André Olean Oliveira Desenvolvimento de imunossensores eletroquímicos baseados em nanopartículas de ouro recobertas por polímeros condutores redox para o monitoramento de marcadores biológicos São José do Rio Preto 2022 Campus de São José do Rio Preto André Olean Oliveira Desenvolvimento de imunossensores eletroquímicos baseados em nanopartículas de ouro recobertas por polímeros condutores redox para a determinação de marcadores biológicos Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Nome do Programa, junto ao Programa de Pós-Graduação em Nome do Programa, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Orientador: Prof. Dr. Marcos F. S. Teixeira Coorientador: Prof. Dr. Gilberto O. Brito São José do Rio Preto 2022 O48d Oliveira, André Olean Desenvolvimento de Imunossensores Eletroquímicos Baseados em Nanopartículas de Ouro Recobertas por Polímeros Condutores Redox para a Determinação de Marcadores Biológicos / André Olean Oliveira. -- São José do Rio Preto, 2022 169 p. : il., tabs. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientadora: Marcos F. S. Teixeira Coorientadora: Gilberto O. Brito 1. Eletroquímica. 2. Química Analítica. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. André Olean Oliveira Desenvolvimento de Imunossensores Eletroquímicos Baseados em Nanopartículas de Ouro Recobertas por Polímeros Condutores Redox para o Monitoramento de Marcadores Biológicos Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Nome do Programa, junto ao Programa de Pós-Graduação em Nome do Programa, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES Comissão Examinadora Prof. Dr. Marcos F. S. Teixeira UNESP – Campus Presidente Prudente Orientador Profa. Dra. Elen Julciléia Romão Sartori Braz UEL – Londrina/PR Profa. Dra. Sonia Tomie Tanimoto SENAI – Três Lagoas/MS Prof. Dr. André Luiz dos Santos UFU – Ituiutaba/MG Profa. Dra. Silvania Lanfredi UNESP – Campus Presidente Prudente São José do Rio Preto 08 de março de 2022 Dedico esse trabalho para meus pais, Maria de Fátima e Manoel. Minha Esposa Gabriela. E ao meu irmão Tiago. Agradecimentos Gostaria de iniciar dizendo que esse foi um dos melhores momentos durante a construção da presente tese. Poder destacar e agradecer pessoas especiais que estiveram envolvidas durante esse processo. Em primeiro lugar, agradeço a Deus, pelo dom da vida e por me manter na fé, para sempre resistir perante os desafios, buscando sempre fazer o meu melhor. À minha Mãe e ao meu Pai, por serem meus maiores exemplos de coragem, otimismo, fé, trabalho, união e amor. Por me ensinarem a tratar as responsabilidades com compromisso e dedicação. Por sempre estarem ao meu lado me incentivando, acalmando ou encorajando, me dando todo o apoio e suporte necessário para que eu conseguisse lutar pelos meus sonhos. Ao meu irmão Tiago, sou igualmente grato. Por todo o apoio, amizade, companheirismo e pelos momentos de descontração. Também pela incrível oportunidade de poder atuar em parceria em trabalhos científicos. Ao Prof. Dr. Marcos F. S. Teixeira, meu grande irmão! Por todos esses anos de amizade e orientação. Por ser um exemplo de amor a ciência. Por toda confiança depositada em minha capacidade e pela oportunidade de desenvolver o presente trabalho. Também, por todos seus ensinamentos, conselhos e discussões científicas, seja elas no laboratório ou em um happy hour com boa cerveja, contribuindo imensamente para meu desenvolvimento como pessoa, pesquisador e futuro cientista. À Profa. Dra. Patrícia M. Seraphim, pela imensurável contribuição para este trabalho e por todos os trabalhos em parceria. Agradeço enormemente por todos esses anos de amizade. (Enfim a dívida do cupcake foi paga!). Ao Prof. Dr. Celso X. Cardoso, por toda parceria e trabalhos em colaboração. Ao Prof. Gilberto O. Brito, pelas valiosas horas em encontros online debatendo e discutindo as diferentes áreas da química. Obrigado pela amizade, coorientação e contribuições científicas. À Profa. Dra. Silvania Lanfredi, pela oportunidade de poder colaborar em um grande trabalho. À Profa. Dra. Elen Sartori, por todas as contribuições para presente tese e pelos grandes trabalhos que tive a grata oportunidade de colaborar. Aos amigos de laboratório GPES, Heitor, Kevin, Gabriel Masiero, Gabriel Zaia, Jaqueline, Miquéias, Natalia, Tainá e Vinicius, pelas horas trabalhadas e partilha de bons momentos acompanhadas de cafés. Ao Me. Yuri A. Oliveira, um irmão que a ciência me deu. Por toda amizade, parceria, conselhos, descontração e por ser um exemplo de persistência e coragem. Ao Me. Fabiano Praxedes, antigo colega de classe que durante o doutorado tornou-se companheiro de pesquisa e de reuniões (intermináveis) do Conselho de Química da Pós. Agradeço também pela disponibilidade para realização das medidas de DRX e ATR-FTIR. Ao Centro de Desenvolvimento de Materiais Funcionais (CDMF/CEPID/FAPESP). Aos docentes e funcionários do Departamento de Química e Bioquímica da FCT – UNESP, Ana Flora, Ana Pires, Beatriz, Eduardo, Gustavo, Sérgio, Silvânia, Valdemiro e Angélica, pelo carinho e ótima convivência durante esses anos. Aos técnicos de laboratório, Sidney, Gabriel, Marcelo e Murillo, sempre dispostos a contribuir. Aos amigos de longa data do Ana Jacinta, em especial aos amigos Jean Yamada, Jéfferson (Pajé), Felipe Mendes, Renan Schafer, Renan (MTB), Lucas (Chicó), Vitor (Chitão), André (Dé), Giovani (Teta), Gleisson (Feio), Rafael (Rato), André (Toty), Thiago (Cagão), Alberson, Paulo (Paulinho), Rafael (Pelo), Gustavo (Mênór), João e Luiz (Luizinho), pela sincera amizade de todos esses anos. À minha segunda família, Paulo, Rosimeire e Eduarda, pelo imenso amor e carinho com o qual eu sempre fui e sou recebido. Sou grato por todo apoio e por fazerem com que eu me sinta como um filho. À minha esposa Gabriela. Que alegria poder retornar a uma página de agradecimento e atualizá-la de namorada a cônjuge. Agradeço por todos esses anos de companheirismo, estando ao meu lado em todos os momentos dessa minha caminhada. Por sempre acreditar em mim e em meus sonhos. Obrigado por todo apoio e incentivo. Eu não teria conseguido sem você ao meu lado. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Informações Curriculares Me. André Olean-Oliveira Data de Nascimento: 17/11/1992 olean.oliveira.a@gmail.com Departamento de Química e Bioquímica Faculdade de Ciências e Tecnologia-Universidade Estadual Paulista (FCT/UNESP) Presidente Prudente, São Paulo, Brasil Graduação 2016 Química UNESP Presidente Prudente-SP/Brasil Pós-graduação 2019 Mestrado em Química UNESP - São José do Rio Preto-SP/Brasil 2022 Doutorado em Química UNESP - São José do Rio Preto-SP/Brasil Produção Capítulo de Livro 1. A. Olean-Oliveira, Marcos F. S. Teixeira, Camila F. Pereira, Camila K. S. Matsu, Eroína F. Santiago, Nátaly M. Vergílio, Patrik D. S. Gois, Danielle C. Santos, Chemistry Show: The Use of Demonstrative Experiments for the Dissemination of Science in the Environment Week FCT/UNESP, in: C. Acadêmica (Ed.), NÚCLEOS ENSINO DA UNESP Artig. 2015, São Paulo, 2015: p. 590. Publicações h-index 6 (Web of Science 02/2022) [1] A. Olean-Oliveira, P. Monteiro Seraphim, M.F.S. Teixeira, Methylated DNA impedimetric immunosensor based on azo-polymer-AuNPs dots and 5-methylcytosine antibody using dissolved oxygen as a redox probe, Electrochem. Commun. 136 (2022) 107242. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.elecom.2022.107242. [2] A. Olean-Oliveira, G.A. Oliveira Brito, C.X. Cardoso, M.F.S. 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Olean-Oliveira, J.C. Pacheco, P.M. Seraphim, M.F.S. Teixeira, Synergistic effect of reduced graphene oxide/azo-polymer layers on electrochemical performance and application as nonenzymatic chemiresistor sensors for detecting superoxide anion radicals, J. Electroanal. Chem. 852 (2019). https://doi.org/10.1016/j.jelechem.2019.113520. [12] A. Olean-Oliveira, T. Olean-Oliveira, A.C.R. Moreno, P.M. Seraphim, M.F.S. Teixeira, A Chemiresistor Sensor Based on Azo-Polymer and Graphene for Real-Time Monitoring of Mitochondrial Oxygen Consumption, ACS Sensors. 4 (2019). https://doi.org/10.1021/acssensors.8b01013. [13] C.F. Pereira, A. Olean-Oliveira, D.N. David-Parra, M.F.S. Teixeira, A chemiresistor sensor based on a cobalt(salen) metallopolymer for dissolved molecular oxygen, Talanta. 190 (2018). https://doi.org/10.1016/j.talanta.2018.07.080. [14] A. Olean-Oliveira, C.F. Pereira, D.N. David-Parra, M.F.S. 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INPI Code: BR 10 2021 021811 8 Experiência Profissional Professor de Química Ensino médio: 2016 - 2017 Colégio São Paulo 2016 - 2017 Colégio Apogeu Professor Bolsista Ensino Superior: 2021 Universidade Estadual Paulista (FCT-UNESP) Química Analítica para o Curso de Engenharia Ambiental 2022 Universidade Estadual Paulista (FCT-UNESP) Química Analítica para o Curso de Engenharia Ambiental 2022 Universidade Estadual Paulista (FCT-UNESP) Análise Instrumental para o Curso de Licenciatura em Química Editor Convidado: 2021 Molecules (MDPI) Divulgador científico: 2011 - 2017 Trupe Quimiatividade Apresentações e palestras interativas para escolas públicas e particulares da região de Presidente Prudente-SP. RESUMO A presente tese reúne os estudos e esforços dedicados ao desenvolvimento de imunossensores eletroquímicos baseados em nanopartículas de ouro recobertas por polímeros condutores redox para o monitoramento de biomarcadores de interesses clínicos. Modificações genéticas e epigenéticas são fenômenos com ocorrência natural, sendo a principal responsável pela diversidade entre organismos. Contudo, fatores ambientais podem influenciar as taxas de mutações havendo como consequência doenças graves como o câncer. Assim, o desenvolvimento de tecnologias confiáveis e acessíveis que possibilitem o monitoramento de biomarcadores indicadores de anomalias genéticas pode auxiliar no diagnóstico precoce, aumentando significativamente as chances de recuperação. Por esse motivo, foram construídos dois imunossensores eletroquímicos baseados em espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) para detecção e quantificação dos biomarcadores de espécies de DNA metilado e facilitador de transporte de glicose 4 (GLUT-4). Os materiais nanocompósitos desenvolvidos foram obtidos por técnica de eletropolimerização em etapa única, tendo como base os monômeros de Bismark Brown Y (BBY) e Tionina (TH). Os filmes formados foram caracterizados por microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (MEV-FEG), revelando nanoestruturas de ouro recobertas pelos polímeros condutores redox. Para imobilização dos anticorpos sobre a superfície dos nanocompósitos foi utilizada a estratégia de adsorção física para o poli(TH)-AuNPs e por ligação covalente para o poli(azo- BBY)-AuNPs. No melhor de nossos esforços, foi verificado que o mecanismo de detecção proposto na presente tese é inédito na literatura. Ele foi baseado na utilização do oxigênio dissolvido como mediador redox, não sendo preciso etapas extras para a marcação ou adição de mediadores redox na solução de análise. Por fim, verificou-se o desempenho analítico dos imunossensores, onde o imunossensor de poli(azo-BBY)-AuNPs apresentou limites de detecção de 0,64 pg mL-1 para espécies de DNA metilado enquanto o imunossensor de poli(TH)-AuNPs apresentou limite de detecção de 38,0 pg mL-1. Ambos os valores são satisfatórios para aplicação na análise de amostras de interesses clínico e acadêmico. Palavras–chave: Sensor de DNA Metilado. Sensor