0 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Viviam Milanez Massolini Avaliação de polimorfismos genéticos na progressão da infecção de pacientes monoinfectados e coinfectados com os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e Vírus da Hepatite C (VHC) Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre(a) em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa. Dra.Maria Inês de Moura Campos Pardini Coorientadora: Profa. Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto Botucatu 2015 Viviam Milanez Massolini Avaliação de polimorfismos genéticos na progressão da infecção de pacientes com os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e Vírus Orientadora: Profa.Dra Coorientadora:Profa.Dra Viviam Milanez Massolini Avaliação de polimorfismos genéticos na progressão da infecção de pacientes monoinfectados e coinfectados com os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e Vírus da Hepatite C (VHC) Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do tí Mestre(a) em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientadora: Profa.Dra. Maria Inês de Moura Campos Pardini Coorientadora:Profa.Dra. Rejane Maria Tommasini Grotto Botucatu 2015 1 Viviam Milanez Massolini Avaliação de polimorfismos genéticos na progressão da monoinfectados e coinfectados com os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e Vírus apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista lio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de em Fisiopatologia em Clínica Maria Inês de Moura Campos Pardini Rejane Maria Tommasini Grotto 2 3 VIVIAM MILANEZ MASSOLINI Avaliação de polimorfismos genéticos na progressão da infecção de pacientes monoinfectados e coinfectados com os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e Vírus da Hepatite C (VHC) Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre(a) em Fisiopatologia em Clínica Médica. Aprovado em: BANCA EXAMINADORA ___________________________________/___/___ Presidente e Orientadora: Profa. Dra. Maria Inês de M. C. Pardini Departamento de Clínica Médica Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP ___________________________________/___/___ Membro: Prof. Dr. Alexandre Naime Barbosa Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem Faculdade de Medicina de Botucatu - UNESP ___________________________________/___/___ Membro: Prof. Dr. Atila Iamarino Departamento de Microbiologia Universidade de São Paulo - USP 4 Prefácio O volume aqui apresentado intitulado Avaliação de polimorfismos genéticos na progressão da infecção de pacientes monoinfectados e coinfectados com os Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e Vírus da Hepatite C (VHC), constitui um estudo de caráter inédito, na linha de pesquisa de polimorfismos genéticos de indivíduos coinfectados HIV/VHC, por tratar-se de uma análise completa da correlação dos 16 genes KIR relatados até o presente momento, com a progressão da infecção ocasionada pelo HIV. Biomédica de formação iniciei minha vida acadêmica na Iniciação científica, ainda na graduação, ocasião a qual tive a oportunidade de trabalhar com a investigação de fatores virológicos, no caso a presença da variante B’ do HIV, e a relação dos mesmos com a progressão da infecção pelo HIV em coinfectados com os vírus HIV/VHC. Seguindo a mesma linha, agora com objetivo de correlacionar polimorfismos do hospedeiro com a progressão da infecção do HIV ingressei no mestrado e, o trabalho aqui apresentado é parte dos resultados destes anos de trabalho. A primeira parte da dissertação consiste em uma revisão de literatura sobre os vírus HIV/VHC e a coinfecção (HIV/VHC), os receptores KIR, sua importância e função nas células Natural Killer e, posteriormente uma breve revisão a respeito dos ligantes de KIR. Segue-se então os objetivos do estudo, as análises realizadas, resultados e discussão e a conclusão. Durante o meu tempo de Mestrado também tive a oportunidade de realizar a padronização de uma metodologia in house para tipagem do HLA de classe I (A, B e C), a qual é apresentada aqui na forma de anexo que irá integrar o Procedimento Operacional Padrão (POP) do Laboratório de Biologia Molecular, do Hemocentro de Botucatu, Faculdade de Medicina, Unesp. 5 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho... Aos meus pais WilsonWilsonWilsonWilson e GeraldaGeraldaGeraldaGeralda MassoliniMassoliniMassoliniMassolini e ao meu irmão William William William William MassoliniMassoliniMassoliniMassolini, que são minha família, meu porto seguro, que sempre estiveram ao meu lado nas horas difíceis e de felicidade e que sem o apoio deles não teria chegado até aqui. Obrigada por todo amor e carinho. 6 Dedico também aos pacientespacientespacientespacientes, que lutam contra a doença em busca de uma qualidade de vida melhor e sem preconceitos e, que contribuíram para a realização deste trabalho. 7 AGRADECIMENTOS � Agradeço primeiramente a DeusDeusDeusDeus por estar sempre presente em minha vida, por me dar forças e por permitir a realização deste sonho me mostrando que não devo desistir frente às adversidades da vida. � A minha mãe GeraldaGeraldaGeraldaGeralda MassoliniMassoliniMassoliniMassolini e ao meu pai Wilson NWilson NWilson NWilson N. Massolini. Massolini. Massolini. Massolini, obrigada por se fazerem tão presentes e necessários, me ajudando gradativamente a ser a pessoa que sou, pelo apoio em todas as minhas decisões, por acreditarem em mim e pelo imenso amor e carinho. Obrigada por tudo. � A minha tia Maria MilanezMaria MilanezMaria MilanezMaria Milanez, meu tio Antonio MilanezAntonio MilanezAntonio MilanezAntonio Milanez, minha avó AlvarinaAlvarinaAlvarinaAlvarina Massolini Massolini Massolini Massolini e In memoriam aos meus avôs WilsonWilsonWilsonWilson MassoliniMassoliniMassoliniMassolini eeee FranciscoFranciscoFranciscoFrancisco MilanezMilanezMilanezMilanez e a minha avó Luzia MilanezLuzia MilanezLuzia MilanezLuzia Milanez, que contribuíram para que eu chegasse até aqui, obrigada pelo apoio, amor e carinho. Saudades dos que já se foram... � A Edmea F. M. SilvaEdmea F. M. SilvaEdmea F. M. SilvaEdmea F. M. Silva e Wilson Roberto da Silva Wilson Roberto da Silva Wilson Roberto da Silva Wilson Roberto da Silva por todo o carinho e apoio para que eu chegasse até aqui. � A minha orientadora Profa. Dra. Maria Inês de Moura Campos PardiniMaria Inês de Moura Campos PardiniMaria Inês de Moura Campos PardiniMaria Inês de Moura Campos Pardini, pela oportunidade de ingressar na pesquisa e em seu laboratório ainda na iniciação científica, por acreditar em mim e na minha capacidade no desenvolvimento deste trabalho, pelo incentivo, pelo apoio e dedicação. Obrigada por me ensinar muito do que hoje eu sei. 8 � A minha coorientadora Profa. Dra. Rejane Maria TommasiniRejane Maria TommasiniRejane Maria TommasiniRejane Maria Tommasini GrottoGrottoGrottoGrotto, que me ajudou a dar os primeiros passos na pesquisa, obrigada pela oportunidade de desenvolver este trabalho, por acreditar em mim e na minha capacidade, obrigada pela orientação, pelo apoio e por tudo que me ensinou. � A Profa. Dra. Adriana CamargAdriana CamargAdriana CamargAdriana Camargo Ferrasio Ferrasio Ferrasio Ferrasi, muito obrigada pelo carinho, pelo apoio, pelos conselhos, ensinamentos e incentivo. Obrigada por ter participado e contribuído para que eu chegasse até aqui. � A Profa. Dra. Patrícia Carvalho GarciaPatrícia Carvalho GarciaPatrícia Carvalho GarciaPatrícia Carvalho Garcia, pelos conselhos, pelo carinho, por se fazer presente nos momentos de dificuldade e também por estar sempre me incentivando e comemorando cada conquista minha. Obrigada pelos ensinamentos e por toda contribuição para que eu chegasse até aqui. � A Dra. Flávia Hebeler Barbosa TrovãoFlávia Hebeler Barbosa TrovãoFlávia Hebeler Barbosa TrovãoFlávia Hebeler Barbosa Trovão, por toda ajuda e apoio durante o desenvolvimento deste trabalho, pelo tempo dedicado a me ensinar e pela ajuda nos experimentos. Obrigada pelo carinho, conselhos e incentivo, você foi muito importante para que eu conseguisse chegar até aqui. � Ao Dr.Alexandre Naime BarbosaAlexandre Naime BarbosaAlexandre Naime BarbosaAlexandre Naime Barbosa e a todos os funcionáriosfuncionáriosfuncionáriosfuncionários do Serviço de Ambulatórios Especializados de infectologia “Domingos Alves Meira”, por toda ajuda e contribuição no desenvolvimento deste trabalho. Em especial ao Dr.Alexandre pelos ensinamentos e colaboração e aos funcionários pela ajuda na coleta das amostras, dos dados e pelo carinho. 9 � Ao Dr. Giovanni Faria SilvaGiovanni Faria SilvaGiovanni Faria SilvaGiovanni Faria Silva e a todos os funcionáriosfuncionáriosfuncionáriosfuncionários do Ambulatório de Hepatites da Disciplina de Gastroenterologia Clínica do Departamento de Clínica Médica da FMB-Unesp, pela colaboração e pela ajuda na coleta das amostras e dados. � Aos pacientespacientespacientespacientes que doaram as amostras para a realização deste trabalho. � A todas as pessoas do Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu em especial a Aline Faria Galvani, Francielle Martins, Caroline Aline Faria Galvani, Francielle Martins, Caroline Aline Faria Galvani, Francielle Martins, Caroline Aline Faria Galvani, Francielle Martins, Caroline NunNunNunNunes, Luiza Souza, Taize Beraldo, Kelly Precipito, Nathália Almeida e es, Luiza Souza, Taize Beraldo, Kelly Precipito, Nathália Almeida e es, Luiza Souza, Taize Beraldo, Kelly Precipito, Nathália Almeida e es, Luiza Souza, Taize Beraldo, Kelly Precipito, Nathália Almeida e Michele Pronunciate Michele Pronunciate Michele Pronunciate Michele Pronunciate pela ajuda durante o desenvolvimento do trabalho, pela companhia, pelo apoio, carinho, pelas conversas e risadas. � A todos os funcionários da equipe do Laboratório de Rotinas Diagnósticas em Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, Regina Célia, Maércio AlhoRegina Célia, Maércio AlhoRegina Célia, Maércio AlhoRegina Célia, Maércio Alho, , , , Sarita Barreto Sarita Barreto Sarita Barreto Sarita Barreto e as aprimorandas Renata Zugaib Renata Zugaib Renata Zugaib Renata Zugaib e Natália Picelli. Natália Picelli. Natália Picelli. Natália Picelli. Pela grande ajuda com as amostras e dados dos pacientes e a Renata pela ajuda na leitura dos resultados da tipagem do HLA. � A todos os funcionários do Hemocentro da UNESP de Botucatutodos os funcionários do Hemocentro da UNESP de Botucatutodos os funcionários do Hemocentro da UNESP de Botucatutodos os funcionários do Hemocentro da UNESP de Botucatu. Obrigada pelo apoio e carinho. � A FAPESPFAPESPFAPESPFAPESP por me contemplar com a bolsa de Mestrado e pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento do trabalho. 