RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 06/03/2026. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) AVALIAÇÃO DO POTENCIAL LÍTICO DE ENDOLISINAS PRODUZIDAS POR FAGOS DE Xanthomonas citri MARIO NICOLAS CACCALANO Rio Claro – SP 2024 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) AVALIAÇÃO DO POTENCIAL LÍTICO DE ENDOLISINAS PRODUZIDAS POR FAGOS DE Xanthomonas citri MARIO NICOLAS CACCALANO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia). Orientador: Dr. Henrique Ferreira Rio Claro – SP 2024 C118a Caccalano, Mario Nicolas Avaliação do potencial lítico de endolisinas produzidas por fagos de xanthomonas citri / Mario Nicolas Caccalano. -- Rio Claro, 2024 81 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientador: Henrique Ferreira 1. Cancro cítrico. 2. Bacteriófago. 3. Enzima. 4. Peptidoglicano. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Rio Claro AVALIAÇÃO DO POTENCIAL LÍTICO DE ENDOLISINAS PRODUZIDAS POR FAGOS DE Xanthomonas citri TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: CERTIFICADO DE APROVAÇÃO AUTOR: MARIO NICOLAS CACCALANO ORIENTADOR: HENRIQUE FERREIRA Aprovado como parte das exigências para obtenção do Título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia), área: Estrutura, Função e Produção de Biomoléculas pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. HENRIQUE FERREIRA (Participaçao Virtual) Departamento de Biologia Geral e Aplicada / Unesp - IB Rio Claro Prof. Dr. GUILHERME DILARRI (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia de Pesca e Ciências Biológicas / Universidade do Estado de Santa Catarina - UDESC Profa. Dra. ALINE MARIA DA SILVA (Participaçao Virtual) Departamento de Bioquímica / USP Rio Claro, 06 de março de 2024 Instituto de Biociências - Câmpus de Rio Claro - Avenida 24 A, 1515, 13506900 https://ib.rc.unesp.br/#!/pos-graduacao/secao-tecnica-de-pos/programas/biologia-celular-e-molecular/CNPJ: 48.031.918/0018-72. P ág . 0 1 de 0 1 - D oc um en to a ss in ad o di gi ta lm en te . P ar a co nf er ên ci a, a ce ss e o si te h ttp s: //p or ta l.s gp e. se a. sc .g ov .b r/ po rt al -e xt er no e in fo rm e o pr oc es so U D E S C 0 00 08 40 3/ 20 24 e o c ód ig o H JJ C 91 65 . 4 “Without error there can be no brilliancy” ― Emanuel Lasker AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente à FAPESP, pelo apoio financeiro através do processo nº2022/01814-0, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), que permitiu a realização desse trabalho. Agradeço ao meu orientador Henrique Ferreira por toda ajuda e ensinamento durante minhas iniciações cientificas e agora durante o meu mestrado. Agradeço aos membros do LGB – Caio, Natalia, Giovane, Vitor, Victor, Rayanne, Gabriel, João, Igor, Guilherme, Giovanna. Agradeço meus pais Danilo e Tânia, ao meu irmão Matias. Agradeço meus amigos Natalia, Talita, Juliana, Lourenço, Gustavo. Agradeço ao grupo de pesquisa do professor Carlos Henrique Inacio Ramos e ao aluno Leonardo Alves Linhares pela ajuda com os ensaios de Dicroísmo Circular. RESUMO O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). Essa bactéria é responsável por diversas perdas na produção de citrus. Assim o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial de endolisinas de bacteriófagos como possíveis antimicrobianos anti - X. citri. Selecionamos 4 genes, dois de cada bacteriófago, para isolamento e construção de sistemas de expressão heteróloga em bactérias. Para os genes do bacteriófago CP1 não fomos capazes de realizar a amplificação por PCR de nenhum dos genes selecionados. Para os dois genes selecionados do bacteriófago CP2, conseguimos amplificar ambos, mas não observamos expressão aparente da endolisina CP2_29-His. Conseguimos, entretanto, expressar e purificar a proteína His-CP2_07. Com a caracterização estrutural por meio do dicroísmo circular (CD), observamos presença de cerca de 40,8% de alfa-hélices. Além disso, realizamos ensaios de estabilidade térmica na faixa de 20 ºC a 90 ºC, onde observamos perda de estrutura a partir dos 50 ºC. Entretanto, com o resfriamento da amostra, observamos um possível ganho de estrutura ocasionado por provável re-enovelamento da proteína. Avaliamos a atividade enzimática da endolisina, onde observamos a degradação de