas/chagas/texto_chagas_pro.htm#tsord#tsord http://www.sucen.sp.gov.br/doencas/chagas/texto_chagas_pro.htm#pmeg#pmeg 25 sendo esta fase denominada crônica indeterminada. Em outros casos, a doença prossegue ativamente, passada a fase inicial, podendo comprometer muitos órgãos do organismo, salientando-se o coração (cardiomegalia) e o sistema digestório (megacólon, megaesôfago ou forma mista). Visando a obtenção de melhores resultados e métodos diagnósticos que facilitem a realização de inquéritos epidemiológicos, assim como o conhecimento da distribuição geográfica das zoonoses, tem-se desenvolvido técnicas diagnósticas de maior sensibilidade e especificidade. No caso das leishmanioses e da doença de Chagas, as técnicas de hemocultura e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) são importantes ferramentas diagnósticas para ambas enfermidades. A hemocultura é um teste parasitológico cuja positividade demonstra a presença do parasito na corrente sangüínea, o qual é visualizado à microscopia óptica. Esta é uma diferença importante em relação à prova molecular, a PCR, a qual tem capacidade de detectar fragmentos do parasita, não necessitando estar presente inteiro na circulação (78). Estudos confirmam que a hemocultura é sensível para o diagnóstico da doença de Chagas, sendo que, resultados persistentemente negativos, denotam fortemente que houve cura parasitológica, mesmo que a sorologia convencional mostre sempre resultado positivo (79). É um método diagnóstico direto que também pode ser utilizado para detecção de Leishmania spp. Sua sensibilidade aumenta quando o volume e o número de amostras é maior, o tempo entre a coleta e o processamento é menor e quando se utiliza o meio LIT (Liver Infusion Tryptose) para cultivo (80). Alguns autores têm usado ensaios moleculares a fim de detectar tripanossomatídeos em hospedeiros vertebrados e invertebrados, utilizando diferentes métodos de extração de DNA (81, 82). A técnica da PCR é altamente sensível e 26 específica, possui habilidade de detectar e identificar o DNA parasitário envolvido, podendo ser aplicada em amostras clínicas, produzindo um resultado seguro em poucas horas (83). Essa técnica tem sido descrita como um método sensível para a detecção do agente, independente da imunocompetência ou da história clínica do paciente. Muitos centros de pesquisa têm avaliado o uso da PCR para diagnóstico de LV utilizando sangue periférico, considerando que a biopsia esplênica e a punção de medula óssea não são técnicas adequadas para uso fora do ambiente domiciliar (21). A amplificação de fragmentos de DNA de Leishmania pela PCR tem sido realizada a partir de diferentes tecidos bem como de aspirado de linfonodos, medula óssea e de leucócitos de sangue periférico utilizando os iniciadores que detectam Leishmania spp. (83, 84), resultando em maior rapidez de execução. Com esta técnica, é possível também a amplificação de fragmento da região conservada do minicírculo de kinetoplastos (k-DNA), considerada a região mais rica em DNA por conter cerca de 25% de todo o DNA do flagelado, e está contida em uma mitocôndria presente em todos os flagelados pertencentes à ordem Kinetoplastida. A estrutura do kDNA é formada por uma rede de moléculas interligadas, de conformação circular de dois tamanhos distintos, conhecidos de maxicírculos e minicírculos (85). Os métodos diagnósticos sorológicos da LVC antes recomendados pelo Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral (PVC-LV) eram o ELISA como método de triagem e a RIFI (Reação de Imunoflorescência Indireta) como confirmatório (86). A despeito das conhecidas vantagens apresentadas pela RIFI, como facilidade na execução, rapidez na emissão de resultados e baixo custo (87, 88), este teste apresenta algumas desvantagens, pois poderia identificar grande número de animais falso-positivos e, sendo assim, não seria o mais específico para o diagnóstico da LV, tendo em vista a possibilidade de apresentar reação cruzada com 27 outras enfermidades, como a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), com a doença de Chagas, ou ainda, com outros agentes infecciosos, tais como Erlichia canis, Toxoplasma gondii, Babesia canis e Dirofilaria immitis (89, 90, 91, 92). Com o intuito de aperfeiçoar a técnica de diagnóstico da LVC, o Ministério da Saúde estabeleceu a substituição do protocolo utilizado atualmente (triagem com ELISA e confirmação com RIFI), com a implantação do teste rápido imunocromatográfico com antígenos recombinantes (k26 e k39) como triagem e o ELISA como confirmatório, considerando vantagens e facilidades no teste rápido imunocromatográfico e ao fornecimento de resultados automatizados sem subjetividade no ELISA (93). Vários antígenos têm sido utilizados para o diagnóstico da LV (94). Geralmente, a purificação destes antígenos requer equipamentos e muito tempo para preparação. A metodologia preparada do antígeno a partir do parasita inteiro é simples e possibilita preparação em larga escala (87). O teste de ELISA utilizando antígeno total bruto é limitado quando se trata de especificidade, por apresentar reações cruzadas não somente com tripanossomatídeos, mas também com organismos filogeneticamente distantes (95). Com o advento da utilização de antígenos recombinantes, houve uma melhora no diagnóstico quanto à sensibilidade e a especificidade da técnica (96). Alguns grupos de pesquisa vêm utilizando antígenos recombinantes para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana e canina, porém há poucos estudos que relatam o uso deste antígenos no diagnóstico de felinos. Em um trabalho realizado por Burns Jr. et al. (97), foi identificado um gene presente no DNA do cinetoplasto da L. infantum (syn. L. chagasi), contendo 117 pb com 39 resíduos de aminoácidos repetitivos na 28 região C-terminal, e a proteína decodificada a partir desse gene é conhecida como rK39. Portanto, pelos aspectos apresentados, estudamos a ocorrência de Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e Trypanosoma cruzi em gatos domésticos (Felis catus domesticus) co-habitantes com cães sabidamente positivos para leishmaniose visceral, procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA), região endêmica para leishmaniose, assim como contribuir para o diagnóstico seguro desta enfermidade nestes animais, associando-se as técnicas de hemocultura em meio de Liver Infusion Tryptose (LIT), as técnicas sorológicas de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e ELISA indireto, utilizando antígenos brutos e recombinante e a técnica molecular de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi, a partir de amostras de sangue dessa espécie, possibilitando a identificação dos animais realmente infectados e a atuação destes como reservatórios no ciclo doméstico da leishmaniose e da doença de Chagas. 