10 � As minhas amigas AAAAliene Suzuki, Natália Cantão, Aline Galvani, Luiza liene Suzuki, Natália Cantão, Aline Galvani, Luiza liene Suzuki, Natália Cantão, Aline Galvani, Luiza liene Suzuki, Natália Cantão, Aline Galvani, Luiza Souza, Taize Beraldo, Renata Zugaib, Caroline Nunes, Fran Martins, Souza, Taize Beraldo, Renata Zugaib, Caroline Nunes, Fran Martins, Souza, Taize Beraldo, Renata Zugaib, Caroline Nunes, Fran Martins, Souza, Taize Beraldo, Renata Zugaib, Caroline Nunes, Fran Martins, Natália Coradi, Karina Massolini, Lethícia Massolini, Natália Coradi, Karina Massolini, Lethícia Massolini, Natália Coradi, Karina Massolini, Lethícia Massolini, Natália Coradi, Karina Massolini, Lethícia Massolini, por estar ao meu lado, pelos conselhos, apoio e carinho, obrigada pela amizade. � Agradeço as companheiras de casa, Heloísa Garcia e Helga NunesHeloísa Garcia e Helga NunesHeloísa Garcia e Helga NunesHeloísa Garcia e Helga Nunes pela companhia, conselhos, conversas e pelas risadas. � A Tathiane SilvestreTathiane SilvestreTathiane SilvestreTathiane Silvestre e a AdrieleAdrieleAdrieleAdriele Levoratto Levoratto Levoratto Levoratto pela amizade, conselhos e caronas. � Obrigada a todos que de alguma forma, presenciaram a minha caminhada e que em algum momento do caminho se fizeram essências para que eu chegasse até aqui... 11 EPÍGRAFE “ Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor, mas lutamos para que o melhor fosse feito. Não somos o que deveríamos ser, nem somos o que iremos ser, mas graças a Deus, não somos o que éramos”. Martin Luther KingMartin Luther KingMartin Luther KingMartin Luther King 12 RESUMO A vulnerabilidade humana à infecção pelo HIV não é uniforme, fatores virológicos e do hospedeiro são determinantes no risco da transmissão e na evolução natural da infecção. Polimorfismos (do hospedeiro) nos genes KIR estão sendo associados à evolução da infecção pelo vírus. Vários estudos vêm sendo realizados em monoinfectados pelo HIV-1, mas pouco se conhece a respeito da relação desses polimorfismos em coinfecção HIV/VHC. A finalidade deste estudo foi analisar a evolução da infecção pelo HIV em pacientes coinfectados HIV/VHC, baseada em parâmetros clínicos, laboratoriais e virológicos, correlacionando polimorfismos de genes KIR. Foram incluídas no estudo 251 amostras, as quais foram distribuídas em três grupos (Grupo 1: 100 indivíduos monoinfectados HIV-1; Grupo 2: 100 indivíduos monoinfectados VHC e Grupo 3: 51 coinfectados HIV/VHC. As determinações dos subtipos (HIV-1) e genótipos (VHC) foram realizadas por sequenciamento. As definições dos polimorfismos dos genes KIR foram determinados por PCR-SSP e do HLA, por sequenciamento. Dados referentes à evolução da infecção pelo HIV-1 e VHC foram analisados a partir dos prontuários médicos dos pacientes. Os resultados obtidos pelo presente estudo com relação aos genes KIR, 2DL2, 2DS2 e 2DL5, sugerem em caráter inédito a correlação destes polimorfismos com a evolução da infecção pelo VHC em indivíduos coinfectados. A inexistência de correlação dos polimorfismos dos genes KIR com a progressão da infecção pelo HIV-1 em coinfectados sugere que nesta condição, a presença do HIV-1 pode estar influenciando muito mais a progressão da doença pelo VHC do que o desenvolvimento de aids propriamente dito. 13 ABSTRACT Human vulnerability to HIV infection is not uniform, virological and host factors are determinants on the risk of transmission and natural infection progression. KIR genes polymorphisms have been being associated with progression of HIV infection. Several studies have been performed in mono-infected by HIV-1, but few knwoledge is known about the relation of these polymorphisms in coinfection by HIV/HCV. The purpose of this study was to assess the increasing of the infection by HIV in patients coinfected HIV/HCV, based on clinical, laboratory and virological parameters and correlating KIR genes polymorphisms. The study included 251 samples which were divided into three groups (Group 1: 100 HIV mono-infected; Group 2: 100 mono-infected HCV; Group 3: 51 Co-Infected HIV/HCV). Determination of subtypes (HIV) and genotypes (HCV) was held using RNA sequencing. Polymorphisms definitions of KIR genes were determined by PCR-SSP and HLA were accomplished out by sequencing. Clinical and laboratory data, regarding the evolution of HIV and HCV infection were analyzed from the medical records of patients. The results obtained by this study concerning KIR, 2DL2, 2DL5 and 2DS2 genes demonstrate the state-of-the-art on the correlation of these polymorphisms with evolution of HCV infection in coinfected individuals. The absence of correlation between the polymorphism of KIR genes with progression of HIV-1 infection in co-infected, suggests that in this particular condition, the presence of HIV-1 may influence much more the disease progression by the HCV than the aids development in itself. 14 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1: Esquema representativo da estrutura do HIV, evidenciando RNA viral, glicoproteínas do envelope gp41 e gp120, proteína da matriz (p17), proteínas do capsídeo (p24) e a enzima transcriptase reversa..........................................................................................................................31 FIGURA 2: Representação esquemática do Genoma do HIV, evidenciando os genes estruturais (gag, pol, env), acessórios (nef, vpu, vif e vpr), regulatórios (tat e rev) e as LTRs.............................................................................................................................32 FIGURA 3: Representação da estrutura da gp120, evidenciando seus domínios interno e externo, além de uma região de ligação em forma de “β-sheet” (folha-beta), que é denominada Bridging Sheet. A molécula de CD4 se liga a uma cavidade da gp120 formada na junção entre os domínios interno, externo e a Bridging Sheet, enquanto que o correceptor liga-se provavelmente a uma região na base da proteína, entre a terceira região variável (alça V3) e a Bridging Sheet ......................................................................................................................................33 FIGURA 4: Representação esquemática da interação da gp 120 da membrana viral com o marcador de superfície celular CD4 na célula-alvo, expondo a terceira região variável da gp120 (V3) a qual se torna apta a ligação com os correceptores CCR5 e/ou CXCR4, conduzindo à condições necessárias para a fusão das membranas celular e viral, processo que é mediado pela gp41, ocorrendo internalização do nucleocapsídeo viral e continuidade do ciclo replicativo do HIV................................................................................................................................34 FIGURA 5: Representação esquemática da terceira região variável da gp120 do HIV- 1 (alça V3), evidenciando a região conservada GPG no subtipo B e os dois resíduos de cisteina que se ligam por ponte dissulfeto dando, então, a essa região uma conformação em alça ..................................................................................................35 15 FIGURA 6: Curso Clínico da Infecção pelo HIV...........................................................37 FIGURA 7: Esquema representativo da estrutura do VHC, evidenciando RNA viral, core protéico, proteínas do envelope e envelope viral...............................................................................................................................40 FIGURA 8: Representação esquemática da organização do RNA genômico do VHC, evidenciando as regiões 5’UTR que contêm IRES (Internal Ribossome Entry Site) e a 3’UTR que flanqueiam a ORF (Open Reading Frame), cuja poliproteína correspondente é clivada em proteínas estruturais e não estruturais, onde estão representados seus produtos proteicos e suas respectivas funções ......................................................................................................................................40 FIGURA 9: Organização molecular e nomenclatura dos genes KIR. Os genes KIR apresentam três tipos de domínios: D0, D1 e D2. Os receptores KIR com três domínios têm configuração D0-D1-D2, já as moléculas com dois domínios podem ter configuração D1-D2, chamadas de tipo 1 ou D0-D2, conhecidas como tipo 2 ......................................................................................................................................46 FIGURA 10: Receptores de ativação e inibição das células NK e suas respectivas funções.........................................................................................................................47 FIGURA 11: Sequência dos genes KIR nos haplótipos A e B ......................................................................................................................................48 FIGURA 12: Eletrofosere em gel de agarose 2% do primeiro teste de PCR-SSP para genotipagem dos genes KIR........................................................................................59 FIGURA 13: Eletrofosere em gel de agarose 2% referente à genotipagem dos genes KIR através de PCR-SSP da amostra de um indivíduo monoinfectado HIV................................................................................................................................60 16 FIGURA 14: Worksheet utilizada na interpretação dos resultados obtidos através da PCR-SSP e revelados em gel de agarose 2%.............................................................61 FIGURA 15: Eletroforese em gel de agarose 2% referente à Tipagem do HLA de classe I (A, B e C). .......................................................................................................62 FIGURA 16: Eletroforese em gel de agarose 2% da reação de Nested-PCR para amplificação da região env do HIV-1: (a) Ladder de 100pb, (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h),(i), (j), (l) e (m) pacientes positivos, banda única de aproximadamente 550pb correspondente a região env do HIV-1 e (n) controle negativo da reação...........................................................................................................................64 FIGURA 17: Eletroforese em gel de agarose 2% da reação de Nested-PCR para amplificação da região genômica 5’UTR do VHC: (a) Ladder de 100pb (LGC Biotecnologia), (b), (c), (d), (e) e (f) pacientes positivos, banda de 214pb correspondente a região 5’UTR do VHC e (g) controle negativo........................................................................................................................65 FIGURA 18: Distribuição dos indivíduos de cada grupo com relação ao sexo..............................................................................................................................66 FIGURA 19: Parte de um cromatograma obtido do sequenciamento da região genômica env do HIV, evidenciando uma sequência de boa qualidade, com espaçamento regular e picos nítidos............................................................................68 17 LISTA DE TABELAS TABELA 1: Epítopos dos Antígenos Leucocitários Humanos que são reconhecidos pelos receptores semelhantes às imunoglobulinas das células NK ............................49 TABELA 2: Faixa etária dos indivíduos monoinfectados HIV-1 (Grupo 1), monoinfectados VHC (Grupo 2) e coinfectados HIV/VHC (Grupo 3)...........................67 TABELA 3: Distribuição dos pacientes do Grupo 1 (N=100) e Grupo 3 (N=51) segundo o fenótipo do arco da alça V3 da gp 120 do HIV (GPG ou GWG)...........................................................................................................................68 TABELA 4: Distribuição dos pacientes do Grupo 1 (N=100) e Grupo 3 (N=51) segundo o fenótipo do arco da alça V3 da gp 120 do HIV (NSI ou SI).................................................................................................................................69 TABELA 5: Distribuição do Grupo 1 com relação a Antigenicidade e Capacidade de Indução de Sincício......................................................................................................69 TABELA 6: Distribuição do Grupo 3 com relação a Antigenicidade e Capacidade de Indução de Sincício......................................................................................................70 TABELA 7: Distribuição dos 100 indivíduos monoinfectados HIV-1 (Grupo 1) e coinfectados HIV/VHC (Grupo 3), com relação a Carga viral, contagem de células T CD4+ e classificação CDC...........................................................................................72 TABELA 8: Distribuição dos indivíduos do Grupo 1 (N=100) segundo a TARV utilizada e tratamento atual..........................................................................................74 