RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 28/02/2022. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Filogenia de Pythium insidiosum pelos genes codificantes do fator de alongamento da tradução (Tef-1α), α e β- tubulina e análise do padrão de restrição por Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE) ANA CAROLINA DO PRADO UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Filogenia de Pythium insidiosum pelos genes codificantes do fator de alongamento da tradução (Tef-1α), α e β- tubulina e análise do padrão de restrição por Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE) ANA CAROLINA DO PRADO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre pelo Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de Parasitas e Micro-organismos. Pela orientação da Profa. Dra. Sandra de Moraes Gimenes Bosco e Co- orientação do Dr. Hans Garcia Garces. Botucatu/SP – 2020 “Eu sou aquela mulher que fez a escalada da montanha da vida removendo pedras e plantando flores.” Cora Coralina https://www.pensador.com/autor/cora_coralina/ Dedicatória Dedico este trabalho a todos que lutam pela educação e pesquisa neste país. Aos que defendem políticas públicas que permitam aos pobres e tantos outros cursarem ensino superior público e de qualidade no Brasil! Agradecimentos Primeiramente eu gostaria de agradecer a minha mãe Elza Aparecida do Prado e meus irmãos, Lucas Aparecido Antunes e Larissa Fernanda do Prado Antunes, por todo suporte financeiro e psicológico, por mostrar orgulho de mim sempre, mesmo não entendendo direito aquilo que escolhi como profissão, certamente não teria conseguido se não fosse a compreensão de vocês. Amo vocês para sempre! Agradeço as minhas amigas ou como preferimos dizer, minhas irmãs que Botucatu e a biologia me deram : Gabriela Marin Vasconcellos, Natália Porfírio e Aline Praxedes Mesquita, faltam-me palavras pra descrever como mesmo longe vocês me abraçaram nesse período, quero tê-las sempre perto, mesmo que de longe, eu amo e amarei vocês pra todo sempre! Agradeço aos meus amigos, colegas de casa na Moradia Estudantil, que dividiram comigo vossas realidades e um lar até o primeiro ano do Mestrado, que me acolheram e me defenderam mesmo quando eu não tinha pra onde ir. Não vou citar nomes pra não ser injusta com ninguém, cada um me apoiou e me deu suporte da sua forma, vocês são a família que Botucatu me deu e sem vocês tudo seria ainda mais difícil, amo vocês para sempre! Agradeço os meus colegas de laboratório, que tenho a permissão de chamar de amigos: Dani, Alana e Gabriel e em especial meu co-orientador que tenho a honra de também ser amiga, Hans. Vocês sempre estavam e estão prontos para discutir minhas dúvidas sobre experimentos, comemoram quando dá certo e me dão suporte quando não dá, sou eternamente grata por tudo, sem vocês eu não teria andado metade deste caminho, amo vocês! Agradeço a uma pessoa especial que a vida me trouxe a pouco tempo, mas tem sido um amigo que já me fez tanto, Adriano, obrigada pelo suporte psicológico, por aguentar minhas crises, por tentar me entender nesses últimos meses só você soube todo nervosismo e ansiedade que passei. Obrigada por deixar seu computador comigo quando o meu já não dava conta, certamente você facilitou muito minha vida, obrigada pela amizade, suporte e compreensão! Sou grata a minha orientadora Prof. Dr. Sandra Bosco pelo suporte, que é uma professora incrível e pesquisadora admirável e acima de tudo é humana, humilde, que sempre demonstra a seus alunos, não só preocupação e interesse profissional, mas também interesse no bem-estar de cada um deles. Obrigada pelo suporte, por acreditar nos seus alunos e sonhar junto com eles! Agradeço ao Prof. Dr. Eduardo Bagagli, que tenho a honra de receber como avaliador deste projeto, pois é um pesquisador incrível e dotado de uma inteligência que só quem discute micologia com ele sabe. Agradeço por me receber em seu laboratório pela contribuição no decorrer deste período, pelas tantas vezes que disse que tudo ia dar certo, obrigada! Também sou grata a todos os funcionários, professores e colegas do departamento de Microbiologia e Imunologia, que contribuem para que tudo aconteça, e sempre estão à disposição, vocês foram e são imprescindíveis! Agradeço ao suporte financeiro da