29 OBJETIVOS 30 2-OBJETIVOS  Comparar os testes diagnósticos de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), ELISA indireto com antígeno bruto e ELISA indireto com antígeno recombinante rK39, bem como as técnicas de hemocultura em meio de Liver Infusion Tryptose (LIT) e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp.e Trypanosoma cruzi;  Determinar a importância de gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA), co-habitantes com cães portadores de leishmaniose visceral, como reservatórios de Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. 31 MATERIAL E MÉTODOS 32 3-MATERIAL E MÉTODOS 3.1 – Locais de realização das técnicas diagnósticas Os procedimentos laboratoriais de hemocultura foram realizados no Laboratório de Sanidade Animal da APTA/SAA – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios – Pólo Centro-Oeste – Bauru; as técnicas de Reação de Imunoflorescência Indireta (RIFI) e ELISA indireto foram realizadas no Laboratório de Imunoparasitologia, pertencente ao Departamento de Biologia e Zootecnia da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira (FEIS-UNESP) e a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada no Laboratório de Doenças Tropicais, pertencente ao Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem da Faculdade de Medicina de Botucatu (FMB-UNESP). Esta pesquisa foi realizada com a autorização da Comissão de Ética em Experimentação Animal (Protocolo CEEA 862-2011) da Faculdade de Medicina de Botucatu (Anexo 1). 3.2- Colheita de Sangue Foram colhidas amostras de sangue de 55 gatos domésticos adultos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA), que está localizada na área rural da região noroeste da cidade de Ilha Solteira, aproximadamente a dois quilômetros do perímetro urbano, e alberga cerca de 50 cães e 50 gatos adultos (Apêndice 1). Para proceder a colheita do material biológico, os felinos foram previamente anestesiados com Zoletil® (10 mg/kg) por via intramuscular (Apêndice 2). As amostras de sangue foram acondicionadas em caixa 33 de isopor, sob refrigeração, até a chegada ao laboratório, onde foram processadas no mesmo dia. Cerca de 5 mL do sangue colhido de cada animal foi fracionado de duas formas diferentes: a primeira parte em tubos Vacutainer contendo EDTA, para que houvesse a separação do plasma, camada leucocitária e sedimento de hemácias, para a realização das técnicas de hemocultura e para a realização da PCR para Leishmania infantum (syn. L.chagasi) e Trypanosoma cruzi. A segunda amostra foi acondicionada em tubos sem EDTA para a separação do soro, o qual foi armazenado em freezer a -20ºC até a realização das técnicas de RIFI e ELISA indireto utilizando antígenos brutos e recombinante. 3.2.1- Identificação Para que não houvesse repetição da amostra, os animais foram marcados com esmalte na região interna do pavilhão auricular, fotografados e identificados utilizando-se de uma ficha individual numerada, onde foram descritas informações necessárias com relação aos seus aspectos clínicos e a observação de presença ou não de ectoparasitas. Logo após este procedimento, os animais permaneceram em observação até que se recuperassem do efeito do anestésico e posteriormente foram devidamente liberados em sua respectiva baia (Apêndice 3). 3.3- Hemocultura Para a realização da hemocultura, foram separados três tubos contendo, em cada um deles, 5 mL de meio LIT (Liver Infusion Tryptose) estéril (Anexo 2). A manipulação das amostras de sangue foi realizada em capela de fluxo laminar, 34 previamente limpa com álcool 70% e mantida sob a ação de luz ultravioleta por 30 minutos. Com uma seringa estéril de 1 mL, retirou-se a porção plasmática e foi transferida para o primeiro tubo. Esse procedimento foi repetido para a porção leucocitária (camada entre o plasma e o sedimento de hemácias), transferida para o segundo tubo e, igualmente para o sedimento de hemácias, o qual foi transferido para um terceiro tubo. As culturas foram mantidas em estufa a 28-30ºC por quatro meses depois da inoculação, quando então foram preparadas para serem submetidas à técnica de PCR para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e Trypanosoma cruzi. 3.3.1- Leitura das hemoculturas Após quinze dias da inoculação do sangue coletado dos gatos, realizou-se a primeira leitura das hemoculturas em capela de fluxo laminar, retirando-se cinco microlitros de cada tubo de cultura inoculado, colocando-se a gota entre lâmina e lamínula e observando-se em microscopia óptica no aumento de 1000X, com óleo de imersão. As leituras foram realizadas quinzenalmente, durante quatro meses e, após este período, as culturas foram processadas para a extração do DNA. 3.4- Preparação das amostras de sangue em meio LIT para extração do DNA de Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. A preparação das amostras de hemocultura para a extração de DNA foi realizada de acordo com Pinto (98) com algumas modificações (Anexo 3). 3.5- Extração do DNA para pesquisa de Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi A partir do sedimento obtido com o preparo das amostras para extração de todas as hemoculturas, bem como a partir dos controles positivos em meio LIT e de amostras de sangue total dos felinos, foi utilizado 300 μL de cada amostra para 35 extração, utilizando recomendações do Kit comercial Illustra Blood Genomic Prep Spin Kit da GE Healthcare® (Anexo 4). 3.6- Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Trypanosoma cruzi As condições de amplificação em termociclador foram as seguintes: cada tubo de reação de 0,2mL recebeu tampão de PCR (50mmol KCl, 10mmol de Tris- HCl), 1,5 mM de MgCl2, 10 mM de DNTPs, 2U de Taq-polimerase (Platinum ®Taq DNA Polymerase, Invitrogen®), 10 pmol de cada oligonucleotídeo, 5μL da amostra testada e 17,5μL de água ultra pura (MIX-PCR). Desta forma, cada tubo conteve 23μL do MIX-PCR e 5μL do produto de extração do DNA. No termociclador (GeneAmp PCR System 9600) as condições de amplificação foram de acordo com Ávila et al. (99), sendo um ciclo para desnaturação inicial a 96◦C por 2 minutos; desnaturação, anexação dos iniciadores e alongamento em 30 ciclos por um minuto cada a 94◦C, 60◦C e 72◦C, respectivamente; e um ciclo de 72◦C por dez minutos. Para amplificação dos fragmentos da região de nDNA, foram utilizados os iniciadores TCZ1 e TCZ2, segundo VIRREIRA et al.(100). TCZ1: 5’ – CGAGCTCTTGCCCACACGGGTGCT - 3’ TCZ2: 5’ - CCTCCAAGCAGCGGATAGTTCAGG - 3’ Nesta reação, os produtos resultantes apresentaram 188 pares de base (pb) de comprimento, correspondendo à amplificação do fragmento contendo uma região específica da região do nDNA de T.cruzi (100). Como controle positivo da reação foi utilizada a cepa “Y” de trypanossoma cruzi, procedente do instituto de Medicina Tropical em São Paulo-SP. Como controle negativo utilizou-se água Milli-Q estéril. 