TABELA 9: Distribuição dos indivíduos do Grupo 3 (N=51) segunda a TARV utilizada e tratamento atual.........................................................................................................75 18 TABELA 10: Distribuição dos indivíduos dos Grupos 2 e 3 segundo variáveis relacionadas a evolução da infecção pelo VHC...........................................................76 TABELA 11: Distribuição dos Grupos 2 e 3, segundo a terapêutica utilizada no tratamento da Hepatite C.............................................................................................78 TABELA 12: : Distribuição da frequência absoluta, relativa e gênica dos genes KIR, nos Grupos 1, 2 e 3......................................................................................................80 TABELA 13: Frequência de cada gene KIR dos pacientes coinfectados (n=51) Grupo 3 e população controle Grupo 1 monoinfectados HIV-1 e Grupo 2 monoinfectados VHC..............................................................................................................................82 TABELA 14: Frequência absoluta e relativa de cada ligante de KIR dos pacientes coinfectados (n=30) Grupo 3 e população controle Grupo 1 monoinfectados HIV-1 e Grupo 2 monoinfectados VHC......................................................................................86 TABELA 15: Frequência de KIR e seus ligantes.........................................................87 19 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ºC : Grau Celsius CCR5 : Receptor C-C de quimiocina tipo 5, que funciona como correceptor viral CDC: Centro de Controle e Prevenção de Doenças (Center for Disease Control) cDNA: DNA complementar CD4: Marcador de superfície celular CD81: Tetraspanina diferenciação celular 81 CLDN: Claudinas CRFs: Formas Recombinantes Circulatórias CXCR4: Receptor C-X-C de quimiocina tipo 4, que funciona como correceptor viral C1 a C5: Regiões constantes da gp120 CV: Carga viral DNA: Ácido desoxirribonucléico dNTPS: Desoxinucleotídeos trifosfato EDTA: Ácido etilenodiaminotetracético et al: e colaboradores E1: Glicoproteína do envelope 1 E2/NS1: Glicoproteína do envelope 2 g: Expresso de RCF (força da centrífuga relativa à aceleração da gravidade) gag, env, pol: Genes estruturais do genoma do HIV gp120: Glicoproteína de superfície do envelope viral do HIV gp41: Glicoproteína transmembrana do envelope viral do HIV GPGR: Sequência de aminoácidos Glicina-Prolina-Glicina-Arginina 20 GWGR: Sequência de aminoácidos Glicina-Triptofano-Glicina-Arginina G1: Grupo 1, representado pelos indivíduos monoinfectados HIV-1 G2: Grupo 2, representado pelos indivíduos monoinfectados VHC G3: Grupo 3, representado pelos indivíduos coinfectados HIV/VHC HGNC: HUGO Gene Nomenclature Committee HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana (Human Immunodeficiency Vírus) HLA: Antígeno Leucocitário Humano HUGO: The Human Genome Organization IQR: Intervalo Interquartil IRES: Sítio de entrada interno do ribossomo (Internal Ribossome Entry Site) IF: Inibidores de fusão II: Inibidores da integrase IMGT: International ImMunoGeneTics information system IP: Inibidores da Protease ITAM: Motivo de ativação à base de tirosina do imunorreceptor ITIM: Motivo de inibição a base de tirosina do imunorreceptor ITRN/ITRNt: Inibidores Nucleosídeos da Transcriptase Reversa ITRNN: Inibidores Não Nucleosídeos da Transcriptase Reversa Kb: Kilobases (1 Kb= 1000 pares de bases) KCI: Cloreto de potássio KDa: Kilodaltons KIR: Receptores semelhantes às imunoglobulinas (killer immunoglobulin-like receptors) 21 LDL-R: Receptor de lipoproteína de baixa densidade Log: Logarítimo LTR: Long terminal repeat MgCl2 : Cloreto de Magnésio mg: Miligrama µL: Microlitro mL: Mililitros µM: Micrometro mM: Milimolar mm3 : Milímetro cúbico MQV: Maraviroque nef, vpu, vif e vpr: Genes acessórios do genoma do HIV NK: Natural Killer ng: Nanograma nm: Nanômetro NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B: Proteínas não estruturais do genoma do VHC NSI: Não Indutor de sincício NR: Não respondedor OCLN: Ocludinas OMS: Organização Mundial de Saúde ORF: Open Reading Frame pb: Pares de base 22 PCR: Reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction) PCR-SSP: Reação em cadeia da polimerase de seqüência de "primers" específicos (Polymerase chain reaction-sequence-specific primers) PTK: Proteína tirosina cinase PTP: Tirosina fosfatase p7: Proteína do nucleocapsídeo do genoma do HIV p11: Enzima protease do genoma do HIV p17: Proteína da matriz do genoma do HIV p24: Proteína do capsídeo do genoma do HIV p32: Enzima integrase do genoma do HIV p66: Enzima transcriptase reversa do genoma do HIV pmol: Picomol PVHA: Pessoas vivendo com HIV/AIDS RE: Retículo endoplasmático RNA: Ácido Ribonucléico RVS: Resposta virológica sustentada SAEI/DAM: Serviço de Ambulatório Especializado em Infectologia Domingos Alves Meira SI: Indutor de sincício SR-BI: Scavenger Receptor Classe B tipo I tat, rev: Genes regulatórios do genoma do HIV TARV: terapia antirretroviral TBE: Tris-Borato 23 Tris-HCl: Tris Hidrocloreto UNAIDS: Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV / AIDS (Joint United Nations Program on HIV/AIDS). U : Unidades U/ µL: Unidades por microlitro UTR: Região não traduzida (Untranslated regions) UV: Luz ultravioleta VGDN: Viral Genetic Diversity Network VHC: Vírus da Hepatite C (Hepatitis C vírus) V1 a V5: Regiões variáveis da gp120 WHO: WORLD HEALTH ORGANIZATION %: Porcentagem 24 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................26 2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................................30 2.1 VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA .....................................................................30 2.1.1 Aspectos epidemiológicos. .........................................................................................30 2.1.2 Classificação genética, estrutura e ciclo de replicação ............................................30 2.1.3 Transmissão .................................................................................................................36 2.1.4 Curso Clínico da Infecção pelo HIV ............................................................................36 2.1.5 Terapia Antirretroviral (TARV) ....................................................................................37 2.2 VÍRUS DA HEPATITE C (VHC) ........................................................................................38 2.2.1 Aspectos epidemiológicos ..........................................................................................38 2.2.2 Classificação, estrutura e ciclo de replicação ...........................................................39 2.2.3 Transmissão. ................................................................................................................41 2.2.4 Curso Clínico da Infecção pelo VHC ..........................................................................42 2.2.5 Tratamento Hepatite C .................................................................................................42 2.3 COINFECÇÃO DO HIV COM VHC ...................................................................................43 2.4 CÉLULA NATURAL KILLER (NK).. ................................................................................43 2.5 RECEPTORES KIR ..........................................................................................................44 2.6 LIGANTES DE KIR. ..........................................................................................................48 3 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................................50 4 OBJETIVOS ........................................................................................................................51 4.1 Objetivo Geral .................................................................................................................51 4.2 Objetivos Específicos .....................................................................................................51 5 CASUÍSTICA E MÉTODOS .................................................................................................52 5.1 Casuística ........................................................................................................................52 5.2 Métodos ...........................................................................................................................53 5.2.1 Processamento inicial das amostras .........................................................................53 5.2.2 Subtipagem viral dos pacientes monoinfectados HIV-1 e coinfectados ..................54 5.2.3 Genotipagem viral dos pacientes monoinfectados VHC e coinfectados .................56 25 5.2.4 Genotipagem dos genes KIR ......................................................................................57 5.2.5 Tipagem do HLA de classe I: A, B e C ........................................................................61 5.2.6 Análise de prontuários ................................................................................................62 5.2.7 Análise dos Dados .......................................................................................................62 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...........................................................................................64 6.1 Triagem das amostras: Confirmação da infecção pelo HIV-1 e/ou VHC .....................64 6.2 Subtipagem e inferência do fenótipo do arco da alça V3 do HIV-1 .............................67 6.3 Variáveis relacionadas a infecção ocasionada pelo HIV-1 ..........................................71 6.4 Terapia antirretrovial (TARV) .........................................................................................73 6.5 Variáveis relacionadas a infecção ocasionada pelo VHC ............................................75 6.6 Terapêutica anti-VHC ......................................................................................................77 6.7 Frequência dos genes KIR entre os grupos de monoinfectados HIV-1, monoinfectados VHC e coinfectados HIV-1/VHC................................................................79 6.8 Análise da correlação dos polimorfismos (do hospedeiro) de genes KIR com a evolução da infecção pelo HIV-1 .........................................................................................82 6.9 Análise da correlação dos polimorfismos (do hospedeiro) de genes KIR com variáveis relacionadas a evolução da infecção pelo VHC .................................................84 6.10 Frequência absoluta e relativa dos ligantes de KIR ...................................................86 6.11 Frequência de KIR e seus ligantes ..............................................................................87 6.12 Análise da correlação dos polimorfismos (do hospedeiro) de genes KIR associados a seus ligantes com variáveis relacionadas a infecção pelo HIV-1 e pelo VHC ...............88 7 CONCLUSÃO ......................................................................................................................89 8 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................91 9 ANEXOS ........................................................................................................................... 