UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS EQUINOS MARIANA SILVA FRASSON Botucatu, São Paulo Maio/2023 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CÂMPUS DE BOTUCATU MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS EQUINOS MARIANA SILVA FRASSON Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Unesp, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Animal. Orientador: Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa Botucatu, São Paulo Maio/2023 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: MARIA CAROLINA ANDRADE CRUZ E SANTOS-CRB 8/10188 Frasson, Mariana Silva. Maturação in vitro de oócitos equinos / Mariana Silva Frasson. - Botucatu, 2023 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Frederico Ozanam Papa Capes: 50504002 1. Fertilização in vitro. 2. Fase de Clivagem do Zigoto. 3. Técnicas de maturação in vitro de oócitos. 4. Oócitos. 5. Embriologia veterinária. 6. Reprodução animal. Palavras-chave: Aspiração folicular; Clivagem; Meio de maturação; Oócitos; Produção de embriões. iii Nome do autor (a): Mariana Silva Frasson Data da Defesa da Dissertação: 26 de maio de 2023. Título: Maturação in vitro de oócitos equinos BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa Presidente e Orientador Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, FMVZ – UNESP – Botucatu/SP Prof. Dr. Fernanda Saules Ignácio Membro Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal, FMVZ – UNESP – Botucatu/SP Dr. Ana Carolina Silva Soares Membro Médica Veterinária Autônoma iv Senhor, fazei-me instrumento de vossa paz. Onde houver ódio, que eu leve o amor; Onde houver ofensa, que eu leve o perdão; Onde houver discórdia, que eu leve a união; Onde houver dúvida, que eu leve a fé; Onde houver erro, que eu leve a verdade; Onde houver desespero, que eu leve a esperança; Onde houver tristeza, que eu leve a alegria; onde houver trevas, que eu leve a luz. São Francisco de Assis DEDICATÓRIA Aos meus pais Evandro e Cláudia, minha irmã Marina e ao meu namorado Lucas, pelo exemplo de humildade, por todo amor, carinho, incentivo, ensinamentos e apoio passados durante esses anos todos. Aos meus avós Sr. Tito (in memoriam), Dona. Lina, Dona. Dirce, Sr. Elizeu, que são meu alicerce e percurssores de mais este sonho em minha vida que se realiza. Aos inteligentes, sensíveis e maravilhosos cavalos. Está conquista dedico a todos vocês! v AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida, por sempre iluminar e direcionar o meu caminho, por me dar força, foco e sabedoria para poder superar os obstáculos dessa jornada. Aos meus pais queridos, Evandro e Cláudia, que são meu exemplo e sempre me aconselhando da melhor forma, sem o apoio deles nada disso seria possível. A minha querida e companheira irmã Marina que mesmo de longe sempre me motivou a continuar seguindo meu sonho. Ao meu namorado Lucas Troncarelli pelo intenso apoio, pela ajuda preciosa nesse trabalho, pelos bons conselhos e por nunca ter duvidado da minha capacidade. Aos meus sogros Regina e Miguel, que me acolheram como uma filha em sua família, a minha querida cunhada Isabella que é como uma irmã para mim. Ao meu orientador Professor Doutor Frederico Ozanam Papa, pela amizade, por confiar em mim e no meu trabalho, pelos ensinamentos e conhecimentos transmitidos, estando sempre disposto em me auxiliar. Muito obrigado, sempre terá minha sincera admiração e respeito. Aos demais professores do Departamento de Reprodução Animal, o meu agradecimento e respeito pela contribuição, aprendizado e experiência concedida. Ao José Dell’Aqua, Márcio Teoro, Prof. Fernanda Saules e Camila Dell’Aqua por todo incentivo, amizade e ensinamentos! A Raquel Puelker e Heloisa Canesin por todo carinho, ensinamentos e intensa disponibilidade e colaboração para ajudar na execução e contribuição deste trabalho. Vocês são incríveis e fazem parte dessa conquista. Aos meus colegas e amigos Thaís Cavalero, Sidnei Nunes, Luiz Roberto Junior, Lorenzo Segabinazzi, Lucas Canuto, Mariana Gobato, Rafael Bandeira, Camila Trinque, Raiza Rocha, Giovana Camargo, Luan Sitó, Beatriz Lippe, Estevam Rodrigues pela amizade que construímos. Aos funcionários do Departamento de Reprodução: Edivaldo, Felipe, Edilson e Evandro. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Unesp – Botucatu/SP pelas oportunidades oferecidas e pelo meu crescimento profissional. vi À Botupharma, pela contribuição e auxílio no desenvolvimento deste trabalho. Ao Claudio Haga, pela disponibilidade em ajudar e por ter aberto as portas do Laboratório de Embriologia da Central de Reprodução CH Reprodução Equina. O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. vii LISTA DE ABREVEATURAS ART´s: Tecnologias de reprodução assistida PIV: Produção in vitro OPU: Ovum Pick Up/ Aspiração folicular MIV: Maturaçã in vitro ICSI: Injeção intracitoplasmática de espermatozoide FIV: Fertilização in vitro CIV: Cultivo in vitro COCs: Complexo cumulus oócitos ZP: Zona pelúcida VG: Vesícula germinativa M I: Metáfase I M II: Metáfase II SFB: Soro fetal bovino GnRH: Hormônio liberador de gonadotrofinas hCG: Gonadotrofina coriônica humana FSH: Hormônio folículo estimulante LH: Hormônio luteinizante IGF - I: Fator de crescimento semelhante a Insulina I EGF: Fator de crescimento epidermal ITS: Insulina, transferrina, sodium selenite TCM 199: Tissue culture medium 199 DMEM/F12: Dulbecco's modified eagle medium - F12 mmol/L: milimol/L Mm: milimolar mL: mililitro μL: microlitro μg: micrograma U.I: Unidades internacionais ºC: graus Celsius O2: Oxigênio CO2: Gás carbônico viii LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Taxa de oóctios degenerados, vesículas germinativas, MI e MII após maturação com dois diferentes meios...............................................................47 Tabela 2 - Número de células e taxa de clivagem por oócitos injetados para diferentes meios de maturação no dia 3 após ICSI .......................................... 47 Tabela 3 - Número de células e taxa de clivagem por oócitos aspirados para diferentes meios de maturação no dia 3 após ICSI ......................................... 48 Tabela 4 - Taxa de blastocisto por oócitos injetados para diferentes meios de maturação ........................................................................................................ 48 Tabela 5 - Taxa de blastocisto por oócitos aspirados para diferentes meios de maturação ........................................................................................................ 48 ix SUMÁRIO CAPÍTULO 1 .................................................................................................... 14 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA .............................................................. 15 2. REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 16 2.1 ASPECTO ANATÔMICO E FUNCIONAL DO OVÁRIO ............................. 16 2.2 GAMETOGÊNESE, OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE ......................... 17 2.3 FERTILIZAÇÃO ......................................................................................... 20 2.4 CLIVAGEM DO ZIGOTO E FORMAÇÃO DO BLASTOCISTO .................. 22 2.5 OBTENÇÃO DE OÓCITOS ........................................................................ 24 2.5.1 Recuperação de oócitos de folículos pré-ovulatórios ....................... 24 2.5.2 Recuperação de oócitos de folículos imaturos ................................. 25 2.5.3 Recuperação de oócitos de ovários excisados post mortem ............ 26 2.6. MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) ................................................................. 27 2.7. INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DO ESPERMATOZOIDE (ICSI) ..... 28 2.8. CULTIVO IN VITRO (CIV) ......................................................................... 29 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................. 30 REFERÊNCIAS ............................................................................................... 31 HIPÓTESE.........................................................................................................37 OBJETIVOS......................................................................................................37 CAPÍTULO 2..................................................................................................... 38 ARTIGO 1: NOVA COMPOSIÇÃO DE MEIO DE MATURAÇÃO PARA A PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES EQUINOS x FRASSON, M.S. MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS EQUINOS. Botucatu- SP.2023.55p. Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu. RESUMO A produção in vitro de embriões equinos pelo método de OPU-ICSI, vem crescendo constantemente devido as melhorias significativas em sua técnica laboratorial e consequentemente melhores resultados na produção de embriões e taxas de prenhez. Desta forma houve um aumento na procura e demanda devido ao interesse entre os criadores de cavalos, para quem está biotecnologia proporciona diversos recursos na reprodução equina, como a otimização no uso do sêmen congelado, permanência de reprodutoras idosas que já impossibilitam sua fertilidade pelas técnicas convencionais e o uso de éguas com distúrbios do trato reprodutivo. No entanto, a maturação in vitro é um ponto crucial para o sucesso na produção in vitro de embriões. Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de dois tipos específicos de meios para a maturação in vitro de oócitos imaturos, analisando a competência de desenvolvimento dos oócitos para a realização da fertilização (ICSI). Foram realizadas cinco sessões de aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom, utilizando quatro (n=4) éguas por sessão. Os complexos cumulus-oócitos (COCs) foram coletados e distribuídos aleatoriamente em dois grupos diferentes. O meio de maturação do grupo controle (GC) foi composto de DMEM/F-12, suplementados com FSH, LH, aditivos (ITS, EGF, IGF, piruvato) e 15% de SFB, já o meio de maturação do grupo experimental (GE) foi constituído de TCM199 com sais de Earle, FSH, 17β-estradiol, aditivos (ITS, EGF, IGF, piruvato) e 10% de SFB. Posteriormente, os COCS foram mantidos em meio de manutenção durante o período de 5-12 horas de espera, em seguida transferidos para meio de maturação e cultivados por 36 horas em incubadora de 5% CO₂ ao ar, em temperatura 38,2°C. Logo após, os COCs foram então desnudados, para a visualização da extrusão do corpúsculo polar, realização da ICSI e os possíveis zigotos foram cultivados em incubadora de 5%CO₂, 6%O₂ à 38,2°C. A clivagem foi verificada no dia 3 após a ICSI, os blastocistos foram avaliados e classificados (em uma escala de grau A- B-C) dos dias 7 a 10. Os resultados demonstraram que não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos em degenerado (GC=15,7%, 13/83; GE= 9,5%, 8/84), estágio VG (GC=4,8%, 4/83; GE=6,0%, 5/84), presuntivos MI (GC=4,8%, 4/83; GE=2,4%, 2/84) ou MII (GC=74,7%, 62/83; GE= 81,0%, 68/84) dos oócitos avaliados após cultura de maturação. Em relação a taxa de clivagem no dia 3 não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos (GC=72,2%, 39/54; GE= 67,9%, 38/56). Na contagem de células, o grupo controle apresentou diferença estatística, tendo maior número de embriões em estágio de 2 células no dia 3 (GC=13,0%, 7/54; GE=1,8%, 1/56). No entanto, o grupo experimental mostrou tendência (P = 0,07) de ter mais embriões no estágio de 8-16 células no dia 3 (GC=5,6%, 3/54; GE=17,9%, 10/56). Não houve diferença significativas na taxa de blastocisto entre os grupos (GC=21,0%, 13/62; GE=23,5%, 16/68). Para a classificação dos embriões, não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos, nos três diferentes graus (9,7%, 6/62 e 13,2%, 9/68 para o grau A; 6,5%, 4/62 e 10,3%, 7 /68 para o grau B; e 4,8%, 3/62 e 0,0%, 0/68 para o grau C, os valores apresentados são do grupo controle e experimental, respectivamente). Embora xi não houve diferença estatística na maioria das variáveis, podemos observar que o grupo experimental mostrou numericamente mais oócitos no estágio MII, menos embriões no estágio de 2 células e mais embriões no estágio de 8-16 células no dia 3. Da mesma forma, podemos observar numericamente mais embriões de alta qualidade (grau A e B) no grupo experimental do que no grupo controle. Ainda assim, com um número total maior de oócitos, provavelmente encontraríamos diferenças estatísticas nessas variáveis. Por este motivo estudos adicionais são necessários para aprimorar a eficiência deste meio de maturação. Palavras-chave: Oócitos, Aspiração folicular, Meio de maturação, Clivagem, Cultivo in vitro, Produção de embriões. xii FRASSON, M.S. MATURATION IN VITRO OF EQUINE OOCYTES. Botucatu- SP, Brazil. 2023.55p. São Paulo State University (UNESP), School of Veterinary Medicine and Animal Science, Botucatu. ABSTRACT The in vitro production of equine embryos by the OPU-ICSI method has been constantly growing due to significant improvements in its laboratory technique and consequently better results in embryo production and pregnancy rates. In this way, there has been a greater demand and demand due to the interest among horse breeders, where with this biotechnology it provides them with several resources in equine reproduction, such as the optimization in the use of frozen semen, the permanence of elderly breeders that already make their fertility impossible due to conventional techniques and mares with reproductive tract disorders. However, in vitro maturation is a crucial point for successful in vitro embryo production. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of two specific types of maturation media, performing in vitro maturation of immature oocytes to analyze the developmental competence of in vitro matured oocytes. Five sessions of ultrasound-guided transvaginal follicular aspiration were performed, using four (n=4) mares per session. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were collected and randomly distributed into two different groups. The maturation medium of the control group (GC) was composed of DMEM/F-12 with 0.1 IU/mL of FSH, 0.1 IU/mL of LH, additives (ITS, EGF, IGF, pyruvate) and 15% of FBS, whereas the maturation medium of the experimental group (EG) consisted of TCM199 with Earle's salts, 0.1 UI/mL of FSH, 17β-estradiol, additives (ITS, EGF, IGF, pyruvate) and 10% of FBS. Subsequently, the COCS were kept in maintenance medium during the waiting period of 5-12 hours, then transferred to maturation medium and cultivated for 36 hours in an incubator with 5% CO2 in air, at a temperature of 38.2°C. Soon after, the COCs were then stripped, visualization of the extrusion of the polar body, ICSI was performed and the presumptive zygotes were cultured in a 5%CO2, 6%O2 incubator at 38.2°C. Cleavage was checked and cells counted on day 3 after ICSI, blastocysts were evaluated and graded (on an A-B-C grade scale) from days 7 to 10. Results demonstrated that there was no difference (P > 0.05) between the groups in degenerate (GC=15.7%, 13/83; EG= 9.5%, 8/84), VG stage (GC=4.8%, 4/83; EG=6.0%, 5 /84), MI presumptives (GC=4.8%, 4/83; GE=2.4%, 2/84) or MII (GC=74.7%, 62/83; GE=81.0%, 68/84) of the oocytes evaluated after maturation culture. Regarding the cleavage rate on day 3, there was no difference (P > 0.05) between groups (GC=72.2%, 39/54; EG= 67.9%, 38/56). In the cell count, the control group showed a statistical difference, having a greater number of embryos at the 2-cell stage on day 3 (GC=13.0%, 7/54; EG=1.8%, 1/56). However, the experimental group tended (P = 0.07) to have more embryos at the 8-16 cell stage on day 3 (GC=5.6%, 3/54; EG=17.9%, 10/ 56). There were no significant differences in blastocyst rate between groups (GC=21.0%, 13/62; EG=23.5%, 16/68). For the classification of the embryos, there was no difference (P > 0.05) between the groups, in the three different grades (9.7%, 6/62 and 13.2%, 9/68 for grade A; 6.5 %, 4/62 and 10.3%, 7/68 for grade B; and 4.8%, 3/62 and 0.0%, 0/68 for grade C, the values shown are for the control group and experimental, respectively). Although there was no statistical difference in most variables, we can observe that the experimental group was superior to the control group. The xiii experimental group numerically showed more oocytes at the MII stage, fewer embryos at the 2-cell stage and more embryos at the 8-16 cell stage on day 3. Likewise, we can numerically observe more high quality embryos (grade A and B) in the experimental group than in the control group. Still, with a larger total number of oocytes, we would likely find statistical differences in these variables. For this reason, additional studies are needed to improve the efficiency of this maturation medium. Keywords: Oocytes, Follicular aspiration, Maturation medium, Cleavage, In vitro culture, Embryo production. CAPÍTULO 1 15 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA A utilização das tecnologias de reprodução assistida (ART´s) em equinos vem apresentando um grande avanço de forma exponencial por todo o mundo, sendo a inseminação artificial e a transferência de embriões produzidos in vivo as técnicas mais realizadas atualmente. No entanto, houve um crescimento na utilização da produção in vitro (PIV) de embriões, principalmente nas biotecnoligas de ICSI e clonagem (ALVARENGA e LANDIM- ALVARENGA, 2009). Segundo a Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS) em 2020 houve um aumento na produção de embriões equinos, produzidos in vivo e in vitro. O notável aumento no número de embriões produzidos in vitro foi impulsionado pelos países Itália, Brasil, EUA, onde o Brasil lidera a produção in vivo mundial e a Italia in vitro (VIANA,2021). Na espécie equina, diferentemente de outras espécies, há alguns obstáculos na produção in vitro de embriões principalmente em relação a fisiologia e a anatomia do oócito da égua (GERANDI e ROBIN, 2019). Rotineiramente, utilizando-se o procedimento de aspiração folicular, são aspirados oócitos imaturos, que estão no estágio de prófase I da meiose I, (METCALF et al., 2020), sendo necessário a realização da etapa de maturação in vitro oocitária.Os oócitos equinos possuem grande quantidade de gotículas lipídicas (VOGELSANG et al., 1987) e fortes junções comunicantes que mantém as células do complexo cumulus-oócito (COC) intensamente ligadas à parede folicular (GOUDET et al., 1997; METCALF et al., 2020), dificultando o processo de aspiração folicular. Além disso na égua, a estimulação hormonal exógena para superovulação apresenta resultados insatisfatórios, comparados com outras espécies. Na espécie equina, fisiologicamente, há apenas um ou dois folículos pré ovulatórios disponíveis por ciclo estral para aspiração folicular e recuperação de oócitos maduros.(METCALF et al., 2020). Em relação à FIV convencional, técnica utilizada em bovinos, apenas recentemente em um estudo desenvolvido obteve sucesso no uso da FIV com sêmen a fresco de equinos, devido principalmente à dificuldade de estimular a 16 capacitação espermática in vitro (Felix, et al., 2022) e o endurecimento da zona pelúcida durante o processo de maturação do oócito. Com isso, a ICSI se tornou a técnica de escolha para a produção in vitro de embriões equinos, principalmente no mercado brasileiro onde utiliza-se em sua maioria sêmen criopreservado importado. Neste contexto, a maturação in vitro (MIV) é uma etapa importante e um fator limitante para a produção in vitro de embriões equinos. Sendo assim, grande é o interesse em aprimorar a produção in vitro de embriões como uma ferramenta para contornar os problemas reprodutivos das éguas e otimizar o uso de sêmen congelado de baixa qualidade ou sêmen de garanhões que já morreram. Com base nisso, o presente estudo tem como objetivo a avaliação da utilização de uma nova estratégia de meio de maturação in vitro de oócitos equinos. 