de GLUT-4. Imunossensor eletroquímico. Nanopartícula de ouro-polímero. Espectroscopia de Impedância Eletroquímica. ABSTRACT The present thesis the studies and efforts dedicated to the development of electrochemical immunosensors based on gold nanoparticles coated with redox conducting polymers for the detection of biomarkers of medical interest. Genetic and epigenetic modifications are naturally occurring phenomena, being the main responsible for the diversity among organisms. However, environmental factors can influence mutation rates resulting in serious diseases such as cancer. Thus, the development of reliable and accessible technologies that allow the monitoring of biomarkers showing genetic anomalies can help in early diagnosis, significantly increasing the chances of recovery. For this reason, two electrochemical immunosensors were constructed based on electrochemical impedance spectroscopy (EIS) for the detection and quantification of biomarkers of methylated DNA species and glucose transport facilitator 4 (GLUT-4). The nanocomposite materials developed were obtained by single-step electropolymerization technique, based on Bismarck Brown Y (BBY) and Thionine (TH) monomers. The formed films were characterized by field emission gun scanning electron microscopy (FEG-SEM), revealing gold particles covered by redox conducting polymers. For the immobilization of antibodies on the surface of the nanocomposites, the strategy of physical adsorption was used for poly(TH)-AuNPs and by covalent bonding for poly(azo-BBY)-AuNPs. In the best of our efforts, was verified that the detection mechanism proposed in the present thesis is unprecedented in the literature. It was based on the use of dissolved oxygen as a redox mediator, requiring no extra steps to label or add redox mediators to the analysis solution. Finally, the analytical performance of the immunosensors was verified, where the poly(azo-BBY)-AuNPs immunosensor presented detection limits of 0.64 pg mL-1 for methylated DNA species while the poly(TH)- AuNPs had a detection limit of 38.0 pg mL-1. Both values are satisfactory for application in the analysis of samples for clinical and academic interests. Keywords: DNA methylation sensor. Glut-4 sensor. Electrochemical immunosensor. Gold nanoparticle-polymers. Electrochemical impedance spectroscopy. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1-Imagem ilustrativa da localização e estrutura do DNA em uma célula eucarionte. A mutação genética ocorre por alteração na sequência do código genético. ............................ 24 Figura 2-Representação esquemática para mutação genética e mutação epigenética. O exemplo apresentado foi baseado na reação epigenética de metilação da citosina mediado pela enzima metiltransferase (DNAMT). .................................................................................. 26 Figura 3-A) Representação esquemática para reação de metilação da citosina mediada pela DNA metiltransferesa e B) representação dos níveis de metilação global e sua associação com tumorgênesis. ........................................................................................................................... 28 Figura 4-Diagrama esquemático para a expressão dos facilitadores de transporte de glicose em células saudáveis (A) e células cancerosas (B). .................................................................. 31 Figura 5-Representação esquemática para a forma clássica de ensaios imunométricos. ...... 32 Figura 6-Representação esquemática para as formas de imunoensaio direto (A e B) e imunoensaio competitivo (C). .................................................................................................. 34 Figura 7-A) Estrutura 3D de uma molécula de anticorpo. B) Representação esquemática de um anticorpo destacando suas regiões. ......................................................................................... 36 Figura 8-Ilustração esquemática para as formas de imobilização e as possíveis orientações dos anticorpos sobre substrato....................................................................................................... 38 Figura 9-Representação esquemática para o mecanismo de resposta de um imunosensor eletroquímico label-free baseado em espectroscopia de impedância eletroquímica............. 40 Figura 10-Representação esquemática do sinal de perturbação de uma interface eletroquímica (A) e das representações gráficas de Nyquist e BODE para o sinal de resposta (B). ............................................................................................................................................. 41 Figura 11-A) Estrutura química do poliacetileno para exemplificação da cadeia polimérica com ligações π-conjugadas. B) Representação esquemática dos orbitais moleculares antes e após oxidação (a) ou redução (b) da cadeia polimérico. Os estados polarônicos foram exemplificados a partir da estrutura do politiofeno. ............................................................... 46 Figura 12 – Estrutura molecular do azo corante Bismark Brown Y. ......................................... 48 Figura 13-A) Mecanismo redox do grupo azo por reação química (A) e eletroquimica (B). C) Imagem esquemática do comportamento de interruptor molecular apresentado pelo filme de poli(azo-BBY). ............................................................................................................................ 49 Figura 14-Estrutura molecular do corante tionina. .................................................................. 50 Figura 15-A) Representação esquemática das características e dimensões da célula eletroquímica para as imunorreações. B) Imagens dos eletrodos antes (i) e após (ii) a modificação com o filme nanocompósito. ............................................................................... 58 Figura 16-A) Representação esquemática do eletrodo impresso utilizado para fabricação do imunossensor de GLUT-4. B) Imagem do eletrodo modificado com filme de poli(TH)-AuNPs. .................................................................................................................................................. 59 Figura 17-Imagens dos eletrodos de FTO após eletropolimerização e eletrodeposição. A) Filme de poli(azo-BBY), B) filme de poli(azo-BBY)-AuNPs e C) eletrodo modificado com AuNP. ...... 60 Figura 18-Imagens dos eletrodos de FTO após eletropolimerização e eletrodeposição. A) Filme de poli(TH), B) filme de poli(TH)-AuNPs e C) eletrodo modificado com AuNPs. ..................... 61 Figura 19-Ilustração das etapas de construção do imunosensor. Os números abaixo estão representando as etapas de modificação. ............................................................................... 63 Figura 20-Representação esquemática do preparo do imunossensor para GLUT-4. Os números abaixo estão representando as etapas de modificação. .......................................................... 64 Figura 21-Voltamogramas ciclicos para a eletropolimerização dos filmes de poli(azo-BBY)- AuNPs (A), poli(azo-BBY) (B) e eletrodeposição de nanopartículas de ouro (C) aplicado 20 ciclos de potenciais com velocidade de varredura de 10 mV s-1 em HCl 0,10 mol L-1. T=25° e atmosfera de N2. ........................................................................................................................................ 68 Figura 22-Mecanismo de formação do filme de poli(azo-BBY). ............................................... 72 Figura 23-Ilustração para a formação do filme nanocompósito de poli(azo-BBY)-AuNPs sobre a superfície do eletrodo de FTO. .............................................................................................. 73 Figura 24-Difratograma de raios X dos eletrodos de FTO, poli(azo-BBBY)@AuNP/FTO e poli(azo-BBY)/FTO. .................................................................................................................... 74 Figura 25-Imagens obtidas por técnica de microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (MEV-FEG) sobre os eletrodos de poli(azo-BBY)-AuNPs/FTO (A) e AuNP/FTO (B). 75 Figura 26-Histograma com os valores de diâmetro médio das nanopartículas no filme de poli(azo-BBY)@AuNP. ............................................................................................................... 76 Figura 27-Voltamogramas ciclicos para a resposta eletroquímica dos filmes de poli(azo- BBY)@AuNP (A), poli(azo-BBY) (B) e AuNP (C) em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) com velocidade de varredura de 25 mV s-1. T=25° e atmosfera de N2............................................ 78 Figura 28- Voltamograma cíclico para resposta eletroquímica do filme de poli(azo-BBY)-AuNPs (A) e poli(azo-BBY) (B) em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) saturado somente com o gás N2 (linha preta) e somente com o gás O2 (linha vermelha) com velocidade de varredura de 25 mV s-1. C) Voltamograma comparativo para resposta em oxigênio dissolvido. D) Magnificação para região de reação de redução de oxigênio destacando os valores de potencial de onset. .................................................................................................................................................. 80 Figura 29-A) Espectros de Nyquist para os filmes de poli(azo-BBY)-AuNPs e poli(azo-BBY) em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) saturado com gás O2. Potencial aplicado de -0,30 V (vs. ECS). B) Magnificação do espectro para a região de alta frequência. O Fit linear é referente ao ajuste matemático do modelo de circuito equivalente da Figura 32. ..................................... 81 Figura 30-Espectro de BODE para os filmes de poli(azo-BBY)-AuNPs e poli(azo-BBY) em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) saturado com gás O2. Potencial aplicado de -0,30 V (vs. ECS). 82 Figura 31- Espectro de BODE para os filmes de poli(azo-BBY)-AuNPs e poli(azo-BBY) em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) saturado com gás O2. Potencial aplicado de -0,30 V (vs. ECS). .......................................................................................................................................... 83 Figura 32-Modelo de circuito equivalente proposto para o filme de poli(azo-BBY)-AuNPs e também utilizado para filme de poli(azo-BBY). ........................................................................ 84 Figura 33-Espectros obidos para a ativação do filme de poli(azo-BBY)-AuNPs antes (• preta) e após 5 minutos de incubação com glutaraldeído (• azul). A) Espectro de Nyquist, B) espectro de capacitância complexa e C) gráfico de capacitância versus impedância real. .................... 89 Figura 34-Espectros obidos para a modificação da superfície do filme de poli(azo-BBY)@AuNP- GA antes (• azul) e após (• verde) 30 minutos de incubação com anticorpo Ab-5-mC. A) Espectro de Nyquist, B) espectro de capacitância complexa e C) gráfico de capacitância versus impedância real. ....................................................................................................................... 91 Figura 35-Espectros obidos para a modificação do filme de poli(azo-BBY)-AuNPs-GA-Ab antes (• verde) e após 30 minutos de incubação com a proteína BSA (• vermelha). A) Espectro de Nyquist, B) espectro de capacitância complexa (ampliada) e C) gráfico de capacitância versus impedância imaginária. ............................................................................................................ 