107 26 1 INTRODUÇÃO O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) constitui o agente etiológico de uma infecção que conduz ao comprometimento progressivo do sistema imune resultando em uma síndrome denominada aids (LEMP et al., 1990). A vulnerabilidade humana a infecção pelo HIV não é uniforme, fatores virológicos e do hospedeiro são determinantes não só quanto ao risco da transmissão, mas também quanto à evolução natural da infecção (ABBAS; LICHTMAN, 2005). Vários estudos vêm demonstrando a diversa variabilidade interindividual na resposta a infecção pelo HIV. Essa variabilidade se deve a progressão da doença, transmissão, susceptibilidade a infecção pelo vírus e fenótipos que variam de indivíduos assintomáticos com um melhor prognóstico a até indivíduos com alta viremia e progressão rápida, culminando em aids e morte (PETZL-ERLER, 1999). Alterações fenotípicas virais relacionadas à terceira região variável da gp120 do HIV também afetam a progressão da infecção, sendo esta região viral essencial ao ciclo replicativo do vírus. A alça V3 da gp120 é constituída de aproximadamente 35 aminoácidos (CANN et al., 1992), com sequência CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC (STANFIELD et al., 1999) nos vírus do subtipo B, mais frequente no Brasil (FOLEY; KORBER, 1995). Estudos vêm demonstrando que algumas variantes B isoladas no Brasil apresentam uma modificação na sequência desta região, onde uma prolina é substituída por um triptofano gerando a sequência GWGR no arco da alça V3 (GALVÃO-CASTRO et al., 1996), designada B’, também denominada por alguns autores como B-Br ou B” (NAGANAWA et al.,1997) e, como é amplamente distribuída no Brasil, com proporção em torno de 40% entre os isolados de subtipo B, sugere-se que ela surgiu ou foi introduzida desde o início da epidemia (MORGADO et al., 1994). Estudos conduzidos com isolados virais do Brasil vêm demonstrando que pacientes infectados com a variante B’ do HIV, apresentam um maior tempo entre a 27 infecção e a progressão para aids, conduzindo então a um melhor prognóstico. Esse efeito protetor da variante B’ parece também apresentar uma relação com o sexo feminino (SANTORO-LOPES et al., 2000; CASSEB et al., 2002; BRITO et al., 2006). Algumas células infectadas pelo HIV são capazes de formar células gigantes multinucleadas, que podem produzir grandes quantidades de vírus, essa característica é denominada indução de sincício (WIGDAHL; GUYTON; SARIN, 1987) e também está relacionada à sequência de aminoácidos da região da alça V3. Assim, o HIV pode ser classificado, quanto a citopatogenicidade, em indutor de sincício (SI) e não indutor de sincício (NSI), sendo que, vírus NSI já foram relacionados a fase inicial da doença, assintomática e com melhor prognóstico (ROSS et al., 1992), enquanto que o fenótipo SI foi associado a um pior prognóstico e imunodepressão pronunciada, caracterizando progressão da infecção (JORDAN et al., 1991). O HIV apresenta tropismo por células CD4+, podendo infectar células do sistema imune que expressam esse marcador de superfície, como linfócitos T, células dendríticas e macrófagos, que são fundamentais para o desenvolvimento da resposta imunológica celular (ABBAS; LICHTMAN, 2005). O sistema imune inato é nossa primeira linha de defesa contra organismos invasores e entre os diferentes constituintes desta linha imunológica do organismo (ABBAS; LICHTMAN, 2005; MALE et al., 2006) estão as células natural killer (NK), uma subpopulação de linfócitos, fundamentais na resposta contra infecções virais (COOPER et al., 2001; MIDDLETON et al., 2003; ABBAS; LICHTMAN, 2005). O controle da atividade das células NK é realizado pela presença de receptores de ativação e inibição, dentre estes, encontram-se um grupo de receptores denominados como KIR (killer immunoglobulin-like receptors) que contribuem para a regulação da função destas células pelo reconhecimento de ligantes ao HLA de classe I (Antígeno Leucocitário Humano) do Complexo Principal de Histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex-MHC) nas células alvo (ABBAS; LICHTMAN, 2005; QI et al., 2006). 28 Estudos têm proposto uma associação de polimorfismos dos genes KIR com a progressão da infecção pelo HIV (QI et al., 2006; CARRINGTON; MARTIN; VAN BERGEN, 2008; TIEMESSEN et al., 2011; MARUTHAMUTHU et al., 2014 ). Os genes KIR3DL1 e KIR3DS1 apresentam-se como variantes alélicas no mesmo lócus, sendo que ambos os grupos de alelos neste lócus apresentaram envolvimento na patogênese do HIV (MARTIN et al., 2003). O receptor ativatório KIR3DS1 foi correlacionado a uma alta capacidade inibitória da replicação do HIV-1, com menor carga viral e lento declínio de células T CD4 + (MARTIN et al., 2002; QI et al., 2006; ALTER et al., 2007). Da mesma forma, várias combinações alélicas do receptor inibitório KIR3DL1 ligante de HLA-Bw4, foi associada a uma menor carga viral do HIV-1 e progressão mais lenta para aids (MARTIN et al., 2007). Relatos recentes têm também demonstrado que as células NK expressam genes KIR que podem estar associados a uma evolução da infecção viral pelo HIV (ALTER et al., 2011), como é o caso dos receptores KIR2DS2 e KIR2DL2 que já foram relacionados a um rápido declínio da taxa de células T CD4+ (GAUDIERI, 2005). Atualmente muitos pacientes infectados com HIV apresentam também, infecção pelo Vírus da Hepatite C (VHC). Na população mundial, aproximadamente 40% das pessoas que são infectadas pelo HIV, são coinfectadas pelo VHC, devido à similaridade nas vias de transmissão (DIETERICH; PUROW; RAJAPAKSA, 1999). No Brasil a coinfecção HIV/VHC foi referida em 11,4% do total de casos confirmados entre os anos de 2007 e 2010 (BRASIL, 2011). Esta porcentagem pode variar dependendo dos diferentes grupos de risco, sendo elevada entre usuários de drogas injetáveis e hemofílicos (DODIG; TAVILL, 2001). Estudos tem também demonstrado a relação de polimorfismo em genes KIR com a progressão da infecção pelo VHC (KNAPP et al., 2010; VASCONCELOS et al., 2013; VIDAL-CASTINEIRA et al., 2014). 29 Quando ocorre a coinfecção por estes dois vírus, HIV e VHC há um pior prognóstico para ambas as infecções (MELLO; PIRES, 2004). A presença do VHC associado ao HIV vem sendo relacionada a algumas alterações na progressão da infecção pelo HIV. Estudo anterior demonstrou, em caráter inédito, que o efeito “protetor” da variante B’ do HIV em coinfectados HIV/VHC é perdido (MASSOLINI, 2011). Embora vários estudos já tenham relatado uma associação de alguns polimorfismos dos genes KIR com a progressão da infecção pelo HIV em monoinfectados, não há muitas informações sobre a influência desses polimorfismos genéticos na população coinfectada HIV/VHC. 30 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) 2.1.1 Aspectos epidemiológicos A aids foi descrita pela primeira vez no ano de 1981 nos Estados Unidos, quando o Centro de Controle e Prevenção de Doenças do governo americano (CDC) relatou que um grupo de pacientes jovens, homossexuais masculinos, exibiam uma série de sintomas, incluindo casos de pneumonia por Pneumocystis jirovecii (carinii), sarcoma de Kaposi, perda de peso súbita, linfadenopatia e supressão geral da função imune (DREW et al., 1981). Atualmente a infecção pelo HIV representa um dos maiores problemas de saúde pública mundial, afetando, segundo dados da UNAIDS (Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV / AIDS) cerca de 35 milhões de indivíduos no mundo (UNAIDS, 2014), sendo que no Brasil é estimado que 734 mil pessoas estejam infectadas (BRASIL, 2014a). 2.1.2 Classificação genética, estrutura e ciclo de replicação O HIV é classificado em dois tipos, o HIV-1 que estabelece uma epidemia global e o HIV-2 com maior prevalência no oeste da África (PANTALEO; GRAZIOSI; FAUCI, 1993). O HIV-1 é ainda subdividido em quatro grupos, M (Major), O (Outlier), N (non-M, non-O) e mais recentemente, P (PLANTIER et al., 2009). O grupo M ainda se subdivide em subtipos (A, B, C, D, F, G, H, J e K) o que evidencia a grande diversidade genética viral (SIMON et al., 1998), a qual se eleva ainda mais pela presença das formas recombinantes circulatórias (CRFs) (TAVEIRA, 2002). Entre os subtipos do HIV-1, o subtipo B é encontrado na Europa e nas Américas, mas apresenta uma frequência menor na África e na Ásia, onde os subtipos A, C, D e E são predominantes (REQUEJO, 2006). No Brasil, estudos indicam que aproximadamente 80% das infecções pelo HIV-1 são ocasionadas pelo subtipo B, sendo este subtipo prevalente na maioria das regiões geográficas, seguido 31 pelos subtipos F, recombinantes B/F e subtipo C (QUEIROZ et al., 2007; GALVÃO- CASTRO et al., 1996). Entretanto a região Sul do País tem se caracterizado pela maior frequência do subtipo C (SANTOS et al., 2007). Com 100 nm de diâmetro, o HIV é um retrovírus do gênero Lentivirus (GALLO et al., 1984; ABBAS; LICHTMAN, 2005), cuja estrutura é constituída por um core proteico envolvendo duas moléculas de RNA idênticas de, aproximadamente, 9,2 kb, que constituem seu genoma e enzimas virais (transcriptase reversa, integrase e protease), circundados por um envelope lipoproteico, no qual se inserem as glicoproteínas de membrana gp120 e gp 41 (Figura 1) (CONNOR; HO, 1992; FREED; MARTIN, 2001). Membrana Lipídica gp 120 gp 41 Transcriptase reversa Matriz Capsídeo Figura 1: Esquema representativo da estrutura do HIV, evidenciando RNA viral, glicoproteínas do envelope gp41 e gp120, proteína da matriz (p17), proteínas do capsídeo (p24) e a enzima transcriptase reversa (Adaptado de NIAID, 2004). O genoma do HIV codifica genes estruturais (gag, pol, env), acessórios (nef, vpu, vif e vpr) e regulatórios (tat e rev) (BARRÉ-SINOUSSI, 1996). Entre os genes estruturais, gag codifica uma poliproteína a qual após clivagem origina as proteínas da matriz, capsídeo e nucleocapsídeo virais, env codifica as glicoproteínas do envelope gp120 e gp41 e pol codifica as enzimas transcriptase reversa, protease e integrase, essenciais ao ciclo replicativo viral (CONNOR; HO, 1992). O RNA viral é ainda flanqueado por sequências não traduzidas, as Long Terminal Repeats (LTRs), importantes na replicação viral (Figura 2) (VARMUS; BROWN, 1989). 32 Figura 2: Representação esquemática do Genoma do HIV, evidenciando os genes estruturais (gag, pol, env), acessórios (nef, vpu, vif e vpr), regulatórios (tat e rev) e as LTRs (Adaptado de RUBBERT; BEHRENS; OSTROWSKI, 2006). Dos três genes estruturais o gene env é o que possui maior variabilidade genética e essa característica favorece o escape ao sistema imune do hospedeiro (FREED; MARTIN, 2001). As duas glicoproteínas codificadas por este gene (gp120 e gp41) estão envolvidas na fusão e entrada do vírus na célula hospedeira (CONNOR; HO, 1992). A gp41 é uma proteína transmembrana com o domínio N-terminal externo e o domínio C-terminal interno à partícula viral, envolvida na fusão do envelope viral e membrana da célula hospedeira (CHAN et al., 1997). A gp120 é uma proteína que apresenta cinco regiões constantes (C1 a C5) e cinco regiões variáveis (V1 a V5) (STARCICH et al., 1986; KOHLSTAEDT et al., 1992), sendo responsável pela ligação com o receptor viral na superfície da célula hospedeira (Figura 3) (TAVEIRA, 2002). Genes estruturais Genes regulatórios Genes acessórios Proteína da matriz Proteína do capsídeo Proteína do nucleocapsídeo Enzimas essenciais ao ciclo replicativo viral Glicoproteínas do envelope envolvidas na fusão das membranas celular e viral e internalização do nucleocapsídeo viral Importante para a replicação viral 33 Figura 3: Representação da estrutura da gp120, evidenciando seus domínios interno e externo, além de uma região de ligação em forma de “β-sheet” (folha-beta), que é denominada Bridging Sheet. (Adaptado de WYATT et al., 1998). A molécula de CD4 se liga a uma cavidade da gp120 formada na junção entre os domínios interno, externo e a Bridging Sheet, enquanto que o correceptor liga-se provavelmente a uma região na base da proteína, entre a terceira região variável (alça V3) e a Bridging Sheet (WYATT; SODROSKI, 1998). A primeira etapa para o ciclo