36 3.6.1- Eletroforese em gel de agarose Alíquotas de 10μL das amostras amplificadas foram homogeneizadas com 5μL de solução de azul de bromofenol, as quais foram submetidas à eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,0% em tampão Tris-borato-EDTA (TBE) 0,5 X. O gel para eletroforese foi preparado com 1,0g de agarose pura em 50mL de tampão Tris-EDTA-Borato (TBE) 0,5X. A agarose foi dissolvida em TBE previamente aquecido, para que se dissolvesse totalmente. O material foi distribuído uniformemente na cuba de eletroforese. A corrida foi realizada em 100 volts por 90 minutos. Ao final, o gel foi corado em solução contendo 5µL de Syber Safe® durante uma hora e as bandas foram visualizadas em transiluminador ultravioleta, com filtro de 300 nm. Foram utilizados como controles positivos produtos da cepa amplificada de T. cruzi, e como negativos, água mili-Q estéril. Para o padrão de peso molecular, foi utilizado o DNA Ladder, 100pb (Invitrogen®). A visualização das bandas no gel e a fotodigitalização foram realizadas sob transiluminação com luz ultravioleta, sendo o tamanho dos fragmentos amplificados verificados a partir da comparação visual com os padrões de peso molecular e com a cepa padrão utilizada como controle positivo. 3.7- Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. Foram utilizados 5 μL de tampão de PCR (50 mmol KCl, 10 mmol de Tris- HCl), 1,5U de Taq-polimerase (Platinum®Taq DNA Polymerase, Invitrogen®), 10 pmol de cada oligonucleotídeo, 1,5mM de MgCl2, 10 mM de DNTPs, 2 μL da amostra testada e 17,5 μL de água ultra pura (MIX-PCR), em cada tubo de reação de 0,2 mL. As condições de amplificação em termociclador (GeneAmp PCR System 37 9600) foram seguidas conforme descritas por Ikonomopoulos et al. (78),com modificações, sendo a desnaturação inicial em um ciclo de 95ºC por 3 minutos, seguido de 33 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 58ºC durante 30 segundos e 72ºC durante 1 minuto e uma extensão final de 72ºC durante 7 minutos. Para amplificação dos fragmentos de minicírculos de kDNA de Leishmania spp. foram utilizados os iniciadores LINR4 e LIN19 (83, 101). LINR4 5’-GGGGTTGGTGTAAAATAGGG-3’ LIN19 5’-CAGAACGCCCCTACCCG-3’ Nessa reação, os produtos resultantes apresentaram 720 pares de base (pb) de comprimento, que correspondem à amplificação de segmento contendo região específica de minicírculo do kDNA de Leishmania spp.. 3.7.1- Eletroforese em gel de agarose A identificação dos produtos amplificados foram feitas em eletroforese em gel de agarose a 1,5% da mesma forma descrita no item 3.6.1. 3.8 - Reação de Imunoflorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e Trypanosoma cruzi 3.8.1- Preparação dos antígenos (manutenção das formas promastigotas de leishmanias e epimastigotas de tripanossomas) Os antígenos nas formas promastigotas de Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e epimastigotas de T.cruzi, foram mantidos em tubos rosqueados contendo 38 10 mL de meio LIT (líquido) e 5 mL de meio (Novy, McNeal, Nicolle) NNN (sólido (Anexo 5). O repique para manutenção do antígeno foi realizado quinzenalmente, dentro da capela de fluxo laminar, retirando-se uma alíquota de cada um dos dois tubos de manutenção mais recente (repique anterior) e colocando-se entre lâmina e lamínula para observação sob microscopia óptica (aumento de 40X), para avaliação do crescimento das promastigotas e epimastigotas. Do tubo que apresentasse parasitas com melhor motilidade e em maior quantidade, repicou-se uma alíquota de 1mL para dois novos tubos contendo NNN e LIT, procedendo-se assim uma nova passagem. As culturas foram mantidas em estufa a 28-30ºC, temperatura ideal para o desenvolvimento das leishmanias e tripanossomas. 3.8.2- Obtenção das promastigotas e epimastigotas para a preparação de lâminas Para a obtenção de uma quantidade viável de promastigotas e epimastigotas por lâmina, foi necessário repicar 0,5 mL de cultura em LIT e NNN para um tubo de rosca contendo somente 10 mL de LIT. Procedeu-se dois repiques em LIT, com intervalo de sete dias para obtenção de maior concentração do agente (para maiores quantidades de lâminas). Após a verificação do crescimento das promastigotas e epimastigotas em microscópio óptico, centrifugou-se 10 mL de LIT a 3000 rpm por 10 minutos; em seguida, desprezou-se o sobrenadante e foi acrescentado de 2 a 3 mL de solução salina tamponada 0,01M pH 7,2 (SST), e centrifugou-se novamente a 3000 rpm por 10 minutos, desprezando- se em seguida o sobrenadante. O processo foi repetido por mais duas vezes, quantificou-se os parasitas em microscópio óptico e, caso a 39 quantidade de promastigotas e epimastigotas fosse inferior a 20 a 30 parasitas por campo, proceder-se-ia novamente à centrifugação, até que então pudesse se obter a concentração desejada. Caso a quantidade de parasitas estivesse concentrada, a mesma seria diluída em SST. 3.8.3 – Confecção de lâminas para Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e para Trypanosoma cruzi As lâminas para RIFI são compostas de duas fileiras de seis orifícios (perfurações). Fixou-se o antígeno, pipetando-se 10 µL da suspensão de promastigotas (quando do preparo de lâminas com leishmanias) e 10 µL da suspensão de epimastigotas (quando do preparo de lâminas com tripanossomas). Logo em seguida a suspensão foi retirada, por aspiração, restando somente uma fina película sobre cada orifício. As lâminas permaneceram em temperatura ambiente para secagem, quando então foram guardadas em laminário à – 20ºC até o momento de uso. A técnica de RIFI foi realizada de acordo com Camargo (102) (Anexo 6). 3.9- Método ELISA indireto para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e Trypanosoma cruzi 3.9.1- Antígenos brutos Foram utilizados os antígenos brutos específicos dos parasitas Leishmania infantum (syn. L. chagasi ) e Trypanosoma cruzi. 40 3.9.2 – Preparação dos antígenos brutos de Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e Trypanosoma cruzi Para a sensibilização da placa de ELISA para a realização do Ensaio Imunoenzimático, necessitou-se a produção dos antígenos brutos de Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi (Anexo 7). 3.9.3- ELISA indireto com antígeno bruto de Leishmania infantum (syn. L. chagasi) O teste ELISA indireto foi realizado de acordo com a técnica descrita por Lima et al.(104) para Leishmania spp. O antígeno utilizado foi o solúvel bruto obtido a partir de promastigotas de Leishmania infantum desenvolvidas em cultivo celular de cepas (IOC – 579) FIOCRUZ (Anexo 8). Os valores de D.O dos soros foram agrupados em níveis de ELISA (NE), os quais variam de 0 (zero) a 9 (nove). O limite máximo do nível zero foi determinado pela média das D.O. de animais negativos para Leishmania infantum, acrescido de dois desvios padrão. A partir desse limite, os intervalos entre os outros níveis de ELISA foram definidos por acréscimo de 35%, e o ponto de corte do teste de ELISA correspondeu a duas vezes e meia o valor das D.O. dos soros de referência negativos, conforme preconizado por Voller et al. (105). Os níveis de anticorpos de cada soro testado foi calculada mediante a determinação do valor A/P (amostra teste em relação ao controle positivo), considerando-se os soros de referência negativos e positivos de acordo com a equação preconizada por Machado et. al. (106) demonstrada a seguir. 