94 Figura 36-Espectro de Nyquist para o imunosensor de poli(azo-BBY)-AuNPs-GA-Ab-BSA em solução aquosa de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) saturada com os gases N2, O2 e ar atmosférico. Potencial aplicado de -0,30 V (vs. ECS). .................................................................................... 95 Figura 37-Variação relativa dos valores de Rredox em função do tempo de incubação do filme de poli(azo-BBY)-AuNPs com glutaraldeído. A barra de erro é relativa ao desvio padrão para a resposta de três diferentes eletrodos. ..................................................................................... 96 Figura 38- Variação relativa dos valores de Rredox em função do tempo de incubação do filme de poli(azo-BBY)-AuNPs-GA com o anticorpo Ab-5-mC. A barra de erro é relativa ao desvio padrão para a resposta de três diferentes eletrodos. .............................................................. 97 Figura 39- Variação relativa dos valores de Rredox em função do tempo de incubação do filme de poli(azo-BBY)-AuNPs-GA-Ab com a proteína BSA. A barra de erro é relativa ao desvio padrão para a resposta de três diferentes eletrodos. .......................................................................... 98 Figura 40-Variação relativa dos valores de Rredox em função do tempo de incubação do filme de poli(azo-BBY)-AuNPs-GA-Ab-BSA frente ao padrão de 5-metilcitosina. A barra de erro é relativa ao desvio padrão para a resposta de três diferentes eletrodos. ................................ 99 Figura 41-A) Espectros de Nyquist (A) e suas respectivas curvas analíticas (B e C) para a resposta do imunosensor frente a diferentes concentrações de 5-mC em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) em O2 saturado em equilíbrio atmosférico. A barra de erro representa o desvio padrão para o mesmo eletrodo em três diferentes experimentos. ........................... 101 Figura 42-Relação Linear de [5-mC]xCr versus [5-mC]. Forma de isoterma de Langmuir usada para o complexo 5-mC/Ab-5mC. ............................................................................................ 103 Figura 43-A) Espectros de Nyquist para calibração do imunossensor de DNA metilado realizada em solução de PBS 0,05 mol L-1 com potencial aplicado de -0,30 V. Os espectros na cor preta representam as adições de padrão de 5-mC e na cor vermelha o espectro obtido para a amostra real. B) Curva de calibração e quantificação da amostra. ........................................ 104 Figura 44-Voltamograma ciclico para a eletropolimerização do filme de poli(TH) pela aplicação de 30 ciclos de potenciais com velocidade de varredura de 20 mV s-1 em solução de HCl 0,10 mol L-1 com 10 mmol L-1 do monômero tionina. T=25° e atmosfera de N2. .......................... 105 Figura 45-Resposta eletroquímica do filme de poli(TH) em solução de KCl 0,50 mol L-1 em atmosfera de N2. A) Espectros de Nyquist para os potenciais aplicados de -0,40 V to +0,65 V vs. ECS (de i a viii). B) Voltametria cíclica registrada em velocidade de varredura de 25 mV s-1. As formas reduzida e oxidada do polímero estão sendo representadas no gráfico de voltametria cíclica. .................................................................................................................. 108 Figura 46-Modelo de circuito equivalente para ajustes matemáticos sobre espectros obtidos para o filme de poli(TH). ......................................................................................................... 109 Figura 47-Valores de Rct em função do potencial aplicado. Os valores de resistência foram obtidos a partir do ajuste matemático feito sobre modelo de circuito equivalente da Figura 46. ........................................................................................................................................... 110 Figura 48-Valores de W em função do potencial aplicado. Os valores do elemento de Warburg foram obtidos a partir do ajuste matemático feito sobre modelo de circuito equivalente da Figura 46. ................................................................................................................................ 111 Figura 49-Valores de CPEfilme em função do potencial aplicado. Os valores de capacitância foram obtidos a partir do ajuste matemático feito sobre modelo de circuito equivalente da Figura 46. ................................................................................................................................ 112 Figura 50-Voltamogramas cíclicos para a eletropolimerização dos filmes de poli(TH) em solução de 10 mmol L-1 de tionina em 0,10 mol L-1 de HCl. Foram aplicados 10 ciclos de potenciais e velocidade de varredura de 20 mV s-1 com intervalo de potencial de: (A) -0,30 a +0,80 V; (B) -0,30 a +1,0 V; (C) -0,30 a +1,4 V; e (D) -0,30 a +1,60 V (vs. ECS). Atmosfera de N2 e T = 25°C. ............................................................................................................................... 114 Figura 51- Valores de Rredox obtidos através de ajuste matemático utilizando modelo de circuito equivalente para os espectros dos filmes de poli(TH) construídos com diferentes intervalos de potenciais.......................................................................................................... 115 Figura 52 - Valores de resistência de transferência de carga (Rredox) em função do número de ciclos aplicado durante a etapa de eletropolimerização obtidos através de ajuste matemático utilizando modelo de circuito equivalente. ............................................................................ 116 Figura 53 - Valores de resistência de transferência de carga (Rredpx) em função da velocidade de varredura aplicada durante a etapa de eletropolimerização obtidos através de ajuste matemático utilizando modelo de circuito equivalente dos filmes de poli(TH). ................... 118 Figura 54-Voltamogramas cíclicos para eletropolimerização dos filmes de poli(TH) com 30 ciclos de potenciais aplicados a uma velocidade de varredura de 20 mV s-1 em 1,0 mmol L-1 do monômero de tionina em 0,10 mol L-1 de HCl (A), HNO3 (B), H2PO4 (C) e H3PO4 (D) sob atmosfera de N2 a 25°C. ......................................................................................................... 119 Figura 55-Espectro de Nyquist para filmes construídos com diferentes eletrólitos de suporte. Potencial aplicado de +0,20 V vs. ECS em KCl 0,50 mol L-1 (pH = 2,0). N2 atm e 25°C. .......... 121 Figura 56-Valores de parâmetros interfaciais versus raio hidratado do ânion utilizados durante a etapa de eletropolimerização. A) Resistência da interface polímero/FTO (Rp), B) capacitância de dupla camada (CPEdc), C) resistência de transferência de carga da interface polímero/solução (Rredox), D) capacitância de filme (CPEfilme) e E) difusão de íons (W) . F) Área de superfície ativa calculada. ................................................................................................. 122 Figura 57-Gráfico de Mott-Schottky dos filmes de poli(TH) em frequência fixa aplicada de 10 kHz. ......................................................................................................................................... 124 Figura 58-Voltamogramas ciclicos para a eletropolimerização dos filmes de poli(azo- BBY)@AuNP (A), poli(azo-BBY) (B) e eletrodeposição de nanopartículas de ouro (C) aplicado 30 ciclos de potenciais com velocidade de varredura de 20 mV s-1. T=25° e atmosfera de N2. ................................................................................................................................................ 126 Figura 59-Voltamogramas cíclico para os eletrodos modificados de poli(TH), poli(TH)-AuNPS e AuNPs em solução de KCl 0,50 mol L-1 aplicando-se velocidade de varredura de 25 mV S-1. Atmosfera de N2. .................................................................................................................... 127 Figura 60-Espectros de Nyquist para os filmes de poli(TH) e poli(TH)-AuNPs em solução de KCl 0,50 mol L-1 com potencial aplicado de +0,20 V (vs. ECS). 25°C e atmosfera de N2. ............. 128 Figura 61-Espectros de Nyquist para os filmes de poli(TH) e poli(TH)-AuNPs em solução de KCl 0,50 mol L-1 saturada com o gás O2 aplicando-se potencial de -0,30 V (vs. ECS). 25°C e atmosfera de N2. ..................................................................................................................... 130 Figura 62-Imagens obtidas através de MEV-FEG para os eletrodos de FTO modificados com o filme de poli(TH) (A), AuNPs (B) e poli(TH)-AuNPs (C). .......................................................... 133 Figura 63-Histograma para os valores de tamanho médio das nanopartículas presentes na Figura 62C. .............................................................................................................................. 134 Figura 64-Voltamograma cíclico referente a eletropolimerização do filme de poli(TH)-AuNPs sobre eletrodo impresso (SPE) com eletrodo de trabalho de platina. 25°C e atmosfera de N2. ................................................................................................................................................ 135 Figura 65-Espectro de Nyquist (A) e BODE (B) obtidos pela resposta do eletrodo de platina antes e após a modificação com o filme nanocompósito de poli(TH)-AuNPs. Solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,4) em atmosfera de N2 e potencial aplicado de -0,30 V vs. ECS. .............. 136 Figura 66-Espectros obidos para a modificação do filme de poli(TH)-AuNPs antes e após incubação com o anticorpo de GLUT-4. A) Espectro de Nyquist, B) espectro de capacitância complexa e C) gráfico de capacitância versus impedância imaginária. ................................. 138 Figura 67-A) Espectros de Nyquist (A) e a respectiva curva analítica (B) para a resposta do imunossensor frente a diferentes concentrações de GLUT-4 em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) em diferentes concentrações contendo O2 saturado em equilíbrio atmosférico. A barra de erro representa o desvio padrão para o mesmo eletrodo em três diferentes experimentos. ......................................................................................................................... 140 Figura 68-A) Espectros de capacitância complexa (A) e sua respectiva curva analítica (B) para a resposta do imunossensor frente a diferentes concentrações de GLUT-4 em solução de PBS 0,05 mol L-1 (pH 7,40) contendo O2 saturado em equilíbrio atmosférico. A barra de erro representa o desvio padrão para o mesmo eletrodo em três diferentes experimentos. ..... 141 Figura 69-Relação Linear de [GLUT-4]xCr versus [GLUT-4]. Forma de isoterma de Langmuir usada para o complexo GLUT-4/Ab-GLUT-4. ......................................................................... 142 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Especificações dos reagentes utilizados no desenvolvimento do projeto. ............. 55 Tabela 2-Valores de potenciais de pico para o primeiro e último ciclo de potencial aplicado obtidos durante a eletropolimerização e eletrodeposição dos filmes sobre o eletrodo de FTO. .................................................................................................................................................. 69 Tabela 3-Parametros impedimétricos determinados a partir de ajustes matemáticos sobre modelo de circuito equivalente apresentado na Figura 32. Os erros foram inferiores a 4%. . 