replicativo viral envolve a interação da gp120 do envelope viral com o marcador de superfície celular CD4 na célula-alvo. Após a interação inicial, a terceira região variável da gp120 (V3) torna-se exposta e apta à ligação com correceptores (CCR5 e/ou CXCR4) (CLAPHAM; WEISS, 1997). As interações com os correceptores conduzem a condições necessárias para a fusão das membranas celular e viral, processo mediado pela gp41 (CAFFREY et al., 1998), ocorrendo internalização do nucleocapsídeo do vírus (Figura 4) (KATZ; SKALKA, 1994). DOMÍNIO EXTERIOR haste Região de ligação: Bridging Sheet (Folha-ponte) 34 Figura 4: Representação esquemática da interação da gp 120 da membrana viral com o marcador de superfície celular CD4 na célula-alvo, expondo a terceira região variável da gp120 (V3) a qual se torna apta a ligação com os correceptores CCR5 e/ou CXCR4, conduzindo à condições necessárias para a fusão das membranas celular e viral, processo que é mediado pela gp41, ocorrendo internalização do nucleocapsídeo viral e continuidade do ciclo replicativo do HIV (Adaptado de LITWAK, 2009). Após liberação do genoma viral no citoplasma da célula, a enzima transcriptase reversa converte o RNA em DNA, o qual é integrado ao genoma celular pela ação da enzima integrase, formando um provírus. Para que ocorra a transcrição dos genes do provírus integrado é necessário à ativação da célula T por antígenos ou citocinas. Após essa ativação, ocorre a transcrição do DNA, produzindo então o RNA mensageiro, o qual é transportado do núcleo para o citoplasma, onde é traduzido e assim as proteínas do HIV são sintetizadas. A protease viral cliva as proteínas recém formadas em fragmentos menores, e em seguida ocorre montagem das partículas virais. Após essa montagem, os vírions são liberados da célula por um processo de brotamento da membrana plasmática, ficando livres para infectar outras células e reiniciar o ciclo de replicação (ABBAS; LICHTMAN; PILLAI, 2008; KLIMAS et al., 2008). Assim, pode-se notar que a terceira região variável da gp120 é essencial ao 35 ciclo replicativo viral. Esta região é constituída de aproximadamente 35 aminoácidos (DALGLEISH et al., 1984; CANN et al., 1992), com sequência CTRPNNNTRKSIHIGPGRAFYTTGEIIGDIRQAHC (STANFIELD et al., 1999). A formação de ponte dissulfeto entre os dois resíduos de cisteina das posições 296 e 331 da gp120 conferem a esta região uma conformação em alça. No topo da alça encontra-se uma região conservada, a sequência Glicina-Prolina-Glicina-Arginina (GPGR) (Figura 5) (FOLEY; KORBER, 1995). Estudos vêm demonstrando que algumas variantes B isoladas no Brasil apresentam uma modificação na sequência desta região, onde uma prolina é substituída por um triptofano gerando a sequência GWGR no arco da alça V3 (GALVÃO-CASTRO et al., 1996), designada B’, também denominada por alguns autores como B-Br ou B” (NAGANAWA et al.,1997) e, como é amplamente distribuída no Brasil, sugere-se que ela surgiu ou foi introduzida desde o início da epidemia (MORGADO et al., 1994). Figura 5: Representação esquemática da terceira região variável da gp120 do HIV-1 (alça V3), evidenciando a região conservada GPG no subtipo B e os dois resíduos de cisteina que se ligam por ponte dissulfeto dando, então, a essa região uma conformação em alça (Adaptado de WILLIAM, 2008). 36 Sendo a alça V3 a principal região imunodominante do HIV, induzindo a formação de anticorpos neutralizantes e funcionando como alvo da resposta celular citotóxica (GOUDSMIT et al., 1988; KENEALY et al., 1989), modificações na estrutura secundária da proteína como a presença do GWG no lugar do GPG na região do arco da alça V3 podem alterar a antigenicidade e, consequentemente a resposta imunológica ao HIV (GALVÃO-CASTRO et al., 1996). 2.1.3 Transmissão As principais vias de transmissão do HIV são a sexual, a vertical de mãe para filho, através de sangue ou secreções contaminados, através do compartilhamento de agulhas contaminadas e por acidentes ocupacionais (MANAVI, 2006; LEVY, 2009). 2.1.4 Curso Clínico da Infecção pelo HIV Após a infecção inicial é observado um período de incubação que pode variar de 3 a 6 semanas, durante essa fase ocorre um rápido aumento da replicação viral e queda inicial da contagem de linfócitos T CD4+. Neste período, o vírus inicia sua disseminação pelo organismo principalmente através dos tecidos linfáticos, podendo o indivíduo infectado apresentar-se assintomático ou com sintomas inespecíficos (BRASIL, 2011a). A infecção pelo HIV até o desenvolvimento de aids apresenta um curso clínico clássico, o qual pode didaticamente ser dividido em três etapas distintas: fase aguda, fase de latência clínica e aids (Figura 6) . 37 Figura 6: Curso Clínico da Infecção pelo HIV. A fase aguda é caracterizada pelo rápido aumento da replicação viral e queda inicial da contagem de linfócitos T CD4+, essa fase pode apresentar-se assintomática ou com sintomas inespecíficos, sendo denominada como Síndrome Retroviral Aguda, com uma duração em torno de 1 a 4 semanas, o que pode dificultar o diagnóstico precoce da infecção. Esta fase é parcialmente controlada por uma rápida resposta do sistema imune que permite, em parte, a estabilização da replicação viral (set point viral) e a restauração parcial dos níveis de linfócitos T CD4+, dando início à fase crônica da infecção (FAUCI et al., 1996). A fase crônica se caracteriza por um longo período assintomático onde a replicação viral se mantém estabilizada, enquanto os níveis de T CD4+ diminuem lentamente. Esta fase pode ter uma duração em média de 4 a 10 anos (BACCHETTI; MOS, 1989). Quando os níveis de linfócitos T CD4+ diminuem drasticamente (geralmente com contagem abaixo de 200 células/mm3) e o sistema imune se torna ineficaz no combate a agentes externos, permanecendo o hospedeiro vulnerável ao aparecimento de infecções oportunistas, identifica-se a fase de aids (PEDERSEN et al., 1989), na qual se o paciente não for tratado pode ir a óbito (Adaptado de AN; WINKLER, 2010). 2.1.5 Terapia antirretroviral (TARV) Os antirretrovirais surgiram na década de 1980 e apresentam como objetivo reduzir a replicação do vírus no organismo, diminuindo a morbidade e mortalidade Aids 38 melhorando a qualidade e expectativa de vida das pessoas, contudo, não erradicam a infecção pelo HIV (BRASIL, 2013). Foi observado, que após manter a carga viral indetectável, as pessoas com reconstituição imune em uso da terapia antirretroviral conseguem obter contagem de linfócitos T CD4+ acima de 500 células/mm3, o que é esperado, atingindo expectativa de vida muito próxima a da população geral (BRASIL, 2013). Atualmente o Ministério da Saúde, disponibiliza vários medicamentos para compor a terapia antirretroviral, sendo que já entraram no mercado 22 drogas, as quais são divididas em seis classes, Inibidores Nucleosídeos da Transcriptase Reversa análogos de nucleosídeos e nucleotídeos (ITRN/ITRNt) que apresentam a capacidade de se incorporar a cadeia de DNA viral, atuando por interação específica à enzima transcriptase reversa (HALLAL et al, 2010); Inibidores Não Nucleosídeos da Transcriptase Reversa (ITRNN), os quais bloqueiam a ação da enzima transcriptase reversa e a multiplicação do vírus diretamente, sem utilizar nucleosídeos (RANG et al, 2012); Inibidores de Protease (IP) que impedem a produção de novas cópias do HIV, atuando na enzima protease do vírus (RANG et al, 2012); Inibidores de fusão, agem bloqueando a entrada do vírus na célula e, consequentemente, sua reprodução por se ligarem especificamente à uma proteína do HIV (BRITO, 2011); Inibidores da Integrase, os quais inibem a replicação viral por bloquear a atividade desta enzima (POMMIER, 2005) e os Antagonistas de correceptores CCR5 , que previnem a interação da glicoproteína viral gp120 com o receptor celular CCR5, necessário para a entrada do vírus nas células do hospedeiro (BRITO, 2011; MIRANDA, 2010). 2.2 VÍRUS DA HEPATITE C (VHC) 2.2.1 Aspectos epidemiológicos O VHC foi descrito pela primeira vez em 1989 como sendo o agente etiológico associado a hepatites não-A e não-B por Choo e colaboradores (CHOO et al., 1989). Atualmente, dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) indicam que 39 aproximadamente 180 milhões de indivíduos estejam infectados no mundo e, que no Brasil exista cerca de 2 a 3 milhões de pessoas infectadas, sendo que, a maioria desconhece esse diagnóstico (BRASIL, 2014b). 2.2.2 Classificação, estrutura e ciclo de replicação O VHC é do gênero Hepacivirus, família Flaviviridae (ROMANOS; SANTOS; WIGG, 2002; SIMMONDS et al., 2005), sua classificação é baseada na topologia de árvores obtidas através de análises filogenéticas entre diferentes variante virais, sendo classificado em seis genótipos principais denominados de 1 a 6 e vários subtipos (a, b, c, etc), sendo que um novo genótipo, designado genótipo 7 foi recentemente descrito (MURPHY et al., 2007). Além dos genótipos e subtipos, múltiplos variantes virais podem estar presentes em um mesmo indivíduo infectado, originando as quasispecies (ROSEN; GRETCH, 1999; LAUER; WALKER, 2001; SIMMONDS et al., 2005). A distribuição dos genótipos do VHC é distinta nas diferentes regiões geográficas (ALVARIZ, 2004), sendo os genótipos 1, 2 e 3 os mais frequentes no Japão, Europa e nas Américas do Norte e do Sul; os genótipos 4 e 5 na África e no Oriente Médio e o genótipo 6 no Sudeste da Ásia (NAINAN et al., 2006; GOTTWEIN; BUKH, 2008). No Brasil, o genótipo 1 é o mais prevalente, seguido pelo 3 e 2 (CAMPIOTTO et al., 2005; CORVINO et al., 2006). O VHC possui genoma de RNA fita simples de aproximadamente 9,7 kb, flanqueado por duas regiões não traduzidas 5’ e 3' UTR (untranslated regions) (Figura 7). O RNA viral possui apenas uma região aberta de leitura (Open reading frame), a qual codifica uma poliproteína precursora que é clivada por proteases celulares e virais dando origem às proteínas estruturais, como a proteína C (core) e glicoproteínas de membrana E1 e E2/NS1 e às proteínas não estruturais (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B) que estão envolvidas na replicação viral (Figura 8) (ROSEN; GRETCH, 1999; SIMMONDS et al., 2005). 40 Figura 7: Esquema representativo da estrutura do VHC, evidenciando RNA viral, core protéico, proteínas do envelope e envelope viral (Adaptado de PERKINS, 2001). Figura 8: Representação esquemática da organização do RNA genômico do VHC, evidenciando as regiões 5’UTR que contêm IRES (Internal Ribossome Entry Site) e a 3’UTR que flanqueiam a ORF (Open Reading Frame), cuja poliproteína correspondente é clivada em proteínas estruturais e não estruturais, onde estão representados seus produtos proteicos e suas respectivas funções (Adaptado de PENIN et al., 2004). O ciclo replicativo tem início quando partículas virais circulantes associadas a lipoproteínas de alta e baixa densidade se ligam através destas nas superfícies das células do hospedeiro e tem a entrada na célula mediada por receptores/ co- PROTEÍNAS DO ENVELOPE ENVELOPE RNA VIRAL CORE PROTÉICO Região Estrutural Região Não-Estrutural Core Glicoproteínas do envelope Responsável pela protease do sítio NS2/NS3 (Nucleocapsídeo) Maturação e infectividade viral - Serina-Proteína - Helicase - Nucleotído-trifosfatase Cofator: Necessário para função de uma enzima Pode estar envolvida na resistência do antiviral interferon Necessário para replicação viral, sendo um excelente alvo para a terapia antiviral REGIÃO ABERTA DE LEITURA 41 receptores de superfície celular, como receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R), Scavenger Receptor Classe B tipo I (SR-BI), a tetraspanina Diferenciação celular 81 (CD81), claudinas (CLDN) e ocludinas (OCLN) (TANG; GRISE, 2009). As partículas virais são reconhecidas pelos receptores celulares por intermédio das proteínas do envelope E1 e E2. Após a etapa de reconhecimento ocorre a entrada na célula através de endocitose mediada por receptor (BARTENCHSCHLAGER; LOHMAN; PENIN, 2013). Posteriormente, o endossoma formado sofre acidificação, o que induz a fusão das glicoproteínas da membrana fazendo com que ocorra a liberação do genoma viral no citosol da célula hospedeira (MORADPOUR; PENIN; RICE, 2007). Com a liberação do material genético, o IRES promove o início da tradução da poliproteína que segue com a produção das proteínas virais. Para a montagem da nova partícula viral as proteínas estruturais associam-se (core) ou integram-se (E1, E2 e p7) com a membrana do retículo endoplasmático (RE) e formam oligômeros funcionais. As proteínas não estruturais formam a maquinaria de replicação viral e para isso se associam do lado citoplasmático da membrana do RE onde interagem entre si e com as proteínas da célula hospedeira. Essa maquinaria usa seu próprio genoma como molde para transcrição de fita complementar negativa de RNA. A fita negativa serve como uma molécula replicativa intermediária na síntese de uma nova molécula de RNA de polaridade positiva que pode ser usada para tradução, replicação ou então ser empacotada para constituir novos vírus (DE FRANCESCO et al., 2003). 