41 ____________________________________________________________________ Após a realização do exame ELISA calculou-se o ponto de corte, os Níveis ELISA (NE) e os valores da amostra em relação ao positivo (A/P). 3.9.4- ELISA indireto com antígeno recombinante rK39 de Leishmania infantum (syn. L. chagasi). O teste ELISA indireto com antígeno recombinante foi padronizado de acordo a técnica descrita por Lima et al.(104) com modificações (Anexo 9). Utilizou- se o antígeno recombinante rK39 de Leishmania infantum (syn. L. chagasi), o qual foi cedido gentilmente pelo Infections Diseases Research Institute (IDRI), procedente de Seattle, Washington, EUA. Os valores de D.O dos soros e os níveis de anticorpos foram determinados de acordo com as preconizações de Voller et al. (105) e Machado et al. (106) respectivamente descritas no item (3.9.3). 3.9.5- ELISA indireto para Trypanosoma cruzi O teste ELISA indireto foi realizado de acordo com a técnica descrita por Lima et al.(104) com modificações. O antígeno utilizado foi o solúvel bruto obtido a partir de epimastigotas desenvolvidas em cultivo celular de cepas (cepa “Y” de Trypanosoma cruzi, mantida no Laboratório de Doenças Tropicais da Faculdade de Medicina de Botucatu- UNESP (Anexo 10). Absorbância média da amostra Absorbância média do soro de referência negativo Absorbância média da amostra do soro de referência positivo Absorbância média da amostra do soro de referência negativo A/P = _ _ 42 Os valores de D.O dos soros e os níveis de anticorpos foram determinados de acordo com as preconizações de Voller et al. (105) e Machado et al. (106), respectivamente, descritas no item (3.9.3). 43 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA Foram construídas tabelas de contigência e calculados o coeficiente Kappa para verificar a concordância entre os testes realizados. Com os dados obtidos, foram também calculados valores de sensibilidade e especificidade relativa, comparando-se as técnicas de PCR com os métodos RIFI, ELISA e Hemocultura, para a pesquisa de Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. Para estas avaliações, foi utilizado o programa SAS for Windows, versão 9.2. 44 RESULTADOS 45 5– RESULTADOS 5.1- Alterações clínicas Durante o exame clínico dos animais, foram observados ectoparasitas (pulgas) em 7,3% (4/55), porém, a grande maioria não apresentou alterações clínicas evidentes, verificando-se sinais de alopecia em 27,3% (15/55), emagrecimento em 21,8% (12/55), lesões gerais no corpo em 23,6% (13/55), lesões em pavilhão auricular em 18,2% (10/55) e 3,6% (2/55) com lesões na região nasal, (Figuras 1 e 2). Apenas um animal (1,8%) apresentava lesões compatíveis com sarna. Os principais sinais clínicos observados nos animais estão descritos no apêndice 4. Figura 1: Aspectos clínicos gerais dos gatos da Associação protetora dos Animais de Ilha Solteira. Botucatu, SP, 2013. 46 Figura 2: Alterações clínicas observadas nos animais: alopecia (A), emagrecimento (B), lesões descamativas e eritematosas em pavilhão auricular (C) e em região nasal (D). Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira-SP. Botucatu, SP, 2013. 47 5.2 – Exames parasitológicos 5.2.1- Hemocultura Dos 55 animais coletados, observou-se pela hemocultura, a presença de protozoários flagelados em amostras de culturas de nove gatos (16,4%) (Figuras 3 e 4). Para os demais animais, as culturas foram consideradas negativas durante os quatro meses de leitura. Figura 3: Hemocultura positiva de gato doméstico procedente da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA), apresentando flagelado livre (seta) em meio LIT (Liver Infusion Tryptose). 1000X. Botucatu, SP, 2013. 48 5.3 – Exames sorológicos 5.3.1 – Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) A técnica de RIFI para Leishmania infantum foi realizada em 51 animais, devido a quantidade insuficiente de material biológico coletado de quatro animais. Pôde-se verificar que, dentre os 51 animais testados, 32 soros foram reagentes (62,7%), sendo que cinco animais apresentaram título 40 (9,8%); 18 animais título 80 (35,3%); oito animais título 160 (15,7%) e um animal apenas apresentou título 320 (2%) (Apêndice 5). A técnica de RIFI foi realizado segundo Camargo (102), sendo considerado reagente soros que apresentassem títulos iguais ou maiores que 40 (Figuras 5, 6 e 7). Figura 4: Exame parasitológico direto (hemocultura) dos gatos da Associação protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 49 Figura 5: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) positiva em gato doméstico procedente da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Formas promastigotas de Leishmania infantum (setas). Aumento de 40X. Botucatu, SP, 2013. 50 Figura 6: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum realizada em soros dos gatos da Associação protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. Figura 7: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Leishmania infantum realizada nos gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA), e suas respectivas titulações. Botucatu, SP, 2013. 51 5.3.2 – Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Trypanosoma cruzi Devido a quantidade insuficiente de material biológico coletado de quatro animais, a técnica de RIFI para T.cruzi foi realizada em 51 animais. Pôde-se verificar que, dentre os 51 animais testados, 28 soros foram reagentes (54,9%), sendo que 14 animais apresentaram título 20 (27,5%) e 14 animais título 40 (27,5%) (Figuras 8, 9 e 10). A técnica de RIFI foi realizado segundo Camargo (102), sendo considerado reagente soros que apresentassem títulos iguais ou maiores que 20 (Apêndice 5). Figura 8: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) positiva para Trypanosoma cruzi realizada em soros dos gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA).Formas epimastigotas de T.cruzi (setas). Aumento de 40X. Botucatu, SP, 2013. 52 Figura 9: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Trypanosoma cruzi realizada em soros dos gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. Figura 10: Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) para Trypanosoma cruzi realizada em soros dos gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA) e suas respectivas titulações. Botucatu, SP, 2013. 53 5.3.3 – Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para Leishmania infantum (syn. L. chagasi). Após a realização do exame ELISA, calculou-se o ponto de corte, os níveis ELISA (NE) e os valores da amostra em relação ao positivo (A/P). Dessa forma, a densidade óptica (D.O) média dos gatos negativos foi de 0,0618333 + - 0,0016 resultando em um ponto de corte de D.O ≥ 0,1545 e nível ELISA 2 (NE≥2). Já os gatos positivos apresentaram densidade óptica média igual a 0,4075 + - 0,0157. Para a média da D.O do controle positivo foram utilizados três gatos de uma área endêmica, sabidamente positivos para leishmaniose . Os gatos negativos foram provenientes de uma área não endêmica. Dessa forma, trabalhou-se com as médias de absorbância para os controles (negativo e positivo) e com valores de A/P para os soros testados. A demonstração da distribuição dos níveis de ELISA podem ser visualizados no Apêndice 6. Ao analisar os resultados, obteve-se uma reatividade positiva de 72,5% (37 gatos) para leishmaniose distribuída em níveis ELISA superiores ou igual ao ponto de corte (NE≥2), e 27,5% (14 gatos) foram considerados negativos (Apêndice 7). O maior número de gatos com reatividade positiva foi observado no NE= 5 (8/51 - 15,7%) e com reatividade negativa (5/51 - 9,8%) foi no NE=2, ou seja, com baixa reatividade antigênica, mas ainda assim foram considerados positivos pelo ELISA. (Figuras 11 e 12). 