85 Tabela 4-Parametros impedimétricos determinados por meio do ajuste matemático sobre modelo de circuito equivalente para os espectros anterior e após ativação da superfície do eletrodo de poli(azo-BBY)-AuNPs com a molécula de glutaraldeído. Os erros apresentados foram inferiores a 4%. .............................................................................................................. 89 Tabela 5-Parametros impedimétricos determinados por meio do ajuste matemático sobre modelo de circuito equivalente para os espectros anterior e após imobilização do anticorpo Ab-5-mC sobre superfície do eletrodo de poli(azo-BBY)-AuNPs-GA. Os erros apresentados foram inferiores a 4%. .............................................................................................................. 90 Tabela 6-Parametros impedimétricos determinados por meio do ajuste matemático sobre modelo de circuito equivalente para os espectros anterior e após desativação dos sítios ativos remanescentes presentes na superfície do eletrodo de poli(azo-BBY)-AuNP-GA-Ab com a molécula de BSA. Os erros apresentados foram inferiores a 4%. ............................................ 93 Tabela 7-Valores comparativos do tempo médio necessário para cada execução de cada etapa para determinação de concentração de DNA metilado entre o sensor e o kit comercial. .... 100 Tabela 8-Valores de limite de detecção para sensores eletroquímicos de DNA metilado. .. 102 Tabela 9-Parametros impedimétricos determinados a partir de ajustes matemáticos sobre modelo de circuito equivalente. Os erros foram inferiores a 4%. ......................................... 129 Tabela 10-Parametros impedimétricos determinados a partir de ajustes matemáticos sobre modelo de circuito equivalente. Os erros foram inferiores a 4%. ......................................... 131 Tabela 11-Parametros impedimétricos determinados a partir de ajustes matemáticos sobre modelo de circuito equivalente para os espectros antes e após modificação com o anticorpo Ab-GLUT-4. Os erros foram inferiores a 4%. .......................................................................... 137 SUMÁRIO Capítulo 1 ........................................................................................................................ 23 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 24 1.1. MUTAÇÕES GENÉTICAS E EPIGENÉTICA ................................................................. 24 1.2. MARCADORES BIOLÓGICOS: BIOMARCADORES .................................................... 26 1.2.1. Espécies de dna metilado como biomarcador para diagnóstico de câncer .......... 27 1.2.2. Transportador de glicose 4 como biomarcador para tecidos tumorais ............... 30 1.3. IMUNOENSAIOS ................................................................................................... 32 1.3.1. Aspectos analíticos ........................................................................................... 34 1.4. IMUNOENSAIO ELETROQUÍMICO .......................................................................... 38 1.4.1. Utilização de espectroscopia de impedância eletroquímica para imunosensoriamento ...................................................................................................... 40 1.5. MATERIAIS NANOCOMPÓSITO BASEADOS EM POLÍMEROS CONDUTORES ............ 42 1.6. NANOPARTÍCULAS DE OURO ................................................................................ 43 1.7.1. Polímero condutor redox baseado no monômero bismarck brown y: um azo- polímero condutor .......................................................................................................... 47 CAPÍTULO 2 ..................................................................................................................... 52 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 52 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 53 2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................. 53 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 53 CAPÍTULO 3 ..................................................................................................................... 54 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................... 54 3. MATERIAIS E MÉTODO ............................................................................................. 55 3.1. REAGENTES ............................................................................................................... 55 3.2. SOLUÇÕES ............................................................................................................ 55 3.2.1. Soluções para eletropolimerização do filme de poli(azo-bby)-aunps .................. 55 3.2.3. Solução tampão fosfato (pbs) ........................................................................... 57 3.3. CARACTERIZAÇÃO POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA .................... 57 3.4. CARACTERIZAÇÃO POR DIFRAÇÃO DE RAIOS X ...................................................... 57 3.5. MEDIDAS ELETROQUÍMICAS ................................................................................. 57 3.5.1. Equipamentos .................................................................................................. 57 3.5.2. Células eletroquímicas ...................................................................................... 57 3.5.2.1. Eletropolimerização e medidas de investigação do desempenho eletroquímico57 3.5.2.2. Análises imunoeletroquímicas para espécie de dna metilado ............................. 58 3.5.2.3. Análise imunoeletroquímica para espécie de glut-4 ............................................ 59 3.5.5. Síntese do imunossensor de espécie de dna metilado basado no filme de poli(azo- bby)-aunps ...................................................................................................................... 63 3.5.6. Síntese do imunossensor para glut-4 baseado no filme de poli(th)-aunps .......... 64 3.5.7. Curva analítica para padrão de dna metilado .................................................... 64 3.5.8. Curva analítica para imunossensor de glut-4 ..................................................... 65 3.5.9. Análise de dna metilado em amostra real ......................................................... 65 CAPÍTULO 4 ..................................................................................................................... 66 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................................. 66 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 67 4.1. DESENVOLVIMENTO DO IMUNOSSENSOR ELETROQUÍMICO PARA ESPÉCIE DE DNA METILADO BASEADO NO FILME NANOCOMPÓSITO DE BISMARCK BROWN Y COM NANOPARTÍCULAS DE OURO ........................................................................................... 67 4.1.1. Construção do nanocompósito de azo-polímero condutor redox com nanopartículas de ouro encapsuladas .............................................................................. 67 4.1.1.1. Eletropolimerização ....................................................................................... 67 4.1.1.2. Mecanismo de formação do filme de poli(azo-bby)-aunps e arquitetura formada 71 4.1.2. Caracterização por difração de raios x ............................................................... 73 4.1.3. Caracterização morfológica ............................................................................... 74 4.1.4. Caracterização eletroquímica do filme de poli(azo-bby)-aunps .......................... 76 4.1.4.2. Resposta frente ao oxigênio dissolvido ................................................................ 79 4.1.4.3. Investigação por espectroscopia de impedância eletroquímica .......................... 80 4.1.4.4. Análise por ajustes matemáticos sobre modelos de circuito equivalente .......... 83 4.1.5. Preparação do imunosensor ............................................................................. 86 4.1.5.1. Ativação da superfície .......................................................................................... 87 4.1.5.2. Imobilização do anticorpo 5-metil citosina .......................................................... 90 4.1.5.3. Bloqueio dos sítios remanescentes ativos com bsa ............................................. 92 4.1.5.6. Afinidade de ligação antigeno-anticorpo ........................................................... 102 4.1.6. Análise em amostra real ................................................................................. 103 4.2. DESENVOLVIMENTO DE IMUNOSSENSOR PARA GLUT-4 BASEADO EM FILME POLIMÉRICO REDOX DE POLI(TH) COM NANOPARTÍCULAS DE OURO ............................. 105 4.2.1. Desenvolvimento do filme de poli(th) ............................................................. 105 4.2.1.1. Eletropolimerização ..................................................................................... 105 4.2.2. Comportamento eletroquímico....................................................................... 107 4.2.2.1. Voltametria ciclica ....................................................................................... 107 4.2.3. Otimização dos parametros para eletropolimerização da poli(th) .................... 113 4.2.3.1. Variação do intervalo de potencial aplicado ...................................................... 113 4.2.3.2. Influência do número de ciclos aplicado ............................................................ 115 4.2.3.3. Estudo da velocidade de varredura aplicada ..................................................... 117 4.2.3.4. Influência do eletrólito de suporte durante a etapa de eletropolimerização ... 118 4.2.3.5. Avaliação do comportamento semicondutor dos filmes eletropolimerizados: análise por mott-schottky ...................................................................................................... 123 4.2.4. Construção do filme nanocompósito ............................................................... 125 4.2.4.1. Resposta frente ao oxigênio dissolvido ......................................................... 129 4.2.5. Caracterização morfológica ............................................................................. 132 4.2.6. Eletropolimerização sobre eletrodo impresso ................................................. 134 4.2.7. Construção e avaliação eletroquímica do immunosensor ................................ 137 4.2.8. Curva analítica ................................................................................................ 139 5. CONCLUSÃO........................................................................................................... 143 5.1. CONCLUSÕES IMUNOSSENSOR PARA DNA METILADO ............................................. 143 5.2. CONCLUSÕES IMUNOSSENSOR PARA GLUT-4 ...................................................... 144 6. ALGUMAS PERSPECTIVAS DE TRABALHOS FUTUROS ............................................... 