2.2.3 Transmissão A transmissão ocorre através do contato com sangue contaminado por transfusão de sangue, compartilhamento de material para uso de drogas (seringas, agulhas, entre outros), higiene pessoal (lâminas de barbear e depilar, por exemplo), ou para confecção de tatuagens. Pode ocorrer de mãe para filho durante a gravidez, ou por relação sexual, no entanto essas duas vias são bem mais raras, desta maneira a hepatite C não é considerada uma doença sexualmente transmissível clássica (BRASIL, 2014b). 42 2.2.4 Curso Clínico da Infecção pelo VHC A hepatite C crônica é geralmente assintomática durante a maior parte da evolução e uma das complicações tardias da infecção é a fibrose hepática, que quando progressiva pode alterar a função hepática e o fluxo sanguíneo local (ROCKEY; FRIEDMAN, 2006). Embora aproximadamente 70-80% dos indivíduos portadores de VHC evoluam para a forma crônica da doença com progressão da fibrose hepática, aproximadamente 20% dos infectados erradicam o vírus em semanas ou meses depois da infecção (HALLIDAY; KLENERMAN; BARNES, 2011) caracterizando o denominado clareamento viral espontâneo. O clareamento viral é definido como a não detecção do RNA viral no plasma ou soro do paciente com sorologia anti-VHC reagente em pacientes que não realizaram tratamento específico (ALTER, 1997; BRASIL, 2011b). A cirrose hepática ocorre em aproximadamente 20% dos casos que evoluem para a forma crônica da doença, geralmente após 15 a 20 anos de infecção e o hepatocarcinoma é detectado em 1 a 3% dos casos de cirrose ao ano. No entanto, a evolução para cronicidade está na dependência de fatores virais, como carga viral e genótipo do VHC e fatores do hospedeiro como sexo, idade, uso de álcool ou coinfecção com outros vírus (STRAUSS, 2001). 2.2.5 Tratamento Hepatite C Os medicamentos utilizados no tratamento da Hepatite C crônica incluem alfainterferona alfa 2b, alfapeginterferona alfa 2a e alfa 2b, ribavirina, alfaepoetina, filgrastima, telaprevir e boceprevir (BRASIL, 2011b). Para analisar a eficiência do tratamento é realizado o monitoramento da resposta virológica, sendo que, para isso é realizado exame quantitativo para detecção do RNA do VHC. Os critérios para avaliação do tratamento definem que para obtenção de uma resposta virológica sustentada (RVS) é necessário que o RNA do VHC esteja indetectável na 24ª semana de seguimento, após o término do tratamento (BRASIL, 2011b). 43 2.3 COINFECÇÃO DO HIV COM O VHC A debilitação imunológica causada pelo HIV acaba conduzindo a evolução da infecção pelo VHC e ao rápido curso natural da infecção, reduzindo aproximadamente de 30 para 7 anos o comprometimento hepático com aparecimento de cirrose e carcinoma hepatocelular, que constituem importante causa de morte em pacientes infectados com HIV (MELLO; PIRES, 2004). O VHC, do mesmo modo, parece acelerar a progressão da infecção pelo HIV para aids e morte, dificultando a reconstituição do sistema imune e aumentando o risco de hepatotoxicidade (POCKROS, 2003). Desta maneira, a coinfecção HIV/VHC ocasiona um pior prognóstico para ambas as infecções (MELLO; PIRES, 2004). 2.4 CÉLULAS NATURAL KILLER (NK) As células NK apresentam-se como grandes linfócitos com numerosos grânulos citoplasmáticos distintos dos linfócitos T e B e são derivadas de precursores da medula óssea com capacidade de realizar sua função de morte sem a necessidade de expansão clonal e diferenciação. Constituem cerca de 5 a 15% das células mononucleares do sangue e baço e são raras em outros órgãos linfóides (ABBAS; LICHTMAN, 2005). Apresentam função crucial na resposta imune inata, especialmente contra infecções virais e células tumorais, devido a sua capacidade de lise celular sem sensibilização prévia e, pela produção de citocinas e quimiocinas que mediam a resposta inflamatória (ABBAS; LICHTMAN, 2005). As células NK usam receptores codificados pelo DNA em sua configuração germinativa para diferenciar células infectadas por patógenos de células saudáveis. Esses receptores detectam a variabilidade de expressão das moléculas de HLA (ausência ou diminuição) na superfície celular, contribuindo para a regulação da 44 atividade das NK, sendo esse mecanismo conhecido como teoria do missing self (reconhecimento do próprio) (ABBAS; LICHTMAN, 2005). Um dos grupos de receptores que contribuem para a regulação da função das células NK através do reconhecimento de ligantes ao HLA de classe I nas células-alvo são os receptores KIR (receptores semelhantes às imunoglobulinas das células NK, do inglês killer immunoglobulin-like receptors) (ABBAS; LICHTMAN, 2005; QI et al., 2006). 2.5 RECEPTORES KIR Os receptores KIR pertencem à superfamília das imunoglobulinas e são constituídos por uma porção extracelular, uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática (KIKUCHI-MAKI et al., 2003). Os genes que codificam esses receptores estão inseridos em uma região conhecida como LCR (leucocyte receptor complex), localizada no cromossomo 19p13.4 (MIDDLETON; CURRAN; MAXWELL, 2002), que é altamente polimórfica em humanos e, seu extensivo polimorfismo vem sendo associado a história natural da infecção pelo HIV (UHRBERG et al.,1997 ; QI et al., 2006). A nomenclatura dos genes KIR é definida pelo subcomitê The Human Genome Organization (HUGO) e o HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) e, é baseada na estrutura das moléculas que eles codificam (CARRINGTON; NORMAN, 2003). Na nominação, posteriormente a expressão KIR, o primeiro dígito refere-se ao número de domínios extracelulares na molécula, seguido pela letra D que denota “domínio.” As moléculas podem ter dois ou três domínios, sendo, portanto, 2D ou 3D, respectivamente (Figura 9) (VILCHES; PARHAM, 2002; PISEGNA et al., 2004). As caudas citoplasmáticas podem ser longas ou curtas, sendo designadas pela letra “L” (do inglês long), quando longas, pela letra “S” (do inglês short), quando curtas ou ainda pela letra “P”, se forem pseudogenes. O dígito final indica o número do gene 45 que codifica a proteína com essa estrutura. Desta forma, KIR3DL1 e KIR3DL2 codificam receptores contendo três domínios extracelulares e cauda citoplasmática longa (VILCHES; PARHAM, 2002). Nos casos em que dois ou mais genes codificam estruturas moleculares e sequências semelhantes, eles deverão ser designados pelo mesmo número, seguido de uma letra final, por exemplo, KIR2DL5A e KIR2DL5B (GOMEZ-LOZANO et al., 2002). As porções transmembrana e citoplasmáticas das moléculas estão ligadas à atividade funcional dos receptores KIR, sendo que os de cauda longa são inibitórios por possuírem um ou dois epítopos denominados ITIM (motivo de inibição a base de tirosina do imunorreceptor do inglês immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs) que liberam sinais inibitórios e ativam a proteína tirosina fosfatase (PTP) que supri a atividade da proteína tirosina cinase (PTK) bloqueando as vias de sinalização dos receptores de ativação, suprimindo a atividade das células NK, tendo ausência de morte celular, já os de cauda curta não apresentam ITIM, porém possuem um aminoácido no domínio transmembrana que permite associação com a molécula DAP-12 que libera sinais ativatórios por meio de ITAM (motivo de ativação à base de tirosina do imunorreceptor do inglês immunoreceptor tyrosinebased activating motifs) (Figura 10) ativando a proteína tirosina cinase (PTK) desencadeando a destruição da célula alvo (VILCHES; PARHAM, 2002; ABBAS; LICHTMAN, 2005). O KIR2DL4 é uma exceção, pois tem uma estrutura única com a combinação de um ITIM na cauda citoplasmática e um aminoácido no domínio transmembrana. Estudos recentes indicam que KIR2DL4 se associa à proteína acessória FcεRI-γ que envia sinais estimulatórios à célula via ITAM, similarmente à DAP-12 (KIKUCHI-MAKI et al., 2005). 46 Figura 9: Organização molecular e nomenclatura dos genes KIR (Adaptado de MARAGON et al., 2008). Os genes KIR apresentam três tipos de domínios: D0, D1 e D2. Os receptores KIR com três domínios têm configuração D0-D1-D2, já as moléculas com dois domínios podem ter configuração D1- D2, chamadas de tipo 1 ou D0-D2, conhecidas como tipo 2 (PISEGNA et al., 2004). 47 Figura 10: Receptores de ativação e inibição das células NK e suas respectivas funções. A) Receptores de ativação das células NK reconhecem seus ligantes nas células-alvo levando a ativação da proteína tirosina cinase (PTK), sendo que durante o reconhecimento de células normais, ou seja, com expressão normal de moléculas do HLA de classe I, ocorre a supressão da atividade da PTK pela ligação dos receptores de inibição ocorrendo a ativação da proteína tirosina fosfatase (PTP). B) Durante uma infecção viral ou outro tipo de estresse ocorre a inibição da expressão de MHC de classe I pelas células, situação que também pode induzir a expressão de outros ligantes de ativação, onde é desencadeada a resposta das células NK, como morte das células-alvo e secreção de citocinas, pois o receptor de inibição não é engajado e o de ativação age sem oposições. C) Células com estresse devido a transformação neoplásica ou devido a infecções podem super expressar ligantes ativadores, o que induz a uma maior fosforilação da tirosina do que os receptores de inibição podem impedir, ocasionanado a morte da célula estressada (Adaptado de ABBAS; LICHTMAN, 2005). Em torno de 14 genes KIR e mais de 100 sequências desses genes foram relatadas, sendo classificados em dois haplótipos gerais conhecidos como A e B (Figura 11), que estão distribuídos com semelhança em caucasóides das populações brasileira, inglesa e argentina (CONTRERAS et al., 2007). Em estudo realizado com 116 indivíduos caucasóides brasileiros doadores voluntários de medula óssea, foi encontrada uma proporção de 51 e 49% de haplótipos A e B, respectivamente (JOBIM; JOBIM, 2008). No haplótipo A estão presentes os genes KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, 48 KIR2DS4, KIR3DL1, KIR3DL2 e KIR3DL3, contendo apenas um gene ativador, o KIR2DS4, totalizando sete genes (MAXWEL et al., 2002). Já o haplótipo B apresenta inúmeras combinações de genes ativadores KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1 e KIR2DS4 e os genes inibidores KIR2DL4, KIR3DL2, KIR3DL3 e KIR3DP1 (CARRINGTON; NORMAN, 2003). Todos os haplótipos KIR apresentam os genes KIR3DL3, KIR3DL2, KIR3DP1 e KIR2DL4, os quais são denominados “genes de moldura” do haplótipo (do inglês, frameworks) (TROWSDALE et al., 2001). Figura 11: Sequência dos genes KIR nos haplótipos A e B (Adaptado de MARAGON et al., 2008). 