RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 04/04/2027. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP Instituto de Química - Câmpus de Araraquara LETÍCIA RAMOS MOLICA EFEITOS DOS HERBICIDAS BROMACIL E TERBACIL SOBRE O METABOLISMO ENERGÉTICO PRÓ-ESTEATÓTICO E PADRÕES EPIGENÉTICOS ESPECÍFICOS EM CULTIVO CELULAR COMO FERRAMENTA PARA TOXICOLOGIA PREDITIVA Araraquara 2025 LETÍCIA RAMOS MOLICA EFEITOS DOS HERBICIDAS BROMACIL E TERBACIL SOBRE O METABOLISMO ENERGÉTICO PRÓ-ESTEATÓTICO E PADRÕES EPIGENÉTICOS ESPECÍFICOS EM CULTIVO CELULAR COMO FERRAMENTA PARA TOXICOLOGIA PREDITIVA Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara, para obtenção do título de Mestra em Biotecnologia Área de Concentração: Bioquímica e Biologia Molecular Orientador(a): Prof. Dr. Karen Cristiane Martinez de Moraes Araraquara 2025 M721e Molica, Letícia Ramos Efeitos dos herbicidas bromacil e terbacil sobre o metabolismo energético pró-esteatótico e padrões epigenéticos específicos em cultivo celular como ferramenta para toxicologia preditiva / Letícia Ramos Molica. -- Araraquara, 2025 118 f. : il. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Química, Araraquara Orientadora: Karen Cristiane Martinez de Moraes 1. Esteatose hepática. 2. Mitocôndria. 3. Expressão gênica. 4. Estresse oxidativo. 5. Produtos químicos agrícolas. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Dados fornecidos pelo autor(a). IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA O presente estudo contribui para os ODS 3 (Saúde e Bem-Estar) e 12 (Consumo e Produção Responsáveis), ao avançar no conhecimento sobre disfunções mitocondriais e estresse oxidativo, elucidando mecanismos de toxicidade hepática, embasando práticas agrícolas mais seguras, terapias inovadoras para doenças hepáticas e conscientização sobre poluentes ambientais que podem influenciando políticas públicas. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH The present study contributes to SDGs 3 (Health and Well-Being) and 12 (Responsible Consumption and Production), by advancing knowledge about mitochondrial dysfunctions and oxidative stress, elucidating mechanisms of liver toxicity, supporting safer agricultural practices, innovative therapies for liver diseases, and raising awareness about environmental pollutants that can influence public policies. DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO LETÍCIA RAMOS MOLICA 09/02/1999 Nacionalidade Brasileira Nome em citações bibliográficas: Molica, Letícia Molica, L. Endereço profissional Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Campus de Rio Claro Departamento de Bioquímica Avenida 24A, 1515 Bela Vista, Rio Claro – SP CEP 13506-900 Telefone: (11) 96354-1282 Currículo Lattes http://lattes.cnpq.br/9986852753261375 ORCID https://orcid.org/0000-0001-7973-1428 FORMAÇÃO ACADÊMICA 2018/2022 Graduação em Ciências biológicas Universidade Estadual Paulista - UNESP PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA PANSA, C. C.; MOLICA, L. R.; OLIVEIRA JÚNIOR, F.C.; SANTELLO, L. C.; MORAES, K. C. M. Cellular and molecular effects of fipronil in lipid metabolism of HepG2 and its possible connection to non-alcoholic fatty liver disease. Journal Biochem Mol Toxicol, v. 38, p. e23595, 2024. PORTO-BARBOSA, THAIS; RAMOS, LETÍCIA FERREIRA; PANSA, CAMILA CRISTIANE; MOLICA, LETÍCIA RAMOS; MALASPINA, OSMAR; MORAES, KAREN C. M.. Inhibition of the miR-1914-5p increases the oxidative metabolism in cellular model of steatosis by modulating the Sirt1-PGC-1α pathway and systemic cellular activity. PLoS One, v. 19, p. e0313185, 2024. DE OLIVEIRA-JÚNIOR, FABIANO CLÁUDIO; OLIVEIRA, ANA CAROLINE PIMENTEL DE; PANSA, CAMILA CRISTIANE; MOLICA, LETÍCIA RAMOS; MORAES, KAREN C. M.. Drosophila melanogaster as a Biotechnological Tool to Investigate the Close Connection Between Fatty Diseases and Pesticides. BRAZILIAN ARCHIVES OF BIOLOGY AND TECHNOLOGY (ONLINE), v. 67, p. e24230091, 2024 PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS ANNUAL METTING SBBq, 52., 2023, (Águas de Lindóia - SP). Cellular and molecular effects of fipronil in lipid metabolism of HEPG2 and its connection to MAFLD. (Pôster). CONGRESSO BRASILEIRO DE BIOLOGIA CELULAR, 21., 2024, (São Paulo - SP). Effects of bromacil exposure on hepatic cells: implications for nonalcoholic fatty liver disease (MAFLD). (Pôster) CONGRESSO BRASILEIRO DE BIOLOGIA CELULAR, 21., 2024, (São Paulo - SP). Mini-curso: IMAGEJ. 2024. (Seminário). INTERNACIONAL CONGRESS OF THE BRASILIAN GENETICS SOCIETY, 69., 2024, (Campos do Jordão - SP). Effects of terbacil exposure on hepaticcells: implications for non-alcoholic fatty liver disease (MAFLD). (Pôster) Dedico este trabalho ao Paulo Sérgio Raimundo que, em momentos de escuridão, nos guiou com amor e alegria. Sua presença trouxe calor aos nossos dias e sua ausência deixou um vazio que só o carinho das memórias pode preencher. Esta conquista é também sua, pois sua força e inspiração permanecem vivas em cada passo que dou. Obrigado por tudo! AGRADECIMENTOS Hoje, ao olhar para trás, vejo que cada passo dessa jornada foi direcionado pelo amor, apoio e dedicação de pessoas especiais que tornaram tudo possível. Gostaria de começar agradecendo à família, minha mãe, Sandra, ao meu padrasto, Paulo, aos meus irmãos, Fernando Júnior e Victória, aos meus sogros Rosana e Reinaldo e as minhas cunhadas, Mila, Luíza e Carol. Vocês foram meu porto seguro, minha fonte de incentivo e meu motivo para seguir em frente, mesmo nos momentos mais desafiadores. Apesar da distância, cada reencontro foi um sopro de alegria que renovou minhas forças e me lembrou do valor da família. Obrigada por serem minha base e meu refúgio. Ao meu namorado, Reinaldo, que caminhou ao meu lado em cada etapa, oferecendo não apenas apoio, mas também amor e compreensão. Suas palavras de incentivo e seu companheirismo foram como faróis nos dias mais escuros. Sem você, essa jornada teria sido muito mais difícil. Obrigada por acreditar em mim, mesmo quando eu duvidava de mim mesma. Aos amigos que fiz no curso de Ciências Biológicas Integral, turma de 2018, meu eterno agradecimento. Vocês foram parte fundamental dessa trajetória, compartilhando desafios, conquistas e risadas que ficarão para sempre guardadas em meu coração. Aos meus amigos, Catarina, Gabriela, Marcelo, Renan e Samantha, obrigada por estarem presentes, mesmo à distância. Suas mensagens foram como abraços virtuais que me deram força para continuar. E a vocês, Luíza, Maria Tereza e Mariana, minha gratidão por essa parceria tão especial que construímos ao longo dos anos. Vocês transformaram os dias mais pesados em momentos leves e cheios de alegria. Ao grupo de pesquisa do Laboratório de Sinalização Celular e Expressão Gênica, meu profundo agradecimento pelo companheirismo e pela troca de conhecimentos, com vocês os dias foram leves e cheio de risadas, que nossa amizade construída perdure pelos anos. Sem vocês, essa conquista não seria possível. Gostaria de agradecer em especial, à Ana Caroline Pimentel de Oliveira, por ter compartilhado comigo esses dois longos anos. Juntas, enfrentamos inúmeros desafios, mas transformamos cada um deles em uma linda parceria. Sua presença foi fundamental para que eu encontrasse força e motivação nos momentos mais difíceis. Obrigada por caminhar ao meu lado e por tornar essa jornada muito mais fácil e agradável. À Professora Doutora Karen Cristiane Martinez de Moraes, minha orientadora, com quem compartilhei uma longa e enriquecedora trajetória de quase seis anos. Sua dedicação, sabedoria e visão foram fundamentais para o meu crescimento profissional e pessoal. Você não apenas me guiou pelos caminhos da ciência, mas também me inspirou a buscar excelência em tudo o que faço. Sua confiança em meu potencial foi essencial para a realização deste trabalho e de tantos outros que desenvolvemos juntas. Obrigada por ser uma mentora tão dedicada e visionária, e por transformar desafios em oportunidades de aprendizado. Você é, sem dúvida, parte essencial da pesquisadora que me tornei. Gostaria de expressar minha gratidão à UNESP, ao Instituto de Biologia e ao Departamento de Biologia Geral e Aplicada (DBGA) do campus de Rio Claro, bem como ao Instituto de Química de Araraquara, pelo suporte e infraestrutura indispensáveis para a realização desta pesquisa. O apoio dessas instituições foi fundamental para o desenvolvimento e conclusão deste trabalho. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro, concedido por meio do Processo nº 2022/06302-8. Hoje, ao concluir essa etapa, carrego comigo não apenas um diploma, mas também memórias, aprendizados e laços que jamais serão esquecidos. A todos que fizeram parte dessa jornada, meu mais sincero obrigada. Vocês são parte do que sou e do que ainda serei. "Se a vitória fosse contada em detalhes ninguém conseguiria distingui-la de uma derrota." — Jean Paul Sartre RESUMO A doença hepática gordurosa não alcoólica (MAFLD) é um grave problema de saúde global, caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura no fígado causado por diferentes etiologias, como a exposição a tóxicos ambientais, como os utilizados indiscriminadamente na agricultura, contribuindo para a exposição humana. No entanto, faltam estudos sobre como esses contaminantes afetam os processos metabólicos e a sinalização celular envolvidos nas doenças hepáticas. Compreender esses mecanismos pode impulsionar inovações biotecnológicas, como a identificação de marcadores moleculares para o diagnóstico e estadiamento dessas doenças. O presente estudo investigou os efeitos dos herbicidas a base de uracila: terbacil (5 nM, 500 nM e 5 µM) e bromacil (5 nM, 5 µM e 50 µM) no metabolismo das células hepáticas HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura. Foram realizados ensaios bioquímicos na cocultura exposta a diferentes concentrações dos herbicidas por 48 horas. O terbacil aumentou os triglicerídeos em 63,98% e a glicose em 40,70%, enquanto o bromacil elevou os triglicerídeos em 277,54% e a glicose em 108,64%. Ambos os herbicidas alteraram os níveis de colesterol, com o bromacil mostrando um aumento global de 47,61%. A exposição aos herbicidas também afetou a saúde mitocondrial, aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e reduzindo o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), indicando disfunção mitocondrial. A glutationa (GSH) e os níveis de NAD+ aumentaram como resposta adaptativa ao estresse oxidativo, enquanto o NADPH apresentou flutuações. Alterações epigenéticas, como hipermetilação do DNA, hiperacetilação de histonas, foram observadas, bem como a hipometilação de RNA m6A, influenciando a expressão de genes relacionados ao metabolismo lipídico e à progressão da MAFLD. A expressão de genes como PGC-1α, SIRT1 e SREBP-1c foi modulada, sugerindo tentativas de compensação celular. Conclui-se que os herbicidas induzem disfunções metabólicas e mitocondriais, contribuindo para a progressão da MAFLD, e destacam-se estratégias terapêuticas que modulam o metabolismo de NAD+ e a defesa antioxidante para proteger as células hepáticas. Palavras-chave: Esteatose Hepática; Mitocôndria; Expressão Gênica; Estresse Oxidativo, Produtos químicos agrícolas. ABSTRACT Nonalcoholic