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ASPECTO ANATÔMICO E FUNCIONAL DO OVÁRIO O sistema reprodutivo da égua é composto pela genitália externa (vulva, clitóris, vestíbulo vaginal) e genitália interna (vagina, cérvix, útero, tuba uterina e ovários), podendo também ser subdividido em dois grupos de órgãos: estruturas que são intrínsecas ao trato reprodutivo e de estruturas que são isoladas ao trato reprodutivo como a retina, glândula pineal, hipotálamo e hipófise, mas que desempenham um papel essencial para o funcionamento e regulação dos eventos reprodutivos (HAFEZ; HAFEZ,2004; BRISKO et al.,2011). O trato reprodutivo está localizado na cavidade pélvica, os órgãos genitais internos são sustentados pelo ligamento largo que consiste em: mesovário que sustenta o ovário, mesossalpinge a tuba uterina e o mesométrio o útero (HAFEZ; HAFEZ,2004). Os ovários estão localizados na área sublombar (ventral a quarta e quinta vertebras lombares), suspensos pelo ligamento largo e geralmente localizados caudais ao rim, esta localização dos ovários pode variar em alguns momentos, devido à extensão do ligamento mesóvario que permite a sua movimentação. O seu tamanho pode variar de acordo com a atividade ovariana, sendo maior durante a fase reprodutiva de ciclicidade, já seu formato (denominado forma de 17 feijão) é devido sua particularidade anatômica pela presença da fossa da ovulação (BRISKO et al.,2011; GINTHER, 1992). Os ovários na espécie equina exigem uma avaliação específica comparado com outras espécies, já que suas particularidades morfológicas influenciam na fisiologia. (EVANS et al.,2007). Na maioria dos animais domésticos a parte medular do ovário encontra- se na região central e é circundada pelo córtex. No entanto, nos equinos podemos referenciar que o ovário é “de dentro para fora”, ou seja, a zona medular (tecidos conectivos, musculares e grande quantidade de vasos sanguíneos) é superficial e a zona cortical (formação e desenvolvimento dos folículos) está no interior da glândula. O tecido cortical atinge a superfície ovariana apenas em uma depressão da borda ventral do ovário, sendo, portanto, a única área por onde ocorre a ovulação; região denominada fossa da ovulação (EVANS et al.,2007). Os ovários desempenham duas funções importantes, a exócrina (produção e liberação de oócitos) e endócrina (produção e liberação de hormônios esteroides – estrógeno e progesterona) (HAFEZ; HAFEZ,2004). A produção do gameta feminino (oócito) é decorrente da interação de dois eventos que ocorre no ovário, isto é, a oogênese e a foliculogênese (SAUMANDE, 1981). 2.2 GAMETOGÊNESE, OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE A gametogênese é o processo de formação e desenvolvimento dos gametas masculino (espermatozoide) e feminino (oócito), denominados respectivamente, espermatogênese e oogênese. Cada gameta formado carrega seu material genético e a fusão deles dará origem ao zigoto e início do desenvolvimento embrionário. A oogênese ocorre durante a vida fetal, as células germinativas primordiais (oogônias), precursoras dos oócitos, iniciam a sua multiplicação através de divisões mitóticas evento que ocorre no córtex ovariano durante a fase inicial do desenvolvimento fetal. Posteriormente as oogônias inicia o primeiro processo de divisão meiótica formando os oócitos primários, que permanece em fase de prófase I da meiose I ou vesícula germinativa, até que a fêmea atinja a puberdade (BLOOM; FAWCETT, 1994). 18 Quando a puberdade é atingida, um pouco antes da ovulação os oócitos primários completam a primeira divisão meiótica, o núcleo do oócito perde seu envoltório nuclear, os cromossomos condensam migrando para a periferia da célula, entrando em metáfase I. Neste momento ocorre a citocinese desigual (divisão das células filhas de forma não iguais) dando origem ao oócito secundário (que retém quase todo citoplasma) e ao primeiro corpúsculo polar (que contém pequeno núcleo e quantidade mínima de citoplasma) que é extrusado dentro do espaço perivitelino. Posteriormente ocorre a absorção do primeiro corpúsculo polar I e o núcleo do oócito secundário retoma a segunda divisão meiótica, que estaciona em metáfase II até que haja a fertilização por um espermatozoide, e, se for fecundado, volta a dividir-se (meiose II) formando o segundo corpúsculo polar (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). A unidade funcional do ovário, é o folículo. O folículo ovariano é uma estrutura extremamente organizada constituída pelo oócito circundado por células foliculares e limitado por uma membrana basal que o separa do estroma ovariano. A principal função do folículo é proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do oócito, bem como produzir hormônios esteroides (PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006). A foliculogênese é o processo de formação, crescimento e maturação folicular, que se inicia com o desenvolvimento das oogônias e a formação do folículo primordial, e que termina com a formação do folículo de Graaf, tambem chamado de folículo antral, ou pré-ovulatório (PICTON, 2001). A partir da puberdade, os folículos primordiais iniciam o processo de crescimento, que compreende as modificações que ocorrem no oócito, nas células foliculares e no estroma ovariano (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). No folículo primordial acontece a proliferação das células da granulosa, que possui camada de células achatadas e são transformadas em células cuboides, ocorrendo a passagem de estágio de folículo primordial para folículo primário (HIRSHFIELD,1992). O folículo primário é caracterizado pelo aumento do tamanho do oócito, posicionado na região central do folículo, circundado por uma camada de células da granulosa com formato cuboide e apresentam uma zona pelúcida em formação (HYTTEL ET AL., 1997). As células da granulosa se comunicam por junções comunicantes (gap) e a principal função dessas junções é permitir a 19 passagem de substancias de baixo peso molecular das células do cumulus para os oócitos (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Os folículos secundários apresentam o oócito inteiramente circundado pela zona pelúcida, possui duas ou mais camadas de células da granulosa de formato cúbico (PRESTES; LANDIM- ALVARENGA, 2006) e diferenciação das células da teca, que são formadas em seguimentos paralelos das fibras de tecido conjuntivo (HIRSHFIELD, 1991). Os folículos terciários tambem denominados de folículos antrais, de Graaf ou pré - ovulatórios, nessa fase do desenvolvimento folicular apresentam a formação de uma cavidade, denominada de antro, que é preenchida por um fluido, o líquido folicular (BLOOM; FAWCETT, 1994). Com o aumento do antro o oócito fica ligeiramente afastado do centro, ocorre a reorganização das células da granulosa por conta da formação do antro, algumas dessas células se concentram em um determinado local da parede do folículo formando um pequeno espessamento o cumulus oophurus, que serve de apoio para o oócito e o mantém projetado no interior do folículo. Além disso, um pequeno grupo de células foliculares envolve o oócito constituindo a corona radiata. Os folículos antrais tambem apresentam uma membrana basal e duas camadas de células tecais que são divididas em interna e externa e ficam situadas ao redor das células da granulosa (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Durante cada ciclo estral, um folículo apresenta um crescimento maior que os outros e se torna o folículo dominante (de Graaf), o qual alcança um ponto máximo de crescimento e desenvolvimento tornando – se apto a ovular. Os demais folículos que estavam tambem em crescimento entram em atresia (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). O processo de maturação oócitária se divide em dois estágios; a primeira é conhecida como fase de crescimento oócitário, quando o folículo primordial e seu oócito iniciam seu crescimento e a atividade das células internas do cumulus contribui de forma ativa para o processo de crescimento do oócito, no qual o seu crescimento está quase completo quando ocorre a formação do antro ((HAFEZ; HAFEZ,2004). Durante esta fase tambem ocorre a regulação da síntese de proteínas e a formação de organelas, tais como: mitocôndrias, ribossomos, grânulos corticais e vesículas contendo fontes energéticas; diferenciando a célula germinativa feminina em um gameta funcional (PAYNTON; BACHVAROVA, 1990). 20 Ao longo deste período acontece a formação de uma membrana glicoproteica, denominada zona pelúcida (ZP), que forma um revestimento protetor ao redor do oócito, o qual consiste de 3 glicoproteínas, ZP1, ZP2 e ZP3 (SOYAL, et al., 2000). A segunda fase denominada de maturação final, envolve as modificações nucleares e citoplasmática do oócito (SATHANANTHAN, 1994). Essa etapa é caracterizada pelo reinício da primeira divisão meiótica, quando o núcleo do oócito deixa a fase de vesícula germinativa e entra em metáfase I, que ocorre após a puberdade dentro do folículo pré-ovulatório (GORDON, 1994). Todo o processo de oogênese, crescimento folicular e maturação oócitária depende de secreção adequada e concentrações suficientemente elevadas de hormônios (Hafez; Hafez, 2004). O GnRH liberado pelo hipotálamo, através do sistema porta-hipotalâmico-hipofisário, atinge a hipófise e estimula a secreção das gonadotrofinas FSH (hormônio folículo estimulante) e LH (hormônio luteinizante). Por via circulação sistêmica esses hormônios chegam aos ovários. O FSH é responsável por estimular o crescimento e desenvolvimento folicular, enquanto o LH terá a função de maturação folicular e oócitária final, posterior ovulação do folículo dominante e luteinização (BRISKO et al.,2011). Na égua não existe um pico pré-ovulatório de LH precedendo a ovulação; em lugar disso, as concentrações de LH aumentam gradativamente durante o estro, que culmina no afinamento e ruptura da parede do folículo e expulsão do oócito, evento este conhecido por ovulação. (HINRICHS et al., 1993). As células presentes no folículo ovulado sofrem uma transformação chamada luteinização, formando o corpo lúteo, que produz progesterona (BRISKO et al.,2011). 