2.6 LIGANTES DE KIR O complexo HLA se localiza no cromossomo 6p21.3, uma região altamente polimórfica do genoma humano diferindo entre indivíduos e grupos populacionais, esse complexo é dividido em três regiões distintas onde estão presentes os genes do HLA responsáveis por codificar as proteínas de classe I, II ou III (FLORES- VILLANUEVA et al., 2003). Dentre os diversos genes do sistema HLA estudados até o momento, as moléculas de HLA de classe I clássicas (A, B e C) são os principais ligantes de KIR e também as que apresentam maior relação com a evolução da infecção pelo HIV-1 segundo a literatura (KAUER; MEHRA, 2009; LICHTERFELD et al., 2006). 49 O maior repertório de ligantes KIR são de alelos que derivam do HLA-C, que se divide em dois grupos (C1 e C2) devido ao aminoácido presente na posição 80 da molécula. O grupo C1 inclui os alelos HLA-C*01, C*03, C*07 e C*08 que são ligantes de KIR2DL2 e KIR2DL3 e o grupo C2 inclui os alelos HLA-C*02, C*04, C*05 e C*06 que são ligantes de KIR2DL1 e KIR2DS1. O KIR2DS4 interage com HLA-C1, C2 e A11. O HLA-B do grupo Bw4, que inclui HLA-B*08, B*13, B*27, B*44, B*51, B*52, B*53, B*57 e B*58 é ligante de KIR3DL1 e o HLA-A dos grupos HLA-A3 e HLA-A11 interagem com KIR3DL2. O KIR2DL4 se liga ao HLA-G, uma molécula de HLA de classe I não clássica, com pouco polimorfismo (Tabela 1). Ligantes para KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DL5, KIR2DS5, KIR3DS1 e KIR3DL3 permanecem indefinidos (MOESTA et al., 2010). Tabela 1: Epítopos dos Antígenos Leucocitários Humanos que são reconhecido pelos receptores semelhantes às imunoglobulinas das células NK . (Adaptado de PARHAM et al., 2012). Estudos têm proposto uma associação de polimorfismos dos genes KIR e de seus ligantes em alelos do HLA classe I com a progressão da infecção pelo HIV (CARRINGTON; MARTIN; VAN BERGEN, 2008; QI et al., 2006). 50 3 JUSTIFICATIVA Polimorfismos em genes KIR vêm sendo associados com a progressão da infecção pelo HIV (QI et al., 2006; CARRINGTON; MARTIN; VAN BERGEN, 2008). Estudos demonstraram a associação de alguns destes genes a uma baixa carga viral, lento declínio de células T CD4+, proteção contra infecções oportunistas e a uma progressão mais lenta para aids, da mesma maneira como alguns polimorfismos de KIR foram associados a uma alta carga viral, rápido declínio de células T CD4+ e progressão rápida para aids (MARTIN et al., 2002; GAUDIERI, 2005; QI et al., 2006; MARTIN et al., 2007). Até o momento, a maioria dos estudos que relataram associação de alguns polimorfismos dos genes KIR com a progressão da infecção pelo HIV, foram realizados apenas em indivíduos monoinfectados pelo HIV, sendo que, não há muitas informações sobre a relação destes polimorfismos, com a evolução da infecção pelo HIV em coinfectados pelo VHC, o que torna evidente a importância de um estudo neste aspecto. 51 4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo Geral • Analisar a evolução da infecção pelo HIV em pacientes coinfectados HIV/VHC, baseada em parâmetros clínicos, laboratoriais e virológicos, correlacionando polimorfismos (do hospedeiro) de genes KIR. 4.2 Objetivos Específicos • Determinar os subtipos do HIV-1 e genótipos do VHC; • Detectar os polimorfismos e verificar a frequência de distribuição dos genes KIR entre os grupos de monoinfectados HIV-1, monoinfectados VHC e coinfectados HIV-1/VHC; • Correlacionar os polimorfismos de genes KIR nos grupos de monoinfectados HIV-1 e de coinfectados (HIV/VHC) com a evolução da infecção pelo HIV-1; • Analisar a correlação dos polimorfismos (do hospedeiro) de genes KIR com variáveis relacionadas à infecção pelo VHC nos grupos de monoinfectados VHC e coinfectados HIV/VHC. 52 5 CASUÍSTICA E MÉTODOS 5.1 Casuística Foram incluídas no presente estudo 251 amostras (amostras de conveniência) coletadas durante o período de junho de 2013 até junho de 2014, as quais foram agrupadas em 3 grupos distintos com base na subtipagem (HIV) e genotipagem (VHC) viral, que encontram-se organizados da seguinte maneira: Grupo 1 (G1): 100 amostras de pacientes monoinfectados pelo HIV-1 subtipo B, selecionados aleatoriamente, convidados a participar do estudo por ocasião de sua coleta de rotina para o exame de carga viral plasmática no SAEI/DAM – Serviço de Ambulatórios Especializados em Infectologia “Domingos Alves Meira” e de amostras coletadas por ocasião do projeto Viral Genetic Diversity Network (VGDN). Grupo 2 (G2): 100 amostras de pacientes monoinfectados pelo VHC, de genótipo 1, com infecção crônica e RNA detectável por técnicas de Biologia Molecular, provenientes do Ambulatório de Hepatites da Disciplina de Gastroenterologia Clínica do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu- FMB-UNESP, convidados a participar do estudo por ocasião de sua coleta de rotina para o exame de PCR quantitativo para acompanhamento da doença. Grupo 3 (G3): 51 amostras de pacientes coinfectados HIV/VHC (Subtipo B do HIV-1 e genótipo 1 do VHC, com infecção crônica e RNA detectável por técnicas de Biologia Molecular), provenientes do SAEI/DAM – Serviço de Ambulatório Especializado em Infectologia Domingos Alves Meira e do Ambulatório de Hepatites da Disciplina de Gastroenterologia Clínica do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina de Botucatu- FMB-UNESP, de indivíduos convidados a participar do estudo por ocasião de sua coleta de rotina para o exame de carga viral plasmática e/ou por ocasião de sua coleta de rotina para o exame de PCR quantitativo para acompanhamento da doença e também de amostras coletadas por ocasião do projeto Viral Genetic Diversity Network (VGDN). 53 Foram selecionadas 90 amostras, sendo 30 de cada Grupo (G1=30, G2=30 e G3=30), para tipagem do HLA de classe I (A, B e C) com o intuito de: - Analisar a presença e a frequência de ligantes de KIR entre os indivíduos monoinfectados HIV-1, monoinfectados VHC e coinfectados HIV/VHC; - Correlacionar a presença dos genes KIR em combinação a seus ligantes (HLA) com a evolução da infecção pelo HIV-1 e também a doença ocasionada pelo VHC nos Grupos: G1 e G3; e G2 e G3, respectivamente. Foram critérios de inclusão para todos os grupos, indivíduos maiores de 18 anos e não aparentados, sendo que, foram incluídos apenas os pacientes que concordaram em participar do estudo, após o devido esclarecimento e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Foram excluídos do estudo gestantes, pacientes que apresentaram qualquer outra coinfecção (Hepatite B, Tuberculose, etc) ou doença hepática de outras etiologias. O presente estudo foi encaminhado para análise e aprovação do Comitê de ética em Pesquisa, da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP e obteve parecer favorável (n°349.761/2013 em anexo 1). 5.2 Métodos 5.2.1 Processamento inicial das amostras Foram coletados 5 mL de sangue total em tubo do tipo Vacutainer® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) contendo 1,5 mg/mL do anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de cada paciente incluído no estudo. Após a separação da alíquota de sangue total, que foi utilizada para extração de DNA genômico, a amostra foi centrifugada a 1312xg, por 15 minutos para separação do plasma que foi utilizado para extração do RNA viral. 54 5.2.2 Subtipagem viral dos pacientes monoinfectados HIV-1 e coinfectados HIV/VHC A quantificação do número de cópias de RNA viral do HIV-1 por mL de plasma, exame conhecido como quantificação da carga viral, foi realizada utilizando Abbott Real Time HIV-1 (RealTime HIV-1; Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL), segundo as especificações do fabricante. Sendo assim, algumas amostras foram subtipadas diretamente do RNA viral extraído a partir do plasma (10 amostras de monoinfectados HIV-1 e 7 amostras de coinfectados HIV/VHC) e as demais subtipadas utilizando como amostra o DNA pró- viral (90 amostras de monoinfectados HIV e 44 amostras de coinfectados HIV/VHC), método bem estabelecido em laboratórios de subtipagem viral (DELWART et al., 1995; KABAMBA-MUKADI et al., 2010). A extração do RNA viral a partir do plasma foi realizada utilizando o kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA), segundo especificações do fabricante. Em seguida, a realização da transcrição reversa foi realizada utilizando o High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystem, CA, USA), segundo as especificações do fabricante. A extração de DNA para subtipagem a partir do DNA pró-viral foi realizada utilizando-se o kit Axyprep™ DNA Extraction Kit (Axygen Scientific, Union City, California), segundo as indicações do fabricante. Amplificação da região de interesse do HIV-1 por Reação em Cadeia da Polimerase Para a comprovação da presença do HIV-1 foi realizada amplificação por Nested-PCR da região genômica C2-V3 da gp120 do HIV-1 utilizando metodologia descrita por DELWART e colaboradores (DELWART et al., 1995), para maiores detalhes vide anexo 2. 55 A comprovação da amplificação foi realizada através de eletroforese em gel de agarose 2% com 0,25ng/ul de brometo de etídio. A corrida eletroforética foi realizada a 90V, 4mA por 40 minutos em tampão TBE (Tris-Borato 45mM/EDTA 1mM). A visualização foi realizada sob luz ultravioleta (UV) e, foram consideradas amplificadas amostras que exibiam uma banda de aproximadamente 550 pares de base (pb). Foi utilizado como marcador de peso molecular o Ladder 100 pb (LGC Biotecnologia). Sequenciamento automático e subtipagem da região C2-V3 do HIV O produto amplificado foi purificado utilizando o kit Invisorb® Fragment CleanUp (Invitek, STRATEC Molecular, GmbH, Berlin,Germany), segundo as recomendações do fabricante e posteriormente sequenciado utilizando o kit ABI Prism® Big Dye™ terminator Cycle Sequencing v.3.1. (Applied Biosystems, CA, USA), segundo as especificações do fabricante. As amostras foram sequenciadas, no equipamento ABI 3500 (Applied Biosystems) em duplicata, sendo que em uma reação foi utilizado o primer ED31 e, na outra o ED33. A qualidade das sequências obtidas foi analisada com o programa Phred (EWING et al., 1998a), adotando-se escore 20 para a validação da qualidade. Um contig das duas reações de sequenciamento realizadas (uma com cada primer) foi obtido utilizando o programa BioEdit (EWING et al., 1998b). A análise de subtipos foi realizada utilizando o REGA HIV-1 Subtyping Tool, versão 2.0 (BIOAFRICA, 2010). Determinação da sequência do arco da alça V3 A sequência de nucleotídeos obtida dos grupos de monoinfectados HIV-1 e coinfectados HIV/VHC da região da alça V3, foi convertida em sequência de aminoácidos, no frame de leitura correto, utilizando o programa BioEdit (EWING et al., 1998b) e, a região referente ao arco da alça V3 foi analisada. Para inferir sobre a capacidade de indução de sincício do vírus, a sequência de aminoácidos referente à região da alça V3 foi analisada pela ferramenta de bioinformática Geno2pheno disponível em: http://coreceptor.geno2pheno.org/ . 