Capes, número do processo 88887.338831/2019-00 e da FAPESP, número do processo 2018/24507-0 pelas bolsas de estudo concedidas, através das quais obtive minha permanência em Botucatu e a realização deste projeto! Lista de abreviações Alu l – Endonuclease de restrição obtida de Arthrobacter luteus (New England, BioLabs) Amplicons – Produto amplificado ou resultante da PCR BLASTn - Basic Local Aligment Search Tool for nucleotide BRA - Brasil COX II - Cytochrome oxidase subunit II DNA - Ácido desoxirribonucleico Eq - Equino Genbank – Banco de dados públicos de sequencias nucleotídicas e proteínas no NCBI Hae III - Endonuclease de restrição isolada de Haemophilus aegyptius (New England, BioLabs) Hinf I – Endonuclease de restrição obtida de Haemophilus influenzae (New England, BioLabs) ITS - Internal transcribed spacer NCBI - National Center for Biotechnology Information Outgroups – grupo externo, distantemente relacionado ao grupo trabalhado, referência para traçar filogenia PCR - Polymerase chain reaction PFGE - Pulse-Field Gel Electrophoresis Pi – Pythium insidiosum Primers forward – Primer iniciador 5’ (início) Primers reverse – Primer iniciador 3’ (fim) Quick CTAB - Método para extração de DNA genômico RNA - Ácido ribonucleico ssp. – indicação de gênero Tef-1α – Fator de alongamento da tradução – 1 alpha THAI - Tailândia WGS - Whole-Genome Shotgun Contigs RESUMO Pythium insidiosum é o agente etiológico da pitiose, uma infecção granulomatosa crônica, com prevalência em regiões de clima tropical e subtropical que acomete mamíferos, principalmente equinos, cães e humanos. Este micro-organismo é um falso fungo que apresenta uma ampla distribuição geográfica, sendo muito prevalente na América do Sul (pitiose equina e canina) e na Tailândia (pitiose humana). Estudos moleculares têm permitido diagnóstico precoce e melhor compreensão das relações filogenéticas, dividindo o patógeno em três clados (I, II e III ou A, B e C). Entretanto essas informações são ainda bastante limitadas e novas regiões gênicas poderiam ajudar a esclarecer a história evolutiva dessa espécie. Assim sendo, este trabalho visou estabelecer as relações filogenéticas entre 52 isolados de P. insidiosum, americanos e asiáticos, por meio do sequenciamento de três novas regiões gênicas: a região do fator de alongamento da tradução (Tef-1α), α e β tubulina, além da padronização da técnica de Pulse Filed Gel Electrophoresis (PFGE) para esta espécie. A região do Tef-1α mostrou-se menos polimórfica em relação a α e β tubulina, entretanto separou as cepas aqui trabalhadas em dois clados distintos, sendo um composto apenas de cepas classificadas previamente como sendo do clado III (asiáticas), e agrupou todas as cepas americanas junto às cepas do clado II. A filogenia baseada no gene da β tubulina separou os isolados nos três clados esperados. Em relação à α tubulina houve diferenciação dos isolados em clados I e II, não observando amplificação do clado III. As cepas do clado II se subdividiram em dois clados monofiléticos. Concluímos que os resultados da filogenia dos genes aqui trabalhados são congruentes com os dados até então estudados para essa espécie, corroborando a hipótese de expansão clonal das cepas asiáticas para o continente americano. As análises de PFGE estão em fase de padronização dos perfis eletroforéticos e acreditamos que poderá complementar os dados sobre as relações evolutivas de Pythium insidiosum. Palavras chaves: Pitiose, Pythium insidiosum, Tef-1α, α- tubulina, β-tubulina, Filogenia, identificação molecular, padrão de restrição. ABSTRACT Pythium insidiosum is the etiological agent of pythiosis, a chronic granulomatous infection, prevalent in tropical and subtropical regions that affects mammals, especially horses, dogs and humans. This is a fungus-like microorganism that has a wide geographical distribution and is very prevalent in South America (equine and canine pythiosis) and Thailand (human pythiosis). Molecular studies have allowed early diagnosis and better understand of phylogenetic relationships, and the pathogen is currently divided into three clades (I, II and III or A, B and C). However, this information is still quite limited for this pathogen and new gene regions could help understanding the evolutionary history of this