145 REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 146 23 Capítulo 1 Introdução 24 1. Introdução 1.1. Mutações Genéticas e Epigenética O ácido desoxirribonucleico (DNA) é um composto orgânico com a função de fornecer o código genético dos seres vivos (SINDEN; WELLS, 1992; PEARSON; EDAMURA; CLEARY, 2005; LOEWE; HILL, 2010). Em células eucariontes, o DNA fica confinado no núcleo celular na forma de cromossomos. Os cromossomos são conjuntos de nucleossomas onde as fitas de DNA se encontram organizadas (Figura 1). Figura 1-Imagem ilustrativa da localização e estrutura do DNA em uma célula eucarionte. A mutação genética ocorre por alteração na sequência do código genético. Fonte: Autoria própria. As mutações no DNA, ou mutações genéticas, são definidas como alterações na sequência do código genético presentes no DNA (SINDEN; WELLS, 1992; PEARSON; EDAMURA; CLEARY, 2005; LOEWE; HILL, 2010). Essas mutações podem ocorrer em diferentes níveis, podendo ser classificadas de acordo com o modo de alteração do código, tal como mutação pontual, por exclusão, por inserção e por translocação, e apresentar diferentes formas de consequências (LOEWE; HILL, 2010). Um famoso exemplo da consequência de uma mutação genética é o caso da Anemia Falciforme, sendo resultado de uma alteração no gene responsável pela formação da hemoglobina (TAYLOR 6TH et al., 2008; JARRETT et al., 2016). A expressão genética responsável pela formação da beta hemoglobina possui 147 aminoácidos. A simples substituição de um único aminoácido (mutação pontual) tem como consequência a formação 25 da proteína da hemoglobina na forma falciforme. Como consequência, há uma diminuição na eficiência da oxigenação de tecidos devido a alteração da estrutura tridimensional da hemoglobina. Contudo, é importante destacar que nem toda mutação genética pode resultar em consequências diretas e/ou de grandes magnitudes. De fato, algumas mantem-se silenciadas no indivíduo. Qualquer célula pode ter seu material genético alterado. A alteração pode ocorrer por influência de fatores externos como, exposição química ou radiações eletromagnéticas ionizantes (por exemplo, radiação ultravioleta e de raio X), ou mesmo por fatores naturais decorrentes de erros durante a replicação (MATSUMURA; ANANTHASWAMY, 2004; HUNTER, 2005; FEIL, 2006; SKINNER; GUERRERO-BOSAGNA; HAQUE, 2015). Caso essa mutação ocorra em uma célula germinativa (óvulos ou espermas) ela poderá ser transmitida para seus descendentes, estando presente em cada célula do desenvolvimento embrionário. Por sua vez, se a mutação ocorrer em qualquer outra linhagem de célula, essa mutação não será transmitida para seus descendentes, sendo classificada como mutação somática. Enquanto a genética dedica-se ao estudo das mutações supracitadas, a epigenética direciona esforços para compreender como as células regulam a atividade genética sem necessidade de alterar a sequência do DNA (Figura 2) (A.; DAIYA, 2001; LARSSON; CASTILHO; GIANNOBILE, 2015; PARK et al., 2019; UNNIKRISHNAN et al., 2019). Essa regulação se dá pelo “ligamento” ou “desligamento” dos genes pela adição de grupos funcionais a nucleotídeos específicos, que irão influenciar na produção de proteínas em células. Essa regulação ajuda a garantir que as células irão produzir apenas aquelas proteínas que são necessárias para sua função. Garantindo assim, por exemplo, que proteínas responsáveis pelo crescimento dos ossos não sejam promovidas em células musculares. Assim como mutações genéticas, reações epigenéticas podem ser afetadas por fatores ambientais (SUTHERLAND; COSTA, 2003; FEIL; FRAGA, 2012). Dieta pessoal e exposição a poluentes são apenas dois exemplos de uma série de fatores que podem influenciar na regulação epigenéticas de um indivíduo. E assim como ocorre com as mutações genéticas, as mutações epigenéticas também podem ser transmitidas para gerações (LILLYCROP; BURDGE, 2015; SCHAGDARSURENGIN; STEGER, 2016). Dessa forma, o monitoramento e entendimento de modificações epigenéticas são de grande importância para avanços nas áreas médicas, seja através de diagnósticos ou por meio de estudos para o entendimento e desenvolvimento de tratamentos, contribuindo 26 com incremento em saúde e bem estar populacional (JONES; BAYLIN, 2002; WEI; LILLEHOJ; HO, 2010; CAMPUZANO et al., 2019). Figura 2-Representação esquemática para mutação genética e mutação epigenética. O exemplo apresentado foi baseado na reação epigenética de metilação da citosina mediado pela enzima metiltransferase (DNAMT). Fonte: Autoria própria. 1.2. Marcadores Biológicos: Biomarcadores Biomarcadores são por definição substâncias indicadoras de estados fisiológicos, estando em estado normal, patológico ou sob resposta farmacológica (GILLESPIE; LADAME; O’HARE, 2019; SHAO; XIAO, 2020). Por meio do monitoramento dos biomarcadores, diagnósticos acurados e conhecimentos dos mecanismos de doenças podem ser conhecidos, possibilitando aplicação de tratamentos específicos e personalizados, elevando as chances de cura (STRIMBU; TAVEL, 2010; GILLESPIE; LADAME; O’HARE, 2019; ZAIDI; SHAHZAD; BATOOL, 2020; KARIMI-MALEH et al., 2021). Os primeiros marcadores biológicos utilizados para monitoramento de enfermidades datam de séculos atrás e tinham como base fatores físicos, como ritmo cardíaco e 27 temperatura relativa do corpo (FERGUSON; VAIDYA, 2010; STRIMBU; TAVEL, 2010). No último século, avanços tecnológicos permitiram análises quantitativas de algumas moléculas em fluidos (como urina e sangue), representando um grande avanço na área médica. E, nas últimas décadas, experimentamos avanços ainda mais expressivos, onde a capacidade das análises passaram de algumas dezenas de moléculas para milhares delas. Como resultado, algumas doenças podem ser completamente mapeadas através de diversas moléculas específicas, permitindo diagnósticos cada vez mais exatos. Especialmente, no caso de doenças como câncer, biomarcadores são úteis para detecção em estágios iniciais da doença, sendo esse um fator crucial para aumento das chances de sucesso de cura (FERGUSON; VAIDYA, 2010; ROY et al., 2010). Além da diminuição do tempo de diagnóstico, biomarcadores auxiliam em sua categorização, nível de severidade e avaliação da resistência ao tratamento por quimioterapia. Todos esses pontos são importantes para tomadas de decisões a nível de intervenções que sejam mais adequadas, diminuir a exposição do paciente a procedimentos desnecessários e podendo aumentar as suas chances de sobrevivência. 1.2.1. Espécies de DNA Metilado como Biomarcador para Diagnóstico de Câncer A metilação do DNA, uma das mais importantes reações epigenéticas, ocorre pela adição de um grupo metila (-CH3) ao carbono 5 da base citosina do DNA (5-mC) (Figura 3), catalisada pela enzima DNA metiltransferase (DNAMT) (WU; ZHANG; GUO, 2013; ZHU et al., 2015). Tais processos de metilação do DNA tem ocorrência natural no organismo humano e desempenha papel crucial na regulação genética, afetando diretamente a impressão genômica (KREJCOVA et al., 2017). Valores anormais nos níveis globais de metilação do DNA, classificados como hipermetilação e hipometilação, podem aumentar, diminuir ou mesmo inativar a atividade genética, podendo desencadear doenças graves como Alzheimer, esquizofrenia e doenças vasculares, bem como diversas classes de tumores cancerígenos, como o câncer que acomete o pulmão, mama, ovário, cólon e sarcomas (HOSSAIN et al., 2017; KREJCOVA et al., 2017; MONTERO-CALLE et al., 2019). Assim, alterações nos níveis globais de 5-mC foram sugeridos como biomarcadores para diagnósticos e prognósticos de tecidos cancerosos (MONTERO-CALLE et al., 2019). Essa importante correlação entre os níveis de metilação do DNA e diagnóstico de doenças 28 demonstrou a necessidade de desenvolvimento de sensores e biosensores, tanto para fins de pesquisa quanto para fins clínicos, que permitam a detecção, quantificação e monitoramento de genes metilados (POVEDANO et al., 2018b, 2018a). Figura 3-A) Representação esquemática para reação de metilação da citosina mediada pela DNA metiltransferesa e B) representação dos níveis de metilação global e sua associação com tumorgênesis. Fonte: Adaptado de (KREJCOVA et al., 2017). Na década de 90, os primeiros métodos para o sensoriamento de espécies de DNA metilado foram reportados (TALEAT et al., 2015; HOSSAIN et al., 2017). Dentre eles, aqueles utilizando tratamento da amostra com bissulfito, como por exemplo o método Frommer, apresentaram certo destaque. O método Frommer consiste em aplicar um tratamento de bissulfito na amostra com a intenção de converter as citosinas não metiladas em uracila (HOSSAIN et al., 2017). Em seguida, a amostra é amplificada através de PCR (do inglês polymerase chain reaction) e primers são aplicados para se ligarem a sítios específicos de citosina-guanina (CpG) de interesse e com isso determinar os níveis de metilação (TALEAT et al., 2015). Esses métodos apresentam vantagens pela relativa simplicidade de equipamentos. Mas, as desvantagens ficam a cargo das múltiplas etapas necessárias para obtenção de quantidades significativas de amostra e análises a fim de se obter um resultado quantitativo (MONTERO-CALLE et al., 2019). Os métodos atualmente desenvolvidos direcionam esforços principalmente no desenvolvimento e aprimoramento de métodos espectroscópicos e eletroquímicos (HOSSAIN 29 et al., 2017; ISLAM et al., 2017). Nesse contexto, os métodos eletroquímicos se destacam em termos de simplicidade em equipamentos, baixo custo, curto tempo de resposta, menor número de etapas de análise, além da possibilidade de miniaturização dos sistemas de análise. Dentre as estratégias eletroquímicas utilizadas para detecção de DNA metilado, os médodos baseados em mecanismos de restrições de endonucleases (REs), tratamento com bissulfito (TB) e reações de imunoafinidade (RIA) apresentam maior destaque (HOSSAIN et al., 2017). As enzimas de restrição endonuclease (REs) promovem quebras em sítios específicos, sendo classificadas como RE sensível a metilação, o qual promove a digestão apenas de DNA metilado e RE resistente a metilação, que promove apenas a clivagem de sequências genéticas não metiladas (CAO; DONG, 2017; XIA; HAO, 2019). Para os sensores baseados no método de restrição endonúclease (REs) a superfície do eletrodo é modificada com sequências genéticas específicas para o DNA metilado a ser reconhecido. Posteriormente, utilizando as enzimas RE, obtém-se a quebra do DNA imobilizado proporcional ao nível de metilação. Nesse método, indicadores redox (por exemplo, solução de [Fe(CN)6]3-/4-, hidroquinona e complexos de rutênio) são utilizados, e a alteração nos sinais eletroquímicos promovidos por eles são utilizados como sinal analítico para quantificar o nível de metilação do DNA (ZHU; TRAVAS- SEJDIC, 2018). O método baseado em bissulfito faz uso do mesmo princípio descrito para os métodos clássicos, durante o primeiro parágrafo, modificando-se a técnica de detecção e transdução. O princípio de operação do sensor baseado em bissulfito também se dá pela imobilização de DNA sobre a superfície de eletrodos com superfícies modificadas ou não modificadas e com o auxílio de indicadores redox acompanha-se os sinais eletroquímicos obtidos correlacionando- os com os níveis de metilação de DNA (HOSSAIN et al., 2017). Ambas as metodologias acima apresentam desvantagens como perda e/ou mudanças irreversíveis nas amostras. Desse modo, o método baseado em imunoafinidade demonstra vantagens por seu mecanismo se basear no reconhecimento específico de espécies de DNA metilados através de anticorpos ou a proteína MDB (do inglês methyl-CpG-binding domain) sem a necessidade de modificações das amostras (MONTERO-CALLE et al., 2019). De fato, em recente trabalho Pingarrón e colaboradores (POVEDANO et al., 2020) clamam pela necessidade de desenvolvimento de estratégias simples e de rápida resposta para o sensoriamento de espécies de DNA metiladas baseando-se em imunoafinidades. Os autores desenvolveram uma plataforma sensorial baseadas em microesferas magnéticas 30 modificadas com proteína estreptavidina e com anticorpo específico marcado com a enzima horseradish peroxidase (HRP). A detecção foi realizada por técnica amperométrica na presença de H2O2 e hidroquinona, servindo de substrato para a HRP para geração do sinal de detecção eletroquímico. Satisfatoriamente, os autores quantificaram espécies de DNA metilado, alcançando limite de detecção na casa de picomol por litro. Apesar dos impressionantes resultados, diferentes etapas (eletro)químicas foram necessárias para aquisição do sinal analítico baseado na reação catalisada pela enzima HRP. Assim, o presente trabalho tem como objetivo simplificar a plataforma imunossensora explorando a resposta específica dos polímeros condutores redox para a molécula de oxigênio dissolvido. 