fatty liver disease (MAFLD) is a serious global health problem, characterized by excessive fat accumulation in the liver caused by different etiologies, such as exposure to environmental toxicants, such as those used indiscriminately in agriculture, contributing to human exposure. However, studies on how these contaminants affect metabolic processes and cell signaling involved in liver disease are lacking. Understanding these mechanisms can drive biotechnological innovations, such as the identification of molecular markers for the diagnosis and staging of these diseases. The present study investigated the effects of uracil terbacyl (5 nM, 500 nM and 5 μM) and bromacil (5 nM, 5 μM and 50 μM) herbicides on the metabolism of HepG2 and LX-2 liver cells grown in coculture. Biochemical assays were carried out on the co-crop exposed to different concentrations of herbicides for 48 hours. Terbacil increased triglycerides by 63.98% and glucose by 40.70%, while bromacil increased triglycerides by 277.54% and glucose by 108.64%. Both herbicides altered cholesterol levels, with bromacil showing an overall increase of 47.61%. Exposure to herbicides also affected mitochondrial health by increasing the production of reactive oxygen species (ROS) and reducing mitochondrial membrane potential (ΔΨm), indicating mitochondrial dysfunction. Glutathione (GSH) and NAD+ levels increased as an adaptive response to oxidative stress, while NADPH showed fluctuations. Epigenetic alterations, such as DNA hypermethylation and histone hyperacetylation, were observed, as well as m6A RNA hypomethylation, influencing the expression of genes related to lipid metabolism and MAFLD progression. The expression of genes such as PGC-1α, SIRT1 and SREBP-1c was modulated, suggesting attempts at cellular compensation. It is concluded that herbicides induce metabolic and mitochondrial dysfunctions, contributing to the progression of MAFLD, and therapeutic strategies that modulate NAD+ metabolism and antioxidant defense to protect liver cells are highlighted. Keywords: Hepatic Steatosis; Mitochondrion; Gene Expression; Oxidative stress; Agricultural Chemicals. LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação da estrutura química do terbacil (B), um herbicida com estrutura análoga a de uracila (A) ............................................................................ 28 Figura 2: Representação da estrutura química do bromacil (B), um herbicida com estrutura análoga a de uracila (A) ............................................................................ 30 Figura 3: Ensaio de MTT. Células HepG2 em azul, LX-2 em rosa e cocultura em amarelo foram crescidas em placas de 96 poços e submetidas às concentrações crescentes de terbacil por 48h ................................................................................. 57 Figura 4: Ensaio de MTT. Células HepG2 em azul, LX-2 em rosa e cocultura em amarelo foram crescidas em placas de 96 poços e submetidas às concentrações crescentes de bromacil por 48h. .............................................................................. 58 Figura 5: Ensaio de LDH. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 6 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. *** p<0.005, ** p <0.05 e * p< 0.5 .................................................................................. 61 Figura 6: Ensaios bioquímicos. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 6 poços e submetidas à diferentes concentrações de Terbacil por 48h. Em A) estão os resultados relativos à presença de triglicérides, glicose e colesterol para os controles experimentais em B) os resultados relativos à presença de triglicérides, glicose e colesterol para as diferentes concentrações de terbacil e (C) os resultados relativos à presença de triglicérides, glicose e colesterol para as diferentes concentrações de bromacil. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p<0,0001, *** p <0.005, ** p <0.05 e * p< 0.5 ........................................................... 64 Figura 7: Mapa de calor da expressão diferencial de mRNAs de 17 genes correlatos ao metabolismo energético em cocultura de células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 submetidas a diferentes concentrações de terbacil (B) e bromacil (C), bem como controles experimentais (A) em relação ao controle por 48h. A escala de cores o azul intenso representa genes super expressos e o branco genes subexpressos. .......... 67 Figura 8: Ensaio da concentração intracelular de espécies reativas de oxigênio (ROS). Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 96 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. ** p <0.05 e * p< 0.5. ................................................................................................................................. 69 Figura 9: Análise da concentração intracelular de glutationa reduzida (GSH). Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 96 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p<0.0001, *** p<0.005, ** p <0.05 e * p< 0.5 ........... 70 Figura 10: Ensaio da concentração intracelular de NAD+/NADH. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 96 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p< 0.0001, *** p<0.005 e ** p <0.05. ....................... 72 Figura 11: Análise da concentração intracelular de NADP+/NADPH. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em frascos de 75 cm2 e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. As barras em preto representam a quantificação total de NADP, ou seja, NADP e NADPH, e as barras em cinza representam a quantificação apenas do NADPH. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p<0.0001, *** p<0.005, ** p <0.05 e * p< 0.5. ..................................................... 74 Figura 12: Ensaio do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm). Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 96 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. O grupo “Bromacil 5 nM” apresentou distribuição não normal (p* = 0,0356), portanto, análises robustas foram empregadas, aonde foram utilizados testes de Brown-Forsythe, seguidos de pós teste Dunet’s T3. **** p< 0.0001 e ** p <0.05.. **** p< 0.0001 e ** p <0.05. .......................................................................... 76 Figura 13: Mapa de calor da expressão diferencial de mRNAs de 10 genes correlatos ao metabolismo oxidativo em cocultura de células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 submetidas a diferentes concentrações de terbacil (B) e bromacil (C), bem como aos controles experimentais (A) em relação ao controle por 48h. Na escala de cores o rosa representa genes superexpressos e o branco genes subexpressos. ............ 80 Figura 14: Ensaio de quantificação da metilação global DNA. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 6 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. * p< 0.5. ................................................................................................ 82 Figura 15: Ensaio de acetilação global de histonas H3. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 96 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p< 0.0001, *** p<0.005, ** p <0.05 e * p < 0.5. ............................... 84 Figura 16: Níveis de expressão relativa de mRNA do gene SCD1. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p< 0.0001 e ** p <0.05 ....................................................................................... 85 Figura 17: Mapa de calor da expressão diferencial de mRNAs de 18 genes correlatos ao metabolismo epigenético em cocultura de células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 submetidas a diferentes concentrações de terbacil (B) e bromacil (C), bem como controles experimentais (A) em relação ao controle por 48h. ......................... 86 Figura 18: Ensaio de (I) monometilação, (II) dimetilação e (III) trimetilação de histonas H3K4. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em placas de 6 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. O grupo “terbacil 5 µM” da dimetilação apresentou distribuição não normal (p* = 0,0429), portanto, análises robustas foram empregadas, aonde foram utilizados testes de Brown-Forsythe, seguidos de pós teste Dunet’s T3. *** p<0.005, ** p <0.05 e * p < 0.5. .................... 89 Figura 19: Níveis de expressão relativa do miRNA 1914-5p. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. *** p <0.005, ** p <0.05 e * p <0.5 ................................................................................. 92 Figura 20: Níveis de expressão relativa de miRNA de U6. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. O grupo “Bromacil 5 µM” apresentou distribuição não normal (p* = 0,0330), portanto, análises robustas foram empregadas, onde foram utilizados testes de Brown- Forsythe, seguidos de pós teste Dunet’s T3. ........................................................... 92 Figura 21: Ensaio de metilação RNA (m6A). Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura em 96 poços e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. ** p <0.05 e * p <0.5 .................................................................................................... 94 Figura 22: Níveis de expressão relativa do mRNA dos genes eraser FTO e ALKBH5 Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p <0.0001, *** p <0.005 e * p <0.5 .................................................. 96 Figura 23: Níveis de expressão relativa do mRNA do gene PGC-1α. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p <0.0001, *** p <0.005 e ** p <0.05. ................................................................. 97 Figura 24: Níveis de expressão relativa de mRNA do gene FOXO1. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. *** p<0.005, ** p <0.05 e * p< 0.5. ................................................................................. 98 Figura 25: Níveis de expressão relativa de mRNA do gene PPAR-α. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. *** p<0.005, ** p <0.05 e * p< 0.5 .................................................................................. 99 Figura 26: Níveis de expressão relativa de mRNA do gene SREBP-1C. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett * p< 0.5. .................................................................................................... 100 Figura 27: Níveis de expressão relativa de mRNA dos genes SIRT1 e SIRT3. Células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas a: (A) Controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p< 0.0001, *** p<0.005, ** p <0.05 e * p< 0.5. ................................... 100 Figura 28: Análise por Western blots da proteína SIRT3 e β-actina. Em I são os níveis de expressão da proteína β-actina e SIRT3 em células hepáticas das linhagens HepG2 e LX-2 cultivadas em cocultura e submetidas aos (A) controles experimentais, diferentes concentrações de (B) terbacil e (C) bromacil por 48h. Em II quantificação da proteína SIRT3. Em Para análise estatística foi utilizado o teste One-Way ANOVA com pós-teste de Dunnett. **** p< 0.0001. ............................................................. 