56 5.2.3 Genotipagem viral dos pacientes monoinfectados VHC e coinfectados HIV/VHC Carga viral Para a quantificação do RNA viral foi utilizado Abbott Real Time HCV (RealTime HCV; Abbott Molecular, Inc., Des Plaines, IL), segundo as especificações do fabricante. Foram incluídas no estudo apenas as amostras que apresentaram RNA viral detectável (≥ 500 Ul/mL) para que fosse possível realizar posterior genotipagem do VHC. Extração de RNA e Transcrição reversa A extração do RNA viral a partir do plasma foi realizada utilizando o kit QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA), segundo especificações do fabricante. Em seguida, a transcrição reversa foi realizada utilizando o High-Capacity cDNA Archive kit (Applied Biosystem, CA, USA), segundo as especificações do fabricante. Amplificação da região de interesse do VHC por Reação em Cadeia da Polimerase A comprovação da presença do VHC foi realizada através de uma amplificação da região genômica 5’UTR do genoma viral, utilizado como amostra o RNA viral extraído a partir do plasma. Para esta amplificação foi realizada uma Nested-PCR, utilizando metodologia descrita por GARSON e colaboradores (GARSON et al., 1990), para maiores detalhes vide anexo 3. A comprovação da amplificação foi realizada através de eletroforese em gel de agarose 2% com 0,25ng/ul de brometo de etídio. A corrida eletroforética foi realizada a 90V, 4mA por 40 minutos em tampão TBE (Tris-Borato 45mM/EDTA 1mM). A visualização foi realizada sob luz ultravioleta (UV) e, foram consideradas amplificadas amostras que exibiam uma banda de 214 pares de base (pb). Foi utilizado como marcador de peso molecular o Ladder 100 pb (LGC Biotecnologia). 57 Sequenciamento automático e genotipagem do VHC O produto amplificado foi purificado utilizando o kit Invisorb® Fragment CleanUp (Invitek, STRATEC Molecular, GmbH, Berlin,Germany), segundo as recomendações do fabricante e posteriormente sequenciado utilizando o kit ABI Prism® Big Dye™ terminator Cycle Sequencing v.3.1. (Applied Biosystems, CA, USA), segundo as especificações do fabricante. As amostras foram sequenciadas, no equipamento ABI 3500 (Applied Biosystems) em duplicata, sendo que em uma reação foi utilizado o primer PTC3 e, na outra o NCR4. A qualidade das sequências obtidas foi analisada com o programa Phred (EWING et al., 1998a), adotando-se escore 20 para a validação da qualidade. As sequências foram analisadas com o software BioEdit (HALL et al., 1999) com a finalidade de construir um contig das duas reações de sequenciamento realizadas, as quais foram genotipadas pelo algoritmo HCV-Blast disponível no banco de dados The Los Alamos HCV Sequence (http://hcv.lanl.gov) (KUIKEN et al., 2005). 5.2.4 Genotipagem dos genes KIR Extração do DNA genômico A extração do DNA genômico das 251 amostras foi realizada a partir de sangue total utilizando-se Axyprep™ DNA Extraction Kit (Axygen Scientific, Union City, California), segundo as instruções do fabricante. Padronização da quantidade de DNA utilizado na PCR-SSP O fabricante do kit KIR Genotyping SSP Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), recomenda que seja utilizado aproximadamente 50ng/µl de DNA na amplificação por PCR-SSP, no entanto, após um primeiro teste utilizando esta concentração, foi observado que algumas bandas apareciam mais fracas no gel, o que dificultava a interpretação dos resultados (Figura 12), desta maneira, após a realização de um segundo teste ficou determinado que a concentração de DNA a ser utilizada na 58 amplificação seria de 100ng/µl. Reação de PCR-SSP Para genotipagem dos genes KIR foi utilizada a técnica de PCR-SSP para genotipagem de 14 genes: KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DL3, KIR3DS1 e 2 pseudogenes: KIR2DP1 e KIR3P1, através do kit KIR Genotyping SSP Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), segundo as especificações do fabricante (maiores detalhes em anexo 4). A comprovação da amplificação foi realizada através de eletroforese em gel de agarose 2% com 0,25ng/ul de brometo de etídio. A corrida eletroforética foi realizada a 90V, 4mA por 80 minutos em tampão TBE (Tris-Borato 45mM/EDTA 1mM). A visualização dos fragmentos amplificados foi realizada sob luz ultravioleta (UV) (Figura 13) e para análise e interpretação dos resultados foi utilizada uma worksheet (Figura 14) disponibilizada pelo fabricante do kit KIR Genotyping SSP Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Foi utilizado como marcador de peso molecular o Ladder de 10 kb (Biolabs). Figura 12: Eletrofosere em gel de agarose 2% do primeiro teste de PCR genes KIR utilizando 50ng/µl de DNA na reação, onde pode ser observado que as bandas ficaram fracas, sendo que, em alguns poços (14 e do 16 ao 20) nem a banda do controle interno apareceu adequadamente, o que dificultou a interpretação dos resultados. Legenda: (a) e (c) (Biolabs), (b) e (d) Ladder de 1 Kb ( bandas específicas para o alelo de interno de 200 pb mais bandas específicas para o alelo de (a) (b) (1) (2) (c) (d) (14) (15 Eletrofosere em gel de agarose 2% do primeiro teste de PCR-SSP para genotipagem dos utilizando 50ng/µl de DNA na reação, onde pode ser observado que as bandas ficaram s, sendo que, em alguns poços (14 e do 16 ao 20) nem a banda do controle interno apareceu adequadamente, o que dificultou a interpretação dos resultados. Legenda: (a) e (c) de 1 Kb (Axygen), (1) ao (20) banda do controle interno de 800 pb mais bandas específicas para o alelo de KIR que o indivíduo apresentava, (21) ao (22) banda do controle interno de 200 pb mais bandas específicas para o alelo de KIR que o indivíduo apresentava. (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) 59 SSP para genotipagem dos utilizando 50ng/µl de DNA na reação, onde pode ser observado que as bandas ficaram s, sendo que, em alguns poços (14 e do 16 ao 20) nem a banda do controle interno apareceu adequadamente, o que dificultou a interpretação dos resultados. Legenda: (a) e (c) Ladder de 10 Kb o controle interno de 800 pb mais que o indivíduo apresentava, (21) ao (22) banda do controle que o indivíduo apresentava. 800pb – referente ao controle interno 800pb – referente ao controle interno 200pb – referente ao controle interno 60 Figura 13: Eletrofosere em gel de agarose 2% referente à genotipagem dos genes KIR através de PCR-SSP da amostra de um indivíduo monoinfectado HIV-1, sendo que, cada poço apresenta uma banda do controle interno da reação (800pb do poço 1 ao 20 e 200pb do 21 ao 22) mais a banda referente a um dos alelos de KIR, quando o indivíduo apresenta o referido alelo. Legenda: (a) e (b) Ladder de 10Kb (Biolabs), (1) banda de 140 pb, (2), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (15) e (19) banda de 800pb referente ao controle interno, (3) banda de 535 pb, (4) banda de 550 pb, (5) banda de 230 pb, (14) banda de 200 pb, (16) banda de 125 pb, (17) banda de 150 pb, (18) banda de 203 pb, (20) banda de 171 pb, (21) banda de 344 pb, (22) banda de 200pb referente ao controle e (23) controle negativo. (a) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (b) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) (23) 800pb- referente ao controle interno 800pb – referente ao controle interno 200pb – referente ao controle interno 61 Figura 14: Worksheet utilizada na interpretação dos resultados obtidos através da PCR-SSP e revelados em gel de agarose 2%. Como citado anteriormente, cada poço da placa representa um alelo e, quando a banda referente a determinado poço aparece no gel significa que a pessoa tem aquele alelo, onde, através da planilha acima é possível saber a qual alelo a banda pertence, como por exemplo, se no poço 1 aparecer uma banda de 140 pb mais a banda de 800pb do controle, significa que o indivíduo apresenta o gene KIR2DL1. 5.2.5 Tipagem do HLA de classe I : A, B e C Para a tipagem do HLA de classe I foram utilizados os kits comerciais SeCore® A Locus Sequencing KIT (RUO) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA); SeCore® B Locus Sequencing Kit, Single Amplification System (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e SeCore® CW Locus Sequencing Kit (RUO) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), segundo as especificações do fabricante (protocolo em anexo 5). A comprovação da amplificação foi realizada através de eletroforese em gel de agarose 2% com 0,25ng/ul de brometo de etídio, sendo a corrida eletroforética realizada a 90V, 4mA por 40 minutos em tampão TBE (Tris-Borato 45mM/EDTA 1mM). 62 A visualização foi realizada sob luz ultravioleta (UV) e, foram consideradas amplificadas amostras que apresentavam uma banda de 990 e outra de 1100 pb para o HLA de classe I - A; 950 e 1400 pb para o HLA de classe I - B e 1370 e 1375 pb para o HLA de classe I - C (Figura 15). O produto amplificado foi sequenciado conforme protocolo em anexo 5 e as sequências de todos os alelos foram analisadas através de um software (uType 6.0) disponibilizado pelo fabricante do kit (Invitrogen). Figura 15: Eletroforese em gel de agarose 2% referente à Tipagem do HLA de classe I (A, B e C). Legenda: (a) Ladder de 1 Kb (Axygen); (b) bandas (sobrepostas) de 990 pb correspondente aos exons 4 e 5 do HLA-A e 1100 kb correspondente aos exons 1, 2 e 3; (c) duas bandas uma de 950 pb correspondente aos exons 4 e 5 do HLA-B e outra de 1400 pb correspondente aos exons 1, 2 e 3; (d) bandas (sobrepostas) de 1370 correspondente aos exons 4 e 5 do HLA-C e 1375 pb correspondentes aos exons 1, 2 e 3. 5.2.6 Análise de prontuários Dados referentes à progressão da doença relacionados às infecções ocasionadas pelos vírus HIV e VHC, como, carga viral, contagem de linfócitos T CD4, tipo de tratamento, caso aids segundo critérios CDC, fibrose, resposta ao tratamento e dados demográficos, foram retirados dos prontuários médicos dos pacientes. 5.2.7 Análise dos Dados Os dados demográficos como sexo e idade foram analisados de forma descritiva, utilizando porcentagem e valores como média, mediana e Intervalo interquartil (IQR), sendo representados em forma de gráficos e tabelas. (a) (b) (c) (d) 63 Os Grupos de monoinfectados HIV-1 e coinfectados HIV/VHC foram distribuídos com relação à presença da variante B’ e também com relação à capacidade de indução de sincício, sendo que a correlação entre esses dois fenótipos (GWG – GPG e NSI - SI) foi realizada utilizando o teste qui-quadrado, sendo considerados valores de p inferiores a 0,05. As variáveis relacionadas à progressão da infecção pelo HIV-1 (Contagem de CD4, carga viral, classificação CDC, tratamento) e pelo VHC (Grau de fibrose, resposta a tratamento e tratamento) foram analisadas de maneira descritiva utilizando porcentagem, média, mediana, intervalo interquartil (IQR) e representadas em forma de gráficos e tabelas. A frequência de distribuição dos genes KIR e de alelos do HLA ligantes de KIR em cada um dos Grupos, 1, 2 e 3, foi analisada utilizando contagem direta a partir de uma tabela geral de dados montada no programa Microsoft Excel, sendo esta a frequência absoluta, sendo que, a frequência relativa foi calculada através de porcentagem. A frequência gênica de KIR foi calculada utilizando o equilíbrio de Hardy- Weinberg, onde os resultados foram confirmados através da fórmula de Bernstein. Possíveis diferenças entre as frequências dos 16 genes KIR com relação ao grupo de pacientes coinfectados e os grupos controles G1 e G2, foram analisadas a partir do teste qui-quadrado, sendo considerados significativos os resultados de p<0,05. Para averiguar diferenças entre a frequência dos ligantes de KIR e, de KIR associado aos seus ligantes foi utilizado o teste exato de Fischer (p<0,05). As correlações entre os polimorfismos dos genes KIR com as variáveis relacionadas à evolução da infecção pelo HIV-1 e também com relação à infecção pelo VHC, foram analisadas utilizando o teste qui-quadrado, sendo considerados significativos os resultados de p<0,05. 6 RESULTADOS E DISCUSSÃO 6.1 Triagem das amostras: Confirmação da infecção pelo HIV e/ou VHC Para selecionar as amostras que seriam incluídas no estudo, uma triagem utilizando técnicas de bio (Figura 16) e/ou VHC (Figura 17) Figura 16: Eletroforese em gel de agarose env do HIV-1: (a) Ladder de 100pb, (b), (c banda única de aproximadamente 550pb da reação. (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (l) (m) (n) RESULTADOS E DISCUSSÃO Triagem das amostras: Confirmação da infecção pelo HIV e/ou VHC Para selecionar as amostras que seriam incluídas no estudo, uma triagem utilizando técnicas