species. Therefore, this study aimed to establish the phylogenetic relationships among 52 american and asian P. insidiosum isolates by sequencing three new gene regions: the translation elongation factor (Tef- 1α), α and β tubulin, in addition to the standardization of the Pulse Filed Gel Electrophoresis (PFGE) technique for this species. The Tef-1α region showed little polymorphic in relation to α and β tubulin, however it separated the strains here studied into two distinct clades, being composed only of strains previously classified as clade III (Asian), and grouped all the American strains next to the clade II strains. The β tubulin gene-based phylogeny separated the isolates into the three expected clades. Regarding α tubulin there was differentiation of isolates in clades I and II, not observing amplification of clade III. The clade II strains were subdivided into two monophyletic clades. We conclude that the results of the phylogeny of the genes here evaluated are consistent with the data previously studied for this species, corroborating the hypothesis of clonal expansion of Asian strains to the American continent. PFGE analyzes are in the phase of standardization of electrophoretic profiles and we believe it may complement the data on the evolutionary relationships of Pythium insidiosum. Key words: pythiosis, Pythium insidiosum, Tef-1α, α- tubulin, β-tubulin, phylogeny, molecular identification, restriction pattern SUMÁRIO 1 – Introdução ................................................................................................... 1 1.1 Revisão Bibliográfica ................................................................................. 3 1.1.1. Oomicetos: o gênero Pythium ssp. ........................................................... 3 1.1.2. Pythium insidosum e Pitiose ..................................................................... 4 1.1.3. Manifestações Clínicas da Pitiose ............................................................ 7 1.1.4. Importância dos estudos moleculares e suas aplicabilidade na filogenia e padrões epidemiológicos ............................................................................... 10 1.1.5. Tipagem Molecular ................................................................................. 12 2 – Objetivos ................................................................................................... 13 2.1.Objetivo Geral ............................................................................................ 13 2.2. Objetivos específicos ................................................................................ 14 3. Materiais e métodos ................................................................................... 14 3.1. Filogenia .................................................................................................... 14 3.2. Cultivo fúngico e extração do material genético ........................................ 14 3.3. Identificação molecular e desenho de primers específicos para P. insidiosum ........................................................................................................ 17 3.4. Reação em cadeia de Polimerase (PCR) e Eletroforese .......................... 18 3.5. Sequenciamento de DNA .......................................................................... 20 3.8. Análises filogenéticas ................................................................................ 20 3.9. Tipagem Molecular ................................................................................... 21 3.10. Cultivo fúngico e protoplastização ........................................................... 21 3.11. Eletroforese de Campo Pulsado (PFGE) ................................................. 23 4. Resultados e Discussão ............................................................................ 23 4.1. Filogenia .................................................................................................... 23 4.2. Desenhos dos primers, PCR e sequenciamento. ...................................... 23 4.3. Análise Filogenéticas ................................................................................ 28 4.5. Tipagem Molecular .................................................................................... 