RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta TESE será disponibilizado somente a partir de 16/08/2021. UNIVERSIDADE ESTADUALPAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA Campus de Araçatuba GABRIELA LOVIZUTTO VENTURIN EFEITO REGULADOR DA PGE2 NA PRODUÇÃO DE TNF-α E IL-17 NA ATIVIDADE MICROBICIDA NA LEISHMANIOSE CANINA Araçatuba 2019 1 GABRIELA LOVIZUTTO VENTURIN EFEITO REGULADOR DA PGE2 NA PRODUÇÃO DE TNF-α E IL-17 NA ATIVIDADE MICROBICIDA NA LEISHMANIOSE CANINA Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutora em Ciência Animal (Área de Medicina Veterinária Preventiva e Produção Animal). Orientadora: Prof.ª Ass. Valéria Marçal Felix de Lima Araçatuba 2019 2 3 4 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por me acolher, ouvir meus pedidos e não me abandonar. Nos momentos de aflição, sua paz se faz presente em minha vida e isso me deu força para continuar a caminhada e vencer mais esta etapa em minha vida. Agradeço a Nossa Senhora Aparecida pela intercessão, por me proteger, ouvir minhas súplicas, por dar coragem e sabedoria durante horas e horas de estudo para que eu pudesse concluir o doutorado. Agradeço a minha orientadora Professora Doutora Valéria, pela disponibilidade e incentivo que foram fundamentais para a realização desse estudo. O apoio prestado, a forma interessada e pertinente como acompanhou a realização deste trabalho me fez crescer. Suas críticas construtivas, as discussões e reflexões foram fundamentais ao longo de todo o meu crescimento. Serei eternamente grata pelo apoio. Aos meus queridos pais pelo dia de hoje, um dos mais importantes da minha vida, conclusão do doutorado e eu tenho muito ou tudo a agradecer a vocês. Vocês se sacrificaram, abdicaram de tempo e projetos pessoais para que eu tivesse a oportunidade de estudar e ter uma boa formação profissional e pessoal.Vocês seguraram as minhas mãos e caminharam juntos comigo me incentivando a seguir em frente mesmo diante dos osbtáculos da vida. Obrigada, Pai e Mãe! Amo vocês! Ao meu esposo Rafael, que me confortou nos momentos difíceis, confiou em mim e mostrou que eu seria capaz de concluir meu trabalho. Suas atitudes me encorajaram. Obrigada! Amo você! Aos tios e primos, que com carinho e sabedoria, torceram por mim nas tomadas de decisões, me aconselharam para que eu alcançasse o meu sucesso. Sou grata a todos vocês. Aos amigos de laboratório Larissa, Jaquelina, Gabriela, Marilene, Sidnei, Fabiana, por toda a cumplicidade, ajuda e companheirismo. Levarei todos vocês sempre em meu coração. À Técnica de Laboratório Flávia Mari Yamamoto, obrigada pela ajuda nos experimentos. Fico feliz em saber que estou finalizando esta etapa e que a levarei como amiga para sempre em minha vida. 5 Aos professores Paulo Sérgio Patto e Flávia de Rezende Eugênio e ao colega Carlos Eduardo de Siqueira, pois foram importantíssimos nas cirurgias. Nossas manhãs foram muito animadas e aprendi muito com vocês! À minha banca de qualificação Profa. e Orientadora Dra. Valéria Marçal Felix de Lima, Profa. Dra. Gisele Fabrino Marques e Profa. Dra. Sandra Helena Penha de Oliveira pelas relevantes considerações sobre o meu trabalho. Ao programa de Pós-graduação em Ciência Animal e a Faculdade de Medicina Veterinária Campus de Araçatuba pela oportunidade, por toda a infraestrutura oferecida e por ser tão bem recebida por todos. A CAPES por me conceder bolsa de mestrado e a FAPESP pelo financiamento do projeto e por me conceder bolsa de doutorado (2016/24388-6). 6 VENTURIN, G.L. Efeito regulador da PGE2 na produção de TNF-α e IL-17 na atividade microbicida na leishmaniose canina. 