1.2.2. Transportador de Glicose 4 como Biomarcador para Tecidos Tumorais Os transportadores de glicose (do inglês glucose transporter - GLUT) compõem o grupo de proteínas de membrana que realizam o transporte da glicose facilitada através da membrana plasmática para ser metabolizada pela glicólise (THORENS; MUECKLER, 2009; ADEKOLA; ROSEN; SHANMUGAM, 2012; BARRON et al., 2016). Existem 14 diferentes proteínas GLUTs (denominadas de GLUT-1 a GLUT-14) localizadas em diferentes regiões do corpo e com diferentes características. Elas podem ser subdividas em classes (classe I, II e III) a depender de suas características e funções. Por exemplo, o GLUT-1 age principalmente como um sensor para glicose em células humanas do tipo beta, enquanto GLUT-5 é principalmente encontrado em células do intestino facilitando também o transporte de frutose. Já o GLUT-4 é sensível a insulina, e quando recrutado aumenta de 10 a 20 vezes o transporte de glicose através da membrana plasmática (BARRON et al., 2016; NAVALE; PARANJAPE, 2016). Células cancerosas tem sua capacidade de proliferação incontrolável, o que resulta em um aumento expressivo da necessidade de ácidos graxos, aminoácidos e açucares para manutenção de seu metabolismo. De fato, estudos recentes demonstraram uma dependência de metabolismo de glicose para produção de energia das células cancerosas, que pode chegar a 30 vezes o valor necessário para a manutenção de uma célula saudável (AUGUSTIN, 2010; CALVO et al., 2010; BARRON et al., 2016). Para suprir essa necessidade, células cancerosas aumentam a expressão de transportadores de glicose em sua membrana (Figura 4) (AUGUSTIN, 2010; BARRON et al., 2016). Também, algumas células tumorais apresentam padrões de expressão de transportadores anormais comparadas com tecidos saudáveis. 31 Figura 4-Diagrama esquemático para a expressão dos facilitadores de transporte de glicose em células saudáveis (A) e células cancerosas (B). Fonte: Adaptado de (BARRON et al., 2016). Com base nesses dados, diversos estudos têm apontado o uso de transportadores de glicose como biomarcadores para diagnóstico de câncer, bem como para acompanhamento de tratamentos de tumores (BARRON et al., 2016). Em especial, o GLUT-4 pode ser considerado um bom indicador para melanomas de colón, peito, tireoide e pâncreas (BINDER et al., 1997; NOGUCHI et al., 1999; MCBRAYER et al., 2012). Os tecidos citados tipicamente não apresentam sensibilidade a insulina. Assim, a presença desse transportador em um desses tecidos revela um padrão anômalo da expressão de transportadores de glicose, indicando uma necessidade anormal de glicose, podendo ser indicativo da presença de células cancerosas naquele tecido (BARRON et al., 2016). Apesar da importância do tema, são poucos os métodos atualmente aplicados para medir e quantificar proteínas transportadoras de glicose. Os métodos existentes são principalmente baseados em imunofluorescência baseados em ensaios imunoenzimáticos (ELISA), sendo metodologias trabalhosas e muitas vezes de caráter semi-quantitativas (BARRON et al., 2016; NAVALE; PARANJAPE, 2016). No melhor dos nossos esforços, não foram encontradas metodologias alternativas, tão pouco imunossensores eletroquímicos para essa 32 finalidade. Diante disso, seria de considerável interesse o desenvolvimento de métodos alternativos, com menor dispêndio de tempo e de reagentes para medir e quantificar a concentração de GLUT-4. Portanto, a presente tese propõe o desenvolvimento do primeiro imunossensor eletroquímico para detecção e quantificação da proteína de GLUT-4. 1.3. Imunoensaios Imunoensaios, ou ensaios imunológicos, são metodologias que exploram a reação antígeno-anticorpo (Ag-Ab) para detecção de alvo(s) em diferentes matrizes biológicas (WILD; DAVIES, 2013; CHO et al., 2018; VASHIST; LUONG, 2018; HASSANPOUR; HASANZADEH, 2021). Sua alta empregabilidade se dá principalmente por três importantes propriedades apresentadas por anticorpos: i) habilidade de ligação com uma ampla variedade de espécies químicas, seja elas naturais ou sintéticas, biomoléculas, células ou vírus. ii) Excepcional especificidade para os substratos no qual o anticorpo se liga; e iii) a grande força de ligação apresentada pelo conjunto antígeno-anticorpo. Imunoensaios podem ser empregados tanto para a detecção e determinação de antígenos quanto para anticorpos (DAVIES, 2013a). Em sua versão mais simples, também conhecido como design imunométrico (Figura 5), um anticorpo é imobilizado sobre um substrato, comumente uma superfície plástica (tal como em poços em uma placa de análise), de modo que permita a sua reação com o antígeno desejado. Figura 5-Representação esquemática para a forma clássica de ensaios imunométricos. Fonte: Adaptado de (DAVIES, 2013b). 33 A esse anticorpo imobilizado dá-se o nome de anticorpo de captura, por ser específico para o analito de interesse. Como etapa seguinte, adiciona-se ao poço a amostra do antígeno. Após completada a reação do anticorpo de captura com o antígeno, um segundo anticorpo é adicionado (anticorpo secundário). O anticorpo secundário apresenta em sua estrutura um marcador (do inglês labeled) responsável pela geração de sinal que sinalize a presença do antígeno (em casos qualitativos), bem como possibilita uma correlação entre intensidade de sinal e concentração de antígeno (em casos quantitativos). Esse marcador pode ser um grupo cromóforo, uma enzima, um isótopo radioativo, dentre outros. Um dos imunoensaios mais populares e amplamente utilizados nos laboratórios de pesquisa e de diagnóstico é o ensaio imunoenzimático ELISA (do inglês enzyme-linked immunosorbent assay). Assim como os anticorpos, enzimas são espécies especializadas em reações específicas (VASHIST; LUONG, 2018). Uma vez que o anticorpo marcado com enzima reage com o antígeno, reagentes que possuam uma reação química específica catalisada pela enzima marcadora são adicionados, gerando produtos de reação coloridos, fluorescentes, luminescentes ou eletroquimicamente ativos (KONDZIOR; GRABOWSKA, 2020; ZAIDI; SHAHZAD; BATOOL, 2020). Como os anticorpos formam uma estrutura em torno do antígeno, essa estratégia é comumente denominada de sanduiche. De maneira similar, mas com objetivo de detectar anticorpos, antígenos podem ser imobilizados sobre a superfície de substratos para que assim sejam capturados anticorpos específicos. Por exemplo, uma camada proteica de um vírus pode ser imobilizada a fim de se capturar anticorpos específicos da amostra. Por sua vez, um segundo anticorpo marcado (como por exemplo o anti-humano IgG) é utilizado para determinação dos anticorpos capturados, também podendo ter caráter qualitativo ou quantitativo (VASHIST; LUONG, 2018). O imunoensaio na forma sanduíche é classificado como um método indireto de detecção, uma vez que o sinal analítico tem origem em uma segunda espécie marcada (WILD; DAVIES, 2013). Há ainda uma outra categoria, os imunoensaios com detecção direta. O modo direto, como o nome sugere, dar-se-á pela detecção direta do antígeno ou anticorpo marcado, capturado pelo anticorpo ou antígeno imobilizado (Figura 6). Por fim, os imunoensaios podem ainda ser classificados como competitivos (limite de reagente) e não competitivos (excesso de reagente). O imunoensaio na forma de sanduíche é considerado não competitivo. A Figura 6 apresenta uma ilustração para o imunoensaio 34 competitivo. Ao adicionar a amostra ao ensaio, há uma competição pelos sítios limitados e os antígenos da amostra tendem a ocupar o lugar dos antígenos marcados, ocorrendo uma diminuição do sinal analítico após etapa de incubação. Dessa forma, a determinação da concentração de antígeno na amostra será inversamente proporcional ao sinal obtido. Figura 6-Representação esquemática para as formas de imunoensaio direto (A e B) e imunoensaio competitivo (C). Fonte: Autoria Própria. 1.3.1. Aspectos analíticos A reação e consequente formação da ligação antígeno (Ag)-anticorpo (Ac) ocorre por meio da atuação de interações eletrostáticas fracas e interações não-covalentes, como ligações de hidrogênio, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas (TRILLING; ZUILHOF, 2013; WELCH et al., 2017; VASHIST; LUONG, 2018; KONDZIOR; GRABOWSKA, 2020). A uma 35 certa distância (alguns nanômetros), forças de longo alcance como a iônica e hidrofóbica atraem a molécula para o sítio de ligação específica. A energia dessas forças atrativas é suficiente para superar a energia de hidratação, expelindo água e permitindo que o par Ab-Ag se aproxime ainda mais, situação na qual as forças atrativas de Van der Waals são dominantes e, portanto, concluem a formação do imunocomplexo. Nesse momento, a força da ligação dependerá do quão efetivo foi o encaixe no sítio de ligação específico, uma vez que essas forças fracas diminuem sua força de ligação em função da distância (REVERBERI; REVERBERI, 2007). A reação Ab-Ag pode ser expressa de acordo com a lei da ação das massas (Eq. 1 e 2): Ab + Ag Ab-Ag ka kd (1) 𝐾𝐾𝑒𝑒𝑒𝑒 = 𝑘𝑘𝑎𝑎 𝑘𝑘𝑑𝑑 = [𝐴𝐴𝐴𝐴−𝐴𝐴𝐴𝐴] [𝐴𝐴𝐴𝐴][𝐴𝐴𝐴𝐴] (2) Onde ka é a constante de associação (também chamada de kon), kd é a constante de dissociação (também chamada de koff) e Keq a constante de equilíbrio. No início da reação, após a adição do antígeno ao meio de análise, a reação se processa no sentido de formação do complexo (Ab-Ag). Com o avanço da reação, uma taxa da reação inversa aumenta progressivamente até que as velocidades direta e inversa se igualem e a reação alcance o equilíbrio químico (REVERBERI; REVERBERI, 2007). Esse é um ponto importante para observação em ensaios imunológicos, pois as velocidades de reação de formação de Ag-Ab podem apresentar grandes variações (de segundos a horas) a depender das espécies em questão. Obviamente, a concentração das espécies tem influência sobre a velocidade, contudo, imunoensaios são limitados a análises com concentrações de analito na ordem de nanogramas. Dessa forma, muitos protocolos utilizam tempos de reação (incubação) de longos períodos (overnight), objetivando para que a reação alcance o equilíbrio. Contudo, valores satisfatórios de confiabilidade podem ser obtidos em tempos médios de algumas horas uma vez que a reação se processa de forma exponencial. Pelo ponto de vista termodinâmico, quanto maior for as forças de ligação, maior será o valor da constante de equilíbrio (Eq. 3): 36 ln�𝐾𝐾𝑒𝑒𝑒𝑒� = −∆𝐺𝐺 𝑅𝑅𝑅𝑅 (3) Onde ΔG é a variação da energia livre de Gibbs, R a constante universal dos gases e T a temperatura absoluta. 