33 5. Conclusão ................................................................................................... 37 6. Referências Bibliográficas ........................................................................ 39 66 1 1 – INTRODUÇÃO A pitiose é uma infecção crônica, granulomatosa, frequentemente confundida com algumas micoses subcutâneas. É causada por um oomiceto do gênero Pythium, um falso fugo, que acomete, principalmente, equinos e cães nas Américas (MENDOZA & ALFARO, 1986; FISCHER et al., 1994) e humanos no sudeste asiático (IMWIDTHAYA, 1994; KRAJAEJUN et al., 2006a). A pitiose vem sendo descrita como uma infecção emergente, (VANITTANAKOM et al., 2004; SANTURIO et al., 2006), entretanto há relatos de casos da doença deste 1884, ano em foi descrita pela primeira vez por veterinários britânicos que trabalhavam com cavalos na Índia. A doença ficou conhecida como “bursattee” ou “bursatte”, do indiano “burus”, “bursator” ou “bausette, que significa estação chuvosa, período este de maior incidência da doença (SMITH, 1884; GAASTRA et al., 2010). Apesar de já relatada, seu agente etiológico só veio a ser isolado entre 1901 e 1924, por cientistas holandeses, o qual ficou conhecido como “Hyphomycosis destruens” na época, entretanto o nome não foi validado, pois não observaram esporulação (DE HAAN & HOOGKAMER, 1901; WITKAMP, 1924; GAASTRA et al., 2010). Acreditava-se que era um zigomiceto (BRIDGES & EMMONS, 1961). Somente em 1974, quando cientistas transferiram a cultura de ágar Sabouraud para um meio aquoso observaram a formação de zoósporo biflagelados, então o reconheceram como sendo um oomiceto do gênero Pythium (AUSTWICK & COPLAND, 1974). Embasados nesta descoberta, denominaram a doença como pitiose (CHANDLER et al., 1980) e seu agente etiológico foi formalmente denominado Pythium insidiosum após as evidências de muitos estudos morfológicos e a observação do desenvolvimento de estruturas reprodutivas sexuais in vitro (DE COCK et al., 1987). Apesar da preferência ecológica de P. insidiosum ainda não ser bem descrita, sabe-se que a espécie ocorre principalmente em águas superficiais, menos frequente em águas profundas e ocasionalmente no solo (MENDOZA, et al., 1993, 1996). A presença de água é uma condição necessária para a formação de zoósporos, forma infectante do patógeno, assim sendo, períodos de grandes índices pluviométricos e inundações são considerados recursos naturais para disperção de Pythium insidiosum em áreas endêmicas 2 (SUPABANDHU et al., 2008; GAASTRA et al., 2010), com mais casos da doença descritos nestes períodos ( MILLER, 1982; DOS SANTOS et al, 2011) Uma questão relevante a ser estudada a respeito desta infecção é seu diagnóstico e tratamento, pois há semelhança da manifestação clínica com algumas micoses que atingem o tecido subcutâneo e a morfologia do P. insidiosum pode ser confundida com fungos zigomicetos, podendo assim ter um tratamento comprometido devido ao diagnóstico equivocado. Apesar de muito parecido morfologicamente com um fungo, há uma grande diferença química e bioquímica na composição de sua parede celular, membrana plasmática e algumas vias proteicas, estruturas que podem ser alvos de fármacos antifúngicos, comprometendo o prognóstico da pitiose (BEAKES 1987; 1989). Atualmente o diagnóstico das infecções fúngicas envolve exame micológico direto, cultura e histopatologia, processos muitas vezes demorados, que dependem da qualidade da amostra clínica, viabilidade do patógeno e experiência do profissional do laboratório, fatos que compromentem o resultado (WAGNER et al., 2018). A biologia molecular tem acrescentado muitas informações a respeito da história evolutiva de muitos patógenos na Microbiologia. Estudos na área da genética molecular têm permitido avanços no uso de técnicas e consequentemente mais assertividade e rapidez no diagnóstico e esclarecimentos a respeito da dinâmica intraespecífica e interespecíficas dos patógenos. Além disso, estas técnicas demostram maior sensibilidade na identificação do patógeno, quando comparado às técnicas tradicionais mencionadas anteriormente (RICKERTS et al., 2007; BUITRAGO et al., 2013; RAMPINI et al., 2016; WAGNER et al., 2018). Estudos envolvendo Pythium insidiosum têm permitido um melhor entendimento em relação a suas