54 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N ív el 0 N ív el 1 N ív el 2 N ív el 3 N ív el 4 N ív el 5 N ív el 6 N ív el 7 N ív el 8 N ív el 9 Níveis ELISA (N.E) Leishmania infantum (syn. L chagasi) Figura 11: Exame ELISA indireto com antígeno bruto de Leishmania infantum realizado em soros de gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. Figura 12: Níveis ELISA (N.E) apresentados em soros de gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 55 5.3.4- Ensaio Imunoenzimático (ELISA) com rK39 Após a realização do exame ELISA com rK39, calculou-se o ponto de corte, os níveis ELISA (NE) e os valores da amostra em relação ao positivo (A/P). Dessa forma, a densidade óptica (D.O) média dos gatos negativos foi de 0,236 + - 0,0176 resultando em um ponto de corte de D.O ≥ 0,590 e nível ELISA 3 (NE≥3). Já os gatos positivos apresentaram densidade óptica média igual a 1,137 + - 0,279. A demonstração da distribuição dos níveis de ELISA podem ser visualizados no Apêndice 8. Ao analisar os resultados, obteve-se uma reatividade positiva de 21,6% (11 gatos) para leishmaniose distribuída em níveis ELISA superiores ou igual ao ponto de corte (NE≥3), e 78,4% (40 gatos) foram considerados negativos (Apêndices 9). O maior número de gatos com reatividade positiva foi observado no NE= 3 (6/51 – 11,7%) e com reatividade negativa (27/51 – 52,9%) foi no NE=0. (Figuras 13 e 14). Figura 13: ELISA indireto com antígeno recombinante rK39 de Leishmania infantum (syn. L. chagasi) realizado em soros de gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 56 0 5 10 15 20 25 30 N ív el 0 N ív el 1 N ív el 2 N ív el 3 N ív el 4 N ív el 5 N ív el 6 N ív el 7 N ív el 8 N ív el 9 Níveis ELISA (N.E) Leishmania infantum (syn. L. chagasi) Figura 14: Níveis ELISA (N.E) apresentados em soros de gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 57 5.4.5 – Ensaio Imunoenzimático (ELISA) para Trypanosoma cruzi Para definir a diluição a ser utilizada nos ensaios, foram testadas as diluições de amostras de soro felino nas proporções de 1:100, 1:200 e 1:400.(Figura 15). Após a realização do exame ELISA, calculou-se o ponto de corte, os níveis ELISA (NE) e os valores da amostra em relação ao positivo (A/P). Dessa forma, a densidade óptica (D.O) média dos gatos negativos foi de 0,2448333 + - 0,089 resultando em um ponto de corte de D.O ≥0,612 e nível ELISA 2 (NE≥2). Já os gatos positivos apresentaram densidade óptica média igual a 1,030333 + - 0,028 . Para a média da D.O. do controle positivo foram utilizados três gatos sabidamente positivos para T.cruzi. Para os controles negativos foram utilizados soros de gatos sabidamente Figura 15: Controles (gatos) positivos e negativos para Trypanosoma cruzi pela técnica de ELISA indireto. Diluições utilizadas: 1/100, 1/200 e 1/400. Botucatu, SP, 2013. 58 negativos. Dessa forma, trabalhou-se com as médias de absorbância para os controles (negativo e positivo) e com valores de A/P para os soros testados. A demonstração da distribuição dos níveis de ELISA podem ser visualizados no Apêndice 10. Ao analisar os resultados, obteve-se uma reatividade positiva de 39,2% (20 gatos) para Trypanosoma cruzi distribuída em níveis ELISA superiores ou igual ao ponto de corte (NE≥2), e 60,8% (31 gatos) foram considerados negativos (Apêndice 11) (Figura 16). O maior número de gatos com reatividade positiva foi observado no NE= 3 (11/51 – 21,6%) e com reatividade negativa (8/51 - 15,7%) foi no NE=2, ou seja, com baixa reatividade antigênica, mas ainda assim foram considerados positivos pelo ELISA (Figura 17). Figura 16: ELISA indireto com antígeno bruto de T. cruzi realizado em soros de gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 59 0 5 10 15 20 25 N ív el 0 N ív el 1 N ív el 2 N ív el 3 N ív el 4 N ív el 5 N ív el 6 N ív el 7 N ív el 8 N ív el 9 5.5- Exames Moleculares 5.5.1- Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. 5.5.1.1- Região do cinetoplasto (kDNA) de 720 pares de bases (pb) Do total de 55 gatos, cinco animais apresentaram positividade para Leishmania spp. em amostras de sangue total (9,1%), não havendo positividade à PCR procedente das amostras de hemocultura (Figuras 18 e 19). Importante ressaltar que, dos cinco gatos positivos à PCR, dois deles não apresentavam qualquer alteração clínica evidente (assintomáticos). Níveis ELISA (N.E) Trypanosoma cruzi Figura 17: Níveis ELISA (N.E) apresentados em soros de gatos da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 60 Figura 18: Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. com a utilização dos iniciadores LINR4 e LIN19 em amostras de sangue total de gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. Figura 19: Eletroforese em gel de agarose a 1,5% com os iniciadores da região de minicírculo do kDNA (LINR4 e LIN19) de 720 pares de bases para Leishmania spp. em amostras de sangue total de 5 gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Marcador de peso molecular 100 pb (Invitrogen). + (controle positivo), - (controle negativo). Botucatu, SP, 2013. 61 5.5.2- Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Trypanosoma cruzi 5.5.2.1- Região de nDNA de 188 pares de bases (pb) Do total de 55 gatos avaliados pela PCR, todos foram negativos para Trypanosoma cruzi nas amostras de sangue total e de hemocultura. 5.6- Apresentação geral dos resultados dos exames de hemocultura, Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Ensaio Imunoenzimático (ELISA) com Ag. Bruto e Ag. Recombinante (rK 39) e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. e Trypanosoma cruzi. Em uma avaliação geral dos resultados dos exames realizados nos gatos para a detecção de infecção por Leishmania spp., pode-se observar que houve uma maior positividade em relação aos exames sorológicos ELISA com antígeno bruto e RIFI, resultando num total de 37 (72,5%) e 32 (62,5%) felinos sororreativos, respectivamente. O diagnóstico pelo ELISA com rK39, apresentou positividade em 11 animais (21,6%); ao exame molecular realizado pela PCR, constatou-se positividade em cinco animais (9,1%) e, pelo diagnóstico parasitológico direto, realizado pela hemocultura, observou-se protozoários flagelados em nove culturas de sangue (Figura 20). 