102 LISTA DE QUADROS Quadro 1: Quantidade inicial de células semeadas em recipientes de diferentes tamanhos respeitando a proporção de 7:3. .............................................................. 37 Quadro 2 – Oligonucleotídeos do metabolismo de lipídeos, metabolismo de uracila e vias adversas utilizados nas reações de qPCR ........................................................ 48 Quadro 3 – Valores encontrados nos ensaios de MTT relacionado com os valores residuais permitidos para o consumo pelas agências reguladoras ........................... 59 Quadro 4 – Quantificação da viabilidade a partir do método de azul de tripano. Células da linhagem HepG2 e LX-2 foram cultivadas em cocultura em placas de 6 poços e submetidas aos herbicidas terbacil (5 nM, 500 nM e 5 µM) e bromacil (5 nM, 5 µM e 50 µM); também estava presente a condição controle, ácidos graxos e DMSO, por 48h. .......................................................................................................................... 60 LISTA DE ABREVIATURAS ACSL4/5 – Acyl-CoA synthetase long-chain family member 4/5 ALKBH5 – AlkB homolog 5 ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Brasil) AOP – Adverse outcome pathway (Via de Resultado Adverso) CAT – Catalase ChREBP – Carbohydrate-responsive element-binding protein CPT1A/CPT2 – Carnitine palmitoyltransferase 1A/2 CYP1A1/CYP3A4/CYP4A – Citocromo P450 (família de enzimas metabolizadoras) DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Meio de cultura celular) DMSO – Dimethyl sulfoxide (Solvente) DNMT1/3A/3B – DNA methyltransferase 1/3A/3B EDTA – Ethylenediaminetetraacetic acid (Agente quelante) EPA – Environmental Protection Agency (Agência de Proteção Ambiental dos EUA) EPIs – Equipamentos de Proteção Individual FASN – Fatty acid synthase FTO – Fat mass and obesity-associated protein GPX1 – Glutathione peroxidase 1 GSH – Glutationa Reduzida HDAC1/2/3/4 – Histone deacetylase 1/2/3/4 IDA – Ingestão Diária Aceitável LDH – Lactato Desidrogenase m6A – Metilação de RNA (N6-metiladenosina) MAFLD – Metabolic-associated fatty liver disease (Doença Hepática Gordurosa Associada à Disfunção Metabólica) MTT – 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Ensaio de viabilidade celular) NAFLD – Non-alcoholic fatty liver disease (Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica) NASH – Non-alcoholic steatohepatitis (Esteatohepatite Não Alcoólica) NCBI – National Center for Biotechnology Information NRF2 – Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 PBS – Phosphate-buffered saline (Tampão fosfato-salino) PGC1-α – Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha PPAR-α/γ – Peroxisome proliferator-activated receptor alpha/gamma qPCR – Quantitative polymerase chain reaction (PCR quantitativa) ROS – Reactive oxygen species (Espécies Reativas de Oxigênio) SAM – S-adenosylmethionine (Cofator enzimático para metilação SCD1 – Stearoyl-CoA desaturase-1 SIRT1/3 – Sirtuin 1/3 SOD1 – Superoxide dismutase 1 SREBP1C/SREBP2 – Sterol regulatory element-binding protein 1C/2 TAFLD – Toxicant-associated fatty liver disease (Doença Hepática Gordurosa Associada a Produtos Tóxicos) TET1/2/3 – Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1/2/3 ToxRefDB – Toxicity Reference Database (Banco de dados de toxicidade) ΔΨm – Potencial de Membrana Mitocondrial SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 23 1.1 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA: UM PAINEL GERAL NAS SOCIEDADES MODERNAS ............................................................... 23 1.2 CONTAMINANTES AMBIENTAIS: PESTICIDAS BASEADOS EM URACILA QUE COLOCAM O EQUILÍBRIO HEPÁTICO EM ALERTA ..................... 25 1.2.1 Terbacil ................................................................................................. 28 1.2.2 Bromacil ............................................................................................... 30 1.3 A EPIGENÉTICA COMO UM ELEMENTO MODULADOR DO METABOLISMO LIPÍDICO NO PROCESSO ESTEATÓTICO HEPÁTICO .............. 32 1.4 TOXICOLOGIA PREDITIVA ................................................................. 34 2 OBJETIVOS ......................................................................................... 36 2.1 GERAL ................................................................................................. 36 2.2 ESPECÍFICOS ..................................................................................... 36 3 METODOLOGIA .................................................................................. 36 3.1 PREPARO DOS REAGENTES ............................................................ 36 3.2 CULTURA DE CÉLULAS: MODELO DE COCULTURA ....................... 37 3.3 ANÁLISES DE VIABILIDADE CELULAR .............................................. 38 3.3.1 MTT ...................................................................................................... 38 3.3.2 Azul de Tripano .................................................................................... 39 3.3.3 Lactato desidrogenase ......................................................................... 39 3.4 ENSAIOS BIOQUÍMICOS..................................................................... 40 3.4.1 Triglicérides .......................................................................................... 40 3.4.2 Glicose ................................................................................................. 41 3.4.3 Colesterol ............................................................................................. 42 3.5 SAÚDE MITOCONDRIAL ..................................................................... 42 3.5.1 Espécies reativas de oxigênio (ROS) ................................................... 43 3.5.2 Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) ........................................ 43 3.5.3 Glutationa reduzida (GSH).................................................................... 44 3.5.4 NAD+/NADH ......................................................................................... 45 3.5.5 NADP+/NADPH ..................................................................................... 46 3.6 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GENES .............................................. 47 3.6.1 Desenho dos oligonucleotídeos ............................................................ 47 3.6.2 Extração de RNA total .......................................................................... 49 3.6.3 Transcrição reversa do RNA total ......................................................... 49 3.6.4 PCR quantitativa ................................................................................... 50 3.7 ANÁLISES EPIGENÉTICA ................................................................... 50 3.7.1 Metilação global do DNA ...................................................................... 50 3.7.2 Histonas ............................................................................................... 51 3.7.2.1 Acetilação de histona H3 ................................................................... 51 3.7.2.2 Metilação de histona H3K4 ................................................................ 52 3.7.3 RNA ...................................................................................................... 53 3.7.3.1 Expressão de miRNA ......................................................................... 53 3.7.3.1.1 Extração de miRNA .............................................................................. 53 3.7.3.1.2 Transcrição de miRNA .......................................................................... 54 3.7.3.2 Metilação do RNA (m6A) ..................................................................... 54 3.8 WESTERN BLOT ................................................................................. 54 3.9 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .................................................................. 55 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 56 4.1 VIABILIDADE CELULAR ...................................................................... 56 4.2 ENSAIOS BIOQUÍMICOS..................................................................... 62 4.2.1 Terbacil ................................................................................................. 62 4.2.2 Bromacil ............................................................................................... 63 4.3 SAÚDE MITOCONDRIAL ..................................................................... 68 4.3.1 Espécies reativas de oxigênio (ROS) ................................................... 68 4.3.2 Glutationa Reduzida (GSH) .................................................................. 69 4.3.3 NAD+/NADH ......................................................................................... 71 4.3.4 NADP+/NADPH ..................................................................................... 73 4.3.5 Potencial da membrana mitocondrial (ΔΨm) ........................................ 75 4.4 ANÁLISES EPIGENÉTICAS ................................................................. 81 4.4.1 Metilação global do DNA ...................................................................... 81 4.4.2 Acetilação de histona H3 ...................................................................... 83 4.4.3 Metilação de histona H3K4 ................................................................... 87 4.4.4 Expressão de miRNAs .......................................................................... 91 4.4.5 Metilação de RNA (m6A) ....................................................................... 93 4.5 ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES ............................................ 97 4.6 WESTERN BLOTTING ....................................................................... 101 5 CONCLUSÕES .................................................................................. 104 REFERÊNCIAS .................................................................................. 