características gênicas e suas relações filogenéticas permitido o estabelecimento de marcadores moleculares tanto para fins de diagnóstico quantos para se entender suas relações evolutivas ( SCHURKO et al., 2003; KAMMARNJESADAKUL et al., 2011; AZEVEDO et al., 2012; ; RIBEIRO et al., 2017). A região ITS (Internal Transcribed Spacer) do DNA nuclear ribossomal, muito usada no diagnóstico molecular de fungos, já foi usada para traçar a filogenia de P. insidiosum, e permitiu a separação das cepas em três clados distintos (I, II e III), sendo o clado I composto unicamente por isolados provenientes do continente americano, e os clados II e III 3 composto majoritariamente por isolados da Tailândia, bem como de outras regiões, como Japão, Austrália, Índia e também dois isolados do continente americano (SCHURKO et al., 2003a; 2003b). Em um estudo realizado por Kammarnjesadakul et al. (2011), analisando as regiões ITS e Cox-II (citocromo oxidase do DNA mitocondrial) foi observado a separação dos isolados de P. insidiosum em três clados distintos, denominados A, B e C, sendo clado A composto por isolados do continente americano e clados B e C por isolados do continente asiático (Tailândia). Esses resultados foram corroborados por Azevedo et al. (2012), ao incluírem isolados provenientes das regiões centro- oeste e sul do Brasil nessas análises filogenéticas. Além disso, a região ITS tem sido usada com êxito na identificação de P. insidisoum, permitindo um diagnóstico preciso e rápido sendo mais assertivo que técnicas tradicionais (BOSCO et al., 2005; BERNHEIM et al., 2019). No entanto para fins de informações evolutivas, dinâmica populacional da espécie e estabelecimento de novos marcadores moleculares para estudos filogenéticos e diagnóticos, estudos com P. insidiosum ainda são restritos. Dessa forma, vimos a necessidade de avanços no conhecimento genômico da espécie em questão e suas relações evolutivas. 1.1– REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1.1. Oomicetos: o gênero Pythium ssp. O gênero Pythium, pertence ao filo Oomycota, que por sua vez pertence ao Reino Stramenopila, um dos três reinos resultantes da divisão do que era conhecido como “Reino Fungi” de forma geral (BRUNS et al., 1991; KWON- CHUNG, 1994). Compreende na sua maioria micro-organismos fitopatogênicos e possui mais de 100 espécies validadas e mais de 300 propostas, sendo em sua maioria cosmopolita, saprófitas de diferentes substratos, tanto na água como no solo, podendo parasitar algas, fungos, plantas e animais, inclusive humanos (KIRK et al, 2008; SCHROEDER et al., 2013). Os oomicetos são organismos heterotróficos, filamentosos e multicelulares, assim como muitos fungos, porém se diferem destes à nível somático estrutural e molecular. A nível estrutural por apresentar celulose e β-glucanas na composição da parede celular (ao invés de quitina como ocorre em fungos verdadeiros), zoósporos 4 biflagelados, estado vegetativo diploide, com meiose ocorrendo na gametogênese, mitocôndrias com crista tubular, vacúolos citoplasmático de corpo denso e estocagem de micolaminarina (1,3- β- glucana, solúvel em água) e uma via alternativa na síntese de lisina (BEAKES et al., 1987; 1989; 2012). Uma outra característica importante que difere os oomicetos dos fungos é quanto ao papel do ergosterol, nos fungos verdadeiros este é o principal esteroide, já os oomicetos são auxotróficos, ou seja, incorporaram esteroides do meio ao invés de produzí-los, além disso estas moléculas não são essenciais no crescimento vegetativo, apenas para o desenvolvimento das estruturas sexuais (HENDRIX, 1964; 1970). As diferenças a nível molecular são evidenciadas por estudos filogenéticos mediante análises moleculares envolvendo regiões gênicas, as quais demostram que o grupo dos oomicetos se encontra filogeneticamente mais próximos de diatomáceas e algas que de fungos (BRUNS et al., 1991; ADHIKARI et al., 2013; TANGPHATSORNRUANG et al., 2016). 