62 Para a investigação da infecção por Trypanosoma cruzi, observamos maior sororreatividade aos exames sorológicos com as técnicas de RIFI e ELISA, identificando-se soros de animais reativos em 28 (54,9%) e 20 (39,2%) gatos, respectivamente. No diagnóstico molecular pela PCR, não ocorreu positividade (Figura 21). Figura 20: Resultados dos testes diagnósticos realizados em gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). para Leishmania spp Botucatu, SP, 2013. Figura 21: Resultados dos testes diagnósticos realizados em gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). para Trypanosoma cruzi. Botucatu, SP, 2013. 63 5.7- Análise comparativa dos resultados das técnicas diagnósticas 5.7.1- Análise das técnicas diagnósticas a partir do exame de Reação da Cadeia pela Polimerase para Leishmania spp. Dos cinco animais positivos ao exame molecular para Leishmania spp., dois animais (40%) também foram positivos aos testes de RIFI, três animais (60%) foram sororreativos também ao teste de ELISA com antígeno bruto, quatro animais (80%) foram positivos para os exames de hemocultura e um animal (20%) foi positivo ao ELISA com rK39 (Tabela 1). Resultados dos Exames Diagnósticos Leishmania spp. Molecular Sorológicos Parasitológico Gato PCR RIFI Titulação ELISA (bruto) (N.E) ELISA rK39 (N.E) Hemocultura 15 P N 2 0 N 47 P 80 7 1 P 48 P N 0 2 P 49 P N 3 0 P 50 P 80 0 3 P P: Positivo; N: Negativo; NE: Nível de ELISA. Ponto de corte para RIFI de L. infantum = 40 (Camargo, 1996). Ponto de corte para ELISA bruto = N.E ≥(2) (Voller, 1980) /Ponto de corte para ELISA rK39 = N.E ≥(3) (Voller, 1980) Tabela 1: Comparação dos resultados do exame de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. comparados com os teste sorológicos da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e ELISA e hemocultura a partir de amostras de gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 64 5.7.2 –Análise das técnicas diagnósticas para Leishmania spp. a partir da técnica de hemocultura Dentre o nove animais com culturas positivas, pôde-se confirmar a presença de protozoários do gênero Leishmania em quatro amostras de sangue total (44,4%), a sororreatividade em sete animais testados (77,7%), pelas técnicas de RIFI e ELISA com antígeno bruto para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e positividade em um animal (11,1%) pela técnica de ELISA com rK39 (Tabela 2). Resultados dos Exames Diagnósticos para Leishmania spp. Parasitológico Sorológicos Molecular Gato Hemocultura RIFI Titulação ELISA(bruto) (N.E) ELISA rK39 (N.E) PCR 7 P 80 4 2 N 47 P 80 7 1 P 48 P N 0 2 P 49 P N 3 0 P 50 P 80 0 3 P 51 P 80 3 1 N 52 P 80 4 0 N 53 P 80 3 2 N 54 P 80 2 0 N P: Positivo; N: Negativo; NE: Nível de ELISA. Ponto de corte para RIFI de L. infantum = 40 (Camargo, 1966) Ponto de corte para ELISA (bruto) = N.E ≥(2) (Voller, 1980)/ Ponto de corte para ELISA rK39= N.E ≥(3) (Voller, 1980) Tabela 2: Comparação dos resultados do exame de hemocultura. com os testes sorológicos de RIFI e ELISA e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Leishmania spp. a partir de amostras dos gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 65 5.7.3 – Análise das técnicas diagnósticas para Trypanosoma cruzi a partir da técnica de hemocultura Dentre os nove animais positivos à hemocultura, nenhum apresentou positividade ao exame da Reação em Cadeia pela Polimerase para Trypanosoma cruzi, estando então descartada a hipótese de que as formas encontradas em culturas fossem epimastigotas. Nos teste sorológicos de RIFI, quatro animais foram reagentes (44,4%) e, ao exame de ELISA, apenas um animal (11,1%) apresentou sororreatividade ao T.cruzi.(Tabela 3). Resultados dos Exames diagnósticos para Trypanosoma cruzi Parasitológico Sorológicos Moleculares Gato Hemocultura RIFI Titulação ELISA (N.E) PCR 7 P 20 3 N 47 P 40 0 N 48 P N 0 N 49 P N 0 N 50 P N 0 N 51 P 40 0 N 52 P N 0 N 53 P 40 0 N 54 P N 0 N P: Positivo; N: Negativo; NE: Nível de ELISA. Ponto de corte para RIFI de T.cruzi = 20 (Camargo, 1966) Ponto de corte para ELISA = N.E≥ (2) (Voller, 1980) Tabela 3: Comparação dos resultados do exame de hemocultura comparados com os testes sorológicos de RIFI e ELISA e Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para Trypanosoma cruzi em amostras de gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2013. 66 5.7.4 – Comparação dos resultados dos animais com alterações clínicas, com os testes de hemocultura, sorológicos RIFI e ELISA (antígenos brutos e rK39) e da Reação em Cadeia pela Polimerase para Leishmania spp. Foram observados sinais clínicos em 30 animais (54,5%), sendo que 26 (42,3%) destes apresentaram alterações clínicas e diagnóstico positivo para Leishmania spp. em pelo menos um teste realizado (Apêndice 12) Observamos que dois animais (3,6%) concordaram a clínica com a RIFI, oito animais (14,5%) concordaram os aspectos clínicos com a hemocultura, houve concordância de três animais (60%) entre os sinais clínicos e quanto à PCR, nove (16,4%) animais apresentaram concordância clínica com a RIFI. Dezoito animais (32,8%) concordaram aspectos clínicos com ambas técnicas sorológicas aplicadas (RIFI e ELISA com antígeno bruto) e três animais (10%) concordaram a alteração clínica com a positividade ao teste de ELISA com rK39. 67 5.7.5- Comparação entre os testes de ELISA com antígeno bruto e ELISA com antígeno recombinante para L.infantum (syn. L. chagasi) Verifica-se pelo teste de ELISA com a utilização de antígeno bruto de L. infantum (syn. L. chagasi), maior encontro de anticorpos anti-Leishmania, um total de 72,5% dos felinos, quando comparados com o teste de ELISA com antígeno recombinante rK39, com o total de 21,6% dos animais testados (Tabela 4). Tabela 4: Comparação entre os testes ELISA com os antígenos brutos de promastigotas de L. infantum (syn. L. chagasi) e proteína recombinante (rK39), no diagnóstico de leishmaniose em gatos procedentes da Associação Protetora dos Animais de Iha Solteira, SP. Botucatu, 2013. Resultados dos testes ELISA (Antígenos brutos e rK39) ELISA Positivo Negativo Total Antígeno bruto 37 14 51 rK39 11 40 51 68 5.8 Análise Estatística-Resultados Foram calculados os valores referentes aos resultados dos testes diagnósticos da PCR, a partir do DNA extraído em amostras de sangue dos felinos domésticos, hemocultura, RIFI e ELISA (antígeno bruto e rK39), os quais podem ser visualizados na Tabela 5. Tabela 5 – Percentual dos casos positivos de Leishmaniose e doença de Chagas em gatos domésticos da Associação protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA). Botucatu, SP, 2012. np / Total % Leishmaniose Hemocultura 9/55 16,4 Sorológico RIFI 32/51 58,2 Sorológico ELISA (Ag. bruto) 37/51 67,3 Sorológico ELISA rK39 11/51 21,6 PCR sangue 5/55 9,1 Doença de Chagas Hemocultura 9/55 16,4 Sorológico RIFI 28/51 50,9 Sorológico ELISA 20/51 36,4 PCR sangue 0/55 0,0 Np: número de positivos Observou-se que houve discordância moderada (coeficiente Kappa= 0,51) comparando-se os resultados obtidos pela PCR de sangue total em relação à hemocultura. Quanto às demais variáveis, não houve concordância significativa entre os testes. A partir da análise da concordância entre PCR de sangue total em relação à hemocultura, RIFI, ELISA (Ag. Bruto) e ELISA com rK39, foram calculados a sensibilidade e especificidade relativa destes métodos empregados. Foi verificada 69 uma alta sensibilidade entre os teste de PCR de sangue total com o diagnóstico de hemocultura, observando-se 80% de sensibilidade e 90% de espeficidade entre as técnicas A segunda técnica que apresentou maior especificidade e sensibilidade, (78,3% e 72%) respectivamente, em relação à PCR de sangue, foi o ELISA com rK39. .Estes resultados podem ser verificados na tabela 6. Tabela 6 – Comparação entre testes diagnósticos para Leishmania spp. utilizando a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) de sangue total como teste padrão ouro.Botucatu, SP, 2013. Método (n)(ng)(nt) Ac.