106 23 1 INTRODUÇÃO 1.1 DOENÇA HEPÁTICA GORDUROSA NÃO ALCOÓLICA: UM PAINEL GERAL NAS SOCIEDADES MODERNAS O fígado é um órgão complexo constituído de células parenquimatosas e não parenquimatosas que desempenham funções importantes para a homeostase corporal, como a manutenção dos níveis de lipídeos e glicose, assimilação preliminar de nutrientes e o próprio metabolismo de substâncias tóxicas ingeridas (MOLICA, 2021). Dentre as doenças que acometem o fígado, a Doença Hepática Gordurosa Associada à Disfunção Metabólica (MAFLD, metabolic-associated fatty liver disease) é uma condição hepática caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura no fígado, associado a disfunções metabólicas. A denominação antiga, Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (NAFLD, non-alcoholic fatty liver disease), se baseava em critérios de exclusão, como a ausência de consumo significativo de álcool, já o diagnóstico de MAFLD é estabelecido por critérios positivos, focando na presença de disfunções metabólicas, como obesidade, diabetes tipo 2 ou outras anormalidades metabólicas, refletindo melhor a fisiopatologia da doença, que está intrinsecamente ligada a distúrbios metabólicos como resistência à insulina e síndrome metabólica (DAYAL et al., 2025; GOFTON et al., 2023). Para o diagnóstico de MAFLD é necessário a identificação de esteatose hepática por meio de métodos como histologia, imagem ou biomarcadores, além da presença de pelo menos uma das seguintes condições: sobrepeso/obesidade (com base em critérios étnicos específicos), diabetes tipo 2 ou evidência de disfunção metabólica, caracterizada pela presença de dois ou mais fatores de risco, como circunferência abdominal aumentada, hipertensão arterial, triglicerídeos elevados, HDL baixo, pré-diabetes ou resistência à insulina (GOFTON et al., 2023; DAYAL et al., 2025). Assim, é possível identificar pacientes com maior risco de progressão da esteatose hepática para as formas mais graves da doença, como esteatohepatite não alcoólica (NASH, non-alcoholic steatohepatitis), cirrose e até hepatocarcinoma. A MAFLD é reconhecida como uma doença multissistêmica, com implicações que vão para além do órgão hepático. Estudos mostram que pacientes com MAFLD têm maior risco de complicações extra-hepáticas, como doenças cardiovasculares, diabetes tipo 2 e doença renal crônica, além de estar associada a um aumento significativo na mortalidade, tanto por causas hepáticas quanto por comorbidades 24 metabólicas, como doenças cardiovasculares e câncer, em comparação com aqueles não diagnosticados com MAFLD (DAYAL et al., 2025; GOFTON et al., 2023). Essa mudança de paradigma no diagnóstico permite uma abordagem mais holística, considerando os múltiplos fatores de risco metabólicos que contribuem para a progressão da doença. A transição de NAFLD para MAFLD representa um avanço significativo na compreensão e no manejo da doença. Ao focar nos mecanismos metabólicos subjacentes, facilita a identificação precoce de pacientes em risco e permite intervenções mais direcionadas, como mudanças no estilo de vida e tratamento de comorbidades metabólicas, bem como permite o diagnóstico concomitante com outras doenças hepáticas, como hepatite viral ou esteatose alcoólica, o que era impossível com a definição de NAFLD (DAYAL et al., 2025). Essa abordagem integrada é crucial para melhorar os desfechos clínicos e reduzir a carga global da doença, que afeta cerca de 25% da população mundial e está em ascensão devido à epidemia de obesidade e diabetes (GOFTON et al., 2023; DAYAL et al., 2025). Inicialmente, quadros de esteatose foram associados exclusivamente ao consumo excessivo de álcool, mas sabe-se que vários estímulos, incluindo abuso de medicamentos, infecções virais, obesidade, diabetes e, atualmente, os contaminantes ambientais se destacaram por desencadear a doença hepática gordurosa, sendo nomeada de doença hepática associadas a produtos tóxicos (TAFLD, Toxicant- associated fatty liver disease) (ARMSTRONG e GUO, 2019; MORETTI; ROMEO; VALENTI, 2024). Considerando as TAFLDs, há mais de uma década bancos de dados compilam informações de análises experimentais de substâncias tóxicas, buscando uma visão ampliada da atuação desses compostos em diferentes organismos. O banco de dados The Toxicity Reference Database (ToxRefDB) compila informações de mais de 5.000 produtos, sendo aproximadamente 44% desses compostos pesticidas, dos quais 10% se correlacionam ao estabelecimento do fígado gordo (https://www.epa.gov/chemical- research/exploring-toxcast-data-downloadable-data). Embora a incidência das doenças hepáticas não seja conhecida no Brasil, estimativas recentes indicam que aproximadamente 34% da população adulta apresenta esteatose hepática, sendo que, desses, a maioria se enquadra nos critérios da MASLD (Doença Hepática Esteatótica Associada à Disfunção Metabólica), conforme demonstrado pelo estudo ELSA-Brasil (2024) (LOPES, et al., 2024). Os dados apresentados são alarmantes 25 frente a política de incentivo ao uso de fitossanitários, o que poderá contribuir com o aumento de indivíduos acometidos por doenças hepáticas num futuro breve. Somando-se a isso, vários produtos tóxicos possuem alta meia-vida — tais como os contaminantes a base de uracila, terbacil, bromacil e lenacil, que podem apresentar meia vida com mais de 100 dias em alguns casos (DEER, 2004) —, o que favorece o seu acúmulo no meio ambiente, podendo potencialmente causar danos a organismos alvo e não-alvo. Falta, portanto, uma legislação mais vigorosa e políticas educacionais capazes de esclarecer e conscientizar seus usuários da periculosidade desses reagentes químicos. Embora os estudos tenham avançado bastante na compreensão dos mecanismos celulares e moleculares correlacionados a esteatose hepática, ainda faltam estudos para se desenvolver terapias inovadoras no combate e/ou controle dessas patogenias. No que se refere aos aspectos correlatos à contribuição de contaminantes ambientais para o aumento de casos de MAFLD, os detalhes mecanísticos da atuação desses elementos, precisam ser melhor investigados (ARMSTRONG e GUO, 2019; KU et al., 2021; ZHUANG et al., 2025). Assim, para facilitar a compreensão de possíveis mecanismos adversos causados pelos contaminantes ambientais nas disfunções hepáticas e ao estabelecimento da esteatoses, vias de sinalização adversas (adverse outcome pathway, AOP) vêm sendo construídas para se avaliar riscos e orientar as análises toxicológicas nos organismos (LICHTENSTEIN et al., 2021). 1.2 CONTAMINANTES AMBIENTAIS: PESTICIDAS BASEADOS EM URACILA QUE COLOCAM O EQUILÍBRIO HEPÁTICO EM ALERTA Mundialmente, os pesticidas são utilizados em diferentes setores da sociedade. No Brasil o seu uso se difundiu a partir de 1960 com a chagada da “Revolução verde” e, atualmente, o país é um dos maiores consumidores mundiais desses compostos químicos (SHARMA et al., 2020; MOLICA et al., 2021). Esses compostos químicos também denominados de agrotóxicos, praguicidas, fitossanitários, entre outros, podem ser classificados de acordo com seus organismos-alvo e/ou em famílias pelo grupamento químico (MOLICA et al., 2021). No entanto, muitos desses compostos são tóxicos a organismos não-alvo por se bioacumularem no meio-ambiente e nos tecidos dos próprios seres vivos, além de possuírem metabólitos que, por vezes, são mais perigosos à saúde (SHARMA et al., 2020). Devido a essas características, no 26 Brasil os fitossanitários têm se tornado um problema sanitário-ambiental (DJEKKOUN et al., 2021). Para os seres vivos, uma das principais vias de entrada dos fitossanitários é pela ingestão de alimentos e água contaminados (LASCH et al., 2021). A exposição constante a esses compostos pode acarretar o aparecimento de doenças agudas e crônicas, tais como cânceres, distúrbios metabólicos e até mesmo MAFLD (SHARMA et al., 2020; MOLICA et al., 2021). Reforçando essas observações, a dieta desempenha um papel fundamental na metilação do DNA de várias maneiras, uma delas é pela regulação da atividade de enzimas associadas ao ciclo de um carbono ou pelo fornecimento de SAM (S-adenosilmetionina) um cofactor enzimático envolvido na transferência de grupos metil (ZHU et al., 2023). Nos humanos, a biossíntese de uridina é regulada pelo fígado e tecido adiposo, sendo o excesso excretado pelos rins ou catabolizado pelos tecidos num equilíbrio dinâmico (JAIN e JACOBSON, 2022). Entretanto, dietas, abuso de álcool e drogas, interferências ambientais, assim como a intoxicação por pesticidas, entre outros fatores que geram depleção de ATP e alteram as enzimas processadoras de uridinas, quebram a homeostase no metabolismo de pirimidinas e nicotinamida, sugerindo correlação direta com o estabelecimento da esteatose. As pirimidinas são nucleotídeos fundamentais à manutenção celular em todos os organismos, bem como são essenciais a síntese de ácidos nucléicos, ao metabolismo de açúcares e lipídeos, influenciando a homeostase sistêmica e hepática (XIONG et al., 2022). Também é possível citar que a uracila participa de várias reações enzimáticas e, como pode ser convertida a uridina (um nucleosídeo formado por um uracil ligado a um anel de ribose), amplia-se ainda mais as maneiras de atuação metabólica. Estudos apontam que a uridina protege da hepatotoxicidade e atua no metabolismo lipídico quando administrada conjuntamente com tamoxifenos (LE et al., 2014). Reforçando essas observações, outros estudos também descrevem a atuação da uridina no equilíbrio do metabolismo de lipídeos em associação aos níveis de acetilação proteica (LE et al., 2013; ZHANG et al., 2020), bem como a indução de esteatose hepática e diabetes tipo II quando administrada cronicamente (URASAKI et al., 2016), evidenciando mecanismos pós-traducionais nas vias metabólicas moduladas pela uracila. Apesar da relevância do tema, poucos estudos investigam as características dos herbicidas à base de uracila e suas interações com o solo, a água e o metabolismo 27 de organismos expostos. Esses compostos, amplamente utilizados na agricultura, podem persistir no ambiente, contaminando ecossistemas e entrando na cadeia alimentar, o que potencializa seus efeitos tóxicos, representando uma lacuna crítica no entendimento de seus impactos à saúde e ao meio ambiente. Portanto, urge a elucidação dos mecanismos pelos quais contaminantes ambientais derivados de uracila podem intervir nas vias bioquímicas essenciais, como a biossíntese de nucleotídeos, em animais e humanos, podendo comprometer a saúde hepática. Os herbicidas inibidores do fotossistema II, como o terbacil e o bromacil (derivados de uracila), atuam ligando-se ao sítio de ligação da QB na proteína D1 do fotossistema II, localizado nos tilacoides dos cloroplastos. Essa ligação bloqueia o transporte de elétrons de QA para QB, interrompendo a cadeia fotossintética e, consequentemente, a fixação de CO₂ e a produção de ATP e NADPH₂, essenciais para o crescimento vegetal. No entanto, a morte da planta não ocorre apenas por "inanição energética", mas também devido à peroxidação lipídica desencadeada pelo acúmulo de clorofila em estado tripleto. Esse estado altamente reativo gera radicais livres e oxigênio singleto, que oxidam lipídios e proteínas das membranas, levando à ruptura celular, desorganização dos tilacoides e perda de clorofila—processos acelerados pela luz (DE OLIVEIRA, 2011). Embora esses herbicidas atuem especificamente em plantas, surge a questão de como poderiam afetar o metabolismo humano, especialmente se ingeridos ou absorvidos. Em humanos, a disfunção mitocondrial — análoga ao bloqueio da cadeia de elétrons no fotossistema II — pode gerar espécies reativas de oxigênio (EROs), causando estresse oxidativo e danos a lipídios, proteínas e DNA (BEGRICHE et al., 2009; SATAPATI et al., 2015; PETERSEN & SHULMAN, 2018; HUANG et al., 2021; DENG et al., 2024). Estudos como os de Song et al. (2012) e Jin et al. (2019) associam herbicidas que bloqueiam o fotossistema II (como atrazina) à disfunção mitocondrial e ao aumento do estresse oxidativo em células humanas (YANG et al., 2024; LI et al., 2024). Essa interferência poderia comprometer processos celulares críticos, incluindo a função hepática, onde a detoxificação de xenobióticos ocorre. Portanto, a escassez de pesquisas sobre os efeitos crônicos desses herbicidas em humanos reforça a necessidade de investigações mais aprofundadas sobre seus mecanismos de toxicidade e potenciais riscos à saúde. 