2.3 FERTILIZAÇÃO A fertilização é o processo pelo qual duas células haploides, o gameta masculino e feminino se funde na região da ampola da tuba uterina para originar o ovo, ou zigoto (HYTTEL et al., 2012; BLOOM; FAWCETT, 1994). Para ocorrer a fecundação e a fusão dos gametas, os espermatozoides passam por algumas modificações, que inclui a capacitação espermática e a reação acrossomal (HAFEZ; HAFEZ,2004). Os espermatozoides não estão aptos a fertilizar o oócito imediatamente após a sua chegada no trato reprodutivo genital da fêmea, para adquirir habilidade de fecundar o oócito, passa pelo 21 processo denominado capacitação espermática que ocorre na região do istmo na tuba uterina. A capacitação espermática inclui modificações que ocorrem na membrana plasmática do espermatozoide, remoção da cobertura glicoproteica e das proteínas do plasma seminal da superfície do espermatozoide, alterações na motilidade do flagelo e modificações no acrossomo para a penetração espermática na membrana plasmática do oócito (HYTTEL et al., 2012). Logo após a capacitação espermática, ocorre a ligação do espermatozoide capacitado à zona pelúcida (ZP) do oócito. O contato com a ZP induz a reação acrossomal do espermatozoide, que sucede a fusão da membrana plasmática do espermatozoide com a membrana externa do acrossomo, em seguida a liberação de enzimas hidrolíticas (acrosina/hialuronidase) pelo acrossomo vai proporcionar a digestão enzimática das glicoproteínas da ZP e a propulsão vigorosa da cauda do espermatozoide permite a penetração da matriz da ZP. Subsequentemente após o espermatozoide atingir o espaço perivitelínico, a membrana do segmento equatorial do espermatozoide adere e funde- se com a membrana do oócito, evento este chamado de singamia (HYTTEL et al., 2012; HAFEZ; HAFEZ,2004). Imediatamente após a fusão do gameta masculino e feminino, o oócito sofre a ativação oócitária, que vai estabelecer o bloqueio à poliespermia, a 2º retomada da meiose e o início do desenvolvimento embrionário (HYTTEL et al., 2012). A ativação oócitária é baseada na interação entre as membranas plasmática do oócito e do espermatozoide, na introdução de um fator espermático no interior do citoplasma do oócito, aumento na concentração de íons de cálcio que será essencial para ativação do desenvolvimento embrionário e tambem o aumento do pH intracelular que ativa a síntese proteica (PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Por outro lado, o bloqueio rápido à poliespermia é mediado pela despolarização elétrica da membrana do oócito, já o bloqueio lento é estabelecido pela reação cortical, onde através de uma onda de exocitose os grânulos corticais do oócito que se fundem a sua própria membrana plasmática liberando as enzimas contidas nos grânulos corticais para o espaço perivitelínico. A liberação dessas enzimas vai modificar as moléculas da zona pelúcida que se liga aos espermatozoides, desta maneira vai ocorrer o 22 endurecimento da zona pelúcida ocasionando o bloqueio da penetração dos espermatozoides (HYTTEL et al., 2012; PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Como outra consequência da ativação oócitária a meiose é retomada e desencadeia a conclusão da segunda divisão celular meiótica do oócito. A célula filha que quase não recebe citoplasma é chamado de segundo corpúsculo polar e a outra célula filha é oócito definitivo, agora referido como zigoto. Quando o núcleo do espermatozoide é englobado pelo citoplasma do oócito ocorre uma série de mudanças de forma sequencial. As mudanças na estrutura nuclear incluem a formação dos pronúcleos masculino e feminino, migração e aproximação desses pronúcleos para o centro do zigoto, perda dos seus envelopes nucleares e mistura dos genomas materno e paterno, evento chamado de cariogamia (HYTTEL et al., 2012). Finalmente, haverá o início de uma divisão mitótica e do desenvolvimento embrionário (YANAGIMACHI, 1994). 2.4 CLIVAGEM DO ZIGOTO E FORMAÇÃO DO BLASTOCISTO A dissolução dos pronúcleos masculino e feminino e mistura dos seus cromossomos irá conceder a formação do zigoto. O citoplasma do zigoto, herdado do oócito, contém a composição molecular e estrutural necessária para iniciar a clivagem (HYTTEL et al., 2012). A clivagem consiste no processo de repetidas divisões mitóticas do zigoto, resultando num rápido aumento no número de células, denominadas blastômeros. Durante a clivagem o zigoto encontra-se envolto pela zona pelúcida (MOORE et al., 2016). Após a quarta divisão celular (estágio de 8- 16 células), os blastômeros sofrem uma mudança em seu comportamento, se aglomeram firmemente uns com os outros, aumentando o contato entre si, formando uma massa compacta de células, processo esse conhecido como compactação. Esse amontoamento dos blastômeros é estabilizado por junções do tipo oclusiva que se formam entre as células externas, entretanto as células internas formam junções comunicantes, permitindo o transporte de pequenas molécula e íons entre elas (MOORE et al., 2016, PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006) Na espécie equina a primeira clivagem ocorre aproximadamente 24 horas após a fecundação e o processo de compactação se inicia no estágio de 8-16 23 células. Quando os blastômeros compactados do embrião se dividem no estágio de 16-32 células é chamado de mórula, constituída de pequeno grupo de células internas rodeadas por um grupo maior de células externas (PRESTES; LANDIM- ALVARENGA, 2006; GINTHER, 1992) As células externas da mórula vão se diferenciar em células do trofoblasto, no qual originará o cório, a porção embrionária da placenta. O cório é o tecido que permite ao feto obter oxigênio e alimento a partir da mãe. Estas células do trofoblasto são necessárias para a implantação do embrião na parede uterina (GINTHER, 1992). Ainda assim, os blastômeros internos da mórula no estágio de 32 células se dividem em 64 células formando a massa celular interna, dando origem ao botão embrionário (PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Inicialmente, a mórula não tem uma cavidade interna, entretanto, durante um processo chamado de cavitação, as células do trofoblasto secretam um fluido para o interior da mórula, ocupando um espaço central formando a blastocele. Desta forma, o botão embrionário posiciona-se de um lado do anel das células trofoblásticas e do outro a blastocele, formando a estrutura característica do processo da clivagem, o blastocisto. A principal característica da fase de blastocisto é a diferenciação em trofoblasto e botão embrionário (PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006). Nas éguas, a chegada do embrião ao útero ocorre ao redor do 6º dia após a fecundação, no estágio de mórula ou blastocisto inicial. Uma particularidade dos embriões equinos é que somente o embrião viável é transportado para o útero através da liberação da prostaglandina E₂ pelo embrião, a qual irá proporcionar contrações locais e relaxamento da musculatura lisa da parede da tuba uterina, permitindo assim que o embrião se mova progressivamente, atravessando a junção útero-tubária, entrando no útero (ALLEN, 2000). O estágio de blastocisto, logo após a entrado do embrião no útero, caracteriza- se tambem pela formação de uma cápsula acelular entre a zona pelúcida e as células do trofoblasto. Durante alguns dias, a cápsula permanece recoberta pela zona pelúcida, que vai se adelgaçando gradativamente até acontecer a eclosão do embrião, porém mesmo depois da eliminação da zona pelúcida o embrião fica envolto pela cápsula acelular até aproximadamente o 20º dia de gestação, quando, então, esta se fragmenta devido a ação de enzimas 24 proteolíticas secretadas pelas células trofoblásticas ou pelo endométrio uterino (PRESTES; LANDIM-ALVARENGA, 2006). 2.5 OBTENÇÃO DE OÓCITOS Para a obtenção dos oócitos de éguas vivas é realizada a técnica de aspiração folicular guiada por ultrassom transvaginal (BRINSKO et al 2011; McKINNON et al, 2011), existem duas principais abordagens para a coleta dos oócitos: recuperação do oócito em maturação através da aspiração do folículo dominante (pré - ovulatório), após a administração de hCG (gonadotrofina coriônica humana) ou um análogo de GnRH (hormônio liberador de gonadotrofina); ou a recuperação dos oócitos imaturos de todos folículos presente no ovário, que devem ser maturados in vitro (HINRICHS, 2018). Ainda assim, é possível recuperar oócitos de ovários excisados de éguas post mortem, a partir da raspagem e lavagem vigorosa dos folículos. 2.5.1 Recuperação de oócitos de folículos pré-ovulatórios Para a realização da aspiração do folículo dominante (pré-ovulatorio), é necessário o monitoramento do ciclo estral da égua, acompanhando o crescimento folicular. No momento que apresenta um ou eventualmente dois folículos dominantes com diâmetro de ±35mm, e edema endometrial grau 3, é feito a administração de hCG ou um análogo de GnRH para ocorrer a maturação oocitária (CARNEVALE, 2016). A aspiração folicular é realizada 24 horas após a utilização do hormônio indutor da ovulação, para permitir a expansão das células do cumulus e não mais que 35 horas, para que a ovulação não ocorra antes da aspiração (HINRICHS, 2012). O oócito recuperado através da aspiração folicular é incubado até o momento previsto em que a égua doadora teria ovulado se o folículo não tivesse sido aspirado. Assim, se um oócito é coletado 24 horas após a estimulação com gonadotrofina, ele é incubado em meio de manutenção de 12- 18 h antes da manipulação; se for coletado 35 horas após a indução hormonal, pode ser incubado em meio de manutenção de 1-7 horas antes da manipulação (HINRICHS, 2012). Em seguida, é feito a injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI) entre 36 - 42 horas após a aspiração folicular. (CARNEVALE, 2016; HINRICHS, 2018). 25 A recuperação de oócitos maturados in vivo a partir da aspiração do folículo pré-ovulatório é mais fácil, devido ao tamanho do folículo e a alta taxa de recuperação oócitária entre 65-80% (HINRICHS, 2012; BRINSKO et al., 2011). No entanto, o número de folículos pré-ovulatorios aspirado é baixo, o uso de hormônios sintéticos que estimulem o crescimento de múltiplos folículos não é uma realidade, pois ainda não há gonadotrofinas comercialmente disponíveis capazes de estimular de forma viável e segura o desenvolvimento de múltiplos folículos pré-ovulatórios na égua, o que significa que apenas 1 ou 2 folículos pré- ovulatórios em desenvolvimento fisiológico por ciclo estariam disponíveis para recuperação de oócitos maduros (STOUT, 2020). Contudo, a manipulação dos oócitos e manuseio dos equipamentos deve ser realizado com cuidado e próximo a temperatura fisiológica da égua, pois os oócitos já iniciaram seu processo de maturação e são extremamente sensíveis a oscilações de temperatura. Por esta razão, caso o transporte dos oócitos se faça necessário, requer o armazenamento em uma incubadora portátil para o bom desempenho da técnica (HINRICHS, 2012). 