1.1.2 Pythium insidosum e pitiose O agente etiológico da pitiose é Pythium insidiosum, que por meio de estudos baseados na sistemática filogenética, análises moleculares e estruturais foi reclassificado no Reino Stramenopila, Filo Oomycota, Classe Oomycetes, Ordem Peronosporales, Família Pythiaceae (DE COCK et al., 1987; ALEXOPOULOS et al., 1996). Pithium insidiosum cresce na forma micelial, com hifas cenocíticas morfologicamente semelhante a fungos zigomicetos, diferindo destes pela composição da parede celular, não apresentando quitina, sendo esta composta majoritariamente por celulose, β-glucana e hidroxiprolina. Adicionalmente, a molécula de ergosterol se encontra ausente em sua membrana plasmática e se reproduz principalmente de forma assexuada. Os zoósporos são células únicas nucleadas e biflageladas sendo um flagelo anterior e um posterior os quais se movimentam de forma helicoidal em direções aleatórias (GRIFFITH et al., 1992; WALKER et al., 2007). O ciclo de vida do P. insidiosum foi proposto pela primeira vez em 1983, onde Miller mostrou que os zoósporos apresentam quimiotaxia a alguma substância presente nos pêlos de mamíferos e em tecido vegetal (MILLER, 1983). O ciclo de vida envolve a colonização de plantas aquáticas, que servem 5 de substratos para seu desenvolvimento e reprodução. Ao encontrar o tecido vegetal, os zoósporos livres no meio aquático se encistam e iniciam a formação de suas hifas por meio da emissão de um tubo germinativo, dessa forma ocorre a colonização da planta com o desenvolvimento das hifas. Nas extremidades dessas hifas ocorre à formação de zoosporângios onde se desenvolverão os zoósporos biflagelados, oriundos da reprodução assexuada, que após a maturação são liberados no meio aquático em busca de um novo tecido vegetal onde reiniciará seu ciclo de vida. A infecção e o desenvolvimento da doença ocorrem quando estes zoósporos livres no ambiente aquático entram em contato com o tecido animal lesionado. O ciclo de vida e quando ocorre a infecção está ilustrado no Esquema 1. Estudos demostram que os zoósporos secretam uma glicoproteína que permite a adesão na superfície tecidual onde se encistam (ESTRADA-GARCIA, 1990; MENDOZA et al., 1993). Esquema 1. Ilustração do ciclo de vida de P. insidiosum e a ocorrência da infecção. Imagens provinientes de: 1. Mendonza et al, 1993; 2. Gaastra et al, 2010; 3. Revista Veterinária (https://www.revistaveterinaria.com.br/saiba-mais-sobre-a-pitiose-equina/); 4. Santurio et al, 2004; 5. Álvarez et al, 2003. P. insidiosum foi considerado por um determinado período como o único agente etiológico da pitiose em animais, no entanto, dois casos de pitiose humana foram reportados por outra espécie, Pythium aphanidermatum, o que reforça a necessidade de mais estudos com este importante gênero (CALVANO et al., 2011; FARMER et al., 2015). https://www.revistaveterinaria.com.br/saiba-mais-sobre-a-pitiose-equina/ 6 A pitiose é comum em regiões tropicais e subtropicais, cuja incidência aumenta após períodos de chuvas. O Brasil é considerado um país endêmico desta doença, com a maioria dos casos em equinos na região do Pantanal Mato-Grossense, sendo esta considerada a de maior incidência da doença no mundo (SANTURIO et al., 2006; ZARO, 2013; SANTOS et al., 2014; MARCOLONGO-PEREIRA et al., 2014). O primeiro caso de pitiose humana, por P. insidiosum, foi relatado na Tailândia em 1985 (THIANPRASIT, 1986, 1990), no entanto diversos casos já foram reportados também na Oceania e Americas ( MILLER, 1983; MENDOZA et al., 1986; MENDOZA & ALFARO, 1986; TRISCOTT et al, 1993; IMWIDTHAYA, 1994; SOHN et al., 1996; MENDOZA et al., 1996; MURDOCH & PARR, 1997; GROOTERS et al., 2003; CAMUS et al., 2004; MENDOZA et al., 2005; BOSCO et al., 2005; OMAR et al.,2019). Casos importados da doença já foram reportados em países fora da região dos trópicos, os quais foram registrados após a passagem dos pacientes por áreas endêmicas de pitiose (GAASTRA et al., 2010; MOSBAH et al., 2012; HUNG & LEDDIN, 2014; LELIEVRE et al., 2015; CASTELLAR et al., 2017). No entanto, um caso denominado autóctone foi relatado na Europa, em um paciente de 21 anos de idade, com lesão ocular após ter nadado em lagoa na Espanha (BERNHEIM et al., 2019). Também foi relatado um caso na África, em Mali, em um cão e mais 33 casos em equinos no Egito (RIVIERRE et al., 2005; MOSBAH et al., 2012). A doença ocorre principalmente em equinos, cães e humanos (MENDOZA & ALFARO, 1986; MEIRELES et al., 1993; FISCHER et al., 1994, IMWIDTHAYA, 1994; DYKSTRA et al., 1999; KRAJAEJUN et al., 2006; KEOPRASOM et al., 2013), no entanto já foi relatada, menos frequentemente, em