% Sens.% Esp.% VPP% VPN% Kappa P Hemocultura (55)(5)(9) 89 80 90 44,4 97,8 0,51 0,001 Sorológico RIFI (51)(5)(32) 39 60 37 9,4 89,5 -0,009 0,894 Sorológico ELISA (Ag. Bruto) (51)(5)(37) 25 40 23,9 5,4 78,6 -0,094 0,086 Sorológico ELISA rK39 (51)(5)(11) 72 20 78,3 9,1 90,0 -0,011 0,928 PCR (Hemocultura) (55)(5)(0) 90 0,0 100 0,0 90,9 -- -- n: Número de gatos considerados na análise; ng: Número de gatos com Leishmaniose pelo PCR no sangue nt: Número de gatos com Leishmaniose pelo teste sob avaliação. 70 DISCUSSÃ0 71 6- DISCUSSÃO O município de Ilha Solteira é considerado uma área endêmica para Leishmaniose Visceral (LV), por conter casos registrados da doença em humanos, animais domésticos e silvestres (37, 38, 107). Um fator relevante é o fato da sede da Associação Protetora dos Animais de Ilha Solteira (APAISA) estar localizada na zona rural da cidade, conter em seu entorno famílias com criadouros de porcos e galinhas, e grande acúmulo de matéria orgânica, fatores que facilitam o crescimento e desenvolvimento dos flebotomíneos e também a manutenção de triatomíneos. O acúmulo de matéria orgânica proporciona um ambiente favorável para o ciclo das leishmanioses (108). Camargo-Neves et al. (109), afirmaram que a presença de matéria orgânica, troncos de árvores, raízes e vegetações no solo representam possíveis criadouros e abrigos para vetores. Além disso, Silva et al. (110), verificaram que a Associação mantêm cães sabidamente positivos para leishmaniose visceral, fato que propicia a manutenção do ciclo biológico dos flebotomíneos e a disseminação da zoonose para os felinos, os quais são mantidos muito próximos aos cães. O gato doméstico pode ser infectado por diversas espécies de Leishmania, podendo ou não ser sintomático (29). Dessa maneira, dentro de uma área endêmica para leishmaniose pode ocorrer um percentual elevado de indivíduos saudáveis, mas sem apresentarem sinais clínicos, devido à resistência felina natural à infecção (56), ou manifestar sinais clínicos referentes a outras patologias, pois de acordo com Sobrinho et al. (111), gatos que vivem em regiões endêmicas para leishmaniose visceral, são mais propensos a manter co-infecções com FIV, podendo apresentar sinais clínicos semelhantes aos da LV. Portanto, necessita-se de um diagnóstico 72 eficaz, com o mínimo de reações cruzadas, a fim de determinar-se a presença de Leishmania spp., especialmente em regiões endêmicas. Neste trabalho, alguns dos animais possuíam aspectos clínicos alterados, tais como presença de alopecia, lesões na orelha e focinho e emagrecimento, dados similares àquelas descritas nos achados de leishmaniose felina no Brasil (55, 49, 112). De acordo com Bonfante-Garrido et al. (66), as regiões mais afetadas nos felinos são a cabeça (75%), o nariz (48%), a orelha (26%) e região ocular (18,6%). É importante ressaltar que as lesões podem proporcionar porta de entrada para insetos hematófagos como, por exemplo, flebotomíneos e triatomíneos, que possuem maior capacidade em picar áreas com menor quantidade de pelos (66). Eventualmente, no caso da leishmaniose, a mesma pode assumir uma forma aguda atípica e o animal vir a óbito em poucas semanas (11). Podem ocorrer anorexia, depressão, emese, diarréia, desidratação, perda de peso e estomatite (43, 69, 70, 51). Lesões de pele foram encontradas em 13 animais (13/55), e de acordo com Costa et al. (104) não é possível afirmar que tais alterações sejam decorrentes de uma infecção por Leishmania spp., uma vez que não foram excluídas outras enfermidade infecciosas nos animais avaliados. Além disso, é importante ressaltar que os gatos do estudo não eram castrados e viviam todos juntos em uma única baia; portanto, não podemos descartar a possibilidade da origem das lesões nas regiões faciais e corporal serem provenientes de brigas entre os gatos. Desta forma, torna-se importante o diagnóstico clínico do animal, pois é sabido que gatos convivem facilmente com patologias de caráter crônico, sendo a mesma condição não vista em cães. A hemocultura é uma técnica muito útil para o isolamento e identificação do parasita, sendo muito utilizada para o diagnóstico da doença de Chagas e também na 73 pesquisa de hemoparasitas no sangue. Em estudos conduzidos por Chiari et al.(114), em uma análise comparativa entre métodos diagnósticos sorológicos, molecular e parasitológico direto, afirmou-se a viabilidade da detecção de protozoários flagelados em amostras de culturas, porém, não sendo possível a identificação da espécie do parasita levando em consideração somente a forma flagelar. Com a aplicação dos cultivos sanguíneos neste trabalho, foi possível encontrar animais com cultura positiva (9/55), e os mesmos apresentaram ao exame clínico sinais de emagrecimento, alopecia e alguns com lesões em pavilhão auricular. Embora a técnica de hemocultura tenha representado uma ferramenta diagnóstica importante para que se avaliasse a presença de protozoários flagelados nas culturas de sangue dos gatos examinados, tornou-se necessário, posteriormente, a confirmação molecular, onde foi possível a diferenciação entre os gêneros Leishmania e Trypanosoma, os quais são semelhantes morfologicamente em cultivo. Observou-se que não houve positividade à técnica de PCR para Trypanosoma cruzi descartando-se a possibilidade das formas flagelares observadas serem epimastigotas deste parasita. Segundo Laurenti (115), a falta de adequação na esterilidade durante o processo da coleta de material e semeadura nos meios pode levar ao crescimento de bactérias e fungos que inibem ou impedem o crescimento de leishmanias, diminuindo, assim, a sensibilidade do teste. Um trabalho realizado por Marodin (116), com felinos domésticos, no diagnóstico pela técnica de isolamento, não houve crescimento nos aspirados de medula óssea e linfonodos. No entanto, em nossa pesquisa, todos os procedimentos para a realização da técnica de hemocultura foram realizados de forma adequada, asséptica e com a menor manipulação possível do 74 sangue coletado, possibilitando o isolamento de protozoários flagelados em alguns felinos domésticos, como é recomendado por Luz (117). A técnica sorológica de RIFI era consolidada juntamente com a técnica de ELISA em inquéritos sorológicos caninos para leishmaniose visceral, apresentando boa sensibilidade relativa. É importante ressaltar que, possíveis reações cruzadas em animais sabidamente