2.5.2 Recuperação de oócitos de folículos imaturos A aspiração dos folículos imaturos é uma técnica bem utilizada para a produção in vitro de embriões equinos. Na década de 90, as taxas de recuperação eram muito baixas, em torno de ≤25% (HINRICHS, 2012). No entanto, com o aprimoramento da técnica esse cenário mudou, apresentando uma taxa média de recuperação oocitária de 50% a 70% (SANSINEMA, 2020). O procedimento da aspiração folicular de oócitos imaturos é mais difícil, pois apresentam folículos menores e as células do cumulus compactadas estão fortemente ligadas a parede do folículo, sendo necessário a raspagem vigorosa da parede do folículo, utilizando uma agulha grande em bisel (calibre 12), geralmente de duplo lúmen (lúmen interno para aspiração, externo para lavagem) e a lavagem repetida do lúmen (5 a 10 vezes) para se obter uma melhor taxa de recuperação de oócitos (GALLI et al., 2014; HINRICHS, 2018). Com esta técnica, todos os folículos presentes no ovário com diâmetro entre 5-10 mm podem ser aspirados no intervalo de 10 -14 dias (CARNEVALE, 2016). Alguns fatores influenciam a taxa de recuperação dos oócitos, como, o tamanho do folículo, cuja taxa de recuperação é mais alta quando a maior 26 porcentagem de folículos aspirados tem menos de 10 mm de diâmetro, aparentemente porque a raspagem mecânica da parede do folículo é mais eficiente em um folículo menor (STOUT, 2020). Outro fator que interfere na taxa de recuperação é a frequência das aspirações foliculares, pois o número de folículos diminui quando a aspiração é realizada em intervalos inferiores a 11 dias (HINRICHS, 2012). Após a OPU, a manipulação dos oócitos imaturos em estágio de vesícula germinativa é executada em temperatura ambiente (20 - 22°C), onde os oócitos podem ser mantidos em meio de manutenção de embriões por 16 -18 horas sem que haja qualquer efeito prejudicial nas taxas de maturação e produção de blastocisto in vitro. Contudo, isso permite o transporte dos oócitos equinos aspirados até um laboratório para o procedimento de ICSI e a sincronização do início da maturação oocitária, com o agendamento de técnicas de reprodução assistida (CHOI et al., 2006). 2.5.3 Recuperação de oócitos de ovários excisados post mortem A recuperação dos oócitos post mortem pode ser a única opção para resgatar a genética de uma égua que veio a óbito. Neste caso, após a morte da égua os ovários são retirados e enviados para o laboratório para serem processados o mais rápido possível para a recuperação do oócito (SANSINEMA, 2020). Os oócitos recuperados dentro do período de 6 - 8 horas após a morte do animal, possui maior probabilidade de produzir embriões do que os oócitos recuperados em períodos mais prolongados (RIBEIRO et al., 2008). Em relação ao transporte, os ovários são armazenados em caixa isotérmica, caso o deslocamento for em período curto de tempo de 0 - 2 horas. Neste caso os ovários são transportados à temperatura corporal (37°C) e para transporte mais longos em temperatura ambiente (21- 25°C) ou um pouco mais baixa (15 - 20°C) (HINRICHS, 2012). Para recuperar os oócitos dos folículos de ovários equinos excisados, o procedimento consiste em abrir completamente cada folículo visível ou palpável usando um bisturi e raspar toda a superfície interna do folículo para remover a camada de células da granulosa (CLÉRICO et al., 2018). Essa técnica promove a completa recuperação do complexo cumulus oócitos (COCs), resultando em 27 bom desenvolvimento e maturação in vitro dos oócitos recuperados (HINRICHS et al., 2005; CHOI et al.; 2006, 2007). 2.6. MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) O primeiro relato de oócitos maturados in vitro foi em 1981 por Fulka & Okolki, apresentando uma taxa de maturação de 68%, porém o primeiro embrião produzido de um oócito maturado in vitro foi em 1989 (FULKA; OKOLSKI, 1981; ZHANG et al., 1989). O principal fator que determina o potencial de produção de embriões in vitro é a competência oócitária, ou seja, a capacidade do oócito concluir todas as etapas de maturação nuclear e citoplasmática; ser fecundado e completar o desenvolvimento embrionário inicial (MORRIS, 2018). No entanto, outro fator que influência no tempo de duração da maturação in vitro é a morfologia do complexo do cumulus-oócitos (CCOs). Quando os oócitos são aspirados dos ovários as células do cumulus estão intactas e podem ser classificadas em compactas ou expandidas (ANGEL et al., 2020; THARASANIT et al., 2009). Os oócitos aspirados com as células do cumulus compactadas requerem tempo de maturação de 30 - 36 horas para atingir MII, enquanto oócitos com o CCO expandido requerem um período de maturação in vitro (MIV) menor, de 22 - 24 horas (HINRICHS et al., 2005). Apesar disso, alguns estudos demonstraram que as taxas de maturação nuclear não aumentam após 30 horas de MIV (GOUDET., et al 2000). Com apresentação de melhores resultados nas taxas de produção de blastocistos, o período de 30 horas de maturação aparenta funcionar tanto para CCO expandido e compacto, portanto, acaba evitando essa diferença no tempo de MIV (MORRIS, 2018). No entanto, antes da realização da MIV, os oócitos imaturos são mantidos em meios de manutenção em temperatura ambiente (20-22°C) durante 2- 12 horas (LAZZARI et al., 2020). Posteriormente, transferidos para o meio de maturação, numa incubadora com 5% de CO₂ a 38,2ºC durante 28 – 30 horas (ANGEL et al., 2020). Após este período, para avaliação da maturidade oocitária, é analisada a expansão das células do cumulus e a extrusão do corpúsculo polar. Isso é necessário para determinar se o oócito está ou não apto a ser fertilizado (McKINNON et al., 2011; DELL'AQUILA et al., 2003). 28 Em relação à composição do meio de maturação in vitro, os meio base mais comumente utilizados são o M199 e o DMEM/F-12. A principal diferença entre esses dois meios é a concentração de glicose (MORRIS,2018). A concentração de glicose do M199 é de 5,5 mmol/L, do DMEM/F12 é de 17,5 mmol/L e já do fluido folicular da égua variam de 3,24 a 4,7 mmol/L. Todavia, pode ser que as diferenças nas concentrações de glicose durante a maturação possam afetar o desenvolvimento do oócito. Além disso, alguns estudos relatam que a utilização do meio DMEM/F12 para maturação dos oócitos aumenta as taxas de clivagem e produção de blastocisto, no entanto outro estudo indica taxas mais baixas de blastocisto para oócitos maturados em DMEM/F-12 do que em M199 (LAZZARI et al., 2020). O meio base de maturação in vitro é suplementado por fonte de proteína (Soro Fetal Bovino- apresenta efeito benéfico na competência meiótica) hormônios (Hormônio Folículo Estimulante – FSH, Hormônio Luteinizante - LH, 17β-estradiol), fatores de crescimento (Epidermal Growth Factor- EGF, Insulin Growth Factor- IGF) antibióticos (gentamicina, amicacina), antioxidantes (cisteamina, piruvato de sódio) (MORRIS, 2018; LAGUTINA et al., 2005; CHOY et al., 2016). Além das substâncias adicionadas ao meio base, os oócitos em cultivo também são afetados por condições fisiológicas específicas, tais como: osmolaridade, temperatura, pH, CO₂ e tensão de oxigênio, que, por sua vez, tornam-se parâmetros importantes que influenciam na capacidade de desenvolvimento do oócito (HUNTER, 2000). Os laboratórios bem estabelecidos de produção in vitro de embriões equinos, alcançam altas taxas de maturação oócitária, acima de 60% atingem o estágio de metáfase II, adequado para a realização da técnica de ICSI e tambem apresentam altas taxas de clivagem após ICSI (≥65%) (HINRICHS, 2012; MORRIS,2018; STOUT, 2020). 2.7. INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DO ESPERMATOZOIDE (ICSI) A ICSI é uma técnica de reprodução assistida para a produção de embriões in vitro, na qual consiste na deposição (injeção) de um único espermatozoide dentro do ooplasma do oócito maduro por meio de uma agulha microscópica. 29 Na espécie equina a ICSI substitui a técnica convencional de fertilização in vitro (FIV) pelo fato de que está não obtém bons resultados, sendo os principais obstáculos o endurecimento da zona pelúcida do oócito durante o processo de maturação e a falha na ativação de espermatozoides (processo de capacitação) para penetração da zona pelúcida e do oolema de oócitos maturados in vitro (LAZZARI et al., 2020). Assim o procedimento da ICSI contorna estas barreiras durante o processo de fertilização se tornando a técnica fundamental para o sucesso de produção de embriões in vitro nos equinos. (SANSINEMA, 2020). 2.8. CULTIVO IN VITRO (CIV) O cultivo in vitro para o desenvolvimento embrionário é uma etapa bem desafiadora, apresentando uma taxa de produção de blastocistos por oócito submetido à ICSI de 23% - 30%, recuperados de folículos imaturos (STOUT, 2020; SANSINEMA, 2020; RADER et al., 2016). Em programas de produção de embriões, os oócitos que são maturados in vitro, são fertilizados através da técnica de ICSI, e mantidos em meio de retenção pós-ICSI, o qual, é composto por um meio base M199, suplementado com 10% soro fetal bovino e mantidos em incubadora com 5% de CO₂ a 38,2ºC durante um período de aproximadamente 2 horas. Os oócitos são transferidos em meio de cultura para embriões (RADER et al., 2016). Para avaliação da clivagem dos embriões, no dia 5 após a ICSI, os embriões clivados são colocados em um novo meio de cultura para o desenvolvimento até a fase de blastocisto (RADER et al., 2016). A maioria dos protocolos de cultivo in vitro implementa uma mudança de meio a cada 2- 3 dias para minimizar o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) (HIRICHS et al., 2007). Diversos laboratórios descrevem diferentes esquemas de troca de meio, como por exemplo, no dia 2 ou 3, ou dia 4 ou 5 (CHOI et al., 2003; TREMOLEDA et al., 2003). No entanto, altas taxas de produção de blastocistos foram relatadas quando o meio é trocado no dia 4 após ICSI (FOSS et al., 2013). Os embriões produzidos in vitro, geralmente atingem o estágio de blastocisto nos dias 7 a 9 após a ICSI, quando são transferidos para uma égua receptora ou criopreservados (CUERVO-ARANGO et al., 2018). Os embriões são examinados diariamente do dia 7 ao dia 10 pós-ICSI para avaliação do 30 desenvolvimento do blastocisto (RADER et al., 2016). Os blastocistos produzidos in vitro, independentemente do dia da cultura que eles tenham se desenvolvido são comparados aos embriões in vivo do dia 6. Idealmente, os blastocistos produzidos in vitro, devem ser transferidos na receptora no dia 4-6 após a ovulação (CUERVO-ARANGO et al., 2018; RADER et al., 2016). Em estudo de DUCHEYNE et al. (2019) relatou que embriões produzidos in vitro que atingem o estágio de blastocisto nos dias 10-12 de cultivo após a ICSI, esses embriões são menos propensos a um diagnóstico positivo de prenhez (3/11: 27 %) do que os embriões que se desenvolveram até o estágio de blastocisto nos dias 6-9 após a ICSI (38/55: 69%). No que diz respeito ao perfil metabólico o embrião equino, possui uma alta taxa de metabolismo de glicose, absorção de piruvato e produção de lactato, os quais, são indicadores úteis à viabilidade embrionária. Dessa forma, o cultivo in vitro é realizado entre os dias 0-4 com baixa concentração de glicose e do dia 5 em diante com alta concentração de glicose (LANE et al., 2001; AZUMA et al., 1995). O meio de cultura de embriões que tem sido consistentemente associado a altas taxas de desenvolvimento de blastocistos equinos é o DMEM/F12 (HINRICHS et al., 2005; CHOI et al., 2006). CONSIDERAÇÕES FINAIS A produção in vitro de embriões equinos pela técnica de ICSI vem crescendo comercialmente e mundialmente; apresentando ser uma técnica desafiadora, com resultados oscilantes. Por essas razões, com o intuito de elucidar as alterações que levam às baixas taxas de produção de blastocistos viáveis, surge a necessidade de estudos e desenvolvimento de pesquisas voltadas à maturação, fertilização e ao cultivo in vitro dos embriões equin 31 REFERÊNCIAS ALLEN, W.R. The Physiology of Early Pregnancy in the Mare. In: American Association of Equine Practitioners. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.46, p. 338-354, 2000. ALVARENGA, M. A.; CRUZ LANDIM-ALVARENGA, F. New Assisted Reproductive Techniques Applied for the Horse Industry. Saunders Elsevier. In J. Sampe, p. 209–221, 2009. 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Papa1 8 9 1Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de 10 Medicina Veterinária e Zootecnia, FMVZ, Universidade Estadual Paulista “Júlio 11 de Mesquita Filho”, UNESP, Botucatu, Brasil 12 13 * Autor para correspondência: m.frasson@unesp.br 14 15 RESUMO 16 17 A produção de embriões in vitro tem crescido ao longo da última década na 18 indústria equina, dessa forma, a utilização de oócitos imaturos tornou-se uma 19 prática padrão nos laboratórios de ICSI em todo o mundo. Perante a esse 20 cenário, para obter taxas de sucesso, o meio de maturação é uma chave 21 importante no processo de produção de embriões. O objetivo deste estudo foi 22 avaliar o efeito do meio de maturação na competência do desenvolvimento de 23 oócitos equinos maturando in vitro e a produção de embriões por ICSI. O meio 24 de maturação controle foi composto de DMEM/F-12 suplementado com FSH, LH, 25 aditivos (ITS, EGF, IGF, piruvato) e 15% de SFB. Esse meio de maturação 26 controle foi embasado ao de Lazzari (2020) do Laboratory Production of Equine 27 Embryos, no entanto o meio de maturação experimental foi constituído de 28 TCM199 com sais de Earle, suplementado com FSH, 17β-estradiol, aditivos (ITS, 29 EGF, IGF, piruvato) e 10% de SFB. Os complexos cumulus-oócitos (COCs) 30 foram coletados por meio de aspiração folicular transvaginal guiada por 31 ultrassom e distribuídos aleatoriamente em dois grupos diferentes, 32 posteriormente, mantidos em meio de manutenção durante o período de 5-12h 33 de espera, em seguida os COCs foram transferidos para meio de maturação e 34 https://www.elsevier.com/journals/theriogenology/0093-691X/guide-for-authors mailto:m.frasson@unesp.br 40 cultivados por 36 horas em incubadora de 5% CO2 ao ar, em temperatura 35 38,2°C. Logo após os COCs foram então desnudados, visualização da extrusão 36 do corpúsculo polar, realização da ICSI e os presuntivos zigotos foram cultivados 37 em incubadora de 5%CO2, 6%O2 à 38,2°C. A clivagem foi verificada e as 38 células contadas no dia 3 após a ICSI, os blastocistos foram avaliados e 39 classificados (em uma escala de grau A-B-C) dos dias 7 a 10. As análises 40 estatísticas do grupo controle (GC) e grupo experimental (GE) foram efetuadas 41 pelo Teste Exato de Fisher. O nível de significância quando considerado 42 diferença estatística entre os grupos foi definido como P < 0,05. Não houve 43 diferença entre os grupos (P > 0,05) em degenerado (GC=15,7%, 13/83; GE= 44 9,5%, 8/84), estágio VG (GC=4,8%, 4/83; GE=6,0%, 5/84), presuntivos MI 45 (GC=4,8%, 4/83; GE=2,4%, 2/84) ou MII (GC=74,7%, 62/83; GE= 81,0%, 68/84) 46 oócitos avaliados após cultura de maturação. Em relação a taxa de clivagem no 47 dia 3 não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos (GC=72,2%, 39/54; GE= 48 67,9%, 38/56). Na contagem de células, o grupo controle apresentou maior (P < 49 0,05) número de embriões em estágio de 2 células no dia 3 (GC=13,0%, 7/54; 50 GE=1,8%, 1/56). No entanto, o grupo experimental mostrou tendência (P = 0,07) 51 de ter mais embriões no estágio de 8-16 células no dia 3 (GC=5,6%, 3/54; 52 GE=17,9%, 10/56). Não houve diferença na taxa de blastocisto (P > 0,05) entre 53 os grupos (GC=21,0%, 13/62; GE=23,5%, 16/68). Para a classificação dos 54 embriões, não houve diferença (P > 0,05) entre os grupos, nos três diferentes 55 graus (9,7%, 6/62 e 13,2%, 9/68 para o grau A; 6,5%, 4/62 e 10,3%, 7 /68 para 56 o grau B; e 4,8%, 3/62 e 0,0%, 0/68 para o grau C, os valores apresentados são 57 do grupo controle e experimental, respectivamente). Embora não houve 58 diferença estatística na maioria das variáveis, podemos observar que o grupo 59 experimental foi superior ao grupo controle. O grupo experimental mostrou 60 numericamente mais oócitos no estágio MII, menos embriões no estágio de 2 61 células e mais embriões no estágio de 8-16 células no dia 3. Da mesma forma, 62 podemos observar numericamente mais embriões de alta qualidade (grau A e B) 63 no grupo experimental do que no grupo controle. Ainda assim, com um número 64 total maior de oócitos, provavelmente encontraríamos diferenças estatísticas 65 nessas variáveis. Por este motivo estudos adicionais são necessários para 66 aprimorar a eficiência deste meio de maturação. 67 41 Palavras-chave: Oócitos, Meio de maturação, Clivagem, Cultivo in vitro 68 Produção de embriões. 69 70 1. Introdução 71 Nos últimos anos têm surgido um interesse significativo a respeito das 72 biotecnologias aplicadas na espécie equina, tanto relacionado ao 73 desenvolvimento de pesquisas quanto na utilização comercial para a produção 74 in vitro de embriões [1]. 75 No entanto, a utilização destas biotecnologias possui alguns fatores 76 limitantes, principalmente relacionados à fisiologia reprodutiva da égua, que por 77 ser uma espécie monovulatória, possui apenas um ou dois folículos dominantes 78 durante cada ciclo estral [2]. Adicionalmente, devido a falta de um hormônio 79 comercialmente disponível, os protocolos de superovulação acabam não sendo 80 utilizados. Devido a estes motivos, quando se realiza a coleta, o número de 81 folículos pré-ovulatórios aspirados é baixo, sendo a maior população folicular de 82 folículos pequenos. Diante disto é preconizado a aspiração folicular de todos os 83 folículos pequenos presente no ovário com o objetivo de se ter maior 84 recuperação oocitária, no entanto, estes oócitos oriundos desses folículos 85 possuem grande quantidade de gotículas lipídicas [3] e fortes junções 86 comunicantes com as células da granulosa [4,5] dificultando a recuperação 87 através da aspiração folicular. 88 Além disso, a maturação in vitro (MIV) apresenta ser outro entrave na 89 produção de embriões. Os elementos que podem influenciar na maturação 90 oócitária são: osmolaridade, temperatura, pH, tensão de CO₂ e O₂, volume do 91 meio, presença de células do cumulus, adição de gonadotrofinas ao meio de 92 maturação e o tempo de cultivo dos oócitos [6]. A escolha do meio de cultura 93 usado na MIV equina é baseada em outras espécies [1], porém, as taxas de 94 maturação in vitro de oócitos equinos são baixas quando comparadas as de 95 outras espécies, geralmente em média 60% atingem o estágio de metáfase II em 96 equinos [7], comparado a 97% em bovinos [8]. 97 Dessa forma, perante a esse cenário o processo de maturação oocitária 98 apresenta ser um ponto crítico para a produção de embriões in vitro [6]. Com 99 base nisso, é desejável a elaboração e adequação de um meio de maturação 100 que melhore as taxas de sucesso dentro de um laboratório de ICSI. Sendo assim, 101 42 o presente estudo tem como seu principal objetivo avaliar o efeito de um novo 102 meio de maturação in vitro de oócitos equinos, através da utilização de uma nova 103 composição de meio, analisando a competência do desenvolvimento de oócitos 104 equinos maturados in vitro e a formação embrionária. 105 106 2. Material e métodos 107 Este estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais 108 (CEUA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade 109 Estadual Paulista (FMVZ - UNESP – Botucatu/São Paulo), sob protocolo nº 110 0251/2022. 111 Todos os produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co, (St 112 Louis, Mo, USA) e meio de cultura da Thermo Fisher Scientific (São Paulo, SP, 113 Brasil), a menos que seja especificado de outra forma. 114 115 2.1 Animais e local de pesquisa 116 Foram utilizadas 20 éguas, de diferentes raças com idade variando entre 117 7 e 15 anos, com boa condição corporal e históricos reprodutivos normais. Os 118 animais foram mantidos em piquetes com livre acesso a água, sal mineral, feno 119 e ração balanceada comercial. 120 A pesquisa foi conduzida no Laboratório de Embriologia da Central CH 121 Reprodução Equina, localizada no município de Adamantina, estado de São 122 Paulo, durante o período de outubro/2021 – abril/2022. 123 124 2.2 Aspiração folicular 125 Foram realizadas cinco sessões de aspiração folicular transvaginal guiada 126 por ultrassonografia, utilizando quatro (n=4) éguas por sessão. Antes de iniciar 127 o procedimento de aspiração folicular o animal foi colocado no tronco de 128 contenção e administrado sedativo, analgésico e espasmolítico (cloridrato de 129 detomidina 5mg IV - butorfanol 1,5mg IV - butilbrometo de hioscina/buscofin 25 130 mg IV) para facilitar o procedimento e diminuir o desconforto. 131 O processo para aspiração dos folículos foi guiado por ultrassonografia 132 (Mindray DP 50 power), utilizando-se um transdutor microconvexo de 5 MHz, 133 encaixado em uma guia de aspiração, conjuntamente com uma agulha de calibre 134 12 G de duplo lúmen (WTA, Cravinhos, SP, Brasil), que apresenta uma cavidade 135 43 interna para a aspiração e uma pequena abertura externa para lavagem dos 136 folículos. A guia com o transdutor foi inserido por via transvaginal para a 137 visualização dos folículos através do ultrassom e o ovário manipulado por meio 138 da palpação transretal. Após a visualização dos folículos ovarianos, a agulha foi 139 inserida através do fundo do saco vaginal, perfurando o ovário e os folículos. 140 Após drenagem do fluido folicular, a parede folicular foi escarificada para 141 remoção dos COCs e o folículo foi lavado com meio de aspiração folicular. Esse 142 procedimento foi repetido, em média 6 vezes para cada folículo aspirado. 