28 1.2.1 Terbacil O Terbacil, 5-cloro-3-(1,1-dimetiletil)-6-metil-2,4(1H,3H)-pirimidinediona, é um herbicida derivado da uracila, pertencente ao grupo das pirimidinas, cuja fórmula molecular é C9H13IN2O2. A sua estrutura apresenta um anel pirimidínico substituído por grupos cloro, metil e terc-butil (PubChem, 2025), conforme exposto na Fig. 1. O terbacil é um herbicida amplamente utilizado no controle de ervas daninha monocotiledôneas e dicotiledôneas em culturas de cana-de-açúcar, maçã, alfafa, pêssego, noz-pecã e algumas espécies de menta (UNIVERSITY OF HERTFORDSHIRE, 2025). As plantas daninhas crescem espontaneamente e competem diretamente com as plantas cultivadas por luz, água, gás carbônico, nutrientes e espaço e, indiretamente, hospedando doenças e pragas, diminuindo a produção (EMBRAPA, 2025). Na planta, o terbacil é absorvido principalmente pelas raízes e translocado via xilema para as folhas, onde atua inibindo a fotossíntese nas plantas suscetíveis, interferindo no transporte de elétrons no fotossistema II (UNIVERSITY OF HERTFORDSHIRE, 2025). Como resultado do metabolismo do terbacil, principalmente por microrganismos, temos a formação de 3-tert-butyl-5-chloro-a6- hydroxymethyluracil, 6-chloro-2,3-dihydro-7-hydroxymethyl-3,3-dimethyl-5H- oxazolo(3,2-a)-pyrimidin-5-one e 6-chloro-2,3-dihydro-3,3,7-trimethyl-5H-oxazolo(3,2- a) pyrimidin-5-one e em seguida conjugado para formar um β-glucosídeo (PubChem, Figura 1: Representação da estrutura química do terbacil (B), um herbicida com estrutura análoga a de uracila (A) Fonte: PubChem, 2025 A) B) 29 2025). O terbacil é um herbicida persistente, possuindo uma meia vida de 5 a 6 meses no solo, no entanto, estudos apontam para uma baixa afinidade ao solo, tornando-se potencialmente móvel em ambientes terrestres, além da possibilidade de lixiviar para águas subterrâneas, sendo necessário um controle sobre sua ação (MACHADO NETO, 1987; EPA, 1996; EPA 2008). Apesar de ser considerado “praticamente atóxico” em estudos de toxicidade aguda e subcrônica, onde a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA) não classifica o Terbacil como carcinogênico para humanos, a exposição ao terbacil via inalação, contato dérmico ou ingestão acidental, especialmente durante a aplicação agrícola, pode causar irritações na pele, olhos e mucosas respiratórias. Além disso, em estudos com animais, a ingestão de grandes quantidades ao longo do tempo resultou em danos hepáticos, redução de peso fetal e problemas no desenvolvimento fetal (DELAWARE HEALTH AND SOCIAL SERVICES, 2013; EPA, 1996; EPA 2008). No Brasil, a legislação atual não prevê revisões periódicas obrigatórias para o registro de agrotóxicos, o que permite o uso contínuo de produtos que podem estar proibidos em outros países, como na União Europeia, onde o Terbacil não possui aprovação para uso como pesticida sob o Regulamento EC 1107/2009, e seu registro está expirado, sendo proibida sua aplicação nos países membros da EU (FRIEDRICH et al., 2021; UNIVERSITY OF HERTFORDSHIRE, 2025). Portanto, devido às variações nas regulamentações internacionais e aos potenciais riscos à saúde humana, é crucial estudos que verifiquem sua de forma preditiva seus potenciais riscos. 30 1.2.2 Bromacil Assim como o terbacil, o bromacil é um herbicida derivado da uracila pertencente ao grupo das pirimidinas, cuja nomenclatura IUPAC é 5-bromo-3-(butan- 2-il)-6-metilpirimidina-2,4(1H,3H)-diona e a fórmula molecular C9H13BrN2O2. A sua estrutura apresenta um anel pirimidínico substituído por grupos bromo, metil e sec- butil (PubChem, 2025), assim como pode ser observado na Fig. 2. O herbicida bromacil é utilizado para o controle de ervas daninha em áreas não cultivadas e cultura de citrus e abacaxi. O modo de ação do bromacil é muito semelhante ao do terbacil, sendo absorvido principalmente pelas raízes e translocado via xilema para outras folhas, inibindo a fotossíntese nas plantas suscetíveis ao interferir no transporte de elétrons no fotossistema II, gerando folhas amarelas e posterior morte da planta daninha (CONCENÇO; MACHADO; CECCON, 2012). A degradação do Bromacil no solo é influenciada por fatores como a presença de oxigênio, tipo de solo e atividade microbiana, resultando em variações significativas nas taxas de decomposição. Em condições aeróbicas, o bromacil pode apresentar uma meia-vida de aproximadamente 275 dias em solos argilosos, que compõem aproximadamente 24% da superfície do território brasileiro, sendo considerado uma degradação lenta (EMBRAPA, 2025; EPA, 2016). Já em condições anaeróbicas, a meia-vida do bromacil em solos arenosos e argilosos foi estimada entre 144 e 198 dias, enquanto em solos esterilizados a sua degradação foi mínima, indicando a importância da atividade microbiana. (MONTANA DEPARTMENT OF ENVIRONMENTAL QUALITY, s.d.; EPA, 2016). Figura 2: Representação da estrutura química do bromacil (B), um herbicida com estrutura análoga a de uracila (A) Fonte: PubChem, 2025 A) B) 31 Embora não seja considerado altamente tóxico, a exposição ao bromacil via inalação, contato dérmico ou ingestão acidental, especialmente durante seu uso agrícola, pode causar irritação na pele, olhos e mucosas respiratórias, além de ser considerado levemente tóxico se ingerido, entrando na Categoria de Toxicidade IV (a mais baixa de quatro categorias), sendo fundamental que os aplicadores utilizem equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados durante o manuseio e a aplicação do produto para minimizar os riscos à saúde (EPA, 1996, NIOSH, 2012). No Brasil, o uso de Bromacil é regulamentado pelas autoridades competentes, e sua aplicação é permitida para o controle de ervas daninha em culturas de citrus e abacaxi e áreas não cultivadas, no entanto, sua comercialização e aplicação são proibidas nos países membros da União Europeia, uma vez que o Regulamento (CE) nº 1107/2009, que estabelece as regras para a autorização de produtos fitofarmacêuticos no mercado europeu, não consta o herbicida Bromacil na lista de substâncias ativas aprovadas (UNIÃO EUROPEIA, 2009). Por outro lado, nos Estados Unidos, o Bromacil é registrado para uso como herbicida pela Agência de Proteção Ambiental (EPA). No entanto, seu uso é altamente regulamentado devido a preocupações ambientais e de saúde humana. Por exemplo, no estado da Califórnia, o Bromacil é classificado como um "Material Restrito", exigindo licenças específicas para sua compra e aplicação. Além disso, o Bromacil é identificado como um potencial contaminante de águas subterrâneas, o que implica em restrições adicionais para prevenir a contaminação de recursos hídricos (EPA, 1996; NEW JERSEY DEPARTMENT OF HEALTH, 2007; CALIFORNIA DEPARTMENT OF PESTICIDE REGULATION, 2007). A compreensão dos efeitos dos herbicidas à base de uracila, como o bromacil e o terbacil, sobre a saúde humana ainda é limitada devido à escassez de estudos específicos, refletindo em divergências quanto as avaliações de seus supostos riscos nas regulamentações internacionais, de modo que um mesmo composto é permitido em alguns países e proibidos em outros. Diante dessa lacuna de conhecimento, estudos atuais investigam a correlação da exposição de mulheres grávidas a grandes quantidades de contaminantes ambientais ao desenvolvimento precoce de MAFLD em crianças (GALVAN-MARTINEZ et al., 2023; ZHU et al., 2023), sugerindo uma forte atuação dos mecanismos epigenéticos nesses fenômenos. 32 1.3 A EPIGENÉTICA COMO UM ELEMENTO MODULADOR DO METABOLISMO LIPÍDICO NO PROCESSO ESTEATÓTICO HEPÁTICO Os avanços das tecnologias vêm contribuindo para o progresso do conhecimento científico. Nesse contexto, a epigenética vem se destacando por modular a expressão de genes, colaborando com as alterações metabólicas (ZHU et al., 2023). Cunhado por Waddington (1942), as alterações epigenéticas são herdáveis ou reversíveis e podem ser descritas como um conjunto de elementos que atuam na modulação transcricional de genes, de modo que haja alterações no fenótipo, sem alterações do genótipo. A regulação epigenética representa uma camada crítica de controle da expressão gênica que vai além do código genético, abrangendo processos moleculares como metilação de bases de DNA, modificações de histonas e alterações na expressão de RNAs não codificadores, como microRNAs (miRNAs), que conjuntamente regulam a atividade gênica, exercendo um papel fundamental na diferenciação celular, na replicação e adesão das células, no desenvolvimento e na adaptação a estímulos ambientais (ZHU et al., 2023; SHAH; SARKAR, 2024). Considerando os contaminantes ambientais e a toxicidade hepática, na busca de elucidar detalhes mecanísticos, alguns estudos apontam que esses compostos são capazes de induzir alterações metabólicas devido a mudanças epigenéticas observadas nos genomas dos indivíduos que, geralmente, ocorrem no início da doença, alterando o perfil da expressão gênica e, consequentemente, favorecendo o estabelecimento de patogenias (ZHU et al., 2023; MORETTI; ROMEO; VALENTI, 2024). A metilação do DNA, por exemplo, envolve a adição de grupos metil em ilhas CpG, influenciando diretamente a acessibilidade transcricional e moldando fenótipos celulares. No contexto de doenças hepáticas, como a esteatose hepática metabólica (MAFLD), estudos demonstram que a hipometilação global do DNA hepático está associada à instabilidade genômica e ao avanço da doença para o carcinoma hepatocelular, enquanto a hipermetilação de genes específicos, como PPAR-γ coativador 1-α (PGC1-α), está relacionada à resistência à insulina e aos níveis de insulina em jejum (MORETTI; ROMEO; VALENTI, 2024). Além disso, as modificações de histonas, como acetilação, metilação e fosforilação, compõem o chamado "código da cromatina", regulando a acessibilidade 33 do DNA e a transcrição gênica, que estão relacionadas com a plasticidade celular e processos patológicos. É possível observar diversos exemplos na literatura, como a histona acetiltransferase p300, que ativa fatores lipogênicos responsivos à glicose, como ChREBP, promovendo a lipogênese e a esteatose, enquanto as histonas desacetilases (HDACs), como HDAC3, SIRT1 e SIRT6, protegem contra a MAFLD ao desacetilar histonas de genes lipogênicos (MORETTI; ROMEO; VALENTI, 2024; SHAH; SARKAR, 2024) Os RNAs não codificadores, como miRNAs e lncRNAs participam do silenciamento gênico, da remodelação da cromatina e da regulação pós-transcricional. A desregulação de miRNAs podem ter um impacto significativo na homeostase lipídica, inclusive atuando na redução dos níveis de triglicerídeos intracelulares, tornando-os potenciais alvos para diversas terapias (YANG, CAPPELLO e WANG, 2015; SHAH; SARKAR, 2024). A disfunção de miRNAs, como miR-122, miR-21 e miR- 192, está associada ao desenvolvimento e progressão de doenças hepáticas, incluindo a MAFLD e o carcinoma hepatocelular (HCC). Nesse sentido, miR-122, por exemplo, representa 70% dos miRNAs hepáticos e atua no metabolismo lipídico e de colesterol, onde níveis reduzidos de miR-122 estão associados à ativação de vias fibróticas, enquanto níveis elevados são observados em pacientes com MAFLD (MORETTI; ROMEO; VALENTI, 2024). Outros miRNAs, como miR-33a/b e miR- 34a/b/c, estão envolvidos no acúmulo de triglicerídeos e na regulação do metabolismo lipídico, respectivamente (MORETTI; ROMEO; VALENTI, 2024). Portanto, esclarecer mecanismos epigenéticos que são desencadeados por contaminantes ambientais, como a metilação do DNA, as modificações de histonas e a regulação por miRNAs, pode fornecer insights valiosos para o desenvolvimento de terapias direcionadas e estratégias de prevenção para doenças hepáticas metabólicas desencadeadas por contaminantes ambientais e câncer, servindo como uma ferramenta estratégica para a toxicologia preditiva. Esses marcadores não apenas antecipam efeitos tóxicos antes do surgimento de danos clínicos, mas também permitem modelar respostas individuais a toxinas, refinando avaliações de risco e guiando intervenções precisas. Assim, ao decifrar como os poluentes reprogramam a expressão gênica, a epigenética fornece à toxicologia preditiva um mapa dinâmico para prever, prevenir e personalizar ações frente a ameaças químicas. (SHAH; SARKAR, 2024; MORETTI; ROMEO; VALENTI, 2024). 