fragmentos celulares de Pseudomonas aeruginosa, bem como degradação do peptidoglicano purificado de Bacillus subtilis. Observamos também ação bactericida da endolisina em X. citri, bem como de outros isolados de interesse clínico (P. aeruginosa e E. coli). Avaliamos também a lise celular de X. citri tratadas com a His-CP2_07 e EDTA 0,375 mM. Estabelecemos a estabilidade de nossa endolisina em pHs próximos ao neutro ou levemente alcalinos e salinidades próximas de 60 mM. Desta forma, nossos resultados demonstram o potencial bactericida de His-CP2_07 contra X. citri e abre caminho para o desenvolvimento de formulações alternativas para controle desta bactéria, bem como de outras bactérias de interesse clínico. Palavras-chave: Cancro-cítrico; Bacteriófagos; Enzima, Peptidoglicano ABSTRACT Citrus canker is a disease caused by the Gram-negative bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri). This bacteria is responsible for several losses in citrus production. Thus, the objective of the present work was to evaluate the potential of bacteriophage endolysins as possible anti-X. citri antimicrobials. We selected 4 genes, two from each bacteriophage, for isolation and construction of heterologous expression systems in bacteria. For the CP1 bacteriophage genes, we were unable to perform PCR amplification of any of the selected genes. For the two genes selected from bacteriophage CP2, we were able to amplify both, but we did not observe apparent expression of the CP2_29-His endolysin. We were, however, able to express and purify the His-CP2_07 protein. With structural characterization using circular dichroism (CD), we observed the presence of around 40.8% alpha-helices. Furthermore, we carried out thermal stability tests in the range of 20 ºC to 90 ºC, where we observed loss of structure from 50 ºC onwards. However, as the sample cooled, we observed a possible gain in structure caused by probable refolding of the protein. We evaluated the enzymatic activity of endolysin, where we observed the degradation of cellular fragments of Pseudomonas aeruginosa, as well as degradation of peptidoglycan purified from Bacillus subtilis. We also observed the bactericidal action of endolysin in X. citri, as well as other isolates of clinical interest (P. aeruginosa and E. coli). We also evaluated cell lysis of X. citri treated with His- CP2_07 and 0.375 mM EDTA. We established the stability of our endolysin at pHs close to neutral or slightly alkaline and salinities close to 60 mM. Thus, our results demonstrate the bactericidal potential of His-CP2_07 against X. citri and paves the way for the development of alternative formulations to control this bacterium, as well as other bacteria of clinical interest. Keywords: Citrus canker; Bacteriophages; Enzyme, Peptidoglycan Sumário 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 9 1.1 Importância da Citricultura .............................................................................................. 9 1.2 Bacteriófagos ............................................................................................................... 10 1.3 Estrutura do peptidoglicano ........................................................................................... 11 1.4 Endolisinas ................................................................................................................... 12 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 15 2.1 Bacteriófagos como alternativa ao combate a isolados de interesse clínico ........................ 15 2.2 Uso de bacteriófagos na agricultura e como forma de aumentar o shelf-life de alimentos ... 17 2.3 Endolisinas como forma de controle antimicrobiano em alimentos ................................... 18 2.4 Endolisinas como forma de combate a isolados de interesse clínico .................................. 19 3 OBJETIVOS ................................................................................................................... 21 3.1 Objetivo geral ............................................................................................................... 21 3.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 21 4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................. 