1.3.2. Características de um Anticorpo Anticorpos são biomoléculas (biopolímeros) com estrutura tridimensional de aproximadamente 10 nm contendo três regiões globulares arranjadas em forma de “Y” e massa molecular de aproximada 150 kDa (Figura 7) (MAKARAVICIUTE; RAMANAVICIENE, 2013; WELCH et al., 2017). Sua estrutura é constituída em cadeias leves (retângulos contendo a letra subscrita “L”) e pesadas (retângulos contendo a letra subscrita “H”). Figura 7-A) Estrutura 3D de uma molécula de anticorpo. B) Representação esquemática de um anticorpo destacando suas regiões. Fonte: Adaptado de (TRILLING; ZUILHOF, 2013). Por sua vez, as cadeias podem ser fracionadas em domínios, havendo domínios constantes (CL e CH) e domínios variáveis (VL e VH), responsáveis pela identificação dos antígenos por ligações específicas (modelo chave-fechadura) (CHIU et al., 2019). Ademais, a 37 estrutura de um anticorpo pode ser fracionada em duas partes, denominados fragmentos: o fragmento de ligação do antígeno (Fab - do inglês antigen-binding fragmente) e o fragmento cristalizável (Fc), formando o tronco da estrutura em “Y”. Enquanto a região de ligação com o antígeno tem a função de identificação, como o próprio nome sugere, o papel da região Fc é modular a atividade do anticorpo após a ligação antígeno-anticorpo se formar. Além das características estruturais, os anticorpos possuem características químicas que moldam sua estrutura. Os resíduos de aminoácidos com características hidrofóbicas se contorcem e ocupam principalmente a parte interna da estrutura da biomolécula (CHIU et al., 2019). Por outro lado, os grupos funcionais hidrofílicos ficam localizados na região externa do anticorpo. Esses grupos quimicamente reativos, como aminas, carboxilas e hidroxilas estão espalhados por sua superfície. Do ponto de vista dos ensaios imunológicos, esses grupos funcionais hidrofílicos são de grande importância pois permitem traçar estratégias para imobilização do anticorpo em diferentes superfícies funcionalizadas, bem como a adição de moléculas que atuem como marcadores que forneçam um sinal mensurável para identificação do anticorpo após sua ligação com o antígeno (TRILLING; ZUILHOF, 2013; CHIU et al., 2019). Além dos grupos supracitados, os anticorpos possuem ainda pontes dissulfeto, espalhadas por toda sua estrutura e responsável pela formação das “dobradiças” que mantem a estrutura em Y. Esse grupo pode ser reduzido para formação do grupo tiol, tendo igual importância na utilização de estratégias para conjugação com outras moléculas e superfícies (TRILLING; ZUILHOF, 2013). Como destacado, o conhecimento dos aspectos químicos da estrutura do anticorpo é importante para determinar as estratégias de imobilização (GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022). Duas estratégias são principalmente aplicadas para a imobilização dos anticorpos sobre superfícies sólidas, sendo elas a imobilização por adsorção e imobilização por formação de ligação covalente (Figura 8) (WELCH et al., 2017; ZHANG et al., 2022). Apesar de conferir simplicidade ao ensaio, a estratégia de imobilização por adsorção não fornece controle da orientação dos anticorpos sobre o substrato, podendo afetar a capacidade de reconhecimento do antígeno e consequentemente o desempenho do imunossensor. Em um cenário ideal, os anticorpos devem ser imobilizados sobre o substrato de forma a expor os sítios de ligação específicos (domínios variáveis) para o meio reacional enquanto a região Fc ficaria de face voltada para a superfície do substrato (perpendicular), como representado na Figura 8. Contudo, outras orientações do anticorpo sobre os substratos são 38 possíveis. Assim, é necessário conciliar os aspectos de densidade de recobrimento e orientação dos anticorpos para um bom desempenho imunossensorial (BYZOVA et al., 2017). Figura 8-Ilustração esquemática para as formas de imobilização e as possíveis orientações dos anticorpos sobre substrato. Fonte: Adaptado de (GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022). A utilização de estratégias de imobilização por ligações covalentes pode auxiliar na orientação dos anticorpos sobre o substrato, uma vez que a imobilização ocorrerá através de ligação de grupos específicos do anticorpo com grupos específicos presentes no substrato (GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022). Além de conferir robustez e boa densidade de anticorpos orientados, a estratégia por formação de ligação covalente permite ainda a alguns imunoensaios a possibilidade de reutilização (KONDZIOR; GRABOWSKA, 2020; GAO; GUISÁN; ROCHA-MARTIN, 2022). 1.4. Imunoensaio Eletroquímico Um dos primeiros imunoensaios reportados na literatura utilizou a técnica de imunoprecipitação como abordagem para quantificação de um antígeno (WU, 2006; DAVIES, 2013a). Posteriormente, houve o advento do radioimunoensaio, seguido das técnicas empregando transdutores ópticos baseados em enzimas, como EMIT (do inglês enzyme multiplied Immuno Technique) e ELISA (do inglês enzyme linked immunosorbent assays), sendo um dos mais conhecidos e mundialmente difundidos imunoensaios para fins acadêmicos e de diagnósticos (WU, 2006; DAVIES, 2013a). 39 Apesar disso, diversos esforços vêm sendo realizados para superar o que é considerado a principal desvantagem de imunoensaios: o fato de envolverem um grande número de etapas complexas. Isso resulta em longos períodos de análise e necessidade de mão de obra especializada. A transposição dessas desvantagens poderia resultar em uma maior descentralização e diminuição dos custos das análises, tornando testes específicos cada vez mais acessíveis (ZAIDI; SHAHZAD; BATOOL, 2020; KIM; PARK, 2021). Nesse sentido, grandes esforços vêm sendo direcionados no desenvolvimento de imunoensaios eletroquímicos (KONDZIOR; GRABOWSKA, 2020; KIM; PARK, 2021). Os imunoensaios baseados em técnicas eletroquímicas apresentam diversas vantagens sobre as metodologias convencionais como relativo baixo custo, fácil manuseio, instrumentação simples, rápida resposta, fácil miniaturização e integração em plataformas portáteis (KONDZIOR; GRABOWSKA, 2020). O princípio de funcionamento de um imunossensor eletroquímico segue os mesmos princípios dos imunoensaios citados anteriormente. A alteração será no sinal analítico obtido após a imunorreação, o qual será convertido e mensurado eletroquimicamente (CHO et al., 2018; KONDZIOR; GRABOWSKA, 2020; KIM; PARK, 2021). Muitos trabalhos reportando imunoensaios eletroquímicos empregam enzimas, mas ao invés de gerar produtos coloridos pela reação específica com substratos, a reação catalisada pela enzima produz (sub)produto eletroquimicamente ativos, que serão oxidados ou reduzidos, provendo um sinal analítico que pode ser mensurado e relacionado com a concentração de antígenos na amostra (SAMADI PAKCHIN et al., 2018; MONTERO-CALLE et al., 2019). Contudo, essa estratégia apresenta desvantagens como o grande número de etapas (eletro)químicas e a possível diminuição da capacidade de reconhecimento do anticorpo devido a alterações estruturais durante a etapa de formação de ligação covalente com os marcadores (HASSANPOUR; HASANZADEH, 2021). Os imunossensores eletroquímicos livres de marcadores (do inglês label-free) são uma importante alternativa devido a sua estratégia de detecção direta (BARADOKE et al., 2020; HASSANPOUR; HASANZADEH, 2021). Seu princípio se baseia na resposta eletroquímica pela transferência eletrônica (oxidação ou redução) de uma espécie química em solução, denominada de mediador redox. Quando na presença do analito, a capacidade de transferência eletrônica sofre alteração devido ao impedimento de acesso do mediador redox 40 à superfície do eletrodo (gate-effect), resultando em diminuição do sinal eletroquímico (Figura 9) (DENG et al., 2016; LACH et al., 2019). Contudo, algumas desvantagens para essa metodologia são apontadas em função da necessidade de dopagem da solução com grandes concentrações de reagentes com valências altas, como o par [Fe(CN)6]3-/4-, que resultam em possíveis falsos positivos e desvios da linha de base (BARADOKE et al., 2020; HASSANPOUR; HASANZADEH, 2021). Tentando superar esse desafio, a presente tese de doutoramento apresenta uma estratégia de detecção alternativa, utilizando polímeros condutores redox e sua seletividade de resposta ao oxigênio dissolvido, que atuou como mediador redox na construção de imunossensores eletroquímicos label-free. Figura 9-Representação esquemática para o mecanismo de resposta de um imunosensor eletroquímico label-free baseado em espectroscopia de impedância eletroquímica. Fonte: Autoria própria. 1.4.1. Utilização de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica para Imunosensoriamento Nas últimas décadas, a utilização da espectroscopia de impedância eletroquímica (EIE) como técnica de transdução em plataformas de biorecognição, como imunossensores, para biosensoriamento ganhou grande destaque, principalmente pela impressionante sensibilidade alcançada pela técnica, chegando a limites de detecção na faixa de picomol 41 (BONANNI; VALLE, 2010; CONGUR; EKSIN; ERDEM, 2015). Além da sensibilidade, a técnica ainda apresenta as vantagens características das plataformas eletroquímicas, tal como baixo custo relativo, facilidade de manuseio e miniaturização (RUSSO et al., 2021). O princípio da técnica é baseado em aplicar uma pequena perturbação ao sistema, na forma de potencial elétrico (em regime de circuito alternado) e obter um sinal de corrente alternada como resposta. Modulando-se a frequência da onda senoidal do sinal de perturbação é possível acompanhar diferentes fenômenos eletroquímicos do sistema (Figura 10) (VON HAUFF, 2019). Figura 10-Representação esquemática do sinal de perturbação de uma interface eletroquímica (A) e das representações gráficas de Nyquist e BODE para o sinal de resposta (B). Fonte: Autoria própria. Dessa forma, a técnica é capaz de medir em uma mesma análise diferentes aspectos físico-químico que estão ocorrendo simultaneamente dentro do sistema eletroquímico, como condutividade da solução, carregamento da dupla camada elétrica (capacitância da dupla camada - Cdc), transferências de elétrons entre eletrodo/solução (resistência de transferência de carga - Rtc) e fenômenos de transporte de massa (elemento de Warburg – W). Ademais, informações morfológicas como estimativa da porosidade e rugosidade também podem ser alcançadas (LASIA, 2002). Essa ampla capacidade de visualização dos fenômenos permitiu aos pesquisadores o desenvolvimento de estratégias de detecção que alcançassem níveis impressionantes de sensibilidade, as quais até então só eram possíveis por meio de técnicas consideradas padrão. 42 Com efeito, a EIE foi capaz de oferecer performance equivalente ou mesmo superior, podendo ainda superar as desvantagens apresentadas por essas técnicas, as quais incluem grandes dispêndios por envolver mão de obra especializada, equipamentos de alto custo e longos períodos de análise (STRONG et al., 2021). Grande parte dos trabalhos de desenvolvimento de plataformas sensoriais que utilizam EIE exploram as reações faradaicas, através da variação de resistência de transferência de carga do sistema, como estratégia de sensoriamento (BARADOKE et al., 2020; STRONG et al., 2021). Isso é comumente realizado a partir de medidas onde o biossensor tem contanto com uma solução contendo o analito de interesse junto a um mediador redox (BARADOKE et al., 2020). À medida em que o biosensor interage com o analito, acompanha- se uma variação nos valores de resistência do sistema (Rtc) correlacionado com a concentração do analito em solução. A escolha dos pesquisadores pela utilização de mediadores redox tem como objetivo ampliar a razão sinal-ruído (RSR), devido grande parte do conjunto biomolécula-analito não se apresentar eletroquimicamente ativo no intervalo de potencial comum para meios aquosos. Apesar disso, a utilização de mediadores redox pode estar sujeita a possíveis falsos positivos na análise (BARADOKE et al., 2020; LE; PARK; CHO, 2020). Nesse sentido, os polímeros condutores redox são alternativas promissoras uma vez que reúnem a facilidade de síntese por meio de eletropolimerização bem como a propriedade redox, necessária para atender as diferentes estratégias dos biosensores eletroquímicos sem a necessidade de adição de mediadores redox em solução. Ademais, apresentam flexibilidade e a possibilidade de ancoragem de diversos materiais biológicos por meio da interação com os grupos funcionais presentes em suas cadeias poliméricas (OLEAN-OLIVEIRA et al., 2021). 