34 1.4 TOXICOLOGIA PREDITIVA Nas últimas décadas, o avanço da industrialização e da globalização resultou no aumento expressivo da produção e do consumo de produtos químicos, levando a uma maior exposição humana a essas substâncias, sendo que, dos mais de 350.000 produtos químicos registrados para a produção, grande parte não possui dados de toxicidade, e menos ainda tem dados toxicológicos in vivo (ZHAO et al., 2024; MORSHEAD; TANGUAY, 2025). Os produtos químicos são encontrados em diversos setores, como a indústria farmacêutica, agroquímica e cosmética, o que amplia os riscos de intoxicação. Essa exposição pode ocorrer por diferentes vias, como contato com a pele, ingestão ou inalação (ZHAO et al., 2024). Dependendo da duração e da concentração da exposição, os efeitos tóxicos podem ser classificados em intoxicações agudas, quando a exposição ocorre em um curto período com manifestação imediata dos sintomas, ou crônicas, quando resultam de exposição prolongada, podendo levar a doenças metabólicas, distúrbios endócrinos ou até mesmo câncer (KHABIB et al., 2022). Diante desse cenário, urge a necessidade de avaliar os riscos dessas substâncias para a saúde humana e o meio ambiente, onde a toxicologia preditiva tem se consolidado como uma abordagem científica essencial para prever e entender os efeitos adversos de compostos químicos. Utilizando modelos in vitro e in silico, busca reduzir a dependência de testes em animais e proporcionar dados mais específicos e reprodutíveis para a espécie humana (MORSHEAD; TANGUAY, 2025). Como mencionado, a exposição aos poluentes ambientais por vezes resulta no desenvolvimento de doenças metabólicas, distúrbios endócrinos ou até mesmo câncer, que é desencadeado por meio de uma série de eventos moleculares e celulares conhecidos como via de resultado adverso (adverse outcome pathway — AOP). Embora ainda a conexão entre a exposição e os efeitos adversos não seja totalmente compreendida, acredita-se que as alterações moleculares nesses processos possam prever a toxicidade (BLACK et al., 2022). A toxicogenômica, uma subárea da toxicologia preditiva, utiliza ferramentas transcriptômicas para analisar alterações nos perfis de expressão gênica induzidas por exposição a substâncias tóxicas, permitindo uma avaliação toxicológica mais detalhada (MEIER et al., 2025). Ainda, para suprir as limitações dos modelos convencionais de toxicologia, diversos modelos alternativos têm sido desenvolvidos, como o peixe-zebra (Danio rerio), vêm ganhando destaque, bem como outros animais inferiores, pois esses modelos têm 35 menos considerações éticas, é mais econômico e permite observação rápida, auxiliando muito o desenvolvimento de triagem de medicamentos em pequena escala (KHABIB et al., 2022; MORSHEAD E TANGUAY, 2025). Outra alternativa é o uso de modelos organ-on-a-chip, que simulam funções fisiológicas humanas em dispositivos microfluídicos tridimensionais, permitindo um monitoramento mais preciso das respostas celulares, ganhando popularidade nas análises de toxicidade de produtos químicos e fármacos (ZHAO et al., 2024). Dentro desse contexto, os modelos de cultura de células humanas se destacam por proporcionar dados mais relevantes para a toxicologia humana, oferecendo um sistema celular altamente reproduzível, prontamente disponível e economicamente viável (BLACK et al., 2022). Embora as culturas celulares bidimensionais (2D) sejam amplamente utilizadas, sua limitação na reprodução do microambiente in vivo tem impulsionado o desenvolvimento de abordagens mais sofisticadas. Como demonstrado por Jeong e Kang (2023), onde os modelos de cocultura surgem como uma alternativa poderosa, permitindo uma análise mais fisiológica das complexas dinâmicas celulares. A integração destes modelos de cocultura com tecnologias emergentes, como sistemas microfluídicos e edição genética CRISPR/Cas9, está ampliando ainda mais suas aplicações. Como observado pelos autores, "estes sistemas cocultura representam uma ponte crítica entre os modelos tradicionais in vitro e os ensaios clínicos, particularmente no desenvolvimento de imunoterapias personalizadas" (JEONG; KANG, 2023, p. 14609). Essa abordagem inovadora está transformando o panorama da pesquisa translacional, oferecendo ferramentas mais precisas para avaliar a eficácia e segurança de novas terapias antes dos ensaios clínicos. Com os avanços da biotecnologia, a toxicologia preditiva tem evoluído significativamente. A integração de tecnologias, como multiômicas (proteômica, metabolômica e epigenômica), aprendizado de máquina e inteligência artificial tem ampliado as possibilidades de análise de dados, tornando os processos mais rápidos, acessíveis e confiáveis (MEIER et al., 2025). A aplicação dessas ferramentas é essencial para a segurança química e regulação de substâncias, proporcionando benefícios diretos à sociedade. Além de minimizar riscos à saúde humana, essa abordagem também reduz a necessidade de testes em animais, atendendo a questões éticas e regulatórias globais (KHABIB et al., 2022). Assim, a toxicologia 36 preditiva continua a se consolidar como um campo essencial para o avanço da ciência e para a proteção da saúde humana e ambiental. 104 5 CONCLUSÕES Os resultados obtidos neste estudo, realizados em cocultivo de células hepáticas HepG2 e LX-2, demonstram que a exposição aos herbicidas terbacil e bromacil induzem alterações significativas no metabolismo hepático, afetando a homeostase lipídica, glicêmica e mitocondrial, além de promover modificações epigenéticas relevantes que podem contribuir para o desenvolvimento de um fenótipo pró-esteatótico hepático, conforme proposto no objetivo geral. A análise bioquímica revelou um aumento significativo nos níveis de triglicerídeos (de 63,98% na concentração de 5 µM de terbacil e 277,54% na concentração de 50 µM de bromacil) e glicose (de 40,70% também na concentração de 5 µM de terbacil e de 108,64% na concentração de 5 nM de bromacil) nas células hepáticas tratadas com os herbicidas independentemente, indicando um desequilíbrio metabólico que favorece o acúmulo lipídico e a resistência à insulina, características marcantes da MAFLD, respondendo assim ao objetivo específico A. Além disso, a disfunção mitocondrial, evidenciada pela redução do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e pelo leve aumento das espécies reativas de oxigênio (ROS) nas condições intermediárias de terbacil e bromacil em função da alta atividade de enzimas antioxidantes, com impacto nos níveis de NAD+ e na atividade de sirtuínas (SIRT1/SIRT3), sugere que os herbicidas comprometem a capacidade mitocondrial e altera o metabolismo oxidativo, o que está diretamente relacionado à desregulação redox e à resistência à insulina As análises epigenéticas revelaram alterações marcantes, incluindo hipermetilação global de DNA, hiperacetilação da histona H3 e redução na metilação m6A, todas associadas à regulação de genes envolvidos no metabolismo lipídico (como SCD1 e SREBP-1c). A diminuição da metilação m6A, juntamente com a redução da expressão dos genes FTO e ALKBH5, sugere um mecanismo de feedback negativo que visa aumentar a metilação do RNA para regular processos metabólicos essenciais, como a lipogênese e a oxidação de ácidos graxos. Essas modificações epigenéticas não apenas validam o potencial dos herbicidas em induzir alterações moleculares duradouras, mas também sugerem biomarcadores promissores para a toxicologia preditiva. A expressão gênica de reguladores metabólicos, como PGC-1α, SIRT1, SIRT3 e SREBP-1c, reforça a ideia de que os herbicidas desencadeiam uma resposta 105 adaptativa nas células hepáticas, que tentam compensar o desequilíbrio metabólico e o estresse oxidativo. No entanto, o aumento da expressão de SREBP-1c, um fator chave na lipogênese, sugere que os herbicidas promovem um ambiente pró- esteatótico, contribuindo para o acúmulo de lipídios no fígado. A ativação de vias antioxidantes, como o aumento da GSH e do NAD+, indica uma tentativa das células de mitigar os danos causados pelos herbicidas, mas essa resposta pode não ser suficiente para prevenir a progressão da doença. Os resultados do Western blot complementam essas observações, revelando uma redução significativa na expressão da proteína SIRT3 em células hepáticas expostas aos herbicidas terbacil e bromacil. As células tratadas com terbacil apresentaram uma diminuição de aproximadamente 47% na expressão de SIRT3, enquanto as expostas ao bromacil mostraram uma redução de cerca de 53%. A SIRT3, uma desacetilase mitocondrial crucial para a regulação do metabolismo energético e do estresse oxidativo, desempenha um papel fundamental na manutenção da homeostase lipídica e na integridade mitocondrial. A diminuição de SIRT3 está associada ao acúmulo de lipídios, ao aumento do estresse oxidativo e à disfunção mitocondrial, fatores que contribuem diretamente para a progressão da MAFLD. Além disso, a redução de SIRT3 compromete a mitofagia, levando ao acúmulo de mitocôndrias disfuncionais e à ativação de vias apoptóticas, o que agrava ainda mais os danos hepáticos. Em síntese, este estudo demonstra que os herbicidas terbacil e bromacil induzem alterações metabólicas, mitocondriais e epigenéticas que podem contribuir para o desenvolvimento da MAFLD. A compreensão desses mecanismos abre caminho para futuras investigações sobre estratégias terapêuticas que visem modular a metilação do RNA, a função mitocondrial e a homeostase redox, com o objetivo de prevenir ou tratar doenças hepáticas associadas à exposição a contaminantes ambientais. Além disso, os resultados destacam a necessidade de maior atenção aos efeitos de herbicidas no metabolismo, reforçando a importância de políticas públicas que promovam o uso seguro e sustentável desses compostos. 