positivos para leishmaniose, apresentam reações cruzadas com T.cruzi, o que direciona para a importância do diagnóstico epidemiológico, que deve ser considerado juntamente com o resultado laboratorial (92). Os protozoários causadores da leishmaniose e da doença de Chagas pertencem à família Trypanosomatidae e compartilham vários antígenos que propiciam a causa de reações cruzadas em diagnósticos sorológicos (118, 119, 92). Observando os resultados finais da Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), realizada nos animais deste estudo, pôde-se verificar a positividade sorológica tanto para Leishmania infantum, quanto para T.cruzi, revelando uma incidência de reações cruzadas nesses animais (Apêndice 5). Das 51 amostras testadas para Leishmania infantum e Trypanosoma cruzi, 16 (31,4%) demonstraram título para L.infantum maior que para T.cruzi, três soros (5,8%) revelaram títulos para Leishmania infantum (syn. L. chagasi). iguais à T.cruzi, e 23 (45,1%) apresentaram títulos para T.cruzi negativos. Pôde-se observar também que, em quatro soros (7,8%), houve uma maior diferença na titulação para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e para T.cruzi, fato que sugere reação cruzada (título 160 e 20 respectivamente) e em cinco soros (9,8%), os títulos para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) eram muito próximos aos títulos para T.cruzi, fato que sugere a aplicação de outros métodos diagnósticos para 75 se chegar ao resultado definitivo. Em dez soros (19,6%), os títulos para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) e T.cruzi apresentaram uma diluição de diferença, ou iguais, enfatizando a comprovação do diagnóstico por técnicas moleculares. Nove soros (17,6%) foram reagentes apenas para T. cruzi e 13 soros (25,5%) foram reagentes somente para Leishmania infantum (syn. L. chagasi), fato que sugere a real infecção dos gatos por estes protozoários. Os testes sorológicos devem ser interpretados com cautela, por não serem 100% sensíveis e específicos e falharem na não detecção de animais infectados no período pré-patente da doença. Dependendo do antígeno utilizado e das condições da RIFI, sua sensibilidade pode variar entre 90% e 100% e a especificidade, entre 80% a 100% (89,53). Em trabalho realizado por Zanette (95) com 50 cães parasitologicamente positivos, a sensibilidade foi de 98% e especificidade de 91% para a RIFI, utilizando como antígeno formas promastigotas de Leishmania infantum (syn. L. chagasi). Em relação à observação de reações cruzadas, foi demonstrado que 42,9% das amostras de soros de cães chagásicos foram reagentes para RIFI com antígenos de promastigotas de Leishmania infantum (syn. L. chagasi). Em pesquisa realizada na cidade de Bauru – SP, área endêmica para leishmaniose visceral, observou-se que das 150 amostras de cães testadas, em quatro soros (2,7%), ocorreu uma grande diferença na titulação para Leishmania spp. e para T.cruzi, sugerindo intensa reação cruzada . Em 16 soros (10,7%) houve resultados de titulação sugestivos de reação cruzada de Leishmania spp. com T.cruzi, já que os títulos para Leishmania spp. eram maiores que os títulos para T.cruzi e, em 42 soros (28%), os títulos para Leishmania spp. eram muito próximos aos títulos de T.cruzi e, portanto, outros métodos diagnósticos deveriam ser utilizados para se chegar ao 76 diagnóstico definitivo (92). Segundo Troncarelli et al. (120), em outra pesquisa realizada em cães para diagnóstico elucidativo da leishmaniose e da tripanossomíase canina em Bauru, do total de 200 soros testados, 33 (16,5%) apresentaram resultado positivo à sorologia para ambos parasitos e, em 30 amostras de fígado e/ou de baço dos 33 cães que apresentavam anticorpos contra Leishmania spp. e T.cruzi, tanto o exame parasitológico direto como a PCR para Leishmania spp. resultaram positivos, indicando a verdadeira infecção por este parasito e a ocorrência de reações cruzadas. A sorologia é um método indireto capaz de medir a infecção, não medindo o grau de parasitismo, a presença da doença ou ainda o potencial de transmissão que o animal possa ter para o vetor (115). Dessa forma é correto afirmar a incidência da reatividade cruzada nos diagnósticos e consequentemente os resultados de falsos positivos e negativos, o que torna necessária a confirmação do diagnóstico por técnicas moleculares. Na comparação entre a técnica sorológica de RIFI e a parasitológica de hemocultura, cujos resultados podem ser verificados no Apêndice 13, observou-se discordância de positividade em apenas dois gatos, nos quais o parasita foi encontrado em meio de cultura, entretanto não apresentaram reatividade sorológica à RIFI, para Leishmania infantum (syn. L. chagasi), e para Trypanosoma cruzi, dados que concordam com o trabalho de Bresciani et al (121), realizado em felinos procedentes de Araçatuba, tendo-se encontrado positividade de 0,7% (2/283) ao exame parasitológico direto de imprint de linfonodo, porém nenhum animal apresentou positividade ao teste sorológico de RIFI. Para tal fato pode-se elucidar que, durante a coleta de sangue, o animal estivesse em período de incubação da doença, apresentando as formas promastigotas de Leishmania e/ou epimastigotas de 77 T.cruzi no sangue, mas sem a produção de anticorpos de defesa para a infecção, ou ainda, que o animal estivesse em imunossupressão por alguma condição debilitante. No teste de ELISA indireto com a utilização de antígenos brutos, a soropositividade foi de 72,5% para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) (37/51), e 39,2% para T.cruzi (20/51), valores semelhantes aos encontrados em estudo realizado por Martín-Sánchez et al (54), no sudeste da Espanha, com 183 gatos encaminhados a clínicas veterinárias, encontrando-se valores próximos a 60% de soropositividade para Leishmania spp, e superiores aos achados de Costa et al.(113), onde encontrou- se positividade em 11,5% em seus gatos estudados da região de Araçatuba; resultados discordantes também aos achados de Diakou et al. (122), demonstrando-se a soropositividade em 3,87% dos gatos estudados na Grécia. Valores superiores aos relatados em uma trabalho realizado por Nasereddin et al (123), em Jerusalém, revelou-se a prevalência de 6,7% de gatos positivos pela técnica de ELISA. A soropositividade para T.cruzi foi inferior aos dados obtidos por Wisnivesky et al. (124), obtendo-se prevalência de 79% dos gatos, em estudo realizado na Argentina. Comparando-se técnicas sorológicas de RIFI e ELISA indireto com antígeno bruto para Leishmania infantum (syn. L. chagasi) empregadas neste trabalho, pudemos observar que ocorreu discordância de resultados em 29,4% das amostras (15/51), onde 9,8% (5/51) apresentaram soropositividade à RIFI e foram negativas ao ELISA e 19,6% (10/51) foram sororreativos ao ELISA e negativos pela RIFI (Apêndice 14). Esse resultados corroboram com o trabalho realizado por Figueiredo et al. (58), onde nenhum felino foi positivo à Reação de Imunoflorescência e apenas um animal apresentou reação positiva ao ensaio i