felinos, bovinos, ovinos, caprinos, asininos e em animais silvestres em cativeiro e também em uma ave silvestre nos Estados Unidos e em avestruz no Brasil (MILLER et al 1985; ; SANTURIO et al 1998; RAKICH et al., 2002; CAMUS et al., 2004; TABOSA et al., 2004; WELLAHAN et al., 2004; LÉON & PÉREZ, 2005; BUERGELTD et al., 2006; PESAVENTO et al., 2008 SANTURIO et al., 2008; GRECCO et al., 2009; VIDELA et al., 2011; ÁLVAREZ et al., 2013; SANTOS et al., 2014; DO CARMO et al., 2015; HECK et al., 2018, SOUTO et al., 2019). A ditribuição e as principais espécies acometidas pela pitiose no mundo estão iliustradas no esquema a seguir (esquema 2). 7 Esquema 2. Ilustração gerada no Paint (Microsoft Office 2010) de acordo com os trabalhos relatando pitiose no mundo publicados até 2019. De acordo com a escala, as cores mais escuras indicam os países com maiores incidência e prevalência da pitiose no mundo. 2.2.1 – Manifestações Clínicas da Pitiose De forma geral a doença tem se manifestado por lesões granulomatosas nos tecidos cutâneo e subcutâneo em diferentes espécies animais (CHAFFIN et al. 1995, GAASTRA et al., 2010; LEAL et al., 2001), por comprometimento gastrointestinal em equinos e cães (MILLER, 1985, FISCHER et al., 1995), ceratite em humanos (TANHEHCO et al., 2011, RATHI et al., 2018) e também pela forma disseminada, caracterizada por infecção sistêmica com a formação de gangrena ou aneurisma (IMWIDTHAYA, 1994, CHITASOMBAT et al., 2018a, b). A pitiose intestinal é a segunda forma de infecção mais comum, entretanto detalhes da forma de contaminação são pouco conhecidos, sendo a ingestão de água com zoósporo considerada a principal forma desta infecção (MENDOZA et al., 1993, BEZERRA et al., 2010, GAASTRA et al., 2010). Os equinos são os animais mais acometidos pela pitiose sem haver predisposição por idade, sexo ou raça. As regiões anatômicas mais afetadas pela doença compreendem as regiões inferiores, como as extremidades distais dos membros, região ventral torácica e abdominal, fato explicado por serem as partes que estão em maior contato com a água, sendo esse o fator determinante para a infecção (MENDOZA et al., 1996). Os zoósporos penetram 8 a superfície do tecido lesionado liberando enzimas proteolíticas e formando o tubo germinativo (RAVISHANKAR et al., 2001; MACDONALD et al., 2002). Em equinos são observadas lesões ulcerativas granulomatosas com bordos irregulares contendo estruturas de coloração branco-amareladas com trajeto semelhante ao das hifas, denominados kunkers, os quais correspondem a uma reação imunológica muito intensa desencadeada pela degranulação de eosinófilos e mastócitos ao redor das hifas (MENDOZA & NEWTON, 2005). O tamanho da lesão varia pelo tempo e local da infecção, apresentando aspecto muco-sanguinolento e hemorrágico com intenso prurido, normalmente ocorre uma lesão única, mas as vezes pode ser multifocal (CHAFFIN et al., 1995). A pitiose equina também pode se disseminar para órgãos internos a partir de infecções subcutâneas (REIS et al., 2003). Também foram observadas lesões atípicas no pantanal mato-grossense com aspectos deformantes porém sem drenagem constante de secreção e o tecido granulomatoso era recoberto por uma pele grossa, a qual chamaram de “tumoração não ulcerada” que após anos permanecem do mesmo tamanho (LEAL et al., 2001a). A segunda forma mais comum em equinos é a pitiose intestinal, com ulceração da mucosa e obstrução do lúmen (SANTURIO et al., 2006). Além dessas duas formas, a pitiose equina pode atingir o tecido ósseo adjacente à lesão cutânea, em membros, causando exostoses, osteólises e osteomielite. Nestas lesões pode se visualizar a presença de granulomas infiltrados por eosinófilos e massas necróticas contendo hifas (MENDOZA et al., 1988; ALFARO & MENDOZA, 1990). A espécie canina é a segunda mais frequentemente acometida pela pitiose e pode se observar em cães oriundos de regiões rurais, que apresentaram contato com regiões alagadas ou água contaminada (FISCHER et al., 1994; DYKSTRA et al., 1999). As lesões podem ser cutâneas ou gastrointestinais, sendo a segunda opção a forma mais frequente, manifestando-se por distúrbios digestivos como anorexia crônica e diarreia, apresentando granulomas nodulares nas paredes de estômago e instestino, as quais são perceptíveis