106 REFERÊNCIAS AN, Y.; DUAN, H. The role of m6A RNA methylation in cancer metabolism. Molecular Cancer, v. 21, n. 1, p. 14, 2022. Disponível em: . Acesso em: 19 fev. 2025. ARMSTRONG, L. E.; GUO, G. L. Understanding Environmental Contaminants’ Direct Effects on Non-alcoholic Fatty Liver Disease Progression. Current Environmental Health Reports, v. 6, n. 3, p. 95–104, 2019. ASSANTE, G.; CHANDRASEKARAN, S.; NG, S.; et al. Acetyl-CoA metabolism drives epigenome change and contributes to carcinogenesis risk in fatty liver disease. Genome Medicine, v. 14, n. 1, p. 67, 2022. Disponível em: . Acesso em: 3 jul. 2024. BAO, J., SCOTT, I., LU, Z., PANG, L., DIMOND, C., GIUS, D., & SACK, M. (2010). SIRT3 is regulated by nutrient excess and modulates hepatic susceptibility to lipotoxicity.. Free radical biology & medicine, 49 7, 1230-7. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2010.07.009 BARBOSA, T. P. Estabelecimento de um modelo celular pró-esteatótico e as particularidades mecanísticas de atuação do microRNA-1914-5p no metabolismo lipídico. 2020. 91 f. Dissertação (Mestrado) - Curso de Biotecnologia, Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Araraquara, 2020 BARDALLO, Raquel G.; COMPANY-MARIN, Idoia; FOLCH-PUY, Emma; et al. PEG35 and Glutathione Improve Mitochondrial Function and Reduce Oxidative Stress in Cold Fatty Liver Graft Preservation. Antioxidants, v. 11, n. 1, p. 158, 2022. Disponível em: . Acesso em: 17 fev. 2025. BARROSO, E.; RODRÍGUEZ-RODRÍGUEZ, R.; ZAREI, M.; et. al. (2020). SIRT3 deficiency exacerbates fatty liver by attenuating the HIF1α-LIPIN 1 pathway and increasing CD36 through Nrf2. Cell Communication and Signaling : CCS, 18. https://doi.org/10.1186/s12964-020-00640-8 BEGRICHE, K.; KNOCKAERT, L.; MASSART, J.; et al. Mitochondrial dysfunction in nonalcoholic steatohepatitis (NASH): are there drugs able to improve it? Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, v. 6, n. 1–4, p. e11–e23, 2009. Disponível em: . Acesso em: 14 fev. 2025. BILAN, S.; BELOUSOV, V. Genetically encoded probes for NAD+/NADH monitoring. Free Radical Biology and Medicine, v. 100, p. 32–42, 2016. Disponível em: . Acesso em: 17 fev. 2025. BLACK, M. B., STERN, A., EFREMENKO, A., et al. (2022). Biological system considerations for application of toxicogenomics in next-generation risk assessment and predictive toxicology. Toxicology in Vitro, 80, 105311. https://doi.org/10.1016/j.tiv.2022.105311 BUI, C. V.; BOSWELL, C. W.; CIRUNA, B.; et al. Apollo-NADP+ reveals in vivo adaptation of NADPH/NADP+ metabolism in electrically activated pancreatic β cells. Science Advances, v. 9, n. 40, p. eadi8317, 2023. Disponível em: . Acesso em: 17 fev. 2025. CADETE, R. L. da S.. Avaliação da citotoxicidade e genotoxicidade de nanomateriais de celulose em células humanas. Dissertação (Mestrado em 107 Engenharia Biomédica) — Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, 2022. Disponível em: https://run.unl.pt/bitstream/10362/147259/1/Cadete_2022.pdf. Acesso em: 12 fev. 2025. CALIFORNIA DEPARTMENT OF PESTICIDE REGULATION. Active Ingredient: Bromacil - Human Health Risk Assessment and Mitigation. Disponível em: https://www.cdpr.ca.gov/docs/whs/active_ingredient/bromacil.htm. Acesso em: 6 fev. 2025. CHEN, P.; YAO, L.; YUAN, M.; et al. Mitochondrial dysfunction: A promising therapeutic target for liver diseases. Genes & Diseases, v. 11, n. 3, p. 101115, 2024. Disponível em: . Acesso em: 20 fev. 2024. CONCENÇO, G.; MACHADO, L. A. Z.; CECCON, G. Espécies de Sorghum infestantes: importância e manejo em sistemas produtivos. Embrapa Agropecuária Oeste, 2012. 9 p. (Comunicado Técnico, 180). Dourados-MS. Disponível em: https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/939023/1/COT201218 0.pdf. Acesso em: 11 fev. 2025. DA SILVEIRA, M. B.; PANSA, C. C.; MALASPINA, O.; et al. The functional activity of the miR-1914-5p in lipid metabolism of the hepatocarcinoma cell line HepG2: a potential molecular tool for controlling hepatic cellular migration. Molecular Biology Reports, v. 48, n. 4, p. 3463–3474, 2021. Disponível em: . Acesso em: 4 jul. 2024. DAYAL, U.; SONI, U.; BANSAL, S; et al. MAFLD: Exploring the Systemic Effects Beyond Liver. Journal of Community Hospital Internal Medicine Perspectives, v. 15, n. 1, 2025. Disponível em: . Acesso em: 24 fev. 2025. DE OLIVEIRA DA SILVA, Brenda; ALBERICI, Luciane Carla; RAMOS, Letícia Ferreira; et al. Altered global microRNA expression in hepatic stellate cells LX-2 by angiotensin-(1–7) and miRNA-1914-5p identification as regulator of pro-fibrogenic elements and lipid metabolism. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, v. 98, p. 137–155, 2018. Disponível em: . Acesso em: 16 maio 2023. DE OLIVEIRA, Rubem Silvério Júnior; CONSTANTIN, Jamil; INOUE, Miriam Hiroko. Biologia e Manejo de Plantas Daninhas. Curitiba – PR: Ommipax, 2011. DEER, H., Pesticides, 15. UTAH State University. 2004. DELAWARE HEALTH AND SOCIAL SERVICES. Terbacil: Frequently Asked Questions. Disponível em: https://www.dhss.delaware.gov/dph/files/terbacilfaq.pdf. Acesso em: 6 fev. 2025. DENG, Y.; DONG, Y.; ZHANG, S.; et al. Targeting mitochondrial homeostasis in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease: a review. Frontiers in Pharmacology, v. 15, p. 1463187, 2024. Disponível em: . Acesso em: 14 fev. 2025. DJEKKOUN, N. et al. Chronic oral exposure to pesticides and their consequences on metabolic regulation: role of the microbiota. European Journal of Nutrition, v. 60, n. 8, p. 4131–4149, 2021. DUAN, Z.; CAI, G.; LI, J.; et al. U6 can be used as a housekeeping gene for urinary sediment miRNA studies of IgA nephropathy. Scientific Reports, v. 8, n. 1, 108 p. 10875, 2018. Disponível em: . Acesso em: 4 jul. 2024. EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA (EMBRAPA). Solos do Brasil. Disponível em: https://www.embrapa.br/tema-solos-brasileiros/solos- do-brasil. Acesso em: 11 fev. 2025. EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA (EMBRAPA). Ver as daninhas e o uso de herbicidas em cana-de-açúcar. Disponível em: https://www.infoteca.cnptia.embrapa.br/infoteca/bitstream/doc/158597/1/Ervas- daninhas-e-o-uso-de-herbicitas-em-cana-de-acucar.pdf. Acesso em: 6 fev. 2025. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA) (2022). Computational Toxicology Research Program: ToxRefDB, http://www.epa. gov/ncct/toxrefdb/. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (EPA). Bromacil and Bromacil Lithium Salt– Registration Review Preliminary Drinking Water Assessment for All Registered Uses. [s.l.]: EPA. 2016. Disponível em: https://downloads.regulations.gov. Acesso em: 11 fev. 2025. ESPÍNDOLA, Mariana Rodrigues. Comparação de métodos utilizados para ensaios de citotoxicidade in vitro na avaliação de compostos com atividade antiplasmodial. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) — Universidade Federal de São João Del Rei (2016). Disponível em: . Acesso em: 13 fev. 2025. FRIEDRICH, K.; GURGEL, A. M.; ALMEIDA, V. E. S.; SARPA, M. Situação regulatória internacional dos agrotóxicos autorizados para uso no Brasil: potencial de danos à saúde e impactos ambientais. Cadernos de Saúde Pública, v. 37, n. 4, e00061820, 2021. Disponível em: https://doi.org/10.1590/0102-311X00061820. Acesso em: 11 fev. 2025 GALVAN-MARTINEZ, D. H. et al. Nutritional, pharmacological, and environmental programming of MAFLD in early life. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology, v. 324, n. 2, p. G99–G114, 1 fev. 2023 GAO, Y., SUN, Y., BAI, D., & WU, X. (2024). Mechanism of the components compatibility of Scutellariae Radix and Coptidis Rhizoma on mice with hyperlipidemia by regulating the Cyp4a family. Journal of Ethnopharmacology, 331, 118263. https://doi.org/10.1016/j.jep.2024.118263 GOFTON, C.; UPENDRAN, Y.; ZHENG, M. ; et al. MAFLD: How is it different from MAFLD? Clinical and Molecular Hepatology, v. 29, n. Suppl, p. S17–S31, 2023. Disponível em: . Acesso em: 24 fev. 2025. GONG, Pin; LONG, Hui; GUO, Yuxi; et al. Chinese herbal medicines: The modulator of nonalcoholic fatty liver disease targeting oxidative stress. Journal of Ethnopharmacology, v. 318, p. 116927, 2024. Disponível em: . Acesso em: 20 fev. 2024. GOPIKA, M.G.; GOPIDAS, S.; JAYAN, G.l S.; et al. Unveiling thiol biomarkers: Glutathione and cysteamine. Clinica Chimica Acta, v. 563, p. 119915, 2024. Disponível em: . Acesso em: 16 fev. 2025. HIRSCHENSON, J.; MELGAR-BERMUDEZ, E.; MAILLOUX, R. J. The Uncoupling Proteins: A Systematic Review on the Mechanism Used in the Prevention 109 of Oxidative Stress. Antioxidants, v. 11, n. 2, p. 322, 2022. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. HLADY, R. A., ZHAO, X., El KHOURY, L. Y., WAGNER, R. T., et. al.. (2024). Epigenetic heterogeneity hotspots in human liver disease progression. Hepatology. https://doi.org/10.1097/HEP.0000000000001023 HOPP, A-K.; TELONI, F.; BISCEGLIE, L.; et al. Mitochondrial NAD+ Controls Nuclear ARTD1-Induced ADP-Ribosylation. Molecular Cell, v. 81, n. 2, p. 340- 354.e5, 2021. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. HUANG, D. Q.; EL-SERAG, H. B.; LOOMBA, R. Global epidemiology of MAFLD-related HCC: trends, predictions, risk factors and prevention. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology, v. 18, n. 4, p. 223–238, 2021. Disponível em: . Acesso em: 14 fev. 2025. IRSHAD, Nadeem; KHAN, Arif‐ullah; SHAH, Fawad Ali; et al. Antihyperlipidemic effect of selected pyrimidine derivatives mediated through multiple pathways. Fundamental & Clinical Pharmacology, v. 35, n. 6, p. 1119–1132, 2021. Disponível em: . Acesso em: 19 fev. 2024. ISO 10993-5:2009. Avaliação biológica de dispositivos médicos — Parte 5: Testes de citotoxicidade in vitro. Genebra: Organização Internacional para Padronização, 2009. Disponível em: https://www.iso.org/standard/36406.html. Acesso em: 12 fev. 2025. ITSUMI, M.; INOUE, S.; ELIA, A.J; et al. Idh1 protects murine hepatocytes from endotoxin-induced oxidative stress by regulating the intracellular NADP+/NADPH ratio. Cell Death & Differentiation, v. 22, n. 11, p. 1837–1845, 2015. Disponível em: . Acesso em: 17 fev. 2025. JAIN, Shanu; JACOBSON, Kenneth A. Adipocyte purinergic receptors activated by uracil nucleotides as obesity and type 2 diabetes targets. Current Opinion in Pharmacology, v. 63, p. 102190, 2022. Disponível em: . Acesso em: 16 maio 2023. JEONG, So-Ra; KANG, Minyong. Exploring Tumor–Immune Interactions in Co-Culture Models of T Cells and Tumor Organoids Derived from Patients. International Journal of Molecular Sciences, v. 24, n. 19, p. 14609, 2023. Disponível em: . Acesso em: 1 maio 2025. JESUS, R.P. De; WAITZBERG, D.L.; CAMPOS, F.G. Regeneração hepática: papel dos fatores de crescimento e nutrientes. Revista da Associação Médica Brasileira, v. 46, n. 3, p. 242–254, 2000. Disponível em: . Acesso em: 13 fev. 2025. JIANG, Haowen; HE, Clifford Jiajun; LI, Albert M.; et al. Mitochondrial Uncoupling Inhibits Reductive Carboxylation in Cancer Cells. Molecular Cancer Research, v. 21, n. 10, p. 1010–1016, 2023. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. https://doi.org/10.1097/HEP.0000000000001023 110 JOSHI, Dinesh C.; BAKOWSKA, Joanna C. Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments, n. 51, p. 2704, 2011. Disponível em: . Acesso em: 7 mar. 2025. JUN, H-J; KIM, J; HOANG, M-H; et al. Hepatic Lipid Accumulation Alters Global Histone H3 Lysine 9 and 4 Trimethylation in the Peroxisome Proliferator- Activated Receptor Alpha Network. PLoS ONE, v. 7, n. 9, p. e44345, 2012. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. KHABIB, M.N.H; SIVASANKU, Y.; LEE, H.B.; et al. Alternative animal models in predictive toxicology. Toxicology, v. 465, p. 153053, 2022. Disponível em: . Acesso em: 11 fev. 2025. KIM, Dae Joong. The Role of the DNA Methyltransferase Family and the Therapeutic Potential of DNMT Inhibitors in Tumor Treatment. Current Oncology, v. 32, n. 2, p. 88, 2025. Disponível em: . Acesso em: 7 mar. 2025. KIM, D-H.; KIM, J.; KWON, J-S.; et al. Critical Roles of the Histone Methyltransferase MLL4/KMT2D in Murine Hepatic Steatosis Directed by ABL1 and PPARγ2. Cell Reports, v. 17, n. 6, p. 1671–1682, 2016. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. KLEIN, R.; NAGY, O.; TÓTHOVÁ, C.; et al. Clinical and Diagnostic Significance of Lactate Dehydrogenase and Its Isoenzymes in Animals. Veterinary Medicine International, v. 2020, p. 1–11, 2020. Disponível em: . Acesso em: 30 jun. 2024. KU, T. et al. Tebuconazole induces liver injury coupled with ROS-mediated hepatic metabolism disorder. Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 220, p. 112309, 2021. LASCH, A. et al. More than additive effects on liver triglyceride accumulation by combinations of steatotic and non-steatotic pesticides in HepaRG cells. Archives of Toxicology, v. 95, n. 4, p. 1397–1411, 2021. LE, Thuc T.; ZIEMBA, Amy; URASAKI, Yasuyo; et al. Disruption of uridine homeostasis links liver pyrimidine metabolism to lipid accumulation. Journal of Lipid Research, v. 54, n. 4, p. 1044–1057, 2013. LE, Thuc T; URASAKI, Yasuyo; PIZZORNO, Giuseppe. Uridine prevents tamoxifen-induced liver lipid droplet accumulation. BMC Pharmacology and Toxicology, v. 15, n. 1, p. 27, 2014. Disponível em: . Acesso em: 16 maio 2023. LEIVAS, G. et al. Accuracy of ultrasound diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease in patients with classes II and III obesity: A pathological image study. Obesity Research & Clinical Practice, v. 15, n. 5, p. 461–465, 2021 LI, R., WANG, Z., WANG, Y., et al. (2023). SIRT3 regulates mitophagy in liver fibrosis through deacetylation of PINK1/NIPSNAP1. Journal of Cellular Physiology, 238, 2090 - 2102. https://doi.org/10.1002/jcp.31069 LI, R., XIN, T., LI, D., et al. (2018). Therapeutic effect of Sirtuin 3 on ameliorating nonalcoholic fatty liver disease: The role of the ERK-CREB pathway and Bnip3-mediated mitophagy. Redox Biology, 18, 229 - 243. https://doi.org/10.1016/j.redox.2018.07.011 111 LI, S.; SUN, D.; CHEN, S.; et al. (2024). UCP2–SIRT3 Signaling Relieved Hyperglycemia-Induced Oxidative Stress and Senescence in Diabetic Retinopathy. Investigative Opthalmology & Visual Science, v. 65, n. 1, p. 14,. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. LI, Xiao-Wei; YI, Bao-Jin; WANG, Zhao-Yi; et al. The ROS/SIRT1/STAR axis as a target for melatonin ameliorating atrazine-induced mitochondrial dysfunction and steroid disorders in granulosa cells. Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 269, p. 115780, 2024. Disponível em: . Acesso em: 1 maio 2025. LI, Y., CHOI, D., LEE, E.,et al.. (2016). Sirtuin 3 (SIRT3) Regulates α-Smooth Muscle Actin (α-SMA) Production through the Succinate Dehydrogenase-G Protein- coupled Receptor 91 (GPR91) Pathway in Hepatic Stellate Cells*. The Journal of Biological Chemistry, 291, 10277 - 10292. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.692244 LICHTENSTEIN, D. et al. An eight-compound mixture but not corresponding concentrations of individual chemicals induces triglyceride accumulation in human liver cells. Toxicology, v. 459, p. 152857, 2021. LIND, P. M.; SALIHOVIC, S.; LIND, L. (2018). High plasma organochlorine pesticide levels are related to increased biological age as calculated by DNA methylation analysis. Environment International, v. 113, p. 109–113. Disponível em: . Acesso em: 2 jul. 2024. LIU, J., LI, D., ZHANG, T., et al. (2017). SIRT3 protects hepatocytes from oxidative injury by enhancing ROS scavenging and mitochondrial integrity. Cell Death & Disease, 8. https://doi.org/10.1038/cddis.2017.564 LIU, L., XING, D., DU, X., et al. (2020). Sirtuin 3 improves fatty acid metabolism in response to high nonesterified fatty acids in calf hepatocytes by modulating gene expression. Journal of dairy science. https://doi.org/10.3168/jds.2019-17670 LIU, Y.J.; KIMURA, M.; LI, X.; et al. ACMSD inhibition corrects fibrosis, inflammation, and DNA damage in MASLD/MASH. Journal of Hepatology, v. 82, n. 2, p. 174–188, 2025. Disponível em: . Acesso em: 17 fev. 2025. LOPES, Gabriela Wünsch; CANHADA, Scheine Leite; REIS, Rodrigo Citton Padilha Dos; et al. Comparing diabetes prediction based on metabolic dysfunction- associated steatotic liver disease and nonalcoholic fatty liver disease: the ELSA- Brasil study. Cadernos de Saúde Pública, v. 40, n. 11, p. e00009924, 2024. Disponível em: . Acesso em: 1 maio 2025. MA, Wenzhe; TANG, Chao; LAI, Luhua. Specificity of Trypsin and Chymotrypsin: Loop-Motion-Controlled Dynamic Correlation as a Determinant. Biophysical Journal, v. 89, n. 2, p. 1183–1193, 2005. Disponível em: . Acesso em: 28 abr. 2025. MACHADO NETO, Joaquim Gonçalves. Efeitos do uso contínuo de herbicidas residuais na composição específica da comunidade infestante e na presença de resíduos no solo de um pomar de citrus (Citrus sinensis (L.) OSBECK). 1987. Dissertação (Mestrado em Engenharia Agrônoma) – ESALQ , 112 Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1987. Disponível em: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11136/tde-20210918- 212105/publico/MachadoNetoJoaquimGoncalves.pdf. Acesso em: 11 fev. 2025. MAHNA, D.; PURI, S.; SHARMA, S. DNA methylation modifications: mediation to stipulate pesticide toxicity. International Journal of Environmental Science and Technology, v. 18, n. 2, p. 531–544, 2021. Disponível em: . Acesso em: 2 jul. 2024. MEIER, M.J.; HARRILL, J.; JOHNSON, K.; et al. Progress in toxicogenomics to protect human health. Nature Reviews Genetics, v. 26, n. 2, p. 105–122, 2025. Disponível em: . Acesso em: 12 fev. 2025. MING, X.; CHEN, S.; LI, H.; et al. m6A RNA Methylation and Implications for Hepatic Lipid Metabolism. DNA and Cell Biology, v. 43, n. 6, p. 271–278, 2024. Disponível em: . Acesso em: 19 fev. 2025. MOLICA, L. R.; BARRETO, I. I.; MORAES, K. C. M. Fitossanitários e doenças hepáticas: Um desafio à saúde pública no Brasil. Research, Society and Development, v. 10, n. 9, p. e15910917835, 23 jul. 2021. MONTANA DEPARTMENT OF ENVIRONMENTAL QUALITY. Bromacil Health Advisory. Helena: Montana DEQ, S.D. Disponível em: https://deq.mt.gov/files/Water/WQPB/Standards/Bromacil.pdf. Acesso em: 11 fev. 2025 MORETTI, V; ROMEO, S; VALENTI, L. (2024)The contribution of genetics and epigenetics to MAFLD susceptibility. Hepatology International, v. 18, n. S2, p. 848– 860. Disponível em: . Acesso em: 25 fev. 2025. MORSHEAD, M. L.; TANGUAY, R. L. Advancements in the developmental zebrafish model for predictive human toxicology. Current Opinion in Toxicology, v. 41, p. 100516, 2025. Disponível em: . Acesso em: 12 fev. 2025. MOSMANN, Tim. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, v. 65, n. 1–2, p. 55–63, 1983. Disponível em: . Acesso em: 16 maio 2023. MU, Y; SUN, J; LI, Z; et al. (2022) Activation of pyroptosis and ferroptosis is involved in the hepatotoxicity induced by polystyrene microplastics in mice. Chemosphere, v. 291, p. 132944. Disponível em: . Acesso em: 16 fev. 2024. NESCI, S.; RUBATTU, S. UCP2, a Member of the Mitochondrial Uncoupling Proteins: An Overview from Physiological to Pathological Roles. Biomedicines, v. 12, n. 6, p. 1307, 2024. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. NEW JERSEY DEPARTMENT OF HEALTH. Hazardous Substance Fact Sheet - Bromacil. 2007. Disponível em: https://nj.gov/health/eoh/rtkweb/documents/fs/0251.pdf. Acesso em: 6 fev. 2025. Ni, X., Gao, C., Zhu, X., Zhang, X., Fang, Y., & Hao, Z. (2024). Isobavachalcone induces hepatotoxicity in zebrafish embryos and HepG2 cells via 113 the System Xc− ‐GSH‐GPX4 signaling pathway in ferroptosis response. Journal of Applied Toxicology, 44(8), 1139–1152. https://doi.org/10.1002/jat.4607 NIOSH Pocket Guide to Chemical Hazards. Bromacil. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Disponível em: https://www.cdc.gov/niosh/npg/npgd0063.html. Acesso em: 6 fev. 2025. NISHIHIRA, Tomohiko; TANAKA, Junji; NISHIKAWA, Kastuhide; et al. Biological significance of enhanced mitochondrial membrane potential in regenerating liver. Hepatology, v. 6, n. 2, p. 220–224, 1986. Disponível em: . Acesso em: 30 jun. 2024. OLSON, J.R.; HOSKO, M.J.; FUJIMOTO, J.M. (1979) Alterations in the liver cell transmembrane potential following CCl4 and bile salt treatment of rats. Life Sciences, v. 25, n. 24–25, p. 2043–2050,. Disponível em: . Acesso em: 30 jun. 2024. PARK, P-H; LIM, R.W.; SHUKLA, S.D. Gene-Selective Histone H3 Acetylation in the Absence of Increase in Global Histone Acetylation in Liver of Rats Chronically Fed Alcohol. Alcohol and Alcoholism, v. 47, n. 3, p. 233–239, 2012. Disponível em: . Acesso em: 2 jul. 2024. PAROLIN, M.B; REASON, I.J. M. Apoptose como mecanismo de lesão nas doenças hepatobiliares. Arquivos de Gastroenterologia, v. 38, n. 2, p. 138–144, 2001. Disponível em: . Acesso em: 13 fev. 2025. PASTORE, D.; TRONO, D.; LAUS, M. N.; et al. (2006). Possible plant mitochondria involvement in cell adaptation to drought stress: A case study: durum wheat mitochondria. Journal of Experimental Botany, v. 58, n. 2, p. 195–210. Disponível em: . Acesso em: 18 fev. 2025. PERRY, Seth W.; NORMAN, John P.; BARBIERI, Justin; et al. Mitochondrial Membrane Potential Probes and the Proton Gradient: A Practical Usage Guide. BioTechniques, v. 50, n. 2, p. 98–115, 2011. Disponível em: . Acesso em: 7 mar. 2025. PETERSEN, M.C.; SHULMAN, G.I. (2018). Mechanisms of Insulin Action and Insulin Resistance. Physiological Reviews, v. 98, n. 4, p. 2133–2223. Disponível em: . Acesso em: 14 fev. 2025. PUBCHEM. Bromacil. Disponível em: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Bromacil. Acesso em: 11 fev. 2025. PUBCHEM. Terbacil. Disponível em: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Terbacil. Acesso em: 11 fev. 2025. RABELO, A.C.S; ANDRADE, A.K.L.; COSTA, D.C. The Role of Oxidative Stress in Alcoholic Fatty Liver Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis of Preclinical Studies. Nutrients, v. 16, n. 8, p. 1174, 2024. Disponível em: . Acesso em: 17 fev. 2025. RAHMAN, I.; KODE, A.; BISWAS, S.K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nature Protocols, v. 1, n. 6, p. 3159–3165, 2006. Disponível em: . Acesso em: 16 fev. 2025. 114 REYNAERT, H. (2002). Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut, 50(4), 571–581. https://doi.org/10.1136/gut.50.4.571 RIUS-PÉREZ, S; TORRES-CUEVAS, I; MILLÁN, I; et al. PGC-1 α , Inflammation, and Oxidative Stress: An Integrative View in Metabolism. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, v. 2020, p. 1–20, 2020. Disponível em: . Acesso em: 21 fev. 2024. SATAPATI, S; KUCEJOVA, B; DUARTE, J A.G.; et al. (2015). Mitochondrial metabolism mediates oxidative stress and inflammation in fatty liver. Journal of Clinical Investigation, v. 125, n. 12, p. 4447–4462. Disponível em: . Acesso em: 14 fev. 2025. SCHWAB, M; THUNBORG, K; AZIMZADEH, O; et al. Targ