22 4.1 Linhagens bacterianas e condições de cultivo ................................................................. 22 4.2 Propagação e manutenção dos bacteriófagos ................................................................... 23 4.3 Procedimentos gerais de biologia molecular ................................................................... 24 4.4 Bioinformática: busca por genes candidatos .................................................................... 25 4.5 Modelagem in silico das endolisinas .............................................................................. 25 4.6 Desenho dos primers ..................................................................................................... 25 4.7 Amplificação dos genes do bacteriófago CP1 ................................................................. 26 4.8 Amplificação dos genes do bacteriófago CP2 ................................................................. 28 4.9 Condições de expressão da endolisina His-CP2_07 e CP2_29-His ................................... 29 4.10 Condições de purificação da endolisina ........................................................................ 29 4.11 Quantificação proteica ................................................................................................. 30 4.12 Avaliação da atividade das endolisinas ......................................................................... 30 4.13 Dicroísmo Circular (CD) e estabilidade térmica ............................................................ 31 4.14 Purificação e coloração do extrato bruto de peptidoglicano de X. citri............................. 31 4.15 Avaliação da ação do NaCl e pH na atividade enzimática .............................................. 32 4.16 Purificação do peptidoglicano de B. subtilis e avaliação da atividade enzimática ............. 33 4.17 Avaliação do efeito bactericida da endolisina ................................................................ 34 4.18 Curva de crescimento com endolisina e EDTA ............................................................. 34 4.19 Análise estatística e construção dos gráficos ................................................................. 35 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 36 5.1 Propagação dos bacteriófagos ........................................................................................ 36 5.2 Avaliação da estrutura e classificação das endolisinas ..................................................... 37 5.2.1 Gene CP1_30 ............................................................................................................ 37 5.2.2 Gene CP1_21 ............................................................................................................ 38 5.2.3 Gene CP2_07 ............................................................................................................ 39 5.2.4 Gene CP2_29 ............................................................................................................ 40 5.3 Clonagem das endolisinas ............................................................................................. 41 5.3.1 Amplificação dos genes do bacteriófago CP1 ............................................................... 41 5.3.2 Amplificação e clonagem dos genes do bacteriófago CP2 ............................................. 41 5.4 Expressão das endolisinas ............................................................................................. 46 5.4.1 Expressão da endolisina His-CP2_07 .......................................................................... 46 5.4.2 Expressão da endolisina CP2_29-His .......................................................................... 48 5.5 Purificação da proteína His-CP2_07 ............................................................................... 49 5.6 Potencial de degradação do peptidoglicano de P. aeruginosa pela endolisina His-CP2_07 . 50 5.7 Avaliação da estrutura da His-CP2_07 por dicroísmo circular (CD) ................................. 51 5.8 Avaliação da estabilidade térmica da endolisina His-CP2_07 ........................................... 52 5.9 Estabilidade da endolisina em diferentes concentrações de NaCl ...................................... 