1.5. Materiais nanocompósito baseados em polímeros condutores A investigação de materiais em escala nanométrica para fabricação de biosensores, em especial imunossensores, tem atraído crescente interesse durante as últimas décadas (NARESH; LEE, 2021). O principal motivo é a possibilidade de modulação de propriedades físicas e químicas em razão do tamanho e formato do nanomaterial. Recentemente, diversos esforços vem sendo dedicado para o desenvolvimento e aplicação de materiais híbridos (nanocompósitos), os quais apresentam melhoras em suas propriedades e características quando em comparação a suas formas individuais (POTTS et al., 2011; ZHANG et al., 2015). Dentre os materiais nanocompósitos desenvolvidos, aqueles baseados em polímeros 43 condutores estão recebendo especial atenção em pesquisas nas mais diversas áreas devido a facilidade de síntese bem como por formar materiais de flexíveis, biocompatíveis e de baixo custo. Destaca-se as bioplataformas sensoriais formadas por polímeros condutores redox e nanopartículas de metais nobres (NPMN) como platina, prata e ouro (HAN et al., 2017). Especialmente, nanopartículas de ouro apresentam propriedades únicas como grande habilidade de adsorção, grande área superficial específica, boa biocompatibilidade bem como alta condutividade eletrônica. Apesar disso, nanopartículas de ouro são instáveis em solução e geralmente necessitam de um invólucro de moléculas, tais como alcanotiois, aminas, nucleotídeos e polímeros para sua estabilização. Nesse sentido, a presença de grupos funcionais nos polímeros condutores possibilita o crescimento de nanopartículas de ouro em meio a uma rede polimérica evitando a sua agregação ou dissolução. Por sua vez, as nanopartículas de ouro em meio a rede polimérica aumentam significativamente a área superficial do polímero condutor, além de atuar como mediador na transferência de elétrons que ocorre nos sítios redox do polímero (LU et al., 2018; TEPALE et al., 2019; ESSOUSI et al., 2020). 1.6. Nanopartículas de Ouro Nanopartículas de ouro vem sendo extensivamente exploradas para as mais variadas aplicações (ASADI et al., 2021; CHEN et al., 2021; LEE; CHOI; HEO, 2021; QIAO; QI, 2021). Uma busca na plataforma Science Direct apresentou 110 000 resultados de trabalhos publicados relacionados a nanopartículas de ouro de 2010 até o presente momento. O grande interesse nessa classe de materiais é principalmente devido a suas interessantes propriedades químicas e físicas resultantes das suas dimensões em escala nanométricas (LOHSE; MURPHY, 2013; FREITAS DE FREITAS et al., 2018). Nanopartículas de ouro podem assumir diferentes formatos e dimensões dependendo da rota sintética, bem como da aplicação desejada, uma vez que cada uma apresenta características específicas. Por exemplo, nanopartículas no formato de bastonetes interagem de duas diferentes maneiras com a luz por possuir valor de comprimento e largura diferentes um do outro. Esse aspecto é amplamente explorado com finalidades ópticas (CHEN et al., 2021; QIAO; QI, 2021). 44 Do ponto de vista eletroquímico, as nanopartículas de ouro são atrativas principalmente por sua ampla área superficial, a qual resulta em ampliação da resposta do sinal eletroquímico e alta condutividade eletrônica, podendo ser utilizado como um mediador, aumentando a eficiência de transferência eletrônica de um sistema eletroquímico (GUO; WANG, 2007; HAN et al., 2017; KIZLING et al., 2018). As nanopartículas possuem grande variedade de rotas sintéticas que podem ser utilizadas para a sua obtenção. Os protocolos são categorizados como de cima para baixo (do inglês top-down), onde processos físicos e químicos são utilizados para degradar um material de partida em menores partes, alcançando a escala nanométrica; e de baixo para cima (bottom-up), onde a síntese inicia com precursores menores, tal como o sal de ouro, para formar estruturas maiores (QIN et al., 2018). Elas também podem ser classificadas em métodos químicos, físicos e biológicos (QIN et al., 2018; QIAO; QI, 2021). Métodos químicos e biológicos utilizam agentes químicos como estabilizantes e redutores para obtenção das nanopartículas. A diferença entre eles é que para a classificação de método biológico, os reagentes necessitam ser não tóxicos (química verde). Assim, derivados de plantas são amplamente utilizados nessa metodologia de síntese, assim como o uso de agentes biológicos como bactérias e fungos. Nos métodos físicos, técnicas como ablação a laser, microondas, ultrassom, são utilizados para a obtenção das nanoestruturas. A utilização de técnicas eletroquímicas para síntese de nanopartículas de ouro é uma interessante alternativa as rotas convencionais por oferecer alto controle sobre a forma da nanopartícula desejada, bem como na diminuição de etapas necessárias em rotas sintéticas convencionais, diminuindo custo de síntese e contribuindo positivamente com o meio ambiente (DUDIN; UNWIN; MACPHERSON, 2010; HOU et al., 2021). 1.7. Polímeros Condutores Redox Desde sua descoberta no fim da década de 70, polímeros condutores vêm ganhando crescente atenção devido a seu grande potencial de aplicabilidade, recebendo o título de “metais sintéticos”, sendo uma alternativa a tecnologias utilizando materiais inorgânicos para áreas de materiais ópticos, eletroquímicos e dispositivos elétrico/eletrônico (LUO et al., 2021; OLEAN-OLIVEIRA et al., 2021; RAMANAVICIUS; RAMANAVICIUS, 2021). Polímeros condutores apresentam vantagens devido a sua diversidade química, baixa densidade, flexibilidade, 45 resistência a corrosão, fácil controle sobre sua forma e morfologia, e controle sobre a condutividade eletrônica. A condutividade desses materiais é tipicamente explicadas por meio da teoria de bandas, onde a diferença de energia (bandgap), também chamada de banda proibida, entre a banda de valência (BV) e a banda de condução (BC) são utilizadas para classificar os materiais como condutores, semi-condutores e isolantes (LE; KIM; YOON, 2017; K; ROUT, 2021). No caso de condutores, as bandas BV e BC encontram-se sobrepostas, possibilitando o livre trânsito dos elétrons pela estrutura do material. Materiais isolantes apresentam bandgap suficientemente alto que impossibilitam a passagem de elétrons da BV para a BC e os semicondutores, como o nome sugere, possuem valores de bandgap intermediários (banda estreita), permitindo, sob determinadas circunstâncias, a promoção de elétrons para a BC. A teoria de bandas explica o comportamento de semicondutor dos polímeros condutores, contudo é necessário um olhar também sobre a sua estrutura química. A principal característica que possibilita conferir condutividade eletrônica aos polímeros condutores é a presença de ligações π em sua cadeia polimérica (Figura 11) (LE; KIM; YOON, 2017; K; ROUT, 2021). A π-conjugação é caracterizada pela presença de ligações simples (ligação do tipo sigma - σ) e dupla (uma ligação sigma e uma ligação pi - π) arranjadas de forma alternada. Essa estrutura pode alternar as ligações, onde orbitais pz se sobrepõem continuamente, resultando em uma condição que permite a movimentação dos elétrons ao longo da cadeia polimérica. Uma característica de destaque dos polímeros condutores é a possibilidade de controle sobre sua condutividade. A modulação da condutividade da cadeia polimérica pode ser facilmente alcançada por meio da dopagem desses materiais. Há várias metodologias para dopagens de polímeros condutores, como dopagem redox, dopagem por injeção de carga e fotodopagem (MOHD RADZUAN; SULONG; SAHARI, 2017; OLEAN-OLIVEIRA et al., 2021). Nesse sentido, a palavra “dopagem” em polímeros se difere para aquela comumente utilizada na química inorgânica. Em inorgânica dopagem é a introdução de pequena quantidade de átomos de um elemento diferente daquele do material principal, de modo que os átomos do dopante substituam alguns átomos do material principal na rede cristalina. A dopagem em um polímero condutor se dá por inserção de quantidades significativas de agentes que adicionam (dopagem tipo-n) ou retiram (dopagem tipo-p) elétrons na matriz polimérica com intenção de formação de polarons, bipolarons e solitons que podem ser 46 deslocalizados e conferem aos polímeros condutores condutividade comparável para a de alguns metais (Figura 11B) (BREDAS; STREET, 1985; ZOZOULENKO et al., 2019; K; ROUT, 2021). Figura 11-A) Estrutura química do poliacetileno para exemplificação da cadeia polimérica com ligações π-conjugadas. B) Representação esquemática dos orbitais moleculares antes e após oxidação (a) ou redução (b) da cadeia polimérico. Os estados polarônicos foram exemplificados a partir da estrutura do politiofeno. Fonte: Adaptado de (LE; KIM; YOON, 2017). A dopagem do tipo-p, elétrons migram do orbital HOMO (high occupied molecular orbital) para a espécie dopante e uma carga positiva é gerada sobre a cadeia polimérica 47 (vacância). Para o caso da dopagem do tipo-n, elétrons são transferidos para o orbital LUMO (lowest unoccupied molecular orbital) aumentando a densidade eletrônica e permitindo a deslocalização da carga negativa gerada (LE; KIM; YOON, 2017; ZOZOULENKO et al., 2019). Além da dopagem, características químicas e estruturais do polímero podem afetar sua condutividade bem como suas propriedades mecânicas (CHEN et al., 2020; K; ROUT, 2021). Características como comprimento da cadeia polimérica, presença de unidades não conjugadas e grau de polimerização podem aumentar ou diminuir a condutividade do polímero. Nesse sentido, um bom controle sobre a síntese interfere diretamente sobre seu desempenho. Polímeros condutores são tipicamente obtidos por rotas de síntese química ou eletroquímica. Técnicas eletroquímicas são vantajosa por permitir a modulação de características através da alteração de parâmetros eletroquímicos empregados durante a síntese, como por exemplo, potencial aplicado e tempo aplicado (OLEAN-OLIVEIRA; OLIVEIRA BRITO; TEIXEIRA, 2020; OLEAN-OLIVEIRA et al., 2021). Além disso, técnicas eletroquímicas podem ser utilizadas para realizar a dopagem do polímero construído com grande controle sobre o grau de dopagem (LE; KIM; YOON, 2017). 1.7.1. Polímero Condutor Redox Baseado no Monômero Bismarck Brown Y: Um Azo-Polímero Condutor O azo-corante Bismarck Brown Y (4,4'-[1,3-Fenilenobis(azo)]-bis[1,3-fenildiamina] segundo a classificação da IUPAC) é um dos primeiros corantes baseados em anilina reportados na literatura. Sua síntese foi descrita pela primeira vez em 1863 por Carl Alexander Von Martius (BYERLY, 1953). O corante Bismark Brown Y foi principalmente utilizado na coloração de tecidos, cultivo de cé