2019. 60 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2019. RESUMO A leishmaniose canina (CanL) é causada pelo parasito intracelular Leishmania infantum. Devido ao alto parasitismo na pele o cão é considerado o principal reservatório urbano da L. Infantum. A prostaglandina-E2 (PGE2) possui propriedades reguladoras potentes do sistema imunológico e pode se ligar aos receptores EP1, EP2 e EP4 que geram ativação celular ou EP3 que gera inibição de resposta celular. Na CanL o papel regulador da PGE2 ainda não foi estudado, por isso, os parâmetros foram avaliados em cultura de leucócitos esplênicos de cães com CanL. Avaliando o nível de PGE2, seus receptores, e seu efeito modulador sobre a PGE2 na atividade da arginase, NO2, citocinas IL-10, IL-17 e TNF-α e carga. Para isso utilizamos seus agonistas, antagonista e inibidor. Nossos resultados mostraram que a expressão do receptor EP2 diminuiu nos leucócitos esplênicos dos cães com CanL quando comparado aos cães saudáveis. Observamos que o NO2 diminuiu quando tratados com os agonistas dos receptores de PGE2 (EP1/EP2/EP3), antagonista dos receptores de PGE2 (AH-6809) e inibidor de COX-2 (NS-398). A concentração das citocinas TNF-α e a IL-17 diminuíram quando tratadas com agonista do receptor de PGE2 (EP2), e quando estimuladas com a PGE2. A carga parasitária diminuiu na cultura de leucócitos esplênicos de cães com CanL estimulados com PGE2. Concluímos que a infecção por Leishmania modula os receptores de PGE2 em cães, e que a ligação da PGE2 aos receptores pode ativar a capacidade microbicida das células. Palavras – Chave: Prostaglandina. Receptores de prostaglandina. Leishmania. Cães. 7 VENTURIN, G.L. PGE2 regulatory effect on TNF-α and IL-17 production on microbicidal activity in canine leishmaniasis. 2019. 60 f. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2019. ABSTRACT Canine leishmaniasis (CanL) is caused by the intracellular parasite Leishmania infantum. Prostaglandin E2 (PGE2) exerts potent regulatory effects on the immune system in Leishmania infection, but in CanL has not yet been studied. In this study, PGE2 and PGE2 receptor levels and the regulatory effect of PGE2 on arginase activity; NO2; the IL-10, IL-17 and TNF-α and parasite load in the presence of agonists, antagonists and inhibitors were evaluated in cultures of splenic leukocytes obtained from dogs with CanL. Our results showed that splenic leukocytes from dogs with CanL had lower EP2 receptor levels than splenic leukocytes from healthy animals. We observed that NO2 levels decreased when the cells were treated with PGE2 receptor agonist (EP1/EP2/EP3), a PGE2 receptor antagonist (AH-6809) or a COX-2 inhibitor (NS-398) and that TNF-α and IL-17 cytokine levels decreased when the cells were treated with a PGE2 receptor agonist (EP2) or stimulated with PGE2. The parasite load in splenic leukocyte cell cultures from dogs with CanL decreased after stimulation of the cells with PGE2. We conclude that the infection of dogs by Leishmania modulates PGE2 receptors and speculate that the binding of PGE2 to its receptors may activate the microbicidal capacity of cells. Keywords: Prostaglandin. Receptors Prostaglandin E. Leishmania. Dogs. 45 Activation, Oxidative Stress and Inflammation Characterize Severe Canine Visceral Leishmaniasis. Sci Rep. 2016;6(1):1–7. 41. Maia C, Nunes M, Cristóvão J, et al. Experimental canine leishmaniasis: Clinical, parasitological and serological follow-up. Acta Trop. 2010;116(3):193–199. 42. 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