143 O meio de aspiração folicular é composto por DMPBS 144 (Nutricell,Campinas, SP, Brasil) com 10% de soro fetal bovino e 1500 UI/L de 145 heparina. O meio de lavagem dos folículos foi introduzido por pressão manual 146 usando uma seringa plástica e a aspiração foi realizada utilizando uma bomba a 147 vácuo por pressão de 100 mmHg. Os COCs aspirados são armazenados em um 148 frasco estéril aquecido em banho-maria em temperatura de 38°C. Todos os 149 folículos presentes nos ovários contendo diâmetro ≥10 mm foram aspirados. 150 Após o término da aspiração, os COCs foram levados imediatamente para o 151 laboratório. 152 153 2.3 Lavagem e seleção dos oócitos 154 No laboratório, após término da sessão de aspiração, o conteúdo aspirado 155 armazenado no frasco estéril, foi filtrado pelo filtro de embriões de 75 micra 156 (WTA, Cravinhos, SP, Brasil), em seguida foi lavado suavemente com solução 157 de DMPBS, com auxílio da seringa de 20 mL e agulha 40x12. Logo após a 158 lavagem do filtro, o conteúdo filtrado foi transferido para uma placa de Petri de 159 100 mm e realizado rastreamento dos oócitos utilizando o estereomicroscópio. 160 Após identificados, os oócitos foram transferidos para meio holding 161 (TCM199 com sais de Hanks com 10% SFB) e divididos aleatoriamente em dois 162 grupos: controle e experimental. Os oócitos foram então transferidos para um 163 tubo de 5 mL (Falcon, Nova York, USA) contendo meio holding e mantidos em 164 incubadora portátil (TED, Cravinhos, Brasil) à 22ºC, durante um período de 5-12 165 horas, após esse período foram transferidos para o meio de MIV. 166 167 168 169 44 2.4 Maturação in vitro (MIV) 170 Após o período de holding, os oócitos foram transferidos para os 171 respectivos meios de maturação. O meio de maturação do grupo controle foi 172 adaptado de [9], a base utilizada foi DMEM – F12 suplementado com 15% de 173 SFB, 1µL/mL insulina – transferrina -sodium selenite (ITS), fatores de 174 crescimento 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL IGF), 0,1 UI/mL de FSH/LH 175 (Pergoveris/Luveris – Merk, Rio de Janeiro, RJ, Brasil), 1 mM de piruvato de 176 sódio e 75 µg/mL de amicacina. 177 O meio de maturação do grupo experimental foi composto por TCM199 178 com sais de Earle, suplementado com 10% de SFB, 1µL/mL de ITS, 50 ng/mL 179 de EGF, 100 ng/mL de IGF, 0,1 UI/mL de FSH (GONAL-f, Rio de Janeiro, RJ, 180 Brasil), 0,01 µg/µL 17β-estradiol (Sigma-Aldrich®), 1 mM de piruvato de sódio, 181 1Mm de cisteamina e 75 µg/mL de amicacina. 182 Para a realização da maturação in vitro, os CCOs foram cultivados em 183 placa de cultura estéril (35x10mm, Falcon, Nova York, USA), utilizando a 184 proporção de 10µl de meio por CCOs. A placa foi montada contendo 10 CCOs 185 em cada gota com 100 µL de meio de maturação, recobertas com óleo mineral 186 branco (Irvine Scientific, Santa Ana, Califórnia, USA). Os CCOs foram incubados 187 em 5% de CO₂ em ar, à 38,2ºC durante 36 horas. 188 189 2.5 Injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) 190 Após o período de MIV, o grau de expansão das células do cumulus foi 191 analisado e os COCs foram desnudados para visualização da extrusão do 192 primeiro corpúsculo polar. Para o desnudamento, as células do cumulus foram 193 retiradas com o auxílio de capilares de plástico de 150 e 125 µm de diâmetro 194 acoplado à um micropipetador (Stripper, Origio, Ballerup, Dinamarca, Europa), 195 utilizando-se uma solução de 0,05% de hialuronidase em holding. Os oócitos que 196 haviam extrusado o primeiro corpúsculo polar (estágio de metáfase II - MII) foram 197 destinados para a ICSI, os restantes foram visualmente classificados em: 198 degenerados, vesículas germinativas (GV) ou presuntivos MI e fixados em formol 199 10% para posterior coloração com DAPI [10] para confirmação do status da 200 cromatina, de acordo com Hirinchs [11]. 201 Oócitos com corpúsculo polar visível foram submetidos à ICSI, como 202 descrito por Salgado [12]. Foi utilizado sêmen congelado de um garanhão de 203 45 fertilidade conhecida. Uma fração (aproximadamente um décimo) de uma 204 palheta de sêmen congelada foi cortada em nitrogênio líquido e descongelada 205 em 1 ml GMOPS (Vitrolife, Englewood, CO, EUA) suplementado com 10% de 206 FBS, em um tubo Falcon de 5 mL, por 60 segundos à 38ºC. Em seguida o sêmen 207 descongelado foi centrifugado a 400 × g por 4 minutos. O sobrenadante foi então 208 removido com o auxílio de uma pipeta e o sedimento foi ressuspendido em 1 mL 209 de GMOPS 10% e centrifugado novamente. O sobrenadante, mais uma vez foi 210 removido e o pellet com os espermatozoides foi misturado com o restante do 211 meio (aproximadamente 10 µL). 212 Com o sêmen já processado, foi realizado o preparo da placa de ICSI, da 213 seguinte forma: utilizando uma placa de Petri de 60 mm (Falcon, Nova York, 214 USA), distribuindo as gotas com os oócitos na parte lateral da placa e a gota com 215 os espermatozoides no meio da placa. Para o preparo da gota com os 216 espermatozoides, foi adicionado meio Sperm Catch (Nidacon, MÖIndal, Suécia), 217 onde foi adicionado 1 μL do sêmen processado. Os oócitos foram mantidos em 218 gotas separadas de 5 μL (dois oócitos por gota) de meio holding. 219 Para o procedimento de ICSI, foi utilizado um microscópio invertido 220 (Axiovert, Zeiss, Oberkochen, Alemanha) equipado com dois 221 micromanipuladores, um microinjetor pneumático (holding, para segurar o 222 oócito) e um microinjetor a óleo (injection, para injetar o espermatozoide) 223 acoplado ao piezzo drill (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha). 224 A ICSI foi realizada utilizando a técnica ICSI piezo [12], na qual uma 225 micropipeta de injeção de ponta romba recebe microvibrações acionadas pelo 226 piezo drill para romper a membrana plasmática do espermatozoide, penetrar a 227 zona pelúcida e no oolema do oócito, depositando o espermatozoide diretamente 228 no ooplasma. 229 Para o processo de fertilização do oócito, apenas um único 230 espermatozoide móvel com morfologia aparentemente normal foi escolhido, a 231 pipeta de injeção imobilizou o espermatozoide com a cauda para dentro da 232 pipeta. No momento que a peça intermediaria fica na borda da pipeta da injection 233 os pulsos de piezo foram aplicados para imobilização do espermatozoide. Já o 234 oócito foi fixado pela pipeta de holding, o corpúsculo polar posicionado às 6:00 235 ou 12:00 e a pipeta de injeção foi introduzida na zona pelúcida e membrana 236 46 plasmática do oócito, na posição de 3 horas para a injeção de espermatozoide 237 no ooplasma [12]. 238 2.6 Cultivo e avaliação embrionária 239 Os oócitos injetados pela técina de ICSI foram incubados em TCM199 240 com sais de Earle suplementado com 10% FBS (pós-ICSI holding) em 5% CO₂ 241 à 38,2ºC por 30 minutos. 242 Logo após este período, os oócitos injetados foram então transferidos e 243 cultivados em microgotas de 15µL, utilizando o meio comercial de cultura Global 244 (Global medium, LifeGlobal, Guilford, Connecticut, EUA) suplementado com 10% 245 FBS, utilizando a proporção de 5 a 7,5 μl meio/oócito, com 2-4 embriões/gota. O 246 ambiente de cultivo foi de 5% CO₂ 6% O₂ em temperatura de 38,2°C. 247 No dia 3 após a ICSI avaliou-se a clivagem e o número de células dos 248 embriões foram contadas. Os oócitos injetados não clivados foram fixamos em 249 formol 10% para posterior coloração com DAPI para avaliação da cromatina [13]. 250 No dia 5 após a ICSI o meio de cultivo embrionário foi trocado para DMM/F-12 251 suplementado com 10% FBS. 252 A avaliação embrionária para detecção da formação de blastocistos e 253 classificação morfológica foi realizada do dia 7 a 10 após a ICSI. Os embriões 254 foram classificados da seguinte forma: Grau A – embriões que se tornaram 255 blastocistos nos dias 7 ou 8 após a ICSI com boa qualidade; Grau B – embriões 256 que se tornaram blastocistos nos dias 7 ou 8 com qualidade moderada e nos 257 dias 9 ou 10 com boa qualidade; Grau C – embriões que se tornaram blastocistos 258 nos dias 7 ou 8 com qualidade ruim ou nos dias 9 ou 10 com qualidade moderada 259 ou ruim. 260 261 2.7 Análise estatística 262 Para avaliação das análises estatísticas, para cada variável foi utilizado o 263 Teste Exato de Fisher, com o nível de significância P < 0,05 e tendência definida 264 como 0,05 < P < 0,1. 265 266 3. Resultados 267 Após o período de MIV, os COCs foram desnudos das células do cumulus 268 e os oócitos foram classificados em degenerados, vesículas germinativas (VG), 269 MI ou MII. Não houve diferença estatística (P > 0,05) entre os grupos para oócitos 270 47 degenerados (15.7%,13/83 e 9.5%, 8/84), VG (4.8%, 4/83 e 6.0%, 5/84), MI 271 (4.8%, 4/83 e 2.4%, 2/84) e MII (74.7%, 62/83 e 81.0%, 68/84) para grupo 272 controle e experimental, respectivamente (Tabela 1). 273 274 Tabela 1. Taxa de oócitos degenerados, vesículas germinativas, MI e MII após 275 maturação com dois diferentes meios. 276 Grupo Degenerados VG MI * MII Controle (GC) 15.7% (13/83) 4.8% (4/83) 4.8% (4/83) 74.7% (62/83) Experimental (GE) 9.5% (8/84) 6.0% (5/84) 2.4% (2/84) 81.0% (68/84) No dia 3 após a ICSI, quando o número de células foi contado e as taxas 277 de clivagem foram avaliadas em relação aos oócitos injetados, o grupo controle 278 apresentou maior número de embriões em estágio de duas células (13.0%, 7/54) 279 quando comparado ao grupo experimental, apresentando diferença significativa. 280 (1.8%, 1/56; P < 0,05). Não houve diferença estatística entre os grupos (P > 0,05) 281 em números de embriões nos estágios de 2-4 células, 4-8 células e >16 células, 282 no entanto o grupo experimental (17.9%, 10/56) apresentou tendência (P = 0.07) 283 a possuir mais embriões no estágio de 8-16 células quando comparado ao grupo 284 controle (5.6%, 3/54). Não houve diferença (P > 0,05) no total de embriões 285 clivados entre os grupos (Tabela 2). 286 287 Tabela 2. Número de células e taxa de clivagem por oócitos injetados para 288 diferentes meios de maturação no dia 3 após ICSI. 289 Grupo 2 cel 2-4 cel 4-8 cel 8-16 cel >16 cel Total CL GC 13.0% (7/54)a 18.5% (10/54) 35.2% (19/54) 5.6% (3/54)* 0.0% (0/54) 72.2% (39/54) GE 1.8% (1/56) 12.5% (7/56) 35.7% (20/56) 17.9% (10/56) 0.0% (0/56) 67.9% (38/56) * Tendência à diferença estatística. GC: controle GE: grupo experimental 290 Quando avaliamos a clivagem em relação ao número de oócitos 291 aspirados, o resultado foi semelhante ao observado em relação aos oócitos 292 injetados, ressaltando que o grupo controle apresentou mais embriões (P < 0,05) 293 em estágio de duas células (8.4%, 7/83) e tendência (P = 0,08) a ter menos 294 embriões no estágio de 8-16 células (3.6%, 3/83) quando comparado ao grupo 295 experimental descrito na tabela 3. 296 48 Tabela 3. Número de células e taxa de clivagem por oócitos aspirados para 297 diferentes meios de maturação no dia 3 após ICSI. 298 Grupo 2 cel 2-4 cel 4-8 cel 8-16 cel >16 cel Total CL GC 8.4% (7/83)a 12.0% (10/83) 22.9% (19/83) 3.6% (3/83)* 0.0% (0/83) 47.0% (39/83) GE 1.2% (1/84) 8.3% (7/84) 23.8% (20/84) 11.9% (10/84) 0.0% (0/84) 45.2% (38/84) * Tendência à diferença estatística GC: grupo controle GE: grupo experimental 299 Na avaliação dos blastocistos e qualidade embrionária, quando a as taxas 300 foram analisadas em relação aos oócitos injetados, constatou-se que ambos os 301 grupos não apresentaram diferenças significativas entre si (P > 0,05) nos 302 diferentes graus de classificação embrionária e total de blastocistos (Tabela 4). 303 Entretanto, podemos observar que o grupo experimental apresentou 304 numericamente mais embriões de melhor qualidade (A e B). 305 306 Tabela 4. Taxa de blastocistos por oócitos injetados para diferentes meios de 307 maturação. 308 Grupo BL A BL B BL C Total BL Controle 9.7% (6/62) 6.5% (4/62) 4.8% (3/62) 21.0% (13/62) Experimental 13.2% (9/68) 10.3% (7/68) 0.0% (0/68) 23.5% (16/68) 309 Em relação a produção de blastocisto por oócitos aspirados também não 310 houve diferença (P > 0,05) entre os grupos quando analisamos as diferentes 311 categorias, BL-A (7.2% 6/83; 10.8% 9/84), BL-B (4.8% 4/83; 8.8% 7/84), BL-C 312 (3.6% 3/83; 0.8% 0/84) e Total BL (15.7% 13/83; 19.8% 16/84), dados descritos 313 na Tabela 5. 314 315 Tabela 5. Taxa de blastocistos por oócitos aspirados para diferentes meios de 316 maturação. 317 Grupo BL A BL B BL C Total BL Controle 7.2% (6/83) 4.8% (4/83) 3.6% (3/83) 15.7% (13/83) Experimental 10.8% (9/84) 8.8% (7/84) 0.8% (0/84) 19.8% (16/84) 318 Em relação aos oócitos e os embriões fixados no formol para avaliação 319 da cromatina pela coloração de DAPI, não foi possivel realizar essa análise pois 320 o material genético ficou degenerado, provavelmente pelo tempo prolongado que 321 ficou fixado no formol. 322 323 49 4. Discussão 324 O presente estudo avaliou uma nova estratégia de meio de maturação in 325 vitro para oócitos equinos, através da avaliação do potencial de desenvolvimento 326 dos oócitos e produção embrionária por meio da ICSI. O meio de maturação 327 utilizado como controle foi baseado em um meio bem estabelecido 328 mundialmente na produção in vitro de embriões equinos [9]. As principais 329 diferenças entre os dois meios foi o meio base, sendo que o controle é 330 constituído DMEM/F-12, enquanto o meio experimental é constituído por 331 TCM199. Além disso, a composição hormonal difere entre os dois meios, 332 enquanto o controle possui LH e FSH, o experimental utiliza apenas FSH como 333 gonadotrofina e apresenta o incremento do estradiol. 334 Como os COCs apresentam alto consumo de glicose durante o processo 335 de maturação in vitro [1], poderíamos pressupor que um meio com alta 336 concentração de glicose poderia ser benéfico para o desenvolvimento e 337 maturação oocitária. No entanto, não houve diferença estatística tanto na taxa 338 de maturação quanto na produção de embriões para os diferentes meios 339 testados (DMEM/F-12 possui 17,5 mmol/L e TCM199 possui 5,5 mmol/L de 340 glicose). Estes achados corroboram com os de LEWIS [14], onde uma 341 concentração elevada de glicose, mas causou uma diminuição no índice 342 glicolítico e uma modificação significativa na função mitocondrial do COCs, no 343 entanto não influenciou o consumo de glicose nem a taxa de maturação e 344 produção de embriões. 345 Quando analisada a adição do LH em meios de maturação de oócitos 346 equinos, Willis [15] observaram que COCs cultivados com a adição de LH bovino 347 em concentrações crescentes obtiveram taxas de maturação semelhantes, em 348 torno de 40%, verificando que a adição do LH não afeta o índice de maturação. 349 Desta forma, no presente estudo não houve adição de LH no grupo experimental. 350 De acordo com Carneiro [16], o fator de crescimento à insulina I (IGF-I) 351 tem efeito positivo na maturação nuclear em oócitos equinos maturados in vitro. 352 Além disso, demonstrou que a adição de IGF-I no meio de maturação in vitro 353 juntamente com FSH, LH, estradiol (E2) e SFB não aumenta a maturação 354 nuclear mas promove maturação citoplasmática. Outros estudos detectaram 355 receptores para o fator de crescimento epidermal (EGF) nos folículos, sendo 356 mais proeminentes das células do cumulus e da granulosa, sugerindo a ação do 357 50 EGF como mediador parácrino na sinalização de LH, dando início ao processo 358 de maturação [17]. 359 Durante a MIV ocorre produção de radicais livres, que são prejudiciais 360 para o desenvolvimento dos oócitos [18]. Como alternativa, para melhorar o 361 ambiente do cultivo, adicionamos no meio experimental a cisteamina como 362 antioxidante, por ser um aminotiol capaz de reduzir importantes moléculas de 363 dissulfeto oxidadas, auxiliando na proteção contra o stress oxidativo [19]. Além 364 disso, utilizamos ITS como suplementação para o meio experimental. A insulina 365 é um hormônio polipeptídico que promove a absorção de glicose e aminoácidos, 366 podendo, por este motivo, apresentar um efeito mitogênico. A transferrina é uma 367 proteína de transporte de ferro e o selênio é um oligoelemento essencial, 368 normalmente fornecido pelo soro [18,20,21}. Adicionalmente, foi utilizado 369 piruvato de sódio, importante para o metabolismo do oócito e como antioxidante. 370 Foi demonstrado que a combinação de glicose e piruvato no meio resulta em 371 maiores taxas de maturação para o COCs em camundongos [22]. Todos estes 372 aditivos utilizados são semelhantes em ambos os meios, com exceção da 373 cisteamina, presente apenas no meio experimental, podendo esta ser uma 374 possível fonte das vantagens observadas neste meio, como melhor 375 desenvolvimento embrionário no dia 3 após a ICSI, e embriões de melhor 376 qualidade. 377 Para avaliação da eficácia dos meios de maturação in vitro foi analisado 378 a taxa de maturação dos oóctios que atingiram o estágio de MII, tanto o grupo 379 controle (74.7%, 62/83) como o experimental (81.0%, 68/84) apresentaram boas 380 taxas de maturação in vitro comparadas com outros estudos, que apresentam 381 taxas entre 50 e 67% [23,24,25,26]. No presente estudo, não houve diferença 382 estatística na taxa de MII entre os grupos, no entanto, o grupo experimental 383 apresentou uma taxa numericamente superior ao grupo controle. 384 A taxa de clivagem um indicador da produção esperada de blastocistos, 385 diante desse fato, neste experimento foi avaliado a taxa de clivagem do grupo 386 controle apresentando 72.2% (39/54) de embriões clivados após a ICSI e o grupo 387 experimental 67.9% (38/56). Apesar de não haver diferença entre os grupos, 388 esses valores são semelhantes aos de outros estudos, que indicam a taxa de 389 clivagem de 65% a 75% [27,28,29,30]. 390 51 Em relação à contagem de células no dia 3 após a ICSI, o grupo controle 391 (13,0%; 7/54) apresentou maior quantidade de embriões com 2 células em 392 relação ao grupo experimental (1.8%; 1/56), mostrando que os embriões com 2 393 células tiveram atraso em seu desenvolvimento. Similarmente, o grupo 394 experimental apresentou uma tendência a possuir maior quantidade de embriões 395 com 8-16 células (17.9%; 10/56) em relação ao grupo controle (5.6%; 3/54), 396 reafirmando a hipótese de que os embriões do grupo controle possuem 397 crescimento mais lento em relação aos embriões do grupo experimental. No dia 398 3 após a ICSI é esperado que os embriões apresentem, em média, de 8 a 16 399 células. Não conhecemos nenhuma literatura que compare o meio de maturação 400 com o número de células de embriões equinos provenientes de ICSI, no dia 3 401 após o cultivo embrionário. 402 Galli e colaboradores [31] observaram uma clara vantagem no uso de um 403 meio à base de DMEM-F12 não apenas na taxa de clivagem, mas também no 404 desenvolvimento do embrião até o estágio de blastocisto. Contrariamente, no 405 presente trabalho não observamos diferença estatística na taxa total de clivagem 406 (GC 72.2%, 39/54 GE 67.9% 38/56) e de blastocistos, no entanto o grupo 407 experimental (23.5%, 16/68), à base de TCM199 apresentou vantagem numérica 408 em relação ao controle (21.0%, 13/62), à base de DMEM/F-12. 409 Para a avaliação do desenvolvimento do embrião em estágio de 410 blastocisto os embriões são examinados diariamente do dia 7 ao dia 10 após a 411 ICSI. Diversos estudos apontam que a produção de blastocisto pode ser 412 esperada entre 20% e 35% para oócitos imaturos [23,24,25]. No entanto, em 413 programas comercias a taxa de produção varia entre 20 e 23% [30,32]. No nosso 414 experimento, ambos os grupos apresentaram resultados semelhantes aos 415 apresentados por laboratórios comerciais de produção in vitro de embriões 416 equinos. Apesar de não ter havido diferença estatística em números de 417 blastocistos nas diferentes categorias de avaliação embrionária (A-B-C), 418 podemos observar que o grupo experimental apresentou numericamente mais 419 embriões de melhor qualidade (A e B). Porém uma das razões por não ter havido 420 diferença estatística pode ser devido ao baixo número de oócitos e embriões 421 Quando analisamos os dados de clivagem e blastocistos, observamos 422 uma grande diferença em percentual ao avaliar em relação aos oócitos aspirados 423 ou oócitos injetados. Isso se deve especialmente à taxa de maturação, quanto 424 52 mais baixa a taxa de maturação, maior será a diferença entre as taxas. Desta 425 forma, acreditamos ser importante expressar também as taxas em relação aos 426 oócitos aspirados. 427 Sabendo que o processo de maturação in vitro é um fator crítico para a 428 produção de embriões, os meios de maturação utilizados no presente estudo 429 foram eficazes para promover a maturação in vitro dos oócitos equinos, sendo 430 uma alternativa para melhorar a competência oócitária, favorecendo o 431 desenvolvimento dos embriões produzidos in vitro. Ainda assim, com um maior 432 número total de oócitos, provavelmente encontraríamos diferenças estatísticas 433 nos dados analisados. Por este motivo, estudos adicionais são necessários para 434 aprimorar a eficiê