à palpação abdominal (BENTINCK-SMITH et al., 1989). As lesões gastrointestinais apresentam inflamações piogranulomatosas com áreas necrosadas na parede do estômago e intestino com detecção de eosinófilo e hifas no exame histopatológico (BENTINCK-SMITH et al., 1989). No trato digestório superior já foi relatado esofagite crônica e nódulo na orofaringe devido à infecção por P. insidiosum (PATTON et al, 1998; HELMAN 9 & OLIVER, 1999). Em gatos a pitiose é mais rara, entretanto há relatos de infecção superficial do trato respiratório e infecção gastrointestinal e lesão sublingual (BISSONNETTE et al., 1991; RAKICH et al., 2002; FORTIN et al., 2017). No Brasil a pitiose felina foi reportada em um gato que apresentou uma massa granulomatosa em região perianal. O animal era proveniente do estado do Mato Grosso (SOARES et al., 2019). Em bovinos há relatos nos Estados Unidos, Brasil e Venezuela. Em todos os relatos foram observados lesões cutâneas em extremidade distal dos membros, com edemas e ulcerações, com infecções multifocais e presença de granulomas envoltos por tecido fibroso sem kunkers e observa-se cura espontânea das lesões (MILLER et al., 1985; SANTURIO et al., 1998; PÉREZ et al., 2005, GABRIEL et al., 2008). Em ovinos temos registros de dois surtos no nordeste brasileiro em 2004, em um rebanho de 120 animais 40 foram infectados após serem colocados em uma área contendo um açude de pastagem na margem. E no segundo rebanho, de um total de 80 animais, 6 foram infectados ao serem expostos em uma área banhada onde havia pastagem. Os sinais clínicos foram lesões ulcerativas nos membros, no abdômen e região pré-escapular (TABOSA et al., 2004). A maior parte dos casos de pitiose humana é reportada na Tailandia, onde houve o primeiro relato em 1985 (THIANPRASIT, 1986, 1990), e a maioria está relacionada à pacientes talassêmicos (SATHAPATAYAVONGS et al., 1989; LAOHAPENSANG et al., 2009; KEOPRASOM et al., 2013). A forma mais comum de pitiose humana é a pitiose vascular, representando cerca de 59% dos casos reportados na Tailandia até 2008. É o caso mais grave de pitiose pois pode progredir para forma disseminada da doença, com altas taxas de mortalidade e morbidade, principalmente em pacientes talassêmicos. Os sinais clínicos são insuficiência arterial dos membros inferiores, prurido cutâneo, úlcera cutânea, celulite, fasciculite necrosante, edema nas pernas, ausência de pulso arterial, aneurisma ilíaco ou femoral e aneurisma da aorta (KRAJAEJUN et al., 2006b). A segunda forma mais frequente de manifestação é a pitiose ocular, onde os pacientes apresentam ulcera na córnea ou ceratite e edema palpebral (KRAJAEJUN et al., 2006b; BERNHEIM et al., 2019; PERMPALUNG et al., 2019). A terceira forma de manifestação da pitiose humana são através das lesões granulomatosas cutâneas e subcutâneas apresentando-se ulceradas e edematosas (KRAJAEJUN et al., 2006b). 39 7 – Conclusões As três regiões gênicas analisadas mostraram-se úteis para estabelecer as relações filogenéticas em P. insidiosum. Dos genes estudados o gene da β- tubulina mostrou os melhores resultados sendo mais diverso genéticamente, separando os isolados de acordo os clados sugeridos e também de acordo com as diferentes regiões geográficas. Embora não tenhamos resultados conclusivos referentes à tipagem molecular, acreditamos que o resultado será bastante relevante para se entender o padrão genômico dentro da especie e complementará os resultados obtidos a respeitos das relações evolutivas. 8- Referências Bibliográficas ABDELJELIL, J. B.; SAGHROUNI, FATMA; KHAMMARI, I.; GHEITH, S.;FATHALLAH, A; SAID, M. B. BOUKADIDA, J. Investigation of a Cluster of Candida albicans Invasive Candidiasis in a Neonatal Intensive Care Unit by Pulsed-Field Gel Electrophoresis. The cientific World JOURNAL, 2012. ADACHI, Y.; TODA T.; NIWA O.; YANAGIDA, M. et al. Differential expressions of essential and nonessential alpha-tubulin genes in Schizosaccharomyces pombe. Molecular and Cellular Biology, v. 6, n. 6, p. 2168–2178, 1986. ADHIKARI, B. N.; HAMILTON J. P.; ZERILLO, M. M.;TISSERAT, N.; LÉVESQUE; C. A; BUELL C. R. Comparative Genomics Reveals Insight into Virulence Strategies of Plant Pathogenic Oomycetes. PLoS ONE, v. 8, n. 10, 2013. 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