56 5.10 Estabilidade da endolisina em diferentes pHs ................................................................ 57 5.11 Avaliação da atividade enzimática da endolisina His-CP2_07 em peptidoglicano purificado de B. subtilis ...................................................................................................................... 58 5.12 Avaliação da atividade bactericida da endolisina His-CP2_07 ........................................ 59 5.13 Curva de crescimento com X. citri ................................................................................ 65 6.0 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 67 7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 68 9 1 INTRODUÇÃO 1.1 Importância da Citricultura A citricultura é uma atividade econômica que gera diversos empregos no setor agrícola, apresentando assim uma alta importância na economia brasileira (Neves, 2010). Atualmente o Brasil é líder mundial na produção de laranjas doce com produção estimada de 309,34 milhões de caixas referente a safra 2023/2024 (FUNDECITRUS, 2023). O Brasil é responsável por 80% do total de suco de laranja exportado do mundo. E somente a região sudeste é responsável por mais de 70% da produção de laranjas do país, o que se deve à enorme produtividade da citricultura no estado de São Paulo (IBGE, 2016). Apesar disso, essa produção é constantemente ameaçada por diversas doenças infecciosas, dentre elas, o cancro cítrico e o huanglongbing (HLB) que juntas já tomam 30-40% das árvores do cinturão citrícola brasileiro (FUNDECITRUS). O cancro cítrico é causado pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri), classificada como Proteobactérias. X. citri é aeróbia obrigatória, possui morfologia de bastonetes e apresenta um flagelo polar (DAS, 2003). O cancro cítrico é uma doença que acomete todas as variedades de citros de importância econômica (GOTTWALD et al., 2002). A infeção e doença ocorre quando a bactéria penetra o tecido vegetal através dos estômatos e lesões vegetais, causando a queda prematura de frutos e desfolha quando em alta severidade (GOTTWALD et al., 2002). Lesões causadas pelo cancro são superficiais e não interferem no uso da fruta para produção de suco. Contudo, os frutos sintomáticos perdem o valor como fruto de mesa e, portanto, há uma depreciação no seu valor agregado. A disseminação do fitopatógeno ocorre principalmente pela ação da chuva e do vento, podendo ser exacerbada pela larva minador dos citros, que ao se alimentar do mesofilo foliar produz galerias facilitando a infecção (CHAGAS, 2001). A principal forma de manejo do cancro cítrico hoje no estado de São Paulo é feita através da aplicação recorrente de soluções à base de cobre, como o oxicloreto de cobre e hidróxido de cobre, bem como uso de quebras-vento para conter a disseminação da doença, uso de mudas sadias para início de pomares e controle da larva minadora dos citros. Contudo, as formulações a base de cobre apresentam toxicidade para animais, vegetais e para a microbiota do solo (FONES & PRESTON 2013; BRUNETTO et al., 10 2016; CORNU et al., 2017;). Em plantas, o excesso de cobre é capaz de causar estresse oxidativo através da formação de espécies reativas de oxigênio (YRUELA, 2009; RAVET & PILON, 2013;). Consequentemente, há a degradação de diversas proteínas e enzimas celulares que podem acarretar na inibição do crescimento vegetal (YRUELA, 2009). Plantas sujeitas a altas concentrações de cobre podem apresentar sintomas como clorose e necrose dos tecidos vegetais (DUCIC & POLLE, 2005). Finalmente, já houve relatos de isolados de Xanthomonas resistentes a esses compostos (BEHLAU et al., 2013). Sendo assim, se faz necessária a buscar por novas alternativas ao cobre para o combate desse fitopatógeno. 1.2 Bacteriófagos Na biosfera existem cerca de 1031 partículas virais, presentes em diversos ambientes e ecossistemas, tendo papel fundamental na dinâmica de diversas populações nesses ambientes (STONE et al., 2019). Os vírus são capazes de infectar diversos organismos como bactérias, archaea e eucariontes (SUTTLE, 2007). Dentro da população viral, há um grupo de vírus que tem como hospedeiro as bactérias, são os chamados bacteriófagos (O'SULLIVAN et al., 2019). Ao injetarem seu material genético na célula hospedeira, os bacteriófagos se multiplicam usando a própria maquinaria celular bacteriana (SHARMA et al., 2017). De maneira geral, os bacteriófagos são compostos por uma cabeça icosaédrica, na qual se encontra o material genético, que é normalmente um DNA de fita dupla, ligada a uma cauda longa, que pode ser contrátil ou não (NORTH & DAVIDSON, 2021). A cauda tem a função de canal de transporte do material genético viral para a célula hospedeira (NOBREGA et al., 2018). O reconhecimento do hospedeiro é feito mediante a interação de proteínas da cauda do bacteriófago e antígenos de superfície da bactéria hospedeira (processo denominado de adsorção) (NOBREGA et al., 2018). Os bacteriófagos são geralmente classificados em relação ao tipo de ácido nucléico que possuem, sua morfologia, modo de infecção, filogenia, sua especificidade ao hospedeiro, sensibilidade a agentes físicos e químicos, bem como ao ambiente que é encontrado (ACKERMANN, 2009). Sua propagação ocorre de duas formas: por ciclo lítico ou lisogênico. No ciclo lítico, os fagos causam a lise das células bacterianas hospedeiras para liberar a progênie viral produzida durante infecção (YOUNG, 2002). 11 Para tal, fazem uso de enzimas (endolisinas) capazes de quebrar o peptidoglicano. Já no ciclo lisogênico, há a integração do material genético do fago no genoma do hospedeiro, que é replicado em conjunto com o DNA do hospedeiro (EREZ et al., 2017). 1.3 Estrutura do peptidoglicano O peptidoglicano é uma estrutura que circunda a membrana celular bacteriana, oferece rigidez a célula e serve de moldura para a fixação de diversas proteínas e outros polímeros. Esta auxilia na manutenção da forma celular e permite a passagem de algumas substâncias químicas por difusão (PAZOS & PETERS, 2019). O peptidoglicano é uma estrutura tridimensional formada por uma porção peptídica e uma porção de açúcar (glicano). O peptidoglicano é um polímero que alterna o ácido-N-acetilmurâmico (MurNAc) e o N-acetilglicosamina (GlcNAc). Esses resíduos são ligados através de uma ligação beta (1-4) (figura 1) (Nelson et al.,2012). Essa cadeia é ligada covalentemente à cadeia peptídica através de uma ligação amida entre o MurNAc e a L-alanina, o primeiro aminoácido da cadeia peptídica. O restante dessa cadeia peptídica é formado por formas L e D alternadas de aminoácidos que variam de bactéria para bactéria (NELSON et al.,2012). Nas bactérias Gram-negativas e em algumas bactérias Gram-positivas como o gênero Bacillus, há a presença de um resíduo do Ácido diaminopimélico na terceira posição da cadeia peptídica. Em contrapartida, na maior parte das Gram-positivas, essa posição é ocupada por uma L-lisina (NELSON et al.,2012). 12 Figura 1 - Representação esquemática da estrutura do peptidoglicano (PG) de Staphylococcus aureus. A - N-acetilglicosaminidase hidrolisa o componente glicano da PG no lado redutor da GlcNAc. B - N-acetil muramidase (também conhecida como "muramidase" ou "lisozima") hidrolisa o componente glicano do PG no lado redutor do MurNAc. Da mesma forma, as transglicosilases líticas quebram a mesma ligação, mas formam intermediários N-acetil-1,6- anidromuramil durante a clivagem. C - A amidase N-acetilmuramoil-L-alanina cliva uma ligação amida entre a parte glicana (MurNAc) e a parte peptídica (L-alanina) da parede celular. D-G - Uma endopeptidase cliva uma ligação amida entre os aminoácidos. Adaptado de NELSON et al.,2012. Por conta da alta taxa de conservação da estrutura do peptidoglicano entre os organismos, há um número limitado de sítios de clivagem para endolisinas e outras hidrolases (NELSON et al.,2012). 1.4 Endolisinas Endolisinas são enzimas capazes de degradar o peptidoglicano presente na parede celular bacteriana. O primeiro relato de sua atividade ocorreu com a própria descoberta dos bacteriófagos por Frederick W (TWORT & LOND, 1915). Essas enzimas podem ser encontradas em quase todos os bacteriófagos (SCHMELCHER & LOESSNER, 2016). Elas são produzidas durante o ciclo lítico destes vírus (SCHMELCHER et al., 2012) e degradam a parede celular bacteriana de dentro para fora das células (STONE et al., 2019). De maneira geral, as endolisinas são agrupadas em 4 principais classes e mecanismos de lise do peptidoglicano. São elas as glicosidases, as endopeptidases, as amido hidrolases e as transglicosilases. As glicosidases clivam a região glicana do peptidoglicano no lado redutor do GlcNAc (Figura 1 A). Outra glicosidase cliva o peptidoglicano no lado redutor do MurNAc (Figura 1 B). 13 A segunda classe são as denominadas amido hidrolases que clivam uma ligação amida entre a cadeia glicana (MurNAc) e a cadeia peptídica (L-alanina) do peptidoglicano (figura 1C). A terceira classe são as endopeptidases que clivam as ligações peptídicas entre os aminoácidos (figura 1 D-1 G). Por fim, a última classe de endolisinas são as transglicosilases que não são verdadeiras hidrolases por não precisarem de água para realizar a clivagem do substrato (Nelson et al.,2012). Essas enzimas são bastante semelhantes às muraidases já que também clivam a ligação beta (1-4) entre os resíduos de N-acetilmuramico e N-acetilglicosamina (Figura 1 B). Figura 2 – Esquema de lise celular por endolisinas. No fim do ciclo há liberação de holinas que formam poros na membrana plasmática da célula permitindo que as endolisinas acessem o peptidoglicano e o degradem. Adaptado de CARRATALÁ et al., 2023. Para a liberação da progênie viral, diversas proteínas são produzidas no interior da bactéria. As endolisinas são responsáveis pela quebra do peptidoglicano (figura 2). Entretanto, em bactérias Gram-negativas, por conta da membrana externa, o acesso das endolisinas ao peptidoglicano é dificultado (figura 3). Desta forma, para acessar o peptidoglicano, há a produção de uma outra proteína denominada holina que causa poros na membrana permitindo o acesso das endolisinas ao peptidoglicano (figura 2) (CARRATALÁ et al., 2023). 14 Figura 3 – Ação da endolisina em diferentes bactérias. Em Gram-negativas, a presença da membrana externa dificulta o acesso das endolisinas ao peptidoglicano. Ao mesmo tempo, em bactérias Gram-positivas, por não apresentarem membrana externa, o acesso ao peptidoglicano é facilitado. Adaptado de CARRATALÁ et al., 2023. As endolisinas apresentam uma estrutura monomérica ou globular (STONE et al., 2019). Em bactérias Gram-positivas, as endolisinas apresentam múltiplos domínios, incluindo domínios de ligação à parede celular, já em Gram-negativas, como é o caso da X. citri, são quase sempre pequenas com apenas um domínio enzimático (SCHMELCHER & LOESSNER, 2016). O uso dessas enzimas se estende em diversos setores como na agricultura, biotecnologia, medicina e controle de contaminantes em alimentos (SCHMELCHER & LOESSNER 2016; STONE et al., 2019; ÖZAL et al., 2022). Assim, o presente trabalho teve por objetivo avaliar uma endolisina codificada por bacteriófagos de X. citri (presentes na coleção do grupo) quanto ao seu potencial para controle de crescimento e prevenção de infecção causada por esta bactéria. 67 6.0 CONCLUSÃO Foi possível identificar a partir do sequenciamento e anotação do genoma dos bacteriófagos CP1 e CP2 quatro prováveis endolisinas. A estrutura teórica dessas endolisinas foi avaliada por modelagem in silico. Contudo apenas as endolisinas do bacteriófago CP2 puderam ser amplificadas por PCR e isoladas para ensaios posteriores. As endolisinas do bacteriófago CP1 não foram amplificadas, provavelmente por erros de sequenciamento/anotação. A endolisina His-CP2_07 foi expressa em E. coli T7 express e purificada por cromatografia de afinidade. Já em relação à expressão da CP2_29-His não observamos expressão aparente. Quanto à caracterização da endolisina His-CP2_07 ela aparenta ser termoestável com maior conteúdo de alfa-hélice e estruturas não definidas. Avaliamos a estabilidade da endolisina em diferentes pHs e salinidades. Nos ensaios de atividade realizados, a endolisina His-CP2_07 apresentou atividade contra peptidoglicano de P aeruginosa e B subtilis. Observamos ação bactericida da endolisina na presença de EDTA contra X. citri, P. aeruginosa e E. coli. Observamos lise celular de X. citri na presença da endolisina e EDTA, indicando então o potencial dessa endolisina para controle desse fitopatógeno. 68 7.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDELRAHMAN, Fatma et al. Pseudomonas Phage ZCPS1 Endolysin as a Potential Therapeutic Agent